JP4430344B2 - 多岐用途型リンカー化合物及びリガンド、並びにそれらの製造方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、チップテクノロジーやクロマトグラフィ、バイオプローブ等にて糖を使用する際に、糖の導入を好適にかつ効率よく行うために用いられる多岐用途型リンカー化合物、及び該多岐用途型リンカー化合物に糖を導入してなるリガンド、リガンド担持体、並びにこれらの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体内に存在する種々の糖は、特定のタンパク質と相互作用して、生物の活動や生命を維持するためのメカニズムの中で重要な役割を果たしている。そのため、糖とタンパク質との相互作用を調べることは、糖の生物活性を調べる上で重要となる。
【０００３】
糖と相互作用するタンパク質は、例えば、以下の手法によって検出される。すなわち、表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲと記載する）法によれば、表面に糖が固定されているセンサチップを用いて、該糖とタンパク質との生化学的結合を調べることができる。また、アフィニティクロマトグラフィの担体に糖を固定すれば、糖と特異的に相互作用するタンパク質を分離精製することができる。さらに、遺伝子工学にて用いられるバイオプローブとして糖を用いれば、糖と相互作用するタンパク質を検出することができる。
【０００４】
本発明者らは、これまでに、上記ＳＰＲのセンサチップやアフィニティクロマトグラフィの担体等のタンパク質分析用の支持体に、種々のオリゴ糖を一段階にて導入して固定可能なリンカー化合物及び該リンカー化合物にオリゴ糖を導入してなるリガンドを見出している（例えば、非特許文献１等を参照）。
【０００５】
上記リンカー化合物は、芳香族アミン部位とビオチン部位とを有している。このうち、上記芳香族アミン部位は、オリゴ糖を導入するために用いられる。また、上記ビオチン部位は、ビオチン−ストレプトアビジン（又はアビジン）結合を利用して、タンパク質分析用の支持体表面に固定化するために用いられる。従って、このリンカー化合物を介することによって、オリゴ糖をタンパク質分析用の支持体に固定化することができる。
【０００６】
ところで、オリゴ糖は１分子だけでは活性がそれほど高くないため、オリゴ糖の生物活性を評価する場合には、通常、上記タンパク質分析用の支持体に３単位以上のオリゴ糖を集合化させて導入することが必要となる。そこで、上記リンカー化合物を介して、オリゴ糖を上記支持体に固定化する場合には、上記リンカー化合物に糖が導入されてなるリガンドを上記支持体表面上に集合化させることによって、３単位以上のオリゴ糖を集合化させなければならない。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００２−０８０４８８号公報（２００２年３月１９日公開）
【０００８】
【特許文献２】
特開２００３−８３９６９号公報（２００３年３月１９日公開）
【０００９】
【非特許文献１】
「日本化学会第７９回春季年会−講演予稿集II」、社団法人日本化学会、２００１年３月１５日、ｐ．１０４２
【００１０】
【非特許文献２】
H. Mach, D. B. Volkin, C. J. Burke, C. R. Middaugh, R. J. Linhardt, J. R. Fromm, D. Loganathan, Biochemistry, 32, 5480−5489 （1993）
【００１１】
【非特許文献３】
Eric K. Wollker and Marry J. Cloninger, Org. Lett., 4, 7−10 （2000）
【００１２】
【非特許文献４】
K. Matuura, H. Kitakouji, A. Tsuchida, N. Sawada, H. Ishida, M. Kiso and K. Kobayashi, J. Am. Chem. Soc., 122, 7406−7407 （2000）
【００１３】
【非特許文献５】
S. Koshida, Y. Suda, Y. Fukui, J. Ormsby, M. Sobel, S. Kusumoto, Tetrahedron Lett., 40 5725−5728 （1999）
【００１４】
【非特許文献６】
D. H. Tomalia, H. Barker and J. Roeck, Polymer. Jornal., 17, 117−132 （1985）
【００１５】
【非特許文献７】
Christof Worner and Rolf Mulhaupt, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32, 1306−1311 （1993）
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記従来のリンカー化合物を含んでなるリガンドを用いた場合、オリゴ糖の糖鎖をセンサチップ表面に２次元的に集合化させて配列させることは可能であるが、その集合状態を制御して、再現性よく配列させることが困難であるという技術的課題が残されている。
【００１７】
すなわち、タンパク質分析用の支持体表面上に固定化されたオリゴ糖を用いて、該オリゴ糖の生物活性を精度よく観測するためには、オリゴ糖の糖鎖の集合状態を同一にし、オリゴ糖とタンパク質との間の相互作用を再現性よく観測することが求められる。ところが、上記従来のリガンドを用いた場合、３単位以上のオリゴ糖の糖鎖の集合状態は、リガンドの集合状態に依存することになり、３単位以上のオリゴ糖の糖鎖の集合状態を常に同一にすることができない可能性がある。オリゴ糖の糖鎖の集合状態が異なれば、観測されるオリゴ糖とタンパク質との相互作用も異なることになり、オリゴ糖の生物活性を再現性よく評価することが困難となる。
【００１８】
本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであって、その目的は、タンパク質分析用の支持体上に糖を再現性よく２次元的に配列し得る新規な多岐用途型リンカー化合物、及び、該リンカー化合物に糖分子が導入されてなる新規なリガンド、リガンド担持体、並びにこれらの製造方法、さらに、これらを用いて糖分子と他の物質との相互作用を測定する方法を提供することにある。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、４単位以上の糖分子を導入可能な部位として４つの芳香族アミノ基を有し、かつ、糖分子と特異的に相互作用するタンパク質の検出や分離を行う際に用いられるタンパク質分析用の支持体に結合可能な部位としてビオチン部位又はイミノビオチン部位（以下、ビオチン部位と総称して記載する）を有する新規な多岐用途型リンカー化合物を用いることによって、上記支持体に４単位以上の糖分子を再現性よく２次元的に配列させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２０】
すなわち、本発明の多岐用途型リンカー化合物（以下、リンカー化合物と記載する）は、上記課題を解決するために、一般式（１）
【００２１】
【化５】

【００２２】
（式中、ＹはＯ又はＮＨで表される構造を有する）にて表される構造を備え、上記Ｘは、末端に芳香族アミノ基を有するとともに主鎖に炭素−窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を、４鎖含んでなる多分岐部位である構造を備えていることを特徴としている。
【００２３】
上記炭化水素誘導鎖とは、炭素及び水素からなる炭化水素鎖にて、一部の炭素や水素が、他の原子や置換基に置き換わっていてもよいものを指すものとする。すなわち、上記炭化水素誘導鎖とは、末端に芳香族アミノ基を有し、炭化水素鎖の主鎖構造である炭素−炭素結合（Ｃ−Ｃ結合）の一部が炭素−窒素結合（Ｃ−Ｎ結合）、炭素−酸素結合（Ｃ−Ｏ結合）やアミド結合（ＣＯ−ＮＨ結合）に置き換わっていてもよいものを指す。
【００２４】
上記の構成によれば、上記リンカー化合物は、上記タンパク質分析用の支持体に固定可能な部位として、ビオチン部位を有している。このビオチン部位は、ストレプトアビジン又はアビジン（以下、アビジンと総称して記載する）に高い親和性を示す。そのため、アビジンが固定されている支持体表面にて、ビオチン−アビジン結合が形成されるので、上記リンカー化合物を、上記支持体表面上に簡単に固定化することができる。
【００２５】
また、上記リンカー化合物は、種々の糖分子を簡便に導入できる部位として、芳香族アミノ基を有している。上記芳香族アミノ基は、各炭化水素誘導鎖に含まれているので、上記リンカー化合物には、４単位以上の糖分子を導入することができる。また、導入された糖分子は、一つのリンカー化合物に導入されているので、導入された４単位以上の糖分子間を所定の間隔に保つことができる。これにより、上記リンカー化合物を介して、タンパク質分析用の支持体上に導入される糖分子の配列を再現性よく得ることができる。
【００２６】
さらに、上記リンカー化合物を用いれば、上記支持体表面に４単位以上の糖分子を集合化させることができるので、糖分子を再現性よく配列させることができ、それによって糖分子の十分な生物活性を得ることができる。これにより、糖分子とタンパク質との相互作用を検出することが可能になり、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。
【００２７】
上記一般式（１）にて表されるリンカー化合物において、上記Ｘは、一般式（２）
【００２８】
【化６】

【００２９】
（式中、ｍ¹，ｍ²，ｎ¹，ｎ²，ｐ¹，ｐ²，ｐ³，ｐ⁴は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数）にて表される構造を備えていることが好ましい。
【００３０】
上記リンカー化合物のＸは、上記炭化水素誘導鎖を４鎖有しているので、このリンカー化合物を介して、上記支持体上に４単位以上の糖分子を導入することが可能である。そのため、上記リンカー化合物を用いることによって、上記支持体表面にて導入された糖分子間の間隔を制御して、これらの糖分子を集合化させることができる。そのため、上記支持体表面上にて、糖分子の配列を再現性よく得ることができる。
【００３１】
従って、上記リンカー化合物を用いることにより、再現性のよい糖分子の生物活性を得ることが可能となる。これにより、糖分子の生物活性を利用するＳＰＲやアフィニティクロマトグラフィ、バイオプローブ等にて、種々の糖分子とタンパク質との特異的な相互作用を好適に検出することが可能になる。
【００３２】
また、本発明のリガンドは、上記の課題を解決するために、上記したいずれかのリンカー化合物の芳香族アミノ基に、糖分子を導入してなるものであることを特徴としている。
【００３３】
上記リガンドは、具体的には、一般式（３）
【００３４】
【化７】

【００３５】
（式中、ｍ¹，ｍ²，ｎ¹，ｎ²，ｐ¹，ｐ²，ｐ³，ｐ⁴は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数）にて表される構造を備えていることが好ましい。
【００３６】
あるいは、上記リガンドは、一般式（４）
【００３７】
【化８】

【００３８】
（式中、ＹはＯ又はＮＨで表される構造を有し、ｍ¹，ｍ²，ｎ¹，ｎ²，ｐ¹，ｐ²，ｐ³，ｐ⁴は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数）にて表される構造を備えていることが好ましい。
【００３９】
上記リガンドのいずれかを用いることにより、上記タンパク質分析用の支持体表面に、４単位（一般式（４）にて表される構造を備えるリガンドの場合）又は４単位以上（一般式（３）にて表される構造を備えるリガンドの場合）の糖分子を固定化することができる。また、一つのリガンドは、４単位以上の糖分子を有しているので、上記支持体表面に２次元的に４単位以上の糖分子を集合化させることができるとともに、再現性よく配列させることができる。それゆえ、上記リガンドを用いることにより、ＳＰＲやアフィニティクロマトグラフィ、バイオプローブ等にて、種々の糖分子とタンパク質との特異的な相互作用を効率よく検出することが可能になる。
【００４０】
また、本発明のリンカー化合物の製造方法は、上記の課題を解決するために、ビオチン系化合物と、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護された分岐鎖を４鎖有するアミン化合物との縮合反応を行うステップと、上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護するステップとを含んでいることを特徴としている。
【００４１】
上記ビオチン系化合物とは、アミン化合物の二級アミノ基と反応し得るように、ビオチン構造又はイミノビオチン構造に置換基を導入して活性化されているものを指す。
【００４２】
上記の方法によれば、アビジンが固定されているタンパク質分析用の支持体に固定可能なビオチン部位と、糖分子を簡便に導入できる芳香族アミノ基とを有している、本発明のリンカー化合物を得ることができる。
【００４３】
また、本発明のリガンドの製造方法は、上記リンカー化合物のいずれかと、糖分子とを用いて、還元アミノ化反応を行うことを特徴としている。
【００４４】
上記の方法によれば、還元アミノ化反応により、リンカー化合物に簡便に糖分子を導入して、本発明のリガンドを得ることができる。
【００４５】
また、本発明の糖分子の導入方法は、上記のリガンドを含む溶液と、表面にストレプトアビジンまたはアビジンを固定化した支持体とを接触させることを特徴としている。
【００４６】
上記の方法によれば、上記リガンド（リガンドに含まれるリンカー化合物）のビオチン部位又はイミノビオチン部位と、上記支持体表面のストレプトアビジン又はアビジンとを結合させることによって、支持体表面に上記リガンドを固定することができる。従って、リガンドを含む溶液と支持体とを接触させるという簡便な方法で、リンカー化合物に結合した糖分子を支持体の表面に配列させることができる。
【００４７】
また、本発明のリガンド担持体は、リガンドを、ビオチン部位又はイミノビオチン部位と、ストレプトアビジン又はアビジンとの結合であるビオチン−アビジン結合を介して表面に固定化させてなることを特徴としている。
【００４８】
上記の構成によれば、ビオチン部位又はイミノビオチン部位と、ストレプトアビジン又はアビジンとの結合であるビオチン−アビジン結合を介して、支持体表面にリガンドを強固に固定することができるので、支持体表面に２次元的に複数の糖分子を再現性よく配列させてなるリガンド担持体を提供することができる。従って、上記リガンド担持体を用いれば、リガンドに含まれる糖分子と、該糖分子と相互作用するタンパク質等の物質との相互作用を再現性よく観測することができるので、糖分子の生物活性の定量的な評価が可能になる。
【００４９】
また、本発明の表面プラズモン共鳴の測定方法は、末端構造が異なる糖分子が導入されてなる少なくとも２つのセンサチップを用いて、上記少なくとも２つセンサチップは、第１の糖分子が支持体表面に固定化されてなる第１のセンサチップと、上記第１の糖分子とは末端構造が異なる第２の糖分子が支持体表面に固定化されてなる第２のセンサチップとを含み、第１のセンサチップを用いて得られた検出結果と、第２のセンサチップを用いて得られた検出結果との差を検出し、糖分子の相互作用を測定することを特徴としている。
【００５０】
また、本発明の表面プラズモン共鳴の測定方法は、上記センサチップに、上記の同一の構造のリンカー化合物を用いて糖分子が固定化されることを特徴とする。
【００５１】
上記方法によると、糖分子以外は同じ構造のリガンドを有する少なくとも２つのセンサチップを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定をすることができるため、少なくとも２つのセンサチップ相互作用の差は、糖分子に起因したものとして観測される。従って、上記測定方法を用いれば、糖分子以外の部分と、他の物質との非特異的な相互作用を低減させ、糖分子と他の物質との特異的な相互作用を観測することができる。
【００５２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００５３】
本発明の多岐用途型リンカー化合物（以下、リンカー化合物）は、オリゴ糖等の糖（以下、糖分子と記載する）の生物活性を利用するＳＰＲやアフィニティクロマトグラフィ、遺伝子工学でのバイオプローブ等のように、糖分子と特異的に相互作用するタンパク質の検出や分離を行う場合に、タンパク質分析用の支持体に糖分子の導入を好適に行うために用いられるものである。また、上記リンカー化合物は、タンパク質との非特異的な相互作用を有していないため、上記のようなタンパク質の検出や分離に好適に用いることができる。
【００５４】
すなわち、本発明のリンカー化合物は、具体的には、前記一般式（１）にて示すように、上記タンパク質分析用の支持体に固定可能な部位として、ビオチン部位又はイミノビオチン部位（以下、ビオチン部位と総称）を有し、糖分子を導入可能な部位として、芳香族アミノ基を有している。
【００５５】
ビオチン又はイミノビオチン（以下、ビオチンと総称）は、塩基性の糖タンパク質であるストレプトアビジン又はアビジン（以下、これらを総称して、アビジンと記載する）と特異的に相互作用することが知られている。そのため、アビジンが固定されている支持体表面に、ビオチン部位を有する上記リンカー化合物を接触させると、ビオチン−アビジン結合が形成されて、上記リンカー化合物を上記支持体表面に簡単に固定化することができる。
【００５６】
また、上記リンカー化合物は、前記一般式（１）にてＸで表される構造を備え、末端に芳香族アミノ基を有するとともに主鎖に炭素−窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を、４鎖含んでなる多分岐部位を有している。この多分岐部位に含まれる芳香族アミノ基のアミノ基（−ＮＨ₂基）は、糖分子中の平衡によって生じるアルデヒド基（−ＣＨＯ基）又はケトン基（−ＣＲ’Ｏ基、Ｒ’は炭化水素基）と反応する。そして、この反応によって形成されたシッフ塩基を引き続き還元することによって、芳香族アミノ基に糖分子が導入されることになる。上記Ｘは、４つの芳香族アミノ基末端を有しているので、上記リンカー化合物には、後述するように、４単位以上の糖分子を導入することができる。
【００５７】
上記Ｘは、具体的には、前記一般式（２）にて示すように、２鎖の炭化水素誘導鎖が、芳香族アミノ基とは反対側の末端にて、１つの窒素（Ｎ）に結合した２分岐構造を２つ有している。そして、この２つの２分岐構造の上記窒素が、−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（ここで、ｍは１〜６の整数である）を介して、１つの窒素（Ｎ）に結合することによって多分岐構造を形成している。なお、上記一般式（２）において、ｍ¹，ｍ²は、１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、互いに同じ整数であってもよい。このうち、製造の簡便性の点から、ｍ¹，ｍ²は、互いに同じ整数であることが好ましく、特に２であることが好ましい。また、ｎ¹，ｎ²は、１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、互いに同じ整数であってもよい。このうち、製造の簡便性の点から、ｎ¹，ｎ²は、互いに同じ整数であることが好ましく、特に２であることが好ましい。また、ｐ¹〜ｐ⁴は、１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。このうち、上記多分岐部位を有する化合物の製造時の簡便さの点から、上記ｐ¹〜ｐ⁴は、互いに同じ整数であることが好ましく、特に２であることが好ましい。
【００５８】
このように、上記Ｘは、炭素や窒素等の原子にて、上記炭化水素誘導鎖を複数結合して分岐構造を形成している多分岐部位である構造を備えている。なお、上記Ｘに含まれる複数の炭化水素誘導鎖は、すべて同じであることが好ましいが、末端に芳香族アミノ基を有していれば、互いに異なる構造を備えていてもよい。
【００５９】
以上のように、一般式（１）にて表される構造を備えているリンカー化合物は、ビオチン部位と芳香族アミノ基末端とを有している。これにより、上記リンカー化合物を介して、上記タンパク質分析用の支持体上に、糖分子を強固にかつ簡単に結合させることができる。
【００６０】
また、上記リンカー化合物は、多分岐部位を有し、該多分岐部位の各末端に芳香族アミノ基を有している。そのため、上記リンカー化合物に糖分子を導入してなるリガンド（後述）を用いることにより、上記支持体表面に効率よく４単位以上の糖分子を集合化させることができる。また、一つのリンカー化合物には４単位以上の糖分子を導入することができるので、上記リガンドを支持体表面に結合させた場合に、複数の糖分子を再現性よく配列させることができる。
【００６１】
さらに、上記リンカー化合物は、タンパク質との非特異的な相互作用の影響をほぼ無視することができる。それゆえ、本発明のリンカー化合物を用いることによって、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。
【００６２】
上記リンカー化合物は、以下に示す製造方法によって製造される。すなわち、上記リンカー化合物は、ビオチン系化合物と、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護された分岐鎖を４鎖有するアミン化合物との縮合反応を行い、その後、上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護することによって製造される。
【００６３】
上記ビオチン系化合物としては、下記一般式（５）
【００６４】
【化９】

