JP4402290B2

JP4402290B2 - 新規な乳酸菌種

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Publication number: JP4402290B2
Application number: JP2000517060A
Authority: JP
Inventors: ガイアー、ヴァルター; プリドモア、デビッド; シュティンゲレ、フランセスカ; − リシャールネーセ、ジャン; デサシイ、パトリス; ポト、ブルーノ
Original assignee: ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー
Priority date: 1997-10-17
Filing date: 1998-10-09
Publication date: 2010-01-20
Anticipated expiration: 2018-10-09
Also published as: WO1999020739A3; AU743435B2; DE69835827T2; CA2305891A1; DE69835827D1; EP1023435B1; BR9813071A; IL134923A0; JP2001520035A; NZ503319A; PL341105A1; ATE338812T1; PT1023435E; AU1154799A; US6579711B1; WO1999020739A2; DK1023435T3; EP1023435A2; ES2273439T3

Description

【０００１】
本発明は、ストレプトコッカス属に属する乳酸菌の、新規な種に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
乳酸菌の同定は、乳製品業界では必須のことであり、いくつかの種の間で、形態的、生理的及び／又は遺伝学的性質において他と異なる特徴を差別化することによって成り立っている。
【０００３】
特定の種の乳酸菌に特徴的な生理的性質は、種々の試験方法、例えば、様々な糖に対する発酵能力の分析や、ＳＤＳ−ＰAＧEタイプの電気泳動ゲル上での、総タンパク質の泳動パターンの標準的な分析により得られる（「乳酸菌のバクテリオシン、微生物学、遺伝学及び応用」（Ｌ．ＤｅＶｕｙｓｔ及びＥ．Ｊ．Ｖａｎｄａｍｅ編、ＢｌａｃｋｉｅＡｃａｄｅｍｉｃ＆Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４）の中のＰｏｔら、「乳酸菌の体系的分類」（Ｔａｘｏｎｏｍｙｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ））。
【０００４】
ＳＤＳ−ＰAＧE電気泳動ゲル上で得られた特定の種の総タンパク質の泳動パターンを、デンシトメーターを用いて、他の種から同様に得られた他の泳動パターンと比較することにより、種間の分類学的関係を明確にすることが可能である。また種々の泳動パターンを、例えばＧｅｌＣｏｍｐａｒ^TMソフトウェアを用いて数値的に解析することにより、様々なパラメーター、特に用いたアルゴリズムの関数である、種間の相関度を確立することが可能になる（ＧｅｌＣｏｍｐａｒ、バージョン４．０、ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈｓ．Ｋｏｒｔｒｉｊｋ、ベルギー；アルゴリズム：ピアソン積モーメント相関係数、平均結合を用いた非加重ペアグループ法（ＰｅａｒｓｏｎＰｒｏｄｕｃｔＭｏｍｅｎｔＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎＣｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ＵｎｗｅｉｇｈｔｅｄＰａｉｒＧｒｏｕｐＭｅｔｈｏｄＵｓｉｎｇＡｖｅｒａｇｅＬｉｎｋａｇｅ））。
【０００５】
ＳＤＳ−ＰAＧEゲル上での電気泳動による総タンパク質の泳動パターンの比較分析は、乳酸菌の種が同一のグループのものであるか又は異なるグループのものであるかを識別する有効な手段として、今日までずっと用いられてきた（Ｐｏｔら、「原核系統学における化学的方法」（ＣｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＳｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ）、１４章、Ｍ．Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ａ．Ｇ．Ｏ‘Ｄｏｎｎｅｌｌ編，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＬｔｄ，１９９４）。
