JP4430123B1 - 細胞培養基材及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 下記式(1)で表すモノマー(a)の重合体(A)と、下限臨界溶解温度を有する重合体(B)と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される1種以上の無機材料(C)とを含有する細胞培養基材。
(式中、R1は水素原子またはメチル基、R2は炭素原子数2〜3のアルキレン基、R3は水素原子または炭素原子数1〜2のアルキル基を表し、nは1〜9の整数を表す。)
【選択図】図1
Description
前記重合体(A)と前記無機材料(C)との質量比((C)/(A))が、0.01〜10の範囲にあり、
細胞培養基材全体に対する前記重合体(B)の含有率が0.0001質量%〜40質量%である細胞培養基材を提供する。
下限臨界溶解温度を有する重合体(B)とを含有し、
前記重合体(A)と前記無機材料(C)との質量比((C)/(A))が、0.01〜10の範囲にあり、
細胞培養基材全体に対する前記重合体(B)の含有率が0.0001質量%〜40質量%である細胞培養基材であって、
該細胞培養基材の細胞培養面に前記重合体(B)が露出していることを特徴とする細胞培養基材を提供する。
前記水媒体(W)中の前記水膨潤性無機材料(C)の濃度が下記式(2)又は式(3)で表される範囲となるように、前記モノマー(a)と前記無機材料(C)と重合開始剤(D)とを水媒体(W)に混合した後、前記モノマー(a)を重合させることにより重合体(A)と前記無機材料(C)との複合体(X)の分散液(L)を製造する第1工程、
前記分散液(L)を支持体に塗布し、その後乾燥することにより前記複合体(X)の薄層を形成する第2工程、
非水溶性の重合開始剤(D)を溶媒(E)に溶解させた溶液を前記複合体(X)の薄層の表面(S)に塗布し、前記溶媒(E)を揮発させる第3工程、
前記表面(S)に前記モノマー(b)の水溶液を塗布した後、紫外線の照射により前記モノマー(b)を重合させる第4工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法を提供する。
式(2) Ra<0.19のとき
無機材料(C)の濃度(質量%)<12.4Ra+0.05
式(3) Ra≧0.19のとき
無機材料(C)の濃度(質量%)<0.87Ra+2.17
(式中、無機材料(C)の濃度(質量%)は、無機材料(C)の質量を水媒体(W)と無機材料(C)の合計質量で除して100を掛けた数値、Raは無機材料(C)と重合体(A)との質量比((C)/(A))である。)
前記モノマー(a)と前記無機材料(C)と重合開始剤(D)とを混合した水媒体(W)を支持体に塗布して、
前記モノマー(a)を重合させることにより、重合体(A)と前記無機材料(C)との複合体(X)の薄層を形成する第1工程、
非水溶性の重合開始剤(D)を溶媒(E)に溶解させた溶液を前記複合体(X)の薄層の表面(S)に塗布し、溶媒(E)を揮発させる第2工程、
前記モノマー(b)の水溶液を前記表面(S)に塗布した後、紫外線の照射により前記モノマー(b)を重合させる第3工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法を提供する。
前記水媒体(W)中の前記無機材料(C)の濃度が下記式(2)又は式(3)で表される範囲となるように、前記モノマー(a)と前記無機材料(C)と重合開始剤(D)とを水媒体(W)に混合した後、前記モノマー(a)を重合させることにより、重合体(A)と前記無機材料(C)との複合体(X)の分散液(L)を製造する第1工程、
前記分散液(L)に、前記モノマー(b)の重合体である重合体(B)を添加し、混合して、支持体に塗布した後、乾燥させる第2工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法を提供する。
式(2) Ra<0.19のとき
無機材料(C)の濃度(質量%)<12.4Ra+0.05
式(3) Ra≧0.19のとき
無機材料(C)の濃度(質量%)<0.87Ra+2.17
(式中、無機材料(C)の濃度(質量%)は、無機材料(C)の質量を水媒体(W)と無機材料(C)の合計質量で除して100を掛けた数値、Raは無機材料(C)と重合体(A)との質量比((C)/(A))である。)
本発明の細胞培養基材は、下記三つの方法で製造することができる。
即ち、第一の製造方法としては、前記水媒体(W)中の前記無機材料(C)の濃度が下記式(2)又は式(3)で表される範囲となるように、前記モノマー(a)と前記無機材料(C)と重合開始剤(D)とを水媒体(W)に混合した後、前記モノマー(a)を重合させることにより重合体(A)と前記無機材料(C)との複合体(X)の分散液(L)を製造する第1工程、
