JP4402454B2 - Ｌｎａホスホラミダイトの製造法 - Google Patents

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Description

発明の詳細な説明
（技術分野）
本発明は、大量スケールのＬＮＡホスホラミダイト(phosphoramidite)製造の高収率で速い方法に関する。
（背景技術）
ロックド核酸（ＬＮＡ；locked Nucleic Acid）の単量体およびオリゴヌクレオチドは１９９７年に発明され（WO 09914226）、そしてこのものはアチセンス薬物候補としての有望な結果を示している。しかしながら、該文献中には、ＬＡＮベースのアンチセンス薬物の効率良い製造に必要なＬＮＡアミダイトの最適な収率を与える大量スケールのＬＮＡホスホラミダイト製造のための製造法はない。
オリゴヌクレオチドの製造は典型的に、カルター(Caruthers)ら（米国特許第4415732号（1980年））によって発明され、その２、３年後にケスター(Koster)（米国特許第4725677号）によって改善された、ホスホラミダイト法を用いて行なわれている。ＬＮＡオリゴマーは、該ホスホラミダイト法に従って製造されるが、しかし今までＬＮＡ単量体の大量スケールの供給は、遅い反応、該反応の間の副生成物の生成、および使用されている室温で不安定である試薬に起因する問題を有している。
オリゴヌクレオチド製造におけるホスホラミダイト活性化およびカップリング反応の機構は、詳細に研究されている。通常、テトラゾールが使用されている（Dahlらによる1987, Nucleic Acid Research, 15, 1729-1743; Beaucage & Iverによる1992, Tetrahedron, 48, 2223-2311）。テトラゾールの推定機構は２段階であり、第１にテトラゾールが三価のリンをプロトン化し、続いてＮ,Ｎ−ジイソプロピルアミンを該テトラゾリドによって置換する。この後者の中間体は、核酸上のヒドロキシ求核体（例えば、５'−ＯＨ）と非常に反応性である。従って、テトラゾールは、酸および求核剤の両方として作用する。
バルジーズ(Vargeese)らによる（Vargeese, C.; Carter, J.; Krivjansky, S.; Settle, A.; Kropp, E.; Peterson, K.; Pieken, W.によるNucleic Acid Research, 1998, 26, 1046-1050; W0 9816540）は、オリゴヌクレオチド製造の間の５'−ヒドロキシル基に対するホスホラミダイトのカップリング反応についての活性化剤を記載している。該活性化剤は４,５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）であり、そしてその有効性はその求核性に基づくと考えられる。ＤＣＩはホスホラミダイトのオリゴマー化における収率を有意に増大する、と示されている。
Vargeeseらは、ＤＣＩを用いる少量スケールのＤＮＡホスホラミダイトチミン単量体の製造法を記載しているが、彼らが使用する方法は、該アミダイトの数回の再沈降後に低収率（７５％)を与えている。キタカ(Kittaka)らによる（Kittaka A., Kuze T.; Amano M.; Tanaka H.; Miyasaka T.; Hirose K.; Yoshida T.; Sarai A.; Yasukawa T.およびIshii S.によるNucleosides & Nucleotides 18, 2769-2783, 1999）はまた該アミダイト製造においてＤＣＩを使用しているが、彼らは該生成物のさらに低収率（６５％）を報告している。Kittakaらによる（Kittaka A.; Horii C.; Kuze T.; Asakura T.; Ito K.; Nakamura K. T.; Miyasaka T.およびInoue J.によるSynthetic letters, S1, 869-872, 1999）はまた、ＤＣＩ（０．７当量）を用いる３'−Ｏホスファイト化(phosphitylation)による誘導化ウリジンホスホラミダイトを製造しているが、更に該反応パラメータについては記載されていない。該収率は、９２％であると報告されている。通常、ウラシルおよびチミンのホスファイト化は、これらの核酸塩基は通常該ホスファイト化試薬を妨害しないので、最も高い収率を与える。
従って、ＤＣＩをＬＮＡホスホラミダイト製造についての活性化剤として使用することを記載する文献は全くない。
これまでに報告されているオキシ−β−Ｄ−リボ−ＬＮＡ（図２）の製造法は、２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイトおよびジイソプロピルエチルアミンを使用している（Koshkin, A. A.; Singh, S. K.;Nielsen, P.; Rajwanshi, V. K.; Kumar, R.; Meldgaard, M.; Olsen, C. E.; Wengel, J.によるTet. 1998, 54, 3607-3630）。該報告されている収率は、低い（ＬＮＡ−Ｔが７０％、ＬＮＡ−Ｕが５８％、ＬＮＡ−Ｇが６４％、ＬＮＡ−Ａが７３％およびＬＮＡ−Ｃについては収率なしと、報告されている）。該オキシ−α−Ｌ−リボ−チミンホスホラミダイトを製造するためのこれまでに報告されている方法（図３）はまた、２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイトおよびジイソプロピルエチルアミンを使用しており、そして収率６０％を与えている（Hakansson, A. E.; Koshkin, A. A.; Sorensen M. D.; Wenget J.によるJ. Org. Chem. 2000, 65, 5161-5166）。