【００６５】
にて表される構造を備えている化合物を挙げることができる。上記ビオチン系化合物は、ペンタフルオロフェニル基（Ｐｆｐ）又はスクシンイミド基（Ｓｕ）を有するエステル化合物である。そのため、上記ビオチン系化合物は、これらの置換基によって活性化されているので、アミン化合物の二級アミノ基（−ＮＨ基）と反応することができる。
【００６６】
また、上記アミン化合物は、二級アミノ基と、保護基によって保護された芳香族アミノ基末端を有する分岐鎖とを含んでいれば特に限定されるものではなく、上記したリンカー化合物の多分岐部位（一般式（１）のＸ）に相当する構造を有していればよい。
【００６７】
従って、上記分岐鎖は、上記した炭化水素誘導鎖に含まれる芳香族アミノ基の代わりに、保護基によって保護された芳香族アミノ基末端を有する以外は、上記炭化水素誘導鎖に含まれる構造を有していればよい。つまり、上記分岐鎖は、炭素及び水素からなる炭化水素鎖にて、一部の炭素や水素が他の原子や置換基に置き換わっていてもよいものである。より具体的には、上記分岐鎖は、保護基によって保護された芳香族アミノ基末端を有するとともに、炭化水素鎖の主鎖構造である炭素−炭素結合（Ｃ−Ｃ結合）の一部が炭素−窒素結合（Ｃ−Ｎ結合）、炭素−酸素結合（Ｃ−Ｏ結合）、アミド結合（ＣＯ−ＮＨ結合）に置き換わっていてもよいものである。
【００６８】
また、上記保護基とは、芳香族アミノ基のアミノ基が上記縮合反応によって反応しないように導入される置換基である。このような保護基は、二級アミノ基の保護基を脱保護する際に影響を受けないものであれば、特に限定されるものではない。上記保護基としては、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基（−ＣＯＯＣ（ＣＨ₃）₃基；Ｂｏｃ基と記載する）、ベンジル基、アリルカルバメート基（−ＣＯＯＣＨ₂ＣＨ＝ＣＨ₂、Ａｌｌｏｃ基）等を挙げることができる。
【００６９】
上記アミン化合物としては、例えば、下記一般式（６）
【００７０】
【化１０】

【００７１】
にて表される構造を備えている化合物を挙げることができる。なお、このアミン化合物の合成方法については、後の実施例にて詳述する。
【００７２】
上記ビオチン系化合物とアミン化合物との縮合反応により、ビオチン系化合物のＰｆｐやＳｕ等の置換基と、アミン化合物の二級アミノ基とが縮合して、アミド結合が形成される。その後、芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護して、保護基を取り外し、芳香族アミノ基にすることによって、上記したリンカー化合物を得ることができる。
【００７３】
次に、上記リンカー化合物の芳香族アミノ基に、糖分子が導入されてなるリガンドについて説明する。本発明のリガンドは、リンカー化合物のアミノ基が、糖分子中の平衡によって生じるアルデヒド基又はケトン基と反応し、この反応によって形成されたシッフ塩基を引き続き還元することによって、芳香族アミノ基に糖分子が導入されることになる。
【００７４】
本発明のリガンドに含まれる糖分子は、還元糖であれば特に限定されない。糖分子としては、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース等の単糖類、結合している糖の数が２糖〜１０糖であるマルトース、ラクトース、後述する硫酸化オリゴ糖等のオリゴ糖類、単糖類やオリゴ糖類が組み合わされて糖数が１１以上であるヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸等の多糖類を挙げることができる。
【００７５】
また、上記オリゴ糖類として、抗血液凝固活性を有することで知られている硫酸化多糖ヘパリン中の下記一般式（７）
【００７６】
【化１１】

【００７７】
にて表される特定の部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を有する硫酸化オリゴ糖や、該硫酸化オリゴ糖の還元末端にグルコースを結合させてなる下記一般式（８）
【００７８】
【化１２】

【００７９】
にて表される構造を備えているオリゴ糖を挙げることができる。
【００８０】
なお、上記オリゴ糖類や多糖類は、同一の単糖分子からなる単一オリゴ糖や単一多糖であってもよく、種々の単糖分子やその誘導体からなる複合糖質や、種々の単糖分子やその誘導体、オリゴ糖類を含んでなる複合多糖類であってもよい。また、上記糖分子は、いずれも、自然界から単離・精製して得られる種々の天然の糖であってもよく、人工的に合成された糖であってもよい。
【００８１】
本発明のリガンドは、具体的には、前記一般式（３）にて表される構造を備えているものである。この一般式（３）にて表される構造を備えているリガンドは、前記一般式（１）にて表され、Ｘが前記一般式（２）にて表される構造を備えているリンカー化合物に、糖分子としてグルコースまたはマルトースまたはラクトースを導入してなるものである。一般式（２）にて表されるＸは、４鎖の炭化水素誘導鎖を含む構造を備えている。この各炭化水素誘導鎖の芳香族アミノ基には、１単位又は２単位の糖分子を導入することができる。そのため、一般式（３）にて表される構造を備えているリガンドは、上記リンカー化合物に４単位以上８単位以下の糖分子が結合したものとなる。なお、上記一般式（３）において、ｍ¹，ｍ²は、一般式（２）中のｍ¹，ｍ²と同様に、１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、互いに同じ整数であってもよい。また、ｎ¹，ｎ²は、一般式（２）中のｎ¹，ｎ²と同様に、１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、互いに同じ整数であってもよい。また、ｐ¹〜ｐ⁴は、一般式（２）中のｐ¹〜ｐ⁴と同様に、１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。
【００８２】
上記リンカー化合物の炭化水素誘導鎖の芳香族アミノ基に導入される糖分子としては、グルコース、マルトース、ラクトースからなる群から選ばれる１つ以上の糖分子を挙げることができる。従って、一般式（３）にて表される構造を備えているリガンドは、一般式（３）のＲ⁷〜Ｒ¹⁰の構造に応じて、上記リンカー化合物に、グルコース、マルトース、ラクトースからなる群から選ばれる糖分子が、４単位以上８単位以下導入されている構造を有している。
【００８３】
なお、上記リンカー化合物の炭化水素誘導鎖の各芳香族アミノ基に導入される糖分子は、互いに異なっていてもよく、一部または全てが同じであってもよいが、糖分子の導入の簡便性の点から、全て同じであることが好ましい。それゆえ、例えば、一般式（３）におけるｍ¹，ｍ²，ｎ¹，ｎ²，ｐ¹，ｐ²，ｐ³，ｐ⁴が全て２で、リンカー化合物に４単位の糖分子が導入される場合に、糖分子がグルコースであれば、下記一般式（１６）で表されるリガンドが好ましい。同様に、４単位の糖分子が導入される場合に、糖分子がマルトースであれば、下記一般式（１７）で表されるリガンドが好ましく、糖分子がラクトースであれば、下記一般式（１８）で表されるリガンドが好ましい。
【００８４】
【化１３】

【００８５】
（一般式（１６）〜（１８）中、ＹはＯ又はＮＨで表される構造を有する）
また、本発明の他のリガンドは、前記一般式（４）にて表される構造を備えているものである。この一般式（４）にて表される構造を備えているリガンドは、前記一般式（１）にて表され、Ｘが前記一般式（２）にて表される構造を備えているリンカー化合物に、上記一般式（８）にて表される構造を備えている糖分子を導入してなるものである。一般式（２）にて表されるＸは、４鎖の炭化水素誘導鎖を含む構造を有しているので、一般式（４）にて表される構造を備えているリガンドは、上記リンカー化合物に４単位の糖分子が結合したものとなる。なお、上記一般式（４）において、ｍ¹，ｍ²は、一般式（２）中のｍ¹，ｍ²と同様に、１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、互いに同じ整数であってもよい。また、ｎ¹，ｎ²は、一般式（２）中のｎ¹，ｎ²と同様に、１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、互いに同じ整数であってもよい。また、ｐ¹〜ｐ⁴は、一般式（２）中のｐ¹〜ｐ⁴と同様に、１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。
【００８６】
上記のリガンドは、いずれもリンカー化合物と糖分子とを含んでなっているので、リンカー化合物内のビオチン部位にて、アビジンを有しているタンパク質分析用の支持体と、ビオチン−アビジン結合により結合することができる。これにより、このビオチン−アビジン結合を介して、上記支持体表面に４単位の糖分子を集合化して固定化されてなるリガンド担持体を提供することができる。よって、上記リガンドを用いることによって、例えばタンパク質分析用の支持体表面に２次元的に複数の糖分子を再現性よく配列してリガンド担持体を得、該リガンド担持体を用いることによって、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。それゆえ、本発明のリガンドは、ＳＰＲやアフィニティクロマトグラフィ、バイオプローブ等にて、種々の糖分子を簡単に導入するために好適に用いることができる。
【００８７】
このように、本発明のリガンドを、ビオチン−アビジン結合を介して支持体の表面に固定化させてなるリガンド担持体も本発明に含まれる。このリガンド担持体はタンパク質分析の用途に限定されず、糖分子との相互作用を調べるための、タンパク質以外の物質の分析の用途として用いることもできる。
【００８８】
上記リガンドは、該リガンドを含むリガンド溶液に、アビジンを固定したタンパク質分析用の支持体を所定時間浸漬する、あるいは、上記支持体にリガンド溶液を注入することによって、上記支持体表面に導入することができ、上記支持体表面に４単位以上の糖分子を集合化して固定化されてなるリガンド担持体を提供することができる。
【００８９】
例えば、ＳＰＲのセンサチップに、上記リガンドを導入してなるリガンド担持体を得る場合には、まず、アビジンを固定したセンサチップを作成する。すなわち、図１（ａ）に示すように、表面に金（Ａｕ）がコーティングされたガラス基板１を用いる。次いで、図１（ｂ）に示すように、下記一般式（９）
ＨＯＯＣＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＳＨ …（９）
にて表される構造を備えている４−チオ酪酸を、金−硫黄結合（Ａｕ−Ｓ結合）を利用して、ガラス基板１上に固定する。なお、この４−チオ酪酸を固定したガラス基板１に代えて、カルボキシル基を有するポリマーがコートされた基板を用いてもよい。
【００９０】
続いて、図１（ｃ）に示すように、カルボジイミド試薬の存在下にて、ガラス基板１上に固定された４−チオ酪酸と、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドとを反応させる。その後、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド部位と、アビジン２が有する末端アミノ基とを縮合させて、図１（ｄ）に示すように、アビジン２をガラス基板１上に固定化する。これにより、アビジンをガラス基板１上に固定したセンサチップが得られる。
【００９１】
次いで、このセンサチップを、本発明のリガンドが含まれるリガンド溶液に接触させる。具体的には、上記センサチップをリガンド溶液に浸漬する、あるいは、センサチップ表面にリガンド溶液を流す。これにより、特異的な相互作用として知られているビオチン−アビジン結合によって、図２（ａ）に示すように、上記センサチップ上にリガンド３を固定化したリガンド担持体４を得ることができる。
【００９２】
なお、リガンド溶液に用いる溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）等の緩衝液を挙げることができる。リガンド溶液に浸漬する場合の浸漬時間は、０．５時間〜１．５時間程度であればよい。また、リガンド溶液を注入する場合の注入量は、０．００６ｍｇ〜０．０６ｍｇ程度であればよい。
【００９３】
上記のように、リガンド３を固定化してなるリガンド担持体４を用い、該リガンド担持体とタンパク質５とを接触させ（図２（ｂ））、常法に従って、表面プラズモン共鳴装置を用いて共鳴角度を測定すれば、該リガンド担持体４とタンパク質５との結合挙動を観測することができる。なお、ＳＰＲ測定に用いるセンサチップとしては、例えば、ガラス、プラスチック等を用いることができ、特にガラスが好適に用いられる。また、リガンド担持体とタンパク質の接触は、例えば、タンパク質をランニングバッファーに溶解した溶液を、該リガンド担持体の表面に流入する、あるいは、上記タンパク質をランニングバッファーに溶解した溶液中に、上記リガンド担持体を浸漬することにより行えばよい。このランニングバッファーとしては、例えば、ＰＢＳ等の緩衝溶液を挙げることができる。
【００９４】
また、例えば、アフィニティクロマトグラフィに用いるアフィニティカラムとして、上記リガンドを導入したリガンド担持体を得る場合、まず、アビジンを固定したカラムを作成する。この作成方法は、常法（例えば、文献；アマシャムファルマシアバイオテク株式会社編、「初めてのリガンドカップリングハンドブック」(2002年)等参照）にて行えばよい。例えば、アミノ基を持つ化合物を固定化させるのに適した担体を充填してあるカラム（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが固定化されたゲル担体を充填してあるカラム）に、アビジン含有溶液を流すことで、上記担体にアビジンを固定化させることができる。このアビジンを固定化されてなる担体（以下、アビジン付加体）に、本発明のリガンドが含まれるリガンド溶液を注入する。これにより、特異的な相互作用として知られているビオチン−アビジン結合によって、アビジン付加体にリガンドを固定化してなるリガンド担持体を得ることができる。
【００９５】
なお、上記アビジン含有溶液に用いられる溶媒としては、例えば、塩化ナトリウム含有の酢酸ナトリウム水溶液等を挙げることができる。また、上記リガンド溶液に用いる溶媒としては、例えば、ＰＢＳ等の緩衝液を挙げることができる。
【００９６】
このように、本発明のリガンドは、ビオチン部位を有しているので、上記のように例えば、タンパク質分析用の支持体表面に、一段階にて簡単に糖分子を導入して固定化することで本発明のリガンド担持体を得ることができる。
【００９７】
上記のように、リガンドを固定化してなるリガンド担持体を有するアフィニティカラムを用いて、アフィニティクロマトグラフィを行うには、以下のようにすればよい。すなわち、アビジンを固定化してなる担体（アビジン付加体）が充填されてなるアフィニティカラムに、タンパク質溶液を注入し、常法に従って、アフィニティクロマトグラフィを行えば、リガンド担持体に結合するタンパク質と、結合しないタンパク質とを分離することができる。なお、上記タンパク質溶液に用いられる溶媒としては、例えば、ＰＢＳ等の緩衝溶液が挙げられる。また、リガンド担持体に結合しないタンパク質の、アフィニティカラムからの溶出に用いられる溶出用溶液としては、例えば、ＰＢＳ等の緩衝溶液を用いればよい。
【００９８】
なお、上記のようにＳＰＲ法のセンサチップや、アフィニティカラムクロマトグラフィに用いるアフィ二ティカラムに充填されるアビジン付加体等の支持体に糖分子を導入する方法も本発明に含まれる。
【００９９】
以上のように、本発明のリガンド担持体は、上記リガンドを有しているので、支持体表面に２次元的に複数の糖分子を再現性よく配列することができる。それゆえ、糖分子の生物活性を再現性よく観測でき、糖分子の構造の解明や、糖分子の生物活性について定量的な評価を行うことができる。
【０１００】
また、支持体表面に糖分子が固定化されているセンサチップを用いて、糖分子の特異的な相互作用を検出するＳＰＲ測定方法も本発明に含まれる。これは、末端構造が異なる糖分子が導入されてなる少なくとも２つのセンサチップを用いて、糖分子とタンパク質等の物質との相互作用作用を観測する。なお、糖分子の末端とは、センサチップに固定されていない側のことである。また、糖分子との相互作用を観測する物質は、タンパク質に限定はされない。
【０１０１】
上記の方法を用いて、糖分子の種類の異なる２つのセンサチップを用いてＳＰＲ測定を行うには、例えば、以下のようにすばよい。第１の糖分子が支持体表面に固定化されてなる第１のセンサチップと、上記第１の糖分子とは末端構造が異なる第２の糖分子が支持体表面に固定化されてなる第２のセンサチップを用意する。これは、上記したように、センサチップ上にリガンドを固定化したリガンド担持体（センサチップ）を作成したのと同様に得られる。これらのセンサチップは、固定化される糖分子が異なっているリガンドを用いればよい。比較する糖分子には、例えば、ラクトースとグルコース、マルトースとグルコース、コージビオースとグルコース等が挙げられる。センサチップに固定化される糖分子が異なっているリガンドは、例えば、上記一般式（１６）〜（１８）に示すリガンドリガンドが挙げられる。なお、リガンドは本発明のものに限らず別のリガンドを用いてもかまわない。
【０１０２】
そして、例えば、第１の糖分子に特異的に作用するタンパク質等を用いて、測定条件を一定にして、上記２つのセンサチップに作用させ、両者の共鳴角度を観測する。この両者の共鳴角度の差を検出することで、糖分子とタンパク質等との特異的な相互作用として測定することができる。
【０１０３】
上記では、２つの種類のセンサチップ同時に測定したが、これに限定されることはなく、２種類以上のセンサチップを測定してもかまわないし、同時に測定しなくてもかまわない。また、少なくとも１つのセンサチップに糖分子を導入していないものを用いてもよい。例えば、リンカー化合物のみを固定化したものを用いてもよい。
【０１０４】
このように、本発明のＳＰＲ測定の方法は、非特異的な相互作用を低減して、糖分子と他の物質との特異的な相互作用を測定することができる。
【０１０５】
【実施例】
以下、本発明のリンカー化合物及びリガンドの合成について、より詳細に説明する。また、合成したリガンドを用いた、ＳＰＲ測定及びアフィニティクロマトグラフィについても詳細に説明する。
【０１０６】
なお、下記の実施例において、各種のスペクトル、旋光度の測定、電気泳動には次の機器を使用した。
＊）核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル：JEOL EX 270, JNM−LA 500 NMR spectrometer（商品名）
＊）質量分析：Mariner（登録商標）Biospectrometry（登録商標）Workstation （商品名、ESI−TOF MS, PE Biosystems, CA, USA） VOYAGER−DERP（商品名、MALDI−TOF MS, PE Biosystems, CA, USA）
＊）旋光度：Perkin Elmer model 241 polarimeter（商品名）
＊）紫外可視分光光度計：JASCO V−530 UV/Vis spectrophometer（商品名）
＊）表面ブラズモン共鳴バイオセンサー：SPR670（商品名、Nippon Laser & Electronics LAB）
＊）電気泳動装置：ATTO CompactPAGE AE−7300（商品名）
＊）電気泳動用既成ゲル：ATTO PAGEL−Compact AE−6000 (12.5%) Lot: 244S024（商品名）
また、クロマトグラフィーには次のシリカゲルを用いた。
＊）薄層クロマトグラフィー：Merck Silica gel 60 F254 (No.5715)（商品名）
＊）調製的薄層クロマトグラフィー：Merck Silica gel 60 F254 (No.5744)（商品名）
＊）中圧カラムクロマトグラフィー：Merck Silica gel 60 (No.9385, 0.040−0.063mm,230−400 mesh)（商品名）
〔実施例１・リンカー化合物の合成〕
本発明のリンカー化合物は、以下の手順にて合成した。
【０１０７】
下記一般式（１０）にて示すように、室温条件下、メタノール（式中、ＭｅＯＨ）中にて、ベンジルアミン（化合物１、式中Ｂｎはベンジル基を表す）と、６当量のアクリル酸メチルとを反応させて、上記ベンジルアミンに２単位のアクリル酸メチルをマイケル付加させ、収率９３％にて化合物２を得た。その後、室温条件下にて、該化合物２が含まれているメタノール中に、大過剰（５０当量）のエチレンジアミンを加え、該エチレンジアミンを化合物２に縮合させて、化合物３を得た。なお、大過剰（５０当量）のエチレンジアミンを加えるのは、エチレンジアミンの２つのアミノ基に同時に化合物２が縮合するのを防ぐためである。
【０１０８】
【化１４】