前記分散液(L)を基材に塗布し、その後乾燥することにより前記複合体(X)の薄層を形成する第2工程、
非水溶性の重合開始剤(D)を溶媒(E)に溶解させた溶液を前記複合体(X)の薄層の表面(S)に塗布し、前記溶媒(E)を揮発させる第3工程、
前記表面(S)に前記モノマー(b)の水溶液を塗布した後、紫外線の照射により前記モノマー(b)を重合させる第4工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法である。
式(2) Ra<0.19のとき
無機材料(C)の濃度(質量%)<12.4Ra+0.05
式(3) Ra≧0.19のとき
無機材料(C)の濃度(質量%)<0.87Ra+2.17
(式中、無機材料(C)の濃度(質量%)は、無機材料(C)の質量を水媒体(W)と無機材料(C)の合計質量で除して100を掛けた数値、Raは無機材料(C)と重合体(A)との質量比((C)/(A))である。)
本製造方法の第4工程における、前記表面(S)への前記モノマー(b)の水溶液の塗布も第2工程に準じて公知慣用の方法を用いてよい。
非水溶性の重合開始剤(D)を溶媒(E)に溶解させた溶液を前記複合体(X)の薄層の表面(S)に塗布し、溶媒(E)を揮発させる第2工程、
前記モノマー(b)の水溶液を前記表面(S)に塗布した後、紫外線の照射により前記モノマー(b)を重合させる第3工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法である。
前記分散液(L)に、前記重合体(B)を添加し、均一に混合して、支持体に塗布した後、乾燥させる第2工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法である。
式(2) Ra<0.19のとき
無機材料(C)の濃度(質量%)<12.4Ra+0.05
式(3) Ra≧0.19のとき
無機材料(C)の濃度(質量%)<0.87Ra+2.17
(式中、無機材料(C)の濃度(質量%)は、無機材料(C)の質量を水媒体(W)と無機材料(C)の合計質量で除して100を掛けた数値、Raは無機材料(C)と重合体(A)との質量比((C)/(A))である。)
この実施例は第一の製造方法で細胞培養基材を製造する例である。
[モノマー(a)、無機材料(C)、水媒体(W)を含む反応溶液の調製]
モノマー(a)としてアクリル酸2メトキシエチル(東亞合成株式会社製)0.6g、無機材料(C)として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG(Rockwood Additives Ltd.社製)0.3g、水媒体(W)として水20g、を均一に混合して反応溶液(1)を調製した。
溶媒(E)として、2−プロパノール9.8g、重合開始剤(D)として1−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー184」(チバガイギー社製)0.2gを、均一に混合して溶液(2)を調製した。
上記反応溶液(1)全量に、溶液(2)を50μl入れ、均一に分散させた後、365nmにおける紫外線強度が40mW/cm2の紫外線を180秒照射し乳白色の複合体(X)の分散液(L1)を作製した。
この反応系のRa=0.5、無機材料(C)の濃度(質量%)=1.48(%)<0.87Ra+2.17=2.61
直径50mmのポリスチレン製シャーレ(アドバンテック東洋株式会社製、PD−50K)に、上記複合体(X)の分散液(L1)を入れ、スピンコーターを用いて2000回転で該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、80℃の熱風乾燥器中で10分間乾燥させ、複合体(X)の薄層を調製した。
前記溶液(2)をシャーレに入れ、スピンコーターにより2000回転で薄く塗布して、室温で5分間静置してエタノールを揮発させ、重合開始剤(D)を複合体(X)の薄層表面に塗布した。
10質量%のN―イソプロピルアクリルアミド(モノマー(b)、株式会社興人製)水溶液2mlをシャーレに入れ、365nmにおける紫外線強度が40mW/cm2の紫外線を60秒照射して、N−イソプロピルアクリルアミドを重合させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを40℃、5時間乾燥させて、細胞培養基材1を得た。
上記得られた細胞培養基材1に、CS-C complete medium(Cell Systems社製培地)を適量入れ、正常ヒト真皮線維芽細胞を播種して(播種濃度は1.2×104個/cm2)、5%二酸化炭素中、37℃で培養を行った。細胞が十分増殖したのを確認して、その(37℃の)培地を吸い取り、4℃の培地を入れ、一定時間静置させ、増殖した細胞を自然剥離させた。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。またこの剥離にかかった時間を記録した。(表1、細胞の剥離回収率=93%、所要時間は18分であった)。