（発明の概要）
本発明は、純粋なＬＮＡホスホラミダイトの大量スケール製造のための新規な高収率で且つ速い方法を提供する。ホスホラミダイトであるＬＮＡ単量体の製造において、該ホスファイト化の段階は重要である。必要ならばまた、該ホスホラミダイトの反応性のために、精製の間のそれらの分解を避ける目的で、容易で且つ効率の良い精製法が所望される。該単量体はかなり長時間にわたる長く連続的なオリゴマー化において使用され、そこではまた不純物が該ホスホラミダイトの分解を引き起こし得るので、絶対的な純度の該アミダイトは必要である。
該新規な方法は、オキシ−β−リボ−ＬＮＡホスホラミダイト（ここで、ＢはＡＢｚ、ＭｅＣＢｚ、ＧＩｂｕおよびＴである）、およびオキシ−α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ−Ｔの製造によって示す（図３）。
Figure 0004402454
本発明は、ＬＮＡホスホラミダイトの製造法を提供し、該方法は求核性活性化剤の存在下で２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラ置換ホスホラミダイトを用いる、ＬＮＡ単量体の３'−ＯＨ基のホスファイト化を含む。
本発明の活性化方法の利点は、以下の通りである：
ａ）取り扱いの容易さ；
ｂ）全ての試薬が室温で安定であること；
ｃ）わずか０．７当量のＤＣＩだけが必要であること；
ｄ）ワークアップの容易さ；
ｅ）室温での速く且つ高収率の反応；
ｆ）コスト的に効率の良い反応；
ｇ）高純度のアミダイトを得るのにクロマトグラフィー精製法が必須でないこと。
該グアニン核酸塩基の公知のホスファイト化副反応、続く遅い転移(tranfer)／転位(rearrangement)反応によって、目的のアミダイトを得ること（Nielsen, J.; Taagaard, M.; Marugg, J. E.; van Boom, J. H.; Dahl, O.によるNuc. Acid. Res. 1986, 14, 7391-7403）（図１を参照）は、本明細書に記載の条件を用いて観察されなかった。
（発明の詳細な記載）
本明細書で使用する用語「ＬＮＡ単量体」とは、国際特許出願番号ＷＯ9914226およびその後のＷＯ0056746、ＷＯ0056748、ＷＯ0066604およびＷＯ0228875に記載されている２',４'−架橋（特に、−Ｏ−ＣＨ２−架橋（オキシ−ＬＮＡの場合）、−Ｓ−ＣＨ２−架橋（チオ−ＬＮＡの場合）、−ＮＲ−ＣＨ２−架橋（アミノ−ＬＮＡの場合；ここで、Ｒは水素、Ｃ１〜６アルキル、フェニル、ベンジルなどである））を有するリボヌクレオチドを意味する。
ＬＮＡ単量体の特に関心ある例は、オキシ−β−Ｄ−リボ−ＬＮＡ（図２を参照）、チオ−β−Ｄ−リボ−ＤＮＡ、アミノ−β−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、オキシ−α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ（図３を参照）、チオ−α−Ｌ−リボ−ＬＮＡまたはアミノ−α−Ｌ−リボ−ＬＮＡと呼ばれるものが挙げられる。
本明細書で使用する用語「ＬＮＡホスホラミダイト」とは、保護された５'ヒドロキシ基（例えば、図２および３に例示するＤＭＴ保護）を有するヌクレオチドを意味し、ここで３'−ヒドロキシ基は三価のリン原子（このものは次いで、適当な脱離基（例えば、ジイソプロピルアミンなどのＮ,Ｎ−ジアルキルアミン）および保護基（例えば、シアノエチル（ＮＣＣＨ２ＣＨ２−）基）と結合する）とカップリングする。固相および液相のオリゴヌクレオチド製造において使用することができるいずれかのＬＮＡホスホラミダイト（このものは、保護された二量体および三量体のＬＮＡホスホラミダイトを含む）を、本発明において使用することができる。
本明細書で使用する用語「２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラ置換ホスホラミダイト」（このものはまた、「ＰＮ２試薬」とも呼ばれる）とは要するに、２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラ置換ホスホラミダイトを意味し、ここで該用語「置換」とは、炭素数が１〜９の直鎖、環状または分枝の、不飽和炭化水素基（例えば、アリルまたはビニル）、飽和炭化水素基、置換炭化水素基、芳香族基または置換芳香族基を意味し、例えばメチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシルであり、好ましい例のアルキルはメチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、特にメチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソ−ブチル、シクロヘキシル、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレンであり、該置換基はヘテロ原子（例えば、酸素または窒素）であり得る。
該ＬＮＡ単量体、並びにホスホラミダイトＬＮＡ単量体は、１'位にいずれかの核酸塩基を有し得る。
