JP4419760B2

JP4419760B2 - Preparative electrophoresis microchip device

Info

Publication number: JP4419760B2
Application number: JP2004256229A
Authority: JP
Inventors: 昭博荒井; 功一鈴木; 伸中村
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2004-09-02
Filing date: 2004-09-02
Publication date: 2010-02-24
Anticipated expiration: 2024-09-02
Also published as: JP2006071505A

Description

本発明は、板状部材の内部に電気泳動流路を有するマイクロチップを使用し、微量のＤＮＡ又はタンパク質などの試料を分離した後、同一マイクロチップ上でフラグメントを分取する機能を有するマイクロチップ電気泳動装置に関する。 The present invention uses a microchip having an electrophoresis channel inside a plate-like member, and has a function of separating fragments on the same microchip after separating a small amount of sample such as DNA or protein. The present invention relates to an electrophoresis apparatus.

近年、分析化学の分野で微量のタンパク質や核酸、ＤＮＡなどを分取、又は分析する場合に貴重なサンプルを用いることから、分析時間の短縮、高純度、省溶媒化を図ることが期待されている。
目的とするＤＮＡフラグメント（断片）の回収はＤＮＡ組み換え実験においては必要不可欠な操作になっている。ＤＮＡフラグメントの回収方法に関する方法の一つにアガロースゲル電気泳動がある。これは、泳動後のアガロースゲル（寒天状ゲル）から、目的のバンドを含む断片を切り出し、ＤＮＡを抽出し精製する方法である。この場合、アガロースゲルはあらかじめ低融点のもの（例えばＴａＫａＲａアガロースＬＯ３、ＮｕＳｉｖｅＧＴＧアガロースなど）、又は純度の高いもの（例えばＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース）を選択する必要がある。 In recent years, in the field of analytical chemistry, precious samples are used when fractionating or analyzing minute amounts of proteins, nucleic acids, DNA, etc., and it is expected to shorten analysis time, achieve high purity, and save solvents. Yes.
Recovery of the target DNA fragment (fragment) is an indispensable operation in DNA recombination experiments. One of the methods relating to the method for recovering DNA fragments is agarose gel electrophoresis. This is a method in which a fragment containing a target band is cut out from an agarose gel (agar-like gel) after electrophoresis, and DNA is extracted and purified. In this case, it is necessary to select an agarose gel having a low melting point (for example, TaKaRa agarose LO3, NuSive GTG agarose, etc.) or a high-purity (for example, Seachem GTG agarose).

ＤＮＡの回収には、アガロースを溶解した後、シリカ担体のＤＮＡ吸着能を利用して不純物を除去し（ＮａＣｌ／エタノール／水洗浄）、目的のＤＮＡフラグメントを回収する。しかし、ＤＮＡフラグメントの回収率は３０〜７０％と低く（ＤＮＡサイズの大きいものほど低い）、ＤＮＡのバンド切り出し時に切り出し口前後の不純物が混入することがある。そのため、精製したものを再度アガロースゲル電気泳動にかけ、抽出・回収操作を繰り返す必要があった。
このように、アガロースゲル電気泳動法には、不純物が混入したり回収率が低いなどの問題や、熟練した作業者が行う必要があるなどの問題があった。 For DNA recovery, after agarose is dissolved, impurities are removed using the silica adsorption ability of the silica support (NaCl / ethanol / water washing), and the target DNA fragment is recovered. However, the recovery rate of DNA fragments is as low as 30 to 70% (the smaller the DNA size, the lower), and impurities before and after the cut-out opening may be mixed when the DNA band is cut out. Therefore, it was necessary to subject the purified product to agarose gel electrophoresis again and to repeat the extraction and recovery operation.
As described above, the agarose gel electrophoresis method has problems such as contamination of impurities and a low recovery rate, and a problem that a skilled worker needs to perform.

ＤＮＡフラグメントを回収する他の方法としては、ゲルを切り出す代わりにゲルの下流に溝を掘り、目的のＤＮＡバンドが通過する際にゲル溝にＤＥＡＥセルロース製の濾紙を挿んで、そのまま電気泳動させることによって、ろ紙に吸着させる方法がある。
さらに他の方法として、ゲルの下流の位置に、泳動方向と直角方向に回収溶液を注入する流路を設け、一定時間ごとに通電を止めて回収部を空気で置換することで、フラクションコレクタに回収する方法がある。
しかし、いずれの方法もゲル電気泳動による分離を基本としているため、分離性能の割には時間を要するという問題があった。 As another method of recovering DNA fragments, instead of cutting out the gel, a groove is dug downstream of the gel, and when the target DNA band passes, a DEAE cellulose filter paper is inserted into the gel groove and electrophoresed as it is. There is a method of adsorbing to filter paper.
As another method, a flow path for injecting the recovery solution in a direction perpendicular to the migration direction is provided at a position downstream of the gel, and the collection part is replaced with air by stopping the energization at regular intervals. There is a way to recover.
However, since each method is based on separation by gel electrophoresis, there is a problem that it takes time for the separation performance.