この実施例は第一の製造方法で細胞培養基材を製造する例である。
第4工程のモノマー(b)として、N―イソプロピルアクリルアミドの17質量%の水溶液を用いたこと以外は、実施例1と同様にして細胞培養基材2を作製した。
実施例1と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養した。細胞が十分増殖したのを確認して、その(37℃の)培地を4℃の培地に交換し、一定時間静置させ、増殖した細胞を自然剥離させた。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。またこの剥離にかかった時間を記録した。(表1、細胞の剥離回収率=98%、所要時間は10分であった)。
この実施例は第二の製造方法で細胞培養基材を製造する例である。
[モノマー(a)、無機材料(C)、水媒体(W)を含む反応溶液の調製]
モノマー(a)としてアクリル酸2メトキシエチル(東亞合成株式会社製)1.28g、無機材料(C)として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG(Rockwood Additives Ltd.社製)0.24g、水媒体(W)として水10g、を均一に混合して反応溶液(3)を調製した。
実施例1と同様な溶液(2)を用いた。
上記反応溶液(3)全量に、溶液(2)を50μl入れ、均一に分散させた後、直径50mmのポリスチレン製シャーレ(アドバンテック東洋株式会社製、PD−50K)に入れ、スピンコーターを用いて2000回転でシャーレの表面に薄く塗布した後、365nmにおける紫外線強度が40mW/cm2の紫外線を180秒照射して、複合体(X)の薄層を調製した。
前記溶液(2)をシャーレに入れ、スピンコーターにより2000回転で薄く塗布して、室温で5分間静置してエタノールを揮発させ、重合開始剤(D)を塗布した。
15質量%のN―イソプロピルアクリルアミド(モノマー(b)、株式会社興人製)水溶液2mlをシャーレに入れ、365nmにおける紫外線強度が40mW/cm2の紫外線を60秒照射して、N−イソプロピルアクリルアミドを重合させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを40℃、5時間乾燥して、細胞培養基材3を得た。
上記得られた細胞培養基材3に、実施例1と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養した。細胞が十分増殖したのを確認して、その(37℃の)培地を4℃の培地に交換し、一定時間静置させ、増殖した細胞を自然剥離させた。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。(表1、細胞の剥離回収率=100%、所要時間は12分であった)。
この実施例は第二の製造方法で細胞培養基材を製造する例である。
第3工程のモノマー(b)として、N―イソプロピルアクリルアミドの3質量%の水溶液を用いたこと以外は、実施例3と同様にして細胞培養基材4を作製した。
上記得られた細胞培養基材4に、実施例1と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養した。細胞が十分増殖したのを確認して、その(37℃の)培地を4℃の培地に交換し、一定時間静置させ、増殖した細胞を自然剥離させた。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。(表1、細胞の剥離回収率=78%、所要時間は30分であった)。
この実施例は第三の製造方法で細胞培養基材を製造する例である。
[モノマー(a)、無機材料(C)、水媒体(W)を含む反応溶液の調製]
モノマー(a)としてアクリル酸2メトキシエチル(東亞合成株式会社製)0.32g、無機材料(C)として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG(Rockwood Additives Ltd.社製)0.08g、界面活性剤として20重量%のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(和光純薬工業株式会社製)水溶液100μl、水媒体(W)として水10g、を均一に混合して反応溶液(5)を調製した。
実施例1と同様な溶液(2)を用いた。
[複合体(X)の分散液(L)の調製(第1工程)]
上記反応溶液(5)全量に、溶液(2)を30μl入れ、均一に分散させた後、365nmにおける紫外線強度が40mW/cm2の紫外線を180秒照射し乳白色の複合体(X)の分散液(L5)を作製した。