【０１０９】
化合物２を得るために、具体的には、ベンジルアミン（4.7 mL, 44.6 mmol）のメタノール溶液（143 mL）にアクリル酸メチル（8.52 mL, 104 mmol）を加えて室温で窒素雰囲気下8時間撹拌し、アクリル酸メチルを（3.87 mL, 47 mmol）追加し１２時間室温で撹拌した。この攪拌した溶液に、その後、さらにアクリル酸メチルを（7.47 mL, 94 mmol）加え終夜撹拌し、メタノール／アクリル酸メチル反応溶液を得た。メタノール／アクリル酸メチル反応溶液を減圧濃縮し、残査を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（300 g, トルエン：酢酸エチル = 5 : 1 〜3 : 1）で精製して、無色オイル状溶液として化合物２を得た。
【０１１０】
得られた化合物２は、収量11.7 g（収率95%）であった。また、得られた化合物２の¹H NMR（400 MHz, CD₃OD）測定を行ったところ、δ7.28-7.20 (5H, m, aromatic), δ4.79 (6H, s, OMe^* × 2), δ3.57 (2H, d, J = 4.6 Hz, NCH₂ ^*Ph),δ2.76 (4H, td, J_gem = 4.6, J_vic = 6.8 Hz , CH₂ ^*NBn), δ2.46 (4H, td, J_gem = 4.6, J_vic = 6.8 Hz, COCH₂ ^*CH₂NBn)であった。なお、各化学シフトδは、Hが複数存在するものには*を付けたプロトン、つまりH^*、に対する測定値を示しており、以下の記載についても同様である。また、ESI−MS（positive）測定（飛行時間型質量分析計測定）を行ったところ、m/z（質量／電荷比）302.1［(M+Na)⁺］であった。
【０１１１】
続いて、下記一般式（１１）にて示すように、上記化合物３が含まれているメタノール中に、室温条件下にて、１１当量のアクリル酸メチルを加えて、化合物３にアクリル酸メチルを４単位付加し、収率８１％にて化合物４を得た。その後、メタノールに２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を添加したアルカリ条件下にて、化合物４のメチルエステルを加水分解し、末端にカルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）を４単位有する化合物５を収率９６％にて得た。
【０１１２】
【化１５】

【０１１３】
化合物４を得るために、具体的に次のような操作を行った。すなわち、化合物２（9.97 g, 35.7 mmol）をメタノール（120 mL）に溶解させ、窒素雰囲気下０℃で５分撹拌し、これに無水エチレンジアミン（60 mL, 1.11 mol）を加え０℃で５０分撹拌後、室温で終夜撹拌し、さらに無水エチレンジアミン（50 mL, 0.93 mol）を加え室温で終夜撹拌して、化合物２／無水エチレンジアミン反応溶液を得た。この化合物２／無水エチレンジアミン反応溶液を濃縮し、黄色オイル状残渣を得た。この黄色オイル状残渣に、メタノール（120 mL）を加えて溶解させ、アクリル酸メチル（19.3 mL, 234 mmol）を加えて室温で終夜撹拌し、さらにアクリル酸メチル（19.3 mL, 234 mmol）を加えて室温で終夜撹拌し、黄色オイル状残渣／アクリル酸メチル反応溶液を得た。この黄色オイル状残渣／アクリル酸メチル反応溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（700 g, クロロホルム:メタノール = 20 : 1 〜7 : 1）で精製して、化合物４として黄色オイル状溶液を得た。
【０１１４】
得られた化合物４の収量は、24.5 g（収率81%）であった。また、得られた化合物４の¹H NMR（400 MHz, CD₃OD）測定を行ったところ、δ7.29-7.28 (5H, m, aromatic H), δ3.66 (12H, s, OMe^*×4), δ3.27 (4H, q, J = 6.1 Hz, CH₂ ^*NHCO), δ2.81 (4H, t, J = 6.8 Hz, CH₂ ^*NBn), δ2.75 (8H, t, CH₂×4, J = 6.8 Hz, CH₂ ^*NCH₂), δ2.52 (4H, t, CH₂×2, J = 5.9, 6.1 Hz, CH₂ ^*CH₂NHCO), δ2.41 (12H, t, CH₂×(2+4), J = 6.8, 6.6 Hz, NCOCH₂ ^*CH₂NHCO, MeOCOCH₂ ^*)であった。また、ESI−MS（positive）m/z 680.4［(M+H)⁺］であった。
【０１１５】
また、化合物５を得るために、具体的に次のような操作を行った。すなわち、化合物４（1.0 mg, 1.47 mmol）をメタノール（7.4 mL）に溶解させ、これに４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（7.4 mL）を加えてアルゴンガス雰囲気下０℃で２時間撹拌し、化合物４／水酸化ナトリウム反応溶液を得た。この化合物４／水酸化ナトリウム反応溶液に４Ｍ塩酸（7 mL）を加えてｐＨ試験紙でｐＨ３を確認後、化合物４／水酸化ナトリウム反応溶液を減圧濃縮し、残渣の水溶液を凍結乾燥させた。得られた凍結乾燥させた残渣を、ＨＰ−２０（300 mL, H₂O 〜H₂O : メタノール = 1 : 1 〜メタノール）で精製し、Ｈ₂Ｏ／メタノールで溶出させた画分を集め減圧濃縮した。その後、減圧濃縮した残渣を凍結乾燥して、化合物５として淡黄色結晶を得た。
【０１１６】
得られた化合物５は、収量878 mg（収率96%）であった。また、得られた化合物５の¹H NMR（400MHz, CD₃OD）測定を行ったところ、δ7.54-7.38 (5H, m, aromatic H), δ3.60(2H, s, NCH₂ ^*Ph), δ3.58 (2H, t, J = 6.1 Hz, CH₂ ^*NHCO), δ3.34-3.24 (16H, m, CH₂×8, CH₂ ^*NBn, MeOCOCH₂CH₂ ^*N, NCH₂CH₂ ^*NHCO), δ2.79 (4H, t, CH₂×2, J = 7.0 Hz, COCH₂ ^*CH₂NBn), δ2.60 (8H, t, CH₂×4, J = 6.4 Hz, MeOCOCH₂ ^*)であった。また、ESI−MS（positive）m/z 624.3［(M+H)⁺］であった。
【０１１７】
なお、本実施例では、化合物５はカルボキシル基が４単位のものまでしか合成していないが、必要であれば、化合物４のメチルエステルを加水分解せずに、エチレンジアミンを再び縮合させ、アクリル酸メチルを付加させる反応を続ければ、末端に８、１６、３２単位のカルボキシル基を有する骨格構造を容易に合成することが可能である。
【０１１８】
次いで、下記一般式（１２）にて示すように、５当量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（式中、ＨＯＢｔ）及び、１０当量のジイソプロピルエチルアミン（式中、ＤＩＰＥＡ）を含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中にて、０℃から４０℃に温度変化させながら、活性化剤として５当量のｏ−［７−アザベンゾトリアゾール−１−イル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（式中、ＨＡＴＵ）を用いて、上記化合物５の末端のカルボキシル基に、一方のアミノ基がｔ−ブトキシカルボニル基（式中Ｂｏｃ、以下、Ｂｏｃ基と記載）にて保護されたフェニレンジアミン誘導体（化合物６、５当量）を縮合させて、化合物７を得た（収率５７％）。続いて、水素雰囲気下、５０℃のメタノール中にて、パラジウム（１０％のＰｄ−Ｃ）を用いて化合物７の接触還元を行って、該化合物７の二級アミノ基の保護基であるベンジル基を脱保護し、収率８０％にて化合物８を得た。
【０１１９】
【化１６】

【０１２０】
化合物６を得るために、具体的に次のような操作を行った。すなわち、ｍ−フェニレンジアミン（7.81 g, 72.2 mmol）をメタノール（240 mL）に溶解させ、ジ−t−ブトキシカルボネート（16.5 mL, 71.8 mmol）と、トリエチルアミン（10 mL, 71.5mmol）とを加え、アルゴンガス雰囲気下、遮光して０℃で３０分撹拌し、その後室温で終夜撹拌し、ｍ−フェニレンジアミン反応溶液を得た。この、ｍ−フェニレンジアミン反応溶液を減圧濃縮して、残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（500 g, クロロホルム：メタノール = 10 : 1 〜7 : 1）で精製して、化合物６として黄白色結晶を得た。
【０１２１】
得られた化合物６は、収量13.3 g（収率88%）であった。また、得られた化合物６の¹H NMR（400 MHz, CDCl₃）測定を行ったところ、δ7.03 （1H, dd , J =7.8, 8.1 Hz, aromaticH）, δ6.54 （1H, d, J = 8.1 Hz, aromatic H）, δ6.36 （1H, t, J = 7.8 Hz, aromatic H）, δ3.67 （2H, s, NH₂）, δ1.51 （9H, m, CH₃×3 of BOC）であった。また、ESI−MS（positive）m/z 209.1［(M+H)⁺］であった。
【０１２２】
また、化合物７を得るために、具体的に次のような操作を行った。すなわち、化合物５（54.8 mg, 87.9 μmol）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（66.4 mg,492 μmol）とを無水ジメチルフォルムアミド（0.9 mL）に窒素雰囲気下で溶解させて、０℃で１５分撹拌し化合物５／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール反応溶液を得た。この化合物５／1−ヒドロキシベンゾトリアゾール反応溶液に、ＨＡＴＵ（168 mg, 441 μmol）とジイソプロピルエチルアミン（150 mL, 882 μmol）と化合物６（98.2 mg, 471 μmol）とを加えて室温で終夜撹拌し、５０℃で５時間撹拌して化合物５／化合物６反応溶液を得た。この化合物５／化合物６反応溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（80 g, クロロホルム：メタノール = 15 : 1 〜5 : 1）で精製して、化合物７として白色結晶を得た。
【０１２３】
得られた化合物７は、収量69.2 mg（収率57%）であった。また、得られた化合物７の¹H NMR（400 MHz, CDCl₃）測定を行ったところ、δ7.39 (4H, s, 1H×4, aromatic H), δ7.39-6.53 (21H, m, aromatic H), δ3.63 (2H, s, NCH₂ ^*Ph),δ3.15 (4H, d, CH₂×2, J = 6.2 Hz, CH₂ ^*NHCO), δ2.76 (8H, t, CH₂×4, J = 6.2 Hz, MeOCOCH₂CH₂ ^*N), δ2.49 (8H, t, CH₂×4, J = 6.2 Hz, MeOCOCH₂ ^*CH₂N), δ2.45 (4H, t, CH₂×2, J = 6.4 Hz, CH₂ ^*NBn), δ2.38 (4H, t, CH₂×2, J = 6.6 Hz, NCH₂CH₂ ^*NHCO), δ2.03 (4H, t, CH₂×2, J = 6.4 Hz, NHCOCH₂ ^*CH₂NBn), δ1.48 (36H, s, CH₃×12, Me of BOC)であった。また、ESI−MS（positive）m/z 693.3［(M+2H)²⁺］であった。
【０１２４】
化合物８を得るために、具体的に次のような操作を行った。すなわち、化合物７（49.8 mg, 36.0 μmol）に１０％Ｐｄ−Ｃ（70.2 mg）のメタノール懸濁液を加え、水素雰囲気下、室温で終夜撹拌し、化合物７反応溶液を得た。化合物７反応溶液をメンブランフィルターでろ過しろ液を減圧濃縮して、化合物８として白色結晶を得た。
【０１２５】
得られた化合物８は、収量36.8 mg（収率80%）であった。また、得られた化合物８の¹H NMR（400 MHz, CD₃CD）測定を行ったところ、δ7.64 (4H, s, 1H×4, aromatic H), δ7.05-6.91 (12H, m, aromatic H), δ3.40 (4H, t, CH₂×2, J = 5.4 Hz, CH₂ ^*NHCO), δ3.19 (8H, br, CH₂×4, MeOCOCH₂CH₂ ^*N), δ2.98 (4H, br, CH₂×2, NCH₂CH₂ ^*NHCO), δ2.89 (4H, t, CH₂×2, J = 5.6 Hz, CH₂CH₂ ^*NH), δ2.71-2.70 (4H, br, CH₂×2, J = 5.6 Hz, MeOCOCH₂ ^*CH₂N), δ2.36 (4H, t, CH₂×2, J = 5.4 Hz, NHCOCH₂ ^*CH₂NBn), δ1.39 (36H, s, CH₃×12, Me of BOC)であった。また、ESI−MS（positive）m/z 647.9［(M+2H)²⁺］であった。
【０１２６】
次に、下記一般式（１３）にて示すように、温度５０℃、トリエチルアミン（式中、ＴＥＡ）の存在下、ＤＭＦ中にて、脱保護されてフリーになった化合物８のアミノ基に、ペンタフルオロフェニル基（Ｐｆｐ）にて活性化したビオチンを縮合させ、化合物９を得た（収率６３％）。その後、０℃の温度条件下、トリフルオロ酢酸（式中、ＴＦＡ）を含むＣＨ₂Ｃｌ₂中にて、化合物９のＢｏｃ基を脱保護して、化合物１０を本発明のリンカー化合物として得た。
【０１２７】
【化１７】

