JP4436972B2 - 軟骨吸収アッセイ - Google Patents
軟骨吸収アッセイ Download PDFInfo
- Publication number
- JP4436972B2 JP4436972B2 JP2000555095A JP2000555095A JP4436972B2 JP 4436972 B2 JP4436972 B2 JP 4436972B2 JP 2000555095 A JP2000555095 A JP 2000555095A JP 2000555095 A JP2000555095 A JP 2000555095A JP 4436972 B2 JP4436972 B2 JP 4436972B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- collagen
- type
- correlating
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 title abstract description 31
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 35
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 30
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 30
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 30
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 claims description 26
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 claims description 26
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 claims description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 16
- ZAHDXEIQWWLQQL-IHRRRGAJSA-N Deoxypyridinoline Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC[N+]1=CC(O)=C(C[C@H](N)C([O-])=O)C(CC[C@H](N)C(O)=O)=C1 ZAHDXEIQWWLQQL-IHRRRGAJSA-N 0.000 claims description 15
- LCYXYLLJXMAEMT-SAXRGWBVSA-N Pyridinoline Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC1=C[N+](C[C@H](O)CC[C@H](N)C([O-])=O)=CC(O)=C1C[C@H](N)C(O)=O LCYXYLLJXMAEMT-SAXRGWBVSA-N 0.000 claims description 14
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 13
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims description 13
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 12
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 claims description 9
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 claims description 9
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 6
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 claims description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 6
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010048038 N-propeptide type I collagen Proteins 0.000 claims 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 8
- GRFNBEZIAWKNCO-UHFFFAOYSA-N 3-pyridinol Chemical group OC1=CC=CN=C1 GRFNBEZIAWKNCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 abstract description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 abstract 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 8
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 8
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 8
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 8
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 8
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- LOJFGJZQOKTUBR-XAQOOIOESA-N NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C)CC1=CN=CN1 Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C)CC1=CN=CN1 LOJFGJZQOKTUBR-XAQOOIOESA-N 0.000 description 6
- 108010049937 collagen type I trimeric cross-linked peptide Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 102000004171 Cathepsin K Human genes 0.000 description 5
- 108090000625 Cathepsin K Proteins 0.000 description 5
- 102100030417 Matrilysin Human genes 0.000 description 5
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 5
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000855 Matrilysin Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000011382 collagen catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 102100027995 Collagenase 3 Human genes 0.000 description 2
- 101000990912 Homo sapiens Matrilysin Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- VEPOHXYIFQMVHW-PVJVQHJQSA-N (2r,3r)-2,3-dihydroxybutanedioic acid;(2s,3s)-3,4-dimethyl-2-phenylmorpholine Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O.O1CCN(C)[C@@H](C)[C@@H]1C1=CC=CC=C1 VEPOHXYIFQMVHW-PVJVQHJQSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 description 1
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 description 1
- 101000627872 Homo sapiens 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101000577887 Homo sapiens Collagenase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001013150 Homo sapiens Interstitial collagenase Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 206010020850 Hyperthyroidism Diseases 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 102000000380 Matrix Metalloproteinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010076503 Matrix Metalloproteinase 13 Proteins 0.000 description 1
