JP4423006B2 - Method for detecting or separating hepatic stem cells - Google Patents

Description

本発明は、胎児肝臓又は再生中の成体肝臓中の細胞集団から、肝幹細胞を検出又は分離する方法に関する。本発明は、肝臓の再生医療や人工肝臓の開発等に有用である。   The present invention relates to a method for detecting or separating hepatic stem cells from a cell population in fetal liver or regenerating adult liver. The present invention is useful for regenerative medicine of the liver, development of an artificial liver, and the like.

重度の肝臓疾患（劇症肝炎、肝硬変、肝癌など）などに対する根本治療は、肝臓移植しかないが、ドナー不足や免疫抑制療法を生涯行う必要性などの問題点があり、肝移植に代わる新しい治療法の開発が望まれている。その中の一つとして、肝幹細胞を利用した細胞移植療法がある。肝幹細胞とは、肝細胞と胆管上皮細胞の両者に分化する能力を持ち、かつ自己複製能をもつ増殖能に富む、肝臓の幹細胞と定義され、胎児期の肝臓、成体における肝臓にも極く少数存在するとされている。また、ここ数年の研究から、胚性幹細胞（ES細胞）や血液幹細胞、骨髄中の他の幹細胞からも肝幹細胞、あるいは肝細胞を誘導する試みが多数行われている。ここで、重要となってくる問題点の一つが、雑多な細胞集団の中から、肝幹細胞を同定し、それらを高純度で分離する方法である。肝幹細胞を特異的に認識し、それらを高純度で分離・回収する事ができれば、体外での肝幹細胞（未分化肝細胞）の増殖および分化誘導により、ハイブリッド型人工肝臓や細胞移植療法などの臨床応用に極めて有用であり、加えて薬物代謝や肝炎ウイルスの感染・増殖の試験管内におけるモデル実験系となりうる。肝幹細胞を同定し、高効率で分離するには、細胞表面抗原に対する抗体を利用する方法が最も適切であると考えられ、造血幹細胞の分離に頻用されている方法である。肝幹細胞の細胞表面抗原に関しては、これまでほとんど同定されていなかったが、近年、既知の５〜６種類の細胞表面抗原の発現を指標に、マウス胎児肝臓から肝幹細胞を濃縮する方法（非特許文献１）が報告された。しかしながら、この方法は複数の抗体を用いる為に、操作が複雑なことと、成体の肝臓から肝幹細胞を分離することは出来ない。本発明者らのグループは、シグナル配列を持った分子、すなわち細胞表面抗原や分泌性蛋白質をコードする遺伝子、を特異的にクローニングするシグナルトラップ法 (非特許文献２) を用いて、マウス胎生14.5日の肝臓に高発現する遺伝子であるdlkを同定し、抗dlkモノクローナル抗体を用いて、胎児肝臓より１ステップで肝幹細胞を高純度精製できる事を見いだした（特許文献１）。しかしながら、肝幹細胞の細胞表面抗原についての情報は、まだ極めて少なく、できるだけ多くの肝幹細胞の表面抗原を同定する事が重要である。   The basic treatment for severe liver diseases (fulminant hepatitis, cirrhosis, liver cancer, etc.) is only liver transplantation, but there are problems such as shortage of donors and the need to perform immunosuppressive therapy throughout life, a new treatment that replaces liver transplantation The development of a law is desired. One of them is cell transplantation therapy using hepatic stem cells. Hepatic stem cells are defined as hepatic stem cells that have the ability to differentiate into both hepatocytes and biliary epithelial cells and are capable of self-renewal and proliferative ability. It is said that there are a few. In recent years, many attempts have been made to induce hepatic stem cells or hepatocytes from embryonic stem cells (ES cells), blood stem cells, and other stem cells in the bone marrow. Here, one of the important problems is a method of identifying hepatic stem cells from a diverse cell population and separating them with high purity. If hepatic stem cells are specifically recognized and can be isolated and collected with high purity, it can be used to induce hybrid stem cells and cell transplantation therapy by in vitro proliferation and induction of hepatic stem cells (undifferentiated hepatocytes). It is extremely useful for clinical application, and can be a model experiment system in vitro for drug metabolism and hepatitis virus infection / growth. In order to identify hepatic stem cells and separate them with high efficiency, a method using an antibody against a cell surface antigen is considered to be most appropriate, and is a method frequently used for separating hematopoietic stem cells. Although the cell surface antigen of hepatic stem cells has hardly been identified so far, in recent years, a method of concentrating hepatic stem cells from mouse fetal liver using the expression of 5 to 6 known cell surface antigens as an index (non-patented) Reference 1) was reported. However, since this method uses a plurality of antibodies, the operation is complicated and hepatic stem cells cannot be separated from the adult liver. The group of the present inventors uses a signal trap method (Non-patent Document 2) for specifically cloning a molecule having a signal sequence, that is, a gene encoding a cell surface antigen or a secreted protein. We identified dlk, a gene highly expressed in the day's liver, and found that hepatic stem cells could be purified to high purity from fetal liver in one step using an anti-dlk monoclonal antibody (Patent Document 1). However, there is still very little information about the cell surface antigens of hepatic stem cells, and it is important to identify as many hepatic stem cell surface antigens as possible.

Suzuki, A. et al. (2000) Hepatology 32:1230-1239Suzuki, A. et al. (2000) Hepatology 32: 1230-1239 Kojima, T. and Kitamura, T. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 487- 490Kojima, T. and Kitamura, T. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 487-490 Kirchner, J. et al. J. Exp. Med. 190：217-228 (1999)Kirchner, J. et al. J. Exp. Med. 190: 217-228 (1999) WO 02/103033A1WO 02 / 103033A1

本発明の目的は、胎児肝臓又は再生中の成体肝臓中等の細胞集団から、肝幹細胞を検出又は分離する方法を提供することである。   It is an object of the present invention to provide a method for detecting or separating hepatic stem cells from a cell population such as in fetal liver or regenerating adult liver.

本願発明者らは、鋭意研究の結果、胎児肝臓中及び再生中の成体肝臓中の肝幹細胞では、Itm2A(Integral membrane protein 2A)タンパクの遺伝子が特異的に高発現していることを見出し、これが２型膜蛋白質であることを確認し、Itm2Aタンパク又はこれをコードするｍＲＮＡを指標として肝幹細胞の検出又は分離を行うことが可能であることに想到し、本発明を完成した。   As a result of earnest research, the inventors of the present application have found that the gene of the Itm2A (Integral membrane protein 2A) protein is specifically and highly expressed in the liver stem cells in the fetal liver and in the regenerating adult liver. It was confirmed that it was a type 2 membrane protein, and it was conceived that hepatic stem cells could be detected or separated using the Itm2A protein or mRNA encoding it as an indicator, and the present invention was completed.

すなわち、本発明は、Itm2Aタンパク又はこれをコードするｍＲＮＡを指標として、生体外に分離された試料中の肝幹細胞の検出又は分離を行う、肝幹細胞の検出又は分離方法を提供する。
That is, the present invention provides a method for detecting or separating hepatic stem cells, which detects or separates hepatic stem cells in a sample separated in vitro using the Itm2A protein or mRNA encoding the same as an index.

本発明により、胎児肝臓又は再生中の成体肝臓中等の細胞集団から、肝幹細胞を効率良く検出又は分離する方法が提供された。本発明の方法により、肝幹細胞を同定し、高純度で分離回収することが可能となった。このようにして分離した肝幹細胞は、臓器移植に替わる次世代の再生医療として期待がかかる肝細胞移植や、ハイブリッド型人工肝臓、in vitroにおける薬物代謝実験等に使用することが可能であるので、本発明はこれらの分野において大きく貢献するものと期待される。   The present invention provides a method for efficiently detecting or separating hepatic stem cells from a cell population such as in fetal liver or regenerating adult liver. By the method of the present invention, hepatic stem cells can be identified and separated and recovered with high purity. The hepatic stem cells thus isolated can be used for hepatocyte transplantation, which is expected as a next-generation regenerative medicine to replace organ transplantation, a hybrid artificial liver, in vitro drug metabolism experiments, etc. The present invention is expected to make a significant contribution in these fields.

下記実施例に具体的に記載するように、本願発明者らは、マウス胎生12.5日齢の未熟肝細胞と胎生17.5 日齢の出生前肝細胞のcDNAチップ解析による遺伝子発現比較より、膜蛋白質Integral membrane protein 2A (Itm2A: Genbank accession No. NM_008409)が、マウス胎児における未熟肝細胞に高発現していることを見出した。ノザンブロット、免疫染色、ホールマウントin situ ハイブリダイゼーションによるItm2A mRNAの発現解析の結果、マウス胎生10.5日から12.5日の胎児肝細胞に高発現しており、その後、急速に減弱していき、成体肝臓では全く発現していないことがわかった。 胎児肝臓は造血器官として働いており、おもに未熟肝細胞と血球から構成されているが、Itm2Aは血球には全く発現しておらず、未熟肝細胞に発現していた。この時期の未熟肝細胞は、肝芽細胞とも呼ばれ、将来、肝細胞と胆管上皮細胞の２種類の細胞に分化する能力をもつ、肝幹細胞であると考えられている。また、ヒト胎児肝臓の全RNAサンプルを用いて、ヒトItm2A (Genbank accession No. NM_004867のmRNAの発現を調べたところ、ヒトにおいても胎生６週目から１２週目のヒト胎児肝臓においても発現が認められた。すなわち、Itm2Aはマウスだけでなく、ヒトにおいても胎児未熟肝細胞に発現している膜蛋白質であることが判明した。   As specifically described in the following examples, the inventors of the present invention have determined that the membrane protein Integral is compared to the gene expression by cDNA chip analysis of immature hepatocytes of mouse embryonic day 12.5 and prenatal liver cells of embryonic day 17.5. It was found that membrane protein 2A (Itm2A: Genbank accession No. NM_008409) was highly expressed in immature hepatocytes in mouse fetuses. As a result of the expression analysis of Itm2A mRNA by Northern blot, immunostaining, and whole mount in situ hybridization, it was highly expressed in fetal liver cells from 10.5 to 12.5 days of mouse embryogenesis. It was found that it was not expressed at all. The fetal liver works as a hematopoietic organ and is mainly composed of immature hepatocytes and blood cells, but Itm2A is not expressed at all in blood cells, but is expressed in immature hepatocytes. The immature hepatocytes at this time are also called hepatoblasts and are considered to be hepatic stem cells that have the ability to differentiate into two types of cells, hepatocytes and bile duct epithelial cells in the future. In addition, when the expression of human Itm2A (Genbank accession No. NM_004867 mRNA) was examined using a total RNA sample of human fetal liver, expression was also observed in human fetal liver from 6th to 12th week of fetal life. In other words, Itm2A was found to be a membrane protein expressed in fetal immature hepatocytes not only in mice but also in humans.