【０００６】
このＳＤＳ−ＰAＧE法では、これまでの実験から、２つの乳酸菌株の間に７８より大きいピアソン相関度が得られた場合（１００を基準とする）、それらは正当に同一種に属すると推論できるということが示されている（「乳酸菌」（ＡｃｉｄＬａｃｔｉｃＢａｃｔｅｒｉａ，ＡｃｔｅｓｄｕＣｏｌｌｏｑｕｅＬａｃｔｉｃ ‘９１，３３−４０頁、ＡｄｒｉａＮｏｒｍａｎｄｉｅ，Ｆｒａｎｃｅ，１９９２）の中の、Ｋｅｒｓｔｅｒｓら、「タンパク質のゲル電気泳動を中心とした乳酸菌の分類と同定法」（ＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＬａｃｔｉｃＢａｃｔｅｒｉａｗｉｔｈＥｍｐｈａｓｉｓｏｎＰｒｏｔｅｉｎＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）；「乳酸菌」（ＴｈｅＬａｃｔｉｃＡｃｉｄＢａｃｔｅｒｉａ）の中のＰｏｔら、「乳酸菌の同定と維持のための培養コレクションの重要な役割」（Ｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｏｆａｃｕｌｔｕｒｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ）、１５章、８１−８７頁；Ｅ．Ｌ．Ｆｏｏ，Ｈ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｒ．ＭｏｌｌｂｙａｎｄＣ．Ｇ．Ｈｅｄｅｎ、「第一回乳酸菌コンピューター討論会議事録」（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅｆｉｒｓｔｌａｃｔｉｃｃｏｍｐｕｔｅｒｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ），ＨｏｒｉｚｏｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ）。
【０００７】
一例として、最近この方法を用いて、好酸性乳酸菌株のグループを６つの特徴的な種に分けることが可能になった（Ｐｏｔら，Ｊ．ＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂ．，１３９，５１３−５１７，１９９３）。同様に、この方法は、他の方法と組み合わせることによって、ストレプトコッカス属のいくつかの新しい種、例えば、ストレプトコッカスディスガラクティアエ、ｓｕｂｓｐ．エクイシミリス、ストレプトコッカスヒオヴァギナリスｓｐ．ｎｏｖ．及びストレプトコッカスソラルテンシスｓｐ．ｎｏｖ．のような新規な種の存在を明らかにすることができるようになっている（Ｖａｎｄａｍｍｅら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４６，７７４−７８１，１９９６；ｄｅｖｒｉｅｓｅら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９７，印刷中）。
【０００８】
しかしながら、乳酸菌株の新規な種の同定では、菌の純粋に形態的及び／又は生理的な分析を行うよりほか仕方がないという訳ではない。実際、形態的及び／又は生理的に極めて類似している２つの種でも、遺伝的な観点からは遠い関係にあるかもしれないのである。従って、乳酸菌株の１６ＳリボソームＲＮＡの分析は、乳酸菌株が既に公知の種又は属に属しているかどうかを最終的に決定するのに、極めて重要な方法である。
【０００９】
今日まで、「ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇＶｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ社」（ＤＳＭ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，独）は、ストレプトコッカス属に属する４８の異なる種を公式に記録している（下記表参照）。これら全ての種は、ストレプトコッカス属に特徴的な１６ＳリボソームＲＮＡを有し、上記したＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、相異性と相同性を有するグループに分けられる。
【００１０】
