JP4417723B2 - ヘッドループdnaの増幅 - Google Patents
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Description
標的および非標的核酸上においてプライミングし伸長させることができるプライマー領域、および
少なくとも1つの非標的核酸の増幅産物の内部配列の逆向き反復であるが、存在するならば、標的核酸の増幅産物の対応する内部配列が存在に対して少なくとも1つのミスマッチを含む領域
を含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーによって、核酸を増幅させることを含む方法を提供する。
標的および非標的核酸をプライミングし、伸長させることができるプライマー領域、および
少なくとも1つの非標的核酸の増幅産物の内部配列の逆向き反復であるが、存在するならば、標的核酸の対応する内部配列に対して少なくとも1つのミスマッチを含む領域
を含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーによって、核酸を増幅させることを含む方法を提供する。
標的領域が異常なシトシンのメチル化が起こる1つまたは複数の部位であり、
単離DNA中の標的領域およびメチル化されていない非標的領域上を、プライミングし、伸長させることができるプライマー領域、および、非標的領域の増幅産物の内部配列の逆向き反復であるが、標的領域の対応する内部配列に対する少なくとも1つのミスマッチを含む領域を含む、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅を行う、
GSTP1遺伝子および/またはその制御用フランキング配列中の標的領域を増幅させるための反応物および条件に単離DNAを曝すこと、および、増幅DNAの存在を決定することを含むアッセイを提供する。
本出願で使用する、用語「プライマー」および「プライマー領域」は、ヌクレオチドおよび重合剤の存在下において合成の開始点として働くことができる、オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは一本鎖であることが好ましいが、二本鎖であってもよい。プライマーが二本鎖である場合、それらの鎖は、増幅反応前に分離させる。本発明で使用するプライマーは、それらが増幅させる異なる鎖の配列と充分相補的であり、したがってプライマーが、増幅反応条件下においてその配列の鎖とハイブリダイズすることができるように選択する。したがって、非相補的塩基または配列をプライマー中に含めることができる。ただしそのプライマーは、当該の配列と充分相補的であり、その配列とハイブリダイズするものとする。
種々の細菌16SリボゾームRNA遺伝子に選択的なヘッドループPCR
16SリボゾームDNAの増幅は、細菌種の同定において使用されることが多く、多数の種の配列が決定されてきている。いくつかの充分に保存された領域の存在が、ほぼすべての細菌リボゾームDNAの増幅用の、プライマー対の設計を可能にしている。図2は、細菌種、大腸菌、Sulfobulus acidophilusおよびSulfobulus thermosulfidooxidansの16SリボゾームRNAの標的領域、および「ユニバーサル」プライマー、NR-RliおよびNR-Fliが結合する領域の配列を示す。フォワードプライマーNR-Lliは、大腸菌のDNA(接頭語EHL)またはS.acidophilusのrDNA(表参照)の増幅を阻害するための、ヘッドループプライマーを設計するための主成分として使用した。EHL48プライマーのヘッドループプライミングの一例は、図3に示す。最初のプライミングサイクルの後、その後のサイクル中に、リバースプライマーの伸長によって、合成された鎖の3'末端においてEHL48の「ヘッド」と相補的な配列の取り込みがもたらされる。これらのヘッド配列をループ状に戻し、増幅産物中のその相補的な標的配列にアニーリングすることができる。ヘッドは大腸菌の標的配列との完全なマッチ部分を形成し、したがってこれをプライミングし伸長させて、伸長したヘアピンループ構造を形成することができる。このような構造は更なる増幅を無効にすると予想される。S.acidophilusの増幅産物に関しては、ヘッド配列は相補領域と4つのミスマッチを有し、プライミングを妨げ、鎖をPCRの更なるラウンド用に利用可能にする。
2×PCRマスターミックス(Promega) 12.5μl
フォワードプライマー(最終400nM) 1.0μl
リバースプライマー(最終400nM) 1.0μl
DNA 1.0μl
SyberGreen(1:1000希釈のストック) 0.2μl
水 9.5μl
大腸菌のDNAと、S.acidophilusまたはS.thermosulfooxidansのDNAの混合物を、非選択的プライマーNR-FliおよびNR-Rli、あるいはヘッドループプライマーEHL48またはEHL68、およびリバースプライマーNR-Rliを使用して増幅させた(図4)。増幅産物は、それらの融解プロファイルを決定することにより分析し、大腸菌のrDNAの産物は約77℃〜78℃で融解し、一方S.acidophilusおよびS.thermosulfooxidansの増幅産物は、約91℃で融解する。対照PCR産物はヘッドループPCR産物より短く、したがってわずかに低い温度で融解することに留意されたい。その際、ブロック内の試験管位置によるわずかな違いも見られる。