- 102000000422 Matrix Metalloproteinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000287433 Turdus Species 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108010045624 glutamyl-lysyl-alanyl-histidyl-aspartyl-glycyl-glycyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000021332 multicellular organism growth Effects 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 150000003147 proline derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 210000004879 pulmonary tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 108091007196 stromelysin Proteins 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000008354 tissue degradation Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
- G01N2800/105—Osteoarthritis, e.g. cartilage alteration, hypertrophy of bone
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Processing And Handling Of Plastics And Other Materials For Molding In General (AREA)
Description
【０００１】
本出願は１９９８年６月１９日に出願された仮出願番号６０／０８９，８２３の一部継続出願である。
本発明は国立衛生研究所から授与された助成金ＡＲ３７３１８及びＡＲ３６７９４の１つ又はそれより多くの政府援助でなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有している。
【０００２】
（発明の分野）
本発明はII型コラーゲン（軟骨）のインビボ（in vivo）吸収を示す架橋テロペプチドアナライト（分析物）を検出するアッセイに関しており、そして特に鉱質化していない軟骨と鉱質化した軟骨の吸収を測定し、識別する免疫アッセイ、並びに軟骨の総インビボ吸収を測定する免疫アッセイを提供する。
【０００３】
（発明の背景）
本出願人の先の米国特許第４，９７３，６６６号、第５，１４０，１０３号、第５，３００，４３４号、第５，３２０，９７０号、第５，８１７，７５５号及び第５，７０２，９０９号を参照し、そしてこれらは参照して本明細書に組み入れる。
コラーゲンのインビボ吸収を示すテロペプチドアナライトを検出する免疫アッセイが知られている。骨吸収を測定する上記のようなＩ型コラーゲンアッセイの例には：ＷＯ８９／０４４９１（Eyre）；ＷＯ８９／１２８２４（Robins）；ＷＯ９１／０８４７８（Eyre）；ＥＰ０５０５２１０Ａ２（Risteli & Risteli）；ＷＯ９２／２１６９８（Eyre）；ＷＯ９４／０３８１３（Naser等）；ＷＯ９４／１４８４４（Baylink）；ＷＯ９５／０４２８２（Naser等）；ＷＯ９５／０８１１５（Qvist & Bonde）；ＷＯ９６／１２１９３（Bonde & Qvist）；ＥＰ０７１８３０９Ａ１（Naser等）；及びＷＯ９６／３６６４５（Eyre等）が含まれる。
【０００４】
軟骨吸収を測定するII型コラーゲンテロペプチドアッセイの例には、ＷＯ９１／０８４７８（Eyre）；ＷＯ９５／０８１１５（Qvist & Bonde）；及びＷＯ９６／１２１９３（Bonde & Qvist）が含まれる。
III型コラーゲンテロペプチドアッセイの例には、ＷＯ８８／０８９８０
（Risteli & Risteli）及びＷＯ９１／０８４７８（Eyre）が含まれる。
【０００５】
以下の特許の開示も重要である：米国特許第４，６２８，０２７号（Gay）は、連結組織タンパク質のモノクローナル抗体を使用するインビトロ診断方法を開示している。米国特許第５，３１６，９１４号（Oshima等）は、肝臓疾患の診断に適用できるヒトIII、IV及びVI型コラーゲンの酵素サンドイッチ免疫アッセイを開示している。ＷＯ９４／１４０７０（Poole & Hollander）は、軟骨におけるコラーゲン開裂を測定する免疫アッセイを開示している。ＷＯ９４／１８５６３（Barrach等）は、関節炎に関連したII型コラーゲン由来のペプチドを検出するサンドイッチ免疫アッセイ方法を開示している。
【０００６】
本出願人の先の国際公開、ＷＯ９１／０８４７８が特に重要である。これは、II型コラーゲンの次の尿吸収産生物：
【０００７】
【化１５】
【０００８】
（式中、括弧は選択自由のアミノ酸残基を示し、そしてＨｙｌ−Ｈｙｌ−Ｈｙｌとして表されている架橋残基はヒドロキシリシルピリジノリン（ＨＰ）、即ち種々の組織の成熟コラーゲン原繊維中に存在する天然の３−ヒドロキシピリジニウム残基である）を開示している。これらのアナライトはII型コラーゲンのＣ末端架橋テロペプチドドメインに由来するので、本明細書では集合的に「col2ＣＴx」と表される。
【０００９】
本発明の開示はまた、アミノ酸を略記する１文字記号も採用する；それ故、上記で示したアナライトのＧｌｕ−Ｈｙｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−（Ｐｒｏ）−（Ｌｅｕ）テロペプチド構成成分は、本明細書では以下、ＥＫＧＰＤ（配列番号１）、ＥＫＧＰＤＰ（配列番号２）及びＥＫＧＰＤＰＬ（配列番号３）と表される。更に、本明細書で使用するとき、記号「Ｋ」は線状ペプチドの場合におけるリシンを表すか、又はヒドロキシリシルピリジノリン（ＨＰ）及びリシルピリジノリン（ＬＰ）のなかから選択される架橋３−ヒドロキシピリジニウム残基を表す。
【００１０】
本出願人と同僚は最近の抄録中でもcol2ＣＴxを記載している：エア（Eyre）等、Bone Miner. Res. １１（Ｓ１）：Ｓ４１３、１９９６年は、ヒト尿中のＩ、II及びIII型コラーゲンから得られる架橋テロペプチドを記載している。
アトレィ（Atley）等、Arth. Rheum. ４０（９Ｓ）：５８４、１９９７年は、ＲＳ−１３０８３０、コラーゲナーゼ−３の選択的インヒビターが、ＩＬ−１αに曝露されたウシ軟骨からのヒドロキシプロリン及びメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）特異的ネオエピトープ、col2ＣＴx、の放出を阻害することを報告している。
【００１１】
アトレィ等、Trans. Orthop. Res. Soc.、ニューオーリンズ、１９９８年は、軟骨II型コラーゲンからの免疫反応性テロペプチドのマトリックスメタロプロテイナーゼ介在性放出を報告している。この研究の目的は、α１（II）Ｃ−テロペプチドＥＫＧＰＤＰのドメインを認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）２Ｂ４に基づく免疫アッセイが、軟骨内のＭＭＰ開裂産生物を測定するのかどうかを評価することであった。図１を参照すると、ｍＡｂ ２Ｂ４は合成ペプチドＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＲＡ（配列番号５）のマトリリシン消化インビトロ産生物ＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰ（配列番号４）を認識するが、ＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱ（配列番号６）、ＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＹ（配列番号７）、ＬＱＹＭＲＡ（配列番号８）又はＹＭＲＡ（配列番号９）は認識しない。これらの著者はまた、滑液、血清及び尿中におけるｍＡｂ ２Ｂ４免疫反応性の検出も認めた。彼等はこの２Ｂ４エピトープが、II型コラーゲンのインビボ吸収の有用なマーカーである可能性を有していると結論した。
【００１２】
モスコヴィッツ（Moskowitz）等、Amer. Coll. Rheum.、カリフォルニア州サンジエゴ、１９９８年１１月８〜１２日は、II型コラーゲンＣ−テロペプチド２Ｂ４エピトープが家族性骨関節症における軟骨吸収のマーカーであることを報告している。
アトレィ等、合同整形外科研究学会会議（Combined Orthopaedic Research Societies Meeting）、フランス国ビッテル、１９９８年９月２８〜３０日は、尿中のII型コラーゲン分解による架橋テロペプチド産生物（col2ＣＴx）を含む、骨及びコラーゲン分解の生化学的マーカーを議論している。
更に、報告によれば、リウマチ様関節炎の診断用マーカーとしてII型コラーゲンのＣ−テロペプチドに対するモノクローナル抗体がオステオメーター・バイオテク（Osteometer Biotech）Ａ／Ｓで開発中である。バイオ・ワールド・インターナショナル（Bio World International）、３頁、１９９７年１２月３日。
【００１３】
（発明の要約）
本発明は、II型コラーゲン（軟骨）のインビボ吸収を測定する改良されたアッセイを提供する。本主題の免疫アッセイは非鉱質化軟骨の吸収と鉱質化軟骨の吸収を識別し、そして総軟骨インビボ吸収を測定するのに有用である。これらの開示された免疫アッセイは、２つの抗体のうちの１つか又はそれらを組み合わせて使用する。第１の抗体はＥＫＧＰＤＰ（配列番号２）と結合するがＥＫＧＰＤＰＬＱ（配列番号１０）とは結合しない；その際、上記式中、Ｋの記号は好ましくは架橋３−ヒドロキシピリジニウム残基を表す。該第１の抗体と結合する血清中のアナライトを測定することによって、非鉱質化軟骨のインビボ吸収の指標が提供される。
第２の抗体はＥＫＧＰＤＰＬＱと結合するが、ＥＫＧＰＤＰとは結合しない；その際、上記式においても、Ｋの記号は好ましくは架橋３−ヒドロキシピリジニウム残基を表す。該第２の抗体と結合する血清中のアナライトを測定することによって、鉱質化軟骨のインビボ吸収の指標が提供される。
【００１４】
総（非鉱質化及び鉱質化）軟骨インビボ吸収の指標は、該第１の抗体と結合する尿中のアナライトを測定することによってか、又は該第１及び第２の抗体と結合する血清中の総アナライトを測定することによって提供される。
本発明の主題軟骨マーカーは、好ましくは、Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド及び遊離リシルピリジノリン（デオキシピリジノリン）架橋のなかから選択される、骨コラーゲン吸収マーカーと関連させて測定される。
【００１５】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
