JP4407022B2 - ビオチンを含む洗浄液、反応試薬および特異的結合アッセイ方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特異的結合アッセイのための洗浄液、反応試薬およびアッセイ方法に関し、とくにアビジン−ビオチン結合を利用した特異的結合アッセイに関する。特異的結合アッセイとは、分子間の特有の空間配置と分子間水素結合の集合とに起因する特異的な分子間相互作用をもった結合対、たとえば抗原と抗体、ホルモンと受容体、ビタミン類と結合蛋白質、核酸の相補的結合鎖などにおいて、その一方を、他方との特異的な複合体形成能力を利用して、各種混合物、たとえば血清、血漿、尿、唾液、核酸抽出物、環境水などから選択的に分析しようとする技術である。
【０００２】
【従来の技術】
アビジンまたはストレプトアビジンとビオチンとの高い親和性に基づく反応系（以下アビジン−ビオチン系という）は、免疫測定法、核酸プローブ法、アフィニティークロマトグラフィーなどの分野において、生体関連物質の固相化や標識化に広く利用されている。
【０００３】
アビジン−ビオチン系を固相化に利用するおもな利点は、（１）被検成分に対する特異的結合物質を効率よく固定化できること、（２）異なる被検成分に対しても同じ固相（いわゆるユニバーサル固相）を適用できること、および（３）時間のかかる免疫反応を液相中で実施し、固相への捕捉をアビジン−ビオチンの高親和結合によって実質的に短時間で済ますことが可能であることなどである。たとえば、特開昭６２−３０９６３号公報には、ビオチン結合タンパク質（アビジン、ストレプトアビジンなど）を固定化した固相と、ビオチン化した第１の免疫学的結合相手と、被検成分と、標識化した第２の免疫学的結合相手と、を同時または別々にインキュベートしたのちＢ／Ｆ分離する固相免疫検定法が開示されている。とくに液相成分による抗原抗体反応を優先的に行った後、固相への捕捉を行なう遅延型固相免疫検定法は、検定時間を短縮するために効果的である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
一般に固相を用いた特異的結合アッセイにおいて、固相表面への望ましくない非特異的結合を低減させることは検出感度を改良するために重要である。たとえば、検出用に標識化した試薬が被検成分の量と関係なく非特異的に固相表面に吸着することは、バックグラウンドシグナルの増加につながる。このことは「アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相」（以後、アビジン固相とよぶことがある）においても当てはまり、とくに固相表面のアビジンまたはストレプトアビジンへの非特異的結合を低減させることが望ましい。
【０００５】
特開平１１−２１１７２７号公報は、たとえばアビジン固相に、ビオチン化特異的結合物質（被検成分に対する特異的結合物質とビオチンとの結合物）を結合させたのち、ポリエチレングリコールとビオチンとの抱合体でアビジン固相をブロッキングするという、固相への非特異的結合の防止技術を開示している。このポリエチレングリコールとビオチンとの抱合体は、従来からよく使用されてきたウシ血清アルブミン、動物ＩｇＧ、ゼラチン、ポリエチレングリコール、界面活性剤などのような非特異的ブロッキング物質とは異なり、前記抱合体中のビオチンが、アビジン固相上のフリーのビオチン結合部位に特異的に結合するいわば特異的ブロッキング物質（特開平１１−３１６２２５号公報）である。この公報には、上記の抱合体でブロッキングした固相を乾燥したのち、更にビオチン溶液を塗布して依然としてフリーのままの結合部位を飽和させるといった記載もある。
【０００６】
上記の特開平１１−２１１７２７号公報および特開平１１−３１６２２５号公報で開示された技術は、すでにビオチン化特異的結合物質が結合した固相形態をなす試薬の製造方法である。しかしながら、「従来の技術」に記載したような遅延型固相免疫検定法においては、ビオチン化特異的結合物質（ビオチン化した第１の免疫学的結合相手）、被検成分、及び標識化特異的結合物質（標識化した第２の免疫学的結合相手）からなる生成物が先に生成するため、上記の特異的ブロッキングをそのまま適用することはできないと考えられる。なぜなら固相を特異的にブロッキングする前に、検体中に存在する種々の干渉因子または遊離の標識化特異的結合物質が先に固相に非特異的結合してしまうからである。
【０００７】
本発明の課題は遅延型固相免疫検定法にも適用可能であって、特異的結合アッセイに用いられるアビジン固相への非特異的結合を低減させるのに有用な手段を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記課題はアビジン固相にビオチン化特異的結合物質を結合させる工程のあとにビオチンを含有する溶液を接触させるという手段により解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち本願第一の発明は、ビオチンを含有することを特徴とする、特異的結合アッセイ用洗浄液である。
【００１０】
また本願第二の発明は、溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方法において、
・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相（１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的結合物質（２）、被検成分（３）、および被検成分に対する標識した第２の特異的結合物質または標識した被検成分類似体（４）を接触させて固相と液相からなる反応混合物を得る工程、
・前記反応混合物中の固相を液相から分離し、前述の洗浄液を用いてその固相を洗浄する工程、及び
・洗浄した前記固相上の標識を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
【００１１】
さらに本願第三の発明は、溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方法において、
・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相（１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的結合物質（２）、および被検成分（３）を接触させて固相と液相からなる第１の反応混合物を得る工程、
・前記第１の反応混合物中の固相を液相から分離し、前述の洗浄液を用いてその固相を洗浄する工程、
・洗浄した前記固相に、被検成分に対する標識した第２の特異的結合物質または標識した被検成分類似体（４）を接触させて、固相と液相からなる第２の反応混合物を得る工程、及び
・前記第２の反応混合物中の固相を液相から分離し、固相上の標識を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
【００１２】
また本願第四の発明は、ビオチンと、被検成分に対する標識した特異的結合物質または標識した被検成分類似体とを含むことを特徴とする、特異的結合アッセイ用反応試薬である。
【００１３】
また本願第五の発明は、溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方法において、
・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相（１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的結合物質（２）、および被検成分（３）を接触させて、固相と液相からなる第１の反応混合物を得る工程、
・前記第１の反応混合物中の固相を液相から分離する工程、
・分離した前記固相に、前述の反応試薬を接触させて固相と液相からなる第２の反応混合物を得る工程、及び
・前記第２の反応混合物中の固相を液相から分離し、固相上の標識を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
【００１４】
また本願第六の発明は、溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方法において、