いくつかのヘッドループPCRの最適化において、本発明者らは、遊離Mg2+の最終濃度を下げた場合、増幅の選択性が改善されたことに気付いた。図5に示す例では、SAHLヘッドループプライマーを使用する50倍過剰なS.acidophilusのDNAの存在下において、大腸菌DNAの増幅の選択性は、Mg2+濃度を1.5mMから1.3mMに低下させると著しく改善される。反応中のdNTPの全体濃度は0.8mMであり、遊離Mg2+濃度は0.5mMのままであった。この増幅に関しては、遊離Mg2+を0.3mMにさらに低下させることによって、任意の増幅が阻害された。パネルBおよびCには、250倍および500倍過剰なS.acidophilusのrDNAの存在下での、大腸菌rDNAの検出を示す。
メチル化DNAに選択的なヘッドループPCR
DNAのメチル化を分析または検出するために、重亜硫酸塩、CのUへの変換(したがって最終的には、コピー後にTへの変換)をもたらす手順で、DNAを最初に処理する。しかしながら、(通常はCpG部位で)メチル化状態である任意のCは、この変換に対して耐性がある。メチル化および非メチル化形のDNA断片は異なる配列を有しているので、メチル化形を特異的に増幅させるプライマーを設計することができる。
プラスミド番号77および番号58を、この作業において使用した。これらは、重亜硫酸塩処理したヒトのGST断片の増幅に由来する、PCR産物のpGEM-T(Promega)への挿入から生成したものであった。これらのプラスミド中のこの挿入体の配列を、以下に示す。
T:元の配列中のT残基
t:重亜硫酸塩による元の配列中のC残基の変換から生成すると予想されるT残基
C:(CpG配列の一部であるために)メチル化し、したがって重亜硫酸塩処理による変換に対して耐性があるC残基
t:CpG配列中に存在したにもかかわらず非メチル化状態であった、Cの変換から生成するT残基
保存特異的プライマー
保存特異的プライマーを、それらが重亜硫酸塩処理により首尾よく変換されたDNA断片を選択的に増幅させるように、(Cの変換から生じる)いくつかの変換されたtを含む領域用に設計する。CpG部位を含む領域を避けることによって、これらのプライマーは、それらのCpG残基におけるメチル化状態と無関係に、DNA断片を増幅させることができるはずである、すなわち、メチル化形断片と非メチル化形断片が、均等に充分に増幅されるはずである。
F2:5'GGTtTTAGGGAATTTttttt
R1T:5'CACCTTTCCCAaaTCCCCAa
下側の場合の塩基(aおよびt)は、元の配列中の変換されたCに対応する。
非メチル化形の断片に対する選択は、1つまたは両方のプライマーに特別な5'伸長部を含ませることによって実施する。原理の明らかな証拠を示すために、ただ1つのプライマーを、その特別な5'伸長部に関して作製した。両方のプライマーを改変する場合、したがって、ここで報告する任意の影響が、大幅に増大すると予想されることは明らかである。F2をプライマーとして選択して、これらの試験用に改変した。5'伸長部(ボックス状)を、以下に示すようにF2プライマーに加えた。
A:元の配列中のTとの相補体
a:元の配列中の変換されたC(U)との相補体、CpG部位の一部ではない
a:元の配列中の変換されたC(U)との相補体、CpG部位の一部である
リアルタイムPCRを、Applied Biosystems7700装置を使用して行った。同じ「リバース」プライマーR1Tを、全体を通して使用した。Sybergreenを使用して増幅を調べた。
インプットしたDNA:
M=番号77のメチル化プラスミドの106個の分子
U=番号58の非メチル化プラスミドの108個の分子
M*U 104個の番号77および108個の番号58(混合物、10,000倍過剰の非メチル化プラスミド)
メチル化(106個の分子)または非メチル化(108個の分子)プラスミドを、リバースプライマーR1Tと組み合わせて、3つの異なるヘッドループプライマー、LUH-F2、CLUH-F2およびFT-F2を用いるPCR反応において使用し、Sybergreenを用いて増幅を調べた(図6)。3つのプライマーはすべて、同等の効率でメチル化プラスミドを増幅させた。非メチル化プラスミドに関しては、PCR産物の出現が、100倍を超えるプラスミドを反応において使用したにもかかわらず大幅に遅れた。プライマーLUH-F2およびFT-F2によって、メチル化DNAと非メチル化DNAの間で増幅の最大の差異が与えられた。乏しい重亜硫酸塩による変換特異的プライマーF2、または無関連な5'伸長部配列を含むプライマーCLUR-F2を、リバースプライマーとしてのR1Tと組み合わせて使用すると、メチル化配列と非メチル化配列の両方が増幅された。プライマーCLUR-F2およびR1Tを使用して得た増幅産物を、融解曲線を分析することによって評価し、それらの解離曲線は図7に示す。
Taqmanプローブによって、増幅中のPCR産物を調べることができる。メチル化および非メチル化GSTP1配列の検出に選択的な、プローブを作製した。