モノクローナル抗体２Ｂ４は、配列ＥＫＧＰＤＰ中のＣ末端エピトープを認識する。この抗体ではＣ末端プロリンが結合していない（即ち、Ｐｒｏ−Ｃ００Ｈ）ことが必要であり、そしてこの抗体にとってはＫがその側鎖（イプシロン）アミノ基を介して誘導体化されている（例えば、架橋されている）ことが好ましい。このプロリンに対して余分のＣ末端アミノ酸が存在すると、このペプチドドメインに対するｍＡｂ ２Ｂ４の結合が妨げられる。
【００１６】
コラーゲナーゼ（ＭＭＰ１及びＭＭＰ１３）、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ２及び９）、ストロメリシン（ＭＭＰ３）及びマトリリシン（ＭＭＰ７）を含む種々のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、軟骨II型コラーゲン又は合成Ｃ−テロペプチドドメイン（ＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＲＡ）からｍＡｂ ２Ｂ４エピトープを産生させることができる。マトリリシン（ＭＭＰ７）は、組換え酵素を使用するインビトロ試験に基づけば、最も強力である。
【００１７】
しかしながら、カテプシンＫは２Ｂ４エピトープ放出に必要なＰ−Ｌ結合を開裂することができず、より長いフラグメント、ＥＫＧＰＤＰＬＱを産生する。このことは、カテプシンＫは本質的に破骨細胞だけが発現するプロテアーゼでありそして破骨細胞が骨を吸収するときに石灰化コラーゲンの吸収に関与する重要な酵素であるので、重要である。破骨細胞（又は非常に類似する細胞）は石灰化軟骨の分解にも関与する。石灰化軟骨は成長中の動物の成長板で一時的に形成され、そして成人骨格では全てのタイプの関節の骨と軟骨間の界面にも存在する。関節炎においては、吸収及び骨リモデリングが促進された結果、破骨細胞による石灰化軟骨の広範な吸収が生じるであろう。この過程は、２Ｂ４によって認識されないコラーゲンII型Ｃ−テロペプチド（ＥＫＧＰＤＰＬＱ）を血流中に放出することができる。
【００１８】
II型コラーゲンテロペプチドアナライトの尿中形態は、ＥＫＧＰＤＰ又はこれより小さいので、尿に放出される前に腎臓及び／又は肝臓内のプロテアーゼがＣ末端−ＬＱを除去している。それ故、免疫反応性col2ＣＴxの次の２つの起源を特定することができる：（１）ＭＭＰによってマトリックスコラーゲンを分解するように活性化された軟骨細胞による直接的産生、及び（２）石灰化軟骨の破骨細胞吸収による循環産生物からの腎臓及び／又は肝臓における二次的な産生。
【００１９】
関節炎（リウマチ様関節炎（ＲＡ）及び骨関節炎（ＯＡ））においては、ＭＭＰは関節軟骨のコラーゲン性マトリックス破壊における重要な作用物であることが知られている。両形態の関節炎においては、骨構造も大いに影響を受ける。ＲＡにおいては、骨粗鬆症は炎症性サイトカインの影響によって疾患過程自体から直接及びコルチコステロイド療法の副作用として、これらの両方で生じる通常の結果である。骨吸収の促進は関係のある関節で最も顕著であり、そしてこれには関節表面下の石灰化軟骨の除去が含まれよう。ＯＡにおいては、骨増殖体（骨副産物）がしばしば、関節病理学で突出した特徴となる。ここでもまた、骨増殖体成長の一部として石灰化軟骨が形成されそしてその後分解されよう（後者は破骨細胞によって）。それ故、関節炎の主要な両形態をモニターしそして管理するために、ＭＭＰ介在性及び破骨細胞介在性（カテプシンＫ）II型コラーゲン破壊を識別測定することが望ましいであろう。血液又は滑液中では、col2ＣＴx（ＥＫＧＰＤＰ）の測定は前者の活性を示すことができ、一方破骨細胞産生物（ＥＫＧＰＤＰＬＱ）の測定は後者の活性を示すことができる。加えて、尿col2ＣＴxは総吸収（非鉱質化及び鉱質化軟骨の両方）の指数を提供することができる。このような尿アッセイは好ましくは、尿試料のクレアチニン含有量を測定し、そして抗体の検出された結合対クレアチニン含有量の比を相関させて尿量に関係のない総II型コラーゲン吸収の尿指数を提供する段階を含んでいる。
【００２０】
本発明主題のＥＫＧＰＤＰ及びＥＫＧＰＤＰＬＱ免疫活性の識別測定は、個々の患者の疾患活性の評価で診断的価値を有している。総骨吸収活性を評価するＩ型コラーゲンマーカーの測定及び／又は他の非鉱質化連結組織破壊原因を評価するIII型コラーゲンマーカーの測定を組み合わせると、適切な療法を指示することができそしてその所望の効果をモニターすることができる。同様に、このような識別アッセイを使用して、新規な医薬品候補を同定し（インビトロでそして動物で）、そして標的組織及び細胞プロセスに与える所望の有益な効果を証明するための臨床試験における代用マーカーを提供することができる。
【００２１】
この目的のためのＩ型コラーゲン吸収マーカーの代表的なアッセイには、Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド（Osteomark（登録商標）、Ostex International、ワシントン州シアトル）、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド（CrossLaps（登録商標）、Osteometer Biotech、デンマーク国ヘーレブ）及び遊離リシルピリジノリン架橋（Pyrilinks（登録商標）-D、Metra Biosystems、カリフォルニア州マウンテンビュー）が含まれる。
【００２２】
III型コラーゲン吸収マーカーの代表的なアッセイには、III型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド及びIII型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドが含まれる。このようなアッセイは米国特許第５，５３２，１６９号、米国特許第５，６４１，６８７号及び米国出願番号０８／９２３，１７５に開示されている。III型コラーゲン吸収マーカーを使用して、血管コラーゲン分解（アテローム性動脈硬化症）、肺組織分解（例えば、気腫及び他の破壊性肺疾患）、筋肉消耗、高齢者の脆弱症候群、肝疾患、甲状腺機能亢進、連結組織に与える糖尿病の二次的影響、並びに非鉱質化連結組織破壊を促進する他の炎症性及び感染性状態を評価することができる。
【００２３】
かくして、本発明は、第１の実施態様では、或る生理学的状態を示すアナライトの存在について体液試料を分析する改良された方法を提供し、この方法は該体液試料を該アナライトと結合する抗体と接触させ、この体液試料中の抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでおり、そして該改良方法は血清試料を
【００２４】
【化１６】
と結合するが
【００２５】
【化１７】
【００２６】
（上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない抗体と接触させ、そして検出された結合を非鉱質化II型コラーゲンのインビボ吸収と相関させることを含んでいる。
【００２７】
第２の実施態様では、本発明は或る生理学的状態を示すアナライトの存在について体液試料を分析する改良された方法を提供し、この方法は該体液試料を該アナライトと結合する抗体と接触させ、この体液試料中の抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでおり、そして該改良方法は血清試料を
【００２８】
【化１８】
と結合するが、
【００２９】
【化１９】
【００３０】
（上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない抗体と接触させ、そして検出された結合を鉱質化II型コラーゲンのインビボ吸収と相関させることを含んでいる。
【００３１】
第３の実施態様では、本発明は或る生理学的状態を示すアナライトの存在について体液試料を分析する改良された方法を提供し、この方法は該体液試料を該アナライトと結合する抗体と接触させ、この体液試料中の抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでおり、そして該改良方法は尿試料を
【００３２】
【化２０】
と結合するが、
【００３３】
【化２１】
【００３４】
（上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない抗体と接触させ、そして検出された結合を非鉱質化と鉱質化の両方のII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させることを含んでいる。
【００３５】
第４の実施態様では、本発明は或る生理学的状態を示すアナライトの存在について体液試料を分析する改良された方法を提供し、この方法は該体液試料を該アナライトと結合する抗体と接触させ、この体液試料中の抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでおり、そして該改良方法は血清試料を
【００３６】
【化２２】
と結合するが、
【００３７】
【化２３】
とは結合しない第１の抗体と接触させ、そして該血清試料を
【００３８】
【化２４】
と結合するが
【００３９】
【化２５】
【００４０】
（上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない第２の抗体と接触させ、そして該第１及び第２の抗体の検出された総結合を鉱質化及び非鉱質化の両方のII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させることを含んでいる。
【００４１】
第５の実施態様では、本発明は或る生理学的状態を示すアナライトの存在について体液試料を分析する改良された方法を提供し、この方法は該体液試料を該アナライトと結合する抗体と接触させ、この体液試料中の抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでおり、そして該改良方法は血清試料を
【００４２】
【化２６】
と結合するが、
【００４３】
【化２７】
とは結合しない第１の抗体と接触させ、そして尿試料を
【００４４】
【化２８】
と結合するが
【００４５】
【化２９】
【００４６】
（上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない第２の抗体と接触させ、そして該第１の抗体の検出された結合を鉱質化II型コラーゲンのインビボ吸収と相関させ、そして該第２の抗体の検出された結合を鉱質化及び非鉱質化の両方のII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させることを含んでいる。
【００４７】