本明細書において用語「核酸塩基(nucleobase)」とは、天然に存在する核酸塩基、並びに天然に存在しない核酸塩基を含む。これまで「天然に存在しない」とみなされてきた様々な核酸塩基がその後に天然において発見されることは、当該分野の当業者にとって明白であるべきである。従って、「核酸塩基」とは、公知のプリンおよびピリミジンのヘテロ環だけでなく、ヘテロ環状アナログおよびそれらの互変異性体をも含む。核酸塩基の例としては、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４,Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６,Ｎ６−エタノ−２,６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−(Ｃ３−Ｃ６)−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、プソイド(pseudo)イソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロプリン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、Ｎ６−アルキルプリン、Ｎ６−アシルプリン、Ｎ６−ベンジルプリン、Ｎ６−ハロプリン、Ｎ６−ビニルプリン、Ｎ６−アセチレン(acetylenic)プリン、Ｎ６−アシルプリン、Ｎ６−ヒドロキシアルキルプリン、Ｎ６−チオアルキルプリン、Ｎ２−アルキルプリン、Ｎ４−アルキルピリミジン、Ｎ４−アシルピリミジン、Ｎ４−ベンジルピリミジン、Ｎ４−ハロピリミジン、Ｎ４−ビニルピリミジン、Ｎ４−アセチレンピリミジン、Ｎ４−アシルピリミジン、Ｎ４−ヒドロキシアルキルピリミジン、Ｎ６−チオアルキルピリミジン、チミン、シトシン、６−アザピリミジン（これは、６−アザシトシンを含む）、２−および／または４−メルカプトピリミジン、ウラシル、Ｃ５−アルキルピリミジン、Ｃ５−ベンジルピリミジン、Ｃ５−ハロピリミジン、Ｃ５−ビニルピリミジン、Ｃ５−アセチレンピリミジン、Ｃ５−アシルピリミジン、Ｃ５−ヒドロキシアルキルプリン、Ｃ５−アミドピリミジン、Ｃ５−シアノピリミジン、Ｃ５−ニトロピリミジン、Ｃ５−アミノピリミジン、Ｎ２−アルキルプリン、Ｎ２−アルキル−６−チオプリン、５−アザシチジニル、５−アザウラシリル、トラゾロピリジニル、イミダゾロピリジニル、ピロロピリミジニルおよびピラゾロピリミジニルを挙げられる。該塩基上の官能性の酸素および窒素基は、必要ならばまたは所望するならば保護することができる。適当な保護基は当該分野の当業者にとってよく知られており、このものは例えば、トリメチルシリル、ジメチルヘキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリルおよびｔ−ブチルジフェニルシリル、トリチル、アルキル基、アシル基（例えば、アセチルおよびプロピオニル）、メタンスルホニルおよびｐ−トルエンスルホニル、イミン（例えば、Ｎ−ジメチルメチレンエネアミンおよびジブチルメチレンエネアミン）を含む。好ましい塩基は例えば、シトシン、メチルシトシン、ウラシル、チミン、アデニンおよびグアニンを含む。
本発明に記載のＬＮＡホスホラミダイトは、２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホラミダイト（ＰＮ２試薬）を用いて高収率で製造する。この試薬を用いて、以前、ＬＮＡホスホラミダイトを製造するのには成功していない。これまでに、２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイトが、ＬＮＡアミダイトの製造に使用されている。これは、本発明に記載の高純度、高収率および短い反応時間を与えない。
本発明における驚くべき発見は、２−シアノ−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホラミダイトが４,５−ジシアノイミダゾールによって活性化され、そしてこの複合体は記載する条件の間に正確な反応性を与え、全ての４ＬＮＡ ＤＭＴ−保護のヌクレオシド（これは、例えばＧ−ヌクレオシドを含む）の効率の良いホスファイト化を保証することである。２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイトを用いる従来の公知の方法の場合には、該ホスファイト化反応は、保護されたグアニン核酸塩基上の酸素によって進行し（図１ａ）、そしてその後に熱力学的に安定な３'−Ｏ−アミダイトに転位する（図１ｂ）。その従来の方法を用いる欠点は、最終生成物が副生成物を含むこと、および遅い転位反応のためにかなり長い反応時間（２４時間にまで）を要し、その結果熱力学的な生成物を与えることである。
ＬＮＡホスホラミダイトの製造のための通常の方法は１４〜７３％の範囲の収率を与えるが、一方で本発明の方法は９５％以上の収率を与える。このことはまた、ＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオチドについてのみ該対応する反応が９２％の収率を与える理由として注目に値する。
本発明の別の利点は、該反応が０．５〜４時間、好ましくは１．０〜３．５時間で終了すること、およびＬＮＡアミダイトのクロマトグラフィーはその効率良い反応のために不要であることである。従って、該ホスファイト反応は典型的に、０．１〜１２時間（例えば０．２〜８時間、例えば０．５〜４．０時間、例えば１．０〜３．５時間）で進行することが可能である。
オリゴヌクレオチド製造における直接的な使用のためのＬＮＡホスホラミダイトは、直接にまたは該反応混合物からの該生成物の簡単な沈降によって、得ることができる。従って、本発明のある態様において、該方法は多くて１つの沈降工程を含む。
本発明において使用するための適当な求核活性化剤は例えば、４,５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、４−アルキルチオイミダゾール、２−アルキルチオイミダゾール、２−ニトロイミダゾール、４−ニトロイミダゾール、４,５−ジハロイミダゾール、４−ハロイミダゾール、２−ハロイミダゾールおよび５−アルコキシテトラゾールを含むが、これらに限定されない。ＤＣＩは、好ましい求核性活性化剤である。ＤＣＩは、ｐＫａが５．２であり、このものはアセトニトリルに容易に溶解する。
適当なＰＮ２試薬としては例えば、２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホラミダイトおよび２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラエチルホスホラミダイト、並びにDahl, B. H., Nielsen, J.およびDahl, O.によるNucleic Acid Research, 1987, 15, 1729-1743（このものは、本明細書の一部を構成する）によって記載の試薬を含むが、これらに限定されない。現在、２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホラミダイトおよび２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラエチルホスホラミダイト、特に２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホラミダイトは、特に適切であると考えている。
現在好ましい組み合わせは、２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラ置換ホスホラミダイトが２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホラミダイトであって、および該求核性活性化剤が４,５−ジシアノイミダゾールである場合である。
該ＬＮＡ単量体および該求核性活性化剤の間のモル比は典型的に、１：０．０００１〜１：１０の範囲であり、好ましくは１：０００１〜１：１の範囲であり、より好ましくは１：０．０００１〜１：０．７の範囲である。
該ＬＮＡ単量体および該ＰＮ２試薬の間のモル比は典型的に、１：０．９〜１：１０の範囲であり、好ましくは１：０．９５〜１：５の範囲であり、より好ましくは１：１である。
現在最も関心のあるＬＮＡ単量体は、グアニン、チミン、シトシン、メチルシトシン、ウラシルまたはアデニン、典型的に保護されたもの（例えば、Ｎ−ベンゾイル保護のシトシン（ＣＢｚ）、Ｎ−ベンゾイル保護のメチルシトシン（ＭｅＣＢｚ）、Ｎ−イソ−ブタノイル保護のグアニン（ＧＩＢｕ）、ウラシル（Ｕ）、チミン（Ｔ）、Ｎ−ベンゾイル保護のアデニン（ＡＢｚ））から選ばれる核酸塩基を有するものである。
（実施例）
実施例１−ホスファイト化方法
４つのホスファイト化方法を調べて、比較した：
Figure 0004402454
 ｉ）２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト、ジイソプロピルアミン；
ｉｉ）２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホラミダイト、１Ｈ−テトラゾール；
ｉｉｉ）２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホラミダイト、ピリジニウムトリフルオロアセテート；
ｉｖ）２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホラミダイト、４,５−ジシアノイミダゾール。
２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイトは、２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホラミダイト（ＰＮ２試薬）と比較していくつかの欠点を有すると考えられる。それは、室温で不安定で、高価で、そしてその高い反応性のために取り扱うのが困難である。その上、核酸塩基との所望しない反応が、２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイトの場合に観察されることが多い（図１）。
３つの異なる活性化剤（１Ｈ−テトラゾール、ピリジニウムトリフルオロアセテートおよび４,５−ジシアノイミダゾール）を、２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホラミダイトと一緒に調べた。４,５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）は、最も良い結果を示した。
実施例２−ＬＮＡホスホラミダイト１〜６の製造の一般的な実験方法：
０．２Ｍ ＬＮＡヌクレオシド（１．０当量）の無水ＣＨ２Ｃｌ２溶液を、アルゴン下で撹拌した。１．０ＭのＤＣＩ（０．７０当量）の無水ＭｅＣＮ溶液を加え、続いて２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホラミダイト（１．０当量）を滴下した。該反応が完結後に（これは、分析用ＴＬＣ＊によって追跡する）、そのものをＣＨ２Ｃｌ２を用いて希釈し、そして飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で２回、およびブラインで１回洗浄した。該有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、そして真空下で濃縮して、無色の発泡体を得た。全てのホスホラミダイトを非常に高収率で（＞９５％）単離した。副生成物は、ＨＰＬＣ−ＭＳ、ＴＬＣまたは３１Ｐ−ＮＭＲによって全く検出され得なかった（純度：ほぼ１００％）。出発物質が乾燥しており且つ純粋である場合には、クロマトグラフィー精製は必要ない。