【０１２８】
化合物９を得るために、具体的に次のような操作を行った。すなわち、ビオチン（80.1 mg, 0.397 mmol）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（80.8 mg, 0.39mmol）を無水ジメチルフォルムアミド（1 mL）にアルゴンガス雰囲気下、溶解させて５０℃で４時間撹拌し、ペンタフルオロフェノール（120 mg, 0.65 mmol）を加えて５０℃で終夜撹拌し、ビオチン反応溶液を得た。ビオチン反応溶液に化合物８（70.6 mg, 54.5 mmol）、トリエチルアミン（60 μL, 0.811 mmol）を加え、５０℃で終夜撹拌し化合物８反応溶液を得た。化合物８反応溶液を減圧濃縮し、残査を酢酸エチル100 mlに溶解し、飽和食塩水（50 mL×3）で洗浄後、有機相に硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。この乾燥した残査から、乾燥剤を濾去後、濾液を減圧濃縮し、残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（25 g, クロロホルム：メタノール = 10 : 1 〜5 : 1）で精製して、化合物９として白色結晶を得た。
【０１２９】
得られた化合物９は、収量52.3 mg（収率63%）であった。また、得られた化合物９の¹H NMR（400 MHz, CD₃OD）測定を行ったところ、δ7.61 (2H, s, aromatic H), δ7.57 (2H, s, aromatic H), δ7.06-6.95 (12H, m, aromatic), δ4.31 (1H, dd, J_B7/B6 = 4.3, J_B7/B3 = 6.6 Hz, Biotin NHCH^*CH₂S), δ4.09 (1H, dd, J_B3/B4 = 4.5, J_B3/B7 = 6.6 Hz, Biotin NHCH^*CHS), δ3.35 (4H, t, CH₂×2, J = 6.8 Hz, CH₂CH₂ ^*NCH₂CH₂CONHPh), δ3.19-3.17 (4H, m, CH₂×2, NCH₂ ^*CH₂CONHCH₂CH₂), δ2.98-2.93 (1H, m, J_B4/B3 = 4.5 Hz, Biotin NHCHCH^*S), δ2.78-2.72 (9H, m, CH + CH₂×4, J_B6a/B6b = 10 Hz, J_B6a/B7 = 4.3 Hz, Biotin NHCHCH₂ ^*S, NCH₂ ^*CH₂CONHPh), δ2.53-2.50 (4H, br, CH₂×2, CH₂ ^*CH₂NCH₂CH₂CONHPh), δ2.44-2.40 (9H, m, CH+ CH₂×4, J_B6b/B6a =10 Hz, Biotin NHCHCH₂ ^*S, NCH₂CH₂CONHPh), δ2.20 (2H, t, J_B12/B11 = 7.6 Hz, Biotin CH₂CH₂CH₂CH₂ ^*CO), δ2.16 (4H, t, CH₂×2, J = 6.8 Hz, CH₂CH₂ ^*N CH₂CH₂CONHPh), δ1.55-1.51 (4H, br , CH₂×2, Biotin CH₂ ^*CH₂CH₂ ^*CH₂CO), δ1.40 (36H, s, CH₃×12, Me of BOC), δ1.28-1.24 (2H, m, CH₂×1, Biotin CH₂CH₂ ^*CH₂CH₂CO)であった。また、ESI−MS（positive）m/z 761.4［(M+2H)²⁺］であった。
【０１３０】
また、化合物１０を得るために、具体的に次のような操作を行った。化合物９（52.3 mg, 34.4 μmol）をジクロロメタン（1.5 mL）に溶解させ、トリフルオロ酢酸（1 mL ）を加え０℃で１時間撹拌し、化合物９／トリフルオロ酢酸反応溶液を得た。この化合物９／トリフルオロ酢酸反応溶液を減圧濃縮し、残渣をＬＨ２０（140 mL, メタノール溶出）を用いて精製して、化合物１０として黄色結晶を得た。
【０１３１】
得られた化合物１０は、収量50.9 mg（収率94%）であった。また、得られた化合物１０の¹H NMR（400 MHz, CD₃OD）測定を行ったところ、δ7.51 (4H, s, aromatic H), 7.21 (8H, s, aromatic H), δ6.83-6.81 (4H, m, aromatic H), δ4.32 (1H, dd, J_B7/B6 = 4.3, J_B7/B3 = 8.0 Hz, Biotin NHCH^*CH₂S), δ4.14 (1H, dd, J_B3/B4 = 4.4, J_B3/B7 = 8.0 Hz, Biotin NHCH^*CHS), δ3.59-3.52 (12H, m, CH₂×6, NCH₂ ^*CH₂CONHPh, CH₂ ^*CH₂NCH₂CH₂CONHPh), δ3.47-3.37 (4H, m, CH₂×2, CONCH₂ ^*CH₂CONH), δ3.35-3.33 (4H, m, CH₂CH₂ ^*NCH₂CH₂CONHPh), δ3.02 (1H, dt, J_B4/B9 = 4.9 Hz, Biotin NHCHCH^*S), δ2.92-2.89 (8H, m, CH₂×4, NCH₂CH₂ ^*CONHPh), δ2.79 (1H, dd, J_gem = 12.8, J_vic = 5.0 Hz, Biotin NHCHCH₂ ^*S), δ2.58 (1H, d, J_gem = 12.8 Hz, Biotin NHCHCH₂ ^*S), δ2.37 (2H, t, J = 7.0 Hz, CONCH₂CH₂ ^*CONH), δ2.31 (2H, t, J = 7.1 Hz, CONCH₂CH₂ ^*CONH), δ2.21 (2H, t, CH₂×1, Biotin COCH₂ ^*CH₂CH₂CH₂), δ1.48-1.19 (6H, br, CH₂×3, Biotin COCH₂CH₂ ^*CH₂ ^*CH₂ ^*)であった。また、ESI-MS（positive）m/z 1142.6［(M+Na)²⁺］であった。また、[a]_D ²² = ＋0.947 （c 0.972, MeOH）であった。
【０１３２】
また、得られた化合物１０は、ＥＳＩ−ＭＳ（positive）ｍ／ｚ＝１１２０．６２[Ｍ＋Ｈ]⁺であり、一般式（１３）にて化合物１０として示す構造を有していることを確認した。また、ＮＭＲ測定を行い、得られたＮＭＲデータからも、上記化合物１０として示す構造を有していることを確認した。
【０１３３】
〔実施例２・リガンドの合成〕
実施例１にて得られたリンカー化合物（化合物１０）を用いて、前記一般式（３）にて表される構造を備えているリガンドを以下の手順にて合成した。
【０１３４】
下記一般式（１４）にて示すように、溶媒として、水：酢酸（ＡｃＯＨ）：メタノール＝１２：１：１５（５％の酢酸溶液、ｐＨ４）を用い、上記化合物１０に対して、９当量のマルトースを加えて、室温にて１．５日間撹拌した。その後、飛行時間型質量分析計にて、４単位のシッフ塩基が形成されたことを確認した後、還元剤として２０当量のＮａＢＨ₃ＣＮを２回に分けて加え、室温にて４日間撹拌し、還元アミノ化反応を行った。得られた化合物を、ＨＰ−２０（ダイアイオン）を用いて精製し、本発明のリガンドとして化合物１１を得た（収率８９％）。この化合物１１は、マルトースが５単位〜７単位集合してなる混合物として得られた。
【０１３５】
【化１８】

【０１３６】
〔実施例３・リガンドの合成〕
実施例２にて得られたリンカー化合物（化合物１０）を用いて、前記一般式（５）にて表される構造を備えているリガンドを以下の手順にて合成した。
【０１３７】
下記一般式（１５）にて示すように、マルトースに代えて、前記一般式（８）にて表される糖分子を用いた以外は、実施例２と同様に操作を行い、化合物１２を得た。
【０１３８】
【化１９】

【０１３９】
具体的に化合物１２を得るために、以下の操作を行った。すなわち、リンカー化合物１０（2.4 mg, 2.1 μmol）と、前記一般式（８）にて表される糖分子（GlcNS6S-IdoA2S-Glcと略、11.0 mg, 12.8 μmol）とを混合溶媒（水/酢酸/メタノール = 12/1/15, 0.4 mL）に溶解させ室温で２日撹拌した。リンカー化合物１０／GlcNS6S-IdoA2S-Glc反応溶液に水素化シアノホウ素ナトリウム（約3 mg, 40 μmol）を加えて室温で２日撹拌後、再び水素化シアノホウ素ナトリウム（約2 mg, 40 μmol）を加えて室温で終夜撹拌し、還元した。還元したリンカー化合物１０／GlcNS6S-IdoA2S-Glc反応溶液を減圧濃縮し、残渣をSephadexG-50 fine［100 mL溶出液：0.85 M食塩水+PBS(1/1 vol.)混合溶液］を用いて精製し、２５４ｎｍでのＵＶ吸収が認められた画分を集めて濃縮し、残渣を凍結乾燥させた。ここで得た凍結乾燥させた残渣をＨＰ−２０（60 mL）を用いて脱塩し、水／メタノール＝１／１で溶出させた画分を集めて濃縮し、凍結乾燥させた。ここで得た凍結乾燥した画分をSephadexG-10（20 mL）を用いて再度脱塩し、２５４ｎｍでのＵＶ吸収が認められた画分を集めて濃縮し、凍結乾燥させて、化合物１２として白色結晶を得た。
【０１４０】
得られた化合物１２は、収量4.99 mg（収率42%）であった。また、得られた化合物１２の¹H NMR（500 MHz, D₂O）測定を行ったところ、δ7.14-7.12 (4H, br, aromatic H), δ6.91-6.59 (12H, br, aromatic H), δ5.36-5.34 (4H, br, H-1''), δ5.12 (4H, br, H-1'), δ4.51 (4H+1H, d, J = 2.6 Hz, H-5', Botin NHCH^*CH₂S), δ4.29 (4H × 2, d, J_gem = 9.3 Hz, H-6''b, H-2'), δ4.19 (4H×3, d, J_gem = 9.3 Hz, H-6''a, H-3', Biotin NHCH^*CHS), δ4.05 (4H, d, J = 2.5 Hz, H-4'), δ4.00-3.93 (4H x 3, m, H-5'', H-1b, H-6b), δ3.86-3.85 (4H, m, H-5), δ3.78-3.72 (4H, m, H-4), δ3.70 (4H, t, H-3''), δ3.67-3.59 (4H x 2, m, H-3, H-6b), δ3.56-3.52 (4H, br, Link PhNHCOCH₂CH₂NCH₂CH₂ ^*), δ3.42 (4H, t, J = 6.6 Hz, Link COCH₂CH₂ ^*NCO), δ3.36-3.30 (4H × 2 + 8H, m, H-2, H-4'', Link PhNHCOCH₂CH₂ ^*N), δ3.25 (4H, dd, J = 10.3, 3.3 Hz, H-2''), δ3.18-3.05 (1H x 2, br, H-1a, Biotin NHCHCH^*S), δ2.93-2.90 (4H, br, Link PhNHCOCH₂CH₂NCH₂ ^*CH₂),δ2.89 (1H, br, Biotin NHCHCH₂ ^*S), δ2.82 (4H, t, J = 6.6 Hz, Link COCH₂ ^*CH₂NCO), δ2.72-2.70 (1H, br, Biotin NHCHCH₂ ^*S), δ2.58 (8H, t, J = 6.6 Hz, Link PhNHCOCH₂ ^*CH₂N), δ2.05 (2H, br, Biotin COCH₂ ^*CH₂ CH₂ CH₂), δ1.53 (2H, t, J = 7.6 Hz, Biotin COCH₂CH₂ CH₂ CH₂ ^*), δ1.30 (2H, t, J = 6.9 Hz, Biotin COCH₂CH₂ ^*CH₂CH₂), δ1.17 (2H, t, J = 7.1 Hz, Biotin COCH₂CH₂CH₂ ^*CH₂)であった。
【０１４１】
このように、重水（D₂O）中で５００ＭＨｚでＮＭＲ測定を行って目的物を同定した。集合化度はＮＭＲのイズロン酸部分の１位プロトンと、リンカー構造内の芳香族プロトン（１６Ｈを基準）の強度比から計算した。両者の強度比は４．１：１６となり、GlcNS6S-IdoA2S-Glcが平均して４．１分子集合していると見積もった。GlcNS6S-IdoA2S-Glcがｎ分子集合した化合物の分子量（Ｍｗ）は、化合物１０の分子量１１２０．４とGlcNS6S-IdoA2S-Glcが１分子集合する際の分子量増加８４０．９７とを用いて、式▲６▼のように表される。
【０１４２】
Ｍｗ＝１１２０．４＋８４０．９７ｎ （式▲６▼）
上式▲６▼にｎ＝４．１を代入し、分子量４５６８．４を得て、これを基に収率を計算すると上記のように４２％と求められた。
【０１４３】
〔実施例４・リガンドの合成〕
実施例１で得られたリンカー化合物である化合物１０（以降ビオチンリンカー１０と呼ぶ）に関して、糖分子の集合度の違いによるレクチンとの相互作用をＳＰＲ測定するために、リガンドを合成した。
【０１４４】
（４−１ 糖分子の単位を定めていないリガンドの合成）
ビオチンリンカー１０を用いて糖分子を集合化させリガンドを得た。ビオチンリンカー１０はメタノールには溶解するが水には不溶なため、糖を集合させる還元アミノ化反応の溶媒は、水、酢酸、メタノールの混合溶媒とし、ｐＨ４の条件で反応を行った。
【０１４５】
初めに、ビオチンリンカー１０に集合させる糖分子としてグルコースを選択し、下記一般式（１９）おいて化合物１６にて表されるリガンドを以下の手順にて合成した。
【０１４６】
下記一般式（１９）に示すように、実施例１にて得られたビオチンリンカー１０に対して８当量（１−アミノ基当たり2当量、8.0 mg, 44μmol）のグルコースを用い、両者を混合溶媒に溶解させて室温で終夜撹拌し、ビオチンリンカー１０／グルコース反応溶液を得た。反応の追跡はＥＳＩ−ＭＳ測定を行った。反応中の上記ビオチンリンカー１０／グルコース反応溶液を少量取り出しメタノールで希釈したサンプルを測定して、シッフ塩基の形成を確認したところ、この段階では大部分のビオチンリンカー１０はアミノ基が遊離のままで存在し、シッフ塩基の生成率は小さかった。そこで上記ビオチンリンカー１０／グルコース反応溶液に、グルコースを順次追加し、最終的に２８当量のグルコースを反応させると、ＥＳＩ−ＭＳ測定の結果、ビオチンリンカー１０は、シッフ塩基の形で存在していることが分かった。なおビオチンリンカー１０に４残基あるアミノ基すべてがシッフ塩基になったわけではなく、それ以外に３、または２、または１残基のアミノ基だけがシッフ塩基になった化合物も存在していた。
【０１４７】
この段階で、ビオチンリンカー１０／グルコース反応溶液に還元剤として水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、シッフ塩基を還元した。還元反応終了後、ＨＰ−２０（商品名）を用いて、還元したビオチンリンカー１０／グルコース反応溶液を精製して、本発明のリガンドとして化合物１６を得た。
【０１４８】
得られた化合物１６をＥＳＩ−ＭＳ測定したところ、グルコースが７または８分子集合した化合物が合成されていたことが分かった。これはグルコースを大過剰に加えたため、シッフ塩基が還元されて生じた２級アミノ基に、さらにグルコースが反応したためである。ＥＳＩ−ＭＳ測定の結果から、上記化合物１６は、グルコースを７または８単位（分子）有するリガンドの混合物であることがわかった。なお得られた上記化合物１６の収率は、化合物が８分子集合体であると仮定した場合、４２％である。この化合物１６を以下８−Ｇｌｃと略称する。
【０１４９】
【化２０】