上記の問題に対し、成分の分離性能を上げることによって目的のフラグメントを高純度で回収する方法として、スラブゲル電気泳動よりも分離性能がよいキャピラリ電気泳動装置で、フラグメント機能を持つものが利用できる。
キャピラリ電気泳動装置は、内径が１００μｍ以下のガラスキャピラリ内に泳動バッファを充填し、一端側に試料を導入した後、両端間に高電圧を印加して分析対象物をキャピラリ内で展開させるものである。キャピラリー内は容積に対して表面積が大きい、すなわち冷却効率が高いことから、キャピラリーの両端間への高電圧の印加が可能となり、ＤＮＡなどの極微量試料を短時間、かつ高分解能で分析することができる。 As a method for recovering the target fragment with high purity by improving the separation performance of the components with respect to the above problems, a capillary electrophoresis apparatus having a better separation performance than slab gel electrophoresis and having a fragment function can be used.
A capillary electrophoresis apparatus is a device in which an electrophoresis buffer is filled in a glass capillary having an inner diameter of 100 μm or less, a sample is introduced into one end, and then a high voltage is applied between both ends to develop an analyte in the capillary. is there. Capillary has a large surface area with respect to volume, that is, cooling efficiency is high, so it is possible to apply a high voltage across both ends of the capillary and analyze trace samples such as DNA with high resolution in a short time. Can do.

しかし、前述のように、電場を取り除いた状態でキャピラリ端面を回収容器に浸ける必要があるため、キャピラリ内のバッファに泳動性がある場合、正確な分取ができなくなる。さらに、電気泳動によって回収するため、回収容器にはあらかじめ数１０μＬの泳動バッファを入れておく必要があり、次の試料に使用するためには、別途、濃縮することになる。 However, as described above, since it is necessary to immerse the end face of the capillary in the collection container with the electric field removed, accurate separation cannot be performed if the buffer in the capillary has electrophoretic properties. Furthermore, in order to collect by electrophoresis, it is necessary to put several tens of μL of the electrophoresis buffer in the collection container in advance, and it is separately concentrated for use in the next sample.

キャピラリゲル電気泳動法の特性を利用したものとして、高分離で検出された成分がキャピラリ出口から溶出する直前に、電圧の印加を止め、キャピラリ出口端を少量のバッファ溶液を入れたサンプル容器に入れ、再度通電することにより、目的のフラクションを回収する手段もある。
さらに、微量分析を目的とした１枚のマイクロチップを利用し、電気泳動させた試料の所望の部分を分画してポッドに回収する方法も提案されている（特許文献１参照。）。
特開２００２−３１０９９２号公報 Using the characteristics of capillary gel electrophoresis, immediately before the components detected in high separation elute from the capillary outlet, the voltage application is stopped and the capillary outlet end is placed in a sample container containing a small amount of buffer solution. There is also a means for collecting the target fraction by energization again.
Furthermore, a method has been proposed in which a single microchip for the purpose of microanalysis is used, and a desired portion of the electrophoresed sample is fractionated and collected in a pod (see Patent Document 1).
JP 2002-310992 A

キャピラリ電気泳動の場合はゲル電気泳動と異なり、サンプルアプライ量を増大させることにより、分離性能が劣化し、ピークの対称性が損なわれる。そのため、回収量をかせぐためには、キャピラリを複数本バンドル化させて、分離性能を維持させたまま、キャピラリ本数倍の量を分取するか、１本のキャピラリに繰り返しサンプルを注入して、同じ回収容器に分取することが考えられる。
ただし、バンドル化する場合は、キャピラリ内部の熱の逃散性がバンドル内部と周囲に差を生じさせ、同じタイミングで目的の分画を得ることが困難になる。
マイクロチップは、主に極微量のＤＮＡなどの試料成分の分析に用いられており、流路幅が小さいため１枚のマイクロチップでは試料を分取回収するには十分な容積ではない。 In the case of capillary electrophoresis, unlike gel electrophoresis, by increasing the amount of sample application, the separation performance deteriorates and the symmetry of the peak is lost. Therefore, in order to increase the recovery amount, bundle a plurality of capillaries and separate the number of capillaries while maintaining the separation performance, or repeatedly inject a sample into one capillary, It is conceivable to dispense into the same collection container.
However, in the case of bundling, it is difficult to obtain a desired fraction at the same timing because the heat dissipation in the capillary causes a difference between the inside and the surrounding of the bundle.
A microchip is mainly used for analyzing sample components such as a very small amount of DNA, and since the flow path width is small, a single microchip does not have a sufficient volume for collecting and collecting a sample.

実例として、ｍＲＮＡから逆転写して得られたｃＤＮＡの純度は、その後のクローニング実験がうまくいくかどうかを左右するため、手間をかけずに極めて純度の高いｃＤＮＡを得ることが必要である。この時、分取したいＤＮＡ量としては５０ｎｇが必要である。
マイクロチップの場合、ピークとして十分検出できる濃度が１０ｎｇ／μＬで、マイクロチップの１本の流路に１回に導入できる試料の体積が０．５ｎＬとすると、５×１０^-3ｎｇしか回収できないことになる。５０ｎｇを得るためには、１０，０００倍の絶対量を分取する必要があるため、１本の分離流路を使って単に繰り返しサンプルを導入するだけでは、限界がある。
そこで、本発明はマイクロチップを使って特定の試料成分を効率よく正確に分取することを目的とする。 By way of illustration, the purity of cDNA obtained by reverse transcription from mRNA affects the success of subsequent cloning experiments, so it is necessary to obtain highly pure cDNA without much effort. At this time, 50 ng is required as the amount of DNA to be separated.
In the case of a microchip, if the concentration that can be sufficiently detected as a peak is 10 ng / μL and the volume of a sample that can be introduced at one time into one flow path of the microchip is 0.5 nL, only 5 × 10 ⁻³ ng can be recovered. It will be. In order to obtain 50 ng, it is necessary to fractionate an absolute amount 10,000 times, and there is a limit to simply introducing a sample repeatedly using one separation channel.
Accordingly, an object of the present invention is to efficiently and accurately sort a specific sample component using a microchip.