＊全てのホスファイト化反応は、Ｇ−ホスホラミダイト（２）製造が完結するのに４時間まで費やすのを除いて、２時間より低くて完結した。
(１Ｒ,３Ｒ,４Ｒ,７Ｓ)−３−(４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシトシン−１−イル)−７−(２−シアノエトキシ−(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)−(４,４ ' −ジメトキシトリチルオキシメチル)−２,５−ジオキサビシクロ[２.２.１]ヘプタン（３）の製造
(１Ｒ,３Ｒ,４Ｒ,７Ｓ)−３−(４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシトシン−１−イル)−１−(４,４'−ジメトキシトリチルオキシメチル)−７−ヒドロキシ−２,５−ジオキサビシクロ[２.２.１]ヘプタン（４．８６ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）に溶解し、そして４,５−ジシアノイミダゾールのＭｅＣＮ（１．０Ｍ、５ｍＬ）を加えた。アルゴン下、周囲温度で撹拌した。２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスフィノジアミダイト（２．４ｍＬ、７．２ｍｍｏｌ）を該反応混合物に滴下した。２時間後に、該反応液をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）を用いて希釈し、このものを分液ろうとに移し、そして飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×１５０ｍＬ）およびブライン（１５０ｍＬ）を用いて抽出した。該水相を合わせてＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）を用いて抽出した。該有機層を貯蔵し、そして乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。ろ過後に、該有機層を真空下で蒸発して、わずかに黄色の発泡体（６．０ｇ、収率９５％）を得た。少量の試料を、クロマトグラフィー精製した物質との比較のために取り出した。該生成物をドライカラムバキュームクロマトグラフィー（径１０ｃｍ；５％容量比のＥｔ３Ｎのｎ−ヘプタン溶液を用いて前処理したシリカゲル；０→７０％容量比のＥｔＯＡｃのｎ−ヘプタンを使用）によって精製した。３を含有する選択した画分を合わせて、真空下で蒸発して、無色の発泡体（５．３ｇ、収率８４％）を得た。
カップリング反応の効率性の差違は、該粗および該クロマトグラフィー精製のホスホラミダイトの間のカップリング反応の効率性のアッセイ（上記を参照）において、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いては全く検出され得なかった。
化合物１、２、４、５および６は、同様な方法で製造した。
ホスホラミダイト１〜６の分析データ
(１Ｒ,３Ｒ,４Ｒ,７Ｓ)−７−(２−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)−１−(４,４'−ジメトキシトリチルオキシメチル)−３−(チミン−１−イル)−２,５−ジオキサビシクロ[２.２.１]ヘプタン（１）
31P-NMR (CDCl3, 121.49 MHz): δ 150.0 (s), 149.3 (s)。
MS (ES): m/z（C41H49N4O9Pとして計算）[M+H]＋: 計算値：773.3、実測値：773.1。
RP HPLC: RT = 5.89分，6.19分。
(１Ｒ,３Ｒ,４Ｒ,７Ｓ)−７−(２−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)−１−(４,４'−ジメトキシトリチルオキシメチル)−３−(２−Ｎ−イソブチリルグアニン−１−イル)−２,５−ジオキサビシクロ[２.２.１]ヘプタン（２）
31P-NMR (CDCl3, 121.49 MHz): δ 150.2 (s), 149.2 (s)。
MS (ES): m/z（C45H54N7O9Pとして計算）[M+H]＋: 計算値：868.4、実測値：868.0。
RP HPLC: RT = 5.52分，5.72分。
(１Ｒ,３Ｒ,４Ｒ,７Ｓ)−３−(４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシトシン−１−イル)−７−(２−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)−１−(４,４'−ジメトキシトリチルオキシメチル)−２,５−ジオキサビシクロ[２.２.１]ヘプタン（３）
31P-NMR (CDCl3, 121.49 MHz): δ 150.5 (s), 150.5 (s)。
MS (ES): m/z（C48H54N5O9Pとして計算）[M+H]＋: 計算値：876.4、実測値：876.2。
RP HPLC: RT = 7.67分，8.13分。
(HPLC溶媒勾配: 0.0-0.5分 95%B、0.5-2.0分 95%→100%B、2.0-7.0分 100%B、7.0-7.5分 100％→95%B、7.5-12.0分 95%B）。