本明細書中の用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びこれらの抗原結合性フラグメントを包含するものである。このようなＥＫＧＰＤＰＬＱ結合性及びＥＫＧＰＤ（Ｐ）（Ｌ）結合性抗体は、当該技術分野において周知の標準的な方法で産生させることができる。代表的なプロトコールは次のとおりである。
【００４８】
ＥＫＧＰＤＰＬＱハイブリドーマの調製：雌ＲＢＦ／ＤｎＪマウスに、完全フロイントアジュバントと、グルタルアルデヒドを介して担体タンパク質キーホールリンペット・ヘマシアニン（ＫＬＨ）に架橋したＥＫＧＰＤＰＬＱ合成ペプチド（ＫＬＨ−ＥＫＧＰＤＰＬＱ）とのエマルジョンを腹腔内に（ｉｐ）注射する。１カ月後、ＫＬＨ−ＥＫＧＰＤＰＬＱのブースター注射を不完全フロイントアジュバントとのエマルジョンでｉｐ投与する。概ね８週間後、マウスを屠殺し、そして脾細胞を、ポリエチレングリコールによって、ＦＯＸ−ＮＹマウスミエローマ細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７３２）と融合させる。融合細胞は、アデニン、アミノプテリン及びチミジン（ＡＡＴ）を含有する選択培地の９６ウェルのプレート中で増殖させる。
【００４９】
概ね１週間後、融合ハイブリドーマコロニー培養上清液は、グルタルアルデヒドを介してウシ血清アルブミンに架橋したＥＫＧＰＤＰＬＱ合成ペプチド（ＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰＬＱ）との反応性について、ＥＬＩＳＡ法で試験する。ＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰＬＱと反応性の抗体を産生するハイブリドーマコロニーは、他の合成ペプチド配列に対するＥＬＩＳＡ法における反応の特異性について二次的に試験する。試験したものの中には、グルタルアルデヒドを介してＢＳＡに架橋したＥＫＧＰＤＰ合成ペプチド（ＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰ）がある。ＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰＬＱとの反応が陽性であり、そしてＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰとの反応が陰性であるハイブリドーマコロニーを凍結保存する。候補ハイブリドーマは、限界希釈法でモノクローン性になるまでクローン化する。
競合ＥＬＩＳＡ法では、可溶性ＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰＬＱだけでなくヒト血清標本も、候補抗体に関して固相ＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰＬＱと競合することが見られる。
【００５０】
免疫化及びスクリーニング目的のために、II型コラーゲンのカテプシンＫ消化物を調製することもできる。プロテオグリカンは、タンパク質変性剤、例えば４ＭグアニジンＨＣｌを使用してヒト関節軟骨の組織試料から抽出される。残渣を水で洗浄し、そして組換えカテプシンＫで消化する（３７℃、ｐＨ５．８）。この消化物を高速液体クロマトグラフィーで、例えば逆相でフラクション化し、そしてピリジノリン架橋を含有するフラクションは３９０ｎｍでの蛍光放射（２９７ｎｍ励起）でモニターする。配列ＥＫＧＰＤＰＬＱの架橋Ｃ−テロペプチドを含有する蛍光フラクションは、Ｎ末端配列分析で同定される。このフラクションはブースター注射、スクリーニング目的及び抗体特異性確認用に使用することができる。
【００５１】
本発明の主題抗体は、当該技術分野で良く知られている多種多様な免疫アッセイフォーマットで使用することができる。例えば、ハーロー（Harlow）及びレーン（Lane）、抗体（Antibodies）：実験室マニュアル（Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、５５３〜６１２頁、１９８８年；免疫アッセイの原理と実務（Principles and Practice of Immunoassay）、プライス（Price）及びニューマン（Newman）（編集）、ストックトン・プレス（Stockton Press）、１９９１年；並びに免疫アッセイ（Immunoassay）、ダイアマンディス（Diamandis）及びクリストポウロス（Christopoulos）（編集）、アカデミック・プレス（Academic Press）、１９９６年、参照。
【００５２】
本特許出願で引用した先行する科学刊行物及び特許刊行物の開示は、全て参照して本明細書に組み入れる。
本発明は好ましい実施態様に関連して記載したが、上記明細書を読んだ後に通常の技倆を有する者は、本明細書に述べられている主題に対して種々の変更、均等物置換及び改変を行うことができよう。それ故、本発明は本明細書で特定的に記載されている方法以外の方法で実施することができる。それ故、特許によって本発明に付与される保護は、特許請求の範囲及びそれらの均等物によってしか限定されないことが意図されている。
【配列表】
本出願は１９９８年６月１９日に出願された仮出願番号６０／０８９，８２３の一部継続出願である。
本発明は国立衛生研究所から授与された助成金ＡＲ３７３１８及びＡＲ３６７９４の１つ又はそれより多くの政府援助でなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有している。
【０００２】
（発明の分野）
本発明はII型コラーゲン（軟骨）のインビボ（in vivo）吸収を示す架橋テロペプチドアナライト（分析物）を検出するアッセイに関しており、そして特に鉱質化していない軟骨と鉱質化した軟骨の吸収を測定し、識別する免疫アッセイ、並びに軟骨の総インビボ吸収を測定する免疫アッセイを提供する。
【０００３】
（発明の背景）
本出願人の先の米国特許第４，９７３，６６６号、第５，１４０，１０３号、第５，３００，４３４号、第５，３２０，９７０号、第５，８１７，７５５号及び第５，７０２，９０９号を参照し、そしてこれらは参照して本明細書に組み入れる。
コラーゲンのインビボ吸収を示すテロペプチドアナライトを検出する免疫アッセイが知られている。骨吸収を測定する上記のようなＩ型コラーゲンアッセイの例には：ＷＯ８９／０４４９１（Eyre）；ＷＯ８９／１２８２４（Robins）；ＷＯ９１／０８４７８（Eyre）；ＥＰ０５０５２１０Ａ２（Risteli & Risteli）；ＷＯ９２／２１６９８（Eyre）；ＷＯ９４／０３８１３（Naser等）；ＷＯ９４／１４８４４（Baylink）；ＷＯ９５／０４２８２（Naser等）；ＷＯ９５／０８１１５（Qvist & Bonde）；ＷＯ９６／１２１９３（Bonde & Qvist）；ＥＰ０７１８３０９Ａ１（Naser等）；及びＷＯ９６／３６６４５（Eyre等）が含まれる。
【０００４】
軟骨吸収を測定するII型コラーゲンテロペプチドアッセイの例には、ＷＯ９１／０８４７８（Eyre）；ＷＯ９５／０８１１５（Qvist & Bonde）；及びＷＯ９６／１２１９３（Bonde & Qvist）が含まれる。
III型コラーゲンテロペプチドアッセイの例には、ＷＯ８８／０８９８０
（Risteli & Risteli）及びＷＯ９１／０８４７８（Eyre）が含まれる。
【０００５】
以下の特許の開示も重要である：米国特許第４，６２８，０２７号（Gay）は、連結組織タンパク質のモノクローナル抗体を使用するインビトロ診断方法を開示している。米国特許第５，３１６，９１４号（Oshima等）は、肝臓疾患の診断に適用できるヒトIII、IV及びVI型コラーゲンの酵素サンドイッチ免疫アッセイを開示している。ＷＯ９４／１４０７０（Poole & Hollander）は、軟骨におけるコラーゲン開裂を測定する免疫アッセイを開示している。ＷＯ９４／１８５６３（Barrach等）は、関節炎に関連したII型コラーゲン由来のペプチドを検出するサンドイッチ免疫アッセイ方法を開示している。
【０００６】
本出願人の先の国際公開、ＷＯ９１／０８４７８が特に重要である。これは、II型コラーゲンの次の尿吸収産生物：
【０００７】
【化１５】
（式中、括弧は選択自由のアミノ酸残基を示し、そしてＨｙｌ−Ｈｙｌ−Ｈｙｌとして表されている架橋残基はヒドロキシリシルピリジノリン（ＨＰ）、即ち種々の組織の成熟コラーゲン原繊維中に存在する天然の３−ヒドロキシピリジニウム残基である）を開示している。これらのアナライトはII型コラーゲンのＣ末端架橋テロペプチドドメインに由来するので、本明細書では集合的に「col2ＣＴx」と表される。
【０００９】
本発明の開示はまた、アミノ酸を略記する１文字記号も採用する；それ故、上記で示したアナライトのＧｌｕ−Ｈｙｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−（Ｐｒｏ）−（Ｌｅｕ）テロペプチド構成成分は、本明細書では以下、ＥＫＧＰＤ（配列番号１）、ＥＫＧＰＤＰ（配列番号２）及びＥＫＧＰＤＰＬ（配列番号３）と表される。更に、本明細書で使用するとき、記号「Ｋ」は線状ペプチドの場合におけるリシンを表すか、又はヒドロキシリシルピリジノリン（ＨＰ）及びリシルピリジノリン（ＬＰ）のなかから選択される架橋３−ヒドロキシピリジニウム残基を表す。
【００１０】
本出願人と同僚は最近の抄録中でもcol2ＣＴxを記載している：エア（Eyre）等、Bone Miner. Res. １１（Ｓ１）：Ｓ４１３、１９９６年は、ヒト尿中のＩ、II及びIII型コラーゲンから得られる架橋テロペプチドを記載している。
アトレィ（Atley）等、Arth. Rheum. ４０（９Ｓ）：５８４、１９９７年は、ＲＳ−１３０８３０、コラーゲナーゼ−３の選択的インヒビターが、ＩＬ−１αに曝露されたウシ軟骨からのヒドロキシプロリン及びメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）特異的ネオエピトープ、col2ＣＴx、の放出を阻害することを報告している。
【００１１】
アトレィ等、Trans. Orthop. Res. Soc.、ニューオーリンズ、１９９８年は、軟骨II型コラーゲンからの免疫反応性テロペプチドのマトリックスメタロプロテイナーゼ介在性放出を報告している。この研究の目的は、α１（II）Ｃ−テロペプチドＥＫＧＰＤＰのドメインを認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）２Ｂ４に基づく免疫アッセイが、軟骨内のＭＭＰ開裂産生物を測定するのかどうかを評価することであった。図１を参照すると、ｍＡｂ ２Ｂ４は合成ペプチドＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＲＡ（配列番号５）のマトリリシン消化インビトロ産生物ＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰ（配列番号４）を認識するが、ＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱ（配列番号６）、ＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＹ（配列番号７）、ＬＱＹＭＲＡ（配列番号８）又はＹＭＲＡ（配列番号９）は認識しない。これらの著者はまた、滑液、血清及び尿中におけるｍＡｂ ２Ｂ４免疫反応性の検出も認めた。彼等はこの２Ｂ４エピトープが、II型コラーゲンのインビボ吸収の有用なマーカーである可能性を有していると結論した。