FAM=カルボキシフルオレセイン、TAMRA=カルボキシテトラメチルローダミン
TET=テトラクロロフルオレセイン、TAMRA=カルボキシテトラメチルローダミン
非メチル化プラスミドとメチル化プラスミドの混合物を、R1Tリバースプライマーと組み合わせて、対照、保存特異的、プライマーF2およびCLUR-F2、または2つのヘッドループプライマー、LUH-F2およびFT-F2を使用して増幅させた。非メチル化およびメチル化産物の増幅は、PRB-UおよびFRB-Mプローブを使用して調べた(図9および10)。非メチル化DNAの増幅は、対照プライマーと比較して、実質的に(FT-F2)、あるいはほぼ完全に(LUH-F2)抑制された。
重亜硫酸塩処理したゲノムDNAからの増幅
GSTP1遺伝子がメチル化しているLNCaP前立腺癌細胞から、およびGSTP1遺伝子中で非メチル化状態であると予想されるPlacentaから、DNAを単離した。
GSTP1遺伝子の第2の領域でのヘッドループ抑制PCR
ヘッドループプライマーを、GSTP1遺伝子の転写配列における、重亜硫酸塩処理したDNA領域用に設計した。プライマーの配列は、以下の表に示す。イノシンは、プライマーGSTR11iおよびGSTHLint5-10Ni中のCpG部位に対応する位置に含まれ、CpG部位では、重亜硫酸塩で変換したDNAは、メチル化の状態に応じて、CまたはUとなりうる。同様にF52Aプライマーは、CpG部位中のCの位置に意図的なミスマッチ(A)を含み、したがってメチル化または非メチル化DNAの増幅には偏りが無い。
ヘッドループプライミングによるPCR増幅の抑制の原理を図1に概略的に示し、特異的配列の例は図3および17に示す。5'伸長部が取り込まれ、次いでコピーされた後に、図で示すように同じDNA鎖中の下流の領域と塩基対を形成することができる、3'末端が生じる。この塩基対形成およびプライミングの有効性は、ヘッド領域の長さおよび配列組成、および増幅産物中の内部配列とのそのマッチの正確さに依存することが予想される。EHL-48ヘッドループプライマーに関しては、大腸菌配列(完全にマッチ)とS.acidophilus増幅産物(4つのミスマッチ)の間の相補性の違いは、S.acidophilusのrDNAの選択的増幅をもたらすのに充分である。LUHF2ヘッドループプライマーに関しては(図17)、下流領域の下線を引いた塩基が、元の断片のCpG配列中のメチル化された可能性があるCに対応する。CpG-メチル化DNAの場合、下線を引いた位置は下流位置のAではなくGを含むと思われ、分子内二本鎖が生じることは考えられないであろう。
Claims (18)
- 標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸を含むサンプル中の、標的核酸を選択的に増幅させるための方法であって、
フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーによって、少なくとも1つの非標的核酸と比較して、標的核酸を選択的に増幅させる工程であって、
前記フォワードプライマーが:
標的および非標的核酸にプライミングし、伸長することができるプライマー領域;および
少なくとも1つの非標的核酸の増幅産物の内部配列の逆向き反復であるが、標的核酸の増幅産物の対応する内部配列に対して少なくとも1つのミスマッチを含む領域であって、前記逆向き反復領域が、プライマー領域の5'に存在する領域;
を含み、
増幅の間に、前記フォワードプライマーが、標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸上で伸長し、第1の鎖生成物を生ぜしめ、前記リバースプライマーが、前記第1の鎖生成物上で伸長し、第2の鎖生成物を生ぜしめ;
フォワードプライマーのプライマー領域の5'に位置する前記逆向き反復領域が、第2の鎖の合成の間にコピーされ、第2の鎖生成物内に3'末端配列を形成し;
前記少なくとも1つの非標的核酸に対応する第2の鎖生成物の3'末端配列が、増幅産物の内部配列に対応する同一の生成物の上流領域にアニーリングし、伸長され、前記非標的核酸の更なる増幅を阻害するヘアピンループ構造を形成する、工程
を含む方法。 - 前記増幅工程が、プライマーおよび逆向き反復領域を含む少なくとも1つのフォワードプライマーまたはリバースプライマーを使用する、請求項1に記載の方法。
- フォワードおよびリバースプライマーを使用し、それぞれがプライマーおよび逆向き反復領域を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記増幅がPCRによるものである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 逆向き反復部分を除いた前記プライマーが、15〜35塩基単位の長さである、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーの逆向き反復配列が、5〜30塩基単位の長さである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーの逆向き反復部分が、非標的核酸の合致する配列上でのアニーリングを可能とするのに十分な数のヌクレオチド、ならびに、標的核酸の対応する配列へのアニーリングを不可とするのに十分なミスマッチを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅の選択性を、予め選択した遊離Mg2+濃度で増幅を行うことによって調整する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 0.7mM未満の濃度の遊離Mg2+の存在下において増幅を行う、請求項8に記載の方法。