・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相（１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的結合物質（２）および被検成分（３）を接触させて固相と液相からなる第１の反応混合物を得る工程、
・前記第１の反応混合物中の固相を液相から分離し、前述の洗浄液を用いてその固相を洗浄する工程、
・洗浄した前記固相に、前述の反応試薬を接触させて固相と液相からなる第２の反応混合物を得る工程、及び
・前記第２の反応混合物中の固相を液相から分離し、固相上の標識を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
【００１５】
以下、本発明を更に詳細に説明する。はじめに本願で使用される用語について説明する。
【００１６】
本願において、「ビオチン」とは、ビオチンそのものばかりでなく、アビジンまたはストレプトアビジンと高親和性の結合対を形成する点でビオチンと実質的に同様の挙動を示すビオチン誘導体およびビオチン類縁体たとえばビオシチン、ビスノルビオチン、テトラノルビオチン、デスチオビオチンなどをも含むものである。ただしビオチンは被検成分とは実質的に直接結合しない。
【００１７】
また本願において、「アビジンまたはストレプトアビジン」とは、天然物または組換え体の、アビジン、ストレプトアビジンまたはそれらの誘導体（重合体を含む）であって、１分子上にビオチン結合能を複数もってもよい蛋白質を意味する。
【００１８】
アビジンまたはストレプトアビジンを固定化するのに使用される固相は水不溶性担体であって、形、大きさ、材質には制限がなく、従来のイムノアッセイや核酸プローブ法、アフィニティークロマトグラフィーで使用されている水不溶性担体であってよい。たとえば、イムノアッセイでよく使われるポリスチレンなどの熱可塑性樹脂で製造された微粒子、ビーズ、板状の担体、反応容器の内壁、セルロースエステルなどの繊維を固相とすることができる。微粒子やビーズを使用するときは、磁力による撹拌やＢ／Ｆ分離をしやすくするために、担体の表面または内部に鉄やフェライトなどの磁性物質を担持させてもよい。
【００１９】
アビジンまたはストレプトアビジンを固相に固定化するには、直接吸着させてもよく、また適切なリンカーを介して化学的に架橋してもよく、ビオチンを固定化した固相にビオチン−アビジン結合により結合させてもよい。
【００２０】
第１の特異的結合物質は、被検成分が抗原のときはその抗原に特異的な抗体でよく、被検成分が抗体のときはその抗体が特異的に結合する抗原でもよいし、その抗体に対する抗体であってもよい。また、被検成分がホルモンのときはその受容体であってもよく、被検成分が受容体のときは対応するホルモンであってもよい。また、被検成分がビタミン類のときはその結合蛋白質であってもよい。また、被検成分が核酸のときは相補的な核酸プローブであってもよい。
【００２１】
被検成分に対するビオチン化した第１の特異的結合物質は、アビジンまたはストレプトアビジンとの結合能、および対応する被検成分との特異的結合能を兼ね備えた結合物を意味する。蛋白質や核酸をビオチン化する方法には公知の方法が多数あり、本発明はそれらの方法によって製造されるビオチン化物質のすべてを利用できる。
【００２２】
被検成分に対する標識した第２の特異的結合物質とは、第１の特異的結合物質とは異なった位置で被検成分に特異的に結合する物質を標識した結合物であって、いわゆるサンドイッチ法の反応試薬を構成する。標識した被検成分類似体とは、第１の特異的結合物質の結合部位をめぐって被検物質と競合する物質を標識した結合物であって、いわゆる競合法の反応試薬を構成する。本願において被検成分類似体という用語は被検成分そのもの及びその類似体を含む。標識は検出用に用いられるもので、この分野において公知であるすべてのもの、たとえば酵素、化学発光物質、蛍光物質、放射性物質などが利用できる。なお本願において、標識という用語は特別に断わらない限り検出用の標識を意味するものとする。標識の検出には特に限定はなく、各標識に応じた方法で行うことができる。反応混合物中の固相を液相から分離する方法には特に限定はなく、いわゆる通常のＢ／Ｆ分離を行うことができる。
【００２３】
上記の反応成分（１）から（３）及び／又は（４）を接触させるとは、アビジン−ビオチン結合の形成、被検成分に対する第一及び／又は第二の特異的結合物質の反応が、特異的結合アッセイの達成に必要な程度進行するのに十分な物理化学的条件下で、十分な時間、インキュベーションすることを意味する。
【００２４】
次に本願発明を順に説明する。まず本願第一の発明による洗浄液は、ビオチンを含むことを特徴とし、必要に応じて酸、塩基、塩、それらの組み合わせからなる緩衝物質、界面活性剤、防腐剤などを含んでもよい。また通常、特異的結合アッセイに使われている公知の洗浄液や緩衝液にビオチンを添加することで製造することができる。
【００２５】
本発明の洗浄液は、使用時はビオチンを含む溶液の形態で用いられ、特に水溶液の形態が好ましいが、輸送、保存の容易さのために、凍結乾燥品や濃縮液で供給されてもよい。洗浄液に含有されるビオチンの濃度に制限はないが、０．１ｎｍｏｌ／ｍＬないし１００ｎｍｏｌ／ｍＬが好ましく、１ｎｍｏｌ／ｍＬないし１０ｎｍｏｌ／ｍＬがとくに好ましい。
【００２６】
本願第二の発明は、溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方法に関するものであり、固相から標識化物質までを含んだ免疫複合体の形成後にはじめてＢ／Ｆ分離及び洗浄を行ういわゆる１ステップアッセイにおいて、洗浄液に本願第一の発明による洗浄液を用いることにより、固相への被検成分および標識化物質の導入後でも、固相への非特異的結合を低減させることができる。
【００２７】
上記の成分（１）から（４）までの接触の仕方に制限はなく、たとえば（１）に（２）を接触させたのち（３）そして（４）の順に接触させてもよく、その逆順に接触させてもよく、すべてを同時に接触させてもよい。好ましくは（２）、（３）および（４）を互いに接触させたのち（１）を接触させるのがよい。すなわち液相成分による特異的結合反応を優先的に行った後、固相への捕捉を行なうのが、アッセイ全体に要する時間を短縮するために効果的である。固相化反応を含めた特異的結合反応の進行は、液相だけの反応に比べて一般に遅いからである。固相への捕捉はアビジン−ビオチンの高親和結合によって実質的に短時間で済ますことができる。
【００２８】
本願第三の発明では、上記の２ステップアッセイにおいて、第１の反応混合物から分離した固相を洗浄する際に、本願第一の発明による洗浄液を用いることにより、非特異的結合を効果的に低減させることができる。この方法は標識物質（４）を反応させる前に固相を洗浄する工程を含み、検体中の妨害成分と標識物質（４）との接触を避けたいときに好適に使用される。上記の成分（１）から（３）までの接触の仕方に制限はなく、たとえば（１）に（２）を接触させたのち（３）を接触させてもよく、その逆順に接触させてもよく、すべてを同時に接触させてもよい。好ましくは（２）および（３）を互いに接触させたのち（１）を接触させるのがよい。
【００２９】
本願第四の発明による反応試薬は酸、塩基、塩、それらの組み合わせからなる緩衝物質、界面活性剤、防腐剤などを含んでもよい。本発明による反応試薬は、使用時は水溶液の形態で用いられるが、輸送、保存の容易さのために、凍結乾燥品や濃縮液で供給されてもよい。含有するビオチンの濃度に制限はないが、０．１ｎｍｏｌ／ｍＬないし１００ｎｍｏｌ／ｍＬが好ましく、１ｎｍｏｌ／ｍＬないし１００ｎｍｏｌ／ｍＬがとくに好ましい。
【００３０】
本願第五の発明では、上記の２ステップアッセイにおいて、第１の反応混合物から分離した固相に、本願第４の発明に記載の反応試薬を接触して第２の反応混合物を得ることにより、非特異的結合を低減させることができる。上記の成分（１）から（３）までの接触の仕方に制限はなく、たとえば（１）に（２）を接触させたのち（３）を接触させてもよく、その逆順に接触させてもよく、すべてを同時に接触させてもよい。好ましくは（２）および（３）を互いに接触させたのち（１）を接触させるのがよい。
【００３１】
本願第六の発明では、上記の２ステップアッセイにおいて、第１の反応混合物から分離した固相を洗浄する際に、本願第一の発明の洗浄液を用い、かつ洗浄後の固相に本願第四の発明の反応試薬を接触し、第２の反応混合物を得ることにより、非特異的結合をとくに効果的に低減させることができる。上記の成分（１）から（３）までの接触の仕方に制限はなく、たとえば（１）に（２）を接触させたのち（３）を接触させてもよく、その逆順に接触させてもよく、すべてを同時に接触させてもよい。好ましくは（２）および（３）を互いに接触させたのち（１）を接触させるのがよい。
【００３２】
意外にも、本願第一の発明の洗浄液および本願第四の発明の反応試薬に含まれるビオチンは、遅延型固相免疫検定法においてすでに固相に非特異結合した標識化物質を追い出す効果を示した。この作用機序は明らかではないが、アビジン上の疎水性領域に標識化物質が非特異的に結合しているところへビオチンを共存せしめた結果、ビオチンがアビジン上のビオチン結合部位に結合し、疎水部分が親水化するか、もしくは立体的に標識化物質が外れやすい構造をとるものと考えられる。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を更に詳細に説明するため実施例を示す。しかし本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３４】
実施例１ ビオチンを含有する洗浄液
つぎに示す組成をもった種々の濃度のビオチンを含有する洗浄液を製造した。
【００３５】
トリス緩衝液 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭ（ｐＨ８）
塩化ナトリウム ０．１５Ｍ
塩化マグネシウム １ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ−２０ ０．０５％
アジ化ナトリウム ０．０５％
ビオチン ０、０．１、１、１０、または１００ｎｍｏｌ／ｍＬ。
【００３６】
実施例２ １ステップＴＳＨ測定における洗浄液へのビオチンの添加効果
実験した１ステップＴＳＨ測定系の概略はつぎの通りである。ビオチン化抗ＴＳＨ抗体溶液３３．３μＬと、検体（ＴＳＨ濃度ゼロおよび１０μＩＵ／ｍＬの標準溶液）３３．３μＬと、アルカリ性ホスファターゼ標識抗ＴＳＨ抗体（ビオチン化抗ＴＳＨ抗体とは異なる部位でＴＳＨに結合するもの）溶液３３．３μＬとを９６穴黒色マイクロタイタープレート中で混合し、３７℃で５分間反応させた。その後ストレプトアビジン固定化磁性微粒子（ダイナル社製）１０μＬと混合し、３７℃で３分間攪拌したのち固相を分離し、実施例１に示した種々の濃度のビオチンを含有する洗浄液で洗浄した。そして発光基質（Ｔｒｏｐｉｘ社ＣＳＰＤ）５０μＬを分注し、酵素反応／発光測定をおこなった。発光測定にはベルトールド社製ルミノメーター ＬＢ９６Ｖを使用し、測光条件は５分後の１秒間測光とした。
【００３７】
結果を表１に示す。洗浄液中のビオチン濃度を増やすに従ってＴＳＨ濃度ゼロの相対発光量ＲＬＵ（以後、たんに発光量とよぶ）が下がっていくことがわかった。すなわち、洗浄液中のビオチン濃度を増やすに従って非特異的結合に起因するバックグラウンドシグナルが下がっていくことがわかった。ビオチン濃度が１０ｎｍｏｌ／ｍＬになると、はじめのビオチン濃度ゼロのときに比べてバックグラウンドシグナルが約３分の１（３３．９％）に減少し、ビオチン濃度をさらに１００ｎｍｏｌ／ｍＬとしてもそれ以下にはならなかった。他方、ＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量にはほとんど影響がなく、結果としてＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量とＴＳＨ濃度ゼロの発光量との比（Ｓ／Ｎ比に相当する）は、ビオチン濃度ゼロのときに比べて１０ｎｍｏｌ／ｍＬでは約３倍に上昇している。洗浄液中のビオチンの濃度を増やしてもＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量にはほとんど影響がなかったことは、いったんストレプトアビジン上のビオチン結合部位に結合したビオチン化免疫複合体が、洗浄液中のビオチンによって追い出されなかったことを意味し、このアッセイ方法の有用性を支持する。
【００３８】
【表１】
【００３９】
実施例３ ２ステップＴＳＨ測定における洗浄液へのビオチンの添加効果
実験した２ステップＴＳＨ測定系の概略はつぎの通りである。ビオチン化抗ＴＳＨ抗体溶液６６．７μＬと検体（ＴＳＨ濃度ゼロおよび１０μＩＵ／ｍＬの標準溶液）３３．３μＬとを９６穴黒色マイクロタイタープレート中で混合し、３７℃で５分間反応させた。その後ストレプトアビジン固定化磁性微粒子（ダイナル社製）１０μＬと混合し、３７℃で３分間攪拌したのち固相を分離し、実施例１に示した種々の濃度のビオチンを含有する洗浄液で洗浄した。その後アルカリ性ホスファターゼ標識抗ＴＳＨ抗体（ビオチン化抗ＴＳＨ抗体とは異なる部位でＴＳＨに結合するもの）溶液５０μＬを分注し、５分間反応後、固相を分離し同じ洗浄液で再び洗浄した。そして発光基質（Ｔｒｏｐｉｘ社ＣＳＰＤ）５０μＬを分注し、酵素反応／発光検出をおこなった。発光測定にはベルトールド社製ルミノメーター ＬＢ９６Ｖを使用し、測光条件は５分後の１秒間測光とした。
【００４０】
結果を表２に示す。洗浄液中のビオチン濃度を増やすに従ってＴＳＨ濃度ゼロの発光量が下がっていくことがわかった。すなわち、洗浄液中のビオチン濃度を増やすに従って非特異的結合に起因すると思われるバックグラウンドシグナルが下がっていくことがわかった。ビオチン濃度が１０ｎｍｏｌ／ｍＬになると、はじめのビオチン濃度ゼロのときに比べてバックグラウンドシグナルが約３分の１（３３．０％）に減少し、ビオチン濃度をさらに１００ｎｍｏｌ／ｍＬとしてもそれ以下にはならなかった。他方、ＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量にはほとんど影響がなく、結果としてＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量とＴＳＨ濃度ゼロの発光量との比（Ｓ／Ｎ比に相当する）は、はじめのビオチン濃度ゼロのときに比べて約３倍に上昇している。洗浄液中のビオチンの濃度を増やしてもＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量にはほとんど影響がなかったことは、いったんストレプトアビジン上のビオチン結合部位に結合したビオチン化免疫複合体が、洗浄液中のビオチンによって追い出されなかったことを意味し、このアッセイ方法の有用性を支持する。
【００４１】
洗浄液中のビオチン濃度が１０ｎｍｏｌ／ｍＬのときは、この実施例３に示した２ステップ測定（表２）においても、先の実施例２に示した１ステップ測定（表１）においてもバックグラウンドシグナルが共に約３分の１に減少するという驚くべき一致を示した。ただし細かく見ると、ビオチン濃度が１ｎｍｏｌ／ｍＬのとき、表２のバックグラウンドシグナルは、はじめのビオチン濃度ゼロのときに比べて３３．６％となり、１０ｎｍｏｌ／ｍＬのときの３３．０％とほぼ同じレベルにまで低下している。これに対して、表１のバックグラウンドシグナルは、はじめのビオチン濃度ゼロのときに比べて１ｎｍｏｌ／ｍＬでは３９．０％となり、１０ｎｍｏｌ／ｍＬのときの３３．９％のレベルにまでは低下しきれていないことがわかる。２ステップアッセイのはじめの洗浄が、標識化物質の導入前であるのに対して、１ステップアッセイの洗浄は、標識化物質の導入後であることから、固相に非特異的結合している標識化物質を一定時間内に追い出すためにより多くのビオチンが必要になるためであると考えられる。
【００４２】
【表２】
【００４３】
実施例４ ビオチンと、被検成分に対する標識した特異的結合物質を含む特異的結合アッセイ用反応試薬
つぎに示す組成をもった種々の濃度のビオチンを含有する前記反応試薬を製造した。
【００４４】
トリス緩衝液 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ０．１Ｍ
ウシ血清アルブミン ０．１％
アジ化ナトリウム ０．１％
アルカリ性ホスファターゼ標識抗ＴＳＨ抗体 ０．７３μｇ／ｍＬ
ビオチン ０、０．１、１、１０、又は１００ｎｍｏｌ／ｍＬ。
【００４５】
実施例５ ２ステップＴＳＨ測定における反応試薬へのビオチンの添加効果
実験した２ステップＴＳＨ測定系の概略はつぎの通りである。ビオチン化抗ＴＳＨ抗体溶液６６．７μＬと検体（ＴＳＨ濃度ゼロおよび１０μＩＵ／ｍＬの標準溶液）３３．３μＬとを９６穴黒色マイクロタイタープレート中で混合し、３７℃で５分間反応させた。その後ストレプトアビジン固定化磁性微粒子（ダイナル社製）１０μＬと混合し、３７℃で３分間攪拌したのち固相を分離し、実施例１に示したビオチン濃度ゼロの洗浄液で洗浄した。その後実施例４に示した反応試薬を分注し、５分間反応後、固相を分離し同じ洗浄液で再び洗浄した。そして発光基質（Ｔｒｏｐｉｘ社ＣＳＰＤ）５０μＬを分注し、酵素反応／発光検出をおこなった。発光測定にはベルトールド社製ルミノメーター ＬＢ９６Ｖを使用し、測光条件は５分後の１秒間測光とした。
【００４６】
結果を表３に示す。洗浄液中のビオチン濃度を増やすに従ってＴＳＨ濃度ゼロの発光量が下がっていくことがわかった。すなわち、洗浄液中のビオチン濃度を増やすに従って非特異的結合に起因するバックグラウンドシグナルが下がっていくことがわかった。ビオチン濃度が１０ｎｍｏｌ／ｍＬになると、はじめのビオチン濃度ゼロのときに比べてバックグラウンドシグナルが約３分の２（６６％）に減少し、ビオチン濃度をさらに１００ｎｍｏｌ／ｍＬとしてもそれ以下にはならなかった。他方、ＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量にはほとんど影響がなく、結果としてＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量とＴＳＨ濃度ゼロの発光量との比（Ｓ／Ｎ比に相当する）は、はじめのビオチン濃度ゼロのときに比べて約１．５倍に上昇している。
【００４７】
【表３】
【００４８】
実施例６ ２ステップＴＳＨ測定における洗浄液・反応試薬へのビオチンの添加効果
実施例３と５の結果から、洗浄液、反応試薬への有効なビオチン添加濃度はそれぞれ１ｎｍｏｌ／ｍＬ、１０ｎｍｏｌ／ｍＬであることがわかったので、これらの濃度に固定して、以下の洗浄液（実施例１に記載）と反応試薬（実施例４に記載）を用いて実施例３、５に準じて実験を行い、ビオチンを添加した場合の効果を試験した。実験はつぎの４つの場合に分けておこなった。
【００４９】
１）洗浄液及び反応試薬：いずれもビオチン濃度ゼロ
２）洗浄液：ビオチン１ｎｍｏｌ／ｍＬ含有、反応試薬：ビオチン濃度ゼロ
３）洗浄液：ビオチン濃度ゼロ、反応試薬：ビオチン１０ｎｍｏｌ／ｍＬ含有
４）洗浄液：ビオチン１ｎｍｏｌ／ｍＬ含有、反応試薬：ビオチン１０ｎｍｏｌ／ｍＬ含有。
【００５０】
結果を表４に示す。１）を基準として、ＴＳＨ濃度ゼロの発光量を見ていくと、まず２）の洗浄液の効果として発光量が３６％に下がっていることがわかる。これは実施例３の結果と同様である。つぎに１）を基準として、３）の反応試薬の効果としては発光量が６４％に下がっている。さらに４）の効果を１）を基準として見ると、２４％に下がっていることがわかる。２）の効果が３６％、３）の効果が６４％であるから、それらが線形的にバックグラウンドシグナル低下に寄与すると仮定すると、６４％×３６％＝２３％となり、４）の結果である２４％と実質的に一致することがわかった。このことから２ステップ測定系においては、洗浄液と標識化物質を含む反応試薬との両方にビオチンを好適に添加すれば、それぞれの効果が独立に働くため、非特異的結合の総合的な低減に効果があることが判明した。
【００５１】
【表４】
【００５２】
【発明の効果】
本発明の特異的結合アッセイ用洗浄液をＢ／Ｆ分離後の固相の洗浄工程に使用することにより、アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相への非特異的結合を低減させる効果を奏する。
【００５３】
また本発明の洗浄液を、本願第二の発明のように１ステップアッセイに使用することにより、標識した物質がアッセイの過程でアビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相に捕捉されたあとであっても、それらの固相への非特異的結合を低減させる効果を奏する。すなわち遅延型固相免疫検定法にも適用可能な、固相への非特異的結合を低減させた特異的結合アッセイ方法を提供する。
【００５４】
更に本願第三の発明のように、標識した物質が、アッセイの過程でアビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相に捕捉される前に、本発明の洗浄液で固相を洗浄することにより、ビオチン濃度が低くても効果的にバックグラウンドシグナルを低減させることができる。すなわち２ステップアッセイにおいて、固相への非特異的結合を低減させた特異的結合アッセイ方法を提供する。
【００５５】
一方、本発明の特異的結合アッセイ用反応試薬は、２ステップアッセイに使用するとき、アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相への非特異的結合を低減させる効果を奏する。被検成分の種類に応じて反応試薬中の好適なビオチン含有量を適宜選択することができ、被検成分の項目ごとにアッセイ用試薬キットとして供給するのに便利である。
【００５６】
本願第五の発明のように、第１の反応混合物を得る工程のあとに固相を洗浄する工程を設ける２ステップアッセイにおいて、本発明の反応試薬を第２の反応混合物を得る工程で用いることにより、非特異的結合を低減させた特異的結合アッセイ方法を提供する。
【００５７】
更に本願第六の発明のように、第１の反応混合物を得る工程のあとに固相を洗浄する工程を設ける２ステップアッセイにおいて、本発明の洗浄液、および本発明の反応試薬を用いることにより、洗浄液中のビオチンおよび反応試薬中のビオチンの両者の非特異的結合低減効果をあわせもった総合的な低減効果を奏する。
【発明の属する技術分野】
本発明は、特異的結合アッセイのための洗浄液、反応試薬およびアッセイ方法に関し、とくにアビジン−ビオチン結合を利用した特異的結合アッセイに関する。特異的結合アッセイとは、分子間の特有の空間配置と分子間水素結合の集合とに起因する特異的な分子間相互作用をもった結合対、たとえば抗原と抗体、ホルモンと受容体、ビタミン類と結合蛋白質、核酸の相補的結合鎖などにおいて、その一方を、他方との特異的な複合体形成能力を利用して、各種混合物、たとえば血清、血漿、尿、唾液、核酸抽出物、環境水などから選択的に分析しようとする技術である。
【０００２】
【従来の技術】
アビジンまたはストレプトアビジンとビオチンとの高い親和性に基づく反応系（以下アビジン−ビオチン系という）は、免疫測定法、核酸プローブ法、アフィニティークロマトグラフィーなどの分野において、生体関連物質の固相化や標識化に広く利用されている。
【０００３】
アビジン−ビオチン系を固相化に利用するおもな利点は、（１）被検成分に対する特異的結合物質を効率よく固定化できること、（２）異なる被検成分に対しても同じ固相（いわゆるユニバーサル固相）を適用できること、および（３）時間のかかる免疫反応を液相中で実施し、固相への捕捉をアビジン−ビオチンの高親和結合によって実質的に短時間で済ますことが可能であることなどである。たとえば、特開昭６２−３０９６３号公報には、ビオチン結合タンパク質（アビジン、ストレプトアビジンなど）を固定化した固相と、ビオチン化した第１の免疫学的結合相手と、被検成分と、標識化した第２の免疫学的結合相手と、を同時または別々にインキュベートしたのちＢ／Ｆ分離する固相免疫検定法が開示されている。とくに液相成分による抗原抗体反応を優先的に行った後、固相への捕捉を行なう遅延型固相免疫検定法は、検定時間を短縮するために効果的である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
一般に固相を用いた特異的結合アッセイにおいて、固相表面への望ましくない非特異的結合を低減させることは検出感度を改良するために重要である。たとえば、検出用に標識化した試薬が被検成分の量と関係なく非特異的に固相表面に吸着することは、バックグラウンドシグナルの増加につながる。このことは「アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相」（以後、アビジン固相とよぶことがある）においても当てはまり、とくに固相表面のアビジンまたはストレプトアビジンへの非特異的結合を低減させることが望ましい。
【０００５】
特開平１１−２１１７２７号公報は、たとえばアビジン固相に、ビオチン化特異的結合物質（被検成分に対する特異的結合物質とビオチンとの結合物）を結合させたのち、ポリエチレングリコールとビオチンとの抱合体でアビジン固相をブロッキングするという、固相への非特異的結合の防止技術を開示している。このポリエチレングリコールとビオチンとの抱合体は、従来からよく使用されてきたウシ血清アルブミン、動物ＩｇＧ、ゼラチン、ポリエチレングリコール、界面活性剤などのような非特異的ブロッキング物質とは異なり、前記抱合体中のビオチンが、アビジン固相上のフリーのビオチン結合部位に特異的に結合するいわば特異的ブロッキング物質（特開平１１−３１６２２５号公報）である。この公報には、上記の抱合体でブロッキングした固相を乾燥したのち、更にビオチン溶液を塗布して依然としてフリーのままの結合部位を飽和させるといった記載もある。
【０００６】
上記の特開平１１−２１１７２７号公報および特開平１１−３１６２２５号公報で開示された技術は、すでにビオチン化特異的結合物質が結合した固相形態をなす試薬の製造方法である。しかしながら、「従来の技術」に記載したような遅延型固相免疫検定法においては、ビオチン化特異的結合物質（ビオチン化した第１の免疫学的結合相手）、被検成分、及び標識化特異的結合物質（標識化した第２の免疫学的結合相手）からなる生成物が先に生成するため、上記の特異的ブロッキングをそのまま適用することはできないと考えられる。なぜなら固相を特異的にブロッキングする前に、検体中に存在する種々の干渉因子または遊離の標識化特異的結合物質が先に固相に非特異的結合してしまうからである。
【０００７】
本発明の課題は遅延型固相免疫検定法にも適用可能であって、特異的結合アッセイに用いられるアビジン固相への非特異的結合を低減させるのに有用な手段を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記課題はアビジン固相にビオチン化特異的結合物質を結合させる工程のあとにビオチンを含有する溶液を接触させるという手段により解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち本願第一の発明は、ビオチンを含有することを特徴とする、特異的結合アッセイ用洗浄液である。
【００１０】
また本願第二の発明は、溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方法において、
・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相（１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的結合物質（２）、被検成分（３）、および被検成分に対する標識した第２の特異的結合物質または標識した被検成分類似体（４）を接触させて固相と液相からなる反応混合物を得る工程、
・前記反応混合物中の固相を液相から分離し、前述の洗浄液を用いてその固相を洗浄する工程、及び
・洗浄した前記固相上の標識を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
【００１１】
さらに本願第三の発明は、溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方法において、
・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相（１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的結合物質（２）、および被検成分（３）を接触させて固相と液相からなる第１の反応混合物を得る工程、
・前記第１の反応混合物中の固相を液相から分離し、前述の洗浄液を用いてその固相を洗浄する工程、
・洗浄した前記固相に、被検成分に対する標識した第２の特異的結合物質または標識した被検成分類似体（４）を接触させて、固相と液相からなる第２の反応混合物を得る工程、及び
・前記第２の反応混合物中の固相を液相から分離し、固相上の標識を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
【００１２】
また本願第四の発明は、ビオチンと、被検成分に対する標識した特異的結合物質または標識した被検成分類似体とを含むことを特徴とする、特異的結合アッセイ用反応試薬である。
【００１３】
また本願第五の発明は、溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方法において、
・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相（１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的結合物質（２）、および被検成分（３）を接触させて、固相と液相からなる第１の反応混合物を得る工程、
・前記第１の反応混合物中の固相を液相から分離する工程、
・分離した前記固相に、前述の反応試薬を接触させて固相と液相からなる第２の反応混合物を得る工程、及び
・前記第２の反応混合物中の固相を液相から分離し、固相上の標識を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
【００１４】
また本願第六の発明は、溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方法において、
・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相（１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的結合物質（２）および被検成分（３）を接触させて固相と液相からなる第１の反応混合物を得る工程、
・前記第１の反応混合物中の固相を液相から分離し、前述の洗浄液を用いてその固相を洗浄する工程、
・洗浄した前記固相に、前述の反応試薬を接触させて固相と液相からなる第２の反応混合物を得る工程、及び
・前記第２の反応混合物中の固相を液相から分離し、固相上の標識を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
【００１５】
以下、本発明を更に詳細に説明する。はじめに本願で使用される用語について説明する。
【００１６】
本願において、「ビオチン」とは、ビオチンそのものばかりでなく、アビジンまたはストレプトアビジンと高親和性の結合対を形成する点でビオチンと実質的に同様の挙動を示すビオチン誘導体およびビオチン類縁体たとえばビオシチン、ビスノルビオチン、テトラノルビオチン、デスチオビオチンなどをも含むものである。ただしビオチンは被検成分とは実質的に直接結合しない。
【００１７】
また本願において、「アビジンまたはストレプトアビジン」とは、天然物または組換え体の、アビジン、ストレプトアビジンまたはそれらの誘導体（重合体を含む）であって、１分子上にビオチン結合能を複数もってもよい蛋白質を意味する。
【００１８】
アビジンまたはストレプトアビジンを固定化するのに使用される固相は水不溶性担体であって、形、大きさ、材質には制限がなく、従来のイムノアッセイや核酸プローブ法、アフィニティークロマトグラフィーで使用されている水不溶性担体であってよい。たとえば、イムノアッセイでよく使われるポリスチレンなどの熱可塑性樹脂で製造された微粒子、ビーズ、板状の担体、反応容器の内壁、セルロースエステルなどの繊維を固相とすることができる。微粒子やビーズを使用するときは、磁力による撹拌やＢ／Ｆ分離をしやすくするために、担体の表面または内部に鉄やフェライトなどの磁性物質を担持させてもよい。
【００１９】
アビジンまたはストレプトアビジンを固相に固定化するには、直接吸着させてもよく、また適切なリンカーを介して化学的に架橋してもよく、ビオチンを固定化した固相にビオチン−アビジン結合により結合させてもよい。
【００２０】
第１の特異的結合物質は、被検成分が抗原のときはその抗原に特異的な抗体でよく、被検成分が抗体のときはその抗体が特異的に結合する抗原でもよいし、その抗体に対する抗体であってもよい。また、被検成分がホルモンのときはその受容体であってもよく、被検成分が受容体のときは対応するホルモンであってもよい。また、被検成分がビタミン類のときはその結合蛋白質であってもよい。また、被検成分が核酸のときは相補的な核酸プローブであってもよい。
【００２１】
被検成分に対するビオチン化した第１の特異的結合物質は、アビジンまたはストレプトアビジンとの結合能、および対応する被検成分との特異的結合能を兼ね備えた結合物を意味する。蛋白質や核酸をビオチン化する方法には公知の方法が多数あり、本発明はそれらの方法によって製造されるビオチン化物質のすべてを利用できる。
【００２２】
被検成分に対する標識した第２の特異的結合物質とは、第１の特異的結合物質とは異なった位置で被検成分に特異的に結合する物質を標識した結合物であって、いわゆるサンドイッチ法の反応試薬を構成する。標識した被検成分類似体とは、第１の特異的結合物質の結合部位をめぐって被検物質と競合する物質を標識した結合物であって、いわゆる競合法の反応試薬を構成する。本願において被検成分類似体という用語は被検成分そのもの及びその類似体を含む。標識は検出用に用いられるもので、この分野において公知であるすべてのもの、たとえば酵素、化学発光物質、蛍光物質、放射性物質などが利用できる。なお本願において、標識という用語は特別に断わらない限り検出用の標識を意味するものとする。標識の検出には特に限定はなく、各標識に応じた方法で行うことができる。反応混合物中の固相を液相から分離する方法には特に限定はなく、いわゆる通常のＢ／Ｆ分離を行うことができる。
【００２３】
上記の反応成分（１）から（３）及び／又は（４）を接触させるとは、アビジン−ビオチン結合の形成、被検成分に対する第一及び／又は第二の特異的結合物質の反応が、特異的結合アッセイの達成に必要な程度進行するのに十分な物理化学的条件下で、十分な時間、インキュベーションすることを意味する。
【００２４】
次に本願発明を順に説明する。まず本願第一の発明による洗浄液は、ビオチンを含むことを特徴とし、必要に応じて酸、塩基、塩、それらの組み合わせからなる緩衝物質、界面活性剤、防腐剤などを含んでもよい。また通常、特異的結合アッセイに使われている公知の洗浄液や緩衝液にビオチンを添加することで製造することができる。
【００２５】
本発明の洗浄液は、使用時はビオチンを含む溶液の形態で用いられ、特に水溶液の形態が好ましいが、輸送、保存の容易さのために、凍結乾燥品や濃縮液で供給されてもよい。洗浄液に含有されるビオチンの濃度に制限はないが、０．１ｎｍｏｌ／ｍＬないし１００ｎｍｏｌ／ｍＬが好ましく、１ｎｍｏｌ／ｍＬないし１０ｎｍｏｌ／ｍＬがとくに好ましい。
【００２６】
本願第二の発明は、溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方法に関するものであり、固相から標識化物質までを含んだ免疫複合体の形成後にはじめてＢ／Ｆ分離及び洗浄を行ういわゆる１ステップアッセイにおいて、洗浄液に本願第一の発明による洗浄液を用いることにより、固相への被検成分および標識化物質の導入後でも、固相への非特異的結合を低減させることができる。
【００２７】
上記の成分（１）から（４）までの接触の仕方に制限はなく、たとえば（１）に（２）を接触させたのち（３）そして（４）の順に接触させてもよく、その逆順に接触させてもよく、すべてを同時に接触させてもよい。好ましくは（２）、（３）および（４）を互いに接触させたのち（１）を接触させるのがよい。すなわち液相成分による特異的結合反応を優先的に行った後、固相への捕捉を行なうのが、アッセイ全体に要する時間を短縮するために効果的である。固相化反応を含めた特異的結合反応の進行は、液相だけの反応に比べて一般に遅いからである。固相への捕捉はアビジン−ビオチンの高親和結合によって実質的に短時間で済ますことができる。
【００２８】
本願第三の発明では、上記の２ステップアッセイにおいて、第１の反応混合物から分離した固相を洗浄する際に、本願第一の発明による洗浄液を用いることにより、非特異的結合を効果的に低減させることができる。この方法は標識物質（４）を反応させる前に固相を洗浄する工程を含み、検体中の妨害成分と標識物質（４）との接触を避けたいときに好適に使用される。上記の成分（１）から（３）までの接触の仕方に制限はなく、たとえば（１）に（２）を接触させたのち（３）を接触させてもよく、その逆順に接触させてもよく、すべてを同時に接触させてもよい。好ましくは（２）および（３）を互いに接触させたのち（１）を接触させるのがよい。
【００２９】
本願第四の発明による反応試薬は酸、塩基、塩、それらの組み合わせからなる緩衝物質、界面活性剤、防腐剤などを含んでもよい。本発明による反応試薬は、使用時は水溶液の形態で用いられるが、輸送、保存の容易さのために、凍結乾燥品や濃縮液で供給されてもよい。含有するビオチンの濃度に制限はないが、０．１ｎｍｏｌ／ｍＬないし１００ｎｍｏｌ／ｍＬが好ましく、１ｎｍｏｌ／ｍＬないし１００ｎｍｏｌ／ｍＬがとくに好ましい。
【００３０】
本願第五の発明では、上記の２ステップアッセイにおいて、第１の反応混合物から分離した固相に、本願第４の発明に記載の反応試薬を接触して第２の反応混合物を得ることにより、非特異的結合を低減させることができる。上記の成分（１）から（３）までの接触の仕方に制限はなく、たとえば（１）に（２）を接触させたのち（３）を接触させてもよく、その逆順に接触させてもよく、すべてを同時に接触させてもよい。好ましくは（２）および（３）を互いに接触させたのち（１）を接触させるのがよい。
【００３１】
本願第六の発明では、上記の２ステップアッセイにおいて、第１の反応混合物から分離した固相を洗浄する際に、本願第一の発明の洗浄液を用い、かつ洗浄後の固相に本願第四の発明の反応試薬を接触し、第２の反応混合物を得ることにより、非特異的結合をとくに効果的に低減させることができる。上記の成分（１）から（３）までの接触の仕方に制限はなく、たとえば（１）に（２）を接触させたのち（３）を接触させてもよく、その逆順に接触させてもよく、すべてを同時に接触させてもよい。好ましくは（２）および（３）を互いに接触させたのち（１）を接触させるのがよい。
【００３２】
意外にも、本願第一の発明の洗浄液および本願第四の発明の反応試薬に含まれるビオチンは、遅延型固相免疫検定法においてすでに固相に非特異結合した標識化物質を追い出す効果を示した。この作用機序は明らかではないが、アビジン上の疎水性領域に標識化物質が非特異的に結合しているところへビオチンを共存せしめた結果、ビオチンがアビジン上のビオチン結合部位に結合し、疎水部分が親水化するか、もしくは立体的に標識化物質が外れやすい構造をとるものと考えられる。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を更に詳細に説明するため実施例を示す。しかし本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３４】
実施例１ ビオチンを含有する洗浄液
つぎに示す組成をもった種々の濃度のビオチンを含有する洗浄液を製造した。
【００３５】
トリス緩衝液 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭ（ｐＨ８）
塩化ナトリウム ０．１５Ｍ
塩化マグネシウム １ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ−２０ ０．０５％
アジ化ナトリウム ０．０５％
ビオチン ０、０．１、１、１０、または１００ｎｍｏｌ／ｍＬ。
【００３６】
実施例２ １ステップＴＳＨ測定における洗浄液へのビオチンの添加効果
実験した１ステップＴＳＨ測定系の概略はつぎの通りである。ビオチン化抗ＴＳＨ抗体溶液３３．３μＬと、検体（ＴＳＨ濃度ゼロおよび１０μＩＵ／ｍＬの標準溶液）３３．３μＬと、アルカリ性ホスファターゼ標識抗ＴＳＨ抗体（ビオチン化抗ＴＳＨ抗体とは異なる部位でＴＳＨに結合するもの）溶液３３．３μＬとを９６穴黒色マイクロタイタープレート中で混合し、３７℃で５分間反応させた。その後ストレプトアビジン固定化磁性微粒子（ダイナル社製）１０μＬと混合し、３７℃で３分間攪拌したのち固相を分離し、実施例１に示した種々の濃度のビオチンを含有する洗浄液で洗浄した。そして発光基質（Ｔｒｏｐｉｘ社ＣＳＰＤ）５０μＬを分注し、酵素反応／発光測定をおこなった。発光測定にはベルトールド社製ルミノメーター ＬＢ９６Ｖを使用し、測光条件は５分後の１秒間測光とした。
【００３７】
結果を表１に示す。洗浄液中のビオチン濃度を増やすに従ってＴＳＨ濃度ゼロの相対発光量ＲＬＵ（以後、たんに発光量とよぶ）が下がっていくことがわかった。すなわち、洗浄液中のビオチン濃度を増やすに従って非特異的結合に起因するバックグラウンドシグナルが下がっていくことがわかった。ビオチン濃度が１０ｎｍｏｌ／ｍＬになると、はじめのビオチン濃度ゼロのときに比べてバックグラウンドシグナルが約３分の１（３３．９％）に減少し、ビオチン濃度をさらに１００ｎｍｏｌ／ｍＬとしてもそれ以下にはならなかった。他方、ＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量にはほとんど影響がなく、結果としてＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量とＴＳＨ濃度ゼロの発光量との比（Ｓ／Ｎ比に相当する）は、ビオチン濃度ゼロのときに比べて１０ｎｍｏｌ／ｍＬでは約３倍に上昇している。洗浄液中のビオチンの濃度を増やしてもＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量にはほとんど影響がなかったことは、いったんストレプトアビジン上のビオチン結合部位に結合したビオチン化免疫複合体が、洗浄液中のビオチンによって追い出されなかったことを意味し、このアッセイ方法の有用性を支持する。
【００３８】
【表１】
実施例３ ２ステップＴＳＨ測定における洗浄液へのビオチンの添加効果
実験した２ステップＴＳＨ測定系の概略はつぎの通りである。ビオチン化抗ＴＳＨ抗体溶液６６．７μＬと検体（ＴＳＨ濃度ゼロおよび１０μＩＵ／ｍＬの標準溶液）３３．３μＬとを９６穴黒色マイクロタイタープレート中で混合し、３７℃で５分間反応させた。その後ストレプトアビジン固定化磁性微粒子（ダイナル社製）１０μＬと混合し、３７℃で３分間攪拌したのち固相を分離し、実施例１に示した種々の濃度のビオチンを含有する洗浄液で洗浄した。その後アルカリ性ホスファターゼ標識抗ＴＳＨ抗体（ビオチン化抗ＴＳＨ抗体とは異なる部位でＴＳＨに結合するもの）溶液５０μＬを分注し、５分間反応後、固相を分離し同じ洗浄液で再び洗浄した。そして発光基質（Ｔｒｏｐｉｘ社ＣＳＰＤ）５０μＬを分注し、酵素反応／発光検出をおこなった。発光測定にはベルトールド社製ルミノメーター ＬＢ９６Ｖを使用し、測光条件は５分後の１秒間測光とした。
【００４０】
結果を表２に示す。洗浄液中のビオチン濃度を増やすに従ってＴＳＨ濃度ゼロの発光量が下がっていくことがわかった。すなわち、洗浄液中のビオチン濃度を増やすに従って非特異的結合に起因すると思われるバックグラウンドシグナルが下がっていくことがわかった。ビオチン濃度が１０ｎｍｏｌ／ｍＬになると、はじめのビオチン濃度ゼロのときに比べてバックグラウンドシグナルが約３分の１（３３．０％）に減少し、ビオチン濃度をさらに１００ｎｍｏｌ／ｍＬとしてもそれ以下にはならなかった。他方、ＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量にはほとんど影響がなく、結果としてＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量とＴＳＨ濃度ゼロの発光量との比（Ｓ／Ｎ比に相当する）は、はじめのビオチン濃度ゼロのときに比べて約３倍に上昇している。洗浄液中のビオチンの濃度を増やしてもＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量にはほとんど影響がなかったことは、いったんストレプトアビジン上のビオチン結合部位に結合したビオチン化免疫複合体が、洗浄液中のビオチンによって追い出されなかったことを意味し、このアッセイ方法の有用性を支持する。
【００４１】
洗浄液中のビオチン濃度が１０ｎｍｏｌ／ｍＬのときは、この実施例３に示した２ステップ測定（表２）においても、先の実施例２に示した１ステップ測定（表１）においてもバックグラウンドシグナルが共に約３分の１に減少するという驚くべき一致を示した。ただし細かく見ると、ビオチン濃度が１ｎｍｏｌ／ｍＬのとき、表２のバックグラウンドシグナルは、はじめのビオチン濃度ゼロのときに比べて３３．６％となり、１０ｎｍｏｌ／ｍＬのときの３３．０％とほぼ同じレベルにまで低下している。これに対して、表１のバックグラウンドシグナルは、はじめのビオチン濃度ゼロのときに比べて１ｎｍｏｌ／ｍＬでは３９．０％となり、１０ｎｍｏｌ／ｍＬのときの３３．９％のレベルにまでは低下しきれていないことがわかる。２ステップアッセイのはじめの洗浄が、標識化物質の導入前であるのに対して、１ステップアッセイの洗浄は、標識化物質の導入後であることから、固相に非特異的結合している標識化物質を一定時間内に追い出すためにより多くのビオチンが必要になるためであると考えられる。
【００４２】
【表２】
実施例４ ビオチンと、被検成分に対する標識した特異的結合物質を含む特異的結合アッセイ用反応試薬
つぎに示す組成をもった種々の濃度のビオチンを含有する前記反応試薬を製造した。
【００４４】
トリス緩衝液 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ０．１Ｍ
ウシ血清アルブミン ０．１％
アジ化ナトリウム ０．１％
アルカリ性ホスファターゼ標識抗ＴＳＨ抗体 ０．７３μｇ／ｍＬ
ビオチン ０、０．１、１、１０、又は１００ｎｍｏｌ／ｍＬ。
【００４５】
実施例５ ２ステップＴＳＨ測定における反応試薬へのビオチンの添加効果
実験した２ステップＴＳＨ測定系の概略はつぎの通りである。ビオチン化抗ＴＳＨ抗体溶液６６．７μＬと検体（ＴＳＨ濃度ゼロおよび１０μＩＵ／ｍＬの標準溶液）３３．３μＬとを９６穴黒色マイクロタイタープレート中で混合し、３７℃で５分間反応させた。その後ストレプトアビジン固定化磁性微粒子（ダイナル社製）１０μＬと混合し、３７℃で３分間攪拌したのち固相を分離し、実施例１に示したビオチン濃度ゼロの洗浄液で洗浄した。その後実施例４に示した反応試薬を分注し、５分間反応後、固相を分離し同じ洗浄液で再び洗浄した。そして発光基質（Ｔｒｏｐｉｘ社ＣＳＰＤ）５０μＬを分注し、酵素反応／発光検出をおこなった。発光測定にはベルトールド社製ルミノメーター ＬＢ９６Ｖを使用し、測光条件は５分後の１秒間測光とした。
【００４６】
結果を表３に示す。洗浄液中のビオチン濃度を増やすに従ってＴＳＨ濃度ゼロの発光量が下がっていくことがわかった。すなわち、洗浄液中のビオチン濃度を増やすに従って非特異的結合に起因するバックグラウンドシグナルが下がっていくことがわかった。ビオチン濃度が１０ｎｍｏｌ／ｍＬになると、はじめのビオチン濃度ゼロのときに比べてバックグラウンドシグナルが約３分の２（６６％）に減少し、ビオチン濃度をさらに１００ｎｍｏｌ／ｍＬとしてもそれ以下にはならなかった。他方、ＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量にはほとんど影響がなく、結果としてＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量とＴＳＨ濃度ゼロの発光量との比（Ｓ／Ｎ比に相当する）は、はじめのビオチン濃度ゼロのときに比べて約１．５倍に上昇している。
【００４７】
【表３】
実施例６ ２ステップＴＳＨ測定における洗浄液・反応試薬へのビオチンの添加効果
実施例３と５の結果から、洗浄液、反応試薬への有効なビオチン添加濃度はそれぞれ１ｎｍｏｌ／ｍＬ、１０ｎｍｏｌ／ｍＬであることがわかったので、これらの濃度に固定して、以下の洗浄液（実施例１に記載）と反応試薬（実施例４に記載）を用いて実施例３、５に準じて実験を行い、ビオチンを添加した場合の効果を試験した。実験はつぎの４つの場合に分けておこなった。
【００４９】
１）洗浄液及び反応試薬：いずれもビオチン濃度ゼロ
２）洗浄液：ビオチン１ｎｍｏｌ／ｍＬ含有、反応試薬：ビオチン濃度ゼロ
３）洗浄液：ビオチン濃度ゼロ、反応試薬：ビオチン１０ｎｍｏｌ／ｍＬ含有
４）洗浄液：ビオチン１ｎｍｏｌ／ｍＬ含有、反応試薬：ビオチン１０ｎｍｏｌ／ｍＬ含有。
【００５０】
結果を表４に示す。１）を基準として、ＴＳＨ濃度ゼロの発光量を見ていくと、まず２）の洗浄液の効果として発光量が３６％に下がっていることがわかる。これは実施例３の結果と同様である。つぎに１）を基準として、３）の反応試薬の効果としては発光量が６４％に下がっている。さらに４）の効果を１）を基準として見ると、２４％に下がっていることがわかる。２）の効果が３６％、３）の効果が６４％であるから、それらが線形的にバックグラウンドシグナル低下に寄与すると仮定すると、６４％×３６％＝２３％となり、４）の結果である２４％と実質的に一致することがわかった。このことから２ステップ測定系においては、洗浄液と標識化物質を含む反応試薬との両方にビオチンを好適に添加すれば、それぞれの効果が独立に働くため、非特異的結合の総合的な低減に効果があることが判明した。
【００５１】
【表４】
【発明の効果】
本発明の特異的結合アッセイ用洗浄液をＢ／Ｆ分離後の固相の洗浄工程に使用することにより、アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相への非特異的結合を低減させる効果を奏する。
【００５３】
また本発明の洗浄液を、本願第二の発明のように１ステップアッセイに使用することにより、標識した物質がアッセイの過程でアビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相に捕捉されたあとであっても、それらの固相への非特異的結合を低減させる効果を奏する。すなわち遅延型固相免疫検定法にも適用可能な、固相への非特異的結合を低減させた特異的結合アッセイ方法を提供する。
【００５４】
更に本願第三の発明のように、標識した物質が、アッセイの過程でアビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相に捕捉される前に、本発明の洗浄液で固相を洗浄することにより、ビオチン濃度が低くても効果的にバックグラウンドシグナルを低減させることができる。すなわち２ステップアッセイにおいて、固相への非特異的結合を低減させた特異的結合アッセイ方法を提供する。
【００５５】
一方、本発明の特異的結合アッセイ用反応試薬は、２ステップアッセイに使用するとき、アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相への非特異的結合を低減させる効果を奏する。被検成分の種類に応じて反応試薬中の好適なビオチン含有量を適宜選択することができ、被検成分の項目ごとにアッセイ用試薬キットとして供給するのに便利である。
【００５６】
本願第五の発明のように、第１の反応混合物を得る工程のあとに固相を洗浄する工程を設ける２ステップアッセイにおいて、本発明の反応試薬を第２の反応混合物を得る工程で用いることにより、非特異的結合を低減させた特異的結合アッセイ方法を提供する。
【００５７】
更に本願第六の発明のように、第１の反応混合物を得る工程のあとに固相を洗浄する工程を設ける２ステップアッセイにおいて、本発明の洗浄液、および本発明の反応試薬を用いることにより、洗浄液中のビオチンおよび反応試薬中のビオチンの両者の非特異的結合低減効果をあわせもった総合的な低減効果を奏する。
Claims (9)
- ビオチンを含有することを特徴とする、特異的結合アッセイ用洗浄液。
- ビオチンを１ｎｍｏｌ／ｍＬないし１００ｎｍｏｌ／ｍＬの濃度で含有する、請求項１記載の洗浄液。
- 溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方法において、
・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相（１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的結合物質（２）、被検成分（３）、および被検成分に対する標識した第２の特異的結合物質または標識した被検成分類似体（４）を接触させて固相と液相からなる反応混合物を得る工程、
・前記反応混合物中の固相を液相から分離し、請求項１または２に記載の洗浄液を用いてその固相を洗浄する工程、及び
・洗浄した前記固相上の標識を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記反応混合物を得る工程が、（２）、（３）および（４）を互いに接触させた後、（１）を接触させる工程である請求項３に記載の方法。
- 溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方法において、
・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相（１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的結合物質（２）、および被検成分（３）を接触させて固相と液相からなる第１の反応混合物を得る工程、
・前記第１の反応混合物中の固相を液相から分離し、請求項１または２に記載の洗浄液を用いてその固相を洗浄する工程、
・洗浄した前記固相に、被検成分に対する標識した第２の特異的結合物質または標識した被検成分類似体（４）を接触させて、固相と液相からなる第２の反応混合物を得る工程、及び
・前記第２の反応混合物中の固相を液相から分離し、固相上の標識を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - ビオチンと、被検成分に対する標識した特異的結合物質または標識した被検成分類似体とを含むことを特徴とする、特異的結合アッセイ用反応試薬。
- ビオチンの濃度が１ｎｍｏｌ／ｍＬないし１００ｎｍｏｌ／ｍＬである請求項６記載の反応試薬。
- 溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方法において、
・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相（１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的結合物質（２）、および被検成分（３）を接触させて、固相と液相からなる第１の反応混合物を得る工程、
・前記第１の反応混合物中の固相を液相から分離する工程、
・分離した前記固相に、請求項６または７に記載の反応試薬を接触させて固相と液相からなる第２の反応混合物を得る工程、及び
・前記第２の反応混合物中の固相を液相から分離し、固相上の標識を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方法において、
・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相（１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的結合物質（２）および被検成分（３）を接触させて固相と液相からなる第１の反応混合物を得る工程、
・前記第１の反応混合物中の固相を液相から分離し、請求項１または２に記載の洗浄液を用いてその固相を洗浄する工程、
・洗浄した前記固相に、請求項６または７に記載の反応試薬を接触させて固相と液相からなる第２の反応混合物を得る工程、及び
・前記第２の反応混合物中の固相を液相から分離し、固相上の標識を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
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