【００１２】
モスコヴィッツ（Moskowitz）等、Amer. Coll. Rheum.、カリフォルニア州サンジエゴ、１９９８年１１月８〜１２日は、II型コラーゲンＣ−テロペプチド２Ｂ４エピトープが家族性骨関節症における軟骨吸収のマーカーであることを報告している。
アトレィ等、合同整形外科研究学会会議（Combined Orthopaedic Research Societies Meeting）、フランス国ビッテル、１９９８年９月２８〜３０日は、尿中のII型コラーゲン分解による架橋テロペプチド産生物（col2ＣＴx）を含む、骨及びコラーゲン分解の生化学的マーカーを議論している。
更に、報告によれば、リウマチ様関節炎の診断用マーカーとしてII型コラーゲンのＣ−テロペプチドに対するモノクローナル抗体がオステオメーター・バイオテク（Osteometer Biotech）Ａ／Ｓで開発中である。バイオ・ワールド・インターナショナル（Bio World International）、３頁、１９９７年１２月３日。
【００１３】
（発明の要約）
本発明は、II型コラーゲン（軟骨）のインビボ吸収を測定する改良されたアッセイを提供する。本主題の免疫アッセイは非鉱質化軟骨の吸収と鉱質化軟骨の吸収を識別し、そして総軟骨インビボ吸収を測定するのに有用である。これらの開示された免疫アッセイは、２つの抗体のうちの１つか又はそれらを組み合わせて使用する。第１の抗体はＥＫＧＰＤＰ（配列番号２）と結合するがＥＫＧＰＤＰＬＱ（配列番号１０）とは結合しない；その際、上記式中、Ｋの記号は好ましくは架橋３−ヒドロキシピリジニウム残基を表す。該第１の抗体と結合する血清中のアナライトを測定することによって、非鉱質化軟骨のインビボ吸収の指標が提供される。
第２の抗体はＥＫＧＰＤＰＬＱと結合するが、ＥＫＧＰＤＰとは結合しない；その際、上記式においても、Ｋの記号は好ましくは架橋３−ヒドロキシピリジニウム残基を表す。該第２の抗体と結合する血清中のアナライトを測定することによって、鉱質化軟骨のインビボ吸収の指標が提供される。
【００１４】
総（非鉱質化及び鉱質化）軟骨インビボ吸収の指標は、該第１の抗体と結合する尿中のアナライトを測定することによってか、又は該第１及び第２の抗体と結合する血清中の総アナライトを測定することによって提供される。
本発明の主題軟骨マーカーは、好ましくは、Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド及び遊離リシルピリジノリン（デオキシピリジノリン）架橋のなかから選択される、骨コラーゲン吸収マーカーと関連させて測定される。
【００１５】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
モノクローナル抗体２Ｂ４は、配列ＥＫＧＰＤＰ中のＣ末端エピトープを認識する。この抗体ではＣ末端プロリンが結合していない（即ち、Ｐｒｏ−Ｃ００Ｈ）ことが必要であり、そしてこの抗体にとってはＫがその側鎖（イプシロン）アミノ基を介して誘導体化されている（例えば、架橋されている）ことが好ましい。このプロリンに対して余分のＣ末端アミノ酸が存在すると、このペプチドドメインに対するｍＡｂ ２Ｂ４の結合が妨げられる。
【００１６】
コラーゲナーゼ（ＭＭＰ１及びＭＭＰ１３）、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ２及び９）、ストロメリシン（ＭＭＰ３）及びマトリリシン（ＭＭＰ７）を含む種々のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、軟骨II型コラーゲン又は合成Ｃ−テロペプチドドメイン（ＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＲＡ）からｍＡｂ ２Ｂ４エピトープを産生させることができる。マトリリシン（ＭＭＰ７）は、組換え酵素を使用するインビトロ試験に基づけば、最も強力である。
【００１７】
しかしながら、カテプシンＫは２Ｂ４エピトープ放出に必要なＰ−Ｌ結合を開裂することができず、より長いフラグメント、ＥＫＧＰＤＰＬＱを産生する。このことは、カテプシンＫは本質的に破骨細胞だけが発現するプロテアーゼでありそして破骨細胞が骨を吸収するときに石灰化コラーゲンの吸収に関与する重要な酵素であるので、重要である。破骨細胞（又は非常に類似する細胞）は石灰化軟骨の分解にも関与する。石灰化軟骨は成長中の動物の成長板で一時的に形成され、そして成人骨格では全てのタイプの関節の骨と軟骨間の界面にも存在する。関節炎においては、吸収及び骨リモデリングが促進された結果、破骨細胞による石灰化軟骨の広範な吸収が生じるであろう。この過程は、２Ｂ４によって認識されないコラーゲンII型Ｃ−テロペプチド（ＥＫＧＰＤＰＬＱ）を血流中に放出することができる。
【００１８】
II型コラーゲンテロペプチドアナライトの尿中形態は、ＥＫＧＰＤＰ又はこれより小さいので、尿に放出される前に腎臓及び／又は肝臓内のプロテアーゼがＣ末端−ＬＱを除去している。それ故、免疫反応性col2ＣＴxの次の２つの起源を特定することができる：（１）ＭＭＰによってマトリックスコラーゲンを分解するように活性化された軟骨細胞による直接的産生、及び（２）石灰化軟骨の破骨細胞吸収による循環産生物からの腎臓及び／又は肝臓における二次的な産生。
【００１９】
関節炎（リウマチ様関節炎（ＲＡ）及び骨関節炎（ＯＡ））においては、ＭＭＰは関節軟骨のコラーゲン性マトリックス破壊における重要な作用物であることが知られている。両形態の関節炎においては、骨構造も大いに影響を受ける。ＲＡにおいては、骨粗鬆症は炎症性サイトカインの影響によって疾患過程自体から直接及びコルチコステロイド療法の副作用として、これらの両方で生じる通常の結果である。骨吸収の促進は関係のある関節で最も顕著であり、そしてこれには関節表面下の石灰化軟骨の除去が含まれよう。ＯＡにおいては、骨増殖体（骨副産物）がしばしば、関節病理学で突出した特徴となる。ここでもまた、骨増殖体成長の一部として石灰化軟骨が形成されそしてその後分解されよう（後者は破骨細胞によって）。それ故、関節炎の主要な両形態をモニターしそして管理するために、ＭＭＰ介在性及び破骨細胞介在性（カテプシンＫ）II型コラーゲン破壊を識別測定することが望ましいであろう。血液又は滑液中では、col2ＣＴx（ＥＫＧＰＤＰ）の測定は前者の活性を示すことができ、一方破骨細胞産生物（ＥＫＧＰＤＰＬＱ）の測定は後者の活性を示すことができる。加えて、尿col2ＣＴxは総吸収（非鉱質化及び鉱質化軟骨の両方）の指数を提供することができる。このような尿アッセイは好ましくは、尿試料のクレアチニン含有量を測定し、そして抗体の検出された結合対クレアチニン含有量の比を相関させて尿量に関係のない総II型コラーゲン吸収の尿指数を提供する段階を含んでいる。
【００２０】
本発明主題のＥＫＧＰＤＰ及びＥＫＧＰＤＰＬＱ免疫活性の識別測定は、個々の患者の疾患活性の評価で診断的価値を有している。総骨吸収活性を評価するＩ型コラーゲンマーカーの測定及び／又は他の非鉱質化連結組織破壊原因を評価するIII型コラーゲンマーカーの測定を組み合わせると、適切な療法を指示することができそしてその所望の効果をモニターすることができる。同様に、このような識別アッセイを使用して、新規な医薬品候補を同定し（インビトロでそして動物で）、そして標的組織及び細胞プロセスに与える所望の有益な効果を証明するための臨床試験における代用マーカーを提供することができる。
【００２１】
この目的のためのＩ型コラーゲン吸収マーカーの代表的なアッセイには、Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド（Osteomark（登録商標）、Ostex International、ワシントン州シアトル）、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド（CrossLaps（登録商標）、Osteometer Biotech、デンマーク国ヘーレブ）及び遊離リシルピリジノリン架橋（Pyrilinks（登録商標）-D、Metra Biosystems、カリフォルニア州マウンテンビュー）が含まれる。
【００２２】
III型コラーゲン吸収マーカーの代表的なアッセイには、III型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド及びIII型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドが含まれる。このようなアッセイは米国特許第５，５３２，１６９号、米国特許第５，６４１，６８７号及び米国出願番号０８／９２３，１７５に開示されている。III型コラーゲン吸収マーカーを使用して、血管コラーゲン分解（アテローム性動脈硬化症）、肺組織分解（例えば、気腫及び他の破壊性肺疾患）、筋肉消耗、高齢者の脆弱症候群、肝疾患、甲状腺機能亢進、連結組織に与える糖尿病の二次的影響、並びに非鉱質化連結組織破壊を促進する他の炎症性及び感染性状態を評価することができる。
【００２３】
かくして、本発明は、第１の実施態様では、或る生理学的状態を示すアナライトの存在について体液試料を分析する改良された方法を提供し、この方法は該体液試料を該アナライトと結合する抗体と接触させ、この体液試料中の抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでおり、そして該改良方法は血清試料を
【００２４】
【化１６】
【００２５】
【化１７】
（上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない抗体と接触させ、そして検出された結合を非鉱質化II型コラーゲンのインビボ吸収と相関させることを含んでいる。
【００２７】
第２の実施態様では、本発明は或る生理学的状態を示すアナライトの存在について体液試料を分析する改良された方法を提供し、この方法は該体液試料を該アナライトと結合する抗体と接触させ、この体液試料中の抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでおり、そして該改良方法は血清試料を