モノマー(b)としてN―イソプロピルアクリルアミド(株式会社興人製)1.7g、水10g、溶液(2)140μl、を混合した後、該溶液を入れるガラス容器の周りを冷却しながら(約10℃)、365nmにおける紫外線強度が40mW/cm2の紫外線を180秒照射し、ポリN―イソプロピルアクリルアミドの水溶液(5)を調製した。この溶液に更に水を5g添加し、均一に混合した後、DIGITAL VISCOMATE粘度計(MODEL VM-100A、山一電機株式会社製)を用いてこの溶液の粘度を測定して、粘度は368mPa・sであった。測定時の溶液温度は24.2℃であった。
分散液(L5)全量に、上記ポリN―イソプロピルアクリルアミドの水溶液(5)を1.0g(固形分0.1g)入れ、均一に混合した後、60mmポリスチレン製シャーレ(60mm/Non−Treated Dish、旭テクノグラス株式会社製)に入れ、スピンコーターを用いて2000回転でシャーレの表面に薄く塗布し、80℃の熱風乾燥器中で10分間乾燥させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを40℃、5時乾燥して、細胞培養基材5を得た。
上記得られた細胞培養基材5に、実施例1と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養した。細胞が十分増殖したのを確認して、その(37℃の)培地を4℃の培地に交換し、一定時間静置させ、増殖した細胞を自然剥離させた。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。(表1、細胞の剥離回収率=100%、所要時間7分であった)。
この実施例は第三の製造方法で細胞培養基材を製造する例である。
第2工程のポリN―イソプロピルアクリルアミドの水溶液(5)を0.7g用いたこと以外は、実施例5と同様にして細胞培養基材6を作製した。
上記得られた細胞培養基材6に、実施例1と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養した。細胞が十分増殖したのを確認して、その(37℃の)培地を4℃の培地に交換し、一定時間静置させ、増殖した細胞を自然剥離させた。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。(表1、細胞の剥離回収率=100%、所要時間15分であった)。
(実施例7)
この実施例は第三の製造方法で細胞培養基材を製造する例である。
[重合体(B)水溶液の調製]
モノマー(b)としてN―イソプロピルアクリルアミド(株式会社興人製)0.57g、水100g、を混合し、真空脱気により水溶液中の酸素を十分除去した後、開始剤として0.1gのK2S2O8(ペルオキソ二硫酸カリウム、和光純薬工業株式会社製)、触媒として80μlのN,N,N‘,N’−テトラメチルエチレンジアミン(花王株式会社製)を添加して、20℃、20時間静置して、ポリN―イソプロピルアクリルアミドの水溶液(6)を得た。この水溶液を50℃に加熱し、ポリN―イソプロピルアクリルアミドを沈殿させて、更に50℃の超純水で洗浄した後、80℃、6時間乾燥させて、固体状のポリN―イソプロピルアクリルアミドを作製した。
実施例5の分散液(L5)全量に、上記固体状のポリN―イソプロピルアクリルアミドを0.1g入れ、均一に混合した後、60mmポリスチレン製シャーレ(60mm/Non−Treated Dish、旭テクノグラス株式会社製)に入れ、スピンコーターを用いて2000回転でシャーレの表面に薄く塗布し、80℃の熱風乾燥器中で10分間乾燥させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを40℃、5時乾燥して、細胞培養基材7を得た。
上記得られた細胞培養基材7に、実施例1と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養した。細胞が十分増殖したのを確認して、その(37℃の)培地を4℃の培地に交換し、一定時間静置させ、増殖した細胞を自然剥離させた。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。(表1、細胞の剥離回収率=79%、所要時間29分であった)。
この実施例は第三の製造方法でパターン状の細胞培養基材を製造する例である。
実施例5の分散液(L5)全量に、実施例5のポリN―イソプロピルアクリルアミドの水溶液(5)を0.1g入れ、均一に混合した後、単ノズルパルスインクジェクター(クラスターテクノロジー(株)製)を用いて、厚さ1mmのポリスチレン板に、直径30μm、間隔が約20μmになるように、円形(点)状に塗布した。次いで、80℃の熱風乾燥器中で10分間加熱処理させ、滅菌水によりこのポリスチレン板を洗浄した後、滅菌袋中でポリスチレン板を40℃、5時間乾燥して、細胞培養基材8を得た。