本発明は、上記した同定手法を用いてストレプトコッカス属に属する乳酸菌の新規な種を同定し、これを酪農産業で一般に利用することに関するものである。
【００１１】
（発明の概要）
この目的で、本発明は、
−１６ＳリボソームＲＮＡがストレプトコッカス属に特有のものであり、
−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲル上で総タンパク質を泳動したときに得られる総タンパク質泳動パターンが、乳酸菌株ＣＮＣＭ I−１９２０の総タンパク質泳動パターンの特徴を有し、しかしながらストレプトコッカス属に属すると認識されている種、すなわち、Ｓ．アシドミニムス、Ｓ．アガラクティアエ、Ｓ．アラクトリティカス、Ｓ．アンギノサス、Ｓ．ボビス、Ｓ．カニス、Ｓ．カプリヌス、Ｓ．コンステラツス、Ｓ．クリセツス、Ｓ．クリスタツス、Ｓ．ディフィシーレ、Ｓ．ドウネイ、Ｓ．ディスガラクティアエｓｓｐ．ディスガラクティアエ、Ｓ．ディスガラクティアエ、ｓｓｐ．エクイシミリス、Ｓ．エクイ、Ｓ．エクイｓｓｐ．エクイ、Ｓ．エクイｓｓｐ．ズーエピデミカス、Ｓ．エクイヌス、Ｓ．フェルス、Ｓ．ガロリティカス、Ｓ．ゴルドニイ、Ｓ．ヒオインテスティナリス、Ｓ．ヒオヴァギナリス、Ｓ．イニアエ、Ｓ．インテルメディウス、Ｓ．インテスティナリス、Ｓ．マカカエ、Ｓ．ミティス、Ｓ．ミュータンス、Ｓ．オラリス、Ｓ．パラサンギニス、Ｓ．パラウベリス、Ｓ．フォカエ、Ｓ．プレオモルファス、Ｓ．ニューモニアエ、Ｓ．ポルシヌス、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．ラッティ、Ｓ．サリバリウス、Ｓ．サンギニス、Ｓ．シロイ、Ｓ．ソブリヌス、Ｓ．スイス、Ｓ．テルモフィルス、Ｓ．トラルテンシス、Ｓ．ウベリス、Ｓ．ヴェスチブラリス、Ｓ．ヴィリダンス、とは異なる、あらゆる乳酸菌株に関するものである。
【００１２】
本発明は、食品用組成物、特に酸性化乳製品及びフレッシュチーズ（フロマージュフレ）の調製のための、本発明記載の乳酸菌株の利用に関するものである。
【００１３】
本発明は、また、本発明記載の乳酸菌株によって分泌され得て、それぞれ３：２：１の比で一連のグルコース、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンから成るポリサッカライドの使用に関するものである。
【００１４】
本発明の主題は、本発明の乳酸菌株を含む食品用又は医薬用組成物である。
【００１５】
最後に、本発明の主題はまた、それぞれ３：２：１の比で一連のグルコース、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンから成るポリサッカライドを含む食品用又は医薬用組成物である。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明の新規な種がストレプトコッカス属に属することは、好ましくは、本発明の菌の１６ＳリボソームＲＮＡ又は１６ＳリボソームＲＮＡに転写されるゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を、これまでに知られている乳酸菌の属する属及び種のそれらと比較することにより示される。
【００１７】
さらに詳細に述べるならば、例えば以下の実施例１に開示された方法、あるいはまた、当業者に公知の他の方法（Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒら，Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１８，４６１−４６７，１９９５；Ｌｕｄｗｉｇら，Ｓｙｓｔｔｅｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１５，４８７−５０１，１９９２）を用いることも可能である。後に示す配列表に示された配列番号１のヌクレオチド配列は、この新規な種に特徴的なものであり、これまでに見つかっているストレプトコッカスの種に見られる１６ＳリボソームＲＮＡの配列と驚くほど類似している。
【００１８】
本発明の新規な種は、相異性と相同性を有する新規グループを構成するが、ストレプトコッカス属に属する公知の他の種とは、上記したＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲル上での総タンパク質同定手法を用いても、区別することができる。
【００１９】