【０１５０】
化合物１６を得るために、具体的に次のような操作を行った。すなわち、ビオチンリンカー１０（6.0 mg, 5.4 μmol）とグルコース（8.0 mg, 44 μmol）とを混合溶媒（水/酢酸/メタノール = 6/1/15, 0.4 mL）に溶解させて室温で終夜撹拌後、グルコース（10 mg, 55 μmol）を追加し、６時間後に再びグルコース（10 mg, 55 μmol）を加えて終夜撹拌し、ビオチンリンカー１０／グルコース反応溶液を得た。このビオチンリンカー１０／グルコース反応溶液に、水素化シアノホウ素ナトリウム（10 mg, 160 μmol）を加えて室温で終夜撹拌し、還元反応させた。この還元反応させたビオチンリンカー１０／グルコース反応溶液を減圧濃縮し、残渣をＨＰ−２０（70 mL）を用いて精製し、水／メタノール＝１／１で溶出させた画分を集めて濃縮し、凍結乾燥させて、化合物１６として白色結晶を得た。
【０１５１】
得られた化合物１６は、収量5.1 mg（収率42%, 8置換体として計算）であった。また、得られた化合物１６の¹H NMR（400 MHz, D₂O）測定を行ったところ、δ6.92 (4H, d, J = 7.6 Hz, aromatic H), δ6.73 (4H, s, aromatic H), δ6.50-6.45 (8H, br, aromatic H), δ4.30-4.27 (1H, m, Biotin NHCH^*CH₂S), δ4.05-4.02 (1H, br, Biotin NHCH^*CHS), δ3.95-3.91 (8H, m, H-2'), δ3.76-3.71 (8H, m, H-5'), δ3.65-3.59 (8H×2, m, H-3', H-6'b), δ3.58-3.45 (8H×3, m, H-6'a, H-4', H-1'b), δ3.25 (8H, dd, J_gem = 15.0, J_vic = 9.6 Hz, H-1'a), δ3.19-3.16 (8H, br, Link CH₂ ^*CH₂NCH₂CH₂CONHPh, NHCOCH₂CH₂ ^*NCO), δ2.96-2.86 (1H, m, Biotin NHCHCH^*S), δ2.72-2.68 (9H, br, CH₂×4 + 1H, Link NCH₂ ^*CH₂NHCOPh, Biotin NHCHCH₂ ^*S), δ2.54-2.49 (5H, br, CH₂×2 + 1H, Link CH₂ ^*NCH₂CH₂NHCOPh, Biotin NHCHCH₂ ^*S), δ2.41 (8H, br, CH₂×4, Link NHCOCH₂CH₂ ^*NCO), δ2.07 (2H, br, Biotin COCH₂ ^*CH₂CH₂CH₂), δ2.00 (4H, br, Link NHCOCH₂CH₂ ^*NCO), δ1.32 (4H, br, Biotin COCH₂CH₂ ^*CH₂CH₂ ^*), δ1.17-1.16 (2H, br, Biotin COCH₂CH₂ ^*CH₂CH₂)であった。また、ESI−MS（positive）m/z 1217.5［(M8+2H)²⁺］, 1135.0［(M7+2H)²⁺］であった。なお、M7: グルコースを7分子有するリガンドの分子量、M8: グルコースを8分子有するリガンドの分子量である。
【０１５２】
次に、ビオチンリンカー１０にマルトースを集合化させリガンドを得た。
【０１５３】
実施例１で得られたビオチンリンカー１０を用いて、前記一般式（１４）にて表される構造を備えているリガンドを以下の手順にて合成した。
【０１５４】
上記一般式（１４）にて示すように、マルトースの当量（始め９当量さらに９当量用）を用いた以外は、上記実施例２と同様に操作を行い、本発明のリガンドとして化合物１１を得た。
【０１５５】
得られた化合物１１中のマルトースの集合化度は、その混合物のＮＭＲを測定し、マルトース非還元末端１位プロトンとリンカー内の芳香族プロトン（16Hを基準）との強度比から計算した。両者の強度比は５．３：１６となり、マルトースが平均して５．３分子集合していると見積もった。マルトースがｎ分子集合した化合物の分子量（Ｍｗ）はビオチンリンカー１０の分子量１１２０．４とマルトースが１分子集合する際の分子量増加３２６．３とを用いて、下記の式▲１▼のように表される。
【０１５６】
Ｍｗ＝１１２０．４＋３２６．３ｎ （式▲１▼）
上記式▲１▼にｎ＝５．３を代入し、分子量２８４９．８を得て、これを基に上記化合物１１の収率を計算すると、８８％と求められた。この化合物１１を以下５．３−Ｍａｌと略称する。
【０１５７】
化合物１１を得るために、具体的に次のような操作を行った。すなわち、ビオチンリンカー１０（3.2 mg, 2.9 μmol）と、マルトース（9.4 mg, 26 μmol）とを混合溶媒（水/酢酸/メタノール = 6/1/15, 0.2 mL）に溶解させて室温で8時間撹拌後、さらにマルトース（9.3 mg, 26 μmol）を加えて室温で終夜撹拌し、ビオチンリンカー１０／マルトース反応溶液を得た。このビオチンリンカー１０／マルトース反応溶液に水素化シアノホウ素ナトリウム（約5 mg, 80 μmol）を加えて室温で終夜撹拌後、再び水素化シアノホウ素ナトリウム（約5 mg, 80 μmol）を加えて室温で終夜撹拌し還元した。この還元したビオチンリンカー１０／マルトース反応溶液を減圧濃縮し、残渣をＨＰ−２０（70 mL）を用いて精製し、水／メタノール＝１／１で溶出させた画分を集めて濃縮し、残渣を凍結乾燥させて、化合物１１として白色結晶を得た。
【０１５８】
得られた化合物１１は、収量7.81 mg（収率89%, 5.3置換体として換算）であった。また、得られた化合物１１の¹H NMR（500 MHz, D₂O）測定を行ったところ、δ7.31-6.51 (16H, br, aromatic H), δ5.05 (1H×5.3, br, H-1), δ4.56-4.44 (1H, br, Biotin NHCH^*CH₂S), δ4.25-4.20 (1H, br, Biotin NHCH^*CHS), δ3.92-3.91 (1H×5.3, br, H-2'), δ3.84-3.82 (1H×5.3×3, br, H-5, H-5', H-6b), δ3.78 (1H×5.3×2, dd, J_gem = 13.7, J_vic = 4.5 Hz, H-6a, H-6'b), δ3.72-3.69 (1H×5.3×3, br, J_3/4 =8.2 Hz, H-6'a, H-3', H-3), δ3.67-3.62 (1H×5.3, br, H-4'), δ3.53 (1H×5.3, d, J_2/1 = 10.0 Hz, H-2), δ3.41 (1H×5.3, t, J_4/3 = 9.5 Hz, H-4), δ3.37-3.36 (4H, br, Link CH₂ ^*CH₂NCH₂CH₂CONHPh), δ3.33-3.30 (4H, br, Link NHCOCH₂CH₂ ^*NCO), δ3.27-3.24 (1H×5.3, br, H-1'b), δ3.17-3.05 (1H×5.3 + 1H, m, J_gem = 13.1, J_vic = 6.2 Hz, H-1'a, Biotin NHCHCH^*S), δ2.88-2.84 (9H, br, CH₂×4 + 1H, Link NCH₂ ^*CH₂NHCOPh, Biotin NHCHCH₂ ^*S), δ2.77-2.70 (1H, br, Biotin NHCHCH₂ ^*S), δ2.60-2.65 (4H, br, Link NHCOCH₂ ^*CH₂NCO), δ2.56 (8H, br, CH₂×4, Link NCH₂CH₂ ^*CONHPh), δ2.20 (2H, t, J_B12/B11 = 5.0 Hz, Biotin COCH₂ ^*CH₂CH₂CH₂) δ2.18-2.13 (4H, br, Link CH₂CH₂ ^*NCH₂CH₂NHCOPh), δ1.59-1.55 (2H, br, Biotin COCH₂CH₂ ^*CH₂CH₂), δ1.54-1.43 (2H, br, Biotin COCH₂CH₂CH₂CH₂ ^*), δ1.28-1.27 (2H, br, Biotin COCH₂CH₂CH₂ ^*CH₂)であった。また、ESI−MS（positive）m/z 1702.2［(M8+2H)²⁺］, 1540.3［(M7+2H)²⁺］, 1376.9［(M6+2H)²⁺］であった。なお、M6: マルトースを６分子有するのリガンドの分子量、M7: マルトースを７分子有するリガンドの分子量、M8: マルトースを８分子有するリガンドの分子量である。
【０１５９】
（４−２ 糖分子が４単位のリガンドの合成）
上記では集合させる糖をビオチンリンカー１０に対して大過剰に加えたために、必要以上の糖が集合した不均一な集合体が得られた。そこで目的とする糖分子が４単位（分子）のリガンドを得るために、加える糖分子の当量を調製した。ここでは、集合化させる糖分子として、グルコース、マルトース、ラクトースの３種類を選択した。
【０１６０】
初めに、実施例１にて得られたビオチンリンカー１０を用いて、前記一般式（１６）にてＹがＯで表される構造を備えているリガンドを以下の手順にて合成した。
【０１６１】
下記一般式（２０）に示すように、グルコースをビオチンリンカー１０に対してまず６当量加え、グルコースを順次加え合計で１２当量加えたとき、未反応のリンカーがまだ残存しても還元剤を加えた以外は、上記実施例４の（４−１）と同様に操作を行い、本発明のリガンドとして化合物１９を得た。
【０１６２】
【化２１】

【０１６３】
終夜還元したビオチンリンカー１０／グルコース反応溶液を、ＨＰ−２０を用いて同様に精製して得られた生成物は、ＥＳＩ−ＭＳ測定の結果、グルコースが４または５分子集合した化合物の混合物であることが確認された。グルコースの集合化度はこの生成物のＮＭＲを測定し、グルコース還元体であるグルシトールの１位プロトンとリンカー内の芳香族プロトン（16Hを基準）の強度比から計算した。両者の強度比は４．２：１６となり、グルコースが平均して４．２分子集合していると見積もった。グルコースがｎ分子集合した化合物の分子量（Ｍｗ）はビオチンリンカーの分子量１１２０．４とグルコースが１分子集合した際の分子量増加１６４．１を用いて式▲２▼のように表される。
【０１６４】
Ｍｗ＝１１２０．４＋１６４．１ｎ （式▲２▼）
上記（式▲２▼）にｎ＝４．２を代入し分子量１８０９．２を得て、これを基に計算すると、化合物１９の収率は２４％と求められた。収率が低いのはＨＰ−２０を用いた精製の際に損失があったためである。このように当量を調整することでグルコースがほぼ４分子集合した化合物を合成することができた。以下、末端にグルシトール型の化合物を４．２分子持つ化合物１９を４−Ｇｌｃと略称する。
【０１６５】
化合物１９を得るために、具体的に次のような操作を行った。すなわち、ビオチンリンカー１０（4.91 mg, 3.11 mmol）と、グルコース（3.45 mg, 19.2 mmol）とを混合溶媒（水/酢酸/メタノール = 12/1/15, 0.2 mL）に溶解させ、室温で８時間撹拌し、ビオチンリンカー１０／グルコース反応溶液を得た。このビオチンリンカー１０／グルコース反応溶液に、さらにグルコース（1.64 mg, 9.1 mmol）を加えて室温で終夜撹拌後、水素化シアノホウ素ナトリウム（4 mg, 48 mmol）を加えて室温で終夜撹拌し、還元した。還元したビオチンリンカー１０／グルコース反応溶液を減圧濃縮し、残渣をＨＰ−２０（70 mL）を用いて精製し、メタノールで溶出させた画分を集めて濃縮し、残渣を凍結乾燥させて、化合物１９として白色結晶を得た。
【０１６６】
得られた化合物１９は、収量2.77 mg（収率35％）であった。また、得られた化合物１９の¹H NMR （500 MHz, D₂O）測定を行ったところ、δ7.05-7.02 (4H, m, aromatic H), δ6.86-6.52 (12H, m, aromatic H), δ4.44 (1H, dd, J_B7/B6 = 5.3, J_B7/B3 = 7.5 Hz, Biotin NHCH^*CH₂S), δ4.17 (1H, dd, J_B3/B4 = 4.5, J_B3/B7 = 7.9 Hz, Biotin NHCH^*CHS), δ3.92 (4H, td, J = 8.6, 4.7 Hz, H-2), δ3.80-3.73 (12H, m, H-3, 6b, 5), δ3.68-3.60 (8H, m, 1H×4×2, H-6a, 4), δ3.30-3.25 (20H, m, 1H×4+ CH₂×2×2, H1a, Link CH₂ ^*CH₂NCH₂CH₂CONHPh, CONCH₂ ^*CH₂CONH), δ3.07 (4H, 1H×4, dd, J_gem = 13.2, J_vic = 8.2 Hz, H1b), δ3.06-3.04 (1H, m, Biotin NHCHCH^*S),δ2.86-2.83 (8H, CH₂×4, br, Link NCH₂ ^*CH₂CONHPh), δ2.63-2.61 (4H, m, 2H×2, Link CONCH₂CH₂ ^*CONH), δ2.54-2.53 (8H, br, CH₂×4, Link NCH₂CH₂ ^*CONHPh), δ2.21-2.06 (6H, br, CH₂×3, Link CH₂CH₂ ^*NCH₂CH₂CONHPh, Biotin COCH₂ ^*CH₂CH₂CH₂), δ1.55 (2H, br, CH₂×1, Biotin COCH₂CH₂ ^*CH₂CH₂), δ1.43-1.42 (2H, br, CH₂×1, Biotin COCH₂CH₂CH₂ ^*CH₂), δ1.30-1.23 (2H, br, CH₂×1, Biotin COCH₂CH₂CH₂CH₂ ^*)であった。また、ESI−MS （positive）m/z 911.4［(M+2Na)²⁺］であった。[a]_D ²² = +0.373 （c 0.0295, H₂O）であった。
【０１６７】
次に、実施例１にて得られたビオチンリンカー１０を用いて、前記一般式（１７）にてＹがＯで表される構造を備えているリガンドを以下の手順にて合成した。
【０１６８】
上記一般式（２０）に示すように、グルコースに変えてマルトースを８当量用いた以外は、上記実施例４の（４−１）と同様に操作を行い、本発明のリガンドとして化合物２０を得た。得られた化合物２０は、そのＮＭＲにおいて末端グルコース１位プロトンと、芳香族プロトンの強度比が４．１：１６となり、平均してマルトースが４．１分子集合した化合物であると見積もられた。化合物２０の収率は上記（式▲１▼）に集合化度４．１を代入して化合物１９の場合と同様に計算すると、６９％と求められた。以下、末端にα−グルコースを４．１分子持つ化合物２０を４−Ｍａｌと略称する。
【０１６９】
化合物２０を得るために、具体的に次のような操作を行った。すなわち、ビオチンリンカー１０（25.0 mg, 15.8 μmol）と、マルトース（34.3 mg, 95.1 μmol）とを混合溶媒（水/酢酸/メタノール = 15/1/15, 0.55 mL）に溶解させて、室温で９時間撹拌し、ビオチンリンカー１０／マルトース反応溶液を得た。ビオチンリンカー１０／マルトース反応溶液に、さらにマルトース（10.7 mg, 29.7 μmol）を加えて室温で終夜撹拌後、水素化シアノホウ素ナトリウム（15 mg, 240 μmol ）を加えて室温で終夜撹拌し、還元させた。還元させたビオチンリンカー１０／マルトース反応溶液を減圧濃縮し、残渣をＨＰ−２０（70 mL）を用いて精製し、水／メタノール＝１／１及びメタノールで溶出された画分を集めて濃縮し、残渣を凍結乾燥させて、化合物２０として白色結晶を得た。
【０１７０】
得られた化合物２０は、収量26.7 mg（収率70%）であった。また、得られた化合物２０の」¹H NMR（500 MHz, D₂O）測定を行ったところ、δ7.06-7.01 (4H, m, aromatic H), δ6.78-6.77 (4H, m, aromatic H^.), δ6.70-6.66 (4H, m, aromatic H^.), δ6.51-6.50 (4H, m, aromatic H), δ5.04 (4H, d, 1H×4, J_vic = 2.7 Hz, H-1), δ4.43 (1H, dd, J_B7/B6 = 8.0, J_B7/B3 = 4.9 Hz, Biotin NHCH^*CH₂S), δ4.19-4.17 (1H, br, Biotin NHCH^*CHS), δ3.92-3.90 (8H, m, CH×4×2, H-2',5'), δ3.83-3.80 (8H, m, CH×4×2, H-5, 6'a), δ3.73 (8H, dd, CH×4×2, J_3/2 = 5.2, J_3'/2' = 5.0 Hz, H-3, 3'), δ3.60 (4H, dd, CH×4, J = 7.4, 11.7 Hz, H-4'), δ3.53 (4H, dd, CH×4, J_2/3 = 8.0, J_2/1 = 3.7 Hz, H-2), δ3.41 (4H, t, CH×4, J = 9.5 Hz, H-4), δ3.30-3.22 (12H, m, 1H×4 + CH₂×2×2, H1'b, Link CH₂ ^*CH₂NCH₂CH₂CONHPh, CONCH₂ ^*CH₂CONH), δ3.14 (4H, dd, 1H×4, J_gem = 12.9, J_vic = 8.0 Hz, H1'a), δ3.06 (1H, m, Biotin NHCHCH^*S),δ2.84-2.83 (9H, br, CH+CH₂×4, Link NCH₂ ^*CH₂CONHPh, Biotin NHCHCH₂ ^*S), δ2.70-2.66 (5H, br, CH+CH₂×4, Link CONCH₂ ^*CH₂CONH, Biotin NHCHCH₂ ^*S),δ2.62-2.60 (4H, br, CH₂×2, Link CONCH₂CH₂ ^*CONH), δ2.53-2.52 (8H, br, CH₂×4, Link NCH₂CH₂ ^*CONHPh),δ2.20-2.04 (6H, br, CH₂×3, Link CH₂CH₂ ^*NCH₂CH₂CONHPh, Biotin COCH₂ ^*CH₂CH₂CH₂), δ1.55 (2H, br, CH₂×1, Biotin COCH₂CH₂ ^*CH₂CH₂), δ1.43-42 (2H, br, CH₂×1, Biotin COCH₂CH₂CH₂ ^*CH₂), δ1.30-1.23 (2H, br, CH₂×1, Biotin COCH₂CH₂CH₂CH₂ ^*)であった。また、ESI−MS（positive）m/z 817.0［(M+3H)³⁺］であった。[a]_D ²²= +5.11（c 0.243, H₂O）であった。Calcd for C₁₀₄H₁₆₅N₁₅O₄₈S・11.9 H₂O: C, 47.30; H7.16; N, 7.96%. Found: C, 47.30; H, 6.88; N, 7.86%。
【０１７１】
次に、実施例１にて得られたビオチンリンカー１０を用いて、前記一般式（１８）にてＹがＯで表される構造を備えているリガンドを以下の手順にて合成した。
【０１７２】
上記一般式（２０）に示すように、グルコースに代えて、ラクトースを８当量用いた以外は、上記（４−１）と同様に操作を行い、本発明のリガンドとして化合物２１を得た。得られた化合物２１は、ＮＭＲ測定において、ガラクトース１位プロトンと芳香族プロトン強度比は４．２：１６となり、ラクトースが平均４．２分子集合した化合物であると見積もられた。この場合も上記式▲１▼による分子量の計算が可能となり、集合化度４．２を代入し分子量２４７７．８を得て、これをもとにして計算すると収率は５７％と求められた。以下、末端にβ−ガラクトースを４．２分子持つ化合物２１を４−Ｌａｃと略称する。
【０１７３】
化合物２１を得るために、具体的に次のような操作を行った。ビオチンリンカー１０（7.88 mg, 5.0 μmol）、ラクトース（10.6 mg, 29.4 μmol）を混合溶媒（水/酢酸/メタノール = 20/1/15, 0.4 mL）に溶解させて、室温で１０時間撹拌し、ビオチンリンカー１０／ラクトース反応溶液を得た。このビオチンリンカー１０／ラクトース反応溶液に、さらにラクトース（3.59 mg, 10.0 μmol）を加え室温で終夜撹拌後、水素化シアノホウ素ナトリウム（5 mg, 80 μmol）を加えて室温で終夜撹拌し還元した。還元したビオチンリンカー１０／ラクトース反応溶液を減圧濃縮し、残渣をＨＰ−２０（70 mL）を用いて精製し、水／メタノール＝１／１及びメタノールで溶出させた画分を集めて濃縮し、残渣を凍結乾燥させて、化合物２１として白色結晶を得た。
【０１７４】
得られた化合物２１は、収量7.08 mg（収率59%）であった。得られた化合物２１の¹H NMR （600 MHz, D₂O）測定を行ったところ、δ6.99 (4H, d, J = 8.3 Hz, aromatic H), δ6.72 (4H, d, J = 6.9 Hz, aromatic H^.), δ6.65 (4H, d, J = 8.3 Hz, aromatic H), δ6.47 (4H, t, J = 6.2 Hz, aromatic H), δ4.38 (4H, d, 1H×4, J_vic = 7.7 Hz, H-1), δ4.35 (1H, m, Biotin NHCH^*CH₂S), δ4.09 (1H, dd, J_B3/B4 =4.4, J_B3/B7 =7.9 Hz, Biotin NHCH^*CHS), δ3.97-3.94 (4H, m, CH×4, H-2'), δ3.84-3.81 (8H, m, CH×4×2, H-5, 5'), δ3.79 (8H, d, CH×4×2, J_4/3 =3.0 Hz, H-4, 6a), δ3.75-3.73 (12H, m, CH×4×3, H-3', 6'a, 6b), δ3.63 (4H, dd, CH×4, J_4'/3'= 6.1 Hz, H-4', 6'b), δ3.57-3.56 (4H, m, CH₂×4, Link CH₂ ^*CH₂NCH₂CH₂CONHPh ), δ3.52 (4H, dd, J_3/2 = 10.0, J_3/4 = 3.5 Hz, H-3), δ3.49 (4H, t, CH₂×2, J = 6.3 Hz, Link CH₂CH₂ ^*NCH₂CH₂CONHPh), δ3.46 (4H, dd, J_2/1 = 7.7, J_2/3 = 10.0 Hz, H-2), δ3.29-3.19 (12H, br, CH×4 + CH₂×4, Link NCH₂ ^*CH₂CONHPh, H-1'b), δ3.02-2.98 (5H, m, Biotin NHCHCH^*S, H-1'a), δ2.81-2.75 (9H, br, CH+CH₂×4, Link NCH₂ ^*CH₂CONHPh, Biotin NHCHCH₂ ^*S), δ2.59 (1H, d, J_gem = 13.2 Hz, Biotin NHCHCH₂ ^*S), δ2.48 (8H, br, Link NCH₂CH₂ ^*CONHPh), δ2.13-2.03 (6H, br, Link CONCH₂CH₂ ^*CONH, Biotin COCH₂ ^*CH₂CH₂CH₂), δ1.47 (2H, br, CH₂×1, Biotin COCH₂CH₂ ^*CH₂CH₂), δ1.35 (2H, br, CH₂×1, Biotin COCH₂CH₂CH₂CH₂ ^*), δ1.18 (2H, br, CH₂×1, Biotin COCH₂CH₂CH₂ ^*CH₂)であった。また、ESI−MS（positive）m/z 831.3［(M+3Na)³⁺］であった。[a]_D ²² = −11.3 （c 0.292,H₂O）であった。Calcd for C₁₀₄H₁₆₅N₁₅O₄₈S・10.4 H₂O: C, 47.78; H7.12; N, 8.04%. Found: C, 47.78; H, 6.95; N, 8.00%。
【０１７５】
〔比較例１・アセチルリンカーを用いたリガンド〕
本実施例では対照化合物として、ビオチンのかわりにアセチル基を導入したリンカー化合物を合成した。すなわち、下記一般式（２１）に示すように、ビオチンを導入する前の２級アミンである化合物８に、ピリジン中無水酢酸を反応させてアセチル化し、化合物１４を得た。その後、化合物１４の末端のＢｏｃ基を先と同じ条件で脱保護してリンカー化合物１５を定量的に得た。以下このリンカー化合物１５をアセチルリンカー１５と略称する。
【０１７６】
【化２２】