上記得られた細胞培養基材8を60mmポリスチレン製シャーレ(60mm/Non−Treated Dish、旭テクノグラス株式会社製)に入れ、Doulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM)培地(FBSを10%添加)(日水製薬株式会社製)を適量入れ、Balb3T3細胞を播種して(播種濃度は1.0×104個/cm2)、5%二酸化炭素中、37℃で培養を行った。46時間増殖させた細胞を顕微鏡で確認したところ、塗布部分がほぼ全面に細胞に覆われていることが観察された。次いで37℃の培地を4℃の培地に交換し、数分静置したところ、細胞が細胞培養基材8から剥離したことが観察された。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。またこの剥離にかかった時間を記録した。(表1、細胞の剥離回収率=98%、所要時間は9分であった)。
この実施例は第三の製造方法で細胞培養基材を製造する例である。
[モノマー(a)、無機材料(C)、水媒体(W)を含む反応溶液の調製]
モノマー(a)としてポリオキシプロピレンモノアクリレート「ブレンマAP−400」(日本油脂株式会社製)0.91g、シリカとしてスノーテックス20(20重量%のコロイダルシリカ水溶液、日産化学工業株式会社製)0.4g(固形分0.08g)、界面活性剤として20重量%のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(和光純薬工業株式会社製100μl、水媒体(W)として水10g、を均一に混合して反応溶液(9)を調製した。
実施例1と同様な溶液(2)を用いた。
上記反応溶液(7)全量に、溶液(2)を30μl入れ、均一に分散させた後、365nmにおける紫外線強度が40mW/cm2の紫外線を180秒照射し淡い乳白色の複合体(X)の分散液(L9)を作製した。
分散液(L9)全量に、実施例5のポリN―イソプロピルアクリルアミド水溶液(5)を0.7g入れ、均一に混合した後、60mmポリスチレン製シャーレ(60mm/Non−Treated Dish、旭テクノグラス株式会社製)に入れ、スピンコーターを用いて2000回転でシャーレの表面に薄く塗布し、80℃の熱風乾燥器中で10分間乾燥させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを乾燥して、細胞培養基材(9)を得た。
上記得られた細胞培養基材9に、実施例1と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養した。細胞が十分増殖したのを確認して、その(37℃の)培地を4℃の培地に交換し、増殖した細胞を自然剥離させ、剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。(表1、細胞の剥離回収率=95%、所要時間10分であった)。
放射線滅菌処理した細胞培養基材の性能を示す例である。
[細胞培養基材の放射線滅菌処理]
実施例6の細胞培養基材6に、吸収線量が10kGyになるように、γ線を照射した(照射処理は日本照射サービス株式会社にて行った)。
上記γ線処理を施した細胞培養基材6に、10%FBSを含有するHu-media-EB2培地(Cell Systems社製)を適量入れ、正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を播種して(播種濃度は1.2×104個/cm2)、5%二酸化炭素中、37℃で培養を行った。細胞が十分増殖したのを確認して、その(37℃の)培地を吸い取り、4℃の培地を入れ、一定時間静置させ、増殖した細胞を自然剥離させた。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。またこの剥離にかかった時間を記録した。(表1、細胞の剥離回収率=96%、所要時間は13分であった)。
重合体(B)を含有しない細胞培養基材
[細胞培養基材の作製]
実施例1の分散液(L1)を、60mmポリスチレン製シャーレ(60mm/Non−Treated Dish、旭テクノグラス株式会社製)に入れ、スピンコーターを用いて2000回転でシャーレの表面に薄く塗布した後、80℃の熱風乾燥器中で10分間乾燥させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを乾燥して、細胞培養基材(1′)を得た。
上記得られた細胞培養基材1′に、実施例1と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養した後、その(37℃の)培地を4℃の培地に交換し、増殖した細胞を自然剥離させ、剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。(表1、細胞の剥離回収率=10%、所要時間は30分であった)。該細胞培養基材の細胞増殖性は、細胞培養基材1とほぼ同じであった。