特に、ＭＲＳ培地中で２８℃で２４時間培養し、総タンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲル上でそのタンパク質を泳動させて得られるこの新規な種の総タンパク質パターンは、乳酸菌株ＣＮＣＭＩ−１９２０を用いて同一条件で得られるパターンに対して少なくとも７８（１００を基準として）のピアソン相関度を示し、様々な種の乳酸菌のいくつか、特に、例えば以下に示す乳酸菌を用いて同一の条件で得られるパターンに対しても同様である。
【００２０】
さらに詳細に述べると、この手法は、（１）定められた条件下で培養した乳酸菌株の培養液の全てのタンパク質（＝総タンパク質）を単離し、（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での電気泳動によりそれぞれのタンパク質を分離し、（３）分離した異なるタンパク質の画分の組み合わせについて、デンシトメーターを用いて各バンドの強さと位置を測定して分析し、（４）そして、このようにして得られたタンパク質パターンを、ストレプトコッカス属のいくつかの他の種のタンパク質パターンと比較する、ものである。
【００２１】
上述した総タンパク質パターンを得る手法は、このようなパターンの数値的な分析と同様に当業者にとって公知である。しかしながら、このような方法で得られた結果は、各段階の方法が十分に標準化されていないと、信頼できるものとはならない。この要求に直面して、標準化した手順がそれぞれの著者によって常に公用可能になっている。このことについては、特に、１９９４年９月１２−１６日にベルギーのゲント大学で欧州連合の主催で開かれたワークショップで、Ｐｏｔらの発表で言及されている（細菌の分類と同定におけるフィンガープリント技法、総細胞タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理（Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａ，ＳＤＳ−ＰＡＧＥｏｆｗｈｏｌｅｃｅｌｌｐｒｏｔｅｉｎ））。
【００２２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲル上での同定手法に用いられるソフトウエアは、種間の相関の程度がこのソフトウエアによって使用されるパラメーター及びアルゴリズムに依存するため、決定的に重要である。理論的に詳細に述べるつもりはないが、デンシトメーターで得られ、コンピューターで規格化したバンドの定量的な比較は、好ましくはピアソン相関係数を用いて行われる。このようにして得られた相同性マトリックスは、ＵＰＧＭＡ（平均結合を用いた非加重ペアグループ法）アルゴリズムを用いて系統立てることができる。このアルゴリズムは、最も類似しているパターンをグルーピングすることを可能にするだけでなく、デンドログラム（樹形図）の構築をも可能にする［Ｋ．Ｋｅｒｓｔｅｒｓ、「コンピューターを利用した細菌系統学」の中の「電気泳動による細菌の分類と同定における数値的方法」（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓｉｎｔｈｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｉａｂｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄＢａｃｔｅｒｉａｌＳｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ）、３３７−３６８頁、Ｍ．Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ａ．Ｇ．Ｏ‘Ｄｏｎｎｅｌｌ編、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓＬｔｄ．１９８５］。
【００２３】
好ましくは、新種の菌株は、その新種の菌株の１つに対し少なくとも８５のピアソン相関度を有する総タンパク質パターンを示す。下記の生物型に関しては、例えばこのピアソン相関度が９０を超えることもあり得る。
【００２４】
このＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲル上での同定手法によって、本発明のストレプトコッカス属に属する新規な種は、これまでに知られている全てのストレプトコッカス種、すなわち、Ｓ．アシドミニムス、Ｓ．アガラクティアエ、Ｓ．アラクトリティカス、Ｓ．アンギノサス、Ｓ．ボビス、Ｓ．カニス、Ｓ．カプリヌス、Ｓ．コンステラツス、Ｓ．クリセツス、Ｓ．クリスタツス、Ｓ．ディフィシーレ、Ｓ．ドウネイ、Ｓ．ディスガラクティアエｓｓｐ．ディスガラクティアエ、Ｓ．ディスガラクティアエ、ｓｓｐ．エクイシミリス、Ｓ．エクイ、Ｓ．エクイｓｓｐ．エクイ、Ｓ．エクイｓｓｐ．ズーエピデミカス、Ｓ．エクイヌス、Ｓ．フェルス、Ｓ．ガロリティカス、Ｓ．ゴルドニイ、Ｓ．ヒオインテスティナリス、Ｓ．ヒオヴァギナリス、Ｓ．イニアエ、Ｓ．インテルメディウス、Ｓ．インテスティナリス、Ｓ．マカカエ、Ｓ．ミティス、Ｓ．ミュータンス、Ｓ．オラリス、Ｓ．パラサンギニス、Ｓ．パラウベリス、Ｓ．フォカエ、Ｓ．プレオモルファス、Ｓ．ニューモニアエ、Ｓ．ポルシヌス、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．ラッティ、Ｓ．サリバリウス、Ｓ．サンギニス、Ｓ．シロイ、Ｓ．ソブリヌス、Ｓ．スイス、Ｓ．テルモフィルス、Ｓ．トラルテンシス、Ｓ．ウベリス、Ｓ．ヴェスチブラリス、Ｓ．ヴィリダンス、とは異なる。
【００２５】
本発明の新規な種は、また、この手法によって、これまで間違ってストレプトコッカス属に分類されていた乳酸菌株、例えば、Ｓ．アジャセンス（新分類＝アビオトロフィアアジャセンス）、Ｓ．カゼリフラブス（＝エンテロコッカスカゼリフラブス）、Ｓ．セコルム（＝エンテロコッカスセコルム）、Ｓ．クレモリス（＝ラクトコッカスラクティス亜種クレモリス）、Ｓ．デフェクチブス（アビオトロフィアデフェクチバ）、Ｓ．フェカリス（＝エンテロコッカスフェカリス）、Ｓ．フェシウム（＝エンテロコッカスフェシウム）、Ｓ．ガリナルム（＝エンテロコッカスガリナルム）、Ｓ．ガルヴィエア（＝ラクトコッカスガルヴィエア）Ｓ．ハンセニー（＝ルミノコッカスハンセニー）、Ｓ．ラクティス（＝ラクトコッカスラクティス亜種ラクティス）、Ｓ．ラクティスクレモリス（＝ラクトコッカスラクティス亜種クレモリス）、Ｓ．ラクティスディアセチラクティス（＝ラクトコッカスラクティス亜種ラクティス）、Ｓ．モルビロラム（＝ギメラモルビロルム）、Ｓ．パルヴラス（＝アトポビウムパルヴラム）、Ｓ．プランタラム（＝ラクトコッカスプランタラム）、Ｓ．ラフィノラクティス（＝ラクトコッカスラフィノラクティス）及びＳ．サッカロリティカス（＝エンテロコッカスサッカロリティカス）と区別することができる。
【００２６】
本発明の乳酸菌株は、例えば、ラクトコッカスラクティスに特徴的な形態を有し、即ち、鎖状に連なった球形を有する。
【００２７】
この新規な種によって発酵され得る糖は、一般に以下の糖類、即ち、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチス（Ｄ）−グルコサミン、サリシン、セルビオース、マルトース、ラクトース、スクロース及びラフィノースのうちの少なくとも１つである。
【００２８】
１例として、スイスの酪農場において単離されたあらゆる新規種株の中で、７株がブダペスト条約に基づいて１９９７年１０月１４日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），２５ｒｕｅｄｕｄｏｃｔｅｕｒＲｏｕｘ，７５７２４Ｐａｒｉｓ、に寄託され、寄託番号ＣＮＣＭＩ−１９２０、Ｉ−１９２１、Ｉ−１９２２、Ｉ−１９２３，Ｉ−１９２４、Ｉ−１９２５、及びＩ−１９２６が付与された。
【００２９】
新規種株は、食品又は医薬品の製品の調製に、特に、例えば、そのままの状態で、濃縮して又は乾燥培養物として使用することができる。
【００３０】
乳製品は、明らかに本発明の範疇の中で好ましいものである。しかしながら、乳は、一方で動物由来の乳、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、シマウマ、ウマ、ロバ、ラクダの乳などを意味すると理解される。この乳には、天然の状態のもの、調製乳、脱脂乳又は微生物の生育や発酵乳の更なる加工に必要な成分、例えば、脂肪、タンパク質、イースト抽出タンパク質、ペプトン及び／又は界面活性剤などを添加した乳がある。乳という用語は、また、一般に野菜乳と呼ばれるものにも用いられる。即ち処理された植物素材からの抽出物、又は、例えば、マメ科植物（ダイズ、ヒヨコ豆、レンズ豆など）又は脂肪性種子（ナタネ、ダイズ、ゴマ、綿実など）があり、これらの抽出物はタンパク質を溶液として又はコロイド状に懸濁して含有しており、化学作用により、酸性下での培養により及び／又は加熱により凝集させることが可能である。最後に乳という言葉は、また、動物性の乳と植物性の乳との混合物をも意味する。
【００３１】