【００２８】
【化１８】
【００２９】
【化１９】
（上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない抗体と接触させ、そして検出された結合を鉱質化II型コラーゲンのインビボ吸収と相関させることを含んでいる。
【００３１】
第３の実施態様では、本発明は或る生理学的状態を示すアナライトの存在について体液試料を分析する改良された方法を提供し、この方法は該体液試料を該アナライトと結合する抗体と接触させ、この体液試料中の抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでおり、そして該改良方法は尿試料を
【００３２】
【化２０】
【００３３】
【化２１】
（上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない抗体と接触させ、そして検出された結合を非鉱質化と鉱質化の両方のII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させることを含んでいる。
【００３５】
第４の実施態様では、本発明は或る生理学的状態を示すアナライトの存在について体液試料を分析する改良された方法を提供し、この方法は該体液試料を該アナライトと結合する抗体と接触させ、この体液試料中の抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでおり、そして該改良方法は血清試料を
【００３６】
【化２２】
【００３７】
【化２３】
【００３８】
【化２４】
【００３９】
【化２５】
（上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない第２の抗体と接触させ、そして該第１及び第２の抗体の検出された総結合を鉱質化及び非鉱質化の両方のII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させることを含んでいる。
【００４１】
第５の実施態様では、本発明は或る生理学的状態を示すアナライトの存在について体液試料を分析する改良された方法を提供し、この方法は該体液試料を該アナライトと結合する抗体と接触させ、この体液試料中の抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでおり、そして該改良方法は血清試料を
【００４２】
【化２６】
【００４３】
【化２７】
【００４４】
【化２８】
【００４５】
【化２９】
（上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない第２の抗体と接触させ、そして該第１の抗体の検出された結合を鉱質化II型コラーゲンのインビボ吸収と相関させ、そして該第２の抗体の検出された結合を鉱質化及び非鉱質化の両方のII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させることを含んでいる。
【００４７】
本明細書中の用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びこれらの抗原結合性フラグメントを包含するものである。このようなＥＫＧＰＤＰＬＱ結合性及びＥＫＧＰＤ（Ｐ）（Ｌ）結合性抗体は、当該技術分野において周知の標準的な方法で産生させることができる。代表的なプロトコールは次のとおりである。
【００４８】
ＥＫＧＰＤＰＬＱハイブリドーマの調製：雌ＲＢＦ／ＤｎＪマウスに、完全フロイントアジュバントと、グルタルアルデヒドを介して担体タンパク質キーホールリンペット・ヘマシアニン（ＫＬＨ）に架橋したＥＫＧＰＤＰＬＱ合成ペプチド（ＫＬＨ−ＥＫＧＰＤＰＬＱ）とのエマルジョンを腹腔内に（ｉｐ）注射する。１カ月後、ＫＬＨ−ＥＫＧＰＤＰＬＱのブースター注射を不完全フロイントアジュバントとのエマルジョンでｉｐ投与する。概ね８週間後、マウスを屠殺し、そして脾細胞を、ポリエチレングリコールによって、ＦＯＸ−ＮＹマウスミエローマ細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７３２）と融合させる。融合細胞は、アデニン、アミノプテリン及びチミジン（ＡＡＴ）を含有する選択培地の９６ウェルのプレート中で増殖させる。
【００４９】
概ね１週間後、融合ハイブリドーマコロニー培養上清液は、グルタルアルデヒドを介してウシ血清アルブミンに架橋したＥＫＧＰＤＰＬＱ合成ペプチド（ＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰＬＱ）との反応性について、ＥＬＩＳＡ法で試験する。ＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰＬＱと反応性の抗体を産生するハイブリドーマコロニーは、他の合成ペプチド配列に対するＥＬＩＳＡ法における反応の特異性について二次的に試験する。試験したものの中には、グルタルアルデヒドを介してＢＳＡに架橋したＥＫＧＰＤＰ合成ペプチド（ＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰ）がある。ＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰＬＱとの反応が陽性であり、そしてＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰとの反応が陰性であるハイブリドーマコロニーを凍結保存する。候補ハイブリドーマは、限界希釈法でモノクローン性になるまでクローン化する。
競合ＥＬＩＳＡ法では、可溶性ＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰＬＱだけでなくヒト血清標本も、候補抗体に関して固相ＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰＬＱと競合することが見られる。
【００５０】
免疫化及びスクリーニング目的のために、II型コラーゲンのカテプシンＫ消化物を調製することもできる。プロテオグリカンは、タンパク質変性剤、例えば４ＭグアニジンＨＣｌを使用してヒト関節軟骨の組織試料から抽出される。残渣を水で洗浄し、そして組換えカテプシンＫで消化する（３７℃、ｐＨ５．８）。この消化物を高速液体クロマトグラフィーで、例えば逆相でフラクション化し、そしてピリジノリン架橋を含有するフラクションは３９０ｎｍでの蛍光放射（２９７ｎｍ励起）でモニターする。配列ＥＫＧＰＤＰＬＱの架橋Ｃ−テロペプチドを含有する蛍光フラクションは、Ｎ末端配列分析で同定される。このフラクションはブースター注射、スクリーニング目的及び抗体特異性確認用に使用することができる。
【００５１】
本発明の主題抗体は、当該技術分野で良く知られている多種多様な免疫アッセイフォーマットで使用することができる。例えば、ハーロー（Harlow）及びレーン（Lane）、抗体（Antibodies）：実験室マニュアル（Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、５５３〜６１２頁、１９８８年；免疫アッセイの原理と実務（Principles and Practice of Immunoassay）、プライス（Price）及びニューマン（Newman）（編集）、ストックトン・プレス（Stockton Press）、１９９１年；並びに免疫アッセイ（Immunoassay）、ダイアマンディス（Diamandis）及びクリストポウロス（Christopoulos）（編集）、アカデミック・プレス（Academic Press）、１９９６年、参照。
【００５２】
本特許出願で引用した先行する科学刊行物及び特許刊行物の開示は、全て参照して本明細書に組み入れる。
本発明は好ましい実施態様に関連して記載したが、上記明細書を読んだ後に通常の技倆を有する者は、本明細書に述べられている主題に対して種々の変更、均等物置換及び改変を行うことができよう。それ故、本発明は本明細書で特定的に記載されている方法以外の方法で実施することができる。それ故、特許によって本発明に付与される保護は、特許請求の範囲及びそれらの均等物によってしか限定されないことが意図されている。
【配列表】
Claims (17)
- 体液試料を、生理学的状態を示すアナライトと結合する抗体と接触させ、該体液試料中の該抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでいる、該アナライトの存在について該体液試料を分析する方法において、血清試料を
- 該血清試料を、Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド及び遊離リシルピリジノリン架橋のなかから選択される骨吸収マーカーと結合する第２の抗体と接触させ、そして該試料中の該第２の抗体の検出された結合を骨のインビボ吸収と相関させる段階を更に含んでいる請求項１に記載の方法。
- 該血清試料を、III型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド及びIII型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドのなかから選択されるIII型コラーゲン吸収マーカーと結合する第２の抗体と接触させ、そして該試料中の該第２の抗体の検出された結合をIII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させる段階を更に含んでいる請求項１に記載の方法。
- 体液試料を、生理学的状態を示すアナライトと結合する抗体と接触させ、該体液試料中の該抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでいる、該アナライトの存在について該体液試料を分析する方法において、血清試料を
- 該血清試料を、Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド及び遊離リシルピリジノリン架橋のなかから選択される骨吸収マーカーと結合する第２の抗体と接触させ、そして該試料中の該第２の抗体の検出された結合を骨のインビボ吸収と相関させる段階を更に含んでいる請求項４に記載の方法。
- 該血清試料を、III型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド及びIII型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドのなかから選択されるIII型コラーゲン吸収マーカーと結合する第２の抗体と接触させ、そして該試料中の該第２の抗体の検出された結合をIII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させる段階を更に含んでいる請求項４に記載の方法。