(１Ｒ,３Ｒ,４Ｒ,７Ｓ)−３−(６−Ｎ−ベンゾイルアデニン−９−イル)−７−(２−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)−１−(４,４'−ジメトキシトリチルオキシメチル)−２,５−ジオキサビシクロ[２.２.１]ヘプタン（４）
31P-NMR (CDCl3, 121.49 MHz): δ 150.1 (s), 149.7 (s)。
MS (ES): m/z（C48H52N7O8Pとして計算）[M+H]＋: 計算値：886.3、実測値：886.0。
RP HPLC: RT = 6.65分，6.82分。
(１Ｒ,３Ｒ,４Ｒ,７Ｓ)−７−(２−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)−１−(４,４'−ジメトキシトリチルオキシメチル)−５−Ｎ−メチル−３−(チミン−１−イル)−２−オキサ−５−アザビシクロ[２.２.１]ヘプタン（５）
31P-NMR (CDCl3, 121.49 MHz): δ 149.8 (s), 149.6 (s)。
MS (ES):m/z（C42H52N5O8Pとして計算）[M+H]＋: 計算値：786.3、実測値：786.2。
RP HPLC: RT = 5.87分，6.26分。
(１Ｓ,３Ｒ,４Ｓ,７Ｒ)−７−(２−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)−１−(４,４'−ジメトキシトリチルオキシメチル)−３−(チミン−１−イル)−２,５−ジオキサビシクロ[２.２.１]ヘプタン（６）
31P-NMR (CDCl3, 121.49 MHz): δ 150.9 (s), 150.6 (s)。
MS (ES):m/z（C41H49N4O9Pとして計算）[M+H]＋: 計算値：773.3、実測値：773.1。
RP HPLC: RT = 6.06分，6.44分。
図１は、ａ）２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト、ジイソプロピルエチルアミンによるグアニンのホスファイト化、ｂ）転移／転位反応によるグアニン３'ＯＨのホスファイト化（遅い）を示す図面である。 図２は、オキシ−β−Ｄ−リボ−ＤＮＡホスホラミダイトを示す図面である。 図３は、２−アミン−β−Ｄ−リボ−ＬＮＡホスホラミダイトおよびオキシ−α−Ｌ−リボ−ＬＮＡチミンホスホラミダイトを示す図面である。

Claims (8)

  1. ＬＮＡホスホラミダイトの製造方法であって、
    ４,５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）の存在下での、２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホラミダイトを用いる、２ ’ ,４ ’ −架橋を有するＬＮＡ単量体の３'−ＯＨ基のホスファイト化を含み、そして、
    該ＬＮＡ単量体およびＤＣＩの間のモル比は、１：０．７〜１：１の範囲である、
    該方法。
  2. 該２ ’ ,４ ’ −架橋は、−Ｏ−ＣＨ ２ −架橋、−Ｓ−ＣＨ ２ −架橋、または−ＮＲ−ＣＨ ２ −架橋であり、ここで、Ｒは、水素、Ｃ １〜６ アルキル、フェニル、およびベンジルからなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
  3. 最大１つの沈降工程を含む、請求項１または２のいずれか記載の方法。
  4. ＬＮＡ単量体および２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホラミダイトの間のモル比は、１：０．９〜１：１の範囲である、請求項１〜３のいずれか１つ記載の方法。
  5. ホスファイト化は０．５〜４時間で進行することができる、請求項１〜４のいずれか１つ記載の方法。
  6. ＬＮＡ単量体は、グアニン、チミン、シトシン、メチルシトシン、ウラシル、またはアデニンから選ばれる核酸塩基を有する、請求項１〜５のいずれか１つ記載の方法。
  7. ＬＮＡ単量体構造は、オキシ−β−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、チオ−β−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、アミノ−β−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、オキシ−α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、チオ−α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、またはアミノ−α−Ｌ−リボ−ＬＮＡから選ばれる、請求項１〜６のいずれか１つ記載の方法。
  8. 該ＬＮＡ単量体およびＤＣＩの間のモル比は、１：０．７である、請求項１〜７のいずれか１つ記載の方法。
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Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2264172T (pt) 2002-04-05 2017-12-06 Roche Innovation Ct Copenhagen As Compostos oligoméricos para a modulação da expressão do hif-1α.