医薬用製品としては、経口投与用として、又は局所使用用として意図された全ての種類の製品を含み、新規種株の培養物を、例えば、そのままで、濃縮して又は乾燥して加えた、許容し得る製剤用の基剤を含む。これらの医薬用製品には、経口摂取可能な懸濁液、ゲル、散布用、カプセル、硬質ゼラチンカプセル、シロップ、又は当業者に公知のあらゆる他の形態の製剤が含まれる。
【００３２】
さらに、本発明の新規種株の中には、この種の新規な生物型を示して、中温性及び好熱性の顕著な特性を有するもの（中温性／好熱性生物型）もある。この生物型に属する株は、実際、約２８℃から約４５℃までの生育最適温度を有する。この性質は、（１）中温性／好熱性生物型のいくつかの培養物を、同時に、２０から５０℃の範囲の温度で調製し、（２）例えば、１６時間の培養後、培地の吸光度の値を測定し、（３）吸光度を温度の関数として表したグラフ［グラジサーム（ｇｒａｄｉｔｈｅｒｍ）］の形で結果をグループ分けすることで、容易に観察できる。Ｆｉｇ．１は、本発明のこのタイプの中温性／好熱性生物型について得ることができる特に代表的なグラフである。その例として、例えば、この特別な生物型を有する新規な種株の中で、菌株ＣＮＣＭＩ−１９２０、Ｉ−１９２１及びＩ−１９２２は特に代表的である。
【００３３】
乳製品業界において、この中温性／好熱性生物型を使用することは非常に重要である。実際、この種は中温性又は好熱性のスターターの製造に用いられる。従って、ヨーグルトタイプの製品を得るために、４５℃で酸性化乳を工業的に製造することが可能である。またレンネットの存在下に２８℃で乳を発酵し、このようにして得られたカードを遠心分離又は限外ろ過によって培養物から分離して、工業的にフレッシュチーズ（フロマージュフレ）を製造することも可能である。このようにして、好熱性株発酵の使用に付随する機械の詰まりの問題は取り除かれる（この問題については，欧州特許出願ＥＰ９６２０３６８３．６に開示されている）。
【００３４】
さらに、本発明の他の新しい生物型を代表する本発明の新規種の他の株の中には、培養用培地に粘性を与えるという顕著な性質を示すものがある（組織化性生物型）。本発明の組織化性生物型菌株によって発酵された乳の高い粘度特性は、下記のように観察され定量される。
【００３５】
１．組織化性生物型菌株を用いて酸性化した乳の構造を、非組織化性生物型の菌株によって酸性化した乳のそれと比較して観察することによる。非粘性の乳はガラスコップの壁に付着するが、それに対して粘性のある乳は自己合着性である。
【００３６】
２．他のテストは、ピペットを用いて行われる。ピペットを酸性化乳に浸漬し、約２ｍｌを吸い上げてからピペットを引き上げる。粘性の乳は、ピペットと液体表面の間にロープを形成するのに対し、非粘性の乳はこのような現象を起こさない。液体をピペットから離すとき、非粘性の乳は水と同じように明確な滴となるが、それに対し粘性の乳は、ピペットの先端まで立ち上がった長いロープにつながった滴を形成する。
【００３７】
３．ロータリーシェーカー用試験管に概略１／３まで充填した時、非粘性の乳は管の内壁を上がってくるが、粘性の乳の上昇は実質的にゼロである。
【００３８】
この特別な生物型の粘性の特性は、粘度を測定する流体力学的パラメーターを用いることによっても測定することができる。２、３の市販の装置でこのパラメーターを測定することができ、例えば、レオメーターＢｏｈｌｉｎＶＯＲ（ＢｏｈｌｉｎＧｍｂＨ社、独）などがある。製造メーカーの指示書に従って、試料をプレートと先端を切り落とした同じ直径のコーン（直径；３０ｍｍ、角度；５．４度、すきま；０．１ｍｍ）の間に入れ、次いで試料を連続回転するせん断速度勾配下に置き、強制的に流動させる。試料は、歪に抵抗してせん断応力と呼ばれる接線方向の力を生む。この応力は、流動抵抗に比例し、トーションバーによって測定される。次いで試料の粘度は、一定のせん断速度に対して、せん断応力（Ｐａ）とせん断速度（ｓ^-1）の比として求められる（“ＬｅＴｅｃｈｎｏｓｃｏｐｅｄｅＢｉｏｆｕｔｕｒｅ”Ｍａｙ，９７参照）。
【００３９】
この生物型の組織化特性の流体力学的測定試験から、つぎのような定義が導かれている。即ち本発明の組織化性生物型に属する乳酸菌株とは、半脱脂乳を３８度で、ｐＨ５．２まで発酵した時、例えば、２９３ｓ^-1のオーダーのせん断速度で、１００ｍPａ．ｓより大きい粘度を培地に与える菌である。例を挙げれば、例えば菌株ＣＮＣＭＩ−１９２２、Ｉ−１９２３、Ｉ−１９２４，Ｉ−１９２５及びＩ−１９２６が、この組織化性生物型株の特に代表的なものである。
【００４０】