【０１７７】
化合物１４を得るために、具体的に次のような操作を行った。すなわち、化合物８（13.1 mg, 54.5 μmol）をピリジン（0.5 mL）に溶解させ、これに無水酢酸（0.5 mL, 5.3 mmol）を加えて室温で４時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮し、トルエンで２回共沸し、残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（5 g, クロロホルム：メタノール = 10 : 1 〜5 : 1）で精製して、化合物１４として黄色結晶を得た。
【０１７８】
得られた化合物１４は、収量12.8 mg（収率95%）であった。また、得られた化合物１４の¹H NMR（400 MHz, CD₃OD）測定を行ったところ、δ7.60 (4H, s, aromatic H), 7.09-6.97 (12H, m, aromatic H), δ3.32 (4H, t, J = 6.6 Hz, AceNCH₂ ^*CH₂CONH), δ3.19-3.17 (4H, br, AceNCH₂CH₂CONHCH₂ ^*), δ2.77 (8H, t, J = 6.1 Hz, NCH₂CH₂ ^*CONHPh), δ2.52 (4H, t, J = 6.4 Hz, AceNCH₂CH₂CONHCH₂CH₂ ^*), δ2.42 (8H, d, J = 6.1 Hz, NCH₂ ^*CH₂CONHPh), δ2.12 (4H, t, J = 6.6 Hz, AceNCH₂CH₂ ^*CONH), δ1.90 (s, 3H, Me of Ace), δ1.40 (s, 36H, Me of Boc)であった。また、ESI−MS（positive）m/z 668.9［(M+2H)²⁺］であった。
【０１７９】
また、アセチルリンカー１５を得るために、具体的に次のような操作を行った。すなわち、化合物１４（12.8 mg, 9.6 μmol）をジクロロメタン（0.5 mL）に溶解させ、トリフルオロ酢酸（0.5 mL）を加えて０℃で１時間撹拌し、化合物１４／トリフルオロ酢酸反応溶液を得た。この化合物１４／トリフルオロ酢酸反応溶液を減圧濃縮し、残渣をＬＨ２０（140 mL, メタノール溶出）を用いて精製して、アセチルリンカー１５として黄色結晶を得た。
【０１８０】
得られたアセチルリンカー１５は、収量14.9 mg（100%）であった。また、得られたアセチルリンカー１５の¹H NMR（400 MHz, CD₃OD）測定を行ったところ、δ7.50 (4H, s, aromatic H), δ7.27-7.19 (8H, m, aromatic H),δ6.86-6.81 (4H, m, aromatic H), δ3.57-3.51 (12H, br, AceNCH₂CH₂CONHCH₂ ^*, NCH₂ ^*CH₂CONHPh),δ3.40 (4H, dd, J = 6.4 Hz, AceNCH₂ ^*CH₂CONH), δ3.35-3.32 (4H, br, J_5/4 = 5.1 Hz, AceNCH₂CH₂CONHCH₂CH₂ ^*), δ2.91 (4H, t, J_7/6 = 6.1 Hz, NCH₂CH₂ ^*CONHPh), δ1.88 (s, 3H, Me of Ace)であった。ESI−MS（positive）m/z 647.8［(M+2H)²⁺］であった。
【０１８１】
上記のように得られたアセチルリンカー１５を用いて、マルトースを集合化させリガンドを得た。下記一般式（２２）に示すように、ビオチンリンカー１０にグルコースを反応させたのに代えて、アセチルリンカー１５に対して合計で２７当量のマルトースを反応させた以外は、上記実施例４の（４−１）と同様に操作を行い、化合物１８を得た。
【０１８２】
【化２３】

【０１８３】
得られた化合物１８は、そのＮＭＲにおいてマルトース非還元末端１位プロトンとリンカー由来の芳香族プロトンの強度比が７．９：１６となり、平均してマルトースが７．９分子集合した化合物であると見積もった。マルトースがn分子集合した化合物の分子量（Ｍｗ）は、アセチルリンカー１５の分子量９３６．１とマルトースが１分子集合する際の分子量増加３２６．３を用いて、式▲３▼のように表される。
【０１８４】
Ｍｗ＝９３６．１＋３２６．３ｎ （式▲３▼）
上記（式▲３▼）にｎ＝７．９を代入し、分子量３５６２．８を得て、これを基に化合物１８収率を計算すると５０％と求められた。以下この化合物１８をＡｃｅ−８−Ｍａｌと略称する。
【０１８５】
化合物１８を得るために、具体的に次のような操作を行った。すなわち、アセチルリンカー１５（3.73 mg, 7.3 μmol）と、マルトース（11.5 mg, 33.6 μmol）とを混合溶媒（水/酢酸/メタノール = 6/1/15, 0.25 mL）に溶解させて室温で終夜撹拌後、さらにマルトース（13.0 mg, 38.0 μmol）を加えて室温で撹拌し、7時間後に再びマルトース（14.7 mg, 42.9 μmol）を加えてから、水素化シアノホウ素ナトリウム（20 mg, 320 μmol）を加えて室温で終夜撹拌し、反応溶液を得た。この反応溶液に、水素化シアノホウ素ナトリウム（20 mg,320 μmol）を再び加えて室温で終夜撹拌した。この再び水素化シアノホウ素ナトリウムを加えた反応溶液を減圧濃縮し、残渣をＨＰ−２０（70 mL）を用いて精製し、水／メタノール＝１／１で溶出させた画分を集め濃縮し、残渣を凍結乾燥させて、化合物１８として白色結晶を得た。
【０１８６】
得られた化合物１８は、収量7.02 mg（50%, 8置換体として換算）であった。また、得られた化合物１８の¹H NMR（500 MHz, D₂O）測定を行ったところ、δ7.09-7.04 (4H, br, J = 7.6 Hz, aromatic H), δ6.93-6.91 (4H, br, aromatic H), δ6.65-6.58 (8H, br, aromatic H), δ5.05 (1H×8, d, J_1/2 = 2.3 Hz, H-1), δ3.88 (1H×8×2, br, H-2', 5'), δ3.83 (1H×8, br, H-5), δ3.82 (1H×8, br, H-6b), δ3.74 (1H×8×2, dd, J_gem = 12.4, J_vic = 5.5 Hz, H-6'b, H-6a), δ3.69 (1H×8, br, J_3/4 = 9.4 Hz, H-3), δ3.67-3.64 (1H×8×2, br, H-3', 6'a), δ3.59-3.57 (1H×8, br, H-4'), δ3.53 (1H×8, dd, J_2/1 = 9.9, J_2/3 = 3.5 Hz, H-2),δ3.41 (1H×8, t, J_4/3 = 9.6 Hz, H-4), δ3.30 (8H, br, Link CH₂ ^*CH₂NCH₂CH₂CONHPh, NHCOCH₂CH₂ ^*NCO), δ3.24 (1H×8, br, H-1'b), δ3.15 (1H×8, br, H-1'a), δ2.87-2.82 (8H, br, Link NCH₂ ^*CH₂CONHPh), δ2.66 (4H, br, J = 8.0 Hz, Link CH₂CH₂ ^*NCH₂CH₂CONHPh), δ2.57 (8H, br, Link NCH₂CH₂ ^*CONHPh), δ2.10-2.08 (4H, br, J = 7.1 Hz, Link NHCOCH₂ ^*CH₂NCO), δ1.88 (3H, s, Me of Ace)であった。また、ESI−MS（positive）m/z 1190.4 ［(M8+2Na+H)³⁺］, 1081.1 ［(M7+2H+Na)³⁺］であった。なお、M7: マルトースを７分子有するリガンドの分子量、M8: マルトースを８分子有するリガンドの分子量である。
【０１８７】
〔比較例２・芳香族アミノ基を２残基有するビオチンリンカーを用いたリガンド〕
比較対照のために、下記一般式（２３）に示すように特許文献２に記載の末端に芳香族アミノ基を２残基もつリンカー化合物２２（divalent type、ビオチンリンカー２２と呼ぶ）を用い、糖分子を２単位（分子）集合させ、リガンドを合成した。
【０１８８】
【化２４】

【０１８９】
上記実施例４の（４−２）で得た糖分子４単位を集合させたリガンドの場合と同様にして、ビオチンリンカー２２を用いて糖分子を２単位集合させたリガンドを合成した。なお、２単位集合させる糖にはグルコースとマルトースを選択した。
【０１９０】
初めに、ビオチンリンカー２２にグルコースを集合させ、リガンドである化合物２３を得た。下記一般式（２４）に示すように、ビオチンリンカー１０に対してグルコースを反応させるのに代え、ビオチンリンカー２２に対して４当量のグルコースを反応させた以外は、上記実施例４の（４−１）と同様に操作を行い、化合物２３を得た。化合物２３の集合化度は、化合物２３のＮＭＲ測定においてグルコース還元体であるグルシトール１位プロトンとビオチンリンカー２２内の芳香族プロトン（8Hを基準）の強度比から計算した。両者の強度比は２．１：８となり、化合物２３にはグルコースが平均して２．１分子集合していると見積もった。グルコースがn分子集合した化合物の分子量（Ｍｗ）はビオチンリンカー２２の分子量５６７．７とグルコースが１分子集合する際の分子増加１６４．１を用いて式▲４▼のように表される。
【０１９１】
Ｍｗ＝５６７．７＋１６４．１ｎ （式▲４▼）
上記（式▲４▼）にｎ＝２．１を代入し、分子量９１２．３を得て、これを基に化合物２３の収率を計算すると７３％と求められた。以下、化合物２３を２−Ｇｌｃと略称する。
【０１９２】
次に、ビオチンリンカー２２にマルトースを集合させ、リガンドである化合物２４を得た。下記一般式（２４）に示すように、グルコースに代えマルトースを用いた以外は、上記化合物２３を得た操作と同様にマルトースを集合化させ、化合物２３を得た。化合物２４のＮＭＲ測定において、末端グルコース１位プロトンとビオチンリンカー２２内の芳香族プロトン（8Hを基準）の強度比は２．０：８となり、化合物２４には、マルトースが平均して２．０分子集合していると見積もられた。マルトースがｎ分子集合した化合物の分子量（Ｍｗ）は、ビオチンリンカー２２の分子量５６７．７とマルトースが１分子集合する際の分子量増加３２６．３を用いて式▲５▼のように表される。
【０１９３】
Ｍｗ＝５６７．７＋３２６．３ｎ （式▲５▼）
上記（式▲５▼）にｎ＝２．０を代入して、分子量１２０７．２を得て、これを基に化合物２４の収率を計算したところ、７６％と求められた。以下、化合物２４を２−Ｍａｌと略称する。
【０１９４】
【化２５】