- a)フォワードおよびリバースプライマーの存在下において、1種または複数の種の混合物から単離した核酸を含む単離核酸サンプルの選択的増幅を行う工程であって、
前記フォワードプライマーが:
種または亜種の範囲を超えて実質的に保存されている核酸にプライミングし伸長することができる領域;および
予め選択した種または亜種に特徴的な、増幅産物の内部の非保存配列の逆向き反復である領域であって、前記逆向き反復領域が、プライマー領域の5'に存在する領域;
を含み;
増幅の間に、前記フォワードプライマーが、核酸上で伸長し、第1の鎖生成物を生ぜしめ、前記リバースプライマーが、前記第1の鎖生成物上で伸長し、第2の鎖生成物を生ぜしめ;
フォワードプライマーのプライマー領域の5'に位置する前記逆向き反復領域が、第2の鎖の合成の間にコピーされ、第2の鎖生成物内に3'末端配列を形成し;
前記予め選択した種または亜種に特徴的な核酸に対応する第2の鎖生成物の3'末端配列が、増幅産物の内部の非保存配列に対応する同一の生成物内の上流領域にアニーリングし、伸長され、前記予め選択した種または亜種に由来する核酸の更なる増幅を阻害するヘアピンループ構造を形成する、工程;および
b)増幅産物の存在を決定する工程;
を含む種の選択の方法。 - 前記種を動物種、細菌種、真菌種および植物種から選択する、請求項10に記載の方法。
- 前記核酸が、リボゾームRNAをコードする遺伝子の一部分を含むDNAである、請求項10または11に記載の方法。
- 前記種が細菌種である、請求項10から12のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子ファミリーのメンバー間の、対立遺伝子のバリアントまたはミューテーションを識別するために使用するときの、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの標的核酸または少なくとも1つの非標的核酸がメチル化核酸を含み、少なくとも1つの標的核酸または少なくとも1つの非標的核酸に、増幅前に修飾工程を施す方法であって、前記修飾工程が化学的修飾であり、非メチル化シトシンをアデニンと塩基対を形成することができる他のヌクレオチドに変換し、一方メチル化シトシンを変化させないか、グアニンと塩基対を形成することができるヌクレオチドに変換する、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーの逆向き反復部分が、修飾された非標的核酸の合致する配列上でのアニーリングおよび伸長を可能とするのに十分な数のヌクレオチド、ならびに、非修飾の標的核酸のアニーリングおよび/または伸長を不可とするのに十分なミスマッチを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記修飾工程が、非メチル化シトシンをウラシルに変換する、請求項15に記載の方法。
- グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)Pi遺伝子および/またはその制御フランキング配列中の1つまたは複数の部位におけるシトシンの異常なメチル化のためのアッセイであって、
GSTP1遺伝子および/またはその制御フランキング配列中の標的領域を増幅させるための反応物および条件に単離DNAを曝す工程であって、
前記標的領域が、異常なシトシンのメチル化が起こっている1つまたは複数の部位であり、前記増幅が、フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施され;
前記フォワードプライマーが:
単離DNA中のメチル化されている標的領域およびメチル化されていない非標的領域の両方にプライミングし、伸長することができるプライマー領域;および
非標的領域の増幅産物の内部配列の逆向き反復であるが、標的領域の対応する内部配列に対して少なくとも1つのミスマッチを含む領域であって、前記逆向き反復領域が、プライマー領域の5'に存在する領域;
を含み;
増幅の間に、前記フォワードプライマーが、標的および非標的領域上で伸長し、第1の鎖生成物を生ぜしめ、前記リバースプライマーが、前記第1の鎖生成物上で伸長し、第2の鎖生成物を生ぜしめ;
フォワードプライマーのプライマー領域の5'に位置する前記逆向き反復領域が、第2の鎖の合成の間にコピーされ、第2の鎖生成物内に3'末端配列を形成し;
前記非標的領域に対応する第2の鎖生成物の3'末端配列が、増幅産物の内部配列に対応する同一の生成物の上流領域にアニーリングし、伸長され、前記非標的領域の更なる増幅を阻害するヘアピンループ構造を形成する、工程;および
増幅DNAの存在を決定する工程;
を含むアッセイ。
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