この組織化性生物型は、また、乳製品業界では非常に重要である。なぜなら、それの乳製品に対する増粘能力は、組織化性乳酸菌の他の種、特に、ラクトバチルスヘルベティクスＣＮＣＭＩ−１４４９，ストレプトコッカステルモフィラスＣＮＣＭＩ−１３５１、ストレプトコッカステルモフィラスＣＮＣＭＩ−１８７９、ストレプトコッカステルモフィラスＣＮＣＭＩ−１５９０、ラクトバチルスブルガリクスＣＮＣＭＩ−８００、及びリューコノストックメセンテロイデスｓｓｐ．クレモリスＣＮＣＭＩ−１６９２の菌株の増粘能力と比べて例外的に高いためである。これらはそれぞれ、欧州特許出願ＥＰ６９９６８９、ＥＰ６３８６４２、ＥＰ９７１１１３７９．０、ＥＰ７５００４３、ＥＰ３６７９１８及びＥＰ９７２０１６２８．１に記載されている。
【００４１】
粘性のある製品の製造は、また、ある種の菌株を用いて、中温性（２５−３０℃）から好熱性（４０−４５℃）の非常に広範囲の温度域にわたって行うことも可能である。この特性上の特徴は、明らかに技術的な有益性を表す。
【００４２】
しかしながら、この組織化性生物型に属する菌株の中には、更に、その糖の組成がヒトの母乳中に含まれるオリゴサッカライドに見られる組成に類似している、高分子量のエクソポリサッカライド（ＥＰＳ）を産生するものがある。このＥＰＳは、実際、それぞれ３：２：１の割合で一連のグルコース、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンからなる［Ａ．Ｋｏｂａｔａ、「糖共役体コンジュゲート（ｔｈｅＧｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｓ），１巻、「乳中の糖タンパク質及びオリゴサッカライド（ＭｉｌｋＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）」、４２３−４４０頁，Ｉ．ＨｏｒｏｗｉｔｚａｎｄＷ．Ｐｉｇｍａｎ編，Ａｃ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９７７」。その例として、菌株ＣＮＣＭＩ−１９２３、Ｉ−１９２４、Ｉ−１９２５及びＩ−１９２６はこのポリサッカライドを産生する。
【００４３】
このエクソポリサッカライドは、天然の状態又は加水分解された状態では、バランスのよい幼児用食品として有益であり、満足すべきものである。
【００４４】
そのため、それぞれ３：２：１の割合で一連のグルコース、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンからなるＥＰＳを産生する、少なくとも１つの乳酸菌株、特に、例えば菌株ＣＮＣＭＩ−１９２４、Ｉ−１９２５又はＩ−１９２６を用いて酸性化した乳を含有する、幼児用及び／又は乳児用の食品を製造することができる。
【００４５】
また一方、このＥＰＳをこの生物型の培地から予め単離して、それをそのままの状態又は加水分解した状態で、例えば、幼児用食品の成分として使用することも可能である。
【００４６】
ＥＰＳの単離は、一般に、まず培養物からタンパク質及び菌体を除去し、それから精製されたＥＰＳの画分を単離する。タンパク質や菌体は、また、アルコールやトリクロロ酢酸で沈殿させた後遠心分離して除去することも可能であり、一方ＥＰＳは、例えば、アセトンなどの溶剤中で沈殿した後遠心分離して精製することができる。必要に応じて、ＥＰＳは、例えば、ゲルろ過又はアフィニティクロマトグラフィーで精製してもよい。
【００４７】
本発明の記載においては、ＥＰＳの単離は、また、発酵し、培養液を例えば乾燥や限外ろ過により濃縮することによる、ＥＰＳの生産の全ての方法を包含する。濃縮は当業者に公知のどんな方法で行ってもよいが、特に、例えば凍結乾燥や熱気流中でのスプレードライが好ましい。この点に関しては、米国特許第３，９８５，９０１号、ＥＰ２９８６０５、ＥＰ６３４３８に記載されている方法を、本発明の記載の中に参考として取り上げた。
【００４８】
母乳のオリゴサッカライドはサイズが小さいので、本発明のＥＰＳを予め部分的に加水分解すると都合がよい。加水分解の条件は、３から１０個の糖から成るオリゴサッカライド、即ち、例えば、６００から２０００ダルトンのオーダーの分子量を有するオリゴサッカライドが得られるように選ばれることが好ましい。
【００４９】
さらに詳しく述べると、本発明のＥＰＳを、０．５規定のトリフロロ酢酸（ＴＦＡ）溶液を用いて１００℃で３０−９０分かけて加水分解し、その後ＴＦＡを蒸発させてオリゴサッカライドを回収することができる。
【００５０】
幼児用製品は、好ましくは、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、血清アルブミン、イムノグロブリンから成るアレルゲン群から選ばれるアレルゲンが除去されていないホエーの加水分解したタンパク質素材を含んでおり、また、加水分解したアレルゲンを含む加水分解タンパク質素材は、１００００ダルトン以下の分子量を有する加水分解残基の形で存在しており、そのような加水分解タンパク質素材は、実質的にはアレルギー性タンパク質やタンパク質由来のアレルゲンを含まない（＝「欧州指令に従った低アレルギー性製品（ｈｙｄｒｏａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｐｒｏｄｕｃｔｉｎａｃｃｏｒｄａｎｃｅｗｉｔｈＥｕｒｏｐｅａｎＤｉｒｅｃｔｉｖｅ）」９６／４／ＥＣ；Ｆｒｉｔｓｃｈｅら、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．ＡｌｌｅｒａｎｄＡｐｐｌ．Ｉｍｍ．，９３，２８９−２９３，１９６０）。
【００５１】
本発明のＥＰＳを、天然の状態で又は部分的に加水分解した状態で、ホエーのこの加水分解タンパク質素材と混合することは可能であり、さらにこの混合物を、乾燥した又はその他の状態で、治療食用の様々な食品、例えば、特に乳児用の食品や、主にアレルギーに苦しむ人々向けを意図した吸収性の良い食品の中に取り込むことが可能である。
【００５２】
本発明は、以下に記載の実施例によって詳細な説明がなされ、さらにその後に図面の簡単な説明がなされる。しかし云うまでもないが、これらの実施例は、本発明の主旨のほんの一例に過ぎず、本発明にいかなる形であれ制限を構成するものではない。パーセントは特に指定されていない限り重量％で表す。
【００５３】
実施例１ストレプトコッカス属の新規な種の同定
スイスの様々な酪農場から単離されたいくつかの乳酸菌株が原因となって、以下に示すような遺伝的、生理学的な同定を行った。使用した方法だけでなく以下に記載される結果も、これらの菌株が新規なストレプトコッカスグループの１部であり、新種の乳酸菌として１つのグループとして表示されるのに十分な相異性と相同性を有していることを示す。一例として、この新規な菌株に属する菌株のあるものは、ブダペスト条約に基づいて１９９７年１０月１４日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、２５ｒｕｅｄｕｄｏｃｔｅｕｒＲｏｕｘ、７５７２４、Ｐａｒｉｓ、に寄託し、Ｉ−１９２０、Ｉ−１９２１、Ｉ−１９２２，Ｉ−１９２３，Ｉ−１９２４、Ｉ−１９２５及びＩ−１９２６の寄託番号を得た。
【００５４】
１．単離した菌株の形態：ラクトコッカスラクティスに特徴的な形態、即ち、顕微鏡下では鎖状につながった球状が観察される。
【００５５】
２．単離した菌株の糖発酵パターン：単離した菌株により発酵され得る糖は、一般的にＤ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−（Ｄ）−グルコサミン、サリシン、セロビオース、マルトース、ラクトース、スクロース及びラフィノースである。この発酵パターンはラクトコッカスラクティスより得られたものと同様である。
【００５６】
３．単離した菌株の１６ＳリボソームＲＮＡ：単離した菌株は４０ｍｌのＨＪＬ培地で３７℃で２４時間培養した後菌体を遠心分離によって集め、各菌体ペレットを、１０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む２．５ｍｌのＴＥバッファー（１０ｍＭトリスｐＨ８、０．１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁し、全体を３７℃で１時間培養する。次いで１０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含有する溶液１００μｌ、５００ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ８．０の溶液２５０μｌ、１０％のＳＤＳを含有する溶液５００μｌを加える。菌株の完全な細胞溶解を確実にするために、全体を６０℃で１時間培養する。混合物を冷却後２．５ｍｌのフェノール／クロロホルムを加え、Ｈｅｒａｅｕｓ遠心分離装置を用いて１０分間遠心分離して２相に分離し、上層を除去する。下層に含まれる染色体ＤＮＡを、２．５ｍｌの９６％エタノールを含む溶液を加えて沈殿し、混合物を穏やかに攪拌して沈殿を形成させる。沈殿したＤＮＡを木製の爪楊枝を使って除去し、１ｍｌのトリスバッファー（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