- 体液試料を、生理学的状態を示すアナライトと結合する抗体と接触させ、該体液試料中の該抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでいる、該アナライトの存在について体液試料を分析する方法において、尿試料を
- 該尿試料のクレアチニン含有量を測定し、そして該抗体の検出された結合対クレアチニン含有量の比を相関させて尿量と関係のないII型コラーゲンの総吸収の尿指数を得る段階を更に含んでいる請求項７に記載の方法。
- 該尿試料を、Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド及び遊離リシルピリジノリン架橋のなかから選択される骨吸収マーカーと結合する第２の抗体と接触させ、そして該試料中の該第２の抗体の検出された結合を骨のインビボ吸収と相関させる段階を更に含んでいる請求項７に記載の方法。
- 該尿試料を、III型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド及びIII型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドのなかから選択されるIII型コラーゲン吸収マーカーと結合する第２の抗体と接触させ、そして該試料中の該第２の抗体の検出された結合をIII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させる段階を更に含んでいる請求項７に記載の方法。
- 体液試料を、生理学的状態を示すアナライトと結合する抗体と接触させ、該体液試料中の該抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでいる、該アナライトの存在について体液試料を分析する方法において、血清試料を
- 該血清試料を、Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド及び遊離リシルピリジノリン架橋のなかから選択される骨吸収マーカーと結合する第３の抗体と接触させ、そして該試料中の該第３の抗体の検出された結合を骨のインビボ吸収と相関させる段階を更に含んでいる請求項１１に記載の方法。
- 該血清試料を、III型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド及びIII型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドのなかから選択されるIII型コラーゲン吸収マーカーと結合する第３の抗体と接触させ、そして該試料中の該第３の抗体の検出された結合をIII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させる段階を更に含んでいる請求項１１に記載の方法。
- 体液試料を、生理学的状態を示すアナライトと結合する抗体と接触させ、該体液試料中の該抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでいる、該アナライトの存在について該体液試料を分析する方法において、血清試料を
- 該尿試料のクレアチニン含有量を測定し、そして該第２の抗体の検出された結合対該クレアチニン含有量の比を相関させて尿量と関係のないII型コラーゲンの総吸収の尿指数を得る段階を更に含んでいる請求項１４に記載の方法。
- 該血清及び尿試料のうちの少なくとも１つを、Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド及び遊離リシルピリジノリン架橋のなかから選択される骨吸収マーカーと結合する第３の抗体と接触させ、そして該試料中の該第３の抗体の検出された結合を骨のインビボ吸収と相関させる段階を更に含んでいる請求項１４に記載の方法。
- 該血清及び尿試料のうちの少なくとも１つを、III型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド及びIII型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドのなかから選択されるIII型コラーゲン吸収マーカーと結合する第３の抗体と接触させ、そして該試料中の該第３の抗体の検出された結合をIII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させる段階を更に含んでいる請求項１４に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8982398P | 1998-06-19 | 1998-06-19 | |
| US60/089,823 | 1998-06-19 | ||
| PCT/US1999/013716 WO1999066327A2 (en) | 1998-06-19 | 1999-06-17 | Cartilage resorption assays |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002518676A JP2002518676A (ja) | 2002-06-25 |
| JP4436972B2 true JP4436972B2 (ja) | 2010-03-24 |
Family
ID=22219750
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000555095A Expired - Fee Related JP4436972B2 (ja) | 1998-06-19 | 1999-06-17 | 軟骨吸収アッセイ |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6255056B1 (ja) |
| EP (1) | EP1088228B1 (ja) |
| JP (1) | JP4436972B2 (ja) |
| AT (1) | ATE302949T1 (ja) |
| AU (1) | AU4692199A (ja) |
| DE (2) | DE19980834T1 (ja) |
| DK (1) | DK1088228T3 (ja) |
| WO (1) | WO1999066327A2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050124071A1 (en) * | 2003-09-30 | 2005-06-09 | Kraus Virginia B. | Methods and compositions for diagnosing musculoskeletal, arthritic and joint disorders by biomarker dating |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4628027A (en) | 1982-05-19 | 1986-12-09 | Molecular Engineering Associates, Ltd. | Vitro diagnostic methods using monoclonal antibodies against connective tissue proteins |
| US5316914A (en) | 1986-09-04 | 1994-05-31 | Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for determining human collagen peptides by way of enzyme immunoassay |
| US5476765A (en) * | 1987-01-09 | 1995-12-19 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptide compositions with immunoreactivities to antibodies to HTLV and as vaccines |
| GB2205643B (en) | 1987-05-08 | 1991-03-13 | Farmos Group Limited | Type iii collagen degradation assay |
| US5320970A (en) | 1987-11-06 | 1994-06-14 | Washington Research Foundation | Detection of collagen degradation in vivo |
| US4973666A (en) | 1987-11-06 | 1990-11-27 | Washington Research Foundation | Peptide fragments containing HP and LP cross-links |
| US5702909A (en) | 1987-11-06 | 1997-12-30 | Washington Research Foundation | Methods of detecting collagen type II degradation in vivo |
| US5300434A (en) | 1987-11-06 | 1994-04-05 | Washington Research Foundation | Hybridoma cell line producing an antibody to type-I collagen amino-terminal telopeptide |
| GB8815174D0 (en) | 1988-06-25 | 1988-08-03 | Rowett Research Inst | Method of monitoring collagen degradation |
| GB9105893D0 (en) | 1991-03-20 | 1991-05-08 | Orion Yhtymae Oy | Bone resorption assay based on a peptide liberated during collagen degradation |
| DE4225038C2 (de) | 1992-07-29 | 1995-11-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Herstellung und Verwendung von Antikörpern gegen Kollagen |