本発明は、重ね合わせた複数枚のマイクロチップを備え、各マイクロチップは同一材料からなり、同一デザインの流路をもち、流路は試料導入流路、導入された試料を分離する分離流路及び分離された試料成分を分取する分取流路を備え、各流路の先端にはリザーバを備え、各リザーバはスルーホールによって全マイクロチップ間でつながっており、最上層または最下層のマイクロチップの分離流路には試料成分の検出部が設置されており、リザーバ間に泳動用電圧が印加される分取用の電気泳動マイクロチップ装置である。 The present invention includes a plurality of superposed microchips, each microchip is made of the same material, has a channel of the same design, the channel is a sample introduction channel, and a separation channel for separating the introduced sample And a separation channel for separating the separated sample components, and a reservoir is provided at the tip of each channel, and each reservoir is connected between all the microchips by through holes, and the top layer or bottom layer micro In the separation flow path of the chip, a sample component detection unit is installed, and this is a preparative electrophoresis microchip apparatus in which a migration voltage is applied between reservoirs.

各マイクロチップにおいて、前記流路が複数本の分離流路を含み、前記分取流路とそれにつながる分取用リザーバは前記複数の分離流路によって共用されるようにつながっているものとすることができる。 In each microchip, the channel includes a plurality of separation channels, and the sorting channel and the sorting reservoir connected to the sorting channel are connected to be shared by the plurality of separation channels. Can do.

また、各マイクロチップにおいて、前記分離流路が環状に形成され、前記分取流路が前記分離の異なる位置に接続されたものとすることもできる。
分取成分の特定には、分取流路の下流、分取用流路の直前で検出することによって行なう。 In each microchip, the separation channel may be formed in an annular shape, and the sorting channel may be connected to a different position of the separation.
The sorting component is specified by detecting it downstream of the sorting channel and immediately before the sorting channel.

本発明では、高分離で分離を行なうためのマイクロチップ流路の延長に、フラクションを分取する複数のリザーバを設け、分離流路が同一デザインのチップを複数枚、積層構造にすることにより、積層枚数倍の分取量を増やすことができる。
アガロースゲル電気泳動などに比べて短時間で、分離度の高い分離が可能である。
キャピラリ電気泳動のように、断続的に電気泳動の停止や分取を繰り返すことなく、高純度のフラグメントを高回収率で得ることができる。 In the present invention, in the extension of the microchip flow path for performing separation with high separation, a plurality of reservoirs for separating fractions are provided, and a plurality of chips with the same design of the separation flow path are made into a laminated structure, The amount of sorting can be increased by a factor of the number of stacked sheets.
Separation with high resolution is possible in a short time compared to agarose gel electrophoresis.
Like capillary electrophoresis, high-purity fragments can be obtained at a high recovery rate without intermittently stopping and separating electrophoresis.

積層構造のチップ枚数に加えて各マイクロチップ内でも、同一特性の複数の分取流路で同時に泳動させた目的成分を、共通のリザーバで分画することによっても、分取量を増やすことが可能になる。
流路に試料成分を分取する環状の分離流路を備えることによっても、効率よく分取することができる。 In addition to the number of chips in a stacked structure, even within each microchip, the fraction can be increased by fractionating the target components that were simultaneously migrated in multiple fractionation channels with the same characteristics in a common reservoir. It becomes possible.
Efficient separation can also be achieved by providing an annular separation channel for separating sample components in the channel.

本発明で実施されるチップ構造の一例を図１に示す。図１は基本的なチップ構造を示しており、同一材料からなり同一デザインの基板に形成された同一形状の流路が、それぞれのリザーバが重なるように、基板を複数枚積層状に重ねたマイクロチップ装置である。
図２は、マイクロチップについて、図１に示した流路における断面の一例を示している。
図３は、図１の各チップに形成されているリザーバや流路等の配置の詳細図を示している。 An example of a chip structure implemented in the present invention is shown in FIG. FIG. 1 shows a basic chip structure, in which a plurality of substrates are stacked in a stacked manner such that channels of the same shape made of the same material and formed on a substrate of the same design overlap each reservoir. It is a chip device.
FIG. 2 shows an example of a cross section of the microchip in the flow path shown in FIG.
FIG. 3 shows a detailed view of the arrangement of reservoirs, flow paths and the like formed in each chip of FIG.

図３に示すように、各チップには分離流路２４及び分離流路２４から分岐した分取流路が形成されている。分離流路２４は電気泳動を行うときに用いる直線状の流路で、分取流路は分取した成分を取り出すための流路である。各流路の端にはリザーバが配置されている。図３では、サンプルリザーバ２０，サンプル排出リザーバ２２，バッファリザーバ２１及びドレイン２３は分離流路２４につながっており、分取リザーバ２６ａ〜２６ｄは分取流路につながっている。すなわち、リザーバ２２，リザーバ２１は、リザーバ２０が配置されている側の分離流路２４に接続されており、リザーバ２６ａ〜２６ｄはリザーバ２３が配置されている側の分離流路２４から分岐されたそれぞれの分取流路に接続されている。 As shown in FIG. 3, each chip has a separation channel 24 and a sorting channel branched from the separation channel 24. The separation channel 24 is a linear channel used for electrophoresis, and the sorting channel is a channel for taking out the separated components. A reservoir is disposed at the end of each flow path. In FIG. 3, the sample reservoir 20, the sample discharge reservoir 22, the buffer reservoir 21, and the drain 23 are connected to the separation channel 24, and the sorting reservoirs 26a to 26d are connected to the sorting channel. That is, the reservoir 22 and the reservoir 21 are connected to the separation channel 24 on the side where the reservoir 20 is disposed, and the reservoirs 26a to 26d are branched from the separation channel 24 on the side where the reservoir 23 is disposed. It is connected to each sorting channel.

２７は目的試料成分を検出する試料成分検出部であり、最上層または最下層に設けられるチップにのみ設けられ、分離流路２４上で分取流路との接続部よりも上流側に配置されている。検出部２７は例えば蛍光検出装置であり、その部分の流路に励起光を照射し、発光する蛍光を検出する。
リザーバの位置は全てのチップで重なる位置に設けられ、図２のように重ねたときに各チップの対応するリザーバが連通する。
分取流路は分離流路２４に比べて流路幅が小さく形成されており、溶液はより速く流れると同時に自然拡散によるリザーバ相互間の相互汚染を抑制することができる。 Reference numeral 27 denotes a sample component detection unit for detecting a target sample component, which is provided only on the chip provided in the uppermost layer or the lowermost layer, and is disposed on the upstream side of the separation channel 24 and the connection with the sorting channel. ing. The detection unit 27 is, for example, a fluorescence detection device, and irradiates excitation light to the flow path of the part to detect emitted fluorescence.
The positions of the reservoirs are provided at positions where all the chips overlap, and the corresponding reservoirs of each chip communicate with each other when they are stacked as shown in FIG.
The sorting channel is formed with a channel width smaller than that of the separation channel 24, so that the solution flows faster, and at the same time, mutual contamination between reservoirs due to natural diffusion can be suppressed.

サンプルをリザーバ２０からリザーバ２２方向に、バッファをリザーバ２１からリザーバ２３方向に定常的に流れるように電圧を設定する。このときのリザーバ２０からリザーバ２２方向の電流値Ｉ₂に対する、リザーバ２１からリザーバ２３方向の電流値Ｉ₁の比は約２倍（Ｉ₁／Ｉ₂＝２）になるように設定する。
その後、０．３秒間程度、Ｉ₁／Ｉ₂の比が０．０５になるように電圧を切り替えることによって、０．５ｎＬ程度のサンプルをリザーバ２０から２３方向の分離流路２４に流す。 The voltage is set so that the sample steadily flows from the reservoir 20 to the reservoir 22 and the buffer from the reservoir 21 to the reservoir 23. At this time, the ratio of the current value I _{1 in} the direction from the reservoir 21 to the reservoir 23 to the current value I _{2 in the} direction from the reservoir 20 to the reservoir 22 is set to be approximately twice (I ₁ / I ₂ = 2).
After that, by switching the voltage so that the ratio of I ₁ / I ₂ becomes 0.05 for about 0.3 seconds, a sample of about 0.5 nL flows from the reservoir 20 to the separation channel 24 in the 23 direction.

再度、Ｉ₁／Ｉ₂の比が２になるように電圧を印加することにより、リザーバ２３方向の流路には、バッファ中に０．５ｎＬのサンプルが導入された状態となり、サンプルを分離することができる。
このようなサンプル注入方式を、一般にゲート注入方式と呼ぶ。このゲート注入を一定の時間間隔で繰り返し、試料を分離流路２４に定期的に導入する。 By applying a voltage again so that the ratio of I ₁ / I ₂ becomes 2, 0.5 nL of the sample is introduced into the buffer in the direction of the reservoir 23, and the sample is separated. be able to.
Such a sample injection method is generally called a gate injection method. This gate injection is repeated at regular time intervals, and the sample is periodically introduced into the separation channel 24.

分離されたサンプルを含む溶液は、リザーバ２３方向に電気泳動し、サンプル中の泳動速度の大きい成分は、泳動速度の小さい成分より速く移動する。電気泳動したサンプルは分離流路２４上に設置されている検出部２７の位置で検出される。具体的には、励起波長４７３ｎｍの高輝度ＬＥＤを光源とするレーザー蛍光検出器を用い、サンプルを透過した光を検出する。 The solution containing the separated sample is electrophoresed toward the reservoir 23, and a component having a high migration speed in the sample moves faster than a component having a low migration speed. The electrophoresed sample is detected at the position of the detection unit 27 installed on the separation channel 24. Specifically, light transmitted through the sample is detected using a laser fluorescence detector using a high-intensity LED with an excitation wavelength of 473 nm as a light source.

目的のサンプルを分取リザーバ２６ａに分取するとき、例えば、目的の成分１が検出部２７で検出された後、分離流路２４中でリザーバ２１からリザーバ２３にかかる電場を一瞬、リザーバ２１−２６ａ間に切り替えることにより、成分１をリザーバ２６ａ方向へ電気泳動させる。
引き続き、分取したい成分２が、検出部２７を通過した後、電圧を２１−２６ｂ間に切り替えて成分２をリザーバ２６ｂ方向へ電気泳動させる。このようにして、順に電圧を切り替えることにより、成分がそれぞれの分取リザーバに分画され、最後の成分４がリザーバ２６ｄに分取された時点で、分離流路２４中のリザーバ２１−２３とリザーバ２０−２２に定常的な電圧をかけていることにより、流路内に残った不要成分を除去することができる。 When the target sample is dispensed into the sorting reservoir 26a, for example, after the target component 1 is detected by the detection unit 27, the electric field applied from the reservoir 21 to the reservoir 23 in the separation channel 24 is instantaneously stored in the reservoir 21- By switching between 26a, the component 1 is electrophoresed toward the reservoir 26a.
Subsequently, after the component 2 to be separated passes through the detection unit 27, the voltage is switched between 21-26b, and the component 2 is electrophoresed toward the reservoir 26b. In this manner, by sequentially switching the voltages, the components are fractionated into the respective sorting reservoirs, and when the last component 4 is sorted into the reservoir 26d, the reservoirs 21-23 in the separation channel 24 By applying a constant voltage to the reservoir 20-22, unnecessary components remaining in the flow path can be removed.

ゲート注入が繰り返されているので、同一フラグメントを同一の分取リザーバへ分画する操作も繰り返す。
この分取動作は重ねられた全てのチップで同時に行なわれ、分取成分は共通の分取リザーバへ集められる。本発明は、上記の電圧比及び波長などに限定されるものではなく、サンプルを分取及び検出できる電圧、波長であれば構わない。 Since the gate injection is repeated, the operation of fractionating the same fragment into the same fractionation reservoir is also repeated.
This sorting operation is performed simultaneously on all the stacked chips, and the sorting components are collected in a common sorting reservoir. The present invention is not limited to the above voltage ratio and wavelength, and any voltage and wavelength can be used as long as the sample can be sorted and detected.

本発明で実施されるチップ構造の、他の実施例図を図４から図８に示す。
図４は図３に示したチップ構造の変形例であり、分離流路３４のリザーバＤ側に、３５ａ
−３６ａ，３５ｂ−３６ｂ，３５ｃ−３６ｃ，３５ｄ−３６ｄに分岐したそれぞれの分取流路を備えている。分取流路は分離流路３４よりも流路幅が小さく、泳動速度が速くなると同時にリザーバ間の相互汚染を抑えることができる。 FIGS. 4 to 8 show other embodiments of the chip structure implemented in the present invention.
FIG. 4 shows a modification of the chip structure shown in FIG.
-36a, 35b-36b, 35c-36c, 35d-36d are provided with respective sorting channels. The sorting channel has a channel width smaller than that of the separation channel 34, and the migration speed is increased, and at the same time, cross contamination between the reservoirs can be suppressed.

図４に示すチップは、サンプルリザーバ３０，サンプル排出リザーバ３２，バッファリザーバ３１，ドレイン３３と分取リザーバ３５ａ−３６ａ，３５ｂ−３６ｂ，３５ｃ−３６ｃ，３５ｄ−３６ｄ間の各リザーバにつながる分取流路及び分離流路３４が形成されている。このチップも図２のように各リザーバが重なるように重ね合わせて使用される。
一実施例として、ゲート方式によってサンプルを分取する方法を示す。
リザーバ３６ａに着目すると、分離流路３４中のリザーバ３１からリザーバ３３にかかっている電場によって電気泳動していった成分１が検出部３７ａを通過した瞬間に、電場をリザーバ３５ａからリザーバ３６ａにかかるように電圧を印加する。その後電場をすぐに元に戻す。 The chip shown in FIG. 4 has a sample reservoir 30, a sample discharge reservoir 32, a buffer reservoir 31, a drain 33 and a sorting flow connected to each reservoir between the sorting reservoirs 35a-36a, 35b-36b, 35c-36c, and 35d-36d. A channel and a separation channel 34 are formed. This chip is also used in such a manner that the reservoirs overlap as shown in FIG.
As one embodiment, a method for sorting samples by a gate method will be described.
When attention is paid to the reservoir 36a, the electric field is applied from the reservoir 35a to the reservoir 36a at the moment when the component 1 electrophoresed by the electric field applied from the reservoir 31 to the reservoir 33 in the separation channel 34 passes through the detection unit 37a. Apply voltage as follows. Then restore the electric field immediately.

この操作によって、成分１のみが３６ａリザーバに分取される。
同様に、検出部３７ｂ〜３７ｄで成分２〜４を検出した後に、リザーバ３５ｂ−３６ｂ、リザーバ３５ｃ−３６ｃ、リザーバ３５ｄ−３６ｄ間に電場をかけることによって、成分２から成分４をそれぞれリザーバ３６ｂからリザーバ３６ｄに分取することができる。 By this operation, only component 1 is dispensed into the 36a reservoir.
Similarly, after the components 2 to 4 are detected by the detection units 37b to 37d, an electric field is applied between the reservoirs 35b to 36b, the reservoirs 35c to 36c, and the reservoirs 35d to 36d, so that the components 2 to 4 are respectively extracted from the reservoir 36b. It can be sorted into the reservoir 36d.