US7713738B2 (en) 2003-02-10 2010-05-11 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds for the modulation of survivin expression
WO2004069991A2 (en) 2003-02-10 2004-08-19 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of survivin expression
ATE443765T1 (de) 2003-03-21 2009-10-15 Santaris Pharma As Analoga kurzer interferierender rna (sirna)
AU2004303464B2 (en) 2003-12-23 2009-10-01 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of BCL-2
AU2005304110B2 (en) 2004-11-09 2009-06-11 Enzon Pharmaceuticals, Inc. LNA oligonucleotides and the treatment of cancer
US9447138B2 (en) 2004-11-09 2016-09-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Potent LNA oligonucleotides for the inhibition of HIF-1a expression
NZ555644A (en) 2004-11-09 2009-04-30 Santaris Pharma As Potent LNA oligonucleotides for the inhibition of HIF-1A expression
ES2548240T3 (es) 2005-12-01 2015-10-15 Pronai Therapeutics, Inc. Terapias para el cáncer y composiciones farmacéuticas usadas en las mismas
JP5244087B2 (ja) 2006-03-23 2013-07-24 サンタリス ファーマ アー／エス 低分子内部セグメント化干渉ｒｎａ
CA3042781C (en) 2006-04-03 2021-10-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Pharmaceutical composition comprising anti-mirna antisense oligonucleotides
EP3502255A1 (en) 2006-04-03 2019-06-26 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Pharmaceutical composition
US8580756B2 (en) 2007-03-22 2013-11-12 Santaris Pharma A/S Short oligomer antagonist compounds for the modulation of target mRNA
EP2126079A1 (en) 2007-03-22 2009-12-02 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the inhibition of apo-b100 expression
EP2173373B1 (en) 2007-06-06 2020-04-15 Sarepta Therapeutics, Inc. Soluble her2 and her3 splice variant proteins, splice-switching oligonucleotides, and their use in the treatment of disease
WO2009027978A1 (en) 2007-08-30 2009-03-05 Hadasit Medical Research Services & Development Ltd. NUCLEIC ACID SEQUENCES COMPRISING NF-ϰB BINDING SITE WITHIN O(6)-METHYLGUANINE-DNA-METHYLTRANSFERASE (MGMT) PROMOTER REGION AND USES THEREOF FOR THE TREATMENT OF CANCER AND IMMUNE-RELATED DISORDERS
EP2623599B1 (en) 2007-10-04 2019-01-02 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Micromirs
US9211537B2 (en) 2007-11-07 2015-12-15 The University Of British Columbia Microfluidic device and method of using same
WO2009109665A1 (en) 2008-03-07 2009-09-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions for treatment of microrna related diseases
ES2541442T3 (es) 2008-08-01 2015-07-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Modulación mediada por microARN de factores estimulantes de colonias
ES2599979T3 (es) 2009-04-24 2017-02-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Composiciones farmacéuticas para el tratamiento de pacientes de VHC que no responden al interferón
WO2011009697A1 (en) 2009-07-21 2011-01-27 Santaris Pharma A/S Antisense oligomers targeting pcsk9
WO2011105902A2 (en) 2010-02-23 2011-09-01 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Antagonists of complement component 8-beta (c8-beta) and uses thereof
WO2011105900A2 (en) 2010-02-23 2011-09-01 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Antagonists of complement component 8-alpha (c8-alpha) and uses thereof
WO2011105901A2 (en) 2010-02-23 2011-09-01 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Antagonists of complement component 9 (c9) and uses thereof
GB201012418D0 (en) 2010-07-23 2010-09-08 Santaris Pharma As Process
EP2609198B8 (en) 2010-08-24 2018-03-28 Sirna Therapeutics, Inc. SINGLE-STRANDED RNAi AGENTS CONTAINING AN INTERNAL, NON-NUCLEIC ACID SPACER
EP2914742A1 (en) 2012-11-05 2015-09-09 Pronai Therapeutics, Inc. Methods of using biomarkers for the treatment of cancer by modulation of bcl2!expression
EP2943570B1 (en) 2013-01-14 2018-01-03 Pierfrancesco Tassone Inhibitors of mirnas 221 and 222 for anti-tumor activity in multiple myeloma
PT3013959T (pt) 2013-06-27 2020-02-04 Roche Innovation Ct Copenhagen As Oligómeros antissentido e conjugados dirigidos para pcsk9