| WO1994014070A1 (en) | 1992-12-04 | 1994-06-23 | Shriners Hospitals For Crippled Children | Immunoassay for the measurement of collagen cleavage in cartilage |
| JPH08505149A (ja) | 1992-12-28 | 1996-06-04 | ジェイ． ベイリンク，デビッド | 骨再吸収検定法 |
| US6653450B1 (en) | 1993-01-28 | 2003-11-25 | Cohesion Technologies, Inc. | Mutated recombinant collagens |
| US5541295A (en) | 1993-02-12 | 1996-07-30 | The Board Of Governors For Higher Education State Of Rhode Island And Providence Plantations | Detection of type II collagen and its peptides |
| EP0711415B1 (de) | 1993-07-28 | 1998-07-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Immunoassay zum nachweis von kollagen typ i oder kollagenfragmenten davon |
| DK104093D0 (da) | 1993-09-17 | 1993-09-17 | Osteometer A S | Fremgangsmaade til bestemmelse af collagen-fragmenter i legemsvaesker, test-kit og midler til udoevelse af fremgangsmaaden og anvendelse af fremgangsmaaden til diagnosticering af lidelser associeret til collagen-metabolismen |
| DE69520111T2 (de) | 1994-10-17 | 2001-09-06 | Osteometer Biotech As Herlev | Schätzung des Fragmentierungsmusters von Kollagen in Körperflüssigkeiten und Diagnose von mit dem Kollagenmetabolismus zusammenhängenden Störungen |
| DE59505585D1 (de) | 1994-12-23 | 1999-05-12 | Roche Diagnostics Gmbh | Antigene und Antikörper zum Nachweis von Kollagen I |
| US5750647A (en) | 1995-05-19 | 1998-05-12 | Washington Research Foundation | Synthetic peptide analogs of NTx |
-
1999
- 1999-06-17 US US09/335,098 patent/US6255056B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-17 AU AU46921/99A patent/AU4692199A/en not_active Abandoned
- 1999-06-17 EP EP99930368A patent/EP1088228B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-17 JP JP2000555095A patent/JP4436972B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-17 DE DE19980834T patent/DE19980834T1/de not_active Withdrawn
- 1999-06-17 DE DE69926888T patent/DE69926888T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-17 AT AT99930368T patent/ATE302949T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-06-17 WO PCT/US1999/013716 patent/WO1999066327A2/en active IP Right Grant
- 1999-06-17 DK DK99930368T patent/DK1088228T3/da active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK1088228T3 (da) | 2006-01-02 |
| DE19980834T1 (de) | 2001-06-13 |
| WO1999066327A3 (en) | 2000-03-09 |
| US6255056B1 (en) | 2001-07-03 |
| EP1088228B1 (en) | 2005-08-24 |
| AU4692199A (en) | 2000-01-05 |
| DE69926888D1 (de) | 2005-09-29 |
| DE69926888T2 (de) | 2006-03-30 |
| EP1088228A2 (en) | 2001-04-04 |
| WO1999066327A2 (en) | 1999-12-23 |
| ATE302949T1 (de) | 2005-09-15 |
| JP2002518676A (ja) | 2002-06-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6095702B2 (ja) | 線維症バイオマーカアッセイ | |
| RU2139541C1 (ru) | Способы определения разрушения коллагена in vivo и наборы для осуществления способов, гибридома, моноклональное антитело и его фрагмент, пептиды, происходящие из коллагена, и способ анализа | |
| JP3423720B2 (ja) | 体液中のコラーゲン断片を測定する方法、該方法を実施するためのテストキット及び手段、並びにコラーゲンの代謝に関連する疾患の存在を診断するために該方法を使用する方法・用途 | |
| JPH08505149A (ja) | 骨再吸収検定法 | |
| US5387504A (en) | Monospecific antibodies and assay system for detecting stromelysin cleavage products | |
| EP1130401A2 (en) | Assays for measurement of type II collagen fragments in urine | |
| JP2000516721A (ja) | 体液中のｄ―アミノ酸の測定法 | |
| WO1998035235A1 (en) | Assay for collagen type ii fragments | |
| JP4436972B2 (ja) | 軟骨吸収アッセイ | |
| US7728112B2 (en) | Method for monitoring collagen type II degradation in cartilage | |
| EP1210606B1 (en) | Cartilage resorption assays | |
| US6916903B2 (en) | Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays | |
| US6348320B1 (en) | Cartilage resorption assays measuring type II collagen fragments | |
| US6602980B1 (en) | Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays | |
| EP1555531B1 (fr) | Procédé d'évaluation de la dégradation du tissu cartilagineux d'un individu | |
| EP1502114A1 (en) | THE METHOD FOR MEASURING THE AMOUNT OF $g(b)iG-H3 PROTEIN AND DIAGNOSTIC KIT USING THE SAME |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060602 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20090402 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090507 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090731 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090807 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090831 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20090901 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091215 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100104 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130108 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130108 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |