JP4403069B2 - Methods for using the 5 'end of mRNA for cloning and analysis - Google Patents

Description

本発明は、サンプル中の複数のｍＲＮＡの５’末端のヌクレオチド配列情報を含む複数の核酸フラグメントを選択的に回収する方法に関する。   The present invention relates to a method for selectively recovering a plurality of nucleic acid fragments containing nucleotide sequence information at the 5 'end of a plurality of mRNAs in a sample.

ゲノム情報を利用するために、ゲノムの一部をｍＲＮＡに転写する。ゲノムおよびその調節プロセスでの使用を理解するために、各ｍＲＮＡ種に関する情報が必要である。このような情報は、所与の生物学的状況において、部分的または全長ヌクレオチド配列およびその相対量または絶対量を含むはずである。
従来、細胞、組織、または生物中に含まれるｍＲＮＡの塩基配列は、逆転写によるｃＤＮＡライブラリーの調製によって分析されていた。テンプレートとしてｍＲＮＡを使用し、前記ｃＤＮＡライブラリー中の各ｃＤＮＡフラグメントを調査する。サンプルは多数の種々のｍＲＮＡを含むので、従来の方法は、遺伝子発現プロフィールの分析および稀な遺伝子の同定での有効性は制限される。したがって、複雑なサンプル中のｍＲＮＡの発現パターンをモニターし、タグと呼ばれる短い配列エレメントによって遺伝子を同定するための他のテクノロジーが開発されている。 To use genomic information, a part of the genome is transcribed into mRNA. In order to understand the genome and its use in the regulatory process, information about each mRNA species is needed. Such information should include partial or full-length nucleotide sequences and their relative or absolute amounts in a given biological context.
Conventionally, the base sequence of mRNA contained in a cell, tissue, or organism has been analyzed by preparing a cDNA library by reverse transcription. Using mRNA as a template, each cDNA fragment in the cDNA library is examined. Because the sample contains a large number of different mRNAs, conventional methods are limited in their effectiveness in analyzing gene expression profiles and identifying rare genes. Therefore, other technologies have been developed to monitor the expression pattern of mRNA in complex samples and identify genes by short sequence elements called tags.

一般に、いわゆるＤＮＡマイクロアレイを使用して、高処理発現プロファイリングが実施される（Ｊｏｒｄａｎ Ｂ．，ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１；ａｎｄ Ｓｃｈｅｎａ Ａ，ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ １９９９）。このような実験のために、各遺伝子または転写物を示す特異的プローブを支持体上に位置付け、同時に複数のサンプルとハイブリッド形成させる。支持体上のプローブがサンプルを示す分子と反応する場合、陽性のシグナルが得られる。これらの実験により、非常に多数の遺伝子または転写物が並行して分析される。しかし、このアプローチは、他の実験手段によって最初に同定されている遺伝子または転写物のみを研究することができるという点で制限される。このような手段には、ｃＤＮＡライブラリー、部分的配列タグおよび／またはコンピュータ予想によって得られた結果を含み得る。ＤＮＡマイクロアレイ実験のこの制限により、複数のｍＲＮＡサンプルから得られた部分的配列またはタグに基づいた別のアプローチが遺伝子発見および発現プロファイリングで使用されている。   In general, high-throughput expression profiling is performed using so-called DNA microarrays (Jordan B., DNA Microarrays: Gene Expression Applications, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, 2001; and SDNA). (Approach, Oxford University Press, Oxford 1999). For such experiments, specific probes representing each gene or transcript are positioned on the support and simultaneously hybridized with multiple samples. A positive signal is obtained when the probe on the support reacts with a molecule indicative of the sample. These experiments analyze a large number of genes or transcripts in parallel. However, this approach is limited in that only genes or transcripts initially identified by other experimental means can be studied. Such means may include cDNA libraries, partial sequence tags and / or results obtained by computer prediction. Due to this limitation of DNA microarray experiments, another approach based on partial sequences or tags obtained from multiple mRNA samples has been used in gene discovery and expression profiling.

いわゆるＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：遺伝子発現の連続分析）法は、ｍＲＮＡ中の塩基配列に関する部分的情報を得るための有効な方法として公知である（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ Ｖ．Ｅ．ｅｔ ａｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，４８４−４８７ （１９９５））。この方法によれば、ＤＮＡコンカテマーを、複数のｍＲＮＡの３’末端の塩基配列に関する情報を含む複数の短いＤＮＡフラグメント（最初、約１０ｂｐ）のライゲーションによって形成し、これらのＤＮＡコンカテマー中の塩基配列を決定する。これは、複数のｍＲＮＡの３’末端の塩基配列に関する部分的情報の取得方法である。３’末端付近の短い塩基配列のみを利用可能であるが、ｍＲＮＡ自体が既に公知である場合、ＳＡＧＥ法は特異的ｍＲＮＡまたは遺伝子を同定することができる場合があるが、利用可能な塩基配列は多くの場合約１０ｂｐの短さである。最近、ＳＡＧＥの改良バージョン（いわゆるＬｏｎｇＳＡＧＥ）が発表されている。この方法により、より長いＳＡＧＥタグがクローニング可能である（Ｓａｈａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，５０８−１２（２００２），米国特許公開番号２００３０００８２９０号および同第２００３００４９６５３号）。ＳＡＧＥ法は、現在、特定の細胞、組織、または生物で発現した遺伝子の重要な分析方法として広範に使用されており、ＳＡＧＥタグは公的なドメイン（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＡＧＥ）の基準に利用可能である。   The so-called SAGE (Serial Analysis Gene Expression) method is known as an effective method for obtaining partial information on a base sequence in mRNA (Velculescu VE et at., Science 270, 484-487 (1995)). According to this method, DNA concatamers are formed by ligation of a plurality of short DNA fragments (initially about 10 bp) containing information on the base sequences of the 3 ′ ends of a plurality of mRNAs, and the base sequences in these DNA concatamers are determined. decide. This is a method for obtaining partial information on the base sequences at the 3 'end of a plurality of mRNAs. Only a short base sequence near the 3 ′ end can be used. If the mRNA itself is already known, the SAGE method may be able to identify a specific mRNA or gene. In many cases it is as short as about 10 bp. Recently, an improved version of SAGE (so-called LongSAGE) has been announced. By this method, longer SAGE tags can be cloned (Saha S. et al., Nat. Biotechnol. 20,508-12 (2002), US Patent Publication Nos. 20030008290 and 20030049653). The SAGE method is now widely used as an important analysis method for genes expressed in specific cells, tissues, or organisms, and the SAGE tag is a public domain (eg, http: //cgap.nci.nih). .Gov / SAGE).

ｍＲＮＡの３’末端の部分的塩基配列を研究するためにＳＡＧＥ法を使用することができるが、３’末端のこのような短い配列における情報のみに基づいて新規の遺伝子をクローン化することは困難である。その複数の適用にもかかわらず、ＳＡＧＥは、ｍＲＮＡの５’末端に近いｃＤＮＡクローンをどのようにして得るかとうことは教示していない。実際、クラスＩＩＳの４ｂｐ制限酵素を使用する。４ｂｐの切断物は、通常、平均し数百個のヌクレオチドを切断し、これは平均してｍＲＮＡ転写物の平均サイズの１／１０である。したがって、ＳＡＧＥ原理により、３’末端の回収頻度が高く、ほとんどの転写物の５’末端に関する情報は収集できないことが強く示唆される。さらに、最初のＳＡＧＥバージョンは、タグの長さが短いために制限され（ほとんどの場合、１０ｂｐ長のタグしか使用しない）、情報の信頼のおける分析およびアノテーションが不可能であった。   SAGE can be used to study the partial base sequence of the 3 'end of mRNA, but it is difficult to clone a new gene based solely on information in such a short sequence at the 3' end It is. Despite its multiple applications, SAGE does not teach how to obtain a cDNA clone close to the 5 'end of the mRNA. In fact, a class IIS 4 bp restriction enzyme is used. A 4 bp cut usually cleaves on average several hundred nucleotides, which on average is 1/10 of the average size of the mRNA transcript. Thus, the SAGE principle strongly suggests that the 3 'end is collected frequently and information about the 5' end of most transcripts cannot be collected. In addition, the first SAGE version was limited due to the short tag length (in most cases only 10 bp long tags were used), and reliable analysis and annotation of information was not possible.

全長ｃＤＮＡクローンおよびその誘導配列の回収技術が存在するにもかかわらず、これらは全長ｃＤＮＡクローンの回収に注目しており、５’末端のみを対象とするフラグメントに注目していない。したがって、全長ｃＤＮＡクローニングアプローチは、転写開始部位および関連するプロモーター領域の高処理同定および分析に適切ではない。   Despite the existence of full-length cDNA clones and techniques for recovering their derived sequences, these focus on recovering full-length cDNA clones and not on fragments targeting only the 5 'end. Therefore, the full-length cDNA cloning approach is not suitable for high-throughput identification and analysis of transcription initiation sites and associated promoter regions.

したがって、本発明の目的は、サンプル中のｍＲＮＡの５’末端の塩基配列に関する情報を獲得することができる新規の一般的方法を提供することである。本発明の別の方法は、新規の遺伝子のクローン化ならびにコード領域および調節領域に関するゲノム配列情報の分析を可能にすることである。情報は、非常に多数の５’末端配列由来の転写開始部位の統計学を含み得る。   Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel general method capable of obtaining information on the base sequence of the 5 'end of mRNA in a sample. Another method of the invention is to allow the cloning of new genes and the analysis of genomic sequence information regarding coding and regulatory regions. Information can include statistics of transcription start sites from a large number of 5 'end sequences.

したがって、本発明は、一般に、転写遺伝子の５’末端に対応する核酸の一部を単離し、これらを配列決定などのさらなる高処理分析に使用する概念に関する。本発明は、対照的な教示を組み合わて新規の方法を提供し、プロモーターのマッピングおよび分析に有用な５’末端への新規の高処理アプローチを提供する。本発明の方法は、新規の遺伝子の発見およびクローニングならびに遺伝子調節の研究のためのサンプル中に含まれるｍＲＮＡの分析に有効である。新規の遺伝子を同定およびクローン化する能力と組み合わせた複雑な調節ネットワークを研究および分析するための本発明の使用により、生物系ならびに発生、ホメオスタシス、疾患などにおけるその状態のモニタリングするための広範な適用領域が開かれる。   Thus, the present invention relates generally to the concept of isolating portions of nucleic acids corresponding to the 5 'end of a transcribed gene and using them for further high throughput analysis such as sequencing. The present invention combines a contrasting teaching to provide a novel method and provides a novel high-throughput approach to the 5 'end useful for promoter mapping and analysis. The method of the present invention is useful for the discovery and cloning of new genes and the analysis of mRNA contained in samples for gene regulation studies. Broad application for monitoring biological systems and their status in development, homeostasis, diseases, etc. by using the present invention to study and analyze complex regulatory networks combined with the ability to identify and clone new genes The area is opened.

本発明は、５’末端を使用した新規のプロモーター分析方法を提供し、一方ＳＡＧＥは関連しない３’末端の使用によりいかなるプロモーター分析も不可能である。
熱心な研究後、本発明者らは、ｍＲＮＡの５’末端の塩基配列に関する情報を含む複数の核酸フラグメントの選択的回収により、ｍＲＮＡ中の塩基配列に関する情報を獲得するだけでなく、新規の遺伝子をクローニングすることができるという事実に到達することにより本発明を完了し、これらはこの目的を果たすための具体的な方法であることも見出した。 The present invention provides a novel promoter analysis method using the 5 ′ end, while SAGE does not allow any promoter analysis due to the use of an unrelated 3 ′ end.
After intensive research, the present inventors not only acquired information on the base sequence in mRNA by selective recovery of a plurality of nucleic acid fragments containing information on the base sequence of the 5 ′ end of mRNA, but also a novel gene. The present invention has been completed by reaching the fact that can be cloned, and it has also been found that these are specific ways to serve this purpose.

すなわち、テンプレートとしてサンプル中に存在するｍＲＮＡを使用して形成されたｃＤＮＡからｍＲＮＡの５’末端領域に相補的な配列を含む複数の第１のｃＤＮＡ鎖を選択的に回収する第１のステップと、第１のステップで回収された第１のｃＤＮＡ鎖のフラグメントを得る第２のステップと、前記ｍＲＮＡの５’末端領域に少なくとも相補的な配列を含むフラグメントを選択的に回収する第３のステップと、回収されたフラグメントを個別にライゲーションするかコンカテマーの形態でライゲーションする第４のステップとを含む、サンプル中の複数のｍＲＮＡの５’末端領域のヌクレオチド配列に関する複数の核酸フラグメントのコンカテマーを調製する方法を提供する。   A first step of selectively recovering a plurality of first cDNA strands comprising a sequence complementary to the 5 ′ end region of mRNA from cDNA formed using mRNA present in a sample as a template; A second step of obtaining a fragment of the first cDNA strand recovered in the first step, and a third step of selectively recovering a fragment containing a sequence at least complementary to the 5 ′ end region of the mRNA Preparing a plurality of nucleic acid fragment concatamers relating to the nucleotide sequence of the 5 ′ terminal region of the plurality of mRNAs in the sample, comprising ligating the recovered fragments individually or in the form of a concatamer. Provide a method.

本発明は、さらに、全長ｃＤＮＡのフラグメントを得る第１のステップと、前記ｍＲＮＡの５’末端領域に少なくとも相補的な配列を含むフラグメントを選択的に回収する第２のステップと、回収されたフラグメントをライゲーションしてコンカテマーを形成する第３のステップとを含む、サンプル中の複数のｍＲＮＡの５’末端領域のヌクレオチド配列に関連する複数の核酸フラグメントのコンカテマーを調製する方法を提供する。なおさらに、本発明により、クローニングおよび配列決定前に５’末端配列の断片化または単離が可能である。このような場合、第１のｃＤＮＡ鎖を、生物学的または人為的な複数の核酸を保持するドライバーを使用したサブトラクティブハイブリダイゼーションによって選択することができる。本発明を、発現の異なる遺伝子の同定に使用することができる。   The present invention further includes a first step of obtaining a full-length cDNA fragment, a second step of selectively recovering a fragment containing a sequence at least complementary to the 5 ′ end region of the mRNA, and the recovered fragment. A third step of ligating to form a concatamer, and a method of preparing a concatamer of a plurality of nucleic acid fragments related to the nucleotide sequence of the 5 ′ end region of a plurality of mRNAs in a sample. Still further, the present invention allows for fragmentation or isolation of the 5 'end sequence prior to cloning and sequencing. In such cases, the first cDNA strand can be selected by subtractive hybridization using a driver that holds a plurality of biological or artificial nucleic acids. The present invention can be used to identify genes with different expression.

本発明はまた、本発明の方法によって調製されたコンカテマーの配列決定による複数のｍＲＮＡの５’末端領域のヌクレオチド配列を決定する方法を提供する。本発明で示すように、非常に多数の５’末端配列タグに関する情報を得るためのコンカテマーの使用により、転写開始部位および関連するプロモーター配列を有効にマッピングすることが可能である。   The present invention also provides a method for determining the nucleotide sequence of the 5 'terminal region of a plurality of mRNAs by sequencing concatamers prepared by the method of the present invention. As shown in the present invention, it is possible to effectively map the transcription start site and associated promoter sequence by using concatamers to obtain information on a large number of 5 'terminal sequence tags.

本発明は、なおさらに、本発明の方法によって調製されたコンカテマーを提供する。本発明は、なおさらに、本発明のコンカテマーを含むベクターを提供する。本発明は、なおさらに、本発明にしたがって調製したコンカテマー由来の配列タグを提供する。本発明は、なおさらに、複数のＲＮＡサンプルの成分を分析するためのコンカテマー由来の配列の使用手段を提供する。本発明は、なおさらに、遺伝子調節および遺伝子発現に必要なゲノム中の領域を同定するためのコンカテマー由来の配列の使用手段を提供する。   The present invention still further provides concatamers prepared by the method of the present invention. The present invention still further provides a vector comprising the concatamer of the present invention. The present invention still further provides concatamer-derived sequence tags prepared according to the present invention. The present invention still further provides a means for using concatemer derived sequences to analyze components of a plurality of RNA samples. The present invention still further provides a means of using concatamer derived sequences to identify regions in the genome that are required for gene regulation and gene expression.

本発明は５’末端の配列決定のためのコンカテマーの使用に制限されず、本明細書中に開示の５’末端の富化およびそのクローニングのための特定のステップの修正形態により、特異的５’末端をそれぞれ配列決定することができる。本発明のこのような実施形態は、固体マトリクスに特異的に結合するリンカーを使用する第１および第２のステップの修正形態を含む。次いで、支持体に結合したｃＤＮＡを使用して、配列決定反応物を調製する。   The present invention is not limited to the use of concatamers for sequencing at the 5 ′ end, and the specific 5 ′ end enrichment disclosed herein and the specific step modifications for its cloning allow specific 5 'The ends can be sequenced individually. Such embodiments of the invention include modifications of the first and second steps that use linkers that specifically bind to a solid matrix. The sequencing reaction is then prepared using the cDNA bound to the support.

上記のように、本発明の方法は、それぞれのステップがさらに複数のステップを含むおよそ３ステップを含み得るがこれらに限定されない。各ステップを以下で説明する。各ステップの具体的な作業例を、下記の作業例で詳述する。   As described above, the method of the present invention can include, but is not limited to, approximately three steps, each step further including a plurality of steps. Each step is described below. A specific work example of each step will be described in detail in the following work example.

＜ステップ１＞
ステップ１は、サンプル中のｍＲＮＡの５’末端に対応する部位を含むｃＤＮＡを選択的に回収することである。ｃＤＮＡを、例えば、テンプレートとしてｍＲＮＡの使用によって合成することができる。 <Step 1>
Step 1 is to selectively recover cDNA containing a site corresponding to the 5 ′ end of mRNA in the sample. cDNA can be synthesized, for example, by using mRNA as a template.

所望の細胞、組織、または生物から採取した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかを出発物質として使用することができる。全ＲＮＡおよびｍＲＮＡの調製方法は既に公知であり、後述の作業例にも記載されている。あるいは、そのインサートの５’末端付近にクラスＩＩＳまたはクラスＩＩＩ酵素の認識部位を保有する場合、ｃＤＮＡライブラリー自体を切断することができる。   Either total RNA or mRNA taken from the desired cell, tissue, or organism can be used as the starting material. Methods for preparing total RNA and mRNA are already known and are described in the working examples described below. Alternatively, the cDNA library itself can be cleaved if it possesses a recognition site for a class IIS or class III enzyme near the 5 'end of the insert.

また、全長ｃＤＮＡライブラリーを使用して、遺伝子の転写部分の５’末端に対応する５’末端核酸を単離することができる。   A full-length cDNA library can also be used to isolate a 5 'terminal nucleic acid corresponding to the 5' end of the transcribed portion of the gene.

ステップ１自体を、公知の方法によって実施することができる。言い換えれば、全長ｃＤＮＡの構築方法および少なくともｍＲＮＡの５’末端に対応する部位を含むｃＤＮＡフラグメントの合成方法が既に公知であり、任意のこれらの方法を適用することができる。好ましい方法の１つは、キャップトラッパー法である（例えば、Ｐｉｅｒｏ Ｃａｒｎｉｎｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３０３，ｐｐ．１９−４４，１９９９）。このキャップトラッパー法を以下に説明する；しかし、本発明は、キャップトラッパー法の使用に制限されず、全長ｃＤＮＡの他の富化または選択アプローチを同様に適用することができる。   Step 1 itself can be carried out by known methods. In other words, a method for constructing full-length cDNA and a method for synthesizing a cDNA fragment containing at least a site corresponding to the 5 'end of mRNA are already known, and any of these methods can be applied. One preferred method is the cap trapper method (eg, Piero Carinci et al., Methods in Enzymology, Vol. 303, pp. 19-44, 1999). This cap trapper method is described below; however, the present invention is not limited to the use of the cap trapper method, and other enrichment or selection approaches for full length cDNA can be applied as well.

キャップトラッパー法は、最初に、テンプレートとしてＲＮＡを使用し、逆転写酵素を使用して第１のｃＤＮＡ鎖を合成する。公知の方法によってこれを行うことができる。ｃＤＮＡをオリゴｄＴプライマーを使用して開始することができ、テンプレートＲＮＡがｍＲＮＡである場合、ランダムプライマーを使用してこれを開始することができる。逆転写酵素の安定化によって逆転写反応効率を高めるので、反応溶液にトレハロースを添加することが望ましい（米国特許第６，０１３，４８８号）。いくつかの制限酵素での内部ｃＤＮＡ切断を回避し、且つ制限酵素での意図しない広範な切断を回避するので、標準的なｄＣＴＰの代わりに５−メチル−ｄＣＴＰを使用することが好ましい。さらに、第１のｃＤＮＡ鎖合成後、タンパク質および消化ペプチドをＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）処理または他のより一般的なｃＤＮＡ精製方法によって除去することができる。   The cap trapper method first synthesizes a first cDNA strand using reverse transcriptase using RNA as a template. This can be done by known methods. The cDNA can be initiated using oligo dT primers, and if the template RNA is mRNA, it can be initiated using random primers. It is desirable to add trehalose to the reaction solution because the reverse transcriptase efficiency is increased by stabilizing the reverse transcriptase (US Pat. No. 6,013,488). It is preferred to use 5-methyl-dCTP instead of standard dCTP, as it avoids internal cDNA cleavage with some restriction enzymes and avoids unintentional extensive cleavage with restriction enzymes. Furthermore, after the first cDNA strand synthesis, proteins and digested peptides can be removed by CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) treatment or other more general cDNA purification methods.

次に、選択的結合物質を、ｍＲＮＡのキャップ構造に結合する。本明細書中の「選択的結合物質」は、特定の物質に選択的に結合する物質を意味する。このような選択的結合物質には、好ましくはビオチンが含まれるが、ビオチンに限定されない。キャップ構造は、ｍＲＮＡの５’末端の構造であるが、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）またはリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）には見られないので、ｍＲＮＡ分子を特異的に選択可能である。したがって、全ＲＮＡを出発物質として使用する場合でさえ、選択的結合物質のみがｍＲＮＡに結合する。さらに、５’末端のキャップ構造が喪失した場合、選択的結合物質はｍＲＮＡに結合しない。公知の方法によってビオチンをキャップ構造に結合させることができる。例えば、キャップ構造を、ＮａＩＯ₄などの酸化剤でのｍＲＮＡの処理およびビオチンヒドラジドでの反応によるキャップ構造内のジオール基の最初の酸化によってビオチン化することができる。 Next, a selective binding substance is bound to the cap structure of the mRNA. As used herein, “selective binding substance” means a substance that selectively binds to a specific substance. Such selective binding substances preferably include biotin, but are not limited to biotin. The cap structure is a structure at the 5 ′ end of mRNA, but is not found in transfer RNA (tRNA) or ribosomal RNA (rRNA), so that an mRNA molecule can be specifically selected. Thus, even when total RNA is used as a starting material, only selective binding substances bind to mRNA. Furthermore, if the 5 ′ end cap structure is lost, the selective binding agent will not bind to the mRNA. Biotin can be bound to the cap structure by known methods. For example, a cap structure can be biotinylated by treatment of mRNA with an oxidizing agent such as NaIO ₄ and initial oxidation of diol groups within the cap structure by reaction with biotin hydrazide.

一本鎖ＲＮＡを、ＲＮアーゼＩ処理などの手段によって切断する。一本鎖ＲＮＡを切断することができるがｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを切断できない任意の他のＲＮアーゼまたは種々の特異性を有する種々の一本鎖ＲＮＡ配列を切断することができるＲＮアーゼのカクテルを代わりに使用することができる。第１のｃＤＮＡ鎖がＲＮＡの５’末端に対応する部位に伸張されたｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドでは、ＲＮＡの５’末端周辺は、ｃＤＮＡとハイブリッド形成できないために一本鎖である。したがって、一本鎖部分でハイブリッドを切断して、このステップによりそのキャップ構造が喪失する。したがって、このステップにより、キャップ構造を維持するためにｍＲＮＡの５’末端を完全に伸長するｃＤＮＡを有するこれらのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドのみが遊離される。   Single-stranded RNA is cleaved by means such as RNase I treatment. Instead of any other RNase that can cleave single-stranded RNA but cannot cleave cDNA / RNA hybrids or a cocktail of RNases that can cleave various single-stranded RNA sequences with different specificities Can be used for In a cDNA / RNA hybrid in which the first cDNA strand is extended to a site corresponding to the 5 'end of RNA, the periphery of the 5' end of RNA is single-stranded because it cannot hybridize with cDNA. Therefore, the hybrid is cleaved at the single-stranded portion, and this cap loses its cap structure. Thus, this step releases only those mRNA / cDNA hybrids that have cDNA that fully extends the 5 'end of the mRNA to maintain the cap structure.

上記選択的結合物質と選択的に結合する支持体に固定したマッチする選択的結合物質を調製する。本明細書では、「マッチする選択的結合物質」は、上記選択的結合物質に選択的に結合する物質を意味し、選択的結合物質がビオチンの場合、ビオチンまたはその誘導体に特異的に結合するアビジン、ストレプトアビジン、またはその誘導体である。支持体は、磁性ビーズ、特に磁性多孔質ガラスビーズであることが好ましいが、これらに限定されない。ストレプトアビジンが固定された磁性多孔質ガラスビーズは市販されているので、このような市販のストレプトアビジンコーティング磁性多孔質ガラスビーズを使用することができる。同様に、多孔質ガラスビーズの代わりにラテックスビーズ、ラテックス磁性ビーズ、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、またはセファロースビーズなどの他の材料を使用することができる。さらに、本発明は、ビオチン−アビジン系の使用に限定されないが、キャップ構造に結合するジゴキシゲニンタグおよび固体マトリクスに結合した抗体を認識するジゴキシゲニンなどの他の結合物質を使用することができる。   A matching selective binding substance immobilized on a support that selectively binds to the selective binding substance is prepared. As used herein, “matching selective binding substance” means a substance that selectively binds to the selective binding substance. When the selective binding substance is biotin, it specifically binds to biotin or a derivative thereof. Avidin, streptavidin, or a derivative thereof. The support is preferably magnetic beads, particularly magnetic porous glass beads, but is not limited thereto. Since magnetic porous glass beads to which streptavidin is immobilized are commercially available, such commercially available streptavidin-coated magnetic porous glass beads can be used. Similarly, other materials such as latex beads, latex magnetic beads, agarose beads, polystyrene beads, or sepharose beads can be used instead of porous glass beads. Furthermore, the present invention is not limited to the use of the biotin-avidin system, but other binding substances such as digoxigenin tag that binds to the cap structure and digoxigenin that recognizes the antibody bound to the solid matrix can be used.

これにしたがって、キャップ構造上の選択的結合物質を支持体上のマッチする選択的結合物質に結合させ、それによりｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを支持体上のキャップ構造に固定するために、キャップ構造を有する上記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを支持体に固定された上記のマッチする選択的結合物質と反応させる。支持体として磁性ビーズを使用する場合、磁力の印加によって磁性ビーズを迅速に回収することができる。一方、支持体への非特異的結合を防止するために、この反応前のこのような結合を遮断するために支持体を大過剰のＤＮＡを含まないｔＲＮＡで処理することが好ましい。表面の遮断に適切な他の物質は、核酸または誘導体（例えば、全ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド）；タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）；多糖（例えば、グリコーゲン、硫酸デキストラン、ヘパリン、または他の多糖）である。上記の一部を含むハイブリッド分子を使用して、非特異的結合部位をマスクすることができる。   In accordance with this, it has a cap structure to bind the selective binding substance on the cap structure to the matching selective binding substance on the support, thereby immobilizing the mRNA / cDNA hybrid to the cap structure on the support. The mRNA / cDNA hybrid is reacted with the matching selective binding substance immobilized on a support. When magnetic beads are used as the support, the magnetic beads can be quickly recovered by applying a magnetic force. On the other hand, in order to prevent non-specific binding to the support, it is preferable to treat the support with a tRNA that does not contain a large excess of DNA in order to block such binding prior to this reaction. Other substances suitable for surface blocking are nucleic acids or derivatives (eg, total RNA or oligonucleotides); proteins (eg, bovine serum albumin); polysaccharides (eg, glycogen, dextran sulfate, heparin, or other polysaccharides). is there. Hybrid molecules containing a portion of the above can be used to mask non-specific binding sites.

上記はキャップトラッパー法によってステップ１を行う場合について注目しているが、ｍＲＮＡの５’末端に相補的な部位を含むｃＤＮＡを選択的に回収することができる限り、他の方法も使用することができる。   The above focuses on the case where Step 1 is performed by the cap trapper method, but other methods may be used as long as cDNA containing a complementary site at the 5 ′ end of mRNA can be selectively recovered. it can.

キャップ選択の代わりに、ｍＲＮＡの５’末端をＢＡＰ（細菌アルカリホスファターゼ）などのホスファターゼで脱リン酸化し、その後脱キャップ酵素ＴＡＰ（タバコ酸性ピロホスファターゼ）で処理することができる。その後、ＲＮＡリガーゼを用いて、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを元のキャップ構造の代わりにｍＲＮＡの５’末端に結合することができる（Ｍａｒｕｙａｍａ Ｋ，Ｓｕｇａｎｏ Ｓ Ｇｅｎｅ １３８，１７１−４（１９９４））。この方法では、例えば、クラスＩＩまたはクラスＩＩＩ認識部位をｃＤＮＡまたはＲＮＡの５’末端に存在するライゲーションステップ時に使用したオリゴヌクレオチド配列またはリボヌクレオチド配列中に位置付けることができる。次いで、このクラスＩＩまたはクラスＩＩＩ認識酵素を使用して、ｃＤＮＡを切断し、５’末端タグを産生することができる。   As an alternative to cap selection, the 5 'end of the mRNA can be dephosphorylated with a phosphatase such as BAP (bacterial alkaline phosphatase) and then treated with the decap enzyme TAP (tobacco acid pyrophosphatase). RNA ligase can then be used to attach ribonucleotides or deoxyribonucleotides to the 5 'end of the mRNA instead of the original cap structure (Maruyama K, Sugano S Gene 138, 171-4 (1994)). In this method, for example, a class II or class III recognition site can be located in the oligonucleotide or ribonucleotide sequence used during the ligation step present at the 5 'end of the cDNA or RNA. This class II or class III recognition enzyme can then be used to cleave the cDNA and produce a 5 'end tag.

ビオチンの代わりに、キャップ結合タンパク質（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９５ １５：３３６３−７１；Ｅｄｅｒｙ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９５ Ｊｕｎ；１５（６）：３３６３−７１）またはキャップ構造に特異的に結合する抗体（Ｔｈｅｉｓｓｅｎ Ｈ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９８６ Ｄｅｃ １；５（１２）：３２０９−１７）を、上記の選択的結合物質として使用することができる。   Specific to cap binding protein (Pelletier et al. Mol Cell Biol 1995 15: 3363-71; Edery I. et al., Mol Cell Biol 1995 Jun; 15 (6): 3363-71) or cap structure instead of biotin Binding antibodies (Theissen H et al. EMBO J. 1986 Dec 1; 5 (12): 3209-17) can be used as the selective binding agents described above.

あるいは、Ｇｅｎｓｅｔに記載のように、オリゴヌクレオチドをキャップ構造に化学的に結合する方法を使用することができる。この方法は、キャップ構造の酸化に基づく（米国特許第６，０２２，７１５号）。これにより、（１）クラスＩＩＳまたはクラスＩＩＩ認識酵素の認識部位を含み得るオリゴヌクレオチドにキャップを付加し、（２）第１のｃＤＮＡ鎖を調製し、その後第２のｃＤＮＡ鎖合成に変換することが可能である。   Alternatively, methods can be used where the oligonucleotide is chemically attached to the cap structure as described in Genset. This method is based on oxidation of the cap structure (US Pat. No. 6,022,715). Thereby, (1) adding a cap to an oligonucleotide that may contain a recognition site for a class IIS or class III recognition enzyme, and (2) preparing a first cDNA strand and then converting it to a second cDNA strand synthesis. Is possible.

あるいは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈに記載のようにキャップスイッチ法を使用することができる（米国特許第５，９６２，２７２号）。クラスＩＩＳまたはクラスＩＩＩ認識酵素を使用することができるように、核酸を認識して認識配列からはなれて切断することができる物質の認識部位を保有するキャップスイッチオリゴヌクレオチドの存在下で第１のｃＤＮＡ鎖を調整することができる。キャップスイッチ機構は、第１の鎖の合成をキャップスイッチオリゴヌクレオチド上で継続させる。第２のｃＤＮＡ鎖によってこれを継続し、その後例えばＳＭＡＲＴ（商標）Ｃｌｏｎｔｅｃｈクローニングシステムに記載のＰＣＲステップを行うことができる。   Alternatively, the cap switch method can be used as described in Clontech (US Pat. No. 5,962,272). The first cDNA in the presence of a cap switch oligonucleotide carrying a recognition site for a substance capable of recognizing and cleaving off the recognition sequence so that a class IIS or class III recognition enzyme can be used. The chain can be adjusted. The cap switch mechanism continues the synthesis of the first strand on the cap switch oligonucleotide. This can be continued with a second cDNA strand, followed by the PCR step described, for example, in the SMART ™ Clontech cloning system.

別の実施形態では、ＲＮＡの質に依存して、ランダムプライミングおよびキャップ構造までのｃＤＮＡの伸長により、５’末端を使用することができる。特定の酵素および反応条件により、高い効率でキャップ部位に達する場合がある（Ｃａｒｎｉｎｃｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００２）。キャップ選択を用いない場合でさえも、キャップ構造の代わりにその後コンカテマーの産生に使用されるクラスＩＩＳまたはクラスＩＩＩ認識酵素部位を保有するオリゴヌクレオチドに結合することが可能である。   In another embodiment, depending on the quality of the RNA, the 5 'end can be used by random priming and extension of the cDNA to a cap structure. Depending on the specific enzyme and reaction conditions, the cap site may be reached with high efficiency (Carninci et al, Biotechniques, 2002). Even without cap selection, it is possible to bind to an oligonucleotide carrying a class IIS or class III recognition enzyme site that is then used for the production of concatemers instead of the cap structure.

最後に、ｃＤＮＡをクラスＩＩ（クラスＩＩＳまたはクラスＩＩＧ）またはクラスＩＩＩ制限酵素で切断して５’末端タグを産生することができる。その後のコンカテマーの形成で５’末端タグを使用する。機械的切断を含む任意の他の方法をおそらく使用することができる。   Finally, the cDNA can be cleaved with class II (class IIS or class IIG) or class III restriction enzymes to produce 5 'end tags. The 5 'end tag is used in subsequent concatamer formation. Any other method including mechanical cutting can possibly be used.

図１は、本発明の作業の流れの例をまとめている。
図１によれば、本発明の方法を行うために、転写領域の５’末端を、複数のＲＮＡ分子もしくは全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ画分を富化した複数のＲＮＡ分子、または全長ｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。 FIG. 1 summarizes an example of the work flow of the present invention.
According to FIG. 1, in order to carry out the method of the present invention, the 5 ′ end of the transcription region is isolated from a plurality of RNA molecules or total RNA, a plurality of RNA molecules enriched in mRNA fraction, or a full-length cDNA library. Can be separated.

複数の全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ分子に本方法を適用する場合、相補ｃＤＮＡ鎖を合成するためのテンプレートとしてｍＲＮＡ分子を使用することができる。転写領域の５’末端を含むｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを富化するために、ｃＤＮＡ鎖を選択ステップに供する。アルカリでの加水分解によるｍＲＮＡ部分の除去または破壊後、転写領域の５’末端を含む第１のｃＤＮＡ鎖プールを調製する。   When this method is applied to a plurality of total RNA or mRNA molecules, the mRNA molecule can be used as a template for synthesizing a complementary cDNA strand. In order to enrich for mRNA / cDNA hybrids containing the 5 'end of the transcribed region, the cDNA strand is subjected to a selection step. After removal or destruction of the mRNA portion by alkaline hydrolysis, a first cDNA strand pool containing the 5 'end of the transcribed region is prepared.

本発明の異なる実施形態では、全長ｃＤＮＡライブラリーを使用して、ｃＤＮＡクローンの５’末端を含むＲＮＡプールを調製することができる。次いで、テンプレートとして上記ＲＮＡプールを使用して一本鎖ｃＤＮＡプールを合成する。アルカリでの加水分解によるＲＮＡ分子の除去または破壊後に第１のｃＤＮＡ鎖の一部が得られ、得られた第１のｃＤＮＡ鎖プールは、転写領域の５’末端を含む。転写領域は、本発明のさらなる処理に利用可能である。全長ｃＤＮＡライブラリーから出発する場合、５’末端の選択は必要ないことに留意のこと。   In different embodiments of the invention, a full-length cDNA library can be used to prepare an RNA pool containing the 5 'end of a cDNA clone. A single stranded cDNA pool is then synthesized using the RNA pool as a template. A portion of the first cDNA strand is obtained after removal or destruction of the RNA molecule by alkaline hydrolysis, and the resulting first cDNA strand pool contains the 5 'end of the transcribed region. The transfer region can be used for further processing of the present invention. Note that when starting from a full length cDNA library, selection of the 5 'end is not necessary.

＜ステップ２＞
ステップ１に続いて、少なくともｍＲＮＡの５’末端に相補的な部位を含むｃＤＮＡを含むフラグメントを選択的に回収するためにステップ２を行う。 <Step 2>
Subsequent to step 1, step 2 is performed to selectively recover a fragment containing cDNA comprising a site complementary to at least the 5 ′ end of the mRNA.

上記キャップトラッパー法を使用する場合、支持体上に固定した第１のｃＤＮＡ鎖を遊離する。水酸化ナトリウムなどのアルカリでの支持体の処理によってこれを行うことができる。アルカリの代わりに、ＲＮアーゼＨ（ＤＮＡとハイブリッド形成したＲＮＡのみを切断する）での酵素反応を使用することができる。アルカリ処理により、ｍＲＮＡ上にキャップを介して支持体に結合したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドからｃＤＮＡが放出され、ｍＲＮＡからｃＤＮＡが分離されて第１のｃＤＮＡ鎖自体のみが遊離する。   When the cap trapper method is used, the first cDNA strand fixed on the support is released. This can be done by treatment of the support with an alkali such as sodium hydroxide. Instead of alkali, an enzymatic reaction with RNase H (which only cleaves RNA hybridized with DNA) can be used. By the alkali treatment, cDNA is released from the mRNA / cDNA hybrid bound to the support via a cap on the mRNA, the cDNA is separated from the mRNA, and only the first cDNA strand itself is released.

次いで、認識配列の外側の認識されたＤＮＡを切断する酵素活性を有する物質によって、リンカーを配列特異的様式で認識される配列を保持するｃＤＮＡに付加する。このような物質は、一定のクラスＩＩおよびクラスＩＩＩ制限酵素が含まれるが、これらに限定されない。   A linker is then added to the cDNA carrying the sequence recognized in a sequence specific manner by a substance having enzymatic activity that cleaves the recognized DNA outside the recognition sequence. Such materials include, but are not limited to, certain class II and class III restriction enzymes.

この実施形態では、少なくともクラスＩＩＳまたはクラスＩＩＩ制限酵素部位および３’末端にランダムオリゴマー部分を保有するリンカーを、上記ｍＲＮＡの５’末端に対応するこの第１のｃＤＮＡ鎖の末端（すなわち、ｃＤＮＡの３’末端）にライゲーションする。その後の５’末端配列タグのコンカテマーへのクローニングのために、第２の認識部位をリンカーに導入することが好ましいが、必須ではない。第２の認識部位は、例えば、クラスＩＩＳまたはクラスＩＩＩ認識酵素に使用する上記認識部位と異なるべきである。   In this embodiment, a linker carrying at least a class IIS or class III restriction enzyme site and a random oligomer moiety at the 3 ′ end is attached to the end of this first cDNA strand corresponding to the 5 ′ end of the mRNA (ie, the cDNA Ligated to the 3 ′ end. It is preferred but not essential to introduce a second recognition site into the linker for subsequent cloning of the 5 'terminal sequence tag into the concatemer. The second recognition site should be different from the recognition site used, for example, for class IIS or class III recognition enzymes.

好ましくは、クラスＩＩＳまたはクラスＩＩＩ認識酵素部位およびランダムオリゴマー部分を保有するリンカーを使用してこれを行うことができる（ＳＳＬＬＭ（一本鎖リンカーライゲーション法）、Ｙ．Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．６，ｐｐ．１２５０−１２５４，（２００１））。クラスＩＩＳおよびクラスＩＩＩ制限酵素は、認識部位以外の部分を切断する制限酵素群である。クラスＩＩＳ制限酵素の例には、ＧｓｕＩの使用が含まれるが、これらに限定されない。ＧｓｕＩ処理により、認識部位から１６ｂｐ下流の鎖および認識部位から１４ｂｐ下流の他の鎖の１つが切断される。別の適切な例は、その認識配列からそれぞれ２０塩基および１８塩基離れて切断するＭｍｅＩである。クラスＩＩＩ制限酵素の例には、その認識部位からそれぞれ２５ｂｐおよび２７ｂｐ離れて切断するＥｃｏＰ１５１が含まれるが、これらに限定されない。ランダムオリゴマー部分は、リンカーの３’末端に存在し、塩基数は特に制限されないが、推奨数は５〜９個、より好ましくは５〜６個である。クラスＩＩＳまたはクラスＩＩＩ制限酵素部位は、切断点がｃＤＮＡ内となるように上記ランダムオリゴマー部分付近に存在すべきである。好ましくは、リンカーは、上記ランダムオリゴマー部分が３’末端に突き出して結合末端が得られる二本鎖ＤＮＡのリンカーであるべきである。さらに、その後の回収を促進する前にリンカーにビオチンなどの選択的結合物質を結合させることが望ましい。   Preferably, this can be done using a linker carrying a class IIS or class III recognition enzyme site and a random oligomer moiety (SSLLM (single-stranded linker ligation method), Y. Shibata et al., BioTechniques, Vol. .30, No. 6, pp. 1250-1254, (2001)). Class IIS and class III restriction enzymes are a group of restriction enzymes that cleave a portion other than the recognition site. Examples of class IIS restriction enzymes include, but are not limited to, the use of GsuI. By GsuI treatment, one of the strand 16 bp downstream from the recognition site and the other strand 14 bp downstream from the recognition site is cleaved. Another suitable example is MmeI which cleaves 20 and 18 bases from its recognition sequence, respectively. Examples of class III restriction enzymes include, but are not limited to, EcoP151 that cleaves 25 bp and 27 bp away from its recognition site, respectively. The random oligomer moiety is present at the 3 'end of the linker, and the number of bases is not particularly limited, but the recommended number is 5 to 9, more preferably 5 to 6. A class IIS or class III restriction enzyme site should be present near the random oligomer portion so that the breakpoint is within the cDNA. Preferably, the linker should be a double-stranded DNA linker in which the random oligomer moiety projects to the 3 'end to give a binding end. Furthermore, it is desirable to bind a selective binding substance such as biotin to the linker before facilitating subsequent recovery.

上記の第１のｃＤＮＡ鎖をこのようなリンカーと反応させる場合、リンカーのランダムオリゴマー部分は第１のｃＤＮＡ鎖の３’末端（すなわち、テンプレートｍＲＮＡの５’末端）とハイブリッド形成する。次に、プライマーとしてこのリンカーを使用し、且つテンプレートとして第１のｃＤＮＡ鎖を使用することによって第２のｃＤＮＡ鎖を合成する。標準的な方法によってこのステップを行うことができる。本発明の異なる実施形態では、複数の核酸に対するハイブリッド形成およびその後の一本鎖および二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの物理的分離によって第１のｃＤＮＡ鎖を除去することができる。米国特許出願第２００２０１０６６６６号に開示の方法（この方法に限定するものではない）によってこのような除去ステップを行うことができる。除去ステップを省略した上記アプローチに類似した標準的な手順による第２の鎖の合成用テンプレートとして除去ステップから回収した一本鎖ｃＤＮＡを使用する。   When the first cDNA strand is reacted with such a linker, the random oligomer portion of the linker hybridizes with the 3 'end of the first cDNA strand (ie, the 5' end of the template mRNA). A second cDNA strand is then synthesized by using this linker as a primer and using the first cDNA strand as a template. This step can be performed by standard methods. In different embodiments of the invention, the first cDNA strand can be removed by hybridization to multiple nucleic acids followed by physical separation of single and double stranded DNA-DNA or DNA-RNA hybrids. Such a removal step can be performed by the method disclosed in US Patent Application No. 200201006666, which is not limited to this method. The single stranded cDNA recovered from the removal step is used as a template for second strand synthesis by a standard procedure similar to the above approach, omitting the removal step.

次いで、得られた二本鎖ｃＤＮＡを、上記クラスＩＩＳまたはクラスＩＩＩ制限酵素で処理する。このステップでは、リンカー由来の部分およびｃＤＮＡの５’末端由来の部分（第２のｃＤＮＡ鎖の５’末端）を含む二本鎖ｃＤＮＡフラグメントを調製する。例として、ＧｓｕＩをクラスＩＩＳ制限酵素として使用する場合および上記ランダムオリゴマー部位からすぐ上流に制限部位を位置付けるようにリンカーをデザインする場合、得られたＤＮＡフラグメントは、長さが１６ｂｐ（しかし、相補鎖は１４ｂｐである）の第２のＤＮＡ鎖の５’末端上の部位（すなわち、ｍＲＮＡの５’末端上の部位）由来の部位を含む。ＭｍｅＩを使用する場合、第２のＤＮＡ鎖フラグメントの長さは、それぞれ２０ｂｐおよび１８ｂｐに増加し、ＥｃｏＰ１５Ｉの場合、それぞれ２５ｂｐおよび２７ｂｐに増加する。   Next, the obtained double-stranded cDNA is treated with the above class IIS or class III restriction enzyme. In this step, a double-stranded cDNA fragment is prepared that includes a linker-derived portion and a portion from the 5 'end of the cDNA (5' end of the second cDNA strand). As an example, when GsuI is used as a class IIS restriction enzyme and when the linker is designed to position the restriction site immediately upstream from the random oligomer site, the resulting DNA fragment is 16 bp in length (but complementary strand). Contains a site from the site on the 5 ′ end of the second DNA strand (ie, the site on the 5 ′ end of the mRNA). When using MmeI, the length of the second DNA strand fragment increases to 20 bp and 18 bp, respectively, and with EcoP15I increases to 25 bp and 27 bp, respectively.

次に、このようなＤＮＡフラグメントを選択的に回収する。選択的結合物質（例えば、ビオチン）が上記のリンカーに結合している場合、マッチする選択的結合物質（例えば、ストレプトアビジン）を固定した支持体の使用によってステップ１と同様に回収することができる。この手順によりステップ２を終了し、少なくとも上記ｍＲＮＡの５’末端に相補的な部位を含む第１のｃＤＮＡ鎖に属するｃＤＮＡ部位を含むフラグメントを選択的に回収する。   Next, such DNA fragments are selectively recovered. When a selective binding substance (for example, biotin) is bound to the above linker, it can be recovered in the same manner as in Step 1 by using a support on which a matching selective binding substance (for example, streptavidin) is immobilized. . Step 2 is completed by this procedure, and a fragment containing a cDNA site belonging to the first cDNA strand containing at least a site complementary to the 5 'end of the mRNA is selectively recovered.

上記はステップ２のためにＳＳＬＬＭを使用する場合について説明しているが、第１のｃＤＮＡ鎖の３’末端（テンプレートｍＲＮＡの５’末端）を含むフラグメントを選択的に回収することができる限り、任意の他の方法によってもステップ２を実施することができる。例えば、制御された速度にて５’→３’方向でヌクレオチドを切断するエキソヌクレアーゼを使用することが可能である。所定の時間の第１のｃＤＮＡ鎖のエキソヌクレアーゼ処理により、第１のｃＤＮＡ鎖の３’末端（テンプレートｍＲＮＡの５’末端）を含む一本鎖フラグメントが遊離する。二本鎖フラグメントのみを分割するヌクレアーゼでの処理によりターゲティングした一本鎖フラグメントのみを得ることが可能である。これらのフラグメントを回収し、アダプターと連結し、クローン化することができる。   The above describes the case of using SSLLM for Step 2, but as long as the fragment containing the 3 ′ end of the first cDNA strand (5 ′ end of the template mRNA) can be selectively recovered, Step 2 can be performed by any other method. For example, it is possible to use an exonuclease that cleaves nucleotides in the 5 'to 3' direction at a controlled rate. By exonuclease treatment of the first cDNA strand for a predetermined time, a single-stranded fragment containing the 3 'end of the first cDNA strand (5' end of the template mRNA) is released. It is possible to obtain only targeted single-stranded fragments by treatment with a nuclease that splits only double-stranded fragments. These fragments can be recovered, ligated with adapters, and cloned.

５’末端に対応する上記の選択されたフラグメントを、リンカーにさらにライゲーションし、その後質がクローニングなどの以後の適用に不十分である場合、ＰＣＲ増幅のために使用することができる。   The above selected fragment corresponding to the 5 'end can be further ligated to a linker and used for PCR amplification if the quality is insufficient for subsequent applications such as cloning.

１つの実施形態では、ｍＲＮＡの５’部分に対応するフラグメントを、３’末端で、第１のリンカーで使用した制限部位と異なり得る別の制限酵素部位のみを含むリンカーにライゲーションする。その後、ｍＲＮＡの５’末端に対応するフラグメントは、両側に制限酵素の制限部位を保有するリンカーを含む。このようなフラグメントを、ＰＣＲによって増幅し、その後１つまたは２つの制限酵素で切断して以下により詳細に記載したコンカテマーのクローニングに適切なＤＮＡフラグメントを産生することができる。   In one embodiment, a fragment corresponding to the 5 'portion of the mRNA is ligated to a linker that contains only another restriction enzyme site at the 3' end that may differ from the restriction site used in the first linker. The fragment corresponding to the 5 'end of the mRNA then contains a linker carrying restriction enzyme restriction sites on both sides. Such fragments can be amplified by PCR and then cleaved with one or two restriction enzymes to produce DNA fragments suitable for cloning the concatamers described in more detail below.

（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ，１９９５）に類似した別の実施形態では、上記ＤＮＡフラグメントまたはＰＣＲ産物を、最初に、互いに反対方向にライゲーションされた２つの５’末端特異的フラグメントから構成される二量体分子の形成に使用する。次いで、これらの二量体を、直接または別のＰＣＲ増幅直後に使用して、以下により詳細に特定したコンカテマーを産生することができる。   In another embodiment similar to (Velculescu et al, 1995), the DNA fragment or PCR product is first composed of two 5 'end-specific fragments ligated in opposite directions to each other. Used to form. These dimers can then be used directly or immediately after another PCR amplification to produce the concatamers specified in more detail below.

本発明のまさに別の実施形態では、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの代わりに、ＲＮＡポリメラーゼは、両末端に適切なリンカーを有する５’末端に対応するフラグメントを一次的に増幅することができる。次いで、逆転写酵素ステップによってＤＮＡフラグメントを再構築し、第２の鎖を形成してコンカテマーを形成する。   In just another embodiment of the invention, instead of PCR amplified DNA, RNA polymerase can primarily amplify a fragment corresponding to the 5 'end with appropriate linkers at both ends. The DNA fragment is then reassembled by a reverse transcriptase step to form a second strand to form a concatamer.

＜ステップ３＞
その後のステップ３は、回収したフラグメントの相互ライゲーションによってコンカテマーを形成する。複数のｍＲＮＡが存在し、且つリンカーが上記のランダムオリゴマー部分で第１のｃＤＮＡ鎖とハイブリッド形成するので、上記の方法によりサンプル内の複数のｍＲＮＡ由来の複数のｃＤＮＡを含むフラグメントを得ることができる。ステップ３は、これらの複数のフラグメントをライゲーションしてコンカテマーを形成する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（これに限定するものではない）に基づいた市販のライゲーションキットを使用した標準的な方法によってｃＤＮＡフラグメントのライゲーションを行うことができる。最初に第２のリンカーを移入してより以前の段階で使用した他の認識部位と異なる制限酵素の認識部位を獲得し、その後２つのフラグメントをライゲーションして反対方向に２つの５’タグを含む二量体（ジタグ）とし、これらのライゲーションしたジタグフラグメントをさらにライゲーションして実施例２および３により詳細に記載したコンカテマーにする方法によってライゲーションを安全に行うことができるが、この方法に限定されない。しかし、本発明の性能は、中間ジタグのクローニングに依存しない。実施例１により詳細に記載されているように、単量体タグを直接自己ライゲーションして本発明を実施するための長さを満たすコンカテマーを形成することができる。したがって、本発明は、ジタグの使用を制限も依存しない。ライゲーションフラグメント数は制限されず、実際、２つ以上の任意の数、好ましくは少なくとも２０〜３０個が本発明の実施に適切である。得られたコンカテマーを、標準的な方法によって増幅またはクローン化することが好ましいが、これらに限定されない。 <Step 3>
The subsequent step 3 forms concatamers by reciprocal ligation of the recovered fragments. Since there are multiple mRNAs and the linker hybridizes with the first cDNA strand at the random oligomer portion described above, a fragment containing multiple cDNAs derived from multiple mRNAs in the sample can be obtained by the above method. . Step 3 ligates these multiple fragments to form concatamers. Ligation of cDNA fragments can be performed by standard methods using commercially available ligation kits based on (but not limited to) T4 DNA ligase. First import a second linker to obtain a restriction enzyme recognition site that is different from the other recognition sites used in earlier steps, then ligate the two fragments and include two 5 'tags in opposite directions Ligation can be performed safely by a method of dimerization (ditag) and further ligation of these ligated ditag fragments to the concatamers described in more detail in Examples 2 and 3, but is not limited to this method . However, the performance of the present invention does not depend on the cloning of the intermediate ditag. As described in more detail in Example 1, monomer tags can be directly self-ligated to form concatamers that meet the length for carrying out the present invention. Thus, the present invention does not rely on limiting the use of ditags. The number of ligation fragments is not limited, and indeed any number of two or more, preferably at least 20-30 is suitable for the practice of the present invention. The resulting concatamers are preferably amplified or cloned by standard methods, but are not limited thereto.

この方法で得られたコンカテマーは、それぞれサンプル内の複数のｍＲＮＡの５’末端と同一の塩基配列（しかし、ＲＮＡ中のウラシルはＤＮＡ中のチミンである）を有する部位を含む。リンカー由来の部分も含むにもかかわらず、リンカーの塩基配列は実験デザインから公知であるので、リンカー由来の部分およびｍＲＮＡ由来の部分をコンカテマーの塩基配列の調査によって明白に区別することができる。したがって、得られたコンカテマーの塩基配列の決定により、サンプル内の複数のｍＲＮＡの５’末端に塩基配列を見出すことが可能である。ＧｓｕＩ、ＭｍｅＩ、またはＥｃｏＰ１５Ｉの好ましい使用様式により、各ｍＲＮＡの５’末端に最大１６、２０、または２５塩基の塩基配列を確認することができる。１６、２０、または２５塩基に関する情報は、ｍＲＮＡのほぼ確実且つ満足な同定および新規のｍＲＮＡであるかどうかの判断に十分である。さらに、コンカテマーの塩基配列の決定により、コンカテマー中に含まれる上記フラグメント数（好ましくは２０〜３０）についてｍＲＮＡの５’末端の塩基配列を確認することが可能であり、それにより複数のｍＲＮＡの５’末端に関する情報を効率よく決定することができる。コンカテマー分析を、５’末端由来の配列とリンカー由来の配列とを区別するためのコンピュータソフトウェアの使用によって自動化することができる。   The concatamers obtained by this method each contain a site having the same base sequence (but uracil in RNA is thymine in DNA) as the 5 'ends of a plurality of mRNAs in the sample. Although the linker base sequence is known from the experimental design even though it includes a linker-derived portion, the linker-derived portion and the mRNA-derived portion can be clearly distinguished by investigating the concatemer base sequence. Therefore, by determining the base sequence of the obtained concatamer, it is possible to find the base sequence at the 5 'end of a plurality of mRNAs in the sample. Depending on the preferred mode of use of GsuI, MmeI, or EcoP15I, a base sequence of up to 16, 20, or 25 bases can be confirmed at the 5 'end of each mRNA. Information on 16, 20, or 25 bases is sufficient for an almost reliable and satisfactory identification of the mRNA and determination of whether it is a novel mRNA. Furthermore, by determining the base sequence of the concatemer, it is possible to confirm the base sequence of the 5 ′ end of the mRNA for the number of fragments (preferably 20 to 30) contained in the concatemer. 'Information about the end can be determined efficiently. Concatemer analysis can be automated through the use of computer software to distinguish between sequences from the 5 'end and linkers.

上記形態中のコンカテマーから得られた特異的５’末端タグ由来の配列を、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）またはＡｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／）からＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージとして利用可能なＦＡＳＴＡなどの配列アラインメントを実施するための標準的なソフトウェアソリューションによってその同一性を分析することができる。このようなソフトウェアソリューションにより、５’末端特異的配列タグを互いにアラインメントしてデータベース検索におけるクラスター化およびさらなる使用のための固有または非重複タグを同定する。次いで、このような全ての非重複配列タグをそれぞれ計数し、各非重複タグの同一サンプルから得られた全タグ数への寄与についてさらに分析することができる。各タグの全タグ数への寄与により、複数のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリー内の転写物を定量することが可能である。各サンプルでこのような方法で得られた結果を、互いの発現パターンを比較するために他のサンプルから得た類似のデータとさらに比較することができる。したがって、本発明により、１つまたは複数のサンプル内の各転写物の発現をプロファイリングし、基準データベースを確立することが可能である。   A sequence derived from a specific 5 'end tag obtained from a concatamer in the above form was obtained from NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) or Accelrys Inc. Its identity can be analyzed by standard software solutions for performing sequence alignments such as FASTA available as a Genetics Computer Group (GCG) package from (http://www.accelries.com/). Such software solutions align 5 'end-specific sequence tags with each other to identify unique or non-overlapping tags for clustering and further use in database searches. All such non-overlapping sequence tags can then be counted individually and further analyzed for the contribution of each non-overlapping tag to the total number of tags obtained from the same sample. Depending on the contribution of each tag to the total number of tags, it is possible to quantify transcripts in multiple mRNA or cDNA libraries. The results obtained in this way for each sample can be further compared with similar data obtained from other samples to compare each other's expression patterns. Thus, according to the present invention, it is possible to profile the expression of each transcript in one or more samples and establish a reference database.

上記のように得た特異的５’末端配列タグをさらに使用して、部分配列または全配列が得られるゲノム内の転写領域を同定することができる。ゲノム配列に５’末端特異的配列を整列させるためのＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）などの標準的なソフトウェアソリューションを使用してこのような検索を行うことができる。ゲノム配列に２０ｂｐのタグを特異的にマッピングされることが見出されたが、いくつかの場合、例えば下記のアプローチの１つによってコンカテマーから得られた最初の配列情報を拡大する必要があり得る。伸長配列の使用により、ゲノム中の活発に転写された領域をより正確に同定可能である。同様に、同一のアプローチおよびソフトウェアソリューションを使用して、他のデータベース（例えば、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｄａｔａｂａｓｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、またはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）など）中の関連配列を検索することができる。   The specific 5 'terminal sequence tag obtained as described above can be further used to identify a transcription region in the genome from which a partial or full sequence is obtained. Such searches using standard software solutions such as NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) to align 5 ′ end specific sequences to genomic sequences It can be carried out. It has been found that a 20 bp tag can be specifically mapped to a genomic sequence, but in some cases it may be necessary to expand the initial sequence information obtained from the concatamers, for example by one of the following approaches: . By using extended sequences, actively transcribed regions in the genome can be more accurately identified. Similarly, using the same approach and software solution, other databases (e.g. NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Database/index.html), EMBL-EBI (http: // /Www.ebi.ac.uk/Databases/index.html), or DNA Data Bank of Japan (http://www.ddbj.nig.ac.jp/)) can be searched. .

ゲノム配列にマッピングすることができる特異的５’末端配列タグにより、調節配列を同定することが可能である（Ｓｕｚｕｋｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．２００１ Ｍａｙ；２（５）：３８８−９３ ａｎｄ Ｓｕｚｕｋｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００１ Ｍａｙ；１１（５）：６７７−８４）。遺伝子では、転写領域の５’末端の上流ＤＮＡは、通常、遺伝子発現の調節で使用されるほとんどの調節エレメントを含む。これらの調節配列を、転写因子の結合部位に関する情報を保持するデータベースの検索によってその機能性についてさらに分析することができる。転写因子結合部位およびＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｒｅｇｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＴＲＲＤ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｍｇｓ．ｂｉｏｎｅｔ．ｎｓｃ．ｒｕ／ｍｇｓ／ｄｂａｓｅｓ／ｔｒｒｄ４／）、ＴＲＡＮＳＦＡＣ（ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ／ＴＲＡＮＳＦＡＣ／）、ＴＦＳＥＡＲＣＨ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｄｂ／ＴＦＳＥＡＲＣＨ．ｈｔｍｌ）、およびＧｅｎｏｍａｔｉｘ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅ／）から提供されたＰｒｏｍｏｔｅｒＩｎｓｐｅｃｔｏｒを含むプロモーター分析のための公的に利用可能なデータベースにより、プロモーター領域のコンピュータ分析リソースが得られる。   Regulatory sequences can be identified by specific 5 ′ end sequence tags that can be mapped to genomic sequences (Suzuki Y et al. EMBO Rep. 2001 May; 2 (5): 388-93 and Suzuki Y et al. Genome Res. 2001 May; 11 (5): 677-84). For genes, the upstream DNA at the 5 'end of the transcribed region usually contains most regulatory elements used in the regulation of gene expression. These regulatory sequences can be further analyzed for their functionality by searching a database that holds information about transcription factor binding sites. Transcription factor binding site and transcription regulatory region database (TRRD) (http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/dbases/trrd4/), TRANSFAC (http: // transSEAR / FandSEFAN / Tranfac / TRfac. (Http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html), and for promoter analysis including PromoterInspector, publicly provided by Genomatics Software (http://www.genomatix.de/) Available databases provide computer analysis resources for promoter regions.

５’末端特異的配列タグまたはゲノムへの５’末端配列のマッピングによって得られた配列情報をさらに使用して、所与の標的遺伝子の調節を操作することができる。このような実験では、プロモーター関連情報を使用して、その活性を変化させるか人工プロモーターと置き換える。あるいは、５’末端特異的タグにより、遺伝子相互作用のためのアンチセンスまたはＲＮＡｉプローブをデザインするための配列情報を得ることができる。   Sequence information obtained by mapping a 5 'end specific sequence tag or 5' end sequence to the genome can further be used to manipulate the regulation of a given target gene. In such experiments, promoter-related information is used to change its activity or replace it with an artificial promoter. Alternatively, 5 'end-specific tags can provide sequence information for designing antisense or RNAi probes for gene interaction.

本発明の異なる実施形態では、コンカテマー由来の配列情報を使用して、全長ｃＤＮＡのクローニング用の特異的プライマーを合成することができる。このようなアプローチでは、所与の５’末端特異的タグ由来の配列を使用して正方向プライマーをデザインする一方で、逆方向プライマーの選択は増幅反応で使用するテンプレートＤＮＡに依存する。生体サンプルから得た複数のＲＮＡ由来のテンプレートおよびオリゴｄＴプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を行うことができる。第１のステップでは、オリゴｄＴプライマーおよび逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡプールを合成する。第２のステップでは、５’末端特異的タグ由来の正方向プライマーおよびオリゴｄＴプライマーを使用して、ｃＤＮＡプールから全長ｃＤＮＡを増幅する。同様に、５’末端タグ由来の正方向プライマーおよびベクターネスト化逆方向プライマーを使用して、既存のｃＤＮＡライブラリーから特異的全長ｃＤＮＡを増幅することができる。   In different embodiments of the invention, sequence information derived from concatamers can be used to synthesize specific primers for cloning full-length cDNAs. In such an approach, sequences from a given 5 'end-specific tag are used to design the forward primer, while the selection of the reverse primer depends on the template DNA used in the amplification reaction. Amplification by polymerase chain reaction (PCR) can be performed using a plurality of RNA-derived templates and oligo dT primers obtained from a biological sample. In the first step, cDNA pools are synthesized using oligo dT primers and reverse transcriptase. In the second step, full-length cDNA is amplified from the cDNA pool using forward and oligo dT primers from a 5 'end specific tag. Similarly, specific full-length cDNAs can be amplified from existing cDNA libraries using forward primers derived from 5 'end tags and vector nested reverse primers.

上記方法は出発物質としてサンプル内のｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを使用する一方で、既存の全長ｃＤＮＡライブラリーを使用することによりステップ１を省略することができる。この方法では、全長ｃＤＮＡライブラリー中に含まれる複数のｃＤＮＡの５’末端（すなわち、ｃＤＮＡのテンプレートとして使用されるｍＲＮＡの５’末端）の塩基配列に関する情報を、上記手順と同様に効率よく得ることができる。   While the above method uses mRNA or total RNA in the sample as starting material, step 1 can be omitted by using an existing full-length cDNA library. In this method, information on the base sequences of the 5 ′ ends of a plurality of cDNAs contained in a full-length cDNA library (that is, the 5 ′ ends of mRNAs used as cDNA templates) can be efficiently obtained as in the above procedure. be able to.

本発明を実施するために使用した出発材料から独立して、発現の異なる遺伝子の５’末端の富化または低濃度の転写物の濃縮のためのサブトラクティブハイブリダイゼーションおよび物理的分離によって、第１の一本鎖ｃＤＮＡ材料を分画することができる。   By subtractive hybridization and physical separation for enrichment of the 5 ′ end of differently expressed genes or enrichment of low transcripts, independent of the starting material used to practice the present invention, the first Single stranded cDNA material can be fractionated.

いくつかの実施形態では、転写領域の５’末端から伸長配列情報を得ることが望ましい。特定の場合、このような伸長配列により、タンパク質合成の開始部位を同定するかゲノム配列により良好にマッピングすることができる。上記のように、本発明は、ステップ２にｃＤＮＡの５’末端へのリンカーのライゲーションを含んでいた。リンカーのような特異的核酸フラグメントに結合またはライゲーションするためのコンカテマーから得た配列を含む一本鎖突出末端の移入を標的特異的様式で使用することができる。ライゲーション後、リンカーを使用して支持体へのリンカーの結合によってＤＮＡフラグメントを富化することができ、これを富化後に放出することができる。プライマーとしてリンカーをさらに使用して、富化前に使用した液相中または固相上に５’末端に関する伸長配列情報を得ることができる。   In some embodiments, it is desirable to obtain extended sequence information from the 5 'end of the transcribed region. In certain cases, such extension sequences can identify the start site of protein synthesis or better map to genomic sequences. As mentioned above, the present invention included in step 2 the ligation of a linker to the 5 'end of the cDNA. Transfer of single stranded overhangs containing sequences derived from concatamers for binding or ligation to specific nucleic acid fragments such as linkers can be used in a target specific manner. After ligation, the linker can be used to enrich the DNA fragment by attachment of the linker to the support, which can be released after enrichment. A linker can further be used as a primer to obtain extended sequence information for the 5 'end in the liquid phase or on the solid phase used prior to enrichment.

本発明によって得られたコンカテマーの塩基配列または伸長５’配列の調査により、上記の新規遺伝子をクローニングすることが可能なだけでなく、サンプル内の遺伝子の発現プロフィールを調査することが可能である。さらに、ゲノム中の転写開始部位のマッピング、プロモーター使用パターンのマッピング、プロモーター領域中のＳＮＰ分析、発現分析とプロモーター情報との組み合わせによる遺伝子ネットワークの作成、別のプロモーター使用および転写因子の利用可能性、および断片化ゲノムＤＮＡ内のプロモーター部位の選択的回収などの種々の目的のためにこのテクノロジーを使用することができる。プロモーター部位を含むゲノムフラグメントを選択するために、例えば、上記ビオチン系の使用によってｍＲＮＡの５’末端と同一の塩基配列を含むフラグメントを支持体に結合し、断片化ゲノムＤＮＡとハイブリッド形成することができる。次いで、ハイブリッド形成ゲノムＤＮＡフラグメントを、例えば、ストレプトアビジンコーティング磁性ビーズの使用によってゲノムフラグメントの混合物から分離し、標準的な条件下でクローニングすることができる。   By examining the base sequence or extended 5 'sequence of the concatamer obtained by the present invention, it is possible not only to clone the novel gene described above, but also to investigate the expression profile of the gene in the sample. Furthermore, mapping of transcription start site in the genome, mapping of promoter usage pattern, SNP analysis in promoter region, creation of gene network by combining expression analysis and promoter information, use of different promoters and availability of transcription factors, The technology can be used for a variety of purposes, such as and selective recovery of promoter sites within fragmented genomic DNA. In order to select a genomic fragment containing a promoter site, for example, by using the biotin system, a fragment containing the same base sequence as the 5 ′ end of mRNA is bound to a support and hybridized with fragmented genomic DNA. it can. The hybridized genomic DNA fragment can then be separated from the mixture of genomic fragments, for example by use of streptavidin-coated magnetic beads, and cloned under standard conditions.

あるいは、全長ｃＤＮＡの混合物にライゲーションし、均一なオリゴヌクレオチド配列を保有する磁性ビーズに結合させた選択された５’末端タグの作製および使用ならびにその後のＳＳＬＬＭ、二本鎖ｃＤＮＡ調製、およびクラスＩＩＳまたはクラスＩＩＩ制限酵素での切断などにおけるライゲーションによってコンカテマークローニングを回避することができる。５’末端特異的タグをビーズに特異的に固定し、Ｌｙｎｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに類似の特異的配列決定のために使用する（米国特許第６，３５２，８２８号；同第６，３０６，５９７号；同第６，２８０，９３５号；同第６，２６５，１６３号；および同第５，６９５，９３４号）。   Alternatively, ligation to a mixture of full-length cDNAs and creation and use of selected 5 ′ end tags attached to magnetic beads carrying a uniform oligonucleotide sequence and subsequent SSLLM, double-stranded cDNA preparation, and class IIS or Concatemer cloning can be avoided by ligation, such as by cleavage with a class III restriction enzyme. A 5 ′ end-specific tag is specifically immobilized to the beads and used for specific sequencing similar to Lynx Therapeutics (US Pat. Nos. 6,352,828; 6,306,597; 6,280,935; 6,265,163; and 5,695,934).

例えば、オリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡの５’末端と結合する「ランダム部分Ｉ」およびライゲーション産物を「タグ化する」ことができるオリゴヌクレオチドのコード部分を有する。ｃＤＮＡとハイブリッド形成しない場合、エキソヌクレアーゼＶＩＩによってオリゴヌクレオチドを破壊することができる。「デコーダー」オリゴヌクレオチドを使用して、配列を拾い出す。次いで、ビーズ上のｃＤＮＡの特異的アレイを、１箇所あたり１つ固体表面上に整列させ、平行配列決定を行う。上記アプローチにより液体アレイ形式をデザイン可能であり、各ビーズを独立した標識によって標識し、配列分析などのために個別に処理することができる。   For example, an oligonucleotide has a “random portion I” that binds to the 5 ′ end of the cDNA and a coding portion of the oligonucleotide that can “tag” the ligation product. If not hybridized to the cDNA, the oligonucleotide can be destroyed by exonuclease VII. A “decoder” oligonucleotide is used to pick up the sequence. The specific array of cDNA on the beads is then aligned on a solid surface, one per location, and parallel sequencing is performed. With the above approach, a liquid array format can be designed, and each bead can be labeled with an independent label and processed individually for sequence analysis and the like.

本発明の異なる実施形態では、公知の５’末端特異的タグを、コンカテマーのクローニングおよび配列決定を省略した５’末端特異的配列の別の分析のために使用することができる。このような場合、約２５ｂｐの５’末端特異的オリゴヌクレオチドを合成し、固体支持体に固定して５’末端特異的マイクロアレイを形成する。次いで、サンプルから得た５’タグのハイブリッド形成により、サンプル中に存在する転写物を同定および定量することが可能である。マイクロアレイの標準的な調製方法および使用は、分子生物学分野の当業者に公知である（Ｊｏｒｄａｎ Ｂ．，ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１：Ｓｃｈｅｎａ Ａ，ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ １９９９）。   In different embodiments of the invention, known 5 'end-specific tags can be used for another analysis of 5' end-specific sequences that omits concatemer cloning and sequencing. In such a case, about 25 bp of 5 'end specific oligonucleotide is synthesized and immobilized on a solid support to form a 5' end specific microarray. The 5 'tag obtained from the sample can then be hybridized to identify and quantify transcripts present in the sample. Standard methods of preparation and use of microarrays are known to those skilled in the field of molecular biology (Jordan B., DNA Microarrays: Gene Expression Applications, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, 2001: SchenaMiroA, DNAA. , A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford 1999).

５’末端の直接配列決定または５’末端特異的マイクロアレイへのハイブリッド形成による読出しのための上記アプローチの修正形態によって、本発明は、コンカテマー形態での５’末端の一般的分析または５’末端特異的選択によって富化された各５’末端分析の異なる手段を提供する。   By a modified form of the above approach for readout by direct sequencing of the 5 ′ end or hybridization to a 5 ′ end specific microarray, the present invention allows for general analysis of the 5 ′ end in concatamer form or 5 ′ end specific It provides a different means of analysis for each 5 ′ end enriched by genetic selection.

図２は、上記ステップ２および３による作業の流れの例をまとめる。
図２では、以下の実施例１にさらに詳述した３３ｂｐのＤＮＡフラグメントのクローニングのために、制限酵素ＸｍａＪＩ、ＭｍｅＩ、およびＸｂａＩを使用する。原則的に、５’末端特異的タグのクローニングは以下のステップを含む。 FIG. 2 summarizes an example of the work flow according to steps 2 and 3 above.
In FIG. 2, the restriction enzymes XmaJI, MmeI, and XbaI are used for the cloning of the 33 bp DNA fragment further detailed in Example 1 below. In principle, the cloning of a 5 ′ end specific tag comprises the following steps:

図１に概説した本発明の最初のステップでは、一本鎖ｃＤＮＡのプールが得られる。プールは、ｍＲＮＡから転写された５’末端領域を含む。ｍＲＮＡから転写した５’末端領域を含む一本鎖ｃＤＮＡの一部に隣接して、特異的リンカー（本明細書中で「第１のリンカー」と命名する）をライゲーションして、その結合部位または５’末端転写領域内の第１のリンカーの外側を切断する制限酵素の認識部位を得る。図中に記載された例の目的のため、認識部位の２１ｂｐ下流を切断し、それによりｍＲＮＡの転写領域の５’末端を含むタグを末端化する制限酵素ＭｍｅＩを使用する。また、「第１のリンカー」のための第２の制限酵素を得る。この例の目的のために、５’末端特異的タグのその後のクローニングのためにＸｍａＪＩを使用する。   In the first step of the invention outlined in FIG. 1, a pool of single stranded cDNA is obtained. The pool includes a 5 'end region transcribed from the mRNA. A specific linker (designated herein as “first linker”) is ligated adjacent to a portion of the single stranded cDNA containing the 5 ′ end region transcribed from the mRNA, and the binding site or A restriction enzyme recognition site that cleaves outside the first linker in the 5 ′ terminal transcription region is obtained. For the purposes of the example described in the figure, the restriction enzyme MmeI is used which cleaves 21 bp downstream of the recognition site, thereby terminating the tag containing the 5 'end of the transcribed region of the mRNA. A second restriction enzyme for the “first linker” is also obtained. For purposes of this example, XmaJI is used for subsequent cloning of 5 'end specific tags.

その後、「第１のリンカー」を使用して、第２の相補ｃＤＮＡ鎖の合成を開始し、それによりｍＲＮＡの転写領域の５’末端を含み、５’末端領域転写ｍＲＮＡを含む領域に隣接する結合部位に関して第１のリンカーの外側に存在する部位で切断する制限酵素の認識部位を有する二本鎖ｃＤＮＡ分子が得られる。   The “first linker” is then used to initiate synthesis of the second complementary cDNA strand, thereby including the 5 ′ end of the transcribed region of the mRNA and adjacent to the region containing the 5 ′ end region transcribed mRNA. A double-stranded cDNA molecule having a restriction enzyme recognition site that cleaves at a site present outside the first linker with respect to the binding site is obtained.

この例の目的のための切断部位の外側を切断する上記制限酵素はＭｍｅＩである。ＭｍｅＩでの切断により、ｍＲＮＡの転写領域の５’末端および「第１のリンカー」を含み、且つＭｍｅＩの切断部位に一本鎖ＤＮＡ突出末端を有するタグの二本鎖ｃＤＮＡフラグメントが得られる。   The restriction enzyme that cuts outside the cleavage site for purposes of this example is MmeI. Cleavage with Mmel yields a double-stranded cDNA fragment of the tag that includes the 5 'end of the mRNA transcription region and the "first linker" and has a single-stranded DNA overhang at the cleavage site of Mmel.

ＭｍｅＩの切断部位の上記一本鎖ＤＮＡ突出末端に「第２のリンカー」をライゲーションして、ｃＤＮＡフラグメントのクローニングに適切な制限酵素の制限部位またはＰＣＲによる増幅のテンプレートとして機能するタグが得られる。   A “second linker” is ligated to the above-mentioned single-stranded DNA protruding end of the cleavage site of MmeI to obtain a tag that functions as a restriction enzyme restriction site suitable for cloning of a cDNA fragment or a template for amplification by PCR.

「第１のリンカー」、ｍＲＮＡから転写された領域の５’末端を含むｃＤＮＡフラグメント、および「第２のリンカー」を含むｃＤＮＡフラグメントを、第１のリンカーに結合した選択的結合物質による支持体への選択的結合によって精製する。   The “first linker”, the cDNA fragment containing the 5 ′ end of the region transcribed from mRNA, and the cDNA fragment containing the “second linker” to the support by the selective binding substance bound to the first linker. Purification by selective coupling of

転写領域の５’末端またはタグを含むｃＤＮＡフラグメントのクローニングの目的のために、「第１のリンカー」、ｍＲＮＡから転写された５’末端領域を含むｃＤＮＡフラグメントまたはタグ、および「第２のリンカー」を含む上記ｃＤＮＡ画分を、ＰＣＲによって増幅し、リンカー部分を制限酵素で切り出してタグをコンカテマーにライゲーションする。この例の目的のために、上記ｃＤＮＡフラグメントから３３ｂｐのフラグメントを切り出す制限酵素ＸｍａＪＩおよびＸｂａＩを使用する。適切な精製ステップ後、例えば、ｍＲＮＡの転写領域の５’末端を含む３０個までのタグを含むコンカテマーの形成のために３３ｂｐのフラグメントを互いにライゲーションするかそれぞれクローニングする。   For the purpose of cloning a cDNA fragment containing the 5 ′ end or tag of the transcribed region, a “first linker”, a cDNA fragment or tag containing the 5 ′ end region transcribed from mRNA, and a “second linker” The above cDNA fraction containing is amplified by PCR, the linker part is excised with a restriction enzyme, and the tag is ligated to a concatamer. For the purposes of this example, the restriction enzymes XmaJI and XbaI that excise a 33 bp fragment from the cDNA fragment are used. After appropriate purification steps, for example, 33 bp fragments are ligated to each other or cloned to form concatamers containing up to 30 tags including the 5 'end of the transcribed region of the mRNA.

ｍＲＮＡから転写した５’末端領域を含むライブラリーを調製するために、配列決定ベクターにコンカテマーをクローン化することができる。   Concatemers can be cloned into sequencing vectors in order to prepare libraries containing 5'-terminal regions transcribed from mRNA.

図３は、５’末端タグの直接配列決定のための別のアプローチを例示するための本発明の作業原理の流れを示す。本発明のこの実施形態の目的のために、ｍＲＮＡから転写された５’末端領域を含み、且つ図１にまとめたように得た一本鎖ｃＤＮＡを、この例の目的のために固体支持体上にライゲーション産物を固定するための特異的標識を有する「第１のリンカー」と命名されたリンカーにライゲーションする。このリンカーを、第１の鎖に相補的な第２のｃＤＮＡ鎖の合成のためのプライマーとして使用することができる。ｍＲＮＡから転写された５’末端領域を含む領域に隣接する二本鎖リンカーを有する一本鎖ＤＮＡまたは５’末端転写領域を含む二本鎖ＤＮＡを、この例の目的のために、ｍＲＮＡの５’末端の高処理連続配列決定アプローチによる個別または並行配列決定に進めることができる。   FIG. 3 shows the working principle flow of the present invention to illustrate another approach for direct sequencing of 5 'end tags. For the purposes of this embodiment of the present invention, a single-stranded cDNA comprising a 5 ′ end region transcribed from mRNA and obtained as summarized in FIG. Ligate to a linker named “first linker” with a specific label on it to immobilize the ligation product. This linker can be used as a primer for the synthesis of a second cDNA strand complementary to the first strand. For the purposes of this example, single-stranded DNA with a double-stranded linker adjacent to the region containing the 5 ′ end region transcribed from mRNA or double-stranded DNA containing the 5 ′ end transcription region is used for purposes of this example. 'Can proceed to individual or parallel sequencing with a high-throughput sequential sequencing approach.

その例によって本発明をここに記載する。本発明は実施例に制限されないことに留意すべきである。分子生物学分野の標準的技術を有する当業者は、実施例に記載の実験を実施することができる。文中で別記していない限り、実施例中で使用した技術用語、略語、およびソリューションは、本発明の分野の当業者に一般に理解されている意味を有する。このような用語、略語、および溶液の一般的な説明を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，２００１）中の一般的試薬で見出すことができる。本明細書中に記載の全ての刊行物は、参照することにより、本明細書中で開示ならびに方法および／または材料を記載するために組み込まれる。   The invention will now be described by way of example. It should be noted that the present invention is not limited to the examples. One skilled in the art having standard techniques in the field of molecular biology can carry out the experiments described in the examples. Unless otherwise noted in the text, technical terms, abbreviations, and solutions used in the examples have the meaning commonly understood by a person skilled in the art of the present invention. Such terms, abbreviations, and general descriptions of solutions can be found in the general reagents in Molecular Cloning (Sambrook and Russel, 2001). All publications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to describe the disclosure and methods and / or materials.

＜ジタグを省略した本発明の５’末端特異的タグの調製＞
本発明を実施するために、例えば細胞質ｍＲＮＡ画分を得るために本明細書中で使用した方法の１つが記載されているＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，２００１．Ｃａｒｎｉｎｃｉ Ｐ．ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３３，３０６−９，（２００２））にさらに詳述されているｍＲＮＡまたは全ＲＮＡサンプルを分子生物学分野の当業者に公知の標準的方法によって調製することができるが、本発明はこの方法に制限されず、ｍＲＮＡまたは全ＲＮＡの調製のための任意の他のアプローチにより、類似の様式で本発明を実施することが可能である。 <Preparation of 5'-end specific tag of the present invention in which ditag is omitted>
In order to practice the present invention, Sambrook and Russel, 2001., which describes one of the methods used herein, eg, to obtain a cytoplasmic mRNA fraction. Carninci P.M. et al. Although the mRNA or total RNA samples detailed further in (Biotechniques 33,306-9, (2002)) can be prepared by standard methods known to those skilled in the field of molecular biology, the present invention Without being limited to the method, the present invention can be implemented in a similar manner by any other approach for the preparation of mRNA or total RNA.

全ＲＮＡまたは細胞質ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製は好ましいが、本実施例で以下に記載のキャップ選択ステップと組み合わせた全ＲＮＡの使用から満足のいく結果を得ることができるので、本発明の実施に必須ではない。一般的に言えば、ｍＲＮＡは全ＲＮＡ調製物の約１〜３％に相当し、その後オリゴｄＴセルロースマトリクスに基づく市販のキットの使用によって調製することができる。このような市販のキット（ＭＡＣＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙ）が含まれるが、これに限定されない）により、本発明を実施するためのｍＲＮＡ画分の調製に適用する場合の推奨される条件下で満足するｍＲＮＡ収量が得られた。本発明を実施するために、大規模なｍＲＮＡ精製によって特に長いｍＲＮＡが喪失するので、１サイクルのオリゴｄＴ ｍＲＮＡ選択で十分である。   Although preparation of mRNA from total RNA or cytoplasmic RNA is preferred, it is essential for the practice of the present invention because satisfactory results can be obtained from the use of total RNA in combination with the cap selection step described below in this example. is not. Generally speaking, mRNA represents about 1-3% of the total RNA preparation and can then be prepared by use of a commercial kit based on an oligo dT cellulose matrix. Such commercially available kits (including but not limited to MACS mRNA isolation kit (Milteny)) under the recommended conditions when applied to the preparation of mRNA fractions for practicing the present invention Satisfactory mRNA yield was obtained. In order to practice the present invention, one cycle of oligo dT mRNA selection is sufficient, as particularly long mRNAs are lost by extensive mRNA purification.

本発明を実施するために使用する全てのｍＲＮＡサンプルを、ｍＲＮＡ純度をモニターするための２３０、２６０、および２８０ｎｍのＯＤ読み取り比について分析した。２３０／２６０比が０．５未満である場合に多糖の除去が成功したと見なし、２６０／２８０比が１．８超または約２．０である場合にタンパク質が有効に除去されたと見なした。ＲＮＡサンプルを、アガロースゲルでの電気泳動によってさらに分析し、全ＲＮＡ調製物中の２８Ｓ ｒＲＮＡと１８Ｓ ｒＲＮＡとの間の良好な比が証明された。   All mRNA samples used to practice the invention were analyzed for 230, 260, and 280 nm OD read ratios to monitor mRNA purity. Polysaccharide removal was considered successful when the 230/260 ratio was less than 0.5, and protein was considered effectively removed when the 260/280 ratio was greater than 1.8 or about 2.0. . RNA samples were further analyzed by electrophoresis on an agarose gel, demonstrating a good ratio between 28S and 18S rRNA in the total RNA preparation.

以下の条件下のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、異なるｍＲＮＡサンプルから第１のｃＤＮＡ鎖を調製した。   The first strand of cDNA was prepared from different mRNA samples using Superscript II (Invitrogen) under the following conditions.

２２μｌの最終体積で、５〜２５μｇの精製ｍＲＮＡまたは５０μｇまでの全ＲＮＡを、１４μｇの適切な精製された第１のｃＤＮＡプライマー鎖（５’−（ＧＡ）₅ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＴＴＴＣＡＴＴＡＣＣＴＣＴＴＴＣＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＴＡＧＡ（Ｔ）₁₆ＶＮ−３’）（配列番号１）と混合し、６５℃で１０分間加熱してプライマーをアニーリングし、その直後に氷上に置いた。 In a final volume of 22 μl, 5-25 μg of purified mRNA or up to 50 μg of total RNA, 14 μg of the appropriate purified first cDNA primer strand (5 ′-(GA) ₅ AAGGATCTCGCCATTTCATTACCTCTTTCTCCGCACCCGACATAGATA (T) ₁₆ VN-3 ′ ) (SEQ ID NO: 1) and heated at 65 ° C. for 10 minutes to anneal the primer and immediately thereafter placed on ice.

第２のチューブでは、最終体積１２８μｌの第１の鎖の合成のための反応混合物を調製した。
・２×ＧＣ Ｉ（ＬＡ Ｔａｑ）緩衝液（ＴａＫａＲａ） ７５μｌ
・ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、および５−メチル−ｄＣＴＰ（各１０ｍＭ） ４μｌ
・４．９Ｍソルビトール ２０μｌ
・飽和トレハロース（約８０％） １０μｌ
・ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ） １５μｌ
・ｄｄＨ₂Ｏ ４μｌ In the second tube, a reaction mixture was prepared for synthesis of the first strand with a final volume of 128 μl.
・ 2 × GC I (LA Taq) buffer (TaKaRa) 75 μl
DATP, dTTP, dGTP, and 5-methyl-dCTP (10 mM each) 4 μl
・ 4.9M sorbitol 20μl
・ Saturated trehalose (about 80%) 10μl
Superscript II reverse transcriptase (200 U / μl) 15 μl
・ DdH ₂ O 4 μl

１．５μｌのα³²Ｐ−ｄＧＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＢｉｏＴｅｃｈ）を含む第３の反応チューブを調製し、放射性トレーサーおよびＲＮＡテンプレートを保持する反応チューブと共に反応混合物を４２℃に加熱した。全溶液が４２℃の出発温度に達した場合、反応混合物およびＲＮＡテンプレートを迅速に混合し、この溶液から４０μｌを放射性トレーサーを保持した反応チューブに移した。残りのＲＮＡを含む反応混合物を、平行して放射性反応混合物で処理することができる。以下の設定を使用したサーマルサイクラーで第１のｃＤＮＡ鎖を合成した。４２℃で３０分間、５０℃で１０分間、５５℃で１０分間。サイクル終了後、最終濃度１０ｍＭのＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍのストック由来）の添加によって反応を停止させた。第１のｃＤＮＡ鎖の合成時に放射性トレーサーを含めることは本発明を実施するために必須ではないが、反応の合成率の測定およびｃＤＮＡの分析（例えば、アルカリゲル電気泳動による）に非常に役立ち得る。以後のステップのために、新規のチューブで放射性および非放射性物質を混合し、共に処理することができる。最終濃度１μｇ／μｌのプロテアーゼＫの添加により、５０℃で１５分間またはそれ以上のインキュベーション後に反応混合物中の残存する酵素活性を破壊した。下記のように、ＣＴＡＢ尿素およびその後のエタノールでの沈殿によって反応混合物からＲＮＡおよび第１のｃＤＮＡ鎖を単離した。約１２８〜１４２μｌの反応混合物に、３２μｌの５Ｍ塩化ナトリウムおよび３２０μｌの１％ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）溶液を含む４Ｍ尿素を添加し、慎重に混合した。溶液を室温で１０分間インキュベートし、その後１５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって沈殿物を単離した。上清を除去し、ペレットを１００μｌの７Ｍ塩化グアニジニウムに慎重に再懸濁した。エタノール沈殿のために、２５０μｌの無水エタノールを添加し、混合物を−８０℃で６０分間静置して沈殿を形成させた。１５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって沈殿を回収し、その後８００μｌの８０％エタノールで２回洗浄した。最後に、ペレットを、４６μｌの水に再懸濁した。 A third reaction tube containing 1.5 μl of α ³² P-dGTP (Amersham Pharmacia Biosciences BioTech) was prepared and the reaction mixture was heated to 42 ° C. along with the reaction tube holding the radiotracer and RNA template. When the total solution reached a starting temperature of 42 ° C., the reaction mixture and RNA template were rapidly mixed and 40 μl from this solution was transferred to a reaction tube holding a radioactive tracer. The reaction mixture containing the remaining RNA can be treated with the radioactive reaction mixture in parallel. The first cDNA strand was synthesized with a thermal cycler using the following settings. 30 minutes at 42 ° C, 10 minutes at 50 ° C, 10 minutes at 55 ° C. At the end of the cycle, the reaction was stopped by the addition of a 10 mM final concentration EDTA solution (from a 0.5 M stock). Inclusion of a radioactive tracer in the synthesis of the first cDNA strand is not essential for practicing the present invention, but can be very helpful in measuring the rate of synthesis of the reaction and analyzing the cDNA (eg, by alkaline gel electrophoresis). . For subsequent steps, the new and the radioactive material can be mixed and treated together in a new tube. The addition of protease K at a final concentration of 1 μg / μl destroyed the remaining enzyme activity in the reaction mixture after incubation at 50 ° C. for 15 minutes or longer. RNA and the first cDNA strand were isolated from the reaction mixture by precipitation with CTAB urea and subsequent ethanol as described below. To about 128-142 μl of the reaction mixture was added 32 μl of 5M sodium chloride and 320 μl of 4M urea containing 1% CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) solution and mixed carefully. The solution was incubated at room temperature for 10 minutes, after which the precipitate was isolated by centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes. The supernatant was removed and the pellet was carefully resuspended in 100 μl 7M guanidinium chloride. For ethanol precipitation, 250 μl of absolute ethanol was added and the mixture was left at −80 ° C. for 60 minutes to form a precipitate. The precipitate was collected by centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes and then washed twice with 800 μl of 80% ethanol. Finally, the pellet was resuspended in 46 μl water.

本明細書中に記載の実施例では、本発明は、全長ｃＤＮＡ選択のためのいわゆるキャップトラッパー法を使用した。本発明はキャップトラッパー法の性能に制限されないので、類似の方法で他の全長選択手段を適用することができる。ｍＲＮＡ分子の５’末端でのキャップ構造のビオチン化によってキャップトラッパー選択を開始した。上記第１のｃＤＮＡ鎖溶液に、３．３μｌの１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）および新たに調製した１０ｍＭ ＮａＩＯ₄溶液（最終濃度１ｍＭ）を添加し、体積を最終体積の５５μｌに増加させた。混合物を暗所の氷上で４５分間インキュベートし、次いで、１μｌの８０％グリセロールの添加によって反応を停止させた。イソプロパノールでの沈殿により反応混合物からＲＮＡおよびｃＤＮＡを単離した。上記反応混合物に、０．５μｌの１０％ＳＤＳ、１１μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、および６１μｌのイソプロパノールを添加し、慎重に混合し、完全な暗所にて−８０℃で３０分間インキュベートした。１５，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離による沈殿物の回収後、ペレットを５００μｌの８０％エタノールで２回洗浄した。最終的に、ペレットを５０μｌの水に再懸濁した。ｍＲＮＡ中の酸化ジオール基を使用して、ビオチンヒドラジドとの反応においてビオチン溶液（ｍｏｉｓｔｕｒｅ）を導入した。上記の５０μｌのＲＮＡ／ｃＤＮＡ溶液に、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）および０．１％Ｗ／ＶＳＤＳを含む反応緩衝液中に濃度１０ｍＭで溶解した１６０μｌのビオチンヒドラジド長腕（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、最終体積２１０μｌまで添加した。室温で一晩反応させて、全ての酸化ジオール基を完全に修飾する。７５μｌの１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．１）、５μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、および７５０μｌの無水エタノールを反応混合物に添加したＲＮＡおよびｃＤＮＡの沈殿によって反応を停止させた。−８０℃で１時間のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって沈殿物を回収した。得られたペレットを、５００μｌの８０％エタノールで２回洗浄し、最後に１７５μｌのＴＥ緩衝液（１ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。 In the examples described herein, the present invention used a so-called cap trapper method for full-length cDNA selection. Since the present invention is not limited to the performance of the cap trapper method, other full length selection means can be applied in a similar manner. Cap trapper selection was initiated by biotinylation of the cap structure at the 5 ′ end of the mRNA molecule. To the first cDNA strand solution, 3.3 μl of 1 M sodium acetate buffer (pH 4.5) and a freshly prepared 10 mM NaIO ₄ solution (final concentration 1 mM) are added to increase the volume to 55 μl of the final volume. It was. The mixture was incubated for 45 minutes on dark ice and then the reaction was stopped by the addition of 1 μl of 80% glycerol. RNA and cDNA were isolated from the reaction mixture by precipitation with isopropanol. To the reaction mixture, 0.5 μl of 10% SDS, 11 μl of 5M sodium chloride, and 61 μl of isopropanol were added, mixed carefully and incubated at −80 ° C. for 30 minutes in complete darkness. After collection of the precipitate by centrifugation at 15,000 rpm for 15 minutes, the pellet was washed twice with 500 μl of 80% ethanol. Finally, the pellet was resuspended in 50 μl water. A biotin solution was introduced in the reaction with biotin hydrazide using oxidized diol groups in the mRNA. 160 μl of biotin hydrazide long arm (Vector Laboratories) dissolved in 50 μl of the above RNA / cDNA solution at a concentration of 10 mM in a reaction buffer containing 50 mM sodium citrate buffer (pH 6.1) and 0.1% W / VSDS. ) Was added to a final volume of 210 μl. React overnight at room temperature to completely modify all oxidized diol groups. The reaction was stopped by precipitation of RNA and cDNA with 75 μl of 1 M sodium citrate pH 6.1, 5 μl 5 M sodium chloride, and 750 μl absolute ethanol added to the reaction mixture. After 1 hour incubation at −80 ° C., the precipitate was collected by centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes. The resulting pellet was washed twice with 500 μl of 80% ethanol and finally resuspended in 175 μl of TE buffer (1 mM Tris (pH 7.5), 0.1 mM EDTA).

それぞれ１μｇの出発ｍＲＮＡまたは全ＲＮＡあたり２０μｌ ＲＮアーゼＩ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）および１単位のＲＮアーゼＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、５または１０Ｕ／μｌ）の添加によって上記溶液由来の全長ｃＤＮＡをさらに処理した。最終体積２００μｌの反応混合物を、３７℃で３０分間インキュベートし、その後４μｌの１０％ＳＤＳ溶液および３μｌの１０μｇ／μｌのプロテイナーゼＫ溶液の添加によって反応を停止させた。ＲＮアーゼＩを破壊するために、反応混合物を４５℃でさらに１５分間インキュベートした。次いで、反応混合物を１：１のトリス（ｐＨ７．５）平衡化フェノール：クロロホルムで１回抽出し、その後ＲＮＡおよびＤＮＡを沈殿させた。沈殿物の収率を改善するために、２０μｇのキャリアｔＲＮＡおよび１体積のイソプロパノールを反応混合物に添加し、−２０℃でインキュベートした。沈殿物を１５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって回収し、５００μｌの８０％エタノールで洗浄し、最後に２０μｌの０．１×ＴＥ緩衝液に再懸濁した。   The full-length cDNA from the solution was further processed by addition of 20 μl RNase I buffer (Promega) and 1 unit RNase I (Promega, 5 or 10 U / μl) per 1 μg starting mRNA or total RNA, respectively. A final volume of 200 μl of the reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes, after which the reaction was stopped by the addition of 4 μl of 10% SDS solution and 3 μl of 10 μg / μl proteinase K solution. To destroy RNase I, the reaction mixture was incubated at 45 ° C. for an additional 15 minutes. The reaction mixture was then extracted once with 1: 1 Tris (pH 7.5) equilibrated phenol: chloroform, after which RNA and DNA were precipitated. In order to improve the yield of the precipitate, 20 μg of carrier tRNA and 1 volume of isopropanol were added to the reaction mixture and incubated at −20 ° C. The precipitate was collected by centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes, washed with 500 μl 80% ethanol and finally resuspended in 20 μl 0.1 × TE buffer.

全長ｃＤＮＡの単離のために、本実施例ではストレプトアビジンによりコーティングした磁性ビーズを使用した。しかし、ストレプトアビジンまたはアビジンでコーティングされた任意の他の固相を類似の様式で使用することができるので、本発明は磁性ビーズの使用に制限されない。磁性ビーズ表面への核酸の非特異的結合を最小にするために、無ＤＮＡｔＲＮＡの使用前にこれらを予めインキュベートした。約５００μｌの磁性ビーズスラリー（ＭＰＧ粒子、ＣＰＧ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）に、約１００μｇのｔＲＮＡを含む１０μｌの水を添加し、氷上で約３０分間時々混合しながらインキュベートした。約３分間の磁力の印加によって磁性ビーズを溶液から分離した。上清を除去した後、ビーズを４．５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０５Ｍ ＥＤＴＡを含む５００μｌの結合緩衝液で３回洗浄して溶液から遊離ストレプトアビジンを除去した。次いで、ビーズを５００μｌの結合緩衝液に再懸濁し、その３５０μｌのスラリーを上記ＲＮアーゼ処理ｃＤＮＡと混合した。得られたスラリーを、撹拌しながら５０℃で１０分間インキュベートし、その後１５０μｌのストレプトアビジンコーティング磁性ビーズをさらに添加した。得られたスラリーを再度撹拌しながら５０℃で２０分間さらにインキュベートした。ビオチン化全長ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを磁性ビーズ上に保持し、磁力の印加によって上清から分離した。その際に、ビーズを、５００μｌの結合緩衝液で２回、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５００μｌの０．３Ｍ塩化ナトリウムで１回、最後に０．４％ＳＤＳ、０．５Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、および１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５００μｌの緩衝液で２回慎重に洗浄した。５ｍＭＥＤＴＡを含む１００μｌの５０ｍＭ水酸化ナトリウムの適用および室温で５分間のインキュベーションによるｍＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのアルカリ処理によって、ビーズから一本鎖ｃＤＮＡを放出させた。このインキュベーション中、スラリーを時々混合した。上清を除去し、同一の条件下で溶離を２回繰り返した。３つ全ての上清をプールし、直ちに氷上に置いた。約１５０μｌの溶離画分を、５０μｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）の添加によって中和し、その後フェノール／クロロホルムで抽出および沈殿させた。次いで、得られた約２００μｌの溶液を上記のようにＲＮアーゼＩおよびプロテイナーゼＫで処理し、同体積のＴｒｉｓ平衡化フェノール：クロロホルム（１：１比）で１回抽出し、２５０μｌのサンプル、１２．５μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、３．５μｌの１μｇ／μｌのグリコーゲン、および２５０μｌのイソプロパノールの添加によってエタノールで水相からＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で３０分間のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。５００μｌの８０％エタノールでのペレットの２回の洗浄後、最後にＤＮＡを５μｌの０．１×ＴＥ緩衝液に再懸濁した。   In this example, magnetic beads coated with streptavidin were used for isolation of full-length cDNA. However, the present invention is not limited to the use of magnetic beads as streptavidin or any other solid phase coated with avidin can be used in a similar manner. In order to minimize non-specific binding of nucleic acids to the magnetic bead surface, they were preincubated prior to use of DNA-free tRNA. To about 500 μl of magnetic bead slurry (MPG particles, CPG, New Jersey), 10 μl of water containing about 100 μg of tRNA was added and incubated on ice for about 30 minutes with occasional mixing. The magnetic beads were separated from the solution by applying a magnetic force for about 3 minutes. After removing the supernatant, the beads were washed 3 times with 500 μl of binding buffer containing 4.5 M sodium chloride and 0.05 M EDTA to remove free streptavidin from the solution. The beads were then resuspended in 500 μl binding buffer and the 350 μl slurry was mixed with the RNase treated cDNA. The resulting slurry was incubated for 10 minutes at 50 ° C. with agitation, after which additional 150 μl of streptavidin-coated magnetic beads were added. The resulting slurry was further incubated at 50 ° C. for 20 minutes while stirring again. The biotinylated full length mRNA / cDNA hybrid was retained on magnetic beads and separated from the supernatant by application of magnetic force. In this case, the beads were washed twice with 500 μl of binding buffer, once with 500 μl of 0.3 M sodium chloride containing 1 mM EDTA, and finally with 0.4% SDS, 0.5 M sodium acetate, 20 mM Tris-HCl ( Carefully washed twice with pH 8.5) and 500 μl buffer containing 1 mM EDTA. Single-stranded cDNA was released from the beads by application of 100 μl of 50 mM sodium hydroxide containing 5 mM EDTA and alkaline treatment of the mRNA / DNA hybrid by incubation at room temperature for 5 minutes. During this incubation, the slurry was mixed from time to time. The supernatant was removed and elution was repeated twice under the same conditions. All three supernatants were pooled and immediately placed on ice. Approximately 150 μl of the eluted fraction was neutralized by the addition of 50 μl of 100 mM Tris (pH 8.0), followed by extraction and precipitation with phenol / chloroform. The resulting approximately 200 μl solution was then treated with RNase I and proteinase K as described above, extracted once with the same volume of Tris-equilibrated phenol: chloroform (1: 1 ratio), and 250 μl of sample, 12 DNA was precipitated from the aqueous phase with ethanol by addition of 5 μl 5M sodium chloride, 3.5 μl 1 μg / μl glycogen, and 250 μl isopropanol. After incubation at -80 ° C for 30 minutes, the DNA was recovered by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes. After two washes of the pellet with 500 μl of 80% ethanol, the DNA was finally resuspended in 5 μl of 0.1 × TE buffer.

本実施例に記載の次のステップのために、制限酵素ＸｈｏＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、およびＸｍａＪＩの認識部位と共にクラスＩＩＳ制限酵素ＭｍｅＩの認識部位を有する特異的リンカーをデザインした。しかし、本発明は、本実施例に記載の制限酵素の使用に制限されず、他の酵素の使用は以後の異なる実施例で記載されている。ランダム突出末端を有する２つの上流オリゴヌクレオチド鎖およびより短い下流オリゴヌクレオチド鎖から二本鎖リンカーを構築した。上流オリゴヌクレオチド鎖については、２つのオリゴヌクレオチドと個別の突出末端の４：１混合物を使用することに留意のこと。以下で命名したオリゴヌクレオチドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｊａｐａｎから入手し、アニーリング前にゲル精製した。オリゴヌクレオチドの異なる末端修飾を以下に示す（「Ｂｉｏ」は５’ビオチン化を示し、「Ｐｉ」は５’リン酸化を示し、「ＮＨ₂」は３’アミノ基を示す）。以後他のオリゴヌクレオチドの文脈で同一の略語を使用した。 For the next step described in this example, a specific linker was designed having a recognition site for class IIS restriction enzyme MmeI along with recognition sites for restriction enzymes XhoI, I-CeuI, and XmaJI. However, the present invention is not limited to the use of the restriction enzymes described in this example, and the use of other enzymes is described in the following different examples. A double stranded linker was constructed from two upstream oligonucleotide strands with random overhangs and a shorter downstream oligonucleotide strand. Note that for the upstream oligonucleotide strand, use a 4: 1 mixture of the two oligonucleotides and individual overhangs. The oligonucleotides named below were obtained from Invitrogen Japan and gel purified prior to annealing. Different end modifications of the oligonucleotides are shown below (“Bio” indicates 5 ′ biotinylation, “Pi” indicates 5 ′ phosphorylation, “NH ₂ ” indicates a 3 ′ amino group). Hereinafter, the same abbreviation was used in the context of other oligonucleotides.

上流オリゴヌクレオチドＧＮ５：Ｂｉｏ−ａｇａｇａｇａｇａｃｃｔｃｇａｇｔａａｃｔａｔａａｃｇｇｔｃｃｔａａｇｇｔａｇｃｇａｃｃｔａｇｇｔｃｃｇａｃｇＮＮＮＮＮ（配列番号２）
上流オリゴヌクレオチドＮ６：Ｂｉｏ−ａｇａｇａｇａｇａｃｃｔｃｇａｇｔａａｃｔａｔａａｃｇｇｔｃｃｔａａｇｇｔａｇｃｇａｃｃｔａｇｇｔｃｃｇａｃＮＮＮＮＮＮ（配列番号３）
下流オリゴヌクレオチド：Ｐｉ−ｇｔｃｇｇａｃｃｔａｇｇｔｃｇｃｔａｃｃｔｔａｇｇａｃｃｇｔｔａｔａｇｔｔａｃｔｃｇａｇｇｔｃｔｃｔｃｔｃｔ−ＮＨ₂（配列番号４） Upstream oligonucleotide GN5: Bio-agagagagaccctcgagataactataacgggtcctaaggtagcgacctaggtccgacgNNNNNN (SEQ ID NO: 2)
Upstream oligonucleotide N6: Bio-agagagagacctcgagataactataacggtcctaaggtagcgacctagggtccgacNNNNNN (SEQ ID NO: 3)
Downstream oligonucleotide: Pi-gtcggacctaggtcgctaccttaggaccgttatagttactcgaggtctctctct-NH ₂ (SEQ ID NO: 4)

オリゴヌクレオチドを、４×ＧＮ５：１×Ｎ６：５×「下流」の比且つ１００ｍＭ塩化ナトリウム中に２μｇ／μｌの濃度で混合した。アニーリングのために、混合物を６５℃でインキュベートし、その後４５℃で５分間、３７℃で１０分間、および２５℃で１０分間さらにインキュベートした。リンカーの一本鎖ｃＤＮＡへのライゲーションのために、１μｇ ｃＤＮＡあたり２μｇのリンカーを使用した。   Oligonucleotides were mixed in a ratio of 4 × GN5: 1 × N6: 5 × “downstream” and a concentration of 2 μg / μl in 100 mM sodium chloride. For annealing, the mixture was incubated at 65 ° C, followed by further incubation at 45 ° C for 5 minutes, 37 ° C for 10 minutes, and 25 ° C for 10 minutes. For ligation of the linker to single stranded cDNA, 2 μg of linker per 1 μg cDNA was used.

最終体積７．５μｌの０．１×ＴＥ中に上記ｃＤＮＡおよび上記リンカーを混合し、６５℃で５分間インキュベートしてｃＤＮＡの二次構造を融解した。次いで、ＴａＫａＲａライゲーションキット（バージョン２）を使用して、二本鎖リンカーを一本鎖ｃＤＮＡにライゲーションした。キットの７．５μｌの「ＩＩ液」および１５μｌの「Ｉ液」を取り出し上記アニーリング反応混合物に添加し、混合し、１６℃で１０時間インキュベートした。０．５ＭのＥＤＴＡを１μｌ、１０％ＳＤＳを１μｌ、１０ｍｇ／ｍｌプロテアーゼＫを１μｌ、および水を１０μｌ添加して、ライゲーション反応を停止させた。４５℃で１５分間のインキュベーション後、得られた混合物を３倍過剰のＴｒｉｓ平衡化フェノール／クロロホルムで抽出した。残存する過剰な遊離リンカーを、製造者の説明書に従ってＳ−３００スピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中での溶液の濾過によって反応混合物から除去した。簡単に述べれば、Ｓ−３００カラムを遠心管に移し、３，０００ｒｐｍで１分間スピンしてカラムから保存緩衝液を除去した。カラムを新規の遠心管に置いた後、ＤＮＡサンプル（約６０μｌ）および別の４０μｌの水をカラムに添加し、カラムを４℃、３，０００ｒｐｍで５分間スピンして濾過物を回収した。ＤＮＡを濃縮するために、Ｓ３００カラム由来の溶離物をＭｉｃｒｏｃｏｎ１００メンブレン（Ａｍｉｃｏｎ）上に置き、最終体積が１０μｌになるまで遠心分離した。メンブレンを、１０μｌの０．１×ＴＥにて６５℃で３分間１回洗浄し、以後の第２の鎖合成で使用するために画分を１つにした。   The cDNA and the linker were mixed in a final volume of 7.5 μl of 0.1 × TE and incubated at 65 ° C. for 5 minutes to melt the secondary structure of the cDNA. The double stranded linker was then ligated to single stranded cDNA using the TaKaRa ligation kit (version 2). 7.5 μl “Liquid II” and 15 μl “Liquid I” of the kit were removed and added to the annealing reaction mixture, mixed and incubated at 16 ° C. for 10 hours. The ligation reaction was stopped by adding 1 μl of 0.5 M EDTA, 1 μl of 10% SDS, 1 μl of 10 mg / ml protease K, and 10 μl of water. After 15 minutes incubation at 45 ° C., the resulting mixture was extracted with a 3-fold excess of Tris equilibrated phenol / chloroform. Residual excess free linker was removed from the reaction mixture by filtration of the solution in an S-300 spin column (Amersham Pharmacia Biosciences) according to the manufacturer's instructions. Briefly, the S-300 column was transferred to a centrifuge tube and spun at 3,000 rpm for 1 minute to remove the storage buffer from the column. After placing the column in a new centrifuge tube, the DNA sample (approximately 60 μl) and another 40 μl of water were added to the column and the column was spun at 4 ° C., 3,000 rpm for 5 minutes to collect the filtrate. To concentrate the DNA, the eluate from the S300 column was placed on a Microcon 100 membrane (Amicon) and centrifuged to a final volume of 10 μl. The membrane was washed once with 10 μl of 0.1 × TE for 3 minutes at 65 ° C., and the fractions were combined for use in subsequent second strand synthesis.

第２のｃＤＮＡ鎖の合成のために、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを適用した。この反応を高温で行うので、過剰の上流プライマーを反応混合物に添加した。このプライマーを、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ Ｊａｐａｎから入手し、使用前にゲル精製した。プライマー配列は、上流プライマーと上記の特徴が類似しているが、ランダム突出末端を含まなかった。５’−Ｂｉｏ−ａｇａｇａｇａｇａｃｃｔｃｇａｇｔａａｃｔａｔａａｃｇｇｔｃｃｔａａｇｇｔａｇｃｇａｃｃｔａｇｇｔｃｃｇａｃｇ（配列番号５）。   A thermostable DNA polymerase was applied for the synthesis of the second cDNA strand. As this reaction was performed at an elevated temperature, excess upstream primer was added to the reaction mixture. This primer was obtained from Invtrogen Japan and gel purified prior to use. The primer sequence was similar in characteristics to the upstream primer but did not contain random overhangs. 5'-Bio-agagagagaccctcgagataactataacgggtcctaaggtagcgacctagggtccgagg (SEQ ID NO: 5)

反応混合物を、以下の成分の混合によって準備した。
・ｃＤＮＡサンプル １０μｌ
・１００ｎｇ／μｌ第２のプライマー鎖 ６μｌ
・５×Ａ緩衝液（ＮＥＢ） ７．２μｌ
・５×Ｂ緩衝液（ＮＥＢ） ４．８μｌ
・２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｔａｋａｒａ） ６μｌ
・ｄｄＨ₂Ｏ ４５μｌまで The reaction mixture was prepared by mixing the following components.
・ CDNA sample 10μl
100 ng / μl second primer strand 6 μl
・ 5 × A buffer (NEB) 7.2 μl
・ 5 × B buffer (NEB) 4.8 μl
・ 2.5 mM dNTP (Takara) 6 μl
・ Up to 45μl of ddH ₂ O

反応混合物を、６５℃に加熱し、その後１５μｌの１Ｕ／μｌ ＥＬＯＮＧＡＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、以下の設定でサーマルサイクラーにて反応を行った。６５℃で５分間、６８℃で３０分間、および７２℃で１０分間。１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１μｌの１０％ＳＤＳ、および１μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫの添加によってポリメラーゼ反応を停止させた。４５℃で１５分間のインキュベーション後、反応混合物を同体積のＴｒｉｓ平衡化フェノール／クロロホルム（１：１比）で抽出した。残存する過剰な遊離プライマーを、製造者の説明書に従ってＳ−３００スピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中での溶液の濾過によって反応混合物から除去した。簡単に述べれば、Ｓ−３００カラムを遠心管に移し、３，０００ｒｐｍで１分間スピンしてカラムから保存緩衝液を除去した。カラムを新規の遠心管に置いた後、ＤＮＡサンプル（約６０μｌ）および別の４０μｌの水をカラムに添加し、カラムを４℃、３，０００ｒｐｍで５分間スピンして濾過物を回収した。ＤＮＡを濃縮するために、Ｓ３００カラム由来の溶離物をＭｉｃｒｏｃｏｎ１００メンブレン（Ａｍｉｃｏｎ）上に置き、最終体積が１０μｌになるまで遠心分離した。メンブレンを、１０μｌの０．１×ＴＥにて６５℃で３分間１回洗浄し、次のステップで使用するために画分を１つにした。   The reaction mixture was heated to 65 ° C., and then 15 μl of 1 U / μl ELONGASE (Invitrogen) was added, and the reaction was performed with a thermal cycler with the following settings. 5 minutes at 65 ° C, 30 minutes at 68 ° C, and 10 minutes at 72 ° C. The polymerase reaction was stopped by the addition of 1 μl 0.5 M EDTA, 1 μl 10% SDS, and 1 μl 10 mg / ml proteinase K. After 15 minutes incubation at 45 ° C., the reaction mixture was extracted with the same volume of Tris equilibrated phenol / chloroform (1: 1 ratio). Residual excess free primer was removed from the reaction mixture by filtration of the solution in an S-300 spin column (Amersham Pharmacia Biosciences) according to the manufacturer's instructions. Briefly, the S-300 column was transferred to a centrifuge tube and spun at 3,000 rpm for 1 minute to remove the storage buffer from the column. After placing the column in a new centrifuge tube, the DNA sample (approximately 60 μl) and another 40 μl of water were added to the column and the column was spun at 4 ° C., 3,000 rpm for 5 minutes to collect the filtrate. To concentrate the DNA, the eluate from the S300 column was placed on a Microcon 100 membrane (Amicon) and centrifuged to a final volume of 10 μl. The membrane was washed once with 10 μl of 0.1 × TE for 3 minutes at 65 ° C., and the fractions were combined for use in the next step.

得られた二本鎖ｃＤＮＡを、次のステップで、クラスＩＩＳ制限酵素（本実施例の目的ではＭｍｅＩであった）で切断した。最終体積１００μｌで以下の成分を混合することによって反応を準備した。
・ｄｄｃＤＮＡ ５０μｌ
・１０×反応緩衝液（ＮＥＢ） １０μｌ
・ＭｍｅＩ（２Ｕ／μｌ、３Ｕ／μｇＤＮＡに等しい） １．５μｌ
・１０×ＳＡＭ ２μｌ
・ｄｄＨ₂Ｏ 最終体積１００μｌにする The resulting double-stranded cDNA was cleaved with a class IIS restriction enzyme (which was MmeI for the purposes of this example) in the next step. The reaction was prepared by mixing the following components in a final volume of 100 μl.
・ DdcDNA 50μl
10 × reaction buffer (NEB) 10 μl
Mmel (equal to 2U / μl, 3U / μg DNA) 1.5μl
・ 10 × SAM 2 μl
DdH ₂ O to a final volume of 100 μl

３７℃で１時間のインキュベーション後、２μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、２μｌの１０％ＳＤＳ、および２μｌの１０μｇ／μｌプロテイナーゼＫの添加およびその後の４５℃でさらに１５分間のインキュベーションによって反応を停止させた。次いで、反応混合物を同体積のＴｒｉｓ平衡化フェノール：クロロホルム（１：１比）で１回抽出し、１５０μｌのサンプル、７．５μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、３μｌの１μｇ／μｌグリコーゲン、および１５０μｌのイソプロパノールの添加により、イソプロパノールで水相からＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で約３０分間のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。５００μｌの８０％エタノールでのペレットの２回の洗浄後、最後にＤＮＡを２μｌの０．１×ＴＥ緩衝液に再懸濁した。   After 1 hour incubation at 37 ° C., the reaction was stopped by addition of 2 μl 0.5 M EDTA, 2 μl 10% SDS, and 2 μl 10 μg / μl proteinase K followed by an additional 15 minutes incubation at 45 ° C. The reaction mixture was then extracted once with the same volume of Tris-equilibrated phenol: chloroform (1: 1 ratio), 150 μl sample, 7.5 μl 5M sodium chloride, 3 μl 1 μg / μl glycogen, and 150 μl isopropanol. Upon addition, DNA was precipitated from the aqueous phase with isopropanol. After incubation for about 30 minutes at -80 ° C, the DNA was recovered by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes. After two washes of the pellet with 500 μl of 80% ethanol, the DNA was finally resuspended in 2 μl of 0.1 × TE buffer.

クラスＩＩＳ制限酵素ＭｍｅＩで二本鎖ｃＤＮＡを切断した後、第２のリンカーを制限部位で２ｂｐ突出末端にライゲーションした。この第２のリンカーは、４５ｂｐ長の以下の２つのオリゴヌクレオチドおよびＸｂａＩ認識部位から構成され、以後のクローニングのために本実施例で使用した。しかし、他の制限酵素をこのステップで類似の効率で適用することができるので、本発明はＸｂａＩの使用に制限されない。   After cleaving the double-stranded cDNA with class IIS restriction enzyme MmeI, the second linker was ligated to the 2 bp protruding end at the restriction site. This second linker was composed of the following two oligonucleotides of 45 bp in length and an XbaI recognition site, and was used in this example for subsequent cloning. However, the invention is not limited to the use of XbaI since other restriction enzymes can be applied with similar efficiency in this step.

上流−ＸｂａＩ：Ｐｉ−ｔｃｔａｇａｔｃａｇｇａｃｔｃｔｔｃｔａｔａｇｔｇｔｃａｃｃｔａａａｇｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃ−ＮＨ２（配列番号６） Upstream-XbaI: Pi-tctagatcaggactcttctatagtgtcaccataagtctctctctc-NH2 (SEQ ID NO: 6)

下流−ＸｂａＩ：ｇａｇａｇａｇａｇａｃｔｔｔａｇｇｔｇａｃａｃｔａｔａｇａａｇａｇｔｃｃｔｇａｔｃｔａｇａＮＮ（配列番号７） Downstream-XbaI: gagagagagagtttaggtgacacatatagaagagagtcctgattagagaNN (SEQ ID NO: 7)

２つのオリゴヌクレオチドをＥｓｐｅｃから入手し、アニーリング前にアクリルアミド電気泳動によって精製した。アニーリングのために、２μｇ／μｌの各オリゴヌクレオチドを含む１００ｍＭ塩化ナトリウムの混合物を６５℃でインキュベートし、その後４５℃で５分間、３７℃で１０分間、および２５℃で１０分間さらにインキュベートした。   Two oligonucleotides were obtained from Espec and purified by acrylamide electrophoresis prior to annealing. For annealing, a mixture of 100 mM sodium chloride containing 2 μg / μl of each oligonucleotide was incubated at 65 ° C., followed by further incubation at 45 ° C. for 5 minutes, 37 ° C. for 10 minutes, and 25 ° C. for 10 minutes.

次いで、２μｌの上記ｃＤＮＡ溶液、４μｌのアニーリングしたリンカーＤＮＡ（０．４μｇ／μｌ）、および８μｌの水を含む反応混合物中で二本鎖リンカーをｃＤＮＡにライゲーションした。リガーゼの添加前に、反応混合物を６５℃で２分間インキュベートし、その後氷上で短時間インキュベートした。次いで、２μｌの１０×反応緩衝液（ＮＥＢ）、２μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、４０Ｕ／μｌ）、および２μｌの水を添加し、その後１６℃で１６時間インキュベートした。反応混合物を６５℃に５分間加熱してライゲーション反応を停止させた。   The double stranded linker was then ligated to the cDNA in a reaction mixture containing 2 μl of the above cDNA solution, 4 μl of annealed linker DNA (0.4 μg / μl), and 8 μl of water. Prior to the addition of ligase, the reaction mixture was incubated at 65 ° C. for 2 minutes followed by a brief incubation on ice. 2 μl of 10 × reaction buffer (NEB), 2 μl of T4 DNA ligase (NEB, 40 U / μl), and 2 μl of water were then added, followed by incubation at 16 ° C. for 16 hours. The reaction mixture was heated to 65 ° C. for 5 minutes to stop the ligation reaction.

第１のリンカーへのライゲーションに失敗した非修飾ＤＮＡから５’末端にビオチン溶液（ｍｏｉｓｔｕｒｅ）を有するライゲーション産物を分離した。ストレプトアビジンコーティング磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を、上記と類似の方法でこの時点で使用した。約２００μｌの元のスラリーを、時々撹拌しながら２００μｌの体積の５μｇのｔＲＮＡと室温で２０分間インキュベートした。磁力によるビーズの回収後、ビーズを、１Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、および５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む２００μｌの緩衝液で３回洗浄し、その後２００μｌの同一の緩衝液に再懸濁した。洗浄ステップ後、ビーズを上記ライゲーション産物と混合し、得られたスラリーを撹拌しながら室温で１５分間インキュベートして修飾ＤＮＡをビーズに結合させた。結合反応終了後、磁力の印加によりビーズを回収し、上清を完全に除去した。磁力によってチューブの底を固定しながら、ビーズを２００μｌの１×Ｂ＆Ｗ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ塩化ナトリウム）＋１×ＢＳＡ緩衝液（１ｍｇ／ｍｌ（ＮＥＢ））で２回、２００μｌのＢ＆Ｗ緩衝液で２回、最後に２００μｌの０．１×ＴＥで２回リンスした。   Ligation products having a biotin solution at the 5 'end were separated from unmodified DNA that failed to ligate to the first linker. Streptavidin-coated magnetic beads (Dynabeads) were used at this point in a similar manner as described above. Approximately 200 μl of the original slurry was incubated with a 200 μl volume of 5 μg tRNA for 20 minutes at room temperature with occasional agitation. After magnetic recovery of the beads, the beads are washed three times with 200 μl of buffer containing 1 M sodium chloride, 0.5 mM EDTA, and 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), and then reconstituted in 200 μl of the same buffer. Suspended. After the washing step, the beads were mixed with the ligation product, and the resulting slurry was incubated for 15 minutes at room temperature with stirring to allow the modified DNA to bind to the beads. After completion of the binding reaction, the beads were recovered by applying a magnetic force, and the supernatant was completely removed. While fixing the bottom of the tube by magnetic force, the beads were washed with 200 μl of 1 × B & W buffer (10 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 2M sodium chloride) + 1 × BSA buffer (1 mg / ml (NEB)). Rinse twice with 200 μl B & W buffer and finally twice with 200 μl 0.1 × TE.

ビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって磁性ビーズに結合したＤＮＡフラグメントを、過剰な遊離ビオチンでの処理によりビーズから遊離させた。新鮮なビオチンストック（Ｓｉｇｍａ）を、４Ｍグアニジントリシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、および０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム中で最終濃度１．５％（Ｗ／Ｖ）に直接調製した。上記ビーズを、５０μｌのビオチン溶液に再懸濁し、時々撹拌しながら４５℃で３０分間インキュベートした。磁力の印加によってビーズから上清を分離し、個別のチューブに回収した。上記と同一の条件下で溶離ステップを３回繰り返し、全画分をイソプロパノール沈殿によるｃＤＮＡの単離のためにプールした。イソプロパノール沈殿のために、約２５０μｌのサンプルを、１２．５μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、３．５μｌの１μｇ／μｌグリコーゲン溶液、および２５０μｌのイソプロパノールと混合した。−８０℃で３０分間のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって沈殿物を回収し、ペレットを、５００μｌの８０％エタノールで２回洗浄し、その後５０μｌの０．１×ＴＥに再懸濁した。   DNA fragments bound to the magnetic beads by biotin-streptavidin interaction were released from the beads by treatment with excess free biotin. Fresh biotin stock (Sigma) prepared directly in 4M guanidine tricyanate, 25 mM sodium citrate (pH 7.0), and 0.5% N-lauroyl sarcosine sodium to a final concentration of 1.5% (W / V) did. The beads were resuspended in 50 μl of biotin solution and incubated at 45 ° C. for 30 minutes with occasional agitation. The supernatant was separated from the beads by applying a magnetic force and collected in a separate tube. The elution step was repeated 3 times under the same conditions as above and all fractions were pooled for isolation of cDNA by isopropanol precipitation. For isopropanol precipitation, approximately 250 μl of sample was mixed with 12.5 μl of 5M sodium chloride, 3.5 μl of 1 μg / μl glycogen solution, and 250 μl of isopropanol. After 30 minutes incubation at −80 ° C., the precipitate is recovered by centrifugation at 15,000 rpm for 15 minutes and the pellet is washed twice with 500 μl of 80% ethanol and then reconstituted in 50 μl of 0.1 × TE. Suspended.

製造者の説明書にしたがって、Ｇ５０スピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのゲル濾過によってＤＮＡをさらに精製し、その後ＲＮアーゼおよびプロテイナーゼＫで処理した。ゲル濾過由来の約１００μｌのサンプルに、２μｌのＲＮアーゼＩ（ＰｒｏＭｅｇａ）を添加し、得られた反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、その後１０μｇ／μｌプロテイナーゼＫを２μｌ、０．５ＭのＥＤＴＡを２μｌ、および１０％ＳＤＳを２μｌ添加し、４５℃で１５分間さらにインキュベートした。次いで、反応混合物を、同体積のＴｒｉｓ平衡化フェノール：クロロホルム（１：１比）で１回抽出し、１５０μｌのサンプル、７．５μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、３μｌの１μｇ／μｌグリコーゲン、および１５０μｌのイソプロパノールの添加によってイソプロパノールで水相からＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で約３０分間のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。   The DNA was further purified by gel filtration on a G50 spin column (Amersham Pharmacia Biosciences) according to the manufacturer's instructions and then treated with RNase and proteinase K. To approximately 100 μl of sample from gel filtration, 2 μl of RNase I (ProMega) is added and the resulting reaction mixture is incubated at 37 ° C. for 10 minutes, after which 2 μl of 10 μg / μl proteinase K, 0.5 M EDTA 2 μl, and 2 μl of 10% SDS were added and further incubated at 45 ° C. for 15 minutes. The reaction mixture was then extracted once with the same volume of Tris equilibrated phenol: chloroform (1: 1 ratio), 150 μl sample, 7.5 μl 5M sodium chloride, 3 μl 1 μg / μl glycogen, and 150 μl isopropanol. Was precipitated from the aqueous phase with isopropanol. After incubation for about 30 minutes at -80 ° C, the DNA was recovered by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes.

ペレットを５００μｌの８０％エタノールで２回洗浄後、最後にＤＮＡを２０μｌの０．１×ＴＥ緩衝液に再懸濁した。   After the pellet was washed twice with 500 μl of 80% ethanol, the DNA was finally resuspended in 20 μl of 0.1 × TE buffer.

クローニング前に、ＤＮＡフラグメントを、以下のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｊａｐａｎから入手した２つのリンカー特異的プライマーを使用したＰＣＲステップによって増幅した。   Prior to cloning, the DNA fragment was amplified by a PCR step using two linker-specific primers obtained from Invitrogen Japan:

プライマー１（ｕｎｉ−ＰＣＲ）
５’Ｂｉｏ−ｇａｇａｇａｇａｇａｃｔｔｔａｇｇｔｇａｃａｃｔａ ３’（配列番号８）
プライマー２（ＭｍｅＩ−ＰＣＲ）
５’Ｂｉｏ−ａｇａｇａｇａｇａｃｃｔｃｇａｇｔａａｃｔａｔａａ ３’（配列番号９） Primer 1 (uni-PCR)
5 ′ Bio-gagagagagagtttagggtgacatta 3 ′ (SEQ ID NO: 8)
Primer 2 (MmeI-PCR)
5 'Bio-agagagagacctcgagattaactata 3' (SEQ ID NO: 9)

全体積５０μｌおよび以下の設定でＰＣＲ増幅を行った。
・ＤＮＡサンプル １μｌ
・１０×緩衝液 ５μｌ
・ＤＭＳＯ ３μｌ
・２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ １２．５μｌ
・プライマー１（３５０ｎｇ／μｌ） ０．５μｌ
・プライマー２（３５０ｎｇ／μｌ） ０．５μｌ
・ｄｄＨ₂Ｏ ２７．５μｌ
・ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μｌ，ＴａＫａＲａ） ０．５ μｌ PCR amplification was performed with a total volume of 50 μl and the following settings.
・ DNA sample 1μl
・ 10x buffer 5μl
・ DMSO 3μl
・ 2.5 mM dNTPs 12.5 μl
・ Primer 1 (350 ng / μl) 0.5 μl
・ Primer 2 (350 ng / μl) 0.5 μl
DdH ₂ O 27.5 μl
・ ExTaq (5U / μl, TaKaRa) 0.5 μl

９４℃で１分間の最初のインキュベーション後、サーマルサイクラーにて９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７０℃で２分間を１５サイクル行い、その後最後に７０℃で５分間インキュベートした。全ＤＮＡサンプルを対象とするために、２０のＰＣＲ反応を並行して実施して、増幅ステップ時により高い収量を得た。次いで、得られたＰＣＲ産物をプールし、さらに精製した。約６００μｌのＤＮＡサンプルに１０μｌの１０μｇ／μｌプロテイナーゼＫ、１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、および１０μｌの１０％ＳＤＳを添加し、４５℃で１５分間インキュベートした。次いで、反応混合物を、同体積のＴｒｉｓ平衡化フェノール：クロロホルム（１：１比）で１回抽出し、６００μｌのサンプル、３０μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、３．５μｌの１μｇ／μｌグリコーゲン、および６００μｌのイソプロパノールの添加によってイソプロパノールで水相からＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で約３０分間のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。ペレットを５００μｌの８０％エタノールで２回洗浄後、最後にＤＮＡを５０μｌの０．１×ＴＥ緩衝液に再懸濁した。   After an initial incubation at 94 ° C. for 1 minute, the thermal cycler was subjected to 15 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute, and 70 ° C. for 2 minutes, and finally incubated at 70 ° C. for 5 minutes. In order to target the entire DNA sample, 20 PCR reactions were performed in parallel, resulting in higher yields during the amplification step. The resulting PCR products were then pooled and further purified. To about 600 μl of DNA sample, 10 μl of 10 μg / μl proteinase K, 10 μl of 0.5M EDTA, and 10 μl of 10% SDS were added and incubated at 45 ° C. for 15 minutes. The reaction mixture was then extracted once with the same volume of Tris equilibrated phenol: chloroform (1: 1 ratio), 600 μl sample, 30 μl 5M sodium chloride, 3.5 μl 1 μg / μl glycogen, and 600 μl isopropanol. Was precipitated from the aqueous phase with isopropanol. After incubation for about 30 minutes at -80 ° C, the DNA was recovered by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes. After the pellet was washed twice with 500 μl of 80% ethanol, the DNA was finally resuspended in 50 μl of 0.1 × TE buffer.

ＰＣＲ産物を、１２％ポリアクリルアミドゲルでさらに精製した。１１９ｂｐの適切なバンドを、ＵＶで視覚化し、適切なマーカーとの比較によって同定し、ブレードでゲルから切り出し、チューブに移し、機械的な力によって破壊し、０．５Ｍ酢酸アンモニウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、および０．１％ＳＤＳを含む１５０μｌの緩衝液にて６５℃で１時間抽出した。溶離ステップを２回繰り返し、その後ＭｉｃｒｏＳｐｉｎカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で３，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離によって上清を濾過した。別の５０μｌの０．１×ＴＥのカラムへの適用後に、遠心分離を繰り返した。次いで、得られた約３００μｌの抽出物を、同体積のＴｒｉｓ平衡化フェノール：クロロホルム（１：１比）で１回抽出し、３００μｌのサンプル、１５μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、３．５μｌの１μｇ／μｌグリコーゲン、および７５０μｌの無水エタノールの添加によってエタノールで水相からＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で約３０分間のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。ペレットを５００μｌの８０％エタノールで２回洗浄後、最後にＤＮＡを５０μｌの０．１×ＴＥ緩衝液に再懸濁した。   The PCR product was further purified on a 12% polyacrylamide gel. Appropriate 119 bp bands were identified with UV, identified by comparison with appropriate markers, cut from the gel with a blade, transferred to a tube, broken by mechanical force, 0.5 M ammonium acetate, 10 mM magnesium acetate, Extraction was performed at 65 ° C. for 1 hour with 150 μl of a buffer containing 1 mM EDTA (pH 8.0) and 0.1% SDS. The elution step was repeated twice, after which the supernatant was filtered by centrifugation for 2 minutes at 3,000 rpm in a MicroSpin column (Amersham Pharmacia Biosciences). Centrifugation was repeated after application to another 50 μl 0.1 × TE column. The resulting approximately 300 μl extract was then extracted once with the same volume of Tris equilibrated phenol: chloroform (1: 1 ratio), 300 μl sample, 15 μl 5 M sodium chloride, 3.5 μl 1 μg / μl DNA was precipitated from the aqueous phase with ethanol by the addition of glycogen and 750 μl absolute ethanol. After incubation for about 30 minutes at -80 ° C, the DNA was recovered by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes. After the pellet was washed twice with 500 μl of 80% ethanol, the DNA was finally resuspended in 50 μl of 0.1 × TE buffer.

クローニング前に、ＤＮＡフラグメントを、上記と同一の条件下での第２のＰＣＲステップによって再増幅させた。この第２のＰＣＲ増幅が好ましいが、ライゲーションに十分な量のＤＮＡを得るために不可欠ではない。簡単に述べれば、５０μｌの全体積および以下の設定でＰＣＲ増幅を行った。   Prior to cloning, the DNA fragment was reamplified by a second PCR step under the same conditions as described above. This second PCR amplification is preferred but not essential to obtain a sufficient amount of DNA for ligation. Briefly, PCR amplification was performed with a total volume of 50 μl and the following settings.

・ＤＮＡサンプル １μｌ
・１０×緩衝液 ５μｌ
・ＤＭＳＯ ３μｌ
・２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ １２．５μｌ
・プライマー１（３５０ｎｇ／μｌ） ０．５μｌ
・プライマー２（３５０ｎｇ／μｌ） ０．５μｌ
・ｄｄＨ₂Ｏ ２７．５μｌ
・ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μｌ，ＴａＫａＲａ） ０．５μｌ ・ DNA sample 1μl
・ 10x buffer 5μl
・ DMSO 3μl
・ 2.5 mM dNTPs 12.5 μl
・ Primer 1 (350 ng / μl) 0.5 μl
・ Primer 2 (350 ng / μl) 0.5 μl
DdH ₂ O 27.5 μl
・ ExTaq (5U / μl, TaKaRa) 0.5μl

９４℃で１分間の最初のインキュベーション後、サーマルサイクラーにて９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７０℃で２分間を６サイクル行い、その後最後に７０℃で５分間インキュベートした。全ＤＮＡサンプルを対象とするために、２０のＰＣＲ反応を並行して実施して、増幅ステップ時により高い収量を得た。次いで、得られたＰＣＲ産物をプールし、さらに精製した。約６００μｌのＤＮＡサンプルに、１０μｇ／μｌプロテイナーゼＫを１０μｌ、０．５ＭのＥＤＴＡを１０μｌ、および１０％ＳＤＳを１０μｌ添加し、４５℃で１５分間インキュベートした。次いで、反応混合物を、同体積のＴｒｉｓ平衡化フェノール：クロロホルム（１：１比）で１回抽出し、６００μｌのサンプル、５Ｍ塩化ナトリウムを３０μｌ、１μｇ／μｌグリコーゲンを３．５μｌ、およびイソプロパノールを６００μｌ添加してイソプロパノールで水相からＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で約３０分間のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。ペレットを５００μｌの８０％エタノールで２回洗浄後、最後にＤＮＡを３０μｌの０．１×ＴＥ緩衝液に再懸濁した。   After an initial incubation at 94 ° C. for 1 minute, 6 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute, and 70 ° C. for 2 minutes were performed, followed by a final incubation at 70 ° C. for 5 minutes. In order to target the entire DNA sample, 20 PCR reactions were performed in parallel, resulting in higher yields during the amplification step. The resulting PCR products were then pooled and further purified. To about 600 μl of DNA sample, 10 μl of 10 μg / μl proteinase K, 10 μl of 0.5 M EDTA, and 10 μl of 10% SDS were added and incubated at 45 ° C. for 15 minutes. The reaction mixture was then extracted once with the same volume of Tris equilibrated phenol: chloroform (1: 1 ratio), 600 μl of sample, 30 μl of 5M sodium chloride, 1 μg / μl glycogen 3.5 μl, and isopropanol 600 μl. The DNA was precipitated from the aqueous phase with addition of isopropanol. After incubation for about 30 minutes at -80 ° C, the DNA was recovered by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes. After the pellet was washed twice with 500 μl of 80% ethanol, the DNA was finally resuspended in 30 μl of 0.1 × TE buffer.

本実施例の目的のために、精製ＰＣＲ産物を制限酵素ＸｍａＪＩおよびＸｂａＩによって消化した。これら２つの制限酵素での切断により、コンカテマーの形成時に再度組み合わせることができる同一の突出末端が得られることに留意のこと。しかし、他の制限酵素を使用して類似の結果を得ることができるので、本発明はこれら２つの酵素の使用に制限されない。ＤＮＡを、以下から構成されるＸｍａＪＩを含む１００μｌの反応混合物で最初に切断した。   For the purposes of this example, the purified PCR product was digested with restriction enzymes XmaJI and XbaI. Note that cleavage with these two restriction enzymes yields the same overhang that can be recombined during concatemer formation. However, the present invention is not limited to the use of these two enzymes as other restriction enzymes can be used to obtain similar results. The DNA was first cleaved with 100 μl of reaction mixture containing XmaJI consisting of:

・ＤＮＡサンプル ３０μｌ
・１０×緩衝液（Ｆｅｒｍａｎｔｕｓ） １０μｌ
・ＸｍａＪＩ（１０Ｕ／μｌ、Ｆｅｒｍａｎｔｕｓ） １０μｌ
・ｄｄＨ₂Ｏ ５０μｌ ・ DNA sample 30μl
10 × buffer (Fermantus) 10 μl
・ XmaJI (10 U / μl, Fermantus) 10 μl
・ DdH ₂ O 50 μl

３７℃で１時間のインキュベーション後、１０μｇ／μｌプロテイナーゼＫを２μｌ、０．５ＭのＥＤＴＡを２μｌ、および１０％ＳＤＳを２μｌサンプルに添加し、４５℃で１５分間インキュベーションした。次いで、反応混合物を、同体積のＴｒｉｓ平衡化フェノール：クロロホルム（１：１比）で１回抽出し、サンプルを２００μｌ、５Ｍ塩化ナトリウムを１０μｌ、１μｇ／μｌグリコーゲンを３．５μｌ、およびイソプロパノールを２００μｌ添加してイソプロパノールで水相からＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で約３０分間のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。ペレットを５００μｌの８０％エタノールで２回洗浄後、最後にＤＮＡを１０μｌの０．１×ＴＥ緩衝液に再懸濁した。   After 1 hour incubation at 37 ° C., 2 μl of 10 μg / μl proteinase K, 2 μl of 0.5 M EDTA, and 2 μl of 10% SDS were added to the sample and incubated at 45 ° C. for 15 minutes. The reaction mixture was then extracted once with the same volume of Tris equilibrated phenol: chloroform (1: 1 ratio), 200 μl sample, 10 μl 5M sodium chloride, 3.5 μl glycogen, and 200 μl isopropanol. The DNA was precipitated from the aqueous phase with addition of isopropanol. After incubation for about 30 minutes at -80 ° C, the DNA was recovered by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes. After the pellet was washed twice with 500 μl of 80% ethanol, the DNA was finally resuspended in 10 μl of 0.1 × TE buffer.

ＸｂａＩでの第２の消化のために、上記のＤＮＡを、以下から構成されるＸｂａＩを含む１００μｌの反応混合物で切断した。   For a second digest with XbaI, the DNA was cut with 100 μl of reaction mixture containing XbaI consisting of:

・ＤＮＡサンプル １０μｌ
・１０×緩衝液（ＮＥＢ） １１μｌ
・１０×ＢＳＡ（ＮＥＢ） １１μｌ
・ＸｂａＩ（２０Ｕ／μｌ、ＮＥＢ） １１μｌ
・ｄｄＨ₂Ｏ ６７μｌ ・ DNA sample 10μl
・ 10 × Buffer (NEB) 11 μl
・ 10 × BSA (NEB) 11 μl
・ XbaI (20 U / μl, NEB) 11 μl
・ DdH ₂ O 67μl

３７℃で１時間のインキュベーション後、１０μｇ／μｌプロテイナーゼＫを２μｌ、０．５ＭのＥＤＴＡを２μｌ、および１０％ＳＤＳを２μｌサンプルに添加し、４５℃で１５分間インキュベーションした。次いで、反応混合物を、同体積のＴｒｉｓ平衡化フェノール：クロロホルム（１：１比）で１回抽出し、２００μｌのサンプル、１０μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、３．５μｌの１μｇ／μｌグリコーゲン、および２００μｌのイソプロパノールの添加によってイソプロパノールで水相からＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で約３０分間のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。ペレットを５００μｌの８０％エタノールで２回洗浄後、最後にＤＮＡを１０μｌの０．１×ＴＥ緩衝液に再懸濁した。   After 1 hour incubation at 37 ° C., 2 μl of 10 μg / μl proteinase K, 2 μl of 0.5 M EDTA, and 2 μl of 10% SDS were added to the sample and incubated at 45 ° C. for 15 minutes. The reaction mixture was then extracted once with the same volume of Tris equilibrated phenol: chloroform (1: 1 ratio), 200 μl sample, 10 μl 5 M sodium chloride, 3.5 μl 1 μg / μl glycogen, and 200 μl isopropanol. Was precipitated from the aqueous phase with isopropanol. After incubation for about 30 minutes at -80 ° C, the DNA was recovered by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes. After the pellet was washed twice with 500 μl of 80% ethanol, the DNA was finally resuspended in 10 μl of 0.1 × TE buffer.

ストレプトアビジンコーティング磁性ビーズでのインキュベーションによって制限消化して切り出された遊離ＤＮＡ末端から得られた３３ｂｐのＤＮＡフラグメントを分離した。これはビオチン標識ＤＮＡフラグメントが保持されていると思われる。ストレプトアビジンコーティング磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を、上記と類似の方法でこの時点で使用した。約１００μｌの元のスラリーを、時々撹拌しながら５μｇのｔＲＮＡと室温で２０分間インキュベートした。磁力によるビーズの回収後、ビーズを、１００μｌの１×Ｂ＆Ｗで３回洗浄した。その後、上記ＤＮＡサンプルをビーズと混合し、撹拌しながら室温で１５分間インキュベートし、磁力による磁性ビーズの回収後、上清を除去した。ビーズを５０μｌの１×Ｂ＆Ｗ緩衝液で再度リンスし、回収された上清をＤＮＡのイソプロパノール沈殿に供した。約２５０μｌのサンプルに７．５μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、３．５μｌの１μｇ／μｌグリコーゲン、および２５０μｌのイソプロパノールを添加した。−８０℃で約３０分間のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。ペレットを５００μｌの８０％エタノールで２回洗浄後、最後にＤＮＡを１０μｌの０．１×ＴＥ緩衝液に再懸濁した。   The 33 bp DNA fragment obtained from the free DNA ends excised by restriction digestion by incubation with streptavidin coated magnetic beads was isolated. This seems to retain the biotin labeled DNA fragment. Streptavidin-coated magnetic beads (Dynabeads) were used at this point in a similar manner as described above. About 100 μl of the original slurry was incubated with 5 μg of tRNA for 20 minutes at room temperature with occasional agitation. After magnetic recovery of the beads, the beads were washed 3 times with 100 μl of 1 × B & W. Thereafter, the DNA sample was mixed with the beads, incubated at room temperature for 15 minutes with stirring, and after recovering the magnetic beads by magnetic force, the supernatant was removed. The beads were rinsed again with 50 μl of 1 × B & W buffer and the recovered supernatant was subjected to DNA isopropanol precipitation. To approximately 250 μl of sample was added 7.5 μl of 5M sodium chloride, 3.5 μl of 1 μg / μl glycogen, and 250 μl of isopropanol. After incubation for about 30 minutes at -80 ° C, the DNA was recovered by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes. After the pellet was washed twice with 500 μl of 80% ethanol, the DNA was finally resuspended in 10 μl of 0.1 × TE buffer.

ＲＮアーゼＩおよびプロテイナーゼＫ処理によってＤＮＡをさらに精製した。上記の１０μｌのサンプルに、５μｌの１０×ＲＮアーゼＩ緩衝液（ＰｒｏＭｅｇａ）、２μｌのＲＮアーゼ（ＰｒｏＭｅｇａ）、および３３μｌの水を添加し、得られた反応混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、その後１μｌの１０μｇ／μｌプロテイナーゼＫ、１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、および１μｌの１０％ＳＤＳを添加し、４５℃で１５分間さらにインキュベートした。次いで、反応混合物を、同体積のＴｒｉｓ平衡化フェノール：クロロホルム（１：１比）で１回抽出し、１００μｌのサンプル、５μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、３．５μｌの１μｇ／μｌグリコーゲン、および１００μｌのイソプロパノールの添加によってイソプロパノールで水相からＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で約３０分間のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。ペレットを５００μｌの８０％エタノールで２回洗浄後、最後にＤＮＡを４０μｌの０．１×ＴＥ緩衝液に再懸濁した。   The DNA was further purified by RNase I and proteinase K treatment. To the 10 μl sample above, 5 μl of 10 × RNase I buffer (ProMega), 2 μl of RNase (ProMega), and 33 μl of water are added, and the resulting reaction mixture is incubated at 37 ° C. for 15 minutes, 1 μl of 10 μg / μl proteinase K, 1 μl of 0.5M EDTA, and 1 μl of 10% SDS were then added and further incubated at 45 ° C. for 15 minutes. The reaction mixture was then extracted once with the same volume of Tris equilibrated phenol: chloroform (1: 1 ratio), 100 μl sample, 5 μl 5M sodium chloride, 3.5 μl 1 μg / μl glycogen, and 100 μl isopropanol. Was precipitated from the aqueous phase with isopropanol. After incubation for about 30 minutes at -80 ° C, the DNA was recovered by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes. After the pellet was washed twice with 500 μl of 80% ethanol, the DNA was finally resuspended in 40 μl of 0.1 × TE buffer.

ＤＮＡフラグメント、１２％ポリアクリルアミドゲルでさらに精製した。適切なマーカーとの比較によって同定した３３ｂｐの適切なバンドを、ブレードでゲルから切り出し、チューブに移し、機械的な力によって破壊し、０．５Ｍ酢酸アンモニウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、および０．１％ＳＤＳを含む１５０μｌの緩衝液にて３７℃で１時間抽出した。抽出ステップを２回繰り返し、その後ＭｉｃｒｏＳｐｉｎカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で３，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離によって上清を濾過した。別の５０μｌの０．１×ＴＥのカラムへの適用後に、遠心分離を繰り返した。次いで、得られた約３００μｌの抽出物を、同体積のＴｒｉｓ平衡化フェノール：クロロホルム（１：１比）で１回抽出し、３００μｌのサンプル、１５μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、３．５μｌの１μｇ／μｌグリコーゲン、および７５０μｌの無水エタノールの添加によってエタノールで水相からＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で約３０分間のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。ペレットを５００μｌの８０％エタノールで２回洗浄後、最後にＤＮＡを４μｌの水に再懸濁した。   The DNA fragment, 12% polyacrylamide gel was further purified. The appropriate 33 bp band identified by comparison with the appropriate marker was excised from the gel with a blade, transferred to a tube, disrupted by mechanical force, 0.5 M ammonium acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM EDTA (pH 8.0). ), And 150 μl of buffer containing 0.1% SDS at 37 ° C. for 1 hour. The extraction step was repeated twice, after which the supernatant was filtered by centrifugation for 2 minutes at 3,000 rpm in a MicroSpin column (Amersham Pharmacia Biosciences). Centrifugation was repeated after application to another 50 μl 0.1 × TE column. The resulting approximately 300 μl extract was then extracted once with the same volume of Tris equilibrated phenol: chloroform (1: 1 ratio), 300 μl sample, 15 μl 5 M sodium chloride, 3.5 μl 1 μg / μl DNA was precipitated from the aqueous phase with ethanol by the addition of glycogen and 750 μl absolute ethanol. After incubation for about 30 minutes at -80 ° C, the DNA was recovered by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes. After the pellet was washed twice with 500 μl of 80% ethanol, the DNA was finally resuspended in 4 μl of water.

本発明の次のステップでは、５’末端を含むＤＮＡフラグメントを互いにライゲーションしてコンカテマーを形成した。このライゲーションのために、以下の反応を設定した。   In the next step of the invention, DNA fragments containing the 5 'end were ligated together to form concatamers. The following reactions were set up for this ligation.

・ＤＮＡサンプル ４μｌ
・１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）１μｌ
・Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（４０Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ） １μｌ
・５０％ＰＥＧ８０００ ４μｌ ・ DNA sample 4μl
1 × 1 of 10 × T4 DNA ligase buffer (New England Biolabs)
T4 DNA ligase (40 U, New England Biolabs) 1 μl
・ 50% PEG8000 4μl

１６℃で４５分間のインキュベーション後、１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１μｌの１０％ＳＤＳ、１μｌの１０μｇ／μｌプロテイナーゼＫ、および３５μｌの水の添加により反応を停止させ、４５℃で１５分間さらにインキュベーションした。次いで、反応混合物を、同体積のＴｒｉｓ平衡化フェノール：クロロホルム（１：１比）で１回抽出し、１００μｌのサンプル、５μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、３．５μｌの１μｇ／μｌグリコーゲン、および１００μｌのイソプロパノールの添加によってイソプロパノールで水相からＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で約３０分間のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。ペレットを５００μｌの８０％エタノールで２回洗浄後、最後にＤＮＡを１０μｌの０．１×ＴＥ緩衝液に再懸濁した。   After 45 minutes incubation at 16 ° C., the reaction was stopped by addition of 1 μl 0.5 M EDTA, 1 μl 10% SDS, 1 μl 10 μg / μl proteinase K, and 35 μl water and further incubated at 45 ° C. for 15 minutes. . The reaction mixture was then extracted once with the same volume of Tris equilibrated phenol: chloroform (1: 1 ratio), 100 μl sample, 5 μl 5M sodium chloride, 3.5 μl 1 μg / μl glycogen, and 100 μl isopropanol. Was precipitated from the aqueous phase with isopropanol. After incubation for about 30 minutes at -80 ° C, the DNA was recovered by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes. After the pellet was washed twice with 500 μl of 80% ethanol, the DNA was finally resuspended in 10 μl of 0.1 × TE buffer.

上記ライゲーション反応により、種々の長さのコンカテマーが得られ、配列決定に適切な長さ（例えば、５００ｂｐ前後）のコンカテマーのみをクローニングするためにサイズ選択を行った。したがって、コンカテマーを８％ポリアクリルアミドゲルで分画し、５００ｂｐを超えるサイズのバンドおよび２００〜５００ｂｐのバンドをブレードでゲルから切り出し、個別にさらに処理した。チューブへのゲル片の移行後、これらを機械的な力によって破壊し、０．５Ｍ酢酸アンモニウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、および０．１％ＳＤＳを含む１５０μｌの緩衝液にて６５℃で１時間抽出した。抽出ステップを２回繰り返し、その後ＭｉｃｒｏＳｐｉｎカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で３，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離によって上清を濾過した。別の５０μｌの０．１×ＴＥのカラムへの適用後に、遠心分離を繰り返した。次いで、得られた約３００μｌの抽出物を、同体積のＴｒｉｓ平衡化フェノール：クロロホルム（１：１比）で１回抽出し、３００μｌのサンプル、１５μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、３．５μｌの１μｇ／μｌグリコーゲン、および７５０μｌの無水エタノールの添加によってエタノールで水相からＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で約３０分間のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。ペレットを５００μｌの８０％エタノールで２回洗浄後、最後にＤＮＡを２μｌの水に再懸濁した。   The ligation reaction yielded concatamers of various lengths, and size selection was performed to clone only concatemers with lengths appropriate for sequencing (eg, around 500 bp). Therefore, concatamers were fractionated on an 8% polyacrylamide gel and bands of size greater than 500 bp and bands of 200-500 bp were cut from the gel with a blade and further processed individually. After transfer of the gel pieces to the tube, they were broken by mechanical force and made into 150 μl buffer containing 0.5 M ammonium acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM EDTA (pH 8.0), and 0.1% SDS. And extracted at 65 ° C. for 1 hour. The extraction step was repeated twice, after which the supernatant was filtered by centrifugation for 2 minutes at 3,000 rpm in a MicroSpin column (Amersham Biosciences). Centrifugation was repeated after application to another 50 μl 0.1 × TE column. The resulting approximately 300 μl extract was then extracted once with the same volume of Tris equilibrated phenol: chloroform (1: 1 ratio), 300 μl sample, 15 μl 5 M sodium chloride, 3.5 μl 1 μg / μl DNA was precipitated from the aqueous phase with ethanol by the addition of glycogen and 750 μl absolute ethanol. After incubation for about 30 minutes at -80 ° C, the DNA was recovered by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes. After the pellet was washed twice with 500 μl of 80% ethanol, the DNA was finally resuspended in 2 μl of water.

最後のクローニングステップでは、コンカテマーを、標準的な条件下でＸｂａＩにて線状化したベクターｐＺＥｒｏ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、ゲル電気泳動によってさらに精製した。このライゲーションのために、以下の反応を設定した。   In the final cloning step, the concatamers were cloned into the vector pZEro-1 (Invitrogen) linearized with XbaI under standard conditions and further purified by gel electrophoresis. The following reactions were set up for this ligation.

・精製コンカテマー ２μｌ
・ＸｂａＩ消化ｐＺＥｒＯ−１（１００ｎｇ／μｌ） １．２５μｌ
・１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）０．５μｌ
・Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２４Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ） ０．６μｌ
・水 ０．６５μｌ ・ Purified concatamer 2μl
XbaI digested pZErO-1 (100 ng / μl) 1.25 μl
10 × T4 DNA ligase buffer (New England Biolabs) 0.5 μl
T4 DNA ligase (24 U, New England Biolabs) 0.6 μl
・ Water 0.65μl

１６℃で一晩のインキュベーション後、６５℃で５分間の熱処理によって反応を停止させ、１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１μｌの１０％ＳＤＳ、１μｌの１０μｇ／μｌプロテイナーゼＫ、および３０μｌの水を添加し、４５℃で１５分間さらにインキュベーションした。次いで、反応混合物を、同体積のＴｒｉｓ平衡化フェノール：クロロホルム（１：１比）で１回抽出し、１００μｌのサンプル、５μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、３．５μｌの１μｇ／μｌグリコーゲン、および１００μｌのイソプロパノールの添加によってイソプロパノールで水相からＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で約３０分間のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。ペレットを５００μｌの８０％エタノールで２回洗浄後、最後にＤＮＡを６μｌの水に再懸濁した。１μｌの上記脱塩ライゲーション溶液を使用して、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ（商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者のマニュアルに記載の形質転換手順にしたがって、Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒｅｒ）を使用したエレクトロポレーションによって形質転換した。５０μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＬＢ培地にて形質転換細菌を選択し、その陽性のクローンを単離し、以下の実施例に記載のようにさらに特徴付けた。   After overnight incubation at 16 ° C., the reaction was stopped by heat treatment at 65 ° C. for 5 minutes and 1 μl 0.5 M EDTA, 1 μl 10% SDS, 1 μl 10 μg / μl proteinase K, and 30 μl water were added. And further incubation at 45 ° C. for 15 minutes. The reaction mixture was then extracted once with the same volume of Tris equilibrated phenol: chloroform (1: 1 ratio), 100 μl sample, 5 μl 5M sodium chloride, 3.5 μl 1 μg / μl glycogen, and 100 μl isopropanol. Was precipitated from the aqueous phase with isopropanol. After incubation for about 30 minutes at -80 ° C, the DNA was recovered by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes. After the pellet was washed twice with 500 μl of 80% ethanol, the DNA was finally resuspended in 6 μl of water. Using 1 μl of the desalted ligation solution, ElectroMAX ™ DH10B ™ cells (Invitrogen) were electroporated using Cell-Porator (Biometer) according to the transformation procedure described in the manufacturer's manual. Transformation. Transformed bacteria were selected on LB medium containing 50 μg / ml zeocin (Invitrogen) and positive clones were isolated and further characterized as described in the examples below.

＜ジタグ形成を含む５’末端特異的タグの別の調製＞
＜組織由来の全ＲＮＡの調製＞
文献では、当業者に公知のＲＮＡ調製のための種々の異なるアプローチが記載されている。全てのこのようなアプローチにより、本発明に適切な組織および細胞を含む生体物質由来の複数のＲＮＡサンプルを調製可能である。以下の２つのこのような手順を詳述する。 <Another preparation of 5 'end-specific tag including ditag formation>
<Preparation of tissue-derived total RNA>
The literature describes a variety of different approaches for RNA preparation known to those skilled in the art. All such approaches can prepare multiple RNA samples from biological material, including tissues and cells suitable for the present invention. Two such procedures are detailed below.

緩衝液および溶液：
ａ）溶液Ｄ：４Ｍグアニジニウムチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ２−メルカプトエタノール、および０．５％ｎ−ラウリル−サルコシン。
ｂ）無ＲＮアーゼＣＴＡＢ／尿素溶液：１％ＣＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ）、４Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）。
ｃ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ、２００１）に記載の水平衡化フェノール。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ、２００１）に記載のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）
５Ｍ塩化ナトリウム
７Ｍ塩化グアニジウム
無ＲＮアーゼ２回蒸留水 Buffers and solutions:
a) Solution D: 4M guanidinium thiocyanate, 25 mM sodium citrate (pH 7.0), 100 mM 2-mercaptoethanol, and 0.5% n-lauryl-sarcosine.
b) RNase-free CTAB / urea solution: 1% CTAB (Sigma), 4M urea, 50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 1 mM EDTA (pH 8.0).
c) Water equilibrated phenol as described in Molecular Cloning (Sambrook and Russel, 2001).
Phosphate buffered saline (PBS) as described in Molecular Cloning (Sambrook and Russel, 2001)
5M sodium chloride 7M guanidinium chloride-free RNase double distilled water

全ＲＮＡの調製プロトコール
組織を冷却した皿にできるだけ迅速に切り出す。
５０ｍｌファルコンチューブでおおよその組織の体積を評価する。最良の組織量は、２０ｍｌの溶液Ｄ中に組織０．５〜１ｇである。
２ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）および１６ｍｌの水平衡化フェノールを添加する。
ボルテックスで混合する。４ｍｌのクロロホルムを添加し、手で強く震盪し、ボルテックスする。
氷上に１５分間静置する。
４℃、６，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。
ピペッティング（２５ｍｌ）によって上部の水相を新規のチューブに移し、約２０ｍｌを回収する。
同体積のイソプロパノール（この場合、約２０ｍｌ）の添加によって水相からＲＮＡを沈殿させ、氷上で１時間保存する。
４℃、７，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、遠心分離によってＲＮＡをペレット化する。
ペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、その後毎回７，５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＳＣＮ塩を除去する。
多糖のＣＴＡＢ除去。４ｍｌの水でのＲＮＡの完全な再懸濁後、ｍＲＮＡの選択的ＣＴＡＢ沈殿を行う。その後、１．３ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを添加し、１６ｍｌのＣＴＡＢ／尿素溶液の添加によってＲＮＡを選択的に沈殿させる。７５００ｒｐｍ（９５００×ｇ）で１５分間遠心分離し、水相を捨てる。
ＲＮＡペレットを４ｍｌの７Ｍ塩化グアニジウムに再懸濁する。
再懸濁したＲＮＡを、最後に８ｍｌのエタノールの添加によって沈殿させる。−２０℃で１〜２時間（またはそれ以上）インキュベートし、４℃、７，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。最後に、ペレットを５ｍｌの７０％エタノールで洗浄する。
７，５００ｒｐｍで５分間再度遠心分離する。
上清を捨てる。
ＲＮＡを５００〜１０００μｌの無ＲＮアーゼ２回蒸留水に再懸濁する。 Total RNA Preparation Protocol Cut tissue as quickly as possible into a chilled dish.
Assess approximate tissue volume in a 50 ml Falcon tube. The best tissue volume is 0.5-1 g tissue in 20 ml solution D.
Add 2 ml of 2M sodium acetate (pH 4.0) and 16 ml of water equilibrated phenol.
Mix by vortexing. Add 4 ml of chloroform, shake vigorously by hand and vortex.
Leave on ice for 15 minutes.
Centrifuge at 4 ° C., 6,000 rpm for 30 minutes.
Transfer the upper aqueous phase to a new tube by pipetting (25 ml) and collect approximately 20 ml.
RNA is precipitated from the aqueous phase by addition of the same volume of isopropanol (in this case about 20 ml) and stored on ice for 1 hour.
Centrifuge at 7,500 rpm for 15 minutes at 4 ° C. and pellet the RNA by centrifugation.
The pellet is washed twice with 70% ethanol and then centrifuged at 7,500 rpm for 2 minutes each time to remove the SCN salt.
Removal of CTAB from polysaccharides. After complete resuspension of RNA in 4 ml of water, selective CTAB precipitation of mRNA is performed. Thereafter, 1.3 ml of 5M NaCl is added and RNA is selectively precipitated by the addition of 16 ml of CTAB / urea solution. Centrifuge for 15 minutes at 7500 rpm (9500 × g) and discard the aqueous phase.
Resuspend the RNA pellet in 4 ml of 7M guanidinium chloride.
The resuspended RNA is finally precipitated by adding 8 ml of ethanol. Incubate at -20 ° C for 1-2 hours (or longer) and centrifuge at 7,500 rpm for 15 minutes at 4 ° C. Finally, the pellet is washed with 5 ml of 70% ethanol.
Centrifuge again at 7,500 rpm for 5 minutes.
Discard the supernatant.
Resuspend the RNA in 500-1000 μl RNase-free double distilled water.

全ＲＮＡ由来のｍＲＮＡ画分の調製
全ＲＮＡ調製物のｍＲＮＡ画分（ｆｒａｇｔｉｏｎ）を、推奨条件下で満足な収量のｍＲＮＡが得られるＭＡＣＳｍＲＮＡ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙ）またはポリＡ−ｑｕｉｃｋ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの市販のキットの使用によって単離することができる。ｍＲＮＡのオリゴｄＴの１選択サイクルで十分である。１〜２μｇ／μｌの高濃度でｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡを再溶解することが望ましい。 Preparation of mRNA fraction derived from total RNA The mRNA fraction of total RNA preparation can be obtained from MACS mRNA isolation kit (Milteny) or poly A-quick (Stratagene), etc. Can be isolated by use of a commercially available kit. One selection cycle of oligo dT of mRNA is sufficient. It is desirable to redissolve poly-A ⁺ RNA at a high concentration of 1-2 μg / μl.

ｃＤＮＡライブラリー由来の複数のＲＮＡサンプルの調製
あるいは、遺伝子の５’末端に対応する複数の核酸を、発現ベクターにクローン化した既存のｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。分子生物学分野の当業者に周知の標準的な方法により、例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写反応によって、このようなライブラリーからＲＮＡ転写物を得ることができる。適切な制限エンドヌクレアーゼでのプラスミドＤＮＡの第１の線状化によって、このようなアプローチを行うことができる。センスＲＮＡを転写可能な制限酵素を選択することができる。ベクターｐＦＬＣ ＩＩＩ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００１ Ｓｅｐ；７７（１−２）：７９−９０）中で得られたライブラリーの場合、インサートの短縮を回避するためのホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＣｃｕＩまたはＰ１−ＳｃｅＩの１つを使用した切断によってベクターを線状化することができる。チューブにおける消化混合物に対して、
プラスミドＤＮＡ １００μｇ
１０×緩衝液 ４０μｌ
制限酵素 １００Ｕ
ｄｄＨ₂Ｏａｄ ４００μｌ
を適切な温度で少なくとも２時間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動によって１μｌの反応混合物を分析する。消化が完了した場合、以下を添加する。
０．５Ｍ ＥＤＴＡ ８μｌ
１０％ＳＤＳ ８μｌ
プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ） ５μｌ
４５℃で１５分間インキュベートし、５００μｌフェノール／クロロホルムでサンプルを抽出する。水相を、５００μｌのクロロホルムで２回再抽出する。最後に、標準的な条件下でイソプロパノールまたはエタノールにて線状化ＤＮＡを沈殿させ、５μｌＴＥに溶解する。 Preparation of multiple RNA samples from a cDNA library Alternatively, multiple nucleic acids corresponding to the 5 'end of a gene can be obtained from an existing cDNA library cloned into an expression vector. RNA transcripts can be obtained from such libraries by standard methods well known to those skilled in the field of molecular biology, for example, by in vitro transcription reactions using T3, T7, or SP6 RNA polymerase. Such an approach can be performed by first linearizing the plasmid DNA with an appropriate restriction endonuclease. Restriction enzymes that can transcribe sense RNA can be selected. In the case of libraries obtained in the vector pFLC III (Carninci P, et al., Genomics, 2001 Sep; 77 (1-2): 79-90), homing endonuclease I- to avoid insert truncation The vector can be linearized by digestion with one of CcuI or P1-SceI. For the digestion mixture in the tube,
100 μg of plasmid DNA
10 × buffer 40 μl
Restriction enzyme 100U
ddH ₂ Oad 400 μl
Is incubated at the appropriate temperature for at least 2 hours and 1 μl of the reaction mixture is analyzed by agarose gel electrophoresis. When digestion is complete, add:
0.5M EDTA 8μl
8% 10% SDS
Proteinase K (10 mg / ml) 5 μl
Incubate for 15 minutes at 45 ° C. and extract sample with 500 μl phenol / chloroform. The aqueous phase is re-extracted twice with 500 μl chloroform. Finally, the linearized DNA is precipitated with isopropanol or ethanol under standard conditions and dissolved in 5 μl TE.

インビトロＲＮＡ合成
無Ｒｎアーゼ条件下にてチューブ中で以下を混合する。
線状化プラスミドＤＮＡ ２０μｇ
５×Ｔ７またはＴ３緩衝液 ２００μｌ
０．１Ｍ ＤＴＴ １００μｌ
２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ ４０μｌ
１０ｍＭ ｒＮＴＰ ５０μｌ
Ｔ７またはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ １０μｌ
ｄｄＨ₂Ｏａｄ １０００μｌ In vitro RNA synthesis Mix the following in a tube under Rnase-free conditions.
20 μg of linearized plasmid DNA
200 μl of 5 × T7 or T3 buffer
0.1M DTT 100 μl
2 mg / ml BSA 40 μl
50 mM 10 mM rNTP
10 μl of T7 or T3 RNA polymerase
ddH ₂ Oad 1000 μl

３７℃で３〜４時間インキュベートし、その後以下を添加する。
１０ｍＭ塩化カルシウム １０μｌ
１Ｕ／μｌ ＤＮアーゼＲＱ１ ５μｌ
３７℃で２０分間インキュベートし、その後以下を添加する。
０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μｌ
１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ ５μｌ Incubate at 37 ° C for 3-4 hours, then add:
10 mM calcium chloride 10 μl
1 U / μl DNase RQ1 5 μl
Incubate at 37 ° C for 20 minutes, then add:
0.5M EDTA 10μl
10 mg / ml proteinase K 5 μl

４５℃で３０分間のインキュベーション後、最終濃度１Ｍの塩化ナトリウムを添加する。フェノール／クロロホルム抽出後、標準的条件下でクロロホルムにて再抽出し、ＲＮＡ転写物を最後にイソプロパノールまたはエタノール沈殿によって回収することができる。ペレットを、２００μｌの水またはＴＥに再懸濁する。ＲＮＡ転写物の質をアガロースゲル電気泳動によって確認し、定量する。   After a 30 minute incubation at 45 ° C., a final concentration of 1 M sodium chloride is added. Following phenol / chloroform extraction, the RNA transcript can be recovered by final extraction with isopropanol or ethanol by re-extraction with chloroform under standard conditions. Resuspend the pellet in 200 μl water or TE. The quality of the RNA transcript is confirmed by agarose gel electrophoresis and quantified.

＜第１のｃＤＮＡ鎖の合成＞
緩衝液および溶液
約８０％の飽和トレハロース水溶液（結晶が残存している）（低金属含有量）
４．９Ｍ高純度ソルビトール
任意選択：Ｔａｋａｒａ ＧＣ−Ｔａｑ緩衝液 <Synthesis of first cDNA strand>
Buffer and approximately 80% saturated aqueous trehalose solution (crystals remain) (low metal content)
4.9M high purity sorbitol optional: Takara GC-Taq buffer

酵素および緩衝液
ＲＮアーゼＨ^-逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および緩衝液または他の逆転写酵素 Enzymes and buffers RN RNase H ^- reverse transcriptase SuperscriptII (Invitrogen) and a buffer or other reverse transcriptase

核酸およびオリゴヌクレオチド
精製された第１のｏｒｉｇｏ−ｄＴプライマー鎖（使用したプライマーの配列：５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’）（配列番号１０））。あるいはまたはさらに、ランダムプライマー（ｄＮ₆−ｄＮ₉）（Ｎは任意のヌクレオチドである）。
ｍＲＮＡ（２．５〜２５μｇを推奨）または全ＲＮＡ（５〜５０μｇ） Nucleic acid and oligonucleotide-purified first oligo-dT primer strand (primer sequence used: 5′-GAGAGAGAGAGGATCCCTCTGGAGAGTTTTTTTTTTTTTTTVN-3 ′) (SEQ ID NO: 10)). Alternatively or in addition, a random primer (dN ₆ -dN ₉ ), where N is any nucleotide.
mRNA (2.5-25 μg recommended) or total RNA (5-50 μg)

放射性化合物
［α−³²Ｐ］ｄＧＴＰ Radioactive compound [α- ³² P] dGTP

プロトコールＡ：トレハロース−ソルビトールの増強
第１のｃＤＮＡ鎖を調製するために、以下の試薬を３つの異なる０．５ｍｌＰＣＲチューブ（Ａ、Ｂ、およびＣ）で合わせる。
チューブＡ：最終体積２１．３μｌで、以下を添加する。
ｍＲＮＡ ２．５〜２５μｇ
または全ＲＮＡ ５〜５０μｇ
第１のプライマー鎖（２μｇ／μｌ） １４μｇ（７μｌ）
全体積 ２２μｌ
混合物（ｍＲＮＡ、プライマー）を６５℃で１０分間加熱してｍＲＮＡの二次構造を溶解する。 Protocol A: Trehalose-sorbitol enhancement To prepare the first cDNA strand, the following reagents are combined in three different 0.5 ml PCR tubes (A, B, and C).
Tube A: In a final volume of 21.3 μl, add:
mRNA 2.5-25 μg
Or 5-50 μg of total RNA
First primer strand (2 μg / μl) 14 μg (7 μl)
Total volume 22μl
The mixture (mRNA, primer) is heated at 65 ° C. for 10 minutes to dissolve the secondary structure of mRNA.

チューブＢ：最終体積７６μｌで、以下を添加する。
５×第１の鎖の緩衝液 ２８．６μｌ
０．１Ｍ ＤＴＴ １１μｌ
ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、および５−メチル−ｄＣＴＰ（各１０ｍＭ）９．３μｌ
４．９Ｍソルビトール ５５．４μｌ
飽和トレハロース ２３．２μｌ
ＲＮアーゼＨ^-ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）１５．０μｌ
最終体積 １４２．５μｌ Tube B: In a final volume of 76 μl, add:
5 × first strand buffer 28.6 μl
0.1 M DTT 11 μl
9.3 μl dATP, dTTP, dGTP, and 5-methyl-dCTP (10 mM each)
4.9 M sorbitol 55.4 μl
Saturated trehalose 23.2 μl
RNase H ^- Superscript II reverse transcriptase (200 U / μl) 15.0 μl
Final volume 142.5 μl

以下を使用したサイクル（またはサーマルサイクル）を準備する。４０℃で４分間、５０℃で２分間、５６℃で６０分間。   Prepare a cycle (or thermal cycle) using: 4 minutes at 40 ° C, 2 minutes at 50 ° C, 60 minutes at 56 ° C.

ｚ出発材料として全ＲＮＡを使用する場合、以下を使用したサイクルを準備する。４０℃で２分間、−０．１℃／秒で３５℃まで、５０℃で２分間、５６℃で６０分間。
あるいは、２５℃でランダムプライマー（ｄＮ₉、Ｎ＝任意のヌクレオチド）を使用してｃＤＮＡをプライミングする。 If using total RNA as the z starting material, prepare a cycle using: 2 min at 40 ° C, up to 35 ° C at -0.1 ° C / sec, 2 min at 50 ° C, 60 min at 56 ° C.
Alternatively, cDNA is primed using random primers (dN ₉ , N = any nucleotide) at 25 ° C.

チューブＣ：
１〜１．５μｌの［α−³²Ｐ］ｄＧＴＰ
コールドスタート（ｃｏｌｄ−ｓｔａｒｔ）のために、以下のように操作する。
チューブＡおよびＢを氷上で迅速に混合する。
チューブＣ中に４０μｌのＡ＋Ｂ混合物を移す。
チューブＡ＋ＢおよびＣを上記サイクリングプログラムのステップ１の４０℃に迅速に移行し、４０℃で４分間アニーリングする。
サーマルサイクラー設定にしたがって反応を進行させる。
ホットスタート（ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ）のために、以下のように操作する。 Tube C:
1-1.5 μl of [α- ³² P] dGTP
For a cold-start, operate as follows.
Mix tubes A and B quickly on ice.
Transfer 40 μl of A + B mixture into tube C.
Tubes A + B and C are transferred quickly to 40 ° C. in step 1 of the cycling program and annealed at 40 ° C. for 4 minutes.
Allow reaction to proceed according to thermal cycler settings.
For hot-start, the following operation is performed.

チューブＡ、Ｂ、Ｃをサーマルサイクラー上に移す。
サイクリングを開始する。
温度が４２℃に達した場合、チューブＡおよびＢを迅速に混合する。
チューブＣ中に４０μｌのＡ＋Ｂ混合物を移す。
サーマルサイクラー設定にしたがって反応を進行させる。
プロトコールＢ：ＧＣＩ−トレハロース−ソルビトールの増強
チューブＡ：最終体積２２μｌで、以下を添加する。
ｍＲＮＡ ５〜２５μｇ
（エタノールで沈殿させ、プライマーと直接再懸濁する）
または全ＲＮＡ（５０μｇまで）（小規模プロトコール用）
精製した第１のｃＤＮＡプライマー鎖（２μｇ／μｌ）１４μｇ（７μｌ）
最終体積 ２２μｌ Transfer tubes A, B, and C onto the thermal cycler.
Start cycling.
When temperature reaches 42 ° C., quickly mix tubes A and B.
Transfer 40 μl of A + B mixture into tube C.
Allow reaction to proceed according to thermal cycler settings.
Protocol B: GCI-trehalose-sorbitol enhancement tube A: In a final volume of 22 μl, add:
mRNA 5-25 μg
(Precipitate with ethanol and resuspend directly with primer)
Or total RNA (up to 50 μg) (for small protocol)
Purified first cDNA primer strand (2 μg / μl) 14 μg (7 μl)
Final volume 22μl

チューブＢ：以下を添加する。
２×ＧＣＩ（ＬＡ Ｔａｑ）緩衝液（ＴａＫａＲａ） ７５μｌ
ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、および５−メチル−ｄＣＴＰ（各１０ｍＭ）４μｌ
４．９Ｍソルビトール ２０μｌ
飽和トレハロース（約８０％） １０μｌ
ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）１５μｌ
ｄｄＨ₂Ｏ ４μｌ
最終体積 １２８μ Tube B: Add the following.
2 × GCI (LA Taq) buffer (TaKaRa) 75 μl
4 μl dATP, dTTP, dGTP, and 5-methyl-dCTP (10 mM each)
4.9 M sorbitol 20 μl
Saturated trehalose (approximately 80%) 10 μl
Superscript II reverse transcriptase (200 U / μl) 15 μl
ddH ₂ O 4 μl
Final volume 128μ

チューブＣ：
α−³²Ｐ−ｄＧＴＰ １．５μｌ Tube C:
α- ³² P-dGTP 1.5 μl

残りの手順のために、通常の反応条件に厳密に従う。以下のサイクルを用いたサーマルサイクラーを（事前に）準備する。４２℃で３０分間、５０℃で１０分間、５５℃で１０分間、４℃で不特定な時間。   For the rest of the procedure, strictly follow normal reaction conditions. Prepare (in advance) a thermal cycler using the following cycle. Unspecified time at 42 ° C for 30 minutes, 50 ° C for 10 minutes, 55 ° C for 10 minutes, 4 ° C.

以下のように操作する。
１）チューブＡ、Ｂ、Ｃをサーマルサイクラーに移す
２）サイクリングを開始する
３）温度が４２℃に達した場合、チューブＡおよびＢを迅速に混合する。
４）チューブＣに４０μｌのＡ＋Ｂ混合物を移す
５）サーマルサイクラーの設定にしたがって反応を進行させる
最後に、最終濃度１０ｍＭのＥＤＴＡで反応を停止させる。 Operate as follows.
1) Transfer tubes A, B, C to thermal cycler 2) Start cycling 3) When temperature reaches 42 ° C, mix tubes A and B quickly.
4) Transfer 40 μl of A + B mixture to tube C 5) Allow the reaction to proceed according to thermal cycler settings Finally, stop the reaction with a final concentration of 10 mM EDTA.

次いで、［α³²Ｐ］ＧＴＰの組み込みを測定し、ｃＤＮＡの収率を計算する。［α³²Ｐ］ＧＴＰの測定によるｃＤＮＡ量の計算は、処理が正確に進行しているかどうかをモニターするのに有用である。 [Α ³² P] GTP incorporation is then measured and the yield of cDNA is calculated. Calculation of the amount of cDNA by measuring [α ³² P] GTP is useful for monitoring whether the process is proceeding correctly.

＜第１のｃＤＮＡ鎖のＣＴＡＢ沈殿＞
緩衝液および溶液
実施例１に記載のＣＴＡＢ溶液
放射能の測定後、チューブを「ホット」および「コールド」の第１の鎖合成（チューブＢおよびＣ）に移し、以下のようにＣＴＡＢ沈殿を行う。
第１の鎖由来のチューブＢおよびＣを混合し、混合物に以下を添加する。
３μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（最終濃度１０ｍＭ）
２μｌの１０μｇ／μｌプロテイナーゼＫ
４５℃または５０℃で少なくとも１５分間且つ１時間までインキュベートする。
１２８〜１４２μｌの第１のｃＤＮＡ反応物に、以下を添加する。
３２μｌの５Ｍ塩化ナトリウム（無ＲＮアーゼ）
３２０μｌのＣＴＡＢ−尿素溶液
室温で１０分間インキュベートする。
１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
上清を除去する。
１００μｌの７Ｍ塩化グアニジニウムで慎重に再懸濁する。
２５０μｌのエタノールを添加し、−２０℃〜−８０℃の氷上に３０〜６０分静置する。
１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清を除去する。
その後、ペレットを８００μｌの８０％エタノールで２回洗浄する。毎回８０％エタノールをチューブに添加し、１５，０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
ｃＤＮＡを４６μｌの水に再懸濁する。 <CTAB precipitation of first cDNA strand>
Buffer and solution After measurement of CTAB solution radioactivity as described in Example 1, the tubes are transferred to “hot” and “cold” first strand synthesis (tubes B and C) and CTAB precipitation is performed as follows. .
Mix tubes B and C from the first strand and add the following to the mixture:
3 μl of 0.5M EDTA (final concentration 10 mM)
2 μl of 10 μg / μl proteinase K
Incubate at 45 ° C or 50 ° C for at least 15 minutes and up to 1 hour.
To 128-142 μl of the first cDNA reaction, add:
32 μl of 5M sodium chloride (no RNase)
Incubate 320 μl of CTAB-urea solution at room temperature for 10 minutes.
Centrifuge for 10 minutes at 15,000 rpm.
Remove the supernatant.
Carefully resuspend with 100 μl of 7M guanidinium chloride.
Add 250 μl of ethanol and let stand on ice at −20 ° C. to −80 ° C. for 30-60 minutes.
Centrifuge for 10 minutes at 15,000 rpm. Remove the supernatant.
The pellet is then washed twice with 800 μl of 80% ethanol. Add 80% ethanol to the tube each time and centrifuge at 15,000 rpm for 3 minutes.
Resuspend the cDNA in 46 μl of water.

＜キャップトラッピング、キャップの酸化およびビオチン化＞
緩衝液および溶液
１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）
１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）
ＮａＩＯ₄溶液（１００ｍＭ超）
１０％ＳＤＳ
ビオチン化緩衝液：３３ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）および０．３３％ＳＤＳ
１０ｍＭビオチンヒドラジド長腕（ＭＷ＝３７１．５１；３．７１ｍｇ／ｍｌ＝１０ｍＭ）を含むクエン酸／ＳＤＳ緩衝液。
キャップビオチン化：（Ａ）ｍＲＮＡのジオール基の酸化 <Cap trapping, cap oxidation and biotinylation>
Buffers and solutions 1M sodium acetate buffer (pH 4.5)
1M sodium citrate (pH 6.0)
NaIO ₄ solution (over 100 mM)
10% SDS
Biotinylation buffer: 33 mM sodium citrate (pH 6.0) and 0.33% SDS
Citrate / SDS buffer containing 10 mM biotin hydrazide long arm (MW = 371.51; 3.71 mg / ml = 10 mM).
Cap biotinylation: (A) Oxidation of diol group of mRNA

最終体積５０〜５５μｌで、以下を添加する。
再懸濁ｃＤＮＡサンプル
３．３μｌの１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）
新たに調製した最終濃度１０ｍＭまでのＮａＩＯ₄溶液
暗所の氷上で４５分間インキュベートする。
最後に、ｃＤＮＡを沈殿させる。 In a final volume of 50-55 μl, add:
Resuspended cDNA sample 3.3 μl of 1 M sodium acetate buffer (pH 4.5)
Incubate freshly prepared NaIO ₄ solution to a final concentration of 10 mM on ice in the dark for 45 minutes.
Finally, the cDNA is precipitated.

以下のプロセスを簡単にするために、１μｌの８０％グリセロールを添加する。
ボルテックスする。
５μｌの１０％ＳＤＳ、１１μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、および６１μｌのイソプロパノールを添加する。
−２０℃〜−８０℃で暗所にて３０分間インキュベートする。
１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。
上清を除去する。
５００μｌの８０％エタノールを添加する。
１５，０００ｒｐｍで２〜３分間遠心分離する。
上清を捨てる。
ステップ１２〜１３を繰り返す。
ｃＤＮＡを５０μｌの水に再懸濁する。
ビオチン化：（Ｂ）酸化ジオール基の誘導体化
ｃＤＮＡ（５０μｌ）に１６０μｌの溶解したビオチンヒドラジド長腕を含む反応緩衝液を添加する。２１０μｌ（最終体積）で反応させる。
室温（２２〜２６℃）で一晩（１０〜１６時間）インキュベートする。
次いで、ビオチン化ｃＤＮＡを沈殿させるために、以下を添加する。
７５μｌの１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．１）
５μｌの５Ｍ塩化ナトリウム
７５０μｌの無水エタノール。
氷上で１時間または−８０℃もしくは−２０℃で３０分間またはそれ以上氷上でインキュベートする。
サンプルを１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
沈殿物を７０％または８０％のエタノールで２回洗浄し、遠心分離する。
上清を捨て、洗浄を繰り返す。ｃＤＮＡを１７５μｌのＴＥ（１ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解する。
酵素および緩衝液ならびにＲＮアーゼＯＮＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびその反応緩衝液を使用してｃＤＮＡの５’末端キャップトラッピングおよび放出させる。 Add 1 μl of 80% glycerol to simplify the following process.
Vortex.
Add 5 μl 10% SDS, 11 μl 5M sodium chloride, and 61 μl isopropanol.
Incubate for 30 minutes in the dark at -20 ° C to -80 ° C.
Centrifuge for 15 minutes at 15,000 rpm.
Remove the supernatant.
Add 500 μl of 80% ethanol.
Centrifuge for 2-3 minutes at 15,000 rpm.
Discard the supernatant.
Repeat steps 12-13.
Resuspend the cDNA in 50 μl of water.
Biotinylation: (B) Oxidized diol group derivatized cDNA (50 μl) is added with 160 μl of dissolved biotin hydrazide long arm reaction buffer. React with 210 μl (final volume).
Incubate overnight (10-16 hours) at room temperature (22-26 ° C).
The following is then added to precipitate the biotinylated cDNA:
75 μl of 1M sodium citrate (pH 6.1)
5 μl 5M sodium chloride 750 μl absolute ethanol.
Incubate on ice for 1 hour or at -80 ° C or -20 ° C for 30 minutes or longer.
Centrifuge the sample at 15,000 rpm for 10 minutes.
Wash the precipitate twice with 70% or 80% ethanol and centrifuge.
Discard the supernatant and repeat the wash. The cDNA is dissolved in 175 μl of TE (1 mM Tris (pH 7.5), 0.1 mM EDTA).
Enzymes and buffers and RNase ONE (Promega) and its reaction buffer are used to cap and release 5 'end caps of cDNA.

ｃＤＮＡサンプルに、最終体積２００μｌで以下を添加する。
２０μｌのＲＮアーゼＩ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）。
１μｌの開始ｍＲＮＡまたは全ＲＮＡ（小規模プロトコールの場合）あたり１単位のＲＮアーゼＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、５または１０Ｕ／μｌ）を第１のｃＤＮＡ鎖合成に使用した。
３７℃で３０分間インキュベートする。
反応を停止させるために、サンプルを氷上に置き、以下を添加する。
４μｌの１０％ＳＤＳおよび
３μｌの１０μｇ／μｌプロテイナーゼＫ。
４５℃で１５分間インキュベートする。
１：１トリス平衡化フェノール：クロロホルムで１回抽出し、水相をＭｉｃｒｏｃｏｎ−１００にロードする。
水で逆抽出し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１００フィルターに再度ロードする。
１ラウンドのＭｉｃｒｏｃｏｎ分離を行う。
８−ｂ）ペレットを２０μｌの０．１ＴＥに完全に溶解する。 Add the following to the cDNA sample in a final volume of 200 μl.
20 μl RNase I buffer (Promega).
One unit of RNase I (Promega, 5 or 10 U / μl) per 1 μl of starting mRNA or total RNA (for small-scale protocols) was used for the first cDNA strand synthesis.
Incubate for 30 minutes at 37 ° C.
To stop the reaction, place the sample on ice and add:
4 μl of 10% SDS and 3 μl of 10 μg / μl proteinase K.
Incubate at 45 ° C for 15 minutes.
Extract once with 1: 1 Tris-equilibrated phenol: chloroform and load the aqueous phase onto the Microcon-100.
Back-extract with water and reload onto Microcon-Centricon 100 filter.
Perform one round of Microcon separation.
8-b) Dissolve the pellet completely in 20 μl of 0.1 TE.

磁性ビーズブロッキング
材料
ストレプトアビジンコーティングＭＰＧ（ＣＰＧｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）
緩衝液および溶液
結合緩衝液：４．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
特殊装置
１．５ｍｌのチューブを保持するためのマグネティックスタンドが必要である。 Magnetic bead blocking material Streptavidin-coated MPG (CPGinc., New Jersey)
Buffer and solution binding buffer: 4.5 M NaCl, 50 mM EDTA (pH 8.0)
A magnetic stand for holding a 1.5 ml tube of special equipment is required.

核酸の非特異的結合をさらに最小にするために、磁性ビーズを無ＤＮＡｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）とインキュベートする。
各調製物のために、５００μｌの磁性ビーズ（２５μｇの出発ｍＲＮＡあたり）を１００μｇのｔＲＮＡとプレインキュベーションする。
時々混合しながら氷上３０分間インキュベートする。
マグネティックスタンドでビーズを分離し（３分間）、上清を除去する。
５００μｌの結合緩衝液で３回洗浄する。 To further minimize non-specific binding of nucleic acids, magnetic beads are incubated with DNA-free RNA (10 mg / ml).
For each preparation, 500 μl of magnetic beads (per 25 μg starting mRNA) are preincubated with 100 μg tRNA.
Incubate on ice for 30 minutes with occasional mixing.
Separate the beads on a magnetic stand (3 minutes) and remove the supernatant.
Wash three times with 500 μl of binding buffer.

＜５’末端ｃＤＮＡの捕捉および遊離＞
以下のように、全長ｃＤＮＡを捕捉するために、ＲＮアーゼＩ処理ｃＤＮＡを混合し、ビーズを洗浄する。
１）５００μｌの洗浄／結合緩衝液にビーズを再懸濁する。
２）３５０μｌのビーズをビオチン化した第１のｃＤＮＡ鎖を含むチューブに移す。
３）混合後、チューブを５０℃で１０分間穏やかに回転させる。
４）１５０μｌのビーズをビオチン化した第１のｃＤＮＡ鎖および３５０μｌのビーズを含むチューブに移す。
５）混合後、チューブを５０℃で２０分間穏やかに回転させる。
マグネティックスタンドにて上清からビーズを分離する。
ビーズを洗浄する。
ビーズを０．５ｍｌの表示の緩衝液で穏やかに洗浄して非特異的に吸収したｃＤＮＡを除去する。
洗浄／結合溶液で２回洗浄する。
０．３Ｍ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡで１回洗浄する。
０．４％ ＳＤＳ／０．５Ｍ ＮａＯＡｃ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）／１ｍＭ ＥＤＴＡで２回洗浄する。
０．５Ｍ ＮａＯＡｃ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）／１ｍＭ ＥＤＴＡで２回洗浄する。
アルカリで遊離する（以下を参照のこと）。
アルカリでビーズから全長ｃＤＮＡを遊離する。
１００μｌの５０ｍＭ ＮａＯＨ、５ｍＭ ＥＤＴＡを添加する。
短時間撹拌し、時々混合しながら室温で５分間インキュベートする。
磁性ビーズを分離し、溶離ｃＤＮＡを氷上に移す。
放射能のモニタリングによって測定した場合にほとんどのｃＤＮＡ（８０〜９０％）をビーズから回収することができるまで１００μｌの５０ｍＭＮａＯＨ、５ｍＭ ＥＤＴＡを使用してさらに２回溶離サイクルを繰り返す。
ｃＤＮＡに５’末端開始可能（ｐｒｉｍａｂｌｅ）部位を付加する。 <Capture and release of 5′-end cDNA>
In order to capture full-length cDNA as follows, RNase I-treated cDNA is mixed and the beads are washed.
1) Resuspend the beads in 500 μl wash / binding buffer.
2) Transfer 350 μl of beads to the tube containing the first biotinylated cDNA strand.
3) After mixing, gently rotate the tube at 50 ° C. for 10 minutes.
4) Transfer 150 μl of beads to a tube containing the first biotinylated cDNA strand and 350 μl of beads.
5) After mixing, gently rotate the tube at 50 ° C. for 20 minutes.
Separate the beads from the supernatant on a magnetic stand.
Wash the beads.
The beads are gently washed with 0.5 ml of the indicated buffer to remove nonspecifically absorbed cDNA.
Wash twice with wash / binding solution.
Wash once with 0.3 M NaCl / 1 mM EDTA.
Wash twice with 0.4% SDS / 0.5 M NaOAc / 20 mM Tris-HCl (pH 8.5) / 1 mM EDTA.
Wash twice with 0.5 M NaOAc / 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) / 1 mM EDTA.
Release with alkali (see below).
Release full length cDNA from beads with alkali.
Add 100 μl of 50 mM NaOH, 5 mM EDTA.
Stir briefly and incubate for 5 minutes at room temperature with occasional mixing.
Separate the magnetic beads and transfer the eluted cDNA onto ice.
Repeat the elution cycle two more times using 100 μl of 50 mM NaOH, 5 mM EDTA until most of the cDNA (80-90%) can be recovered from the beads as measured by radioactivity monitoring.
A 5'-primable site is added to the cDNA.

ＲＮアーゼステップ
酵素および緩衝液
−ＲＮアーゼＯＮＥ（商標）およびその緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）
５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を氷上のチューブに添加し、迅速に混合する。
１μｌのＲＮアーゼＩ（１０Ｕ／μｌ）を添加し、迅速に混合する。
３７℃で１０分間インキュベートする。
ＲＮアーゼＩを除去するために、ｃＤＮＡをプロテイナーゼＫおよびフェノール／クロロホルム抽出（逆抽出を含む）で処理する。
３μｇｌのグリコーゲンを添加する。ｃＤＮＡを１サイクルのＭｉｃｒｏｃｏｎ−１００で処理する。 RNase Step Enzymes and Buffers-RNase ONE ™ and its buffers (Promega)
Add 50 μl of 1M Tris-HCl (pH 7.0) to a tube on ice and mix rapidly.
Add 1 μl RNase I (10 U / μl) and mix rapidly.
Incubate at 37 ° C. for 10 minutes.
To remove RNase I, the cDNA is treated with proteinase K and phenol / chloroform extraction (including back extraction).
Add 3 μg of glycogen. The cDNA is treated with 1 cycle of Microcon-100.

開始可能な部位の付加前のｃＤＮＡの分画
材料
Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓ−４００スピンキットまたは別のキット
緩衝液および溶液
カラム緩衝液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、および１００ｍＭ ＮａＣｌ
ＳＤＳを含まないカラム緩衝液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１００ｍＭ ＮａＣｌ Fractionation of cDNA before addition of startable sites Material Amersham-Pharmacia S-400 Spin Kit or another kit Buffer and solution column buffer: 10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1% SDS, And 100 mM NaCl
Column buffer without SDS: 10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA, and 100 mM NaCl

Ｓ−４００スピンカラムクロマトグラフィー
詳細なプロトコールはキットに記載されている。これは、Ｓ−４００スピンカラムの実行プロトコールである。
カラムを震盪する。
シールをはがし（ｂｒａｋｅ）、２ｍｌチューブに移す。
３，０００ｒｐｍで１分間（＋４℃）遠心分離する。
ｃＤＮＡ（２０μｌ未満）を添加する。
ｃＤＮＡの添加後、８０μｌの水を添加する。
３０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。
Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００で濃縮するかイソプロパノールで沈殿させる。収率は８０％超のはずである。 Detailed protocols for S-400 spin column chromatography are described in the kit. This is the implementation protocol for the S-400 spin column.
Shake the column.
Remove the seal and transfer to a 2 ml tube.
Centrifuge at 3,000 rpm for 1 minute (+ 4 ° C.).
Add cDNA (less than 20 μl).
After the addition of cDNA, 80 μl of water is added.
Centrifuge for 2 minutes at 3000 rpm.
Concentrate with Microcon 100 or precipitate with isopropanol. The yield should be greater than 80%.

＜ＳＳＬＬＭ＞
材料
Ｓ−３００スピンカラムクロマトグラフィキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
緩衝液および溶液
カラム緩衝液：１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、１００ｍＭＮａＣｌ <SSLLM>
Material S-300 Spin Column Chromatography Kit (Amersham-Pharmacia)
Buffer and solution column buffer: 10 mM TrisHCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1% SDS, 100 mM NaCl

酵素および緩衝液
Ｔａｋａｒａ ＤＮＡリガーゼキットＩＩ
核酸およびオリゴヌクレオチド
本実施例では、制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＧｓｕＩおよびＭｍｅＩの認識部位を導入するが、本発明は、これらの制限酵素およびその認識部位の使用に依存も制限もされない。特に、ＢｇｌＩＩ（認識部位ＡＧＡＴＣＴ）を、クローニングに適切な任意のエンドヌクレアーゼに置換することができる。このような酵素の他の例には、ＡｓｃＩ（認識部位：ＧＧＣＧＣＧＣＣ）またはＸｂａＩ（認識部位：ＴＣＴＡＧＡ）が含まれ得る。 Enzymes and Buffers Takara DNA Ligase Kit II
Nucleic acids and oligonucleotides In this example, recognition sites for restriction enzymes BglII, GsuI and MmeI are introduced, but the present invention is not dependent or restricted by the use of these restriction enzymes and their recognition sites. In particular, BglII (recognition site AGATCT) can be replaced with any endonuclease suitable for cloning. Other examples of such enzymes may include AscI (recognition site: GGCGCGCC) or XbaI (recognition site: TCTAGA).

ＧｓｕＩ制限部位を含む以下のオリゴヌクレオチドを合成する。
オリゴヌクレオチドＢｇ−Ｇｓｕ−ＧＮ５：
５’−ビオチン−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＴＡＧＧＣＴＴＡＡＴＡＧＧＴＧＡＣＴＡＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＮＮＮＮＮ−３’（配列番号１１）；
オリゴヌクレオチドＢｇ−Ｇｓｕ−Ｎ６：
５’−ビオチン−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＴＡＧＧＣＴＴＡＡＴＡＧＧＴＧＡＣＴＡＧＡＴＣＴＧＧＡＧＮＮＮＮＮＮ−３’（配列番号１２）；
オリゴヌクレオチドＢｇ−Ｇｓｕ−下流：
５’Ｐ−ＣＴＧＧＡＧＡＴＣＴＡＧＴＣＡＣＣＴＡＴＴＡＡＧＣＣＴＡＧＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−ＮＨ₂ ３’（配列番号１３）。 The following oligonucleotide containing a GsuI restriction site is synthesized.
Oligonucleotide Bg-Gsu-GN5:
5'-biotin-AGAGAGAGAACTAGGCTTATATAGGTGACTAGTAGCTGGAGGNNNNN-3 '(SEQ ID NO: 11);
Oligonucleotide Bg-Gsu-N6:
5'-biotin-AGAGAGAGAACTAGGCTTATATAGGTGACTAGTAGCTGGAGNNNNNN-3 '(SEQ ID NO: 12);
Oligonucleotide Bg-Gsu-downstream:
5 ′ P-CTGGAGATCTAGTCACCTATAAGCCTAGTTCTCTCTCT-NH ₂ 3 ′ (SEQ ID NO: 13).

ＭｍｅＩ制限部位を含む以下のオリゴヌクレオチドを合成する。
オリゴヌクレオチドＢｇ−Ｍｍｅ−ＧＮ５：
５’−ビオチン−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＴＡＧＧＣＴＴＡＡＴＡＧＧＴＧＡＣＴＡＧＡＴＣＴＴＣＣＲＡＣＧＮＮＮＮＮ−３’（配列番号１４）；
オリゴヌクレオチドＢｇ−Ｍｍｅ−Ｎ６：
５’−ビオチン−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＴＡＧＧＣＴＴＡＡＴＡＧＧＴＧＡＣＴＡＧＡＴＣＴＴＣＣＲＡＣＮＮＮＮＮＮ−３’（配列番号１５）；オリゴヌクレオチドＢｇ−Ｍｍｅ−下流：
５’Ｐ−ＧＴＹＧＧＡＧＡＴＣＴＡＧＴＣＡＣＣＴＡＴＴＡＡＧＣＣＴＡＧＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−ＮＨ₂ ３’（配列番号１６）。
（ＲはＧまたはＡを示し、ＹはＣまたはＴを示す） The following oligonucleotides containing Mmel restriction sites are synthesized.
Oligonucleotide Bg-Mme-GN5:
5'-biotin-AGAGAGAGAACTAGGCTTATATAGGTGACTAGTAGATTTCCRACGNNNNN-3 '(SEQ ID NO: 14);
Oligonucleotide Bg-Mme-N6:
5′-biotin-AGAGAGAGAACTAGGCTTATATAGGTGACTAGTAGCTTCRACNNNNNN-3 ′ (SEQ ID NO: 15); oligonucleotide Bg-Mme—downstream:
5 ′ P-GTYGGAGATCTAGTCACCTTATAAGCCTAGTTCTCTCTCT-NH ₂ 3 ′ (SEQ ID NO: 16).
(R represents G or A, Y represents C or T)

Ｐは、オリゴヌクレオチドが５’リン酸化されるべきであることを意味し、ＮＨ₂は、非特異的ライゲーションおよびヘアピンプライミングを回避するためにアミノ基を付加することを示す。オリゴヌクレオチドを、１０％アクリルアミド電気泳動を使用した第１のｃＤＮＡ鎖プライマーとして標準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ、２００１）にしたがったアクリルアミドゲル電気泳動によって精製すべきである。オリゴヌクレオチドを、フェノール／クロロホルム、クロロホルムで抽出し、第１のｃＤＮＡプライマー鎖に関して２体積のエタノールで沈殿させるべきである。 P means that the oligonucleotide should be 5 ′ phosphorylated, NH ₂ indicates adding an amino group to avoid non-specific ligation and hairpin priming. Oligonucleotides should be purified by acrylamide gel electrophoresis according to standard techniques (Sambrook and Russel, 2001) as the first cDNA strand primer using 10% acrylamide electrophoresis. Oligonucleotides should be extracted with phenol / chloroform, chloroform and precipitated with 2 volumes of ethanol for the first cDNA primer strand.

＜リンカーの調製＞
ＯＤチェックおよびＢｇ−Ｇｓｕ−ＧＮ５、Ｂｇ−Ｇｓｕ−Ｎ６、および「下流」オリゴヌクレオチドの４：１：５での混合後（少なくとも２μｇ／μｌのＤＮＡ）、最終濃度１００ｍＭのＮａＣｌを添加する。オリゴヌクレオチドを、６５℃で５分、４５℃で５分、３７℃で１０分、２５℃で１０分でアニーリングする。 <Preparation of linker>
After OD check and Bg-Gsu-GN5, Bg-Gsu-N6, and “downstream” oligonucleotide mix 4: 1: 5 (at least 2 μg / μl DNA), a final concentration of 100 mM NaCl is added. Oligonucleotides are annealed at 65 ° C. for 5 minutes, 45 ° C. for 5 minutes, 37 ° C. for 10 minutes, and 25 ° C. for 10 minutes.

＜第１のｃＤＮＡ鎖のライゲーション＞
１μｇまでの一本鎖ｃＤＮＡについて２μｇのリンカー混合物を使用する。リンカーおよびｃＤＮＡ（最終体積５μｌ）を混合する。
６５℃で５分間加熱して一本鎖ｃＤＮＡの二次構造を溶解する。
リンカーおよびｃＤＮＡ混合物を氷上に移す。
ＴＡＫＡＲＡ ＤＮＡライゲーションキットの５μｌのＩＩ液を添加する。
キットの１０μｌのＩ液を添加する。
１０℃で一晩インキュベートする（少なくとも１０時間超）。 <Ligation of the first cDNA strand>
Use 2 μg of linker mix for up to 1 μg of single stranded cDNA. Mix linker and cDNA (final volume 5 μl).
Heat at 65 ° C. for 5 minutes to dissolve the secondary structure of the single-stranded cDNA.
Transfer the linker and cDNA mixture onto ice.
Add 5 μl of II solution of TAKARA DNA ligation kit.
Add 10 μl of solution I from the kit.
Incubate overnight at 10 ° C. (at least> 10 hours).

ライゲーション反応終了時に、１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１μｌの１０％ＳＤＳ、１μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、１０μｌの水の添加によって反応を停止させ、４５℃で１５分間インキュベートする。フェノール／クロロホルム、クロロホルムで処理し、６０μｌのカラム緩衝液で逆抽出する（説明書を参照のこと）。
ライゲーション後、Ｓ−３００スピンカラムクロマトグラフィーを使用して過剰のリンカーを除去する。 At the end of the ligation reaction, the reaction is stopped by the addition of 1 μl 0.5 M EDTA, 1 μl 10% SDS, 1 μl 10 mg / ml proteinase K, 10 μl water and incubated at 45 ° C. for 15 minutes. Treat with phenol / chloroform, chloroform and back-extract with 60 μl column buffer (see instructions).
After ligation, excess linker is removed using S-300 spin column chromatography.

１）カラムを数回震盪し、垂直にする。
２）上部のキャップを除去し、その後下部のキャップを除去する。
３）カラムの緩衝液を排出する。２ｍｌのカラム緩衝液を適用し、重力によって２回排出する。
カラムを１５ｍｌ遠心管に入れ、スイングローターにて室温、４００×ｇで２分間遠心分離する。
１００μｌの緩衝液をカラムに適用し、４００×ｇで２分間遠心分離する。溶離体積をチェックする。これが投入（１００μｌ）と異なる場合、溶離体積が添加体積と同一になるまでこのステップを繰り返す。
キャップを切り取った後、１．５ｍｌチューブを１５ｍｌ遠心管にセットし、サンプルをカラムに入れる。４００×ｇで２分間遠心分離する。
溶離画分を別のチューブに回収する。カラムに５０μｌの緩衝液を適用し、遠心分離を繰り返し、別のチューブに画分を回収する。
ステップ６を３〜５回以上繰り返す；溶離画分を個別に保持する。
回収された画分を、シンチレーションカウンターで計数する。通常、最初の２〜３画分（ｃＤＮＡのｃｐｍの８０％）を混合する。
最終濃度０．２ＭまでＮａＣｌを添加し、等量のイソプロパノールの添加によってｃＤＮＡを沈殿させる。
８０％冷エタノールでの沈殿および２回の洗浄後、水に再懸濁する。 1) Shake the column several times to make it vertical.
2) Remove the upper cap, and then remove the lower cap.
3) Drain the column buffer. Apply 2 ml column buffer and drain twice by gravity.
Place the column in a 15 ml centrifuge tube and centrifuge at 400 × g for 2 minutes in a swing rotor at room temperature.
Apply 100 μl of buffer to the column and centrifuge at 400 × g for 2 minutes. Check elution volume. If this is different from the input (100 μl), repeat this step until the elution volume is equal to the addition volume.
After removing the cap, place the 1.5 ml tube into the 15 ml centrifuge tube and place the sample in the column. Centrifuge for 2 minutes at 400 × g.
Collect the eluted fraction in a separate tube. Apply 50 μl of buffer to the column, repeat the centrifugation and collect the fraction in a separate tube.
Repeat step 6 3-5 times or more; keep the elution fractions individually.
The collected fraction is counted with a scintillation counter. Usually the first 2-3 fractions (80% of cDNA cpm) are mixed.
Add NaCl to a final concentration of 0.2M and precipitate the cDNA by adding an equal volume of isopropanol.
Resuspend in water after precipitation with 80% cold ethanol and two washes.

第２のｃＤＮＡ鎖
以下のように、サーマルサイクラーでの第２のｃＤＮＡ鎖プログラムを設定する。
ステップ１ ６５℃で５分間
ステップ２ ６８℃で３０分間
ステップ３ ７２℃で１０分間
ステップ４ ＋４℃ The second cDNA strand program in the thermal cycler is set as follows.
Step 1 65 ° C for 5 minutes Step 2 68 ° C for 30 minutes Step 3 72 ° C for 10 minutes Step 4 + 4 ° C

＜第２のｃＤＮＡ鎖の手順＞
第２の鎖ステップで、試験管に以下を混合する。
ｃＤＮＡ
６μｌのＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（Ｔａｋａｒａ）
６μｌの２．５ｍＭ（各）ｄＮＴＰ（Ｔａｋａｒａ）
０．５μｌの［α−³²Ｐ］ｄＧＴＰ（組み込みのために選択する）
第２の鎖プログラムの開始後、サーマルサイクラーにチューブを置く。
サンプルが６５℃の場合、最終ステップでチューブに３μｌの５Ｕ／μｌＬＡポリメラーゼまたは代わりの熱安定性ポリメラーゼカクテルを添加する。
急速且つ完全に混合する。 <Procedure for the second cDNA strand>
In the second strand step, mix the following in a test tube.
cDNA
6 μl of LA-Taq polymerase buffer (Takara)
6 μl of 2.5 mM (each) dNTP (Takara)
0.5 μl of [α- ³² P] dGTP (select for incorporation)
After the start of the second strand program, place the tube on the thermal cycler.
If the sample is at 65 ° C., add 3 μl of 5 U / μl LA polymerase or an alternative thermostable polymerase cocktail to the tube in the final step.
Mix rapidly and thoroughly.

サーマルサイクラーのサイクル終了後、１０ｍＭのＥＤＴＡ（最終濃度）の添加によって反応を停止させ、プロテインキナーゼＫ処理、フェノール−クロロホルム抽出、およびエタノール沈殿によって反応物を浄化する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＣＳＨＬ ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと）。 At the end of the cycle of the thermal cycler, the reaction is stopped by adding 10 mM EDTA (final concentration) and the reaction is clarified by protein kinase K treatment, phenol-chloroform extraction, and ethanol precipitation (Sambrook and Russel, 2001, Molecular Cloning). , CSHL press, NY).

＜ｃＤＮＡの切断＞
次いで、ｃＤＮＡを、本実施例のＧｓｕＩのようなクラスＧＩＩｓ制限酵素で切断すべきである。
緩衝液（１０×）（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ） １０μｌ
ＧｓｕＩ（１Ｕ／μｌ）（５Ｕ／μｇＤＮＡを使用） Ｙμｌ
ｄｄＨ₂Ｏ Ｘμｌ
最終体積 １００μｌ
（ＹおよびＸは、ｃＤＮＡの量に依存して変化する）
１）３７℃で１時間インキュベートする。
２）０．５Ｍ ＥＤＴＡ２μｌを添加する。
３）６５℃で１５分間インキュベートして酵素を失活させる。 <Cleaving cDNA>
The cDNA should then be cut with a class GIIs restriction enzyme such as GsuI of this example.
Buffer (10 ×) (MBI Fermentas) 10 μl
GsuI (1 U / μl) (using 5 U / μg DNA) Yμl
ddH ₂ O X μl
Final volume 100 μl
(Y and X vary depending on the amount of cDNA)
1) Incubate at 37 ° C for 1 hour.
2) Add 2 μl of 0.5M EDTA.
3) Incubate at 65 ° C. for 15 minutes to inactivate the enzyme.

磁性ビーズの調製
適量のＣＰＧ−ＭＰＧ（磁性多孔質ガラスビーズ）を調製する。キャップトラッパーステップと同一の検討材料は、この時点で有効である。
２００μｌのＧＰＣビーズを調製する。
５μｌのｔＲＮＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加する。
時々震盪しながら室温で１０〜２０分間または氷上で３０〜６０分間インキュベートする。
マグネティックスタンド上にビーズを３分間移し、水相を除去する。
以下で３回洗浄する。１Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡは、ビーズの出発体積と少なくとも同体積を使用する。
ビーズの出発体積と等価の１Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡにビーズを再懸濁する。 Preparation of magnetic beads An appropriate amount of CPG-MPG (magnetic porous glass beads) is prepared. The same considerations as the cap trapper step are valid at this point.
Prepare 200 μl of GPC beads.
Add 5 μl tRNA (20 mg / ml).
Incubate for 10-20 minutes at room temperature or 30-60 minutes on ice with occasional shaking.
Transfer the beads on a magnetic stand for 3 minutes and remove the aqueous phase.
Wash three times with: 1M NaCl and 10 mM EDTA use at least the same volume as the starting volume of the beads.
Resuspend the beads in 1 M NaCl and 10 mM EDTA equivalent to the starting volume of the beads.

＜ｃＤＮＡタグの遊離＞
洗浄したビーズと混合し、ＧｓｕＩでサンプルを切断する。
時々穏やかに混合しながら室温で１５分間インキュベートする。
マグネティックラックに３分間置く。
上清を除去する。
１×ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）洗浄を含む５００μｌの１×Ｂ＆Ｗ緩衝液（結合および洗浄緩衝液＝５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、および１Ｍ ＮａＣｌ）で４回リンスする。
２００μｌの１×リガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）で２回洗浄する。 <Release of cDNA tag>
Mix with washed beads and cut sample with GsuI.
Incubate for 15 minutes at room temperature with occasional gentle mixing.
Place on magnetic rack for 3 minutes.
Remove the supernatant.
Rinse 4 times with 500 μl of 1 × B & W buffer (binding and wash buffer = 5 mM Tris pH 7.5, 0.5 mM EDTA, and 1 M NaCl) with 1 × BSA (bovine serum albumin) wash.
Wash twice with 200 μl of 1 × ligase buffer (NEB).

＜結合ｃＤＮＡへのリンカーのライゲーション：ＩＩリンカーライゲーション＞
この実施例では、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位を有するリンカーを使用する。しかし、本発明は、第２のリンカーにおけるＥｃｏＲＩの使用に依存も制限もされない。コンカテマーのクローニングの利便性に応じて任意の他の制限酵素およびその認識部位を使用することができる。 <Linker Ligation to Binding cDNA: II Linker Ligation>
In this example, a linker having a recognition site for the restriction enzyme EcoRI is used. However, the present invention is not dependent or limited on the use of EcoRI in the second linker. Any other restriction enzyme and its recognition site can be used depending on the convenience of concatemer cloning.

＜合成すべきオリゴヌクレオチド＞
５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＡＡＴＴＣＮＮ−３’（配列番号１７）
５’−Ｐ−ＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ−３’（配列番号１８）
リンカー１に記載のように、オリゴヌクレオチドを精製し、アニーリングする。 <Oligonucleotide to be synthesized>
5′-GAGAGAGAGAACTTTAGGTGACACTATAGAAGAGTCCTGAGAATTCNN-3 ′ (SEQ ID NO: 17)
5′-P-GAATTTCCAGGACTCTTCTATAGTGTCACCTAAAGTCCTCTCTCTC-3 ′ (SEQ ID NO: 18)
Oligonucleotides are purified and annealed as described in Linker 1.

ＬｏＴＥ（１ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）および０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）２０μｌを懸濁し、リンカーＩＩ（０．４μｇ／μｌ）を添加する。
チューブを６５℃で５分間加熱し、室温で１５分間静置する。
ＴａＫａＲａライゲーションキットＩＩのＩＩ液２５μｌおよびＩ液５０μｌを添加する。
１６℃で一晩インキュベートする。
ライゲーション後、１×ＢＳＡを含む５００μｌの１×Ｂ＆Ｗ緩衝液で４回洗浄する。
２００μｌの１×Ｂ＆Ｗ緩衝液で１回洗浄し、１×ＢＳＡを含む２００μｌの１×ＢｇｌＩＩ緩衝液で２回洗浄する。 Suspend 20 μl of LoTE (1 mM Tris (pH 7.5) and 0.1 mM EDTA) and add linker II (0.4 μg / μl).
The tube is heated at 65 ° C. for 5 minutes and allowed to stand at room temperature for 15 minutes.
Add 25 μl of II solution and 50 μl of I solution of TaKaRa Ligation Kit II.
Incubate overnight at 16 ° C.
After ligation, wash 4 times with 500 μl of 1 × B & W buffer containing 1 × BSA.
Wash once with 200 μl of 1 × B & W buffer and twice with 200 μl of 1 × BglII buffer containing 1 × BSA.

＜タグ化酵素を使用したｃＤＮＡの遊離＞
サンプルに以下を添加する。
−ＬｏＴＥ Ｘμｌ
−１０×緩衝液 １０μｌ
−ＢｇｌＩＩ Ｙμｌ
（全体積を１００μｌにする）。
１）断続的に穏やかに混合しながら３７℃で１時間インキュベートする。
２）磁石上に置き、上清を新規のチューブに回収する。上清は、遊離した５’末端フラグメントを含む。
３）ＬｏＴＥで体積を２００μｌに増加させる。
２００μｌ サンプル（リンカーでタグ化した５’末端）に、以下を添加する。
１３３μｌ ７．５Ｍ ＮＨ₄水溶液
３μｌ １μｇ／μｌグリコーゲン
３４０μｌ イソプロパノール。
−２０℃または−８０℃で少なくとも３０分間インキュベートする。
微量遠心分離機にて４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間スピンする。上清を除去する。ペレットを８０％または７０％エタノールで２回洗浄する。１５，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、エタノール洗浄物を取り出す。終了時に、１０μｌのＬｏＴＥに再懸濁する。 <Release of cDNA using tagged enzyme>
Add the following to the sample:
-LoTE Xμl
−10 × buffer 10 μl
-BglII Yμl
(The total volume is 100 μl).
1) Incubate for 1 hour at 37 ° C with intermittent gentle mixing.
2) Place on magnet and collect supernatant in a new tube. The supernatant contains the free 5 'end fragment.
3) Increase the volume to 200 μl with LoTE.
To a 200 μl sample (5 ′ end tagged with linker) add:
133 μl 7.5 M NH ₄ aqueous solution 3 μl 1 μg / μl glycogen 340 μl isopropanol.
Incubate at -20 ° C or -80 ° C for at least 30 minutes.
Spin for 20 minutes at 15,000 rpm in a microcentrifuge. Remove the supernatant. Wash the pellet twice with 80% or 70% ethanol. Centrifuge at 15,000 rpm for 3 minutes and remove the ethanol wash. At the end, resuspend in 10 μl LoTE.

ジタグを形成するためのタグのライゲーション
ｃＤＮＡの５’末端をライゲーションしてジタグを形成する。
１）ＴａＫａＲａライゲーションキットＩＩのＩＩ液１０μｌおよびＩ液２０μｌを添加する。
２）１６℃で一晩インキュベートする。
３）１０μｌのｄｄＨ₂Ｏ、１μｌの０．５Ｍ ＲＤＴＡ、１μｌの１０％ＳＤＳ、および１μｌの１０μｇ／μｌプロテイナーゼＫを添加する。
４）４５℃で１５分間インキュベートする。
５）１：１のＴｒｉｓ平衡化フェノール：クロロホルム水相で１回抽出する。フェノール−クロロホルムおよびクロロホルム後、逆抽出する。
６）Ｇ−５０スパンカラム（サイズ排除）を使用して最も小さいｃＤＮＡフラグメントを除去する。
７）キャリアとして５μｇのグリコーゲンの添加によってイソプロパノールで沈殿する。
１００μｌサンプル
６７μｌ ７．５Ｍ ＭＨ₄ＯＡｃ
５μｌグリコーゲン
１８０μｌイソプロパノール
８）４℃で２０分間スピンする。
９）８０％または７０％エタノールで２回洗浄し、遠心分離し、エタノールを除去する。 Ligating a tag to form a ditag The 5 ′ end of the cDNA is ligated to form a ditag.
1) Add 10 μl of II solution and 20 μl of I solution of TaKaRa Ligation Kit II.
2) Incubate overnight at 16 ° C.
3) Add 10 μl ddH ₂ O, 1 μl 0.5 M RDTA, 1 μl 10% SDS, and 1 μl 10 μg / μl proteinase K.
4) Incubate at 45 ° C for 15 minutes.
5) Extract once with 1: 1 Tris equilibrated phenol: chloroform aqueous phase. Back-extract after phenol-chloroform and chloroform.
6) Remove the smallest cDNA fragment using a G-50 span column (size exclusion).
7) Precipitate with isopropanol by addition of 5 μg glycogen as carrier.
100 μl sample 67 μl 7.5M MH ₄ OAc
5 μl glycogen 180 μl isopropanol 8) Spin at 4 ° C. for 20 minutes.
9) Wash twice with 80% or 70% ethanol, centrifuge and remove ethanol.

＜固定酵素でのｃＤＮＡの切断＞
１）サンプルを５μｌのＬｏＴＥに再懸濁する。以下を順番に添加する。
ＬｏＴＥ Ｘμｌ
１０×ＥｃｏＲＩ制限緩衝液 ５μｌ
ＥｃｏＲＩ Ｙμｌ（２０ＵのＥｃｏＲＩを使用）。
体積を全部で５０μｌに増加させる。
２）３７℃で１時間インキュベートする。
３）１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１μｌの１０％ＳＤＳ１、および１μｌの１０μｇ／μｌプロテイナーゼＫ１０％を添加する。
４）４５℃で１５分間インキュベートする。
５）１：１のＴｒｉｓ平衡化フェノール：クロロホルムで水相から１回抽出する。フェノール−クロロホルムおよびクロロホルムでの抽出後、逆抽出する。
６）キャリアとして５μｇのグリコーゲンの添加によりイソプロパノールで沈殿させる。
１００μｌ サンプル
６７μｌ ７．５Ｍ ＮＨ₄ＯＡｃ
５μｌグリコーゲン
１８０μｌ イソプロパノール
８）４℃で２０分間スピンする。
９）８０％または７０％エタノールで２回洗浄し、遠心分離し、毎回エタノール洗浄物を除去する。 <Cleaving cDNA with a fixed enzyme>
1) Resuspend sample in 5 μl LoTE. Add the following in order.
LoTE Xμl
10 × EcoRI restriction buffer 5 μl
EcoRI Yμl (using 20U EcoRI).
Increase the volume to a total of 50 μl.
2) Incubate at 37 ° C for 1 hour.
3) Add 1 μl of 0.5 M EDTA, 1 μl of 10% SDS1, and 1 μl of 10 μg / μl proteinase K 10%.
4) Incubate at 45 ° C for 15 minutes.
5) Extract once from aqueous phase with 1: 1 Tris equilibrated phenol: chloroform. Back-extract after extraction with phenol-chloroform and chloroform.
6) Precipitate with isopropanol by addition of 5 μg glycogen as carrier.
100 μl Sample 67 μl 7.5M NH ₄ OAc
5 μl glycogen 180 μl isopropanol 8) Spin at 4 ° C. for 20 minutes.
9) Wash twice with 80% or 70% ethanol, centrifuge and remove ethanol wash each time.

＜コンカテマーを形成するためのジタグのライゲーション＞
１）５μｌのＬｏＴＥに再懸濁する。
２）ＴａＫａＲａライゲーションキットＩＩのＩＩ液５μｌおよびＩＩ液１０μｌを添加する。
３）１６℃で１．５時間インキュベートする。
４）１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１μｌの１０％ＳＤＳ１、および１μｌの１０μｇ／μｌプロテイナーゼＫを添加する。
５）４５℃で１５分間インキュベートする。
６）１：１のＴｒｉｓ平衡化フェノール：クロロホルムで水相から１回抽出する。フェノール−クロロホルムおよびクロロホルムでの抽出後、逆抽出する。
７）キャリアとして５μｇのグリコーゲンの添加によりイソプロパノールで沈殿させる。
１００μｌ サンプル
６７μｌ ７．５Ｍ ＮＨ₄ＯＡｃ
５μｌグリコーゲン
１８０μｌ イソプロパノール
８）４℃で２０分間スピンする。
９）８０％または７０％エタノールで２回洗浄し、遠心分離し、除去する。
５μｌ ｄｄＨ₂Ｏに再溶解する。 <Ligation of ditags to form concatamers>
1) Resuspend in 5 μl LoTE.
2) Add 5 μl of II solution and 10 μl of II solution of TaKaRa Ligation Kit II.
3) Incubate at 16 ° C. for 1.5 hours.
4) Add 1 μl of 0.5 M EDTA, 1 μl of 10% SDS1, and 1 μl of 10 μg / μl proteinase K.
5) Incubate at 45 ° C for 15 minutes.
6) Extract once from aqueous phase with 1: 1 Tris equilibrated phenol: chloroform. Back-extract after extraction with phenol-chloroform and chloroform.
7) Precipitate with isopropanol by addition of 5 μg glycogen as carrier.
100 μl Sample 67 μl 7.5M NH ₄ OAc
5 μl glycogen 180 μl isopropanol 8) Spin at 4 ° C. for 20 minutes.
9) Wash twice with 80% or 70% ethanol, centrifuge and remove.
Redissolve in 5 μl ddH ₂ O.

上記で得られたコンカテマーを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのクローニングベクターにさらにライゲーションする。本発明で使用することができる広範な種々のクローニングベクターが、当分野で公知である。   The concatamer obtained above is further ligated to a cloning vector such as pBluescriptII KS + (Stratagene). A wide variety of cloning vectors that can be used in the present invention are known in the art.

標準的なライゲーション：
過剰なコンカテマーＤＮＡおよび１００ｎｇのＥｃｏＲＩで線状化した適切なベクターを５μｌの体積で３回混合する。次いで、ＤＮＡライゲーションキットバージョン２（Ｔａｋａｒａ）の５μｌのＩ液を混合してインサート／ベクター混合物にする。チューブを、１６℃で１２〜１６時間インキュベートする。 Standard ligation:
Excess concatamer DNA and appropriate vector linearized with 100 ng EcoRI are mixed three times in a volume of 5 μl. The DNA ligation kit version 2 (Takara) 5 μl of solution I is then mixed to form an insert / vector mixture. Tubes are incubated at 16 ° C. for 12-16 hours.

形質転換：
ライゲーション溶液から塩を除去するために、２μｇのグリコーゲン（Ｒｏｃｈｅ）、２０ｍＭ塩化ナトリウム、および８０％エタノールの添加後にＤＮＡを沈殿させる。ＤＮＡペレットを、１５０μｌの８０％エタノールで２回洗浄し、ペレットを１０μｌの水に溶解する。１μｌの脱塩ライゲーション溶液を使用し、製造者のマニュアルに記載の形質転換手順に従って、Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）などを使用してＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ（商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）細胞（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎｅ）を形質転換する。形質転換した細菌を、選択培地にプレートし、一晩成長させる。コンカテマーのさらなる特徴づけのために陽性のクローンをこれらのプレートから単離する。 Transformation:
In order to remove salt from the ligation solution, the DNA is precipitated after addition of 2 μg glycogen (Roche), 20 mM sodium chloride, and 80% ethanol. The DNA pellet is washed twice with 150 μl 80% ethanol and the pellet is dissolved in 10 μl water. 1 μl of desalted ligation solution is used to transform ElectroMAX ™ DH10B ™ cells (Invtrogene) using Cell-Portor (Biometer) etc. according to the transformation procedure described in the manufacturer's manual. Transformed bacteria are plated on selective media and allowed to grow overnight. Positive clones are isolated from these plates for further characterization of concatamers.

＜ジタグの形成を含む５’末端特異的タグの別の調製＞
実施例１および２に記載のもの以外のリンカーおよび制限酵素を使用して本発明を実施することができる。１つのこのような実施形態では、以下を変化させるが、特記しない限り実施例１と同一のプロトコールを使用して本発明を行った。上記のようにＲＮＡサンプルを調製し、第１のｃＤＮＡ鎖合成に移行する。得られたｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを、キャップトラッパーアプローチによって分画し、ｍＲＮＡの５’末端に相同な配列を含むｃＤＮＡ転写物を単離した。次いで、一本鎖ｃＤＮＡを、以下のオリゴヌクレオチドから構成される異なる第１のリンカーにライゲーションした。 <Another preparation of 5 'end specific tag including ditag formation>
The present invention can be practiced using linkers and restriction enzymes other than those described in Examples 1 and 2. In one such embodiment, the present invention was performed using the same protocol as Example 1 unless otherwise specified. An RNA sample is prepared as described above, and the process proceeds to the first cDNA strand synthesis. The resulting cDNA-RNA hybrid was fractionated by a cap trapper approach and a cDNA transcript containing a sequence homologous to the 5 ′ end of the mRNA was isolated. The single stranded cDNA was then ligated to a different first linker composed of the following oligonucleotides.

新規のリンカーにより、制限酵素ＸｈｏＩ（下線を引いた大文字で示す）、ＸｍａＪＩ（大文字で示す）、およびタグ化酵素ＭｍｅＩ（イタリック体で示す）の認識部位を得た。
ｃＤＮＡへのリンカーのライゲーション後、第２のｃＤＮＡ鎖を調製し、二本鎖ＤＮＡをＭｍｅＩで切断して５’末端特異的タグを得た。次いで、これらのタグを、ストレプトアビジンコーティング磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）で精製し、その後第２のリンカーを添加した。下記のように、第２のリンカーは、実施例１および２で使用したリンカーと比較して異なるＹ形構造を有していた。 The novel linker provided recognition sites for the restriction enzymes XhoI (indicated by underlined capital letters), XmaJI (indicated by capital letters), and the tagged enzyme MmeI (indicated by italics).
After ligation of the linker to the cDNA, a second cDNA strand was prepared and the double-stranded DNA was cleaved with Mmel to obtain a 5 ′ end specific tag. These tags were then purified with streptavidin-coated magnetic beads (Dynabeads), after which a second linker was added. As described below, the second linker had a different Y-shaped structure compared to the linker used in Examples 1 and 2.

ＥｃｏＲＩ制限部位（下線で示す）を有し、２つの一本鎖突出末端が鎖特異的に増幅するようにこのリンカーをデザインした。この時点で、異なるクローニング部位を有する２つの制限酵素を使用したことに留意のこと。
５’末端タグへの第２のリンカーのライゲーション後、２つのリンカーおよび１つのタグを含む得られたＤＮＡフラグメントを、以下のプライマーを使用したＰＣＲによって増幅した。 This linker was designed to have an EcoRI restriction site (indicated by underline) so that the two single-stranded overhanging ends amplify in a strand-specific manner. Note that at this point, two restriction enzymes with different cloning sites were used.
After ligation of the second linker to the 5 ′ end tag, the resulting DNA fragment containing two linkers and one tag was amplified by PCR using the following primers.

ＸＭ＿ｃＤＮＡ＿ＰＣＲ：
５’−ｔｔａｇａｔｇａｇａｇｔｇａｃｔｃｇａｇｃｃｔａｇ−３’（配列番号２４）
ＥｃｏＲＩ＿Ｙ２下流＿ＰＣＲ：
５’−ｃｔａｃｇａｔｃｇｇａａｔｔｔｇａｇｃｔａａｇｔｇ−３’（配列番号２５） XM_cDNA_PCR:
5'-ttagatgagagtgactcgagcctag-3 '(SEQ ID NO: 24)
EcoRI_Y2 downstream_PCR:
5′-ctacgatcggaatttgagctaagtg-3 ′ (SEQ ID NO: 25)

ビオチン−ストレプトアビジン相互作用によってＤＮＡテンプレートが結合しているストレプトアビジンコーティングビーズ上でＰＣＲ産物を直接増幅した。ＰＣＲプライマーがいかなるビオチン溶液（ｍｏｉｓｔｕｒｅ）も含まないので、磁力の印加によってビーズからＰＣＲ産物を直接分離し、１２％ポリアクリルアミドゲルでのさらなる精製に供することができる。   PCR products were directly amplified on streptavidin-coated beads to which the DNA template was bound by biotin-streptavidin interaction. Since the PCR primer does not contain any biotin solution, the PCR product can be separated directly from the beads by application of a magnetic force and subjected to further purification on a 12% polyacrylamide gel.

次いで、精製ＰＣＲ産物を、ＸｍａＪＩで切断し、１２％ポリアクリルアミドゲルで精製し、自己ライゲーションして両末端に５’末端特異的タグおよび第２のリンカー由来の突出末端を含む二量体タグを形成させた。これらの二量体化産物を、ＥｃｏＲＩでさらに切断し、１２％ポリアクリルアミドゲルで再度精製し、その後ライゲーション反応においてコンカテマー化した。この最後のゲル精製は、ＥｃｏＲＩでの消化時に切断されたＤＮＡフラグメントからの二量体タグの分離に不可欠であった。ライゲーション産物を、６％ポリアクリルアミドゲルで分画し、３００〜６００ｂｐおよび６００〜４，０００ｂｐの範囲のＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ単離のために切り出した。   The purified PCR product is then cleaved with XmaJI, purified on a 12% polyacrylamide gel and self-ligated to produce a dimeric tag containing a 5 ′ end-specific tag at both ends and a protruding end from the second linker. Formed. These dimerization products were further cut with EcoRI, purified again on a 12% polyacrylamide gel, and then concatamerized in a ligation reaction. This final gel purification was essential for the separation of the dimer tag from the DNA fragment cleaved upon digestion with EcoRI. Ligation products were fractionated on a 6% polyacrylamide gel and DNA fragments ranging from 300-600 bp and 600-4,000 bp were excised for DNA isolation.

両画分から単離したＤＮＡフラグメントを、ベクターｐＺｅｒｏ１．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、形質転換細菌を、５０μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＬＢ培地で選択した。陽性のクローンを単離し、以下の実施例に記載のようにさらに特徴付けた。   DNA fragments isolated from both fractions were cloned into the EcoRI site of vector pZero1.0 (Invitrogen) and transformed bacteria were selected in LB medium containing 50 μg / ml Zeocin (Invitrogen). Positive clones were isolated and further characterized as described in the examples below.

＜５’末端配列タグの配列決定＞
力価チェック後、市販の選別機（Ｑ−ｂｏｔおよびＱ−ｐｉｘ；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）によって細菌クローンを回収し、３８４マイクロウェルプレートに移した。ベクターＤＮＡを保持する形質転換大腸菌クローンを、３８４マイクロウェルプレートに分注し、４つの９６ウェルプレートで成長させた。一晩の成長後、プラスミドを、手動（Ｉｔｏｈ Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：１３１５−１３１６）または自動（Ｉｔｏｈ Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．９：４６３−４７０）のいずれかで抽出した。典型的には、配列を、Ｓｈｉｂａｔａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０００ １０，１７５７−７１）などに記載の標準的な配列決定法に従って、ＲＩＳＡ配列決定ユニット（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，ＪＡＰＡＮ）またはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ３７７で配列決定した。また、製造者の製品説明書に従って、クローニングベクターの隣接領域をネスト化したプライマーおよびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＡＢＩ３７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）シークエンサーを使用して、コンカテマーの配列決定を行った。その全配列を対象とするために、末端からいくつかのコンカテマーを配列決定した。 <Sequencing of 5 ′ terminal sequence tag>
After the titer check, the bacterial clones were collected by a commercial sorter (Q-bot and Q-pix; Genetics) and transferred to a 384 microwell plate. Transformed E. coli clones carrying vector DNA were dispensed into 384 microwell plates and grown in four 96 well plates. After overnight growth, plasmids were either manually (Itoh M. et al. 1997, Nucleic Acids Res 25: 1315-1316) or automated (Itoh M. et al. 1999, Genome Res. 9: 463-470). Extracted with Typically, the sequence is a Shibata K. et al. et al. (Genome Res. 2000 10, 1757-71) and others were sequenced with a RISA sequencing unit (Shimadzu, JAPAN) or Perkin Elmer-Applied Biosystems ABI377. Also, according to the manufacturer's product instructions, using primers that nested the flanking regions of the cloning vector and BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0 (Applied Biosystems) and ABI3700 (Applied Biosystems) sequencer Made a decision. Several concatamers were sequenced from the ends to cover the entire sequence.

ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびｐＺｅｒｏ１．０で使用した標準的プライマー：
Ｍ１３逆方向プライマー：５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ（配列番号２６）
Ｍ１３（−２０）正方向プライマー：５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ（配列番号２７） Standard primers used with the vectors Bluescript and pZero1.0:
M13 reverse primer: 5′-CAGGAAACAGCTATGAC (SEQ ID NO: 26)
M13 (−20) forward primer: 5′-GTAAAACGACGGCCAG (SEQ ID NO: 27)

＜５’末端配列タグの同定＞
図６に記載のように、コンカテマーから得られた配列を、二量体タグおよび隣接リンカー部位の構造によって特徴付ける。クローニングステップ時に使用した制限酵素の認識部位を保持する定義された領域は、それぞれ５’末端特異的配列タグに隣接する。したがって、５’末端特異的配列タグを、手動配列決定分析または適切なコンピュータプログラムを使用した自動化処理によって同定することができる。各５’末端特異的配列タグを、コンピュータファイルまたはデータ−ベースシステムに保存することができる。
最初の配列の読み取りを、コンピュータ手段によって分析した。配列分析に関与する各抗体を、以下に示し、これは１つの読み取りの分析を示す。 <Identification of 5 ′ terminal sequence tag>
As described in FIG. 6, the sequence obtained from the concatemer is characterized by the structure of the dimer tag and adjacent linker sites. Each defined region that retains the recognition site for the restriction enzyme used during the cloning step is adjacent to the 5 ′ end specific sequence tag. Thus, 5 ′ end specific sequence tags can be identified by manual sequencing analysis or automated processing using an appropriate computer program. Each 5 ′ end specific sequence tag can be stored in a computer file or data-base system.
Initial sequence reads were analyzed by computer means. Each antibody involved in sequence analysis is shown below, which represents an analysis of one reading.

０）元の配列：
＞ｚｚｂ２１３０５ｉ０３ｔ３．ｓｃｆ ５９６ ０ ５９６ ＳＣＦ
ＴＣＧＴＴＡＡＣＴＡＴＴＡＧＧＣＧＡＡＴＴＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＴＣＴＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＡＣＣＧＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＡＡＴＡＧＴＴＡＣＴＣＧＡＧＧＴＣＴＣＴＣＧＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＡＧＴＴＴＴＴＣＧＴＡＴＧＴＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧＧＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧＴＣＴＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＣＧＧＡＡＣＣＧＣＡＣＣＧＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧＧＡＡＡＡＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＣＴＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＧＴＴＣＡＧＡＴＣＡＡＡＡＧＴＣＧＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧＧＧＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＡＧＴＣＴＡＧＡＴＧＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＣＣＮＡＡＴＮＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＮＡＣＣＡＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＧＣＡＴＡＣＣＴＣＧＡＧＴＡＴＣＣＴＡＴＡＣＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＡＧＣＴＴＧＧＧＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＡＡＡＴＴＣＣＣＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧ
（配列番号２８） 0) Original array:
> Zzb21305i03t3. scf 596 0 596 SCF
TCGTTAACTATTAGGCGAATTGGGCCCTCTAGGTCGACGAGTTCTCAGCAGAGCCGCCGTCTAGAGCCCCGCCCTCCCGGGCCACCGTCGGACCTAGAATAGTTACTCGAGGTCTCTCGTCGGACCTAGAGTTTTTCGTATGTTTGTCATCGTCGGACCTAGGTCCGACGGTCCATTCCTGAGAGTCTCTCTAGGTCCGACGAGAGAGAGAGGATCCTTCTGTCTAGACCCTGACGCCGGAACCGCACCGTCGGACCTAGGTCCGACGGAAAAGCAGCTTCCTCCACTCTAGGTCCGACGGTGTGTGTGTGTGTGCGTGTTCTAGAGACTGGT CAGATCAAAAGTCGTCGGACCTAGGTCCGACGGGGCTGGTGAGATGGCTCAGTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCCNAATNCCAGCACACCGGCGCGCGCNACCAGTGGATCCGAGCCCGGTACCAAGCTTGATGCATACCTCGAGTATCCTATACTGTCACCTAAATAGCTTGGGGTAATCATGGTCATAGCTGTCTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCAAAATTCCCAACAACATAG
(SEQ ID NO: 28)

１）配列のｐＺＥｒＯ−１ベクター部分を、「ｃｒｏｓｓ＿ｍａｔｃｈ」と呼ばれるプログラムを使用してマスクした。Ｘは「マスク」を示す。
＞ｚｚｂ２１３０５ｉ０３ｔ３．ｓｃｆ ５９６ ０ ５９６ ＳＣＦ
ＴＣＧＴＴＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＴＣＴＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＡＣＣＧＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＡＡＴＡＧＴＴＡＣＴＣＧＡＧＧＴＣＴＣＴＣＧＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＡＧＴＴＴＴＴＣＧＴＡＴＧＴＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧＧＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧＴＣＴＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＣＧＧＡＡＣＣＧＣＡＣＣＧＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧＧＡＡＡＡＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＣＴＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＧＴＴＣＡＧＡＴＣＡＡＡＡＧＴＣＧＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧＧＧＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＡＧＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＧ 1) The pZErO-1 vector part of the sequence was masked using a program called “cross_match”. X represents a “mask”.
> Zzb21305i03t3. scf 596 0 596 SCF
TCGTTAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGTCGACGAGTTCTCAGCAGAGCCGCCGTCTAGAGCCCCGCCCTCCCGGGCCACCGTCGGACCTAGAATAGTTACTCGAGGTCTCTCGTCGGACCTAGAGTTTTTCGTATGTTTGTCATCGTCGGACCTAGGTCCGACGGTCCATTCCTGAGAGTCTCTCTAGGTCCGACGAGAGAGAGAGGATCCTTCTGTCTAGACCCTGACGCCGGAACCGCACCGTCGGACCTAGGTCCGACGGAAAAGCAGCTTCCTCCACTCTAGGTCCGACGGTGTGTGTGTGTGTGCGTGTTCTAGAGACTGGT CAGATCAAAAGTCGTCGGACCTAGGTCCGACGGGGCTGGTGAGATGGCTCAGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXG

２）「ｃｒｏｓｓ＿ｍａｔｃｈ」を使用してリンカー配列を検索する。
実施例１のリンカー配列：「ＮＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣ」（配列番号２９）
実施例３のリンカー配列：「ＮＧＴＴＧＧＡＣＣＴＡＧＧＴＣＣＡＡＣＮ」（配列番号３０）
「ｃｒｏｓｓ＿ｍａｔｃｈ」を使用して見出したリンカー（出力からの抜粋）： 2) Search for linker sequence using “cross_match”.
Linker sequence of Example 1: “NCTAGGTCCGAC” (SEQ ID NO: 29)
Linker sequence of Example 3: “NGTTGGACCCTGTCCAACN” (SEQ ID NO: 30)
Linker found using "cross_match" (excerpt from output):

リンカー１ ＴＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧ ８６−９８ １３−１ Ｃ（配列番号３１）
リンカー２ ＴＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧ １１８−１３０ １３−１ Ｃ
リンカー３ ＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧ １５１−１６３ １３−１ Ｃ（配列番号３２）
リンカー４ ＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧ １５８−１７０ １−１３
リンカー５ ＴＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧ １９０−２０２ １−１３
リンカー６ ＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧ ２４９−２６１ １３−１ Ｃ
リンカー７ ＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧ ２５６−２６８ １−１３
リンカー８ ＴＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧ ２８８−３００ １−１３
リンカー９ ＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧ ３４７−３５９ １３−１ Ｃ
リンカー１０ ＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧ ３５４−３６６ １−１３ Linker 1 TCTAGGTCCGACG 86-98 13-1 C (SEQ ID NO: 31)
Linker 2 TCTAGGTCCGACG 118-130 13-1 C
Linker 3 CCTAGGTCCGACG 151-163 13-1 C (SEQ ID NO: 32)
Linker 4 CCTAGGTCCGACG 158-170 1-13
Linker 5 TCTAGGTCCGACG 190-202 1-13
Linker 6 CCTAGGTCCGACG 249-261 13-1 C
Linker 7 CCTAGGTCCGACG 256-268 1-13
Linker 8 TCTAGGTCCGACG 288-300 1-13
Linker 9 CCTAGGTCCGACG 347-359 13-1 C
Linker 10 CCTAGGTCCGACG 354-366 1-13

３）「ｃｒｏｓｓ＿ｍａｔｃｈ」由来の出力の使用。タグ抽出プログラムにより、配列中のリンカーの位置および方向を同定する。
−−−−−−−−−−−−は逆方向のリンカーを意味する。
＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋は正方向のリンカーを意味する。
−−−−−−−−−−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋二量体リンカー（逆方向および正方向） 3) Use output from “cross_match”. The tag extraction program identifies the position and orientation of the linker in the sequence.
------------ means the linker in the reverse direction.
+++++++++++++ means forward linker.
---------- ++++++++++ dimer linker (reverse and forward)

＞ｚｚｂ２１３０５ｉ０３ｔ３ ５９６
ＴＣＧＴＴＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＴＣＴＣＡＧＣＡ
ＧＡＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＡＣ−−−−−−−−−−−−−ＡＴ
ＡＧＴＴＡＣＴＣＧＡＧＧＴＣＴＣＴ−−−−−−−−−−−−−ＧＴＴＴＴＴＣＧＴＡＴＧＴＴＴＧＴＣＡＴ
−−−−−−−−−−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＧＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＡＧＡＧＴＣＴＣ＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋
＋＋ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧＴＣＴＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＣＧＧＡＡＣＣＧＣＡＣ−−
−−−−−−−−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＧＡＡＡＡＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＣ＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋
ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＧＴＴＣＡＧＡＴＣＡＡＡＡＧＴ−−−−
−−−−−−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＧＧＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＡＧＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＧ > Zzb21305i03t3 596
TCGTTAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGTCGACGAGTTCTCAGCA
GAGCCGCCCTCTAGAGCCCCGCCCTCCCGGGGCCAC ------------- AT
AGTTACTCGAGGTCTCT ------------ GTTTTTCGGTATGTTTGTCAT
---------- ++++++++++++ GTCCCATTCCTGAGAGCTCTC ++++++++++++
++ AGAGAGAGAGGATCCTTCTGTCTAGACCCTGACGCCCGGAACCGCAC--
-------- ++++++++++++ GAAAAGCAGCCTTCCTCCAC ++++++++++++++
GTGTGTGTGTGTTGCGTGTTCTAGAGACTGGTTCAGATCAAAAGT ----
------ +++++++ GG ++ GGGGCTGGTGGAGATGGCTCAGXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXG

４）スクリプトにより、可能な位置の制限酵素部位を検索した。例えば、２つのタグに十分な長さの２つのリンカー（またはリンカー−ベクター）の間のギャップ。
単量体のための「ＴＣＴＡＧＡ」
二量体のための「ＧＡＡＴＴＣ」
「^******」でマスクした。 4) A restriction enzyme site at a possible position was searched using a script. For example, a gap between two linkers (or linker-vectors) long enough for two tags.
"TCTAGA" for monomers
"GAATTC" for dimers
Masked with " ^****** ".

＞ｚｚｂ２１３０５ｉ０３ｔ３ ５９６
ＴＣＧＴＴＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＴＣＴＣＡＧＣＡ
ＧＡＧＣＣＧＣＣＧ＊＊＊＊＊＊ＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＡＣ−−−−−−−−−−−−−ＡＴ
ＡＧＴＴＡＣＴＣＧＡＧＧＴＣＴＣＴ−−−−−−−−−−−−−ＧＴＴＴＴＴＣＧＴＡＴＧＴＴＴＧＴＣＡＴ
−−−−−−−−−−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＧＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＡＧＡＧＴＣＴＣ＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋
＋＋ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧ＊＊＊＊＊＊ＣＣＣＴＧＡＣＧＣＣＧＧＡＡＣＣＧＣＡＣ−−
−−−−−−−−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＧＡＡＡＡＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＣ＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋
ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴ＊＊＊＊＊＊ＧＡＣＴＧＧＴＴＣＡＧＡＴＣＡＡＡＡＧＴ−−−−
−−−−−−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＧＧＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＡＧＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＧ > Zzb21305i03t3 596
TCGTTAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGTCGACGAGTTCTCAGCA
GAGCCCGCCG ****** GCCCGCCCCTCCCCGGCCAC ------------- AT
AGTTACTCGAGGTCTCT ------------ GTTTTTCGGTATGTTTGTCAT
---------- ++++++++++++ GTCCCATTCCTGAGAGCTCTC ++++++++++++
++ AGAGAGAGAGGATCCTTCTG ****** CCCTGACGCCCGGAACCGCAC--
-------- ++++++++++++ GAAAAGCAGCCTTCCTCCAC ++++++++++++++
GTGTGTGTGTGTTGCGGTGT *** GACTGGTTCAGATCAAAAGT ----
------ +++++++ GG ++ GGGGCTGGTGGAGATGGCTCAGXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXG

５）スクリプトにより、ベクター、リンカー、制限酵素部位からマスクされていない配列からタグを抽出した。タグはまた、ａ）正確なサイズ（１９〜２０ｂｐ）であり、ｂ）リンカーのすぐ隣に正しい方向で存在しなければならない（＋＋＋＋＋＋＋タグまたはタグ−−−−−−−−−）。   5) A tag was extracted from the sequence that was not masked from the vector, linker, and restriction enzyme sites by script. The tag must also a) be the correct size (19-20 bp) and b) be in the right orientation immediately next to the linker (+++++++ tag or tag ---------).

タグ１ ２０ ＧＴＧＧＣＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＧＧＧＧＣ（配列番号３３）
タグ２ １９ ＡＧＡＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＡＡＣＴＡＴ（配列番号３４）
タグ３ ２０ ＡＴＧＡＣＡＡＡＣＡＴＡＣＧＡＡＡＡＡＣ（配列番号３５）
タグ４ １９ ＧＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＡＧＡＧＴＣＴＣ（配列番号３６）
タグ５ ２０ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧ（配列番号３７）
タグ６ ２０ ＧＴＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＧＴＣＡＧＧＧ（配列番号３８）
タグ７ １９ ＧＡＡＡＡＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＣ（配列番号３９）
タグ８ ２０ ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴ（配列番号４０）
タグ９ ２０ ＡＣＴＴＴＴＧＡＴＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＣ（配列番号４１）
タグ１０ ２０ ＧＧＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＡＧ（配列番号４２） Tag 1 20 GTGGCCCGGGAGGGCGGGGC (SEQ ID NO: 33)
Tag 2 19 AGAGACCTCGAGTAACTAT (SEQ ID NO: 34)
Tag 3 20 ATGACAAACATACACGAAAAC (SEQ ID NO: 35)
Tag 4 19 GTCCATTCCTGAGAGCTC (SEQ ID NO: 36)
Tag 5 20 AGAGAGAGAGAGATCCTTCTG (SEQ ID NO: 37)
Tag 6 20 GTGCGGTTCCGGCGTCAGGG (SEQ ID NO: 38)
Tag 7 19 GAAAAGCAGCCTTCCCCCAC (SEQ ID NO: 39)
Tag 8 20 GTGTGTGTGTGTGTGCGTGT (SEQ ID NO: 40)
Tag 9 20 ACTTTTGATCTGAACCAGTC (SEQ ID NO: 41)
Tag 10 20 GGGCTGGTGGAGATGGCTCAG (SEQ ID NO: 42)

以下の定義を使用して、タグを分類した。
「良好なタグ」は、以下を意味する。
１）ベクター配列ではない（ステップ１）。
２）リンカー配列ではない（ステップ２）。
３）制限部位ではない（ステップ４）。
４）正確な方向でリンカーに隣接している（ステップ５）。
５）正確なサイズである（１９〜２０ｂｐ）（ステップ５）。
今後、精度（ｑｕａｌｉｔｙ ｖａｌｕｅ）も役立つ。 Tags were classified using the following definitions:
“Good tag” means:
1) Not a vector sequence (step 1).
2) Not a linker sequence (step 2).
3) Not a restriction site (step 4).
4) Adjacent to the linker in the correct orientation (step 5).
5) The exact size (19-20 bp) (step 5).
In the future, the quality value will also be useful.

プログラムにより、リンカー情報、マスクした配列、タグ配列を出力する。
「ジャンク」は、以下を意味する。
プログラム／スクリプトは制限酵素部位またはリンカー配列を認識することができない場合（精度の悪さによる）、配列をジャンクと見なす。適切にマスクされなかったベクター配列も（精度の悪さによる）、ジャンクと見なす。 The linker information, masked sequence, and tag sequence are output by the program.
“Junk” means:
If the program / script cannot recognize a restriction enzyme site or linker sequence (due to poor accuracy), the sequence is considered a junk. Vector sequences that are not properly masked (due to inaccuracy) are also considered junk.

以下に、コンピュータベースの配列決定の読出し分析の出力を示す。実施例１に示したプロトコールにしたがって調製したクローンから配列の読出しを得た。ＸｍａＪＩおよびＸｂａＩにより消化後に同一の突出末端が作製されるので、この実施例では、配列の多数のリンカー部位は組換えＸｍａＪＩ／ＸｂａＩ側に由来することに留意のこと。プログラムによって、記号によって示されたリンカー部位が同定され、上記のように５’末端特異的配列タグを強調した。以下に示した５’末端特異的タグのリストでは、逆転写酵素の無テンプレート部位の活性によってこの位置で人工物が開始されるので、プログラムにより第１の塩基が自動的に除去されることに留意のこと。   Below is the output of a computer-based sequencing read analysis. Sequence reads were obtained from clones prepared according to the protocol shown in Example 1. Note that in this example, multiple linker sites in the sequence are derived from the recombinant XmaJI / XbaI side, since identical overhangs are created after digestion with XmaJI and XbaI. The program identified the linker site indicated by the symbol and highlighted the 5 'end specific sequence tag as described above. In the list of 5 'end-specific tags shown below, the artifact is initiated at this position by the activity of the templateless site of reverse transcriptase, so the program will automatically remove the first base. Please note.

＞ｚｚｂ２１１０６ｉ０９ｔ３．ｓｃｆ ５６９（単量体）
ＣＡＴＴＡＧＧＧＧＡＴＴＧＧＧＣＣＣ＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＧＴＡＣＣＴＣＣＴＣＧＣＡＴＣＣＣＧＣ
＊＊＊＊＊＊ＡＣＣＴＴＣＧＡＣＡＣＧＣＡＣＡＣＣＡＣ−−−−−−−−−−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＡＴＧＧ
ＡＣＣＧＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣ＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＣＧＧＡＴＣＧＧＧＴＧＧＧＴＣＧＧＡＣ＊＊
＊＊＊＊ＡＣＧＡＡＣＴＧＣＴＧＣＧＡＣＣＴＣＴ−−−−−−−−−−−−−ＣＡＣＡＧＣＧＣＣＧＧＣＴＣ
ＣＧＧＡＧＡ−−−−−−−−−−−−−ＣＴＣＧＧＡＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＴＣＴ−−−−−−−−−−−−
−ＴＣＣＧＧＣＧＣＴＧＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣ−−−−−−−−−−−−−ＧＣＧＡＣＣＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧ
ＧＴＧＴ−−−−−−−−−−−−−ＧＡＣＴＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＡＣＧＴＣＴ−−−−−−−−−−＋＋＋
＋＋＋＋＋＋＋ＧＣＣＧＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡ＊＊＊＊＊＊ＣＴＧＡＧＣＴＡＡＡＴＣＣＣＣＡＡ
ＣＣＣ−−−−−−−−−−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＧＡＧＴＡＡＣＴＡＴＡＡＣＧＧＴＣＣＴ＊＊＊＊＊＊ＧＣ
ＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＧＧＡＡＴＣ−−−−−−−−−−−−−ＡＣＣＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴＡＡＣ
ＣＧＴＣＧＧＡＣ＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＡＧＧＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＧＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ > Zzb21106i09t3. scf 569 (monomer)
CATTAGGGGATTGGGCCC ++++++++++++ GTACCTCCTCGCATCCCCGC
****** ACTTCTCGACACGCACACCAC --------- ++++++++ ATGG
ACCGAGGGCCCCAGCC ++++++++ CGGATCCGGGTGGGTCGGAC **
*** ACGAACTGCTGGCGACCCTCT ------------ CACAGCGCCCGCTCTC
CGGAGA ------------ CTCGGAGCTCGCAAAGTCT -----------
-TCCGGCCGCTGCGGCAGCTCCC ------------ GCGACCAGGTCCGACG
GTGT ------------- GACTCTGGGCGAGAACGTCT ---------- ++++
++++++++ GCCGTTCCCTGCCTGCTGGA ******* CTGAGCTAAATCCCCAA
CCC ---------- ++++++++++++ GAGTAACTATAACGGTCCT ****** GC
GAGCTCCAGGGCGAATC ------------- ACCCCGGGGGGCGGGACTAAC
CGTCGGAC ++++++++++++++ AGGGACCGCTGCGGGTCCGXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXN

リンカー１ １９ ３１
リンカー２ ７７ ８９ Ｃ
リンカー３ ８４ ９６
リンカー４ １１７ １２９
リンカー５ １７４ １８６ Ｃ
リンカー６ ２０７ ２１９ Ｃ
リンカー７ ２３９ ２５１ Ｃ
リンカー８ ２７２ ２８４ Ｃ
リンカー９ ３０５ ３１７ Ｃ
リンカー１０ ３３８ ３５０ Ｃ
リンカー１１ ３４５ ３５７
リンカー１２ ４０４ ４１６ Ｃ
リンカー１３ ４１１ ４２３
リンカー１４ ４６８ ４８０ Ｃ
リンカー１５ ５０９ ５２１ Linker 1 19 31
Linker 2 77 89 C
Linker 3 84 96
Linker 4 117 129
Linker 5 174 186 C
Linker 6 207 219 C
Linker 7 239 251 C
Linker 8 272 284 C
Linker 9 305 317 C
Linker 10 338 350 C
Linker 11 345 357
Linker 12 404 416 C
Linker 13 411 423
Linker 14 468 480 C
Linker 15 509 521

タグ１ Ｆ １９ ＧＴＡＣＣＴＣＣＴＣＧＣＡＴＣＣＣＧＣ（配列番号４３）
タグ２ Ｒ ２０ ＧＴＧＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＣＧＡＡＧＧＴ（配列番号４４）
タグ３ Ｆ ２０ ＡＴＧＧＡＣＣＧＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣ（配列番号４５）
タグ４ Ｆ １９ ＣＧＧＡＴＣＧＧＧＴＧＧＧＴＣＧＧＡＣ（配列番号４６）
タグ５ Ｒ １９ ＡＧＡＧＧＴＣＧＣＡＧＣＡＧＴＴＣＧＴ（配列番号４７）
タグ６ Ｒ ２０ ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＴＧ（配列番号４８）
タグ７ Ｒ １９ ＡＧＡＣＴＴＴＧＣＡＧＧＣＴＣＣＧＡＧ（配列番号４９）
タグ８ Ｒ ２０ ＧＧＡＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＧＧＡ（配列番号５０）
タグ９ Ｒ ２０ ＡＣＡＣＣＧＴＣＧＧＡＣＣＴＧＧＴＣＧＣ（配列番号５１）
タグ１０ Ｒ ２０ ＡＧＡＣＧＴＴＣＴＣＧＣＣＣＡＧＡＧＴＣ（配列番号５２）
タグ１１ Ｆ ２０ ＧＣＣＧＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡ（配列番号５３）
タグ１２ Ｒ ２０ ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＡＴＴＴＡＧＣＴＣＡＧ（配列番号５４）
タグ１３ Ｆ １９ ＧＡＧＴＡＡＣＴＡＴＡＡＣＧＧＴＣＣＴ（配列番号５５）
タグ１４ Ｒ １９ ＧＡＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＣＧＣ（配列番号５６）
タグ１５ Ｆ １８ ＡＧＧＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＧ（配列番号５７）
ｚｚｂ２１１０６ｉ０９ｔ３ジャンク１８ ＣＡＴＴＡＧＧＧＧＡＴＴＧＧＧＣＣＣ（配列番号５８）
ｚｚｂ２１１０６ｉ０９ｔ３ジャンク２８ ＡＣＣＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴＡＡＣＣＧＴＣＧＧＡＣ（配列番号５９）
ｚｚｂ２１１０６ｉ０９ｔ３ジャンク１ Ｎ Tag 1 F 19 GTACCTCCCTCGCATCCCCGC (SEQ ID NO: 43)
Tag 2 R 20 GTGGTGTGCGTGTCGAAGGT (SEQ ID NO: 44)
Tag 3 F 20 ATGGACCGAGGGCCCAGCC (SEQ ID NO: 45)
Tag 4 F 19 CGGATCGGGTGGGTCGGAC (SEQ ID NO: 46)
Tag 5 R 19 AGAGTGCGCAGCAGTTCGT (SEQ ID NO: 47)
Tag 6 R 20 TCTCCGGAGCCGCGCGTGTG (SEQ ID NO: 48)
Tag 7 R 19 AGACTTTGCAGGCTCCGAG (SEQ ID NO: 49)
Tag 8 R 20 GGAGCTGCCGCAGCGCCGGA (SEQ ID NO: 50)
Tag 9 R 20 ACACCGTCGGACCTGGTGCC (SEQ ID NO: 51)
Tag 10 R 20 AGAGTTCTCGCCCAGAGTC (SEQ ID NO: 52)
Tag 11 F 20 GCCGTTCCCTGCCTGCTGGA (SEQ ID NO: 53)
Tag 12 R 20 GGGTTGGGGATTTAGGCTCAG (SEQ ID NO: 54)
Tag 13 F 19 GAGTAACTATAACGGTCCT (SEQ ID NO: 55)
Tag 14 R 19 GATTCCGCCCTGGAGCTCGC (SEQ ID NO: 56)
Tag 15 F 18 AGGGACCGCTGCGTCCG (SEQ ID NO: 57)
zzb21106i09t3 junk 18 CATTAGGGGATTGGGCCC (SEQ ID NO: 58)
zzb21106i09t3 junk 28 ACCCGGGGGGCGGGACTAACCGTCGGAC (SEQ ID NO: 59)
zzb21106i09t3 junk 1 N

上記実施例と同様に、下記の配列例は、実施例３にしたがって調製したコンカテマーに由来し、上記と同一のソフトウェアソリューションによって分析する。   Similar to the above examples, the following sequence examples are derived from concatamers prepared according to Example 3 and analyzed by the same software solution as described above.

＞ｚｚｃ２０４０１ｃ１１ｔ３ ６０７（二量体）
ＴＧＡＴＡＡＧＧＣＡＡＴＧＧＣＣＴＣＴＡＡＴＧＣＴＧＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＧＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣ−−−−−−−−−−＋＋＋＋＋＋＋＋
＋＋ＧＡＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣ＊＊＊＊＊＊ＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ−−
−−−−−−−−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＣＡＧＡＧＣＣＴ＊＊＊＊＊＊ＧＴＣＴＧＴ
ＣＡＧＡＡＴＣＡＧＡＡＧＴ−−−−−−−−−−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＧＣＴＴＴＧＣＡＧＡＣＧＣＣＡＣＴ
ＧＴ＊＊＊＊＊＊ＡＡＡＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＴＴＣＣ−−−−−−−−−−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＣＣ
ＴＧＣＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣ＊＊＊＊＊＊ＡＡＣＴＣＴＧＴＴＡＴＡＣＡＣＴＡＡＣ−−−−−−−−
−−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＡＧＡＧＡＣＴＧＡＡＣＡＧＣＧＧＧＣＧＡ＊＊＊＊＊＊ＣＡＧＣＣＡＴＣＴＴＧＣ
ＣＣＣＡＣＣＴ−−−−−−−−−−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＧＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＣ＊＊＊
＊＊＊ＣＣＣＣＣＣＴＣＴＡＴＧＣＧＴＧＣＧＴＣ−−−−−−−−−−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＡＧＴＧＴＧＧ
ＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧＧＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＧ > Zzc20401c11t3 607 (dimer)
TGATAAGGCAATGGCTCTCATAATGCTGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXGCCGCCGCGCGCTTCCGCGTC ---------- ++++++++++
++ GAGGGCCGCCCGCCCGCCCTC ****** TTGTTTTTTG--
-------- ++++++++++++ GGGCAGAGCGAGCAGAGCCT ****** CTGTGT
CAGAATCAGAAGT --------- ++++++++++++ GCTTTGCAGACGCCACT
GT ****** AAAATCTCACCTGGGACTTTCC --------- ++++++++++ CC
TGCGCGGCCCTGCGCGGC ****** AACTCTGTTATACACTACAC --------
−− ++++++++++++ AGAGACTGAACAGCGGGGCGA **** CAGCCATCTTGC
CCCCACCT --------- ++++++++++ GCTTGCCCTCTCGCGCCATGCCC ***
*** CCCCCCCTCTATGCGTCGCGTC --------- ++++++++++ AGTGTGGG
CGTTCTCGGGNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXG

リンカー１ ８３−１０２ １−２０
リンカー２ １４９−１６８ １−２０
リンカー３ ２１４−２３３ １−２０
リンカー４ ２７９−２９８ １−２０
リンカー５ ３４３−３６２ １−２０
リンカー６ ４０８−４２７ ２０−１ Ｃ
リンカー７ ４７４−４９３ ２０−１ Ｃ
タグ１ ２０ ＧＡＣＧＣＧＧＡＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣ（配列番号６０）
タグ２ ２１ ＧＧＡＧＧＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＣ（配列番号６１）
タグ３ １９ ＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴ（配列番号６２）
タグ４ ２０ ＡＧＧＣＴＣＴＧＣＴＣＧＣＴＣＴＧＣＣＣ（配列番号６３）
タグ５ １９ ＡＣＴＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＡＣＡＧＡＣ（配列番号６４）
タグ６ １９ ＡＣＡＧＴＧＧＣＧＴＣＴＧＣＡＡＡＧＣ（配列番号６５）
タグ７ ２０ ＧＧＡＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＡＣＴＴＴ（配列番号６６）
タグ８ １９ ＧＣＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧＧ（配列番号６７）
タグ９ １９ ＧＴＴＡＧＴＧＴＡＴＡＡＣＡＧＡＧＴＴ（配列番号６８）
タグ１０ ２０ ＴＣＧＣＣＣＧＣＴＧＴＴＣＡＧＴＣＴＣＴ（配列番号６９）
タグ１１ １９ ＡＧＧＴＧＧＧＧＣＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧ（配列番号７０）
タグ１２ ２０ ＧＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣＡＡＧＣ（配列番号７１）
タグ１３ ２０ ＧＡＣＧＣＡＣＧＣＡＴＡＧＡＧＧＧＧＧＧ（配列番号７２）
タグ１４ １９ ＮＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＣＴ（配列番号７３）
ジャンク１ ２６ ＴＧＡＴＡＡＧＧＣＡＡＴＧＧＣＣＴＣＴＡＡＴＧＣＴＧ（配列番号７４）
ジャンク２ １ Ｇ Linker 1 83-102 1-20
Linker 2 149-168 1-20
Linker 3 214-233 1-20
Linker 4 279-298 1-20
Linker 5 343-362 1-20
Linker 6 408-427 20-1 C
Linker 7 474-493 20-1 C
Tag 1 20 GACGCGGAAGGCCGCGCGGC (SEQ ID NO: 60)
Tag 2 21 GGAGGGCGGGCGGCGCCCTC (SEQ ID NO: 61)
Tag 3 19 CAAAAAAAAAAAAAAAACT (SEQ ID NO: 62)
Tag 4 20 AGGCTCTGCCTCGCTCTGCCC (SEQ ID NO: 63)
Tag 5 19 ACTTCTGATTCTGACAGAC (SEQ ID NO: 64)
Tag 6 19 ACAGTGGGCGTCGCAAAGC (SEQ ID NO: 65)
Tag 7 20 GGAAAGTCCCAGGTGGACTTT (SEQ ID NO: 66)
Tag 8 19 GCCGCCGAGGGCCGCGAGGG (SEQ ID NO: 67)
Tag 9 19 GTTAGTGTATAACAGAGTT (SEQ ID NO: 68)
Tag 10 20 TCGCCCGCTGTTCAGTCCTCT (SEQ ID NO: 69)
Tag 11 19 AGGTGGGGCAAGATGGCTG (SEQ ID NO: 70)
Tag 12 20 GGCATGGCCAGAAAGCAAGC (SEQ ID NO: 71)
Tag 13 20 GACGCACGCATAGAGGGGGGG (SEQ ID NO: 72)
Tag 14 19 NCCATGGAACAGCCACACT (SEQ ID NO: 73)
Junk 1 26 TGATAAGGCAATGGCTCTCATAATGCTG (SEQ ID NO: 74)
Junk 2 1 G

両実施例では、ＭｍｅＩはいくらかの頻度でより短いＤＮＡフラグメントに切断するので、読み取られた配列の５’末端特異的タグの長さは異なることに留意のこと。５’末端特異的タグの統計分析により、実施例において、約４５％のタグの長さが２１ｂｐであり、さらに４４％のタグの長さが２０ｂｐであることが示された。クラスＩＩＳ酵素ＧｓｕＩの使用についても、配列の長さにいくらかばらつきが認められるが、約９２％で１６ｂｐのＤＮＡフラグメントが得られた。   Note that in both examples, the length of the 5 'end-specific tag of the read sequence is different because MmeI cuts into shorter DNA fragments with some frequency. Statistical analysis of 5 'end-specific tags showed that in the examples, about 45% of tag length was 21 bp and another 44% of tag length was 20 bp. The use of the class IIS enzyme GsuI also showed some variation in sequence length, but a DNA fragment of 16 bp was obtained at about 92%.

＜５’末端配列タグの特徴づけ＞
５’末端特異的配列タグを、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）またはＦＡＳＴＡ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／）のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージで利用可能）などの配列アラインメントを実施するための標準的なソフトウェアソリューションによってその同一性について分析することができる。このようなソフトウェアソリューションにより、相互の５’末端特異的配列タグがアラインメントされ、データベース検索および５’末端配列データベースの構築でさらに使用することができる固有または非重複タグを同定することが可能である。
５’末端配列データベースを使用した遺伝子の同定
５’末端特異的タグを使用したＧｅｎＢａｎｋでのＢＬＡＳＴ検索の一例を以下に示す。１６ｂｐのタグ（５’−ＡＣＣ ＴＣＣ ＣＴＣ ＣＧＣ ＧＧＡ Ｇ）（配列番号７５）は、ヒトＴＧＦ−ｂ１：ＪＢＣ ２６４（１９８９）４０２−４０８の５’末端に由来する。
クエリー＝（１６文字）（ＡＣＣＴＣＣＣＴＣＣＧＣＧＧＡＧ） <Characteristics of 5 'terminal sequence tag>
5 ′ end specific sequence tags can be obtained from NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) or FASTA (Accelrys Inc. (http://www.accelries.com/)) Its identity can be analyzed by standard software solutions for performing sequence alignments (such as available in the Group (GCG) package). Such a software solution allows alignment of mutual 5 ′ end-specific sequence tags to identify unique or non-overlapping tags that can be further used in database searches and construction of 5 ′ end sequence databases. .
Gene Identification Using 5 'End Sequence Database An example of a BLAST search in GenBank using a 5' end specific tag is shown below. The 16 bp tag (5′-ACC TCC CTC CGC GGA G) (SEQ ID NO: 75) is derived from the 5 ′ end of human TGF-b1: JBC 264 (1989) 402-408.
Query = (16 characters) (ACCTCCCCTCCCGGGAG)

＜ゲノムへの５’末端特異的タグのマッピング＞
本実施例に記載の５’末端特異的配列タグを使用して、部分的配列または全配列が得られたゲノム内の転写流域を同定することができる。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）のような標準的なソフトウェアソリューションを使用してこのような検索を実施して、ゲノム配列に対して５’末端特異的配列タグを整列させることができる。ヒト、ラット、またはマウスのような巨大ゲノムの場合、コンカテマーから得られた最初の配列情報を拡大する必要があり得る。拡大配列の使用により、ゲノム中の能動的に転写された領域をより正確に同定可能である。 <Mapping of 5 'end-specific tags to the genome>
The 5 ′ end specific sequence tag described in this example can be used to identify a transcriptional basin in the genome from which a partial or full sequence was obtained. Such searches are performed using standard software solutions such as NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) to identify 5 ′ end specific genomic sequences. Target sequence tags can be aligned. For large genomes such as human, rat, or mouse, it may be necessary to expand the initial sequence information obtained from the concatamers. The use of extended sequences can more accurately identify actively transcribed regions in the genome.

別の例では、実施例１および３で調製したコンカテマー由来の５’末端タグを、マウスゲノムへのマッピングによってさらに分析した。この例では、５’末端タグのライブラリーを、実施例１の成体マウスの全脳および実施例３のマウス由来の１７．５日間の胚全体から調製した。タグ配列を、実施例５に記載のコンピュータ手段によって配列の読出しから得た。配列タグを、少なくとも１８ｂｐ適合の閾値およびミスマッチまたはギャップのペナルティを使用してマウスゲノムにマッピングした。結果をまとめた表を以下に示した。   In another example, the 5 'end tag from the concatamer prepared in Examples 1 and 3 was further analyzed by mapping to the mouse genome. In this example, a library of 5 'end tags was prepared from whole brains of adult mice of Example 1 and 17.5 days of whole embryos from mice of Example 3. The tag sequence was obtained from reading the sequence by computer means as described in Example 5. Sequence tags were mapped to the mouse genome using a threshold of at least 18 bp match and a mismatch or gap penalty. A table summarizing the results is shown below.

遺伝子を識別するための統計分析および比較により、約８９％の部位が最も可能性が高い転写部位であることが示された。

Statistical analysis and comparison to identify genes showed that about 89% of the sites are the most likely transcription sites.

＜５’末端配列タグの統計分析＞
サンプル中の複数の同一のｍＲＮＡから得た５’末端配列タグまたは同一のｃＤＮＡライブラリー内の核酸フラグメントを、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）のような標準的なソフトウェアソリューションによって分析して、実施例５に記載の非重複配列タグを同定することができる。次いで、全てのこのような非重複配列タグをそれぞれ計数し、各非重複タグの同一サンプルから得た全タグの総数への寄与についてさらに分析することができる。各タグの全タグの総数への寄与により、サンプルまたはｃＤＮＡライブラリー中の複数のｍＲＮＡ中の転写物を定量可能なはずである。各サンプルについてこのような方法で得られた結果を、その発現パターンを比較するために、他のサンプルから得た類似のデータとさらに比較することができる。 <Statistical analysis of 5 'terminal sequence tag>
A 5 ′ terminal sequence tag obtained from multiple identical mRNAs in a sample or a nucleic acid fragment in the same cDNA library can be expressed as NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) Can be analyzed by standard software solutions to identify the non-overlapping sequence tags described in Example 5. All such non-overlapping sequence tags can then be counted individually and further analyzed for the contribution of each non-overlapping tag to the total number of all tags from the same sample. The contribution of each tag to the total number of all tags should be able to quantify transcripts in multiple mRNAs in a sample or cDNA library. Results obtained in this way for each sample can be further compared with similar data from other samples to compare their expression patterns.

＜転写開始部位の同定＞
ゲノム配列にマッピングすることができる５’末端特異的配列タグにより、調節配列を同定可能である。遺伝子では、転写領域の５’末端のＤＮＡ上流は、通常、遺伝子発現の調節で使用されるほとんどの調節エレメントを含む。これらの調節配列を、転写因子の結合部位に関する情報を保持するデータベースでの検索によってその機能性についてさらに分析することができる。転写因子結合部位およびプロモーター分析に関する公的に利用可能なデータベースには、以下が含まれる。
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｒｅｇｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＴＲＲＤ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｍｇｓ．ｂｉｏｎｅｔ．ｎｓｃ．ｒｕ／ｍｇｓ／ｄｂａｓｅｓ／ｔｒｒｄ４／）
ＴＲＡＮＳＦＡＣ（ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ／ＴＲＡＮＳＦＡＣ／）
ＴＦＳＥＡＲＣＨ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｄｂ／ＴＦＳＥＡＲＣＨ．ｈｔｍｌ）
Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ Ｓｏｆｔｗａｒｅが提供するＰｒｏｍｏｔｅｒＩｎｓｐｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅ／）。 <Identification of transcription start site>
Regulatory sequences can be identified by 5 ′ end-specific sequence tags that can be mapped to genomic sequences. For genes, the DNA upstream of the 5 ′ end of the transcription region usually contains most of the regulatory elements used in the regulation of gene expression. These regulatory sequences can be further analyzed for their functionality by searching in a database that holds information about transcription factor binding sites. Publicly available databases for transcription factor binding sites and promoter analysis include:
TRANSCRIPTION REGULATION REGION DATABASE (TRRD) (http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/dbasees/trrd4/)
TRANSFAC (http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/)
TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)
PromoterInspector (http://www.genomicix.de/) provided by Genomatics Software.

＜５’末端配列タグ由来の情報を使用した全長ｃＤＮＡのクローニング＞
コンカテマー由来配列情報を使用して、全長ｃＤＮＡクローニングのための特異的プライマーを合成することができる。このようなアプローチでは、所与の５’末端特異的タグ由来の配列を使用して正方向プライマーをデザインすることができるが、逆方向プライマーの選択は増幅反応で使用したテンプレートＤＮＡに依存する。生体サンプルから得た複数のＲＮＡ由来のテンプレートおよびオリゴｄＴプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を行うことができる。第１のステップでは、オリゴｄＴプライマーおよび逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡプールを合成する。第２のステップでは、５’末端特異的タグ由来の正方向プライマーおよびオリゴｄＴプライマーを使用して、ｃＤＮＡプールから全長ｃＤＮＡを増幅することができる。同様に、５’末端タグ由来の正方向プライマーおよびベクターネスト化逆方向プライマーを使用して、既存のｃＤＮＡライブラリーから特異的全長ｃＤＮＡを増幅することができる。 <Cloning of full-length cDNA using information derived from 5 ′ terminal sequence tag>
Concatemer-derived sequence information can be used to synthesize specific primers for full-length cDNA cloning. In such an approach, the forward primer can be designed using sequences from a given 5 ′ end specific tag, but the selection of the reverse primer depends on the template DNA used in the amplification reaction. Amplification by polymerase chain reaction (PCR) can be performed using a plurality of RNA-derived templates and oligo dT primers obtained from a biological sample. In the first step, cDNA pools are synthesized using oligo dT primers and reverse transcriptase. In the second step, full length cDNA can be amplified from the cDNA pool using forward and oligo dT primers derived from a 5 ′ end specific tag. Similarly, specific full-length cDNAs can be amplified from existing cDNA libraries using forward primers derived from the 5 ′ end tag and vector nested reverse primers.

＜ｃＤＮＡライブラリー由来の５’末端タグの別のクローニングアプローチ＞
インサートの５’末端にクラスＩＩＳエンドヌクレアーゼの認識部位を有する既存のｃＤＮＡライブラリーから複数のｃＤＮＡを増幅することができる。このようなライブラリー由来のＰＣＲ産物を、本明細書中の実施例に記載のようにさらに処理する。 <Another cloning approach for 5 'end tag from cDNA library>
Multiple cDNAs can be amplified from an existing cDNA library having a class IIS endonuclease recognition site at the 5 'end of the insert. PCR products from such libraries are further processed as described in the examples herein.

＜キャップ構造のクラスＩＩｓ認識部位を有するオリゴヌクレオチドへの置換による５’末端のクローニング＞
実施例１〜３に記載のように、最初の転写物の５’末端を含むｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを得ることができる。次いで、このようなｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中のキャップ構造を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼまたはタバコ酸性ピロホスファターゼなどの加水分解酵素によって酵素的に除去する。次いで、クラスＩＩｓ認識部位を有する一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを、脱キャップｍＲＮＡの５’末端に存在するリン酸基でＴ４ ＲＮＡリガーゼによってＲＮＡにライゲーションする。ライゲーションされたオリゴヌクレオチドは、実施例１〜３に記載の手順に従った第２の鎖合成のためのプライマーとして機能する。本明細書中に記載のように、ライゲーションステップにおける修飾オリゴヌクレオチドの使用により、二本鎖ｃＤＮＡを支持体に結合させ、コンカテマーのクローニングに使用することができる。 <Cloning of 5′-end by substitution with oligonucleotide having cap structure class IIs recognition site>
As described in Examples 1-3, cDNA / RNA hybrids containing the 5 'end of the initial transcript can be obtained. The cap structure in such a cDNA / RNA hybrid is then enzymatically removed by a hydrolase such as T4 polynucleotide kinase or tobacco acid pyrophosphatase. Single or double stranded oligonucleotides with class IIs recognition sites are then ligated to RNA by T4 RNA ligase with a phosphate group present at the 5 ′ end of the decapped mRNA. The ligated oligonucleotide functions as a primer for second strand synthesis according to the procedure described in Examples 1-3. As described herein, the use of modified oligonucleotides in the ligation step allows double stranded cDNA to be bound to a support and used for concatamer cloning.

＜サンプルの増幅ステップ＞
本発明でサンプル量が制限される場合、サンプル材料を、以下のアプローチによって増幅することができる。第１のステップでは、複数のｍＲＮＡを実施例１１に記載のように処理して、キャップ構造をクラスＩＩｓ認識部位を有する適切なオリゴヌクレオチドに置換する。第２のステップでは、リンカーに相補的なプライマーおよびｐｏｌｙ−Ａプライマーを使用したＰＣＲステップによって上記テンプレートを増幅する。実施例１に記載のように、本発明のためにＰＣＲ産物を使用することができる。 <Sample amplification step>
If the sample volume is limited in the present invention, the sample material can be amplified by the following approach. In the first step, multiple mRNAs are processed as described in Example 11 to replace the cap structure with an appropriate oligonucleotide having a class IIs recognition site. In the second step, the template is amplified by a PCR step using a primer complementary to the linker and a poly-A primer. As described in Example 1, PCR products can be used for the present invention.

＜拡大した５’末端配列の使用＞
コンカテマーのために得た最初の５’末端配列を使用して、配列決定プライマーを合成し、転写領域の５’末端に関する拡大した配列情報を得ることができる。 <Use of expanded 5 'terminal sequence>
Using the initial 5 ′ end sequence obtained for the concatemer, sequencing primers can be synthesized to obtain expanded sequence information about the 5 ′ end of the transcribed region.

＜遺伝子の不活化＞
５’末端特異的配列タグから得た配列情報を、ノックダウン研究に適用することができるアンチセンスプローブまたはＲＮＡｉのデザインに使用することができる。 <Inactivation of genes>
Sequence information obtained from 5 ′ end specific sequence tags can be used in the design of antisense probes or RNAi that can be applied to knockdown studies.

参考文献

References

実施例に記載の手順にしたがった本発明の作業原理の流れの例を示す図である。It is a figure which shows the example of the flow of the working principle of this invention according to the procedure as described in an Example. コンカテマーへの５’末端特異的タグのクローニングのための本発明の作業原理の流れの例を示す図である。FIG. 4 shows an example of the working principle flow of the present invention for cloning of 5 'end-specific tags into concatamers. ５’末端タグの直接配列決定の別アプローチを例示するための本発明の作業原理の流れを示す図である。FIG. 5 shows the working principle flow of the present invention to illustrate another approach for direct sequencing of 5 'end tags. ５’末端特異的タグのクローニングのための第１のリンカーのライゲーションの例を示す図である。例は、実施例１〜３に記載のプロトコールにしたがって使用したリンカーを示す。FIG. 6 shows an example of ligation of a first linker for cloning of a 5 ′ end specific tag. The examples show the linker used according to the protocol described in Examples 1-3. ５’末端特異的タグのクローニングのための第２のリンカーのライゲーションの例を示す図である。例は、実施例１〜３に記載のプロトコールにしたがって使用したリンカーを示す。FIG. 6 shows an example of ligation of a second linker for cloning of a 5 ′ end specific tag. The examples show the linker used according to the protocol described in Examples 1-3. 実施例１〜３にしたがって調製した５’末端タグ二量体の構造を示す例を示す図である。実施例１にしたがって調製したコンカテマーの場合、ＸｍａＪＩおよびＸｂａＩが消化後に再度組み合わせることができる同一の突出末端を作製するので、異なるリンカー部位を見出すことができる。このようなコンカテマーの１つの例を、図に示す。It is a figure which shows the example which shows the structure of the 5 'terminal tag dimer prepared according to Examples 1-3. In the case of concatamers prepared according to Example 1, different linker sites can be found because XmaJI and XbaI create identical overhangs that can be recombined after digestion. One example of such a concatamer is shown in the figure.

配列表Sequence listing

Claims (33)

ｍＲＮＡの５’末端領域のヌクレオチド配列に対応するＤＮＡフラグメントを調製する方法であって、
（ａ）ｍＲＮＡの５’末端のヌクレオチド配列に対応する核酸を調製するステップと、
（ｂ）前記核酸のうちの、ｍＲＮＡの５’末端領域のヌクレオチド配列に対応する末端領域に少なくとも１つのリンカーを結合するステップと、
（ｃ）リンカー内に認識部位を有し、かつｍＲＮＡの５’末端に対応する核酸内に切断部位を有する制限酵素により前記核酸を切断するステップと、
（ｄ）得られたｍＲＮＡの５’末端に対応するＤＮＡフラグメントを回収するステップと
を含む、方法。A method for preparing a DNA fragment corresponding to the nucleotide sequence of the 5 ′ end region of mRNA comprising:
(A) preparing a nucleic acid corresponding to the nucleotide sequence at the 5 ′ end of the mRNA;
(B) linking at least one linker to a terminal region corresponding to the nucleotide sequence of the 5 ′ terminal region of mRNA among the nucleic acids;
(C) cleaving the nucleic acid with a restriction enzyme having a recognition site in the linker and having a cleavage site in the nucleic acid corresponding to the 5 ′ end of the mRNA;
(D) recovering a DNA fragment corresponding to the 5 ′ end of the obtained mRNA. 前記ＤＮＡフラグメントの長さが５〜１００ｂｐである、請求項１に記載の方法。  The method according to claim 1, wherein the length of the DNA fragment is 5 to 100 bp. 前記ＤＮＡフラグメントの長さが１５〜３０ｂｐである、請求項１に記載の方法。  The method according to claim 1, wherein the length of the DNA fragment is 15 to 30 bp. 前記ＤＮＡフラグメントの長さが１０〜３０ｂｐである、請求項１に記載の方法。  The method according to claim 1, wherein the length of the DNA fragment is 10 to 30 bp. 前記ステップ（ａ）の核酸が、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、および全長ｃＤＮＡからなる群から選択される核酸に由来する、請求項１に記載の方法。  The method of claim 1, wherein the nucleic acid of step (a) is derived from a nucleic acid selected from the group consisting of total RNA, mRNA, and full-length cDNA. 前記ステップ（ａ）が、
ｍＲＮＡの５’キャップ構造をオリゴヌクレオチドに置換することと、
テンプレートとして前記ｍＲＮＡを使用して第１のｃＤＮＡ鎖を合成して前記ｍＲＮＡの５’末端に対応する核酸を産生することと
を含む、請求項１に記載の方法。Step (a)
replacing the 5 ′ cap structure of the mRNA with an oligonucleotide;
The method of claim 1, comprising synthesizing a first cDNA strand using the mRNA as a template to produce a nucleic acid corresponding to the 5 ′ end of the mRNA. ｍＲＮＡの５’末端領域のヌクレオチド配列に対応するＤＮＡフラグメントを調製する方法であって、
（ａ）ｍＲＮＡのキャップ構造をオリゴヌクレオチドに置換するステップと、ここで、前記オリゴヌクレオチドが制限酵素認識部位を含み、前記制限酵素の切断部位がｍＲＮＡの５’末端に対応する核酸内に存在する、
（ｂ）テンプレートとして前記ｍＲＮＡを使用して第１のｃＤＮＡ鎖を合成するステップと、
（ｃ）テンプレートとして前記第１のｃＤＮＡ鎖を使用して第２のｃＤＮＡ鎖を合成するステップと、
（ｄ）得られた二本鎖ｃＤＮＡを前記制限酵素により切断するステップと、
（ｅ）ｍＲＮＡの５’末端に対応する、得られたＤＮＡフラグメントを回収するステップと
を含む、方法。A method for preparing a DNA fragment corresponding to the nucleotide sequence of the 5 ′ end region of mRNA comprising:
(A) replacing the cap structure of mRNA with an oligonucleotide, wherein the oligonucleotide contains a restriction enzyme recognition site, and the restriction enzyme cleavage site is present in the nucleic acid corresponding to the 5 ′ end of the mRNA ,
(B) synthesizing a first cDNA strand using the mRNA as a template;
(C) synthesizing a second cDNA strand using the first cDNA strand as a template;
(D) cleaving the obtained double-stranded cDNA with the restriction enzyme;
(E) recovering the resulting DNA fragment corresponding to the 5 ′ end of the mRNA. 前記ステップ（ａ）の核酸が、生体サンプル、インビトロ合成ＲＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、人為的に作製した複数の核酸、またはタグライブラリーに由来する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。  The nucleic acid of said step (a) is derived from a biological sample, an in vitro synthetic RNA, a cDNA library, a plurality of artificially prepared nucleic acids, or a tag library. Method. 前記ステップ（ａ）が、
テンプレートとしてＲＮＡを使用して第１のｃＤＮＡ鎖を合成し、得られた第１のｃＤＮＡ鎖およびＲＮＡのｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを産生することと、
５’キャップ構造を特異的に認識する選択的結合物質を使用してｍＲＮＡの５’キャップ構造を有する特定のｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを選択することと、
前記ｍＲＮＡの５’末端に対応する核酸を回収することと
を含む、請求項１に記載の方法。Step (a)
Synthesizing a first cDNA strand using RNA as a template to produce a resulting first cDNA strand and a cDNA / RNA hybrid of RNA;
Selecting a specific cDNA / RNA hybrid having a 5 ′ cap structure of mRNA using a selective binding agent that specifically recognizes the 5 ′ cap structure;
Collecting the nucleic acid corresponding to the 5 'end of the mRNA. 前記ステップ（ａ）で調製した核酸が全長ｃＤＮＡであり、前記選択的結合物質が支持体に結合している、請求項９に記載の方法。  The method according to claim 9, wherein the nucleic acid prepared in the step (a) is a full-length cDNA, and the selective binding substance is bound to a support. 前記ステップ（ａ）が、
テンプレートとしてＲＮＡを使用して第１のｃＤＮＡ鎖を合成し、得られた第１のｃＤＮＡ鎖およびＲＮＡのｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを産生することと、
前記ｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドからｍＲＮＡの５’末端領域に対応する核酸を回収することと
を含む、請求項１に記載の方法。Step (a)
Synthesizing a first cDNA strand using RNA as a template to produce a resulting first cDNA strand and a cDNA / RNA hybrid of RNA;
Recovering the nucleic acid corresponding to the 5 'end region of the mRNA from the cDNA / RNA hybrid. 前記ステップ（ａ）が、
テンプレートとしてＲＮＡを使用して第１のｃＤＮＡ鎖を合成し、得られた第１のｃＤＮＡ鎖およびＲＮＡのｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを産生することと、
前記ＲＮＡ中に存在するｍＲＮＡの５’キャップ構造に対する選択的結合物質をコンジュゲートすることと、
前記ｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを支持体に接触させることと、ここで、もう一つのマッチする選択的結合物質を前記支持体に固定し、前記マッチする選択的結合物質が前記選択的結合物質と特異的に結合する、
前記支持体に固定したｍＲＮＡから前記ｍＲＮＡの５’末端に対応する核酸を回収することと
を含む、請求項１に記載の方法。Step (a)
Synthesizing a first cDNA strand using RNA as a template to produce a resulting first cDNA strand and a cDNA / RNA hybrid of RNA;
Conjugating a selective binding agent to the 5 ′ cap structure of mRNA present in the RNA;
Contacting the cDNA / RNA hybrid with a support, wherein another matching selective binding substance is immobilized on the support, and the matching selective binding substance is specific to the selective binding substance. To join,
The method according to claim 1, comprising recovering a nucleic acid corresponding to the 5 ′ end of the mRNA from mRNA immobilized on the support. 前記選択的結合物質がキャップ結合タンパク質またはキャップ結合抗体である、請求項９または１０に記載の方法。  11. The method according to claim 9 or 10, wherein the selective binding substance is a cap binding protein or a cap binding antibody. 前記選択的結合物質がビオチンであり、前記マッチする選択的結合物質が、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンに特異的に結合するそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。  13. The method of claim 12, wherein the selective binding agent is biotin and the matching selective binding agent is selected from the group consisting of avidin, streptavidin, and derivatives thereof that specifically bind to biotin. . 前記選択的結合物質がジゴキシゲニンであり、前記マッチする選択的結合物質がジゴキシゲニンに対する抗体である、請求項１２に記載の方法。  13. The method of claim 12, wherein the selective binding agent is digoxigenin and the matching selective binding agent is an antibody against digoxigenin. 前記支持体が、磁性ビーズ、アガロースビーズ、ラテックスビーズ、セファロースマトリクス、シリカゲルマトリクス、またはガラスビーズ製である、請求項１０または１２に記載の方法。  13. A method according to claim 10 or 12, wherein the support is made of magnetic beads, agarose beads, latex beads, sepharose matrix, silica gel matrix, or glass beads. 前記ステップ（ｂ）が、
ｍＲＮＡの５’末端領域のヌクレオチド配列に対応する末端領域にリンカーを結合することと、ここで、前記リンカーが認識配列とは異なる部位を切断する制限酵素に関する少なくとも１つの制限酵素認識部位を保有する、
テンプレートとして前記核酸を使用して第２のｃＤＮＡ鎖を合成することと、
得られたリンカー結合二本鎖ｃＤＮＡを前記制限酵素により処理することと、
リンカー部分と、前記ｍＲＮＡの５’末端領域に対応するｃＤＮＡの一部とを含む得られたフラグメントを回収することと
を含む、請求項１に記載の方法。Step (b)
linking a linker to a terminal region corresponding to the nucleotide sequence of the 5 ′ terminal region of mRNA, wherein said linker possesses at least one restriction enzyme recognition site for a restriction enzyme that cleaves a site different from the recognition sequence ,
Synthesizing a second cDNA strand using the nucleic acid as a template;
Treating the resulting linker-bound double-stranded cDNA with the restriction enzyme;
The method of claim 1, comprising recovering the resulting fragment comprising a linker moiety and a portion of the cDNA corresponding to the 5 ′ end region of the mRNA. 前記リンカーが二本鎖オリゴヌクレオチド領域を含み、前記リンカーを使用して第２のｃＤＮＡ鎖を合成する、請求項１７に記載の方法。  18. The method of claim 17, wherein the linker comprises a double stranded oligonucleotide region and the linker is used to synthesize a second cDNA strand. 前記第２のｃＤＮＡ鎖を前記リンカーと部分的または全てが相補的な他のオリゴヌクレオチドを使用して合成する、請求項１７に記載の方法。  18. The method of claim 17, wherein the second cDNA strand is synthesized using other oligonucleotides that are partially or fully complementary to the linker. 前記選択的結合物質が前記リンカーに結合しているか前記リンカー中に含まれ、前記回収ステップが選択的結合物質を支持体上に固定されたマッチする選択的結合物質に結合させて前記支持体を回収するステップを含み、前記マッチする選択的結合物質が前記選択的結合物質に特異的に結合する、請求項１７に記載の方法。  The selective binding substance is bound to or contained in the linker, and the recovering step binds the selective binding substance to a matching selective binding substance immobilized on a support to bind the support. 18. The method of claim 17, comprising the step of recovering, wherein the matching selective binding agent specifically binds to the selective binding agent. 前記選択的結合物質がビオチンであり、前記マッチする選択的結合物質が、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンに特異的に結合するそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。  21. The method of claim 20, wherein the selective binding agent is biotin and the matching selective binding agent is selected from the group consisting of avidin, streptavidin, and derivatives thereof that specifically bind to biotin. . 前記選択的結合物質がジゴキシゲニンであり、前記マッチする選択的結合物質がジゴキシゲニンに対する抗体である、請求項２０に記載の方法。  21. The method of claim 20, wherein the selective binding agent is digoxigenin and the matching selective binding agent is an antibody against digoxigenin. 前記制限酵素がクラスＩＩまたはクラスＩＩＩ制限酵素である、請求項１７に記載の方法。  18. The method of claim 17, wherein the restriction enzyme is a class II or class III restriction enzyme. 前記制限酵素がクラスＩＩＧまたはクラスＩＩＳ制限酵素である、請求項１７に記載の方法。  18. The method of claim 17, wherein the restriction enzyme is a class IIG or class IIS restriction enzyme. 前記制限酵素が、ＧｓｕＩ、ＭｍｅＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓｇＩ、およびＥｃｏＰ１５Ｉからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。  24. The method of claim 23, wherein the restriction enzyme is selected from the group consisting of GsuI, MmeI, BpmI, BsgI, and EcoP15I. 請求項１に記載の方法によって調製されたＤＮＡフラグメントの配列決定によってｍＲＮＡの５’末端領域のヌクレオチド配列を決定する方法。  A method for determining the nucleotide sequence of the 5 'end region of mRNA by sequencing a DNA fragment prepared by the method of claim 1. ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼのカクテルによって前記ｍＲＮＡの５’末端領域に対応する核酸を増幅するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。  2. The method of claim 1, further comprising amplifying a nucleic acid corresponding to the 5 'end region of the mRNA by DNA polymerase or a cocktail of DNA polymerases. 前記ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性である、請求項２７に記載の方法。  28. The method of claim 27, wherein the DNA polymerase is thermostable. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｏｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＢＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＭａｔｅｒ Ａｍｐ ＡｍｐｌｉＴｈｅｒｍ ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。  28. The DNA polymerase is selected from the group consisting of Taq polymerase, Pwo DNA polymerase, Kod DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, Vent DNA polymerase, Deep Vent DNA polymerase, rBST DNA polymerase, and Mater Amp AmpliTherm DNA polymerase. The method described in 1. 前記第１のｃＤＮＡ鎖を合成し、物理的手段によって分画する、請求項１に記載の方法。  The method of claim 1, wherein the first cDNA strand is synthesized and fractionated by physical means. 前記核酸を複数の核酸へのハイブリッド形成によって分画する、請求項３０に記載の方法。  32. The method of claim 30, wherein the nucleic acid is fractionated by hybridization to a plurality of nucleic acids. 回収された前記核酸をビーズに結合させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。  The method of claim 1, further comprising binding the recovered nucleic acid to beads. 請求項１又は７に記載の方法によって得られた２以上のＤＮＡフラグメントを互いにライゲーションするステップを含む、ｍＲＮＡの５’末端に対応する２以上のＤＮＡフラグメントを含むコンカテマーの調製方法。  A method for preparing a concatamer comprising two or more DNA fragments corresponding to the 5 'end of mRNA, comprising ligating together two or more DNA fragments obtained by the method according to claim 1 or 7.

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