【０１９５】
化合物２３を得るために、具体的に次のような操作を行った。すなわち、ビオチンリンカー２２（4.14 mg, 7.3 μmol）と、グルコース（3.84 mg, 21.3 μmol）とを混合溶媒（水/酢酸/メタノール = 6/1/15, 0.25 mL）に溶解させて、室温で６時間撹拌し、ビオチンリンカー２２／グルコース反応溶液を得た。このビオチンリンカー２２／グルコース反応溶液に、さらにグルコース（1.38 mg, 7.66 μmol）を加えて室温で終夜撹拌後、水素化シアノホウ素ナトリウム（6 mg, 96 μmol）を加えて室温で終夜撹拌し還元した。この還元したビオチンリンカー２２／グルコース反応溶液を減圧濃縮し、残渣をＨＰ−２０（70 mL）を用いて精製し、水／メタノール＝１／１で溶出させた画分を集めて濃縮し、残渣を凍結乾燥させて、化合物２３として白色結晶を得た。
【０１９６】
得られた化合物２３は、収量4.84 mg（収率74%）であった。得られた化合物２３の¹H NMR（600MHz, D₂O）測定を行ったところ、δ7.51 (4H, d, J = 6.6 Hz, aromatic H), δ6.62 (4H, d, J = 9.1 Hz, aromatic H), δ4.33 (1H, dd, J_B7/B4 = 3.0, J_B7/B6 = 5.0 Hz, Biotin NHCH^*CH₂S), δ3.88 (2H, dd, J_2/1 = 4.4, J_2/3 = 4.9 Hz, H-2), δ3.84 (1H, dd, J_B3/B4 = 4.4, J_B3/B7 = 3.7 Hz, Biotin NHCH^*CHS), δ3.75 (2H, dd, J_3/2 = 4.9, J_3/4 = 3.2 Hz, H-3), δ3.74-3.72 (2H, m, H-6b), δ3.72-3.69 (4H, br, CH₂×2, Link NCH₂CH₂ ^*NHCOPh),δ3.69-3.67 (2H, m, H-5), δ3.64 (4H, t, CH₂×2, J = 4.6 Hz, Link NCH₂ ^*CH₂NHCOPh), δ3.60 (2H, dt, J_4/3 = 2.5, J_4/5 = 7.7 Hz, H-4), δ3.53 (2H, dd, J = 2.2, 6.0 Hz, H-6a), δ3.33-3.29 (2H, dt, J_gem = 13.7, J_vic = 4.7 Hz, H-1a), δ3.11 (2H, dt, J_gem = 11.2, J_vIc = 3.3 Hz, H-1b), δ2.72 (1H, dd, J_gem =12.9, J_vic =5.0 Hz, Biotin NHCHCH₂ ^*S), δ2.57 (1H, d, J_gem = 13.2 Hz, Biotin NHCHCH₂ ^*S), δ2.55-2.53 (1H, m, J = 3.3 Hz, Biotin NHCHCH^*S), δ2.14 (2H, t, J_B12/B11 = 7.0 Hz, Biotin COCH₂ ^*CH₂CH₂CH₂), δ1.22-1.10 (4H, m, CH₂×2, Biotin COCH₂CH₂ ^*CH₂CH₂ ^*)であった。また、ESI−MS（positive）m/z 470.7［(M+2Na)²⁺］であった。[a]_D ²² = +6.61（c 0.145,H2 O）であった。Calcd for C₄₀H₆₁N₇O₁₄S・6.5 H₂O: C, 47.45; H, 7.31; N, 9.69%. Found: C, 47.44; H,6.580; N, 9.60%。
【０１９７】
また、化合物２４を得るために、具体的に次のような操作を行った。すなわち、ビオチンリンカー２２（4.12 mg, 7.3 μol）とマルトース（7.9 mg, 22.1 μmol）とを混合溶媒（水/酢酸/メタノール = 12/1/15, 0.25 mL）に溶解させて室温で終夜撹拌しビオチンリンカー２２／マルトース反応溶液を得、その後水素化ホウ素シアノナトリウム（6 mg, 96 μmol）を加えて室温で終夜撹拌し還元した。この還元したビオチンリンカー２２／マルトース反応溶液を減圧濃縮し、残渣をＨＰ−２０（70 mL）を用いて精製し、水／メタノール＝１／１で溶出させた画分を集めて濃縮し、残渣を凍結乾燥させて、化合物２４として白色結晶を得た。
【０１９８】
得られた化合物２４は、収量6.71 mg（収率75%）であった。また、得られた化合物２４の¹H NMR（500 MHz, D₂O）測定を行ったところ、δ7.60 (4H, d, J = 4.5 Hz, aromatic H), δ6.74 (4H, d, J = 8.8 Hz, aromatic H), δ5.09 (2H, d, J_1/2 = 3.7 Hz, H-1), δ4.44 (1H, dd, J_B7/B6 = 4.8, J_B7/3 = 3.1 Hz, Biotin NHCH^*CH₂S), δ3.95-3.93 (2H, br, H-2'), δ3.91-3.90 (2H, br, H-5'),δ3.90-3.89 (2H + 1H, br, Biotin NHCH^*CHS, H-3'), δ3.87-3.86 (2H, br, H-5), δ3.82 (2H, d, J_gem =12.7 Hz, H-6a), δ3.76 (2H, dd, J_gem =12.5, J_vic =5.2 Hz, H-6b), δ3.72 (4H, m, 1H×2×2, J_gem = 12.1, J_3/4 = 9.3 Hz, H-6'a, H-3), δ3.66 (4H, br, CH₂×2, Link NCH₂CH₂ ^*NHCOPh), δ3.62 (4H, d, J_gem = 11.8 Hz, H-6'b, H-4'), δ3.58-3.54 (6H, m, CH₂×2 + 1H×2, Link NCH₂ ^*CH₂NHCOPh, H-2), δ3.42 (2H, t, J_4/3 = 9.6 Hz, H-4), δ3.37 (2H, dt, J_gem = 13.7, J_vic = 4.8 Hz, H-1'b), δ3.29 (2H, td, J_gem = 7.4, J_vic = 3.0 Hz, H-1'a), δ2.83 (2H, dd, J_gem = 13.0, J_vic = 5.1 Hz, Biotin NHCHCH₂ ^*S), δ2.67 (2H, d, J_gem = 12.8 Hz, Biotin NHCHCH₂ ^*S), δ2.65-2.62 (2H, m, Biotin NHCHCH^*S), δ2.24 (2H, t, J_B12/B11 = 7.0 Hz, Biotin COCH₂ ^*CH₂CH₂CH₂), δ1.31-1.19 (4H, m, CH₂×2, J_B11/B12 = 7.0, J_B9/B10= 7.4 Hz, Biotin COCH₂CH₂ ^*CH₂CH₂ ^*), δ0.95-0.91 (2H, m, Biotin COCH₂CH₂CH₂ ^*CH₂)であった。また、ESI−MS（positive）m/z 632.8［(M+2Na)²⁺］であった。[a]_D ²²= +6.95 （c 0.222, H₂O）であった。Calcd for C₅₂H₈₁N₇O₂₄S・9.1 H₂O: C, 45.13; H, 7.17; N, 7.09%.Found: C, 45.13; H, 6.63; N, 7.37%。
【０１９９】
以上のように、糖分子を４単位あるいは２単位集合させたリガンドを合成した。以下これらのリガンドを用いてタンパク質との相互作用をＳＰＲ測定により解析した。
【０２００】
〔実施例５・ＳＰＲ法を用いた糖分子とタンパク質との特異的相互作用〕
ＳＰＲ測定ではアナライトがリガンド以外の分子と非特異的に相互作用する場合が多い。そのため実際の測定では、特異的な相互作用と非特異的なものとが合わさった共鳴角度変化を観測している。非特異的な相互作用を低減し、特異的な相互作用を観測するということが測定上の最大の問題点となる。本発明者らは、この問題点を次の方法（２チャンネル解析法と称する）により解決できるのではないかと考えた。
【０２０１】
本実施の形態で用いるＳＴＲ測定を行う装置ＳＰＲ６７０（商品名、Nippon Laser & Electronics LAB）には、（Ｓ）,（Ｒ）という２つのチャンネルがあり、図３に示すように、それぞれの表面上のリガンドとアナライトとの相互作用を同時に観測できる。例えば、一方の表面は４−Ｍａｌを、他方には４−Ｇｌｃを固定化し、グルコースに結合するレクチンであるコンカナバリンＡ（Concanavalin A，Con A）をこれら２つの表面に同時に同条件で流すとする。Con Aは４−Ｍａｌの末端に存在するグルコピラノースと結合するが、これを持たない４−Ｇｌｃとは結合しにくいと考えられる。４−Ｍａｌと４−Ｇｌｃとは、末端に存在する糖の有無以外は同じ構造なので、Con Aとの相互作用に差があるとすれば、４−Ｍａｌに存在するグルコピラノースに起因すると考えられる。すなわち観測される（Ｓ）,（Ｒ）の共鳴角度変化の差がグルコピラノースとCon Aとの特異的な相互作用に相当する。
【０２０２】
このように２種類の異なるリガンドを（Ｓ）と（Ｒ）とにそれぞれ固定化し、両者の相互作用の差を観測するという従来の手法を応用し、末端の糖の有無以外は同じ構造を持つ化合物をリガンドとして用いることによって、糖分子とタンパク質との特異的な相互作用が検出できることを本発明者らは見いだした。
【０２０３】
（５−１ リガンド導入チップの作製）
初めに、ＳＰＲ測定により糖分子とタンパク質との相互作用解析を行うために、センサチップにリガンドを固定化した。すなわち、実施例４で合成したリガンドをビオチン−アビジンの結合を利用してチップ上に固定化させ、リガンド導入チップ（リガンド担持体）を得た。なお、アビジンをＳＰＲセンサチップ上に固定化させてから、リガンドを固定化した。
【０２０４】
具体的にリガンド導入チップを得るために、以下のような操作を行った。すなわち、初めに、１３×２０×０．７ｍｍのガラス基盤に５０ｎｍの金薄膜を蒸着した日本レーザー電子株式会社製のセンサチップを、ＵＶオゾンクリーナー（商品名：NL−UV253、日本レーザー電子株式会社）に入れて紫外線を２０分間照射し、オゾンでセンサチップの表面を洗浄した。次に、このセンサチップを１００μＭの4,4'−ジチオ酪酸エタノール溶液の入ったシャーレに浸し、室温で３０分間緩やかに振とうさせた（商品名：Bio Dancer、New Brunswick Scientific社）。チップに4−チオ酪酸を、金−硫黄結合を用いて固定させた。このチップをエタノールで３回洗浄したのち、１６０ｍＭ水溶性カルボジイミド水溶液１ｍＬと１３ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド 1,4−Dioxan溶液９ｍＬとの混合溶液の入ったシャーレに浸し、室温で３０分間緩やかに振とうさせた。シャーレに水１０ｍＬを加え室温で５分間振とうさせて、活性化反応を終了させた。チップを水で４回洗浄し風乾後、ＳＰＲ６７０のセンサチップカートリッジに取り付けた。センサチップカートリッジに取り付けたチップにランニングバッファーを流し、レーザー光を金膜に照射させ、そのとき観測される表面プラズモン共鳴角度変化をモニターした。なお、ランニングバッファーは、ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液（PBS）を用い、サンプルを流すとき以外は、常にランニングバッファーを流速５ｍＬ／ｍｉｎでチップ上に流した。またＳＰＲ測定はすべて一定温度（25℃）で行い、測定で用いるサンプル溶液は全て、シリンジフィルター（Whatman(copyright) PURADISC（登録商標） 25TF 0.2 mm PTFE Membrane filter）を用いてろ過してから使用した。
【０２０５】
上記チップにランニングバッファーを流し、共鳴角度変化が一定になってから、０．１ｍｇ／ｍＬニュートロアビジン（PIERCE, NeutrAvidin（登録商標）,CA47105 ）酢酸ナトリウム水溶液（10 mM, pH 5.5）を，流速５μＬ／ｍｉｎで６０μＬずつ３回流した。ＳＰＲでサンプル溶液を流した後はランニングバッファーに切り替え、余分なサンプルを洗い流して、共鳴角度変化が一定になってから次の操作を行った。残存する活性エステルを不活性化（キャッピング）するために、１．０Ｍアミノエタノールを含むＰＢＳ溶液（pH 8.5）を流速５μＬ／ｍｉｎで６０μＬずつ２回流し、アビジン付加チップ（アビジン付加体）を得た。
【０２０６】
続いて、種々の濃度の実施例４で得たリガンドのＰＢＳ溶液を、流速１０μＬ／ｍｉｎで６０μＬずつ順に流し、上記アビジン付加チップ上にリガンドを固定化させ、リガンド導入チップ（リガンド担持体）を得た。なお、リガンドの固定化はＳＰＲセンサーグラムでレゾナンスユニットの上昇が認められなくなるまで繰り返えした。
【０２０７】
リガンドを固定化させるまでのＳＰＲセンサーグラムの一例を図４に示す。ここではＳチャンネル（以下（Ｓ）と略称する）には上記実施例４の（４−３）で得た４−Ｍａｌ、Ｒチャンネル（以下（Ｒ）と略称する）には４−Ｇｌｃを固定化させた時のセンサーグラムを表示した。センサーグラムは、横軸は時間、縦軸は共鳴角度変化（Response（ＲＵ；Response Unit））を示している。
【０２０８】
アナライトを添加する時以外は、チップ上にランニングバッファーとしてリン酸緩衝溶液（pH 7.4, 以下PBSと略称する）が流速５μＬ／ｍｉｎで絶えず流れている。チップ上へのアナライトの添加が終了すると、自動的にＰＢＳが流れて、結合に関与しなかった余分なアナライトを洗浄するようにした。０．１ｍｇ／ｍＬのニュートロアビジン酢酸ナトリウム溶液（10 mM 酢酸ナトリウム，pH 5.5）を流速５μＬ／ｍｉｎで６０μＬ流すと、共鳴角度の増加が観測され、ニュートロアビジンが上記チップに固定化されたことが分かった。
【０２０９】
その後チップ上に残存する活性エステルをキャッピングするため、１．０Ｍエタノールアミンを含むＰＢＳ溶液を、流速５μＬ／ｍｉｎで６０μＬ流した。キャッピングの後、共鳴角度変化が一定になった時点と、ニュートロアビジン溶液を流す前と後との共鳴角度変化量を固定化量とした。このセンサーグラムでの固定化量は（Ｓ）が３６９０ＲＵ、（Ｒ）が３４８０ＲＵとなった。
【０２１０】
次に、（Ｓ）には４．９μＭ、１６．３μＭ、４９μＭの４−Ｍａｌ溶液を、（Ｒ）には０．４９μＭ、４．９μM の４−Ｇｌｃ溶液を流速１０μＬ／ｍｉｎで６０μＬ流して固定化した。固定化されなかった過剰なリガンドを洗い流し、共鳴角度変化が一定になった時点と、固定化前との共鳴角度変化量をリガンドの固定化量とした。なおリガンドの固定化は、集合体を流しても固定化量が増えない状態に達するまで繰り返し行った。このセンサーグラムでの４−Ｍａｌの固定化量は２２０ＲＵ、４−Ｇｌｃの固定化量は２２０ＲＵとなり、２種類の異なるリガンドが同程度に固定化されたリガンド導入チップが作製できた。同様の手法でリガンドの異なる種々のリガンド導入チップを作製した。
【０２１１】
（５−２ リガンドの固定化についての検証）
合成したリガンドが、ビオチン−ニュートロアビジンの結合によりチップ上に固定化されているかどうかを、ビオチンを持たない比較例１で得たアセチルリンカー１５によりマルトースを集合化させた化合物１８（Ace−8−Mal）を用いてＳＰ測定で検証した。すなわち、５．３−Ｍａｌと同じ条件で、Ａｃｅ−８−Ｍａｌをニュートロアビジンが固定化されたチップ上に流し、これが固定化されなければ、非特異的なリガンドの固定化がないことを確認できる。
【０２１２】
まず、上記（５−１）と同様にニュートロアビジンを固定化させたアビジン付加チップを作製した。このときのニュートロアビジンの固定化量は、（Ｓ）が６６２０ＲＵ、（Ｒ）が６３３０ＲＵであった。このチップの（Ｓ）に順に、０．６１μＭのＡｃｅ−８−Ｍａｌ溶液、５．４８μＭのＡｃｅ−８−Ｍａｌ溶液、０．６１μＭの５．３−Ｍａｌ溶液、５．４８μＭの５．３−Ｍａｌ溶液を、流速１０μＬ／ｍｉｎで６０μＬ流し、（Ｒ）にはＰＢＳだけを流し続けた。このときの（Ｓ）と（Ｒ）との差に相当する（Ｄ）のセンサーグラムを重ねて描いたのが、図５である。なお、同図では、Ａｃｅ−８−ＭａｌはＡｃｅ−Ｍａ１と、５．３−ＭａｌはＢｉｏ−Ｍａｌと表記している。
【０２１３】
図５に示すように、ＳＰＲ測定の結果からビオチンを含む５．３−Ｍａｌが特異的にチップ上に固定化され、ビオチンを含まないＡｃｅ−８−Ｍａｌは、全く固定化されなかった。したがって、ビオチンリンカーを用いて糖分子を集合化した化合物（リガンド）は、ビオチン−アビジン（ニュートロアビジン）の結合によって特異的にチップ上に固定化することができた。
【０２１４】
（５−３ リガンド導入チップを用いた糖分子とレクチンとの相互作用）
上記（５−１）で得られたリガンド導入チッップに、種々の濃度のタンパク質のＰＢＳ溶液を、流速２０μＬ／ｍｉｎで６０μＬずつ流し、ＳＰＲ測定により、リガンド導入チップとタンパク質との結合及び解離の挙動を観測した。
【０２１５】
なお用いたタンパク質は以下の通りである。
＊）BSA（SIGMA ALUBMUN,BOVINE）
＊）Concanavalin A（コンカナバリンＡ，SEIKAGAKU KOGYO）
＊）Pea Lectin（エンドウマメレクチン，SEIKAGAKU KOGYO）
＊）Peanut Lectin（ピーナッツレクチン，SEIKAGAKU KOGYO）
＊）RCA₁₂₀（ヒママメレクチン，SEIKAGAKU KOGYO）
なお、上記タンパク質が導入されたリガンド導入チップは、該リガンド導入チップ表面に、１０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を６０μＬ／ｍｉｎで６０μＬ流すことによって解離させ再生させて、再使用した。この操作もセンサーグラムでレクチンを流す前のレゾナンスユニット値（Response（ＲＵ；Response Unit））になるまで、１〜３回繰り返して行った。
【０２１６】
初めに、上記（５−１）で得られた、５．３−Ｍａｌと８−Ｇｌｃとを用いたリガンド導入チップで、Con Aとの相互作用を調べた。まず、上記（５−１）と同様にチップにニュートロアビジンを固定化させ、アビジン付加チップを得た。このときのニュートロアビジンの固定化量は、（Ｓ）が５４７０ＲＵ、（Ｒ）が４３８０ＲＵであった。その後、アビジン付加チップの（Ｓ）に５．３−Ｍａｌを、（Ｒ）に８−Ｇｌｃを固定化し、リガンド導入チップを得た。なお、リガンドの固定化量は、（Ｓ）は３９０ＲＵ、（Ｒ）は３９０ＲＵであった。
【０２１７】
このように作成したリガンド導入チップに、１．０ＭのCon A溶液を流速１０μＬ／ｍｉｎで６０μＬ流した。このとき観測された（Ｓ）、（Ｒ）および両者の差に相当する（Ｄ）の共鳴角度変化を図６に示す。図６に示すように、Con A溶液を流すとリガンド導入チップ上のリガンドとCon Aとが結合して、（Ｓ）、（Ｒ）とも共鳴角度が上昇した。次に結合に関与しなかったCon Aを洗い流してＰＢＳを流速１０μＬ／ｍｉｎで約１０００秒流した後、１０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液を流速６０μＬ／ｍｉｎで６０μＬ流し、リガンドに結合したCon Aを解離させた。解離にともなう共鳴角度の急激な減少が見られ、共鳴角度がCon Aを流す前のベースラインと同じレベルで一定になったことから、Con Aが完全に解離したことが分かった。同図中の（Ｄ）は、結合、解離を表す典型的なＳＰＲセンサーグラムと同様になった。すなわちこの系でCon Aとグルコピラノースとの特異的な相互作用を観測できた。
【０２１８】
さらに、上記リガンド導入チップに様々な濃度のCon Aを作用させ相互作用をＳＰＲ測定した。また、BSA、およびPSAとの相互作用についてもＳＰＲ測定し共鳴角度変化観測した。
【０２１９】
以上の結果から、次の以下のことが明らかとなった。すなわち、合成したビオチンリンカーによって糖分子を集合化させたリガンドは、アビジン（ニュートロアビジン）を固定化させたチップ上に固定化することができる。またCon Aとグルコピラノースとの特異的な相互作用を解析することができる。
【０２２０】
また、リガンド導入チップを用いた「２チャンネル解析法」によって、タンパク質との非特異的な相互作用を打ち消すことができると結論した。また、ConAと同様に、グルコピラノース認識レクチンであるPSAが特異的に相互作用しなかったことから、糖認識能をもつレクチンでも、チップ上に固定化された糖分子とは結合の程度に差が出るということが分かった。
【０２２１】
また、本発明の４−Ｍａｌ及び４−Ｇｌｃと、比較例である２−Ｍａｌ及び２−Ｇｌｃとを固定化させたリガンド導入チップを作製し、これを用いて様々な濃度の、Con A, BSA, PSA, RCA₁₂₀, PNA溶液を流し、ＳＰＲ測定して共鳴角度変化観測した。
【０２２２】
糖分子の集合化の度合いによるレクチンとの相互作用の違いについて、得られた結果をまとめて表１に示した。
【０２２３】
【表１】