次に、ラットに２−アセチルアミノフルオレン(2-AAF)を前投与して成熟肝細胞の増殖能を抑制した状態で、７０％部分肝切除術を施してやると、門脈周囲にオーバル細胞(oval cell)と呼ばれる小型の細胞が出現する（Evarts, RP., et al (1989) Cancer Research, 49: 1541-1547）。オーバル細胞は増殖能の高い細胞で、未熟肝細胞と胆管上皮細胞の両者の性質を併せ持つ事から、成体肝臓における肝幹細胞と考えられている。このオーバル細胞は、重度の肝臓疾患などで、肝細胞の***・増殖が抑制された状態では、それに代わって肝再生を担うと考えられている。このオーバル細胞の起源は、不明な点が多いが、最近では骨髄中の造血幹細胞の分化転換によって生じるというデータが報告されている(Matsusaka, S. et al. (1999) Hepatology. 29(3):670-6 ; Petersen, BE., et al. (1999) Science 284: 1168-1170 ; Theise, ND., et al. (2000) Hepatology. 31: 235-240)。ラットにオーバル細胞が出現してくるモデルにおいて、肝臓でのItm2Aの発現を調べたところ、部分肝切除４日から発現が認められ、徐々に減弱しながら13日目まで発現しており、２０日では消失した。この発現パターンは、成熟肝細胞には発現しておらず、オーバル細胞に発現しているアルファフェトプロテインの発現パターンと同様であることから(Pertersen, BE. Et al. (1989) Hepatology. 27: 1030-1038)、Itm2Aはオーバル細胞に発現している事が示唆された。   Next, when 2-acetylaminofluorene (2-AAF) was pre-administered to rats to suppress the growth ability of mature hepatocytes and 70% partial hepatectomy was performed, oval cells ( Oval cells) appear (Evarts, RP., et al (1989) Cancer Research, 49: 1541-1547). Oval cells are highly proliferative cells and have both the properties of immature hepatocytes and bile duct epithelial cells, and are considered hepatic stem cells in the adult liver. These oval cells are thought to be responsible for liver regeneration instead of hepatocyte division / proliferation in severe liver diseases. The origin of this oval cell is unclear, but recently, data has been reported that it is caused by transdifferentiation of hematopoietic stem cells in the bone marrow (Matsusaka, S. et al. (1999) Hepatology. 29 (3) : 670-6; Petersen, BE., Et al. (1999) Science 284: 1168-1170; Theise, ND., Et al. (2000) Hepatology. 31: 235-240). In a model in which oval cells appeared in rats, the expression of Itm2A in the liver was examined. Expression was observed from the 4th day of partial hepatectomy, and it was gradually attenuated until the 13th day. Then it disappeared. This expression pattern is not expressed in mature hepatocytes and is similar to the expression pattern of alphafetoprotein expressed in oval cells (Pertersen, BE. Et al. (1989) Hepatology. 27: 1030 -1038), Itm2A was expressed in oval cells.

以上の結果から、Itm2Aは、胎児肝臓における肝幹細胞と成体肝臓における肝幹細胞の両者に発現している膜蛋白質であり、Itm2Aの遺伝子、またはタンパク質の発現を指標に肝幹細胞を同定する事が可能である。また、Itm2Aは細胞膜タンパク質であるので、Itm2Aの細胞外領域を認識するモノクローナル抗体を利用して、FACS (Fluorescein activated cell sorting)やMACS (Magnetic beads cell sorting)といった細胞分離装置を用いて、肝幹細胞を分離することが可能である。このようにして分離した肝幹細胞は、臓器移植に替わる次世代の再生医療として期待がかかる肝細胞移植や、ハイブリッド型人工肝臓、in vitroにおける薬物代謝実験等に使用することが可能である。   From the above results, Itm2A is a membrane protein expressed in both hepatic stem cells in fetal liver and hepatic stem cells in adult liver, and it is possible to identify hepatic stem cells using Itm2A gene or protein expression as an index. It is. In addition, since Itm2A is a cell membrane protein, hepatic stem cells can be obtained using a monoclonal antibody that recognizes the extracellular region of Itm2A and using a cell separation device such as FACS (Fluorescein activated cell sorting) or MACS (Magnetic beads cell sorting). Can be separated. The hepatic stem cells thus isolated can be used for hepatocyte transplantation, which is expected as next-generation regenerative medicine in place of organ transplantation, a hybrid artificial liver, in vitro drug metabolism experiments, and the like.

上記の通り、Itm2Aタンパク質及びそれをコードするｃＤＮＡ配列は既に公知であり、マウスのItm2AのｃＤＮＡ配列及びそれがコードするアミノ酸配列は、Genbank accession No. NM_008409に記載されており、ヒトのItm2AのｃＤＮＡ配列及びそれがコードするアミノ酸配列は、Genbank accession No. XM_084285に記載されていた。これらの配列を配列表の配列番号１及び３にそれぞれ示す。   As described above, the Itm2A protein and the cDNA sequence encoding the same are already known. The mouse Itm2A cDNA sequence and the amino acid sequence encoded by it are described in Genbank accession No. NM_008409, and the human Itm2A cDNA The sequence and the amino acid sequence encoded by it were described in Genbank accession No. XM_084285. These sequences are shown in SEQ ID NOs: 1 and 3, respectively.

Itm2A遺伝子は、肝幹細胞において発現するので、Itm2A遺伝子の発現を調べることにより肝幹細胞を検出することができる。Itm2A遺伝子の発現は、細胞中のItm2Aタンパク又はこれをコードするｍＲＮＡを測定（検出、半定量又は定量）することにより調べることができる。細胞中のｍＲＮＡの測定は、常法により行うことができる。すなわち、例えば、下記実施例に記載の通り、ノーザンブロット法により行うこともできるし、逆転写ＰＣＲ(RT-PCR)を行い、ＰＣＲ産物を電気泳動することにより、さらに電気泳動バンドをサザンブロット法にかけることにより行うことができる。あるいは、RT-PCRをリアルタイム検出ＰＣＲ(RTD-PCR)法により行うことにより、鋳型となるｃＤＮＡ量、ひいてはｍＲＮＡ量を正確に定量することができる。あるいは、NASBA法等により、ｍＲＮＡを直接増幅し、電気泳動さらには電気泳動後のノーザンブロットにより測定することも可能である。これらの方法自体は、いずれも常法であり、必要な試薬キット及び装置は市販されている。また、Itm2AのｃＤＮＡ配列が公知（配列番号１及び３に記載）であるので、これらの方法に必要なプローブやプライマーは容易に設計することができるし、下記実施例にも具体的にこれらの例が記載されている。したがって、Itm2AタンパクをコードするｍＲＮＡの測定は、当業者が容易に行うことができる。なお、Itm2AのｍＲＮＡ（又はｍＲＮＡを鋳型として得られたｃＤＮＡ）の検出や増幅に用いられるプローブやプライマーは、Itm2AのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのいずれかの鎖に相補的な配列を有するものが好ましいが、プローブやプライマーのサイズの１０％以下、好ましくは５％以下の塩基のミスマッチを有するものを用いることも可能である。このようなミスマッチを有するプライマーを用いることにより、増幅産物に所望の制限酵素部位を付与することができる。このような制限酵素部位は、増幅産物をベクターへ組み込む際に便利な場合がある。また、プローブやプライマーのサイズは、特に限定されないが、常法と同様、１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上であり、サイズの上限は特にないが、プライマーの場合には、通常、５０塩基以下、好ましくは４０塩基以下であり、プローブの場合には全長以下が適当である。なお、本発明は、Itm2AのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとハイブリダイズする、これらのプローブ及びプライマーのような、Itm2AのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ測定用核酸をも提供する。   Since the Itm2A gene is expressed in hepatic stem cells, hepatic stem cells can be detected by examining the expression of the Itm2A gene. The expression of the Itm2A gene can be examined by measuring (detecting, semi-quantifying or quantifying) the Itm2A protein or mRNA encoding the same in the cell. Measurement of mRNA in cells can be performed by a conventional method. That is, for example, as described in the following Examples, it can be performed by Northern blotting, or reverse transcription PCR (RT-PCR) is performed, and the PCR product is electrophoresed. It can be done by applying to. Alternatively, by performing RT-PCR by a real-time detection PCR (RTD-PCR) method, the amount of cDNA serving as a template, and hence the amount of mRNA can be accurately quantified. Alternatively, mRNA can be directly amplified by NASBA method or the like, and measured by electrophoresis or further Northern blot after electrophoresis. These methods are all conventional methods, and necessary reagent kits and apparatuses are commercially available. In addition, since the cDNA sequence of Itm2A is known (described in SEQ ID NOs: 1 and 3), probes and primers necessary for these methods can be easily designed, and these examples are also specifically described in the following examples. An example is given. Accordingly, those skilled in the art can easily measure mRNA encoding the Itm2A protein. The probes and primers used for detection and amplification of Itm2A mRNA (or cDNA obtained using mRNA as a template) preferably have a sequence complementary to either strand of Itm2A mRNA or cDNA. It is also possible to use a probe or primer having a base mismatch of 10% or less, preferably 5% or less of the size. By using a primer having such a mismatch, a desired restriction enzyme site can be added to the amplification product. Such a restriction enzyme site may be convenient when the amplification product is incorporated into a vector. The size of the probe or primer is not particularly limited, but is 15 bases or more, preferably 20 bases or more, as in the conventional method, and there is no particular upper limit on the size, but in the case of a primer, usually 50 bases or less. The length is preferably 40 bases or less, and in the case of a probe, the length is less than the appropriate length. The present invention also provides nucleic acids for measuring Itm2A mRNA or cDNA, such as these probes and primers, which hybridize with Itm2A mRNA or cDNA.