WO2015075166A1 (en) 2013-11-22 2015-05-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for treatment of a bacterial infection
EP3099798B1 (en) 2014-01-29 2018-06-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Oligonucleotides and methods for inhibiting or reducing bacterial biofilms
GB201410693D0 (en) 2014-06-16 2014-07-30 Univ Southampton Splicing modulation
AU2015318782A1 (en) 2014-09-18 2017-04-06 The University Of British Columbia Allele-specific therapy for Huntington Disease haplotypes
KR102620328B1 (ko) 2014-10-03 2024-01-02 콜드스프링하버러보러토리 핵 유전자 산출량의 표적화 증강
US20190055550A1 (en) * 2015-08-24 2019-02-21 Roche Innovation Center Copenhagen A/S LNA-G Process
AU2016334804B2 (en) 2015-10-09 2022-03-31 University Of Southampton Modulation of gene expression and screening for deregulated protein expression
AU2016370653A1 (en) 2015-12-14 2018-06-21 Cold Spring Harbor Laboratory Antisense oligomers for treatment of Autosomal Dominant Mental Retardation-5 and Dravet Syndrome
US11096956B2 (en) 2015-12-14 2021-08-24 Stoke Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and uses thereof
US20220354888A1 (en) 2016-08-03 2022-11-10 Aalborg Universitet ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES (ASOs) DESIGNED TO INHIBIT IMMUNE CHECKPOINT PROTEINS
EP4303321A2 (en) 2017-08-25 2024-01-10 Stoke Therapeutics, Inc. Antisense oligomers for treatment of conditions and diseases
WO2019076919A1 (en) 2017-10-17 2019-04-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) COMBINED TREATMENT OF CYSTIC FIBROSIS
WO2021005223A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of epilepsy
IT201900017234A1 (it) 2019-09-25 2021-03-25 Int Centre For Genetic Engineering And Biotechnology Anti-miRNA per il trattamento del leiomioma
WO2021074657A1 (en) 2019-10-17 2021-04-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combination treatment for cystic fibrosis
IL292286A (en) * 2019-10-18 2022-06-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Production method for bicyclic phosphoramidite
US20230018780A1 (en) * 2019-11-13 2023-01-19 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Method for producing oligonucleic acid compound
WO2021099394A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of cancer
WO2021231107A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Stoke Therapeutics, Inc. Opa1 antisense oligomers for treatment of conditions and diseases
WO2022011262A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating epilepsy
KR20230118076A (ko) * 2020-12-11 2023-08-10 야마사 쇼유 가부시키가이샤 시토신형 가교형 뉴클레오시드 아미다이트 결정 및 그 제조 방법
AU2022219031A1 (en) 2021-02-12 2023-09-07 Merand Pharmaceuticals, Inc. Agents, compositions, and methods for the treatment of hypoxia and ischemia-related disorders
WO2022200633A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Neumirna Therapeutics Aps Microrna-27b inhibitors
AU2022245292A1 (en) 2021-03-26 2023-10-12 Neumirna Therapeutics Aps Microrna-134 inhibitors
WO2022254021A1 (en) 2021-06-04 2022-12-08 Neumirna Therapeutics Aps Antisense oligonucleotides targeting adenosine kinase
CA3229568A1 (en) 2021-08-17 2023-02-23 Korea Advanced Institute Of Science And Technology Antisense oligonucleotide targeting cav3.1 gene and uses thereof
CA3228833A1 (en) 2021-08-19 2023-02-23 Neumirna Therapeutics Aps Antisense oligonucleotides targeting adenosine kinase
WO2023152369A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Nucleic acid mir-9 inhibitor for the treatment of cystic fibrosis
WO2024017990A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating chronic pain disorders
EP4332239A1 (en) 2022-08-30 2024-03-06 Istituto Romagnolo per lo Studio dei Tumori "Dino Amadori" - IRST S.r.l. Mir-based assay for gastro-entero-pancreatic neuroendocrine tumor diagnosis and prognosis

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4800197A (en) * 1996-10-15 1998-05-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Improved coupling activators for oligonucleotide synthesis

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