【０２２４】
表１より、解離定数（K_D）は値が小さいほど分子間の結合が強いことを表している。表１を用いて、同じアナライトに対する解離定数を比較すると、４単位の糖分子が集合した系が、２単位の系の約２／３の値であることがわかる。すなわち糖をより多く集合化させたことにより、Con Aとの結合が強くなったことが確認された。
【０２２５】
さらに詳細な検討をするためにCon Aとリガンドとの結合速度定数（k_a）、解離速度定数（k_d）を比較すると次のことが明らかになった。すなわち両者の結合速度には差がないが、解離速度は、糖分子を４単位有するリガンドが２単位のもの約１／２の値であり、比較的大きな差が見受けられた。つまり糖分子を４単位有するリガンドでは、結合したCon Aが解離しにくい状況にあるということが分かった。集合化させる糖分子の数を増やすと、結合速度には変化は出ないが、一度結合したCon Aが解離した後に再結合する機会が増えて解離速度が低下し、この影響により解離定数が小さな値になったと考えられる。この結果から本発明のリンカー化合物は糖分子を集合化させ、クラスター効果によって相互作用する分子との結合を強めることが確認された。
【０２２６】
次に、糖分子を変えて、ガラクトースとガラクトース認識レクチンの相互作用を解析した。上記（５−１）で得た末端のガラクトースの有無だけが異なる４−Ｌａｃと４−Ｇｌｃとをニュートロアビジンチップに固定化したリガンド導入チップを用いた。濃度の異なるRCA₁₂₀、また、PNAを用いて上記と同様のＳＰＲ測定を行った。また、４−Ｌａｃと４−Ｇｌｃとのリガンド導入チップに、様々の濃度のCon A, BSA, PSA, RCA₁₂₀ , PNA溶液を流してＳＰＲ測定を行い、共鳴角度変化（Ｄ）を観測した。これらの観測結果から、ラクトースを集合化させたリガンドを用いれば、ガラクトースとガラクトース結合レクチンRCA₁₂₀及びPNAとの特異的な相互作用を解析することができることが明らかになった。
【０２２７】
以上により得られたＳＰＲ測定の結果から以下のことが言える。
１）本研究で合成したリンカーを用いて糖分子を集合化させたリガンドを、ビオチン−アビジン（ニュートロアビジン）の結合によってＳＰＲセンサチップ上に固定化させることができた。
２）「２チャンネル解析法」と称される、末端の糖分子以外が同じ構造である対照リガンドを用いる方法によって、ＳＰＲ測定で一番問題となる非特異的な相互作用を相殺して、糖とタンパク質との特異的な相互作用を検出することを可能にした。
３）集合化度の異なる糖リガンドを固定化させた糖チップを用いることによって、クラスター効果による糖分子とレクチンとの結合の増強を観察することができた。
【０２２８】
以上のように、本発明のリンカー化合物は、糖分子を集合化し、得られる集合体（リガンド導入チップ）は、ＳＰＲ測定によるレクチンと糖との相互作用解析に充分適用できるものである。
【０２２９】
〔実施例６・アフィニティクロマトグラフィ〕
（６−１ アフィニティカラム作製）
実施例４で合成したリガンドを用いてアフィニティカラムを作製した
一般に行われているアフィニティカラムの作製法に従い、実施例４で得られたリガンド４−Ｍａｌを固定化したアフィニティカラムを作製した。カラム担体はAmersham社製Hitrap NHS−activated Hp （カラム体積1 mL）を用いた。これはゲルマトリックスにスペーサを介して活性基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドが固定化されており（ゲル1 mL 当たり10 mmol NHS 基）、アミノ基を持つ化合物を担体上に固定化させるのに適している。アフィニティーカラムの作製手順の概略を図６に示す。
【０２３０】
カラムへの溶液の注入は、カラムに接続した１ｍＬもしくは５ｍＬのシリンジ（商品名：テルモシリンジ、ガンマ線滅菌済み 1 mL, 5 mL）を用いて、カラムの下端から流出する溶液が毎秒1滴の流速となるよう手動で行った。また、全ての溶液はシリンジフィルター（Millex−GS SyringeDriveFilterUnit0.22 μm）を用いてろ過したものを用いた。バッファーとして以下の１〜３の溶液を調製した。
【０２３１】
１）ニュートロアビジンカップリングバッファー（0.5 M 塩化ナトリウム含有の10mM 酢酸ナトリウム水溶液 pH 5.5 ）
２）ブロッキングバッファー（0.5 M 塩化ナトリウム含有の0.5 M エタノールアミン水溶液 pH 8.3 ）
３）洗浄バッファー（0.5 M 塩化ナトリウム含有の0.1 M 酢酸ナトリウム水溶液 pH4.0 ）
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドがゲル坦体に固定化されたゲル坦体を充填してある活性化カラム（Amasharm 社製Hitrap NHS−activated HP ）１ｍＬに、氷冷した１ｍＭ塩酸１ｍＬを通じ充填されていたイソプロパノールを除去した。その後すぐ２．０ｍｇ／ｍＬのニュートロアビジン カップリングバッファー溶液１ｍＬを通じ、密栓し室温で３０分放置した。次にブロッキングバッファー６ｍＬを通じて密栓し、室温で３０分放置したあと、洗浄バッファー６ｍＬ、ブロッキングバッファー６ｍＬ、ＰＢＳ６ｍＬを順に通じた。その後０．５ｍｇ／ｍＬのリガンド（4−Mal）ＰＢＳ溶液を１ｍＬ通じ、密栓し室温で３０分放置した。その後ＰＢＳ５ｍＬを通じて過剰なリガンドを洗い流した。
【０２３２】
（６−２ アフィニティクロマトグラフィ）
上記（６−１）で得られたアフィニティカラムを用いて、リガンドと相互作用するタンパク質と、相互作用しないタンパク質とを分離した。なお、用いたタンパク質は以下の３種類である。
【０２３３】
＊）BSA（SIGMA ALUBMUN,BOVINE）
＊）Concanavalin A（Con A, SEIKAGAKU KOGYO）
＊）Pea Lectin （PSA, SEIKAGAKU KOGYO）
実施例５の（５−３）のＳＰＲ測定の結果から、Con Aは４−Ｍａｌと強く結合し、水酸化ナトリウム水溶液によって解離することが分かっている。またPSAおよびBSAは特異的に相互作用しないことも分かっている。
【０２３４】
以上のことから、これらのタンパク質の混合溶液をアフィニティーカラムに通すと、Con A のみが４−Ｍａｌに結合してカラムに保持され、それ以外は素通りして溶出されると予想した。保持されたCon A は、水酸化ナトリウムを含むＰＢＳ溶液をカラムに通じることで溶出されると考えられる。または結合阻害剤としてグルコース溶液をカラムに通じても溶出されると考えた。なお、このアフィニティクロマトグラフィの手順を、図７示す。
【０２３５】
初めに、（６−１）で作製したカラムに、それぞれのタンパク質の最終濃度が1 mM になるように調整したタンパク質混合ＰＢＳ溶液１ｍＬを通じ、密栓し５分室温で放置した。
【０２３６】
続けてＰＢＳ５ｍＬを通じ、流出液を１ｍＬずつ集めた（Mix−1.2.3.4.5 とした）。次に解離剤として順に０．１ｍＭ，１．０ｍＭ，１０ｍＭ，１ＭグルコースＰＢＳ溶液を５ｍＬずつ通じ、それぞれの流出液を１ｍＬずつ集めた（順に0.1Glc−1 〜5, 1Glc−1 〜5, 10Glc−1 〜5,1000Glc−1 〜5 とした）。ＰＢＳ５ｍＬを通じてカラムを洗浄後、１０ｍＭ水酸化ナトリウムＰＢＳ溶液５ｍＬを通じ、流出液を１ｍＬずつ集めた（NaOH−1.2.3.4.5とした）。
【０２３７】
（６−３・タンパク質の同定）
上記（６−２）のアフィニティクロマトグラフィにより、集めた画分は紫外分光計を用いて波長２８０ｎｍでの吸光度を測定し、吸収が認められた画分を、以下のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。
【０２３８】
初めに以下の溶液を調製した。なお、全ての溶液はシリンジフィルター（Millex−GS Syringe Drive Filter Unit 0.22 mm ）を用いてろ過してから用いた。
＊）0.5 M Tris−HCl 緩衝溶液pH 6.8
＊）泳動槽用緩衝溶液（ナカライテスク製 泳動用緩衝溶液使用）
＊）サンプル調整用バッファー （SDS 0.3 mg, 2−メルカプトエタノール 0.3 mL, グリセリン 6 mL, 50 mM Tris−HCl 緩衝溶液3 mL, イオン交換水1 mL）
＊）マーカー色素溶液（ブロムフェノールブルー 1 mg, グリセリン 0.1 mL, イオン交換水 0.9 mL ）
＊）クマジーブリリアントブルー染色液（ナカライテスク製ラピッドステインCBBキット使用）
集めた画分１ｍＬを凍結乾燥してから、イオン交換水１００μＬを加え再度溶解させた。この溶液２０μＬとサンプル調整用バッファー１０μＬを混合し、９５℃で１０分加熱してサンプル溶液を調整した。泳動用緩衝溶液を充填した電気泳動槽に既成ゲル（ATTO PAGEL−Compact AE−6000（SDS 12.5%含有））をセットし、各レーンに、マーカー色素溶液を１μＬと、変性させたサンプル溶液を１０μＬずつのせ２０ｍＡの一定電流で泳動させた。スタンダードとしてPrestained protein maeker. Low range（ナカライテスク製）を同時に泳動した。泳動終了後ゲルを取りだし、クマジーブリリアントブルー染色液に浸し室温で５０分振盪させた（New Brunswick Scientific 社製Bio Dancer 使用）。振盪後ゲルをイオン交換水で洗浄し、さらに６０℃のイオン交換水に浸し脱色させた。脱色したゲルは乾燥させて保存した。
【０２３９】
具体的には、１２．５％アクリルアミドゲル（ATTO PAGEL−Compact AE−6000）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマジーブリリアントブルーによって染色した。この結果が図８である。図８に示すように、Mix−2画分まではCon A，PSA，BSAの３つバンドが見られ、これらが溶出されていることがわかる。Mix−3ではBSA，PSAのバンドが消え、Con Aのバンドだけが現れている。それ以降の画分にはBSA，PSAのバンドは見られず、Mix−4，Mix−5，10Glc−1，NaOH−2のいずれの画分にもCon Aのバンドが見られた。これらの結果から、次の２つのことが分かった。
（1）BSA，PSAはカラムを素通りした。（過剰量のタンパク質をアプライしたために吸着されるはずのCon Aの一部も溶出されていて、Mix−2にも３つのタンパク質すべてが見られる。）
（2）大部分のCon Aは、担体上の４−Ｍａｌと結合して保持され、溶離剤によってカラムから溶出する。
【０２４０】
以上の結果からわかるように、４−Ｍａｌを固定化させたアフィニティーカラムを用いて、Con AとPSAとBSAとの混合溶液からCon Aだけを選択的に分離することができた。
【０２４１】
【発明の効果】
本発明のリンカー化合物は、以上のように、４単位以上の糖分子を導入可能な部位として、４つの芳香族アミノ基を有している。また、糖分子と特異的に相互作用するタンパク質の検出や分離を行う際に用いられるタンパク質分析用の支持体に結合可能な部位として、ビオチン部位又はイミノビオチン部位を有している。
【０２４２】
それゆえ、上記リンカー化合物を用いることによって、上記支持体に４単位以上の糖分子を再現性よく２次元的に配列させることができるという効果を奏する。また、上記リンカー化合物は、タンパク質との非特異的な相互作用の影響をほぼ無視することができるので、糖分子とタンパク質との相互作用を観測する際に、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。
【０２４３】
また、本発明のリガンドは、上記リンカー化合物に糖分子を導入してなるものである。
【０２４４】
それゆえ、上記リガンドを、例えば、タンパク質分析用の支持体表面に導入することにより、２次元的に複数の糖分子を再現性よく集合化させて配列させることができるので、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になるという効果を奏する。
【０２４５】
従って、上記リンカー化合物又はリガンドを用いることにより、糖分子と特異的に相互作用するタンパク質の検出や分離を行うためのＳＰＲやアフィニティクロマトグラフィ、遺伝子工学でのバイオプローブ等にて、タンパク質分析用の支持体に糖分子の導入を好適に行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）〜（ｄ）は、本発明におけるリガンドを導入するために、アビジンを固定した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサチップを作成する工程を示す斜視図である。
【図２】（ａ）は本発明にかかるリガンド導入チップであり、（ｂ）は同図（ａ）のリガンド導入チップとタンパク質との相互作用を表す斜視図である。
【図３】本発明のリガンドのＳＰＲ測定に用いた「２−チャンネル解析法」の模式図である。
【図４】本発明のリガンド担持体を得る工程におけるＳＰＲ測定の結果を表すグラフである。
【図５】本発明のリガンド（Ｍａｌ−Ｂｉｏ）と比較例のリガンド（Ａｃｅ−Ｍａ１）と相互作用を表すＳＰＲ測定の結果を表すグラフである。
【図６】本発発明のリガンド５．３−Ｍａｌおよび８−ＧｌｃとコンカナバリンＡとの相互作用を表すＳＰＲ測定の結果を表すグラフである。
【図７】（ａ）〜（ｃ）は、本発明におけるリガンド担持体を有するアフィニティカラムを作成する工程を示す図である。
【図８】アフィニティクロマトグラフィの手順を表す図である。
【図９】４−Ｍａｌとタンパク質との結合についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す図である。
【符号の説明】
１ ガラス基板
２ アビジン（ストレプトアビジン）
３ リガンド
４ リガンド導入チップ（リガンド担持体）
５ タンパク質

Claims (2)

1. 一般式（１）
   

   

   （式中、ＹはＯ又はＮＨで表される構造を有する）にて表される構造を備え、
   上記Ｘは、一般式（２）
   

   

   （式中、ｍ１，ｍ２，ｎ１，ｎ２，ｐ１，ｐ２，ｐ３，ｐ４は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数）にて表される構造を備えていることを特徴とする多岐用途型リンカー化合物。
2. 請求項１記載の多岐用途型リンカー化合物の芳香族アミノ基に、糖分子を導入してなるものであり、一般式（３）
   

   

   （式中、ｍ１，ｍ２，ｎ１，ｎ２，ｐ１，ｐ２，ｐ３，ｐ４は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数）にて表される構造、または一般式（４）
   

   

   （式中、ＹはＯ又はＮＨで表される構造を有し、ｍ１，ｍ２，ｎ１，ｎ２，ｐ１，ｐ２，ｐ３，ｐ４は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数）にて表される構造を備えることを特徴とするリガンド。

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