図５に示すチップは、図３及び図４に示すチップの分離流路が１本であったのに対し、２本である。また、サンプルリザーバ４０ａ，４０ｂ、サンプル排出リザーバ４２ａ，４２ｂ、バッファリザーバ４１ａ，４１ｂは２つずつ形成されているが、これらをチップ上で共用する構造でも構わない。このチップでは流路４４ａと４４ｂは等しく形成されており、流路４４ａに対するリザーバ４０ａ、４１ａ、４２ａの相対的な位置関係と流路４４ｂに対するリザーバ４０ｂ、４１ｂ、４２ｂの相対的な関係は等しく形成されている。
溶媒排出リザーバ４３及びサンプル分取リザーバ４６ａ〜４６ｄは１つずつ形成されており、２つの流路によって電気泳動された成分を同時に分取できる。 The number of chips shown in FIG. 5 is two compared to the number of separation channels of the chips shown in FIGS. 3 and 4. Further, although two sample reservoirs 40a and 40b, two sample discharge reservoirs 42a and 42b, and two buffer reservoirs 41a and 41b are formed, they may be shared on the chip. In this chip, the channels 44a and 44b are formed equally, and the relative positional relationship of the reservoirs 40a, 41a, 42a with respect to the channel 44a and the relative relationship of the reservoirs 40b, 41b, 42b with respect to the channel 44b are formed equally. Has been.
The solvent discharge reservoir 43 and the sample collection reservoirs 46a to 46d are formed one by one, and the components electrophoresed by the two flow paths can be simultaneously collected.

また、リザーバ４６ａ〜４６ｄは、２つの分離流路からの距離が等しくなるように一直線に配置してもよいし、図５に示すように、隣り合う分取リザーバが接触しないように、互いにずらして配置してもよく、その場合には、リザーバ４６ａ〜４６ｄの配置面積を小さくすることができる。 In addition, the reservoirs 46a to 46d may be arranged in a straight line so that the distances from the two separation channels are equal, and as shown in FIG. 5, the reservoirs 46a to 46d are shifted from each other so that adjacent sorting reservoirs do not contact each other. In this case, the arrangement area of the reservoirs 46a to 46d can be reduced.

サンプル分取リザーバ４６ａ〜４６ｄに繋がっている分取流路は分離流路に繋がっており、分取流路は分離流路よりも流路幅が小さく形成されているために、分取流路中では泳動速度が速くなる。また分取リザーバ間の相互汚染を抑えることができる。
分離流路４４ａ，４４ｂを電気泳動する溶液の速度が２つの流路で同じであるように設定されているので、試料成分検出部４７ａ〜４７ｄは一方の分離流路４４ａの方に設置したが、他方の分離流路４４ａ，４４ｂに設置してもよい。 The sorting channel connected to the sample sorting reservoirs 46a to 46d is connected to the separation channel, and the sorting channel is formed with a channel width smaller than that of the separation channel. Inside, the migration speed becomes faster. Further, cross contamination between the sorting reservoirs can be suppressed.
Since the speed of the solution for electrophoresis in the separation channels 44a and 44b is set to be the same in the two channels, the sample component detection units 47a to 47d are installed toward one of the separation channels 44a. Alternatively, it may be installed in the other separation channel 44a, 44b.

図５のチップも対応するリザーバが重なるように複数枚が重ねられ、最上層または最下層のチップに検出部４７ａ、４７ｂが配置され、ゲート注入方式で試料が導入されることにより、検出部４７ａ〜４７ｄで同時に検出したものを次々に分取リザーバに回収することができる。
目的のサンプルを分取リザーバ４６ａに分取するとき、例えば、目的の成分１が分離流路４４ａの検出部４７ａで検出された後、リザーバ４１ａ−４３及びリザーバ４１ｂ−４３間にかかる電場を一瞬、リザーバ４１ａ−４６ａ及びリザーバ４１ｂ−４６ａ間に切り替えることにより、成分１をリザーバ４６ａ方向へ電気泳動させる。
このとき電場が同時に切り替わることにより、分離流路４４ｂ中の成分１もリザーバ４６ａ方向へ電気泳動される。
分離流路の容積は１本のときよりも増大しているので、一度に分取できる試料の量は多くなる。 A plurality of the chips in FIG. 5 are also stacked so that the corresponding reservoirs overlap, and the detection units 47a and 47b are arranged on the uppermost or lowermost chip, and the sample is introduced by the gate injection method, thereby detecting the detection unit 47a. Those detected simultaneously at ˜47d can be collected in the sorting reservoir one after another.
When the target sample is sorted into the sorting reservoir 46a, for example, after the target component 1 is detected by the detection unit 47a of the separation channel 44a, the electric field applied between the reservoir 41a-43 and the reservoir 41b-43 is momentarily applied. By switching between the reservoir 41a-46a and the reservoir 41b-46a, the component 1 is electrophoresed toward the reservoir 46a.
At this time, the electric field is switched at the same time, whereby the component 1 in the separation channel 44b is also electrophoresed toward the reservoir 46a.
Since the volume of the separation channel is larger than that of one, the amount of sample that can be collected at a time is increased.

図６に示すチップは、図５に示すチップの分離流路が２本であったのに対し、分離流路が５本である。また、サンプルリザーバ５１，サンプル排出リザーバ５２，溶媒リザーバ５０，溶媒排出リザーバ５３は１つずつ形成されているが、複数あっても構わない。
また、試料分取リザーバ５６ａ〜５６ｄは、１つずつ形成されており、５本の分離流路５４ａ〜５４ｅによって電気泳動された成分を同時に分取できる。
また、リザーバ５６ａ〜５６ｄは、５つの分離流路５４ａ〜５４ｅからの距離がなるべく等しくなるように配置するほうが好ましい。 The chip shown in FIG. 6 has five separation channels, whereas the chip shown in FIG. 5 has two separation channels. Further, although the sample reservoir 51, the sample discharge reservoir 52, the solvent reservoir 50, and the solvent discharge reservoir 53 are formed one by one, there may be a plurality.
The sample sorting reservoirs 56a to 56d are formed one by one, and the components electrophoresed by the five separation channels 54a to 54e can be sorted simultaneously.
The reservoirs 56a to 56d are preferably arranged such that the distances from the five separation channels 54a to 54e are as equal as possible.

サンプル分取リザーバ５６ａ〜５６ｄに繋がっている分取流路は分離流路５４ａ〜５４ｅに繋がっており、分取流路は分離流路よりも流路幅が小さく形成されているために、分取流路中では泳動速度が速くなる。
このチップも対応するリザーバが重なるように複数枚が重ね合わせて使用される。
試料検出部５７ｅは最上層または最下層のチップに配置される。分離流路５４ａ〜５４ｅを電気泳動する速度が５つの流路で同じであるとして、試料成分検出部５７ｅは分離流路５４ｅの方に設置したが、分離流路５４ａ〜５４ｄのいずれか、又は全てに設置してもよい。 The sorting channels connected to the sample sorting reservoirs 56a to 56d are connected to the separation channels 54a to 54e, and the sorting channels are formed to have a channel width smaller than that of the separation channels. The migration speed increases in the intake channel.
This chip is also used by overlapping a plurality of corresponding reservoirs.
The sample detection unit 57e is arranged on the uppermost or lowermost chip. The sample component detection unit 57e is installed toward the separation channel 54e on the assumption that the electrophoresis speeds of the separation channels 54a to 54e are the same in the five channels, but either of the separation channels 54a to 54d, or You may install in all.

この実施例においても、図３のチップと同様、ゲート方式でサンプルを分取する。
目的のサンプルを分取リザーバ５６ｃに分取するとき、例えば、目的の成分１が検出部５７ｅで検出された後、リザーバ５１−５３間にかかる電場を一瞬、リザーバ５１−５６ｃ間に切り替えることにより、成分５をリザーバ５６ｃ方向へ電気泳動させる。
このとき、同時に分離流路５４ａ〜５４ｄ中の成分１〜４もリザーバ５６ｃ方向へ電気泳動させる。
分離流路の容積は１本のときよりも増大しているので、一度に分取できる試料の量は多くなる。 Also in this embodiment, the sample is separated by the gate method as in the chip of FIG.
When the target sample is sorted into the sorting reservoir 56c, for example, after the target component 1 is detected by the detection unit 57e, the electric field applied between the reservoirs 51-53 is switched between the reservoirs 51-56c for a moment. The component 5 is electrophoresed toward the reservoir 56c.
At this time, the components 1 to 4 in the separation channels 54a to 54d are also electrophoresed toward the reservoir 56c.
Since the volume of the separation channel is larger than that of one, the amount of sample that can be collected at a time is increased.

図７に示すマイクロチップ図は、分離流路が環状に形成されたものである。図８に示す図は図７のマイクロチップを複数枚重ねたときの図であり、リザーバ６０〜７３はスルーホールでつながっている。この環状の分離流路は、電場を順次変えながら試料成分の電気泳動を行なうことを特徴としている。
リザーバ６０をサンプルリザーバ、リザーバ６１をサンプル排出リザーバ、リザーバ６４をバッファリザーバ、リザーバ６９をドレインリザーバとする。 In the microchip diagram shown in FIG. 7, the separation channel is formed in an annular shape. 8 is a view when a plurality of the microchips of FIG. 7 are stacked, and the reservoirs 60 to 73 are connected through through holes. This annular separation channel is characterized by performing electrophoresis of sample components while sequentially changing the electric field.
The reservoir 60 is a sample reservoir, the reservoir 61 is a sample discharge reservoir, the reservoir 64 is a buffer reservoir, and the reservoir 69 is a drain reservoir.

リザーバ６４−６９間に電場をかけることで電気泳動を行い、その間の分離流路から分岐した分取流路、その分取流路につながっている試料分取リザーバ６３，６５，６７にて試料の分取を行なう。分取流路に分岐する分離流路には、上記説明と同様に試料検出部を有している。
検出部で目的成分を検出すると、一瞬電場をリザーバ６４―６５間に変えることによって、成分をリザーバ６５に分取することができる。その後電場を元に戻し、次々に各リザーバで試料を分取する。
試料がドレインリザーバ６９の近くまでくると、ドレインリザーバを、例えばリザーバ７０に変えることにより、さらに電気泳動を行なうことが可能になる。
このようにすることで、１つの試料をより多くのリザーバに分取できる。 Electrophoresis is performed by applying an electric field between the reservoirs 64-69, and a sample is collected in a separation flow path branched from the separation flow path therebetween, and sample separation reservoirs 63, 65, 67 connected to the separation flow path. Sort out. The separation flow path that branches into the sorting flow path has a sample detection unit as described above.
When the target component is detected by the detector, the component can be sorted into the reservoir 65 by changing the electric field for a moment between the reservoirs 64-65. Thereafter, the electric field is returned to the original state, and samples are collected in each reservoir one after another.
When the sample comes close to the drain reservoir 69, it is possible to perform further electrophoresis by changing the drain reservoir to the reservoir 70, for example.
In this way, one sample can be dispensed into more reservoirs.