重合体(B)を過剰に含有した細胞培養基材
[細胞培養基材の作製]
実施例1の分散液(L1)に、実施例5のポリN―イソプロピルアクリルアミド水溶液(5)を6.3g入れ(ポリN―イソプロピルアクリルアミドの全固形分に対する含有量は41質量%である)、スピンコーターを用いて2000回転でシャーレの表面に薄く塗布した後、80℃の熱風乾燥器中で10分間乾燥させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを乾燥して、細胞培養基材(2′)を得た。
上記得られた細胞培養基材2′に、実施例1と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞の培養を行った。しかし、播種した細胞が死滅し、増殖は全く見られなかった。
無機材料(C)の濃度が式(3)の範囲を超えた例である。
[モノマー(a)、水膨潤性無機材料(C)、水媒体(W)を含む反応液の調製]
モノマー(a)としてアクリル酸2メトキシエチル(東亞合成株式会社製)1.32g、無機材料(C)として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG(Rockwood Additives Ltd.社製)0.25g、非水溶性の重合開始剤(d1)として溶液(2)25μl、水媒体(W)として水10gを均一に混合して反応液(3′)を調製した。
この比較例から、無機材料(C)の濃度(質量%)が式(3)の範囲を超えると、反応液全体がゲル化してしまい、複合体(X)の分散液(L)が得られず、(第一、第三の製造方法の)シャーレへのコーティングによる細胞培養基材の製造ができないことが理解できる。
ポリN―イソプロピルアクリルアミドと無機材料(C)から構成した三次元網目構造を有するヒドロゲルからなる細胞培養基材の製造例である。
[モノマー、無機材料(C)、水媒体(W)を含む反応液の調製]
モノマーとしてN―イソプロピルアクリルアミド(株式会社興人製)1.13g、無機材料(C)としてLaponite XLG(Rockwood Additives Ltd.社製)0.4g、水媒体(W)として水10gを均一に混合して反応液(4′)を調製した。
溶媒(E)として、ポリオキシプロピレンモノアクリレート「ブレンマAP−400」(日本油脂株式会社製)98g、重合開始剤(d1)として1−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー184」(チバガイギー社製)2gを、均一に混合して溶液(3)を調製した。
上記反応溶液(4′)全量に、溶液(3)を50μl入れ、超音波分散機で均一に分散させた後、60mmポリスチレン製シャーレ(60mm/Non−Treated Dish、旭テクノグラス株式会社製)に入れ、スピンコーターを用いて2000回転でシャーレの表面に薄く塗布し、シャーレの周りを氷で冷やしながら、365nmにおける紫外線強度が40mW/cm2の紫外線を180秒照射し、N―イソプロピルアクリルアミドを重合させて、ヒドロゲルの薄層を作製した。
上記乾燥したヒドロゲルの薄層をシャーレに入れ、CS-C complete medium(Cell Systems社製培地)を適量入れ、正常ヒト真皮線維芽細胞を播種して(播種濃度は1.2×104個/cm2)、5%二酸化炭素中、37℃で培養を行った。細胞が十分増殖したのを確認して、その(37℃の)培地を4℃の培地に交換し、増殖した細胞を自然剥離させ、剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。またこの剥離にかかった時間を記録した。(表1、細胞の剥離回収率=70%、所要時間は30分であった)。
(2)細胞T:マウス腫瘍線維芽細胞(Balb3T3)
(3)細胞H:正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞
また、この細胞培養基材は、酸素を除去することなく極短時間で、容易に製造できることが明らかであった。
Claims (8)
- 下記式(1)で表されるモノマー(a)の重合体(A)と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される1種以上の無機材料(C)とが相互作用することにより形成された複合体と、
下限臨界溶解温度を有する重合体(B)とを含有し、
前記重合体(A)と前記無機材料(C)との質量比((C)/(A))が、0.01〜10の範囲にあり、
細胞培養基材全体に対する前記重合体(B)の含有率が0.0001質量%〜40質量%である細胞培養基材であって、