下記実施例において具体的に記載されるように、Itm2Aタンパク質は、２型膜蛋白であることが確認された。２型膜蛋白質とは、N末端側が細胞内に存在し、C末端側が細胞外に出るタイプの膜蛋白質である。したがって、Itm2Aタンパク質のＣ末端側領域をエピトープとするモノクローナル抗体を作製し、該モノクローナル抗体と細胞とを接触させることにより、細胞表面に存在するItm2Aタンパクと該モノクローナル抗体とが、抗原抗体反応により結合するので、これを利用して肝幹細胞を検出し、また、分離することができる。細胞表面上の抗原と、該抗原に対するモノクローナル抗体との抗原抗体反応を利用して、該モノクローナル抗体と抗原抗体反応する細胞を検出し、又は分離する方法は、この分野において周知であり、細胞表面上のItm2Aと抗原抗体反応するモノクローナル抗体が得られれば容易に行うことができる。例えば、免疫組織化学、FACS（fluorescence activated cell sorting; 蛍光活性化細胞分離）、MACS（magnetic cell sorting; 磁気細胞分離）等を用いる方法等の公知の方法により検出又は分離することができる。本発明の検出方法および分離方法においては、Itm2Aタンパクを検出することによりItm2A遺伝子の発現を検出することが好ましい。細胞表面に発現するItm2Aタンパクの細胞外領域に結合可能な抗体やリガンドを用いてItm2Aの発現を検出することにより、細胞を固定したり溶解することなく、非侵襲的にItm2Aタンパクの発現を検出することが可能である。この場合、FACS や MACS等のセルソーターを用いることで、効率的に細胞を検出または分離することができる。FACS及びMACSは、この分野において周知であり、そのためのセルソーター等の装置も市販されているので、Itm2Aタンパクの細胞外領域（Ｃ末端側領域）をエピトープとするモノクローナル抗体が得られれば、肝幹細胞の検出及び分離を容易に行うことができる。   As specifically described in the following examples, it was confirmed that the Itm2A protein is a type 2 membrane protein. A type 2 membrane protein is a type of membrane protein in which the N-terminal side is present in the cell and the C-terminal side is outside the cell. Therefore, by producing a monoclonal antibody having the Cm-terminal region of Itm2A protein as an epitope and bringing the monoclonal antibody into contact with cells, the Itm2A protein present on the cell surface and the monoclonal antibody are bound by an antigen-antibody reaction. Thus, hepatic stem cells can be detected and separated using this. A method for detecting or isolating a cell that reacts with an antibody on an antigen surface using an antigen-antibody reaction between an antigen on the cell surface and a monoclonal antibody against the antigen is well known in the art. If a monoclonal antibody capable of antigen-antibody reaction with the above Itm2A is obtained, it can be carried out easily. For example, it can be detected or separated by a known method such as a method using immunohistochemistry, FACS (fluorescence activated cell sorting), MACS (magnetic cell sorting) or the like. In the detection method and the separation method of the present invention, it is preferable to detect the expression of the Itm2A gene by detecting the Itm2A protein. Detect Itm2A protein non-invasively without immobilizing or lysing cells by detecting Itm2A expression using antibodies or ligands that can bind to the extracellular domain of Itm2A protein expressed on the cell surface Is possible. In this case, cells can be efficiently detected or separated by using a cell sorter such as FACS or MACS. FACS and MACS are well known in this field, and devices such as cell sorters are also commercially available. Therefore, if a monoclonal antibody having an epitope in the extracellular region (C-terminal region) of Itm2A protein is obtained, hepatic stem cells Can be easily detected and separated.

Itm2AのｃＤＮＡの塩基配列が公知（配列番号１及び３）であるので、Itm2Aタンパクの細胞外領域（Ｃ末端側領域）は、常法に基づき容易に調製することができる。配列番号１に示すマウスItm2AｃＤＮＡでは、およそ376ntよりも下流の領域、配列番号３に示すヒトItm2AｃＤＮＡでは、およそ368ntよりも下流の領域が細胞外領域である。したがって、この細胞外領域の全領域又はその中の一部の領域によりコードされるアミノ酸配列（アミノ酸残基数は５以上、好ましくは１０以上）を有するペプチドを作製し、それを抗原として用いて常法によりモノクローナル抗体を作製することによりItm2Aタンパクの細胞外領域をエピトープとするモノクローナル抗体を作製することができる。免疫原として用いられるペプチドは、短いものであれば化学合成により合成することができるし、長いものであれば遺伝子工学的に調製することができる。下記実施例に具体的に記載されるように、Itm2AのｃＤＮＡは、胎児肝臓又は再生中の成体肝臓中の肝幹細胞からＰＣＲにより大量に調製することができる。したがって、該ｃＤＮＡ中の細胞外領域部分又はその部分領域をＰＣＲにより増幅し、それを適当なベクターに組み込み、宿主細胞に導入して大量に所望のペプチドを調製することができる。免疫原として用いられるペプチドは、化学合成による場合は、市販のペプチド合成機を用いて容易に調製できるし、遺伝子工学的手法により調製する場合も上記概説した方法により常法に基づき容易に調製できる。なお、免疫原として用いるペプチドが比較的短い場合（例えば１０アミノ酸残基以下)には、免疫応答を効率的に誘起するために、ペプチドを他のタンパク質キャリア（例えばキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)等）に結合したものを免疫原として用いることもできる。これも常法である。なお、本発明は、Itm2Aの細胞外領域と抗原抗体反応する、このような肝幹細胞検出又は分離用モノクローナル抗体をも提供する。   Since the base sequence of the Itm2A cDNA is known (SEQ ID NOs: 1 and 3), the extracellular region (C-terminal region) of the Itm2A protein can be easily prepared based on a conventional method. In the mouse Itm2A cDNA shown in SEQ ID NO: 1, the region downstream from about 376 nt, and in the human Itm2A cDNA shown in SEQ ID NO: 3, the region downstream from about 368 nt is the extracellular region. Therefore, a peptide having an amino acid sequence (the number of amino acid residues is 5 or more, preferably 10 or more) encoded by the entire extracellular region or a part of the extracellular region is prepared and used as an antigen. A monoclonal antibody having an epitope in the extracellular region of Itm2A protein can be prepared by preparing a monoclonal antibody by a conventional method. If the peptide used as an immunogen is short, it can be synthesized by chemical synthesis, and if it is long, it can be prepared by genetic engineering. As specifically described in the Examples below, Itm2A cDNA can be prepared in large quantities by PCR from liver stem cells in fetal liver or regenerating adult liver. Therefore, an extracellular region portion or a partial region thereof in the cDNA can be amplified by PCR, incorporated into an appropriate vector, and introduced into a host cell to prepare a desired peptide in a large amount. Peptides used as immunogens can be easily prepared using a commercially available peptide synthesizer in the case of chemical synthesis, and can also be easily prepared based on conventional methods by the method outlined above even when prepared by genetic engineering techniques. . In addition, when a peptide used as an immunogen is relatively short (for example, 10 amino acid residues or less), in order to efficiently induce an immune response, the peptide is transferred to another protein carrier (for example, keyhole limpet hemocyanin (KLH)). Etc.) can also be used as an immunogen. This is also a common method. The present invention also provides such a monoclonal antibody for detection or separation of hepatic stem cells, which reacts with the extracellular region of Itm2A in an antigen-antibody reaction.

下記実施例に具体的に記載されるように、胎児肝臓及び再生中の成体肝臓中に肝幹細胞が存在することが確認された。したがって、本発明の方法を適用する試料となる対象組織としては、胎児肝臓及び再生中の成体肝臓を挙げることができる。胎児肝臓については、マウスでは胎生10.5日〜12.5日の胎児肝臓で、ヒトでは妊娠６週目〜１２週目の胎児肝臓でItm2A遺伝子が高発現している。再生中の成体肝臓については、２−アセチルアミノフルオレン(2-AAF)などの肝臓毒を前投与して成熟肝細胞の増殖能を抑制した状態で、部分肝切除術を施してやると、門脈周囲にオーバル細胞と呼ばれる小型の細胞が出現するが、このオーバル細胞の集団の中に肝幹細胞が含まれるので、再生中の成体肝臓中のオーバル細胞群を対象として本発明の方法を行うこともできる。さらに、骨髄などの肝臓以外の組織や胚性幹細胞（ES細胞）にも肝幹細胞が存在している可能性があるので、これらの組織又は細胞集団も本発明の方法の対象とすることができる。   As specifically described in the following examples, it was confirmed that hepatic stem cells were present in the fetal liver and the regenerating adult liver. Therefore, examples of the target tissue to be a sample to which the method of the present invention is applied include fetal liver and regenerating adult liver. Regarding the fetal liver, the Itm2A gene is highly expressed in the fetal liver from 10.5 days to 12.5 days in the mouse in the mouse and in the fetal liver in the 6th to 12th weeks of gestation in the human. For adult liver during regeneration, if hepatotoxin such as 2-acetylaminofluorene (2-AAF) is pre-administered to suppress the growth ability of mature hepatocytes, partial hepatectomy is performed. Although small cells called oval cells appear in the surroundings, hepatic stem cells are included in this oval cell population. Therefore, the method of the present invention may be performed on a group of oval cells in the regenerating adult liver. it can. Furthermore, since hepatic stem cells may be present in tissues other than the liver, such as bone marrow, and embryonic stem cells (ES cells), these tissues or cell populations can also be targeted by the method of the present invention. .

本願出願人は、先に、dlk(delta-like)という細胞膜蛋白質が、胎生肝細胞に高発現していることを見出し、抗dlkモノクローナル抗体を用いたMACSにより、効率的に胎生肝細胞を分離する方法を開発した。dlk自体は公知であり、そのアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列は、例えば、ヒトdlkは、Genbank accession番号U15979およびNM_003836等に示されている。ラットdlkは、Genbank accession番号AB046763およびD84336等に示されている。ウシのdlkは、Genbank accession番号AB009278に示されている。また、dlkの細胞外領域をエピトープとするモノクローナル抗体も公知であり(Kaneta, M. et al. (2000) J. Immunol. 164:256-264)、この公知のモノクローナル抗体を用いたMACSにより胎生肝細胞を分離することができる（特許文献１）。Itm2Aを高発現する肝幹細胞は、このようなdlk陽性肝細胞中に多く含まれるので、試料から先ず、抗dlk抗体陽性細胞を選択し、選択された細胞集団を対象として本発明の方法を適用すると、効率良く肝幹細胞を検出又は分離することができる。下記実施例ではこの方法を採用している。   The applicant of the present application first found that a cell membrane protein called dlk (delta-like) is highly expressed in fetal liver cells, and efficiently separated fetal liver cells by MACS using an anti-dlk monoclonal antibody. Developed a way to do. dlk itself is known, and its amino acid sequence and cDNA sequence are shown in Genbank accession numbers U15979 and NM_003836, for example, for human dlk. Rat dlk is shown in Genbank accession numbers AB046763 and D84336, etc. Bovine dlk is shown in Genbank accession number AB009278. In addition, a monoclonal antibody having an epitope in the extracellular region of dlk is also known (Kaneta, M. et al. (2000) J. Immunol. 164: 256-264), and embryos are produced by MACS using this known monoclonal antibody. Hepatocytes can be isolated (Patent Document 1). Since hepatic stem cells that highly express Itm2A are abundant in such dlk-positive hepatocytes, first, anti-dlk antibody-positive cells are selected from the sample, and the method of the present invention is applied to the selected cell population. Then, hepatic stem cells can be detected or separated efficiently. This method is adopted in the following embodiments.

下記実施例において具体的に記載されるように、Itm2Aは、マウス及びヒトの両者の肝幹細胞中で高発現していた。配列番号１及び３からわかるように、マウスとヒトのItm2Aタンパクのアミノ酸配列の相同性は高い。マウスとヒトは、共に哺乳綱に属するが、目のレベルで異なっており、哺乳類の中では大きく異なる生物である。それにも拘らず、相同性の高いItm2Aが肝幹細胞中に高発現していることから、Itm2Aは、マウス及びヒト以外の他の動物、特に他の哺乳動物の肝幹細胞においても同様に高発現する、普遍的なタンパク質であると考えられる。したがって、本発明の方法は、マウス及びヒト以外の動物にも適用できる。   As specifically described in the Examples below, Itm2A was highly expressed in both mouse and human hepatic stem cells. As can be seen from SEQ ID NOS: 1 and 3, the homology of the amino acid sequences of mouse and human Itm2A proteins is high. Both mice and humans belong to the class Mammalia, but differ at the eye level, and are very different organisms among mammals. Nevertheless, itm2A is highly expressed in hepatic stem cells because it is highly expressed in hepatic stem cells. It is also highly expressed in other animals other than mice and humans, especially in other mammalian liver stem cells. It is considered to be a universal protein. Therefore, the method of the present invention can be applied to animals other than mice and humans.

本発明の方法により分離された肝幹細胞は、上記のように、臓器移植に替わる次世代の再生医療として期待がかかる肝細胞移植や、ハイブリッド型人工肝臓、in vitroにおける薬物代謝実験等に使用することが可能である。とりわけ、再生中の成体肝臓から肝幹細胞を分離できるという知見は重要である。患者本人の肝臓から、肝幹細胞を分離すれば、その肝幹細胞を患者本人に細胞移植することができ、この場合には、移植される細胞が患者自身のものであるから移植に対する拒絶反応は起きない。   As described above, the hepatic stem cells isolated by the method of the present invention are used for hepatocyte transplantation, hybrid type artificial liver, in vitro drug metabolism experiments and the like that are expected as next-generation regenerative medicine replacing organ transplantation. It is possible. In particular, the knowledge that hepatic stem cells can be isolated from the regenerating adult liver is important. If hepatic stem cells are isolated from the patient's own liver, the hepatic stem cells can be transplanted into the patient himself. In this case, the transplanted cells are the patient's own, and rejection of the transplantation occurs. Absent.

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

１． 材料と方法
マウス胎生肝細胞の調製
すべての実験にはC57/BL6, slcマウス（日本エスエルシー）を用いた。胎生12.5日の胎児マウス200個体と、胎生17.5日の胎児マウス50個体から、それぞれ肝臓を摘出し、コラゲナーゼ処理によって肝臓を消化し、細胞懸濁液を調製した。次に細胞懸濁液をハムスター抗ｄｌｋモノクローナル抗体(Kaneta, M. et al. (2000) J. Immunol. 164:256-264）、ビオチン化抗ハムスター抗体、ストレプトアビジンビーズと順次反応させ、autoMACSを用いて、肝幹細胞、および出生前胎児肝細胞を調製した。この方法によって調製したdlk陽性細胞の純度は、胎生12.5日の細胞で95 %以上、胎生17.5日の細胞で85 %以上であった。 1. Materials and methods
Preparation of mouse embryonic hepatocytes C57 / BL6, slc mice (Japan SLC) were used for all experiments. Liver was extracted from 200 fetal mice of embryonic day 12.5 and 50 fetal mice of embryonic day 17.5, respectively, and the liver was digested by collagenase treatment to prepare a cell suspension. Next, the cell suspension was reacted sequentially with hamster anti-dlk monoclonal antibody (Kaneta, M. et al. (2000) J. Immunol. 164: 256-264), biotinylated anti-hamster antibody, and streptavidin beads, and autoMACS was reacted. Used to prepare hepatic stem cells and prenatal fetal hepatocytes. The purity of dlk-positive cells prepared by this method was 95% or more for embryonic day 12.5 cells and 85% or more for embryonic day 17.5 cells.

ラットオーバル細胞誘導モデル
８週令のオスのF344ラットに2−アセチルアミノフルオレン（和光純薬工業）を1.5 mg/kg（体重）の投与量で一日一回、４日間経口投与し、７０％部分肝切除術を施した。部分肝切除術を施した日をday 0とし、翌日から５日間2−アセチルアミノフルオレンを等量、経口投与した。Day 0, 4, 7, 9, 11, 13, 20に肝臓を採取し、遺伝子発現解析に用いた。対照として、未処置の肝臓を用いた。また、Day 7において、２ステップコラゲナーゼ消化法と低速遠心（500 rpm, 1 min）を組み合わせて、肝臓組織から実質細胞と非実質細胞をそれぞれ調製し、遺伝子発現解析(後述)に用いた。なお、肝臓組織から実質細胞と非実質細胞の調製は、具体的には次のようにして行った。ラットをネンブタール麻酔下開腹し、肝下部下大静脈を結紮した後、門脈にカテーテルを刺入し前潅流液（Ca2+, Mg2+ freeハンクス液）を流し始めると同じ20mL/分の流速で10分間潅流し、次いで0.05%コラゲナーゼ溶液(collagenase type IA、シグマ社)で、同様に10分間潅流し、肝臓を消化した。肝臓を50 ml遠沈管に回収し、前潅流液を加えて、良く懸濁した後、500 rpm, 1 minの遠心分離を行った。上清を非実質細胞画分、沈澱を実質細胞画分としてそれぞれ回収し、4-5回の洗浄の後、RNAの調整を行った。 Rat Oval Cell Induction Model 2-acetylaminofluorene (Wako Pure Chemical Industries) was orally administered once daily for 4 days to an 8-week-old male F344 rat at a dose of 1.5 mg / kg (body weight), 70% A partial hepatectomy was performed. The day on which partial hepatectomy was performed was defined as day 0, and the same amount of 2-acetylaminofluorene was orally administered for 5 days from the next day. Livers were collected on Day 0, 4, 7, 9, 11, 13, 20 and used for gene expression analysis. As a control, untreated liver was used. On Day 7, parenchymal cells and non-parenchymal cells were prepared from liver tissue by combining a two-step collagenase digestion method and low-speed centrifugation (500 rpm, 1 min), and used for gene expression analysis (described later). The preparation of parenchymal cells and non-parenchymal cells from liver tissue was specifically performed as follows. Rats were laparotomized under Nembutal anesthesia, the lower inferior vena cava was ligated, a catheter was inserted into the portal vein, and preperfusion solution (Ca2 +, Mg2 + free Hanks solution) started to flow for 10 minutes at the same flow rate of 20 mL / min After perfusion, the liver was digested in the same manner with a 0.05% collagenase solution (collagenase type IA, Sigma) for 10 minutes. The liver was recovered in a 50 ml centrifuge tube, pre-perfusate was added and well suspended, and then centrifuged at 500 rpm for 1 min. The supernatant was collected as a non-parenchymal cell fraction and the precipitate was collected as a parenchymal cell fraction, and RNA was adjusted after washing 4-5 times.

DNAチップ解析
胎生12.5日と胎生17.5日のマウス肝臓からそれぞれ調製したdlk陽性細胞 (上記)から、常法により、Trizol試薬（商品名、ニッポンジーン社製）、Oligotex dT30 (商品名、第一化学薬品社製)を用いてmRNAを調製した。調製したmRNAは、Incyte Genomics社(米国)製のマウスGEM2マイクロアレーで、9514クローンが搭載されているDNAチップを用いてDNAチップ解析を行った。 DNA chip analysis Trizol reagent (trade name, manufactured by Nippon Gene), Oligotex dT30 (trade name, Daiichi Chemicals) from dlk positive cells (above) prepared from mouse livers of embryonic day 12.5 and embryonic day 17.5, respectively. MRNA was prepared using the same method. The prepared mRNA was subjected to DNA chip analysis using a mouse chip GEM2 microarray manufactured by Incyte Genomics (USA) using a DNA chip on which 9514 clones were mounted.

遺伝子発現解析
採取した肝臓、あるいは細胞からTrizol試薬（ニッポンジーン）を用いてRNAを抽出した。ノーザンブロットによる遺伝子発現解析は、1レーンあたり10マイクログラムの全RNAを、ホルムアルデヒド変性ゲルにて電気泳動し、ナイロン膜に転写した後、DIGラベルしたcDNAプローブ(後述）を用いてハイブリダイズを行った。プローブの検出は、CDP-starを基質とした化学発光により行った。RT-PCR法による遺伝子発現解析は、抽出したRNAより、First-strand cDNA synthesis kit (商品名、Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いてcDNAを合成した後、PCRを用いてItm2Aの発現を解析した。PCRプライマーは、フォワードプライマーが5'-att tac cat ggt gag atg tg-3'、リバースプライマーが5'-aag tgt cta atc ttc cag ca-3'であり、これらのプライマーを用いて500bpのPCR産物を増幅した。また、このPCR産物を鋳型として、マウスItm2Aに対するDIGラベルcDNAプローブを作製した。ヒトItm2Aに対するDIGラベルcDNAプローブは、下記のヒト全長Itm2A cDNAを組み込んだpCRII ベクターから、EcoRI/HindIIIでバンドを切り出したものを鋳型として作製した。 Gene expression analysis RNA was extracted from the collected liver or cells using Trizol reagent (Nippon Gene). For gene expression analysis by Northern blot, 10 micrograms of total RNA per lane was electrophoresed on a formaldehyde-denaturing gel, transferred to a nylon membrane, and then hybridized using a DIG-labeled cDNA probe (described later). It was. Probe detection was performed by chemiluminescence using CDP-star as a substrate. Gene expression analysis by RT-PCR was performed by synthesizing cDNA from extracted RNA using First-strand cDNA synthesis kit (trade name, manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), and then analyzing Itm2A expression using PCR. . The PCR primers are 5'-att tac cat ggt gag atg tg-3 'for the forward primer and 5'-aag tgt cta atc ttc cag ca-3' for the forward primer, and a 500 bp PCR product using these primers. Was amplified. A DIG-labeled cDNA probe for mouse Itm2A was prepared using this PCR product as a template. A DIG-labeled cDNA probe for human Itm2A was prepared using a template obtained by excising a band with EcoRI / HindIII from the pCRII vector incorporating the human full-length Itm2A cDNA described below.

マウスおよびヒトItm2A全長cDNAの単離と発現ベクターの構築
マウスItm2A (Genbank accetion No. NM_008409)、およびヒトItm2A (Genbank accetion No. XM_084285)の遺伝子配列情報より、PCRプライマーを設計した。方向性を維持した発現ベクターへの挿入の為、マウスに関しては、5' 端にEcoRI による制限酵素消化配列を付加したフォワードプライマーとXhoIによる制限酵素消化配列を付加したリバースプライマーを設計した。ヒトに関しては、ReverseプライマーのみHind IIIによる制限酵素消化配列を付加したものを設計した。マウスの場合は、胎生12.5日の肝臓より調製したcDNAを鋳型として、ヒトの場合は市販のヒト胎児より調製した全RNAから合成したcDNAを鋳型として、それぞれPCRによって、ほぼ全長をふくむItm2A cDNAを合成した（終了コドンの手前45bpまでの配列を含み、終了コドンをもたない）。プライマーの配列は、マウスが フォワード：5'-gga att cca gcc caa gat act gat tc-3', リバース：5'-ccg ctc gag cgg gtg tct aat ctt cca gca tt-3', ヒトがフォワード：5'-cga tct cct ctt gca gtc tgc-3'、リバース：5'-aag ctt ctc ttg aca gat ctt ggt c-3'であった。PCRによる増幅後、アガロースゲル電気泳動で展開した後、目的のバンドを切り出し抽出した後、マウスItm2A のPCR産物は、EcoRIとXhoIにて消化し、発現ベクター（pcDNA4/Myc-His: Invitrogen社製）のEcoRI/XhoI部位に挿入した。この発現ベクターにはC末端側に、MycタグとHisタグが付いているので、発現タンパク質は、Itm2AとMycタグ、His タグとの融合タンパクである。ヒトItm2AのPCR産物は、pCRII ベクター (Invitrogen)にT/A クローニングした。 Isolation of mouse and human Itm2A full-length cDNA and construction of expression vector PCR primers were designed from gene sequence information of mouse Itm2A (Genbank accetion No. NM_008409) and human Itm2A (Genbank accetion No. XM_084285). In order to insert into the expression vector maintaining the orientation, a forward primer with a restriction enzyme digestion sequence with EcoRI and a reverse primer with a restriction enzyme digestion sequence with XhoI were designed at the 5 'end. For humans, a reverse primer with a restriction enzyme digestion sequence by Hind III was designed. In the case of mice, cDNA prepared from the liver of embryonic day 12.5 was used as a template.In the case of humans, cDNA synthesized from total RNA prepared from a commercially available human fetus was used as a template. Synthesized (contains a sequence up to 45 bp before the termination codon and has no termination codon). Primer sequence: mouse forward: 5'-gga att cca gcc caa gat act gat tc-3 ', reverse: 5'-ccg ctc gag cgg gtg tct aat ctt cca gca tt-3', human forward: 5 '-cga tct cct ctt gca gtc tgc-3', reverse: 5'-aag ctt ctc ttg aca gat ctt ggt c-3 '. After amplification by PCR, development by agarose gel electrophoresis, extraction and extraction of the target band, the PCR product of mouse Itm2A was digested with EcoRI and XhoI, and an expression vector (pcDNA4 / Myc-His: manufactured by Invitrogen) ) In the EcoRI / XhoI site. Since this expression vector has a Myc tag and a His tag on the C-terminal side, the expressed protein is a fusion protein of Itm2A, Myc tag, and His tag. The human Itm2A PCR product was T / A cloned into the pCRII vector (Invitrogen).

培養細胞への遺伝子導入
マウスItm2A全長cDNAを組み込んだ発現ベクター（pcDNA4/Myc-His）は、リポフェクション法によって、マウス繊維芽細胞株NIH-3T3細胞に導入した。この操作は具体的には次のようにして行った。DNA 8μgとLIPOFECTAMINE PLUS reagent (Invitrogen社)16μLとを混和したものを500μLのOPTI-MEM培地に加え（A液）、室温で15分間放置した。ついで、LIPOFECTAMINE reagent (Invitorogen社) 24μLと500μLのOPTI-MEM培地を混和した溶液（B液）を作成し、A液とB液を混和して、室温で15分間放置した。次に、OPTI-MEM培地を4mL加えて全量5mLとした（C液）。前日に10 cm径の培養皿に播いておいたNIH-3T3細胞を１回OPTI-MEM培地で洗浄した後、C液を加えてCO₂ インキュベーター内（37℃, 5% CO₂, 95 % Air）で3時間培養し、5 mLのDMEM/20 % FBS培地を加え、更に培養を行った。翌日、DMEM/10 % FBS培地に交換した。遺伝子導入48時間後に、トリプシン処理によって、細胞を培養皿より剥がし、細胞懸濁液とし、FACSによる発現解析を行った（後述）。 Gene transfer to cultured cells An expression vector (pcDNA4 / Myc-His) incorporating mouse full length cDNA of Itm2A was introduced into mouse fibroblast cell line NIH-3T3 cells by lipofection method. Specifically, this operation was performed as follows. A mixture of 8 μg of DNA and 16 μL of LIPOFECTAMINE PLUS reagent (Invitrogen) was added to 500 μL of OPTI-MEM medium (solution A) and left at room temperature for 15 minutes. Next, a solution (solution B) in which 24 μL of LIPOFECTAMINE reagent (Invitorogen) and 500 μL of OPTI-MEM medium were mixed was prepared, and solutions A and B were mixed and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. Next, 4 mL of OPTI-MEM medium was added to make a total volume of 5 mL (solution C). The NIH-3T3 cells that had been seeded in a 10 cm diameter culture dish on the previous day were washed once with OPTI-MEM medium, and then added with solution C in a CO ₂ incubator (37 ° C, 5% CO ₂ , 95% Air ) For 3 hours, 5 mL of DMEM / 20% FBS medium was added, and further culture was performed. The next day, the medium was replaced with DMEM / 10% FBS medium. 48 hours after gene introduction, the cells were detached from the culture dish by trypsin treatment to obtain a cell suspension, and expression analysis was performed by FACS (described later).

FACS解析
マウスItm2A全長cDNAを組み込んだ発現ベクター（pcDNA4/Myc-His）を遺伝子導入したNIH3T3細胞の細胞懸濁液を抗Mycモノクローナル抗体、あるいは抗Hisモノクローナル抗体と反応させた（４℃、１５分）。PBSで洗浄後、ビオチン化抗マウスIgGと反応させ（4℃、１５分）、PBSで洗浄後、ストレプトアビジン-FITC , またはストレプトアビジン-APCと反応させた（４℃、１５分）。Itm2Aの発現は、Mycタグ、あるいはHisタグの発現を指標にFACS Calibur (BECTON DICKINSON) で解析した。 FACS analysis Mouse suspension of NIH3T3 cells transfected with an expression vector (pcDNA4 / Myc-His) incorporating mouse Itm2A full-length cDNA was reacted with anti-Myc monoclonal antibody or anti-His monoclonal antibody (4 ° C., 15 minutes) ). After washing with PBS, it was reacted with biotinylated anti-mouse IgG (4 ° C., 15 minutes). After washing with PBS, it was reacted with streptavidin-FITC or streptavidin-APC (4 ° C., 15 minutes). Itm2A expression was analyzed by FACS Calibur (BECTON DICKINSON) using Myc tag or His tag expression as an index.

抗Itm2Aポリクローナル抗体の作製
マウスItm2A cDNAの細胞内領域をPCRで増幅し、増幅産物をGST融合蛋白質発現ベクター（pGEX-5X-1: Amersham Pharmacia Biotech）のEcoRI/Sal I部位に挿入した。作製した発現ベクターを大腸菌に導入し、IPTG添加によって、GSTとItm2Aの融合蛋白質を誘導した後、グルタチオンカラムを用いて、アフィニテイー精製した。これを抗原としてウサギを免疫し、抗マウスItm2A抗体を作製した。Itm2Aの細胞内領域のクローニングに用いたPCRプライマーは、フォワード側が5'-gga att cca gcc caa gat act gat tc-3'、リバース側が5'-gtc gac ccc aga gag cca tct ttc t-3'であった。 Preparation of anti-Itm2A polyclonal antibody The intracellular region of mouse Itm2A cDNA was amplified by PCR, and the amplified product was inserted into the EcoRI / Sal I site of a GST fusion protein expression vector (pGEX-5X-1: Amersham Pharmacia Biotech). The prepared expression vector was introduced into Escherichia coli, IPST was added to induce a fusion protein of GST and Itm2A, and affinity purification was performed using a glutathione column. Rabbits were immunized using this as an antigen to produce anti-mouse Itm2A antibody. The PCR primers used for cloning the intracellular region of Itm2A are 5'-gga att cca gcc caa gat act gat tc-3 'on the forward side and 5'-gtc gac ccc aga gag cca tct ttc t-3' on the reverse side. there were.

免疫組織化学
クリオスタットを用いて、7 μmの凍結切片を作製し、4 %パラホルムアルデヒドで固定した。Itm2Aに対する免疫染色は、抗Itm2A抗体（ウサギIgG）、ビオチン化抗ウサギIgG を順次反応させ、DABを基質とした反応によって染色を行った。対比染色として、ヘマトキシリンによる核染色を行った。 Using an immunohistochemical cryostat, 7 μm frozen sections were prepared and fixed with 4% paraformaldehyde. For immunostaining for Itm2A, anti-Itm2A antibody (rabbit IgG) and biotinylated anti-rabbit IgG were reacted sequentially, and staining was performed by a reaction using DAB as a substrate. As counterstaining, nuclear staining with hematoxylin was performed.

ホールマウントin situ ハイブリダイゼーション
胎生10.5日と胎生11.5日のマウス胎児をまるごとDIGラベルしたItm2A RNAプローブを用いて、ハイブリダイズした。プローブの検出は、アルカリフォスファターゼ標識された抗DIG抗体と反応させた後、NBT/BCIPを基質とした化学発色により行った。 Whole mount in situ hybridization Embryonic day 10.5 and day 11.5 mouse fetuses were hybridized using the whole DIG-labeled Itm2A RNA probe. Probe detection was performed by chemical color development using NBT / BCIP as a substrate after reacting with an anti-DIG antibody labeled with alkaline phosphatase.

Itm2Aモノクローナル抗体の作製
Itm2Aタンパク質のＣ末端側領域をエピトープとするモノクローナル抗体を作製する為に、実施例１の「材料と方法」の「マウスおよびヒトItm2A全長cDNAの単離と発現ベクターの構築」の項に記載したマウスItm2A全長cDNAを組み込んだ発現ベクター（pcDNA4/Myc-His）を遺伝子導入したCOS-7細胞の細胞懸濁液を、免疫助成剤（完全フロイントアジュバント：和光純薬工業）と１：１で混合したエマルジョンを６週令のウイスターラット（メス）の両足蹠に１X１０^７細胞ずつ注射し、免疫を行った。初回免疫から３日後、１０日後にそれぞれ追加免疫を行い、最終免疫の翌日に、ラットをネンブタール麻酔下、両足のリンパ節を採取し、リンパ球を調整した。ついで、マウスのミエローマ細胞株（P3X）とポリエチレングリコール法で細胞融合を行った。96穴プレートでHAT(アミノプテリン、ヒポキサンチン、チミジン)を含むRMPI1640/10 % FBS培地でCO₂インキュベーター内（37℃, 5% CO₂, 95%空気）で培養を行った。 Production of Itm2A monoclonal antibody
In order to produce a monoclonal antibody having the C-terminal region of Itm2A protein as an epitope, it was described in the section “Isolation of mouse and human Itm2A full-length cDNA and construction of expression vector” in “Materials and Methods” of Example 1. A cell suspension of COS-7 cells into which an expression vector (pcDNA4 / Myc-His) incorporating mouse Itm2A full-length cDNA has been introduced is mixed 1: 1 with an immune support agent (complete Freund's adjuvant: Wako Pure Chemical Industries). The emulsion was immunized by injecting 1 × 10 ⁷ cells into both footpads of 6-week-old Wistar rats (female). Booster immunization was performed 3 days and 10 days after the first immunization, and the day after the final immunization, the rats were anesthetized with Nembutal and the lymph nodes of both feet were collected to prepare lymphocytes. Subsequently, cell fusion was performed with a mouse myeloma cell line (P3X) by the polyethylene glycol method. Cultivation was performed in a 96-well plate in a CO ₂ incubator (37 ° C., 5% CO ₂ , 95% air) in a RMPI 1640/10% FBS medium containing HAT (aminopterin, hypoxanthine, thymidine).

抗Itm2Aモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
培養開始から９日後以降、増殖しコロニーを形成してきた約150のハイブリドーマの培養上清について、マウスItm2A遺伝子を発現させたHEK293細胞（実施例１の「材料と方法」の「マウスおよびヒトItm2A全長cDNAの単離と発現ベクターの構築」の項に記載したマウスItm2A全長cDNAを組み込んだ発現ベクタ（pcDNA4/Myc-His）を、「培養細胞への遺伝子導入」に記載した方法でHEK293細胞に遺伝子導入した細胞懸濁液）を用いたFACS解析よりスクリーニングを行った。細胞懸濁液を培養上清と反応させた（４℃、１５分）。PBSで洗浄後、ビオチン化抗ラットIgGと反応させ（4℃、１５分）、PBSで洗浄後、ストレプトアビジン-PEと反応させ（４℃、１５分）。FACS Calibur (BECTON DICKINSON) で解析した。FACSによるスクリーニングで陽性であった培養上清を、次いでマウス胎児肝細胞を用いた免疫染色によりスクリーニングを行った。この操作は具体的には次のようにして行なった。胎生12.5日の胎児マウスから上記「材料と方法」の「マウス胎生肝細胞の調製」の項に記載した方法で肝細胞を含む全ての細胞を調整した。細胞を１X１０^５細胞の細胞数で集細胞遠心装置（サイトスピン３；SHANDON）を用いてスライドグラス上に塗沫した（室温、800rpm, 3分）。塗沫標本を4 %パラホルムアルデヒドで固定した後、1.5% 正常ヤギ血清を含むPBSで処理した（室温、３０分）。次いで、上記培養上清、ビオチン化抗ラット抗体と順次反応させ、DABを基質とした反応によって染色を行った。対比染色として、ヘマトキシリンによる核染色を行った。その結果、Itm2Aを認識する２種類のハイブリドーマ細胞株を樹立した（クローン3A2, 8B1）。 Screening of anti-Itm2A monoclonal antibody-producing hybridomas HEK293 cells expressing mouse Itm2A gene in the culture supernatant of about 150 hybridomas that had grown and formed colonies after 9 days from the start of culture (in Example 1) The expression vector (pcDNA4 / Myc-His) incorporating the mouse Itm2A full-length cDNA described in the section “Materials and Methods”, “Isolation of mouse and human Itm2A full-length cDNA and construction of expression vector”, Screening was performed by FACS analysis using a cell suspension in which HEK293 cells were transfected by the method described in “Gene introduction”. The cell suspension was reacted with the culture supernatant (4 ° C., 15 minutes). After washing with PBS, it was reacted with biotinylated anti-rat IgG (4 ° C., 15 minutes), washed with PBS, and reacted with streptavidin-PE (4 ° C., 15 minutes). Analysis was performed with FACS Calibur (BECTON DICKINSON). The culture supernatant that was positive in the screening by FACS was then screened by immunostaining using mouse fetal liver cells. Specifically, this operation was performed as follows. All cells including hepatocytes were prepared from embryonic day 12.5 fetal mice by the method described in “Preparation of mouse embryonic hepatocytes” in “Materials and Methods” above. The cells were smeared on a slide glass at a cell count of 1 × 10 ⁵ cells (cytospin 3; SHANDON) (room temperature, 800 rpm, 3 minutes). The smear was fixed with 4% paraformaldehyde and then treated with PBS containing 1.5% normal goat serum (room temperature, 30 minutes). Subsequently, the culture supernatant and biotinylated anti-rat antibody were sequentially reacted, and staining was performed by a reaction using DAB as a substrate. As counterstaining, nuclear staining with hematoxylin was performed. As a result, two hybridoma cell lines recognizing Itm2A were established (clone 3A2, 8B1).

磁気ビーズを用いた細胞分離
胎生13.5日の胎児マウスから上記「材料と方法」の「マウス胎生肝細胞の調製」の項に記載した方法で肝細胞を含む全ての細胞を調整した。細胞をFACS用細胞膜浸透化試薬（BECTON DICKINSON）で処理した（室温、５分）。遠心後（1000rpm、５分）、細胞を、上記した抗Itm2Aモノクローナル抗体を含む培養上清、ビオチン化抗ラット抗体、ストレプトアビジンビーズと順次反応させた（各反応条件は、それぞれ、４℃、１５分）。次いで、autoMACSを用いて、Itm2A陽性細胞を分離した。この操作は具体的には次のようにして行なった。上記の一連の反応を終えた細胞懸濁液を遠心後（1000rpm, ５分）、3mLの0.5% BSAを含むフローサイトメトリー・シース液（BIOSURE）に懸濁した。細胞懸濁液をautoMACS(MILTENYI BIOTEC)にセットし、同装置の分離プログラムPOSSELD2を用いて、Itm2A陽性細胞をポジテイブセレクションによって分離した。
結果
１．cDNAチップ解析
上記の通り、dlk (delta-like)は、胎生肝細胞に高発現している細胞膜蛋白質であり、抗dlkモノクローナル抗体とMACS (Magnetic beads cell sorting)を組み合わせる事によって、胎児肝臓から、肝細胞のみを高純度で回収する事ができる（特許文献１)。胎生12.5日の胎生肝臓のdlk発現細胞と胎生17.5日のdlk発現細胞の遺伝子発現比較をDNAチップ解析により行った。解析に使用したDNAチップは、Incyte Genomics (米国)製のマウスGEM2 マイクロアレーで、9514クローンが搭載されているDNA チップである。胎生12.5日の胎生肝細胞は（dlk発現細胞）、肝芽細胞と呼ばれ肝細胞と胆管上皮細胞へと両方向に分化しうる能力をもっている。この中に、更に自己複製能も併せ持つ肝幹細胞が含まれていると考えられる。一方、胎生17.5日の胎生肝細胞は出生直前であり、その大部分は肝細胞に運命決定されており、グルコース6フォスファターゼやチロシンアミノトランスフェラーゼといった肝臓特有の代謝酵素の遺伝子を発現し始める時期である。したがって、この両者の遺伝子発現を比較することによって、肝芽細胞特異的な遺伝子、ひいては肝幹細胞特異的な遺伝子や、発生に伴い発現が誘導される遺伝子を同定することが期待できる。解析の結果、全9514クローンの内、218 クローンが発現増強されており、133クローンが発現減少していた。肝幹細胞に特異的に発現している遺伝子を同定する事を目的に、発生にともない発現が減少した133クローンに着目した結果、減少率が大きく（２倍以上）、その一次構造上、２型膜蛋白質である事が予想されているIntegral membrane protein 2A (Itm2A: Genbank accetion No. NM_008409 )に着目した。 Cell separation using magnetic beads All cells including hepatocytes were prepared from embryonic day 13.5 fetal mice by the method described in "Preparation of mouse embryonic liver cells" in "Materials and methods" above. . The cells were treated with a FACS cell membrane permeabilizing reagent (BECTON DICKINSON) (room temperature, 5 minutes). After centrifugation (1000 rpm, 5 minutes), the cells were sequentially reacted with the culture supernatant containing the above-mentioned anti-Itm2A monoclonal antibody, biotinylated anti-rat antibody, and streptavidin beads (each reaction condition was 4 ° C., 15 ° C., respectively). Min). Subsequently, Itm2A positive cells were separated using autoMACS. Specifically, this operation was performed as follows. The cell suspension after the above series of reactions was centrifuged (1000 rpm, 5 minutes) and then suspended in a flow cytometry sheath solution (BIOSURE) containing 3 mL of 0.5% BSA. The cell suspension was set in autoMACS (MILTENYI BIOTEC), and Itm2A positive cells were separated by positive selection using the separation program POSSELD2 of the same apparatus.
result
1. cDNA chip analysis As described above, dlk (delta-like) is a cell membrane protein highly expressed in fetal liver cells. By combining anti-dlk monoclonal antibody and MACS (Magnetic beads cell sorting), fetal liver, Only hepatocytes can be recovered with high purity (Patent Document 1). Comparison of gene expression between dlk-expressing cells in the embryonic liver at 12.5 days and dlk-expressing cells at 17.5 days in the embryo was performed by DNA chip analysis. The DNA chip used for the analysis is a mouse GEM2 microarray manufactured by Incyte Genomics (USA), which is a DNA chip on which 9514 clones are mounted. Embryonic hepatocytes (dlk-expressing cells) on day 12.5 are called hepatoblasts and have the ability to differentiate into hepatocytes and biliary epithelial cells in both directions. It is considered that hepatic stem cells having further self-replicating ability are included in this. On the other hand, embryonic hepatocytes on the 17.5th day of embryonic life are just before birth, and most of them are destined for hepatocytes, and it is time to start expressing genes of liver-specific metabolic enzymes such as glucose 6 phosphatase and tyrosine aminotransferase . Therefore, by comparing the gene expression of both, it can be expected that hepatoblast-specific genes, and thus hepatic stem cell-specific genes, and genes whose expression is induced as a result of development are identified. As a result of the analysis, out of all 9514 clones, 218 clones had enhanced expression and 133 clones had decreased expression. As a result of focusing on 133 clones whose expression decreased with development for the purpose of identifying genes specifically expressed in hepatic stem cells, the reduction rate was large (more than 2 times), and its primary structure was type 2 We focused on Integral membrane protein 2A (Itm2A: Genbank accetion No. NM_008409), which is expected to be a membrane protein.

２．胎生肝臓におけるItm2Aの遺伝子発現解析
DNAチップ解析において、Itm2Aは胎生12.5日で高発現しており、胎生17.5日では発現強度が半分以下になるという結果であったので、実際にノーザンブロットで発生肝におけるItm2Aの発現を確認した。その結果、胎生12.5日の肝臓で高発現しており、その後、急速に発現が減弱し、胎生16.5 日では若干の発現が認められるものの、成体肝臓では発現は検出できなかった。胎生12.5日の肝臓は、造血器官として機能しており、多数の血球が混在している。Itm2Aが胎生肝細胞に発現しているのか、血球に発現しているのかを調べる為に、胎生12.5日の肝臓から、dlk陽性細胞と陰性細胞をautoMACSを用いて分画化して、それぞれの画分におけるItm2Aの発現をRT-PCRで調べたところ、Itm2Aはdlk陽性細胞に特異的であった。胎生肝臓において、dlkの発現は胎生肝細胞に特異的であり、血球には発現していないことから、Itm2Aも胎生肝細胞に特異的に発現している事が示唆された。更に発現の時期を遡る為に、胎生10.5日と11.5日の胎児のホールマウントin situハイブリダイゼーションを行った結果、両者の肝臓原基にその発現が認められた。マウスにおいては、胎生9.5日頃、肝臓原基が腸管の一部から形成されるが、Itm2Aはその直後からすでに発現している事がわかった。Itm2A遺伝子はマウスだけでなく、ヒトにおいても非常に高い相同性が保たれている(Genbank accetion No. XM_084285)。ヒトの胎児肝臓においても、マウスと同様に発現が認められるかを、市販のヒト胎児肝臓全RNAサンプル（TAKARA）を用いてノーザンブロットにより調べたところ、妊娠６週目から12週目の胎児肝臓においてItm2Aの発現が認められた。 2. Gene expression analysis of Itm2A in fetal liver
In the DNA chip analysis, Itm2A was highly expressed on embryonic day 12.5, and the result showed that the expression intensity became half or less on embryonic day 17.5. Thus, the expression of Itm2A in the developing liver was actually confirmed by Northern blotting. As a result, it was highly expressed in the liver of embryonic day 12.5, and then the expression was rapidly attenuated. Although expression was observed slightly in embryonic day 16.5, expression was not detected in adult liver. The liver of 12.5 days of gestation functions as a hematopoietic organ, and many blood cells are mixed. To examine whether Itm2A is expressed in fetal liver cells or blood cells, dlk positive cells and negative cells are fractionated from the liver of embryonic day 12.5 using autoMACS. Itm2A was specific for dlk-positive cells when RT-PCR was used to examine the expression of Itm2A in the minute. In the fetal liver, dlk expression is specific to fetal hepatocytes and not to blood cells, suggesting that Itm2A is also specifically expressed in fetal hepatocytes. Furthermore, in order to go back to the time of expression, fetal whole mount in situ hybridization was performed on embryonic days 10.5 and 11.5, and as a result, expression was observed in both liver primordia. In mice, the liver primordium was formed from part of the intestine around embryonic day 9.5, but it was found that Itm2A was already expressed immediately after that. The Itm2A gene maintains very high homology not only in mice but also in humans (Genbank accetion No. XM — 084285). In human fetal liver, whether or not expression was observed in the same manner as in mice was examined by Northern blotting using a commercially available human fetal liver total RNA sample (TAKARA), fetal liver at 6th to 12th weeks of pregnancy. In Itm2A expression was observed.

３．マウス胎生肝臓における免疫組織化学
ノーザンブロットとRT-PCRによる遺伝子発現解析から、Itm2Aは胎生肝細胞に発現している事が示唆されたが、更に確認の為、作製した抗Itm2A抗体（ウサギIgG）を用いて、胎生12.5日の肝臓切片を免疫染色した。その結果、Itm2Aは胎生肝細胞に発現しているアルファフェトプロテインやdlkと同様に、胎生肝細胞で染まり、血球では染まらなかった。また、胎生肝臓をコラゲナーゼ処理して得られた細胞懸濁液のサイトスピン標本をもちいて、dlkとItm2Aの二重染色を行った結果、dlkとItm2Aの染色が完全に一致した。 3. Immunohistochemistry in mouse embryonic liver Northern blot and RT-PCR gene expression analysis suggested that Itm2A is expressed in embryonic hepatocytes, but for further confirmation, an anti-Itm2A antibody (rabbit IgG) was prepared. Was used to immunostain embryonic day 12.5 liver sections. As a result, Itm2A was stained by fetal liver cells and not by blood cells, like alphafetoprotein and dlk expressed in fetal liver cells. Moreover, as a result of double staining of dlk and Itm2A using a cytospin specimen of a cell suspension obtained by treating the embryonic liver with collagenase, the staining of dlk and Itm2A was completely consistent.

4．FACS解析
Itm2Aは、その一次構造から、一回膜貫通型の２型膜蛋白質であると予想されているが、実際に細胞膜に出ている事を証明した論文はない。Itm2Aの細胞外領域に対するモノクローナル抗体を作製し、Itm2Aを発現している肝幹細胞を分離しようとする為には、まず、Itm2Aが本当に２型膜蛋白質であるということを確認する必要がある。２型膜蛋白質とは、N末端側が細胞内に存在し、C末端側が細胞外に出るタイプの膜蛋白質である。PCRによってクローニングしたマウスItm2A cDNA は、C末端にMyc タグとHis タグとの融合タンパク質となるように発現ベクター（pcDNA4/Myc-His: Invitrogen)にクローニングされているので、Itm2Aが構造上の予測通りに２型膜蛋白質であれば、細胞に発現させた時に、C末端側に付加されているMycタグ、His タグが細胞外に出てくるので、抗Myc抗体、抗His抗体によって、FACS解析が可能である。NIH3T3細胞にこのItm2A-Myc-His融合タンパク質を強制発現させ、抗Myc抗体と抗His抗体によってFACS解析したところ、抗Myc抗体で4.3 %, 抗His抗体で16.5 %の細胞が、シフトが見られた。すなわち、Itm2Aは確かに２型膜蛋白質であることが確認された。両者間での値の差は、実験ごとの遺伝子導入効率の差であると考えられる。 Four. FACS analysis
Itm2A is predicted to be a single-transmembrane type 2 membrane protein because of its primary structure, but there is no paper that proves that it actually appears in the cell membrane. In order to produce a monoclonal antibody against the extracellular region of Itm2A and to isolate hepatic stem cells expressing Itm2A, it is first necessary to confirm that Itm2A is really a type 2 membrane protein. A type 2 membrane protein is a type of membrane protein in which the N-terminal side is present in the cell and the C-terminal side is outside the cell. Mouse Itm2A cDNA cloned by PCR is cloned into an expression vector (pcDNA4 / Myc-His: Invitrogen) so that it becomes a fusion protein of Myc tag and His tag at the C-terminus. In the case of a type 2 membrane protein, when expressed in cells, the Myc tag and His tag added to the C-terminal come out of the cell, so FACS analysis can be performed using anti-Myc and anti-His antibodies. Is possible. When this Itm2A-Myc-His fusion protein was forcibly expressed in NIH3T3 cells and FACS analysis was performed with anti-Myc and anti-His antibodies, a shift was seen in 4.3% for anti-Myc antibody and 16.5% for anti-His antibody. It was. That is, it was confirmed that Itm2A is a type 2 membrane protein. The difference in value between the two is considered to be the difference in gene transfer efficiency for each experiment.

5. ラットオーバル細胞（成体肝臓における肝幹細胞）におけるItm2Aの遺伝子発現解析
肝臓は、非常に再生力の強い臓器であり、肝臓毒や部分肝切除によって、その一部を失っても速やかに再生が起こり、約１週間で元の肝重量に復元する。この場合の肝再生は、成熟肝細胞が増殖するが、２−アセチルアミノフルオレン(2-AAF)などの肝臓毒を前投与して成熟肝細胞の増殖能を抑制した状態で、７０％部分肝切除術を施してやると、門脈周囲にオーバル細胞と呼ばれる小型の細胞が出現する。オーバル細胞は増殖能の高い細胞で、未熟肝細胞と胆管上皮細胞の両者の性質を併せ持つ事から、成体肝臓における肝幹細胞と考えられている。そこで、発生過程における胎児肝幹細胞に発現していることが示唆されたItm2Aが、オーバル細胞、すなわち肝再生過程において出現してくる成体肝臓における肝幹細胞でも発現しているかを検討した。通常の７０％部分肝切除ではItm2Aの発現は、全く検出されなかったが、2-AAF投与と７０％部分肝切除を組み合わせてオーバル細胞の出現を誘導した場合にのみ、Itm2Aの遺伝子発現が、部分肝切除４日後から誘導され、徐々に減弱しながら１３日目まで発現が続き、２０日後には消失した。この発現パターンは、オーバル細胞に出現時期、オーバル細胞マーカーであるアルファフェトプロテインの発現パターンと酷似しており、Itm2Aがオーバル細胞に発現していることが示唆された。 5. Analysis of gene expression of Itm2A in rat oval cells (hepatic stem cells in adult liver) The liver is a very regenerative organ that can be rapidly regenerated even if part of it is lost by liver toxin or partial hepatectomy. Occurs and restores to the original liver weight in about a week. In this case, the liver regeneration is such that mature hepatocytes proliferate, but 70% partial liver in the state in which the liver hepatotoxin such as 2-acetylaminofluorene (2-AAF) is pre-administered to suppress the proliferation ability of mature hepatocytes. When excision is performed, small cells called oval cells appear around the portal vein. Oval cells are highly proliferative cells and have both the properties of immature hepatocytes and bile duct epithelial cells, and are considered hepatic stem cells in the adult liver. Therefore, it was examined whether Itm2A, which was suggested to be expressed in fetal liver stem cells during development, was also expressed in oval cells, ie, liver stem cells in the adult liver that appear during liver regeneration. Itm2A expression was not detected at all in normal 70% partial hepatectomy, but only when it was induced to develop oval cells by combining 2-AAF administration with 70% partial hepatectomy, It was induced from 4 days after partial hepatectomy, and continued to develop until day 13 while gradually decreasing, and disappeared after 20 days. This expression pattern was very similar to the expression pattern of alpha fetoprotein, an oval cell marker, at the time of appearance in oval cells, suggesting that Itm2A is expressed in oval cells.