本発明のマイクロチップ構成は上記の説明に限定されるものではなく、分離流路又は分取流路の形状や本数、リザーバの数などを変えて配置しても実施可能である。 The microchip configuration of the present invention is not limited to the above description, and the microchip configuration can be implemented by changing the shape or number of separation channels or sorting channels, the number of reservoirs, and the like.

本発明はＤＮＡなどの微量の試料成分の分取に利用ができる。 The present invention can be used for fractionating a small amount of sample components such as DNA.

本発明である複数枚のマイクロチップを重ね合わせた電気泳動マイクロチップ装置の一実施例を示す分解斜視図である。It is a disassembled perspective view which shows one Example of the electrophoresis microchip apparatus which piled up the several microchip which is this invention. 図１で示すマイクロチップ装置の断面図を示している。FIG. 2 shows a cross-sectional view of the microchip device shown in FIG. 1. 図１で示すマイクロチップ装置の１つのマイクロチップを示す斜視図である。It is a perspective view which shows one microchip of the microchip apparatus shown in FIG. 他の実施例の電気泳動マイクロチップ装置の１つのマイクロチップを示す斜視図である。It is a perspective view which shows one microchip of the electrophoresis microchip apparatus of another Example. さらに電気泳動マイクロチップ装置の１つのマイクロチップを示す斜視図である。Furthermore, it is a perspective view which shows one microchip of an electrophoresis microchip apparatus. さらに電気泳動マイクロチップ装置の１つのマイクロチップを示す斜視図である。Furthermore, it is a perspective view which shows one microchip of an electrophoresis microchip apparatus. さらに電気泳動マイクロチップ装置の１つのマイクロチップを示す斜視図である。Furthermore, it is a perspective view which shows one microchip of an electrophoresis microchip apparatus. 図７のマイクロチップを５枚重ねたときの状態を示す斜視図である。FIG. 8 is a perspective view showing a state when five microchips of FIG. 7 are stacked.

符号の説明Explanation of symbols

１，２，３，４，５試料成分
１０マイクロチップ基板
１２リザーバ及び流路
２０，３０，４０，５０サンプルリザーバ
２１，３１，４１，５１バッファリザーバ
２２，３２，４２，５２サンプル排出リザーバ
２３，３３，４３，５３排出ドレイン
２４，３４，４４，５４分離流路
３５，６５分取リザーバ
２６，３６，４６，５６分取リザーバ
２７，３７，４７，５７検出部
1, 2, 3, 4, 5 Sample component 10 Microchip substrate 12 Reservoir and flow path 20, 30, 40, 50 Sample reservoir 21, 31, 41, 51 Buffer reservoir 22, 32, 42, 52 Sample discharge reservoir 23, 33, 43, 53 Discharge drain 24, 34, 44, 54 Separation flow path 35, 65 Preparative reservoir 26, 36, 46, 56 Preparative reservoir 27, 37, 47, 57 Detector

Claims

重ね合わせた複数枚のマイクロチップを備え、
前記各マイクロチップは同一材料からなり、同一デザインの流路をもち、
前記流路は試料導入流路、導入された試料を分離する分離流路及び分離された試料成分を分取する分取流路を備え、
前記各流路の先端にはリザーバを備え、各リザーバはスルーホールによって全マイクロチップ間でつながっており、
最上層又は最下層のマイクロチップの分離流路には試料成分の検出部が設置されており、
前記リザーバ間に泳動用電圧が印加される分取用の電気泳動マイクロチップ装置。 It is equipped with a plurality of stacked microchips,
Each of the microchips is made of the same material, has the same design flow path,
The flow path includes a sample introduction flow path, a separation flow path for separating the introduced sample, and a fractionation flow path for separating the separated sample components,
A reservoir is provided at the tip of each flow path, and each reservoir is connected between all microchips by through holes.
In the separation channel of the uppermost layer or the lowermost microchip, a sample component detection unit is installed,
A preparative electrophoresis microchip device in which a migration voltage is applied between the reservoirs.

前記マイクロチップにおいて、前記流路は複数本の分離流路を含み、
前記分取流路とそれにつながる分取用リザーバは前記複数の分離流路によって共用されるようにつながっている請求項１に記載の電気泳動マイクロチップ装置。 In the microchip, the flow path includes a plurality of separation flow paths,
2. The electrophoresis microchip device according to claim 1, wherein the sorting channel and the sorting reservoir connected to the sorting channel are connected so as to be shared by the plurality of separation channels.

前記マイクロチップにおいて、前記分離流路は環状に形成され、前記分取流路は前記分離の異なる位置に接続された複数個からなる請求項１に記載の電気泳動マイクロチップ装置。
2. The electrophoresis microchip device according to claim 1, wherein in the microchip, the separation channel is formed in an annular shape, and the sorting channel is composed of a plurality connected to different positions of the separation.