該細胞培養基材の細胞培養面に前記重合体(B)が露出していることを特徴とする細胞培養基材。
- 前記水膨潤性粘土鉱物が、水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリロナイト、水膨潤性サポナイト及び水膨潤性合成雲母から選択される、水媒体(W)中で1〜10層に層状剥離する1種以上の粘土鉱物であり、前記シリカが水分散性のコロイダルシリカである請求項1又は2に記載の細胞培養基材。
- 前記重合体(B)が、N−置換(メタ)アクリルアミド誘導体及びN,N−ジ置換(メタ)アクリルアミド誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種のモノマー(b)の重合体である請求項1〜3のいずれかに記載の細胞培養基材。
- 前記モノマー(b)が、N−イソプロピル(メタ)アクリルアミド、N−n−プロピル(メタ)アクリルアミド、N−シクロプロピル(メタ)アクリルアミド、N−エトキシエチル(メタ)アクリルアミド、N−テトラヒドロフルフリル(メタ)アクリルアミド、N−エチルアクリルアミド、N−エチル−N−メチルアクリルアミド、N,N−ジエチルアクリルアミド、N−メチル−N−n−プロピルアクリルアミド、N−メチル−N−イソプロピルアクリルアミド、N−アクリロイルピペリディン及びN−アクリロイルピロリディンからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項4記載の細胞培養基材。
- 請求項4記載の細胞培養基材の製造方法であって、
水媒体(W)中の前記無機材料(C)の濃度が下記式(2)又は式(3)で表される範囲となるように、前記モノマー(a)と前記無機材料(C)と重合開始剤(D)とを水媒体(W)に混合した後、前記モノマー(a)を重合させることにより重合体(A)と前記無機材料(C)との複合体(X)の分散液(L)を製造する第1工程、
前記分散液(L)を支持体に塗布し、その後乾燥することにより前記複合体(X)の薄層を形成する第2工程、
非水溶性の重合開始剤(D)を溶媒(E)に溶解させた溶液を前記複合体(X)の薄層の表面(S)に塗布し、前記溶媒(E)を揮発させる第3工程、
前記表面(S)に前記モノマー(b)の水溶液を塗布した後、紫外線の照射により前記モノマー(b)を重合させる第4工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
式(2) Ra<0.19のとき
無機材料(C)の濃度(質量%)<12.4Ra+0.05
式(3) Ra≧0.19のとき
無機材料(C)の濃度(質量%)<0.87Ra+2.17
(式中、無機材料(C)の濃度(質量%)は、無機材料(C)の質量を水媒体(W)と無機材料(C)の合計質量で除して100を掛けた数値、Raは無機材料(C)と重合体(A)との質量比((C)/(A))である。) - 請求項4記載の細胞培養基材の製造方法であって、
前記モノマー(a)と前記無機材料(C)と重合開始剤(D)とを混合した水媒体(W)を支持体に塗布して、
前記モノマー(a)を重合させることにより、重合体(A)と前記無機材料(C)との複合体(X)の薄層を形成する第1工程、
非水溶性の重合開始剤(D)を溶媒(E)に溶解させた溶液を前記複合体(X)の薄層の表面(S)に塗布し、溶媒(E)を揮発させる第2工程、
前記モノマー(b)の水溶液を前記表面(S)に塗布した後、紫外線の照射により前記モノマー(b)を重合させる第3工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法。 - 請求項4記載の細胞培養基材の製造方法であって、
前記水媒体(W)中の前記無機材料(C)の濃度が下記式(2)又は式(3)で表される範囲となるように、前記モノマー(a)と前記無機材料(C)と重合開始剤(D)とを水媒体(W)に混合した後、前記モノマー(a)を重合させることにより、重合体(A)と前記無機材料(C)との複合体(X)の分散液(L)を製造する第1工程、
前記分散液(L)に、前記モノマー(b)の重合体である重合体(B)を添加し、混合して、支持体に塗布した後、乾燥させる第2工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
式(2) Ra<0.19のとき
無機材料(C)の濃度(質量%)<12.4Ra+0.05
式(3) Ra≧0.19のとき
無機材料(C)の濃度(質量%)<0.87Ra+2.17
(式中、無機材料(C)の濃度(質量%)は、無機材料(C)の質量を水媒体(W)と無機材料(C)の合計質量で除して100を掛けた数値、Raは無機材料(C)と重合体(A)との質量比((C)/(A))である。)
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