6. 抗Itm2Aモノクローナル抗体（クローン3A2）を用いた、胎児肝細胞のFACS解析
Itm2Aは、アミノ酸配列から２型膜タンパク質であることが推定され、「結果」の「4．FACS解析」の項で示した通り、マウスまたはヒトのItm2A遺伝子を外来性に動物細胞に遺伝子導入した場合、２型膜タンパク質として細胞表面に発現されることが実験的に確認された。作製した抗Itm2Aモノクローナル抗体を用いて、常法に従い、マウス胎生12.5日の肝臓細胞のFACS解析を行った結果、Itm2Aの発現を検出できなかった。Kirchnerらは、2種類のT細胞由来細胞株において、Itm2Aは通常、細胞表面にも発現しているものの、大部分は細胞内オルガネラの膜に発現しており、T細胞活性化にともない細胞表面に移行するということを報告している（非特許文献３）。そこで、胎児肝臓細胞を細胞膜浸透化試薬（BECTON DICKINSON）で処理したのち、抗Itm2Aモノクローナル抗体、ビオチン化抗ラットIgG, ストレプトアビジンPEと順次反応させ、FACSしたところ, 約19%の細胞がItm2Aを強く発現していることが確認できた。この結果は、胎児肝臓細胞において、通常Itm2Aは細胞内オルガネラに局在していることを示唆している。そこで、以下の実験では、細胞を細胞膜浸透化試薬で処理した後、FACSまた磁気ビーズによる細胞分離を行った。 6. FACS analysis of fetal liver cells using anti-Itm2A monoclonal antibody (clone 3A2)
Itm2A is presumed to be a type 2 membrane protein from the amino acid sequence. As shown in “4. FACS analysis” in “Results”, mouse or human Itm2A gene was introduced into animal cells exogenously. In some cases, it was experimentally confirmed to be expressed on the cell surface as a type 2 membrane protein. Using the prepared anti-Itm2A monoclonal antibody, FACS analysis of mouse embryonic day 12.5 liver cells was performed according to a conventional method. As a result, itm2A expression could not be detected. Kirchner et al., In two types of T cell-derived cell lines, although Itm2A is usually expressed on the cell surface, the majority is expressed on the membrane of intracellular organelles. (Non-Patent Document 3). Therefore, after fetal liver cells were treated with a cell membrane permeabilizing reagent (BECTON DICKINSON), they were reacted sequentially with anti-Itm2A monoclonal antibody, biotinylated anti-rat IgG and streptavidin PE, and FACS, about 19% of the cells contained Itm2A It was confirmed that it was strongly expressed. This result suggests that Itm2A is normally localized to intracellular organelles in fetal liver cells. Therefore, in the following experiment, cells were treated with a cell membrane permeabilizing reagent, and then cells were separated using FACS or magnetic beads.

7. FACS解析によるItm2Aとdlkの発現比較
dlk (delta-like)は、胎生肝細胞に高発現している細胞膜蛋白質であり、抗dlkモノクローナル抗体とMACS (Magnetic beads cell sorting)を組み合わせる事によって、胎児肝臓から肝細胞のみを高純度で回収する事ができる（特許文献１）。肝臓における遺伝子発現のパターンから、Itm2A遺伝子は、dlk遺伝子よりも早く発現消失する為、より未熟な細胞マーカーである可能性が高い。FACSにより、抗dlkモノクローナル抗体と抗Itm2Aモノクローナル抗体で２次元解析を行ったところ、胎生12.5日と13.5日の肝臓では、dlk陽性細胞のうち、それぞれ94 %と89 %がItm2A陽性であった。一方、肝臓の発生が進んだ胎生15.5日の肝臓では、dlk陽性細胞のうち45 %がItm2A陽性であった。この結果は、Itm2Aがより未熟な肝幹細胞に発現しているマーカーである事を示している。 7. Comparison of Itm2A and dlk expression by FACS analysis
dlk (delta-like) is a cell membrane protein highly expressed in fetal liver cells. By combining anti-dlk monoclonal antibody and MACS (Magnetic beads cell sorting), only hepatocytes are recovered from fetal liver with high purity. (Patent Document 1). Because of the pattern of gene expression in the liver, the Itm2A gene disappears faster than the dlk gene, so it is likely that it is a more immature cell marker. As a result of two-dimensional analysis by FACS with anti-dlk monoclonal antibody and anti-Itm2A monoclonal antibody, 94% and 89% of the dlk-positive cells in the embryonic day 12.5 and 13.5 days were respectively Itm2A-positive. On the other hand, 45% of the dlk positive cells were positive for Itm2A in the embryonic day 15.5 liver with advanced liver development. This result indicates that Itm2A is a marker expressed in more immature hepatic stem cells.

8. Itm2Aモノクローナル抗体（クローン3A2）と磁気ビーズを用いた肝幹細胞分離
マウス胎生13.5日の肝臓細胞（4.2X10⁷細胞）を上記のとおり、AutoMACSを用いてItm2A陽性細胞とItm2A陰性細胞とに分離した結果、Itm2A陽性細胞（1.3 X10⁶細胞; 分離後の11 %）とItm2A陰性細胞（1.21 X10⁷細胞; 分離後89 %）とに分離できた。分離後のそれぞれの細胞画分のサイトスピン標本を作製し、肝細胞マーカーであるアルブミンとdlkで二重染色した結果、Itm2A陽性細胞の93 %がアルブミン／dlk陽性の肝細胞であり、一方、Itm2A陰性細胞の89 %がアルブミン／dlk陰性の血球系の細胞であった。 8. Separation of hepatic stem cells using Itm2A monoclonal antibody (clone 3A2) and magnetic beads <br/> Mouse embryonic day 13.5 liver cells (4.2X10 ⁷ cells) were Itm2A positive and Itm2A negative using AutoMACS as described above As a result, the cells were separated into Itm2A positive cells (1.3 × 10 ⁶ cells; 11% after separation) and Itm2A negative cells (1.21 × 10 ⁷ cells; 89% after separation). Cytospin specimens of each cell fraction after separation were prepared and double-stained with albumin and dlk as hepatocyte markers. As a result, 93% of Itm2A positive cells were albumin / dlk positive hepatocytes, 89% of Itm2A negative cells were albumin / dlk negative blood cells.

考察
２型膜蛋白質であるItm2Aは、元々未熟な軟骨・骨の前駆細胞に発現している分子として同定されたが、肝臓における発現は全く知られていなかった（Deleersnijder, W. et al (1996) Journal of Biological Chemistry 271 (32): 19475-82）。今回、胎生12.5日と胎生17.5 日の胎生肝細胞での遺伝子発現比較により、胎生10.5日から12.5日の胎生肝細胞に高発現していることを明らかにした。この時期の肝細胞は肝芽細胞とよばれ、肝細胞と胆管上皮細胞の両者に分化しうる能力をもっている。さらに、この肝芽細胞の中に自己複製能もあわせもつ肝幹細胞が含まれていると考えられる。また、成体の肝臓においても、ある種の病的な状態（重篤な肝臓疾患）で、成熟肝細胞の***、増殖能が抑制されている状態では、オーバル細胞という肝幹細胞が出現してくる。このオーバル細胞の起源については、不明な点が多いが、骨髄由来であることを示唆する報告が複数だされている。すなわち、骨髄細胞の肝細胞への分化転換によって生じる事が示唆されている。Itm2Aは通常の肝再生過程では、全く発現誘導されず、オーバル細胞が出現してくる肝再生モデルにおいて、その出現時期と合わせて発現が誘導された。この結果は、Itm2Aが発生過程における胎児肝幹細胞のみならず、骨髄由来ともいわれる成体肝臓における肝幹細胞にも発現している新規の細胞表面抗原であることが分かった。以上の結果から、Itm2Aは、発生過程の肝幹細胞、成体における肝幹細胞、骨髄やES 細胞からの分化転換によって生じる肝幹細胞における良いマーカーであり、Itm2Aの遺伝子やタンパク質の発現を指標に、肝幹細胞を同定し、高純度で分離回収することが可能となる。このようにして分離した肝幹細胞は、臓器移植に替わる次世代の再生医療として期待がかかる肝細胞移植や、ハイブリッド型人工肝臓、in vitroにおける薬物代謝実験等に使用することが可能である。 Discussion Itm2A, a type 2 membrane protein, was originally identified as a molecule expressed in immature cartilage and bone progenitor cells, but its expression in the liver was not known at all (Deleersnijder, W. et al (1996). ) Journal of Biological Chemistry 271 (32): 19475-82). In this study, we compared the gene expression in embryonic liver cells on embryonic day 12.5 and embryonic day 17.5, and found that it was highly expressed in embryonic liver cells from embryonic day 10.5 to 12.5. Hepatocytes at this time are called hepatoblasts and have the ability to differentiate into both hepatocytes and bile duct epithelial cells. Furthermore, it is considered that hepatic stem cells having self-replicating ability are included in these hepatoblasts. In the adult liver, hepatic stem cells called oval cells appear when the ability to divide and proliferate mature hepatocytes is suppressed under certain pathological conditions (serious liver disease). . There are many unclear points about the origin of this oval cell, but several reports suggest that it originates from bone marrow. That is, it has been suggested that it is caused by transdifferentiation of bone marrow cells into hepatocytes. Expression of Itm2A was not induced at all during normal liver regeneration, but was induced in the liver regeneration model in which oval cells appeared along with its appearance. These results indicate that Itm2A is a novel cell surface antigen expressed not only in fetal liver stem cells during development but also in liver stem cells in adult liver, which is also said to be derived from bone marrow. Based on the above results, Itm2A is a good marker for developing hepatic stem cells, hepatic stem cells in adults, and hepatic stem cells resulting from transdifferentiation from bone marrow and ES cells, and using itm2A gene and protein expression as an indicator Can be identified and separated and recovered with high purity. The hepatic stem cells thus isolated can be used for hepatocyte transplantation, which is expected as next-generation regenerative medicine in place of organ transplantation, a hybrid artificial liver, in vitro drug metabolism experiments, and the like.

Claims (9)

Itm2Aタンパク又はこれをコードするｍＲＮＡを指標として、生体外に分離された試料中の肝幹細胞の検出又は分離を行う、肝幹細胞の検出又は分離方法。 A method for detecting or isolating hepatic stem cells, comprising detecting or isolating hepatic stem cells in a sample isolated in vitro using the Itm2A protein or mRNA encoding the same as an index. Itm2Aタンパクの細胞外領域と抗原抗体反応するモノクローナル抗体を細胞と反応させ、細胞表面上に結合された該モノクローナル抗体を指標とする請求項１記載の方法。 The method according to claim 1, wherein a monoclonal antibody that reacts with an extracellular region of the Itm2A protein reacts with an antigen and reacts with a cell, and the monoclonal antibody bound on the cell surface is used as an index. 細胞中のItm2AタンパクのｍＲＮＡの存在又は生産量を指標とする請求項１記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the presence or production amount of mRNA of the Itm2A protein in the cell is used as an index. 胎児肝臓中の細胞集団に含まれる肝幹細胞を検出又は分離する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein hepatic stem cells contained in a cell population in fetal liver are detected or separated. 再生中の成体肝臓中の細胞集団に含まれる肝幹細胞を検出又は分離する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein hepatic stem cells contained in a cell population in a regenerating adult liver are detected or separated. 前記再生中の成体肝臓は、肝臓毒を投与し、かつ、肝臓の一部を切除した成体の肝臓である請求項５記載の方法。 6. The method according to claim 5, wherein the regenerating adult liver is an adult liver administered with liver toxin and excised from a part of the liver. 肝臓以外の組織又は胚性幹細胞中の細胞集団に含まれる肝幹細胞を検出又は分離する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein hepatic stem cells contained in a cell population in tissues other than liver or embryonic stem cells are detected or separated. 前記Itm2Aは、ヒトItm2Aである請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the Itm2A is human Itm2A. 細胞集団の中から肝幹細胞を分離する方法である請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 8, which is a method for separating hepatic stem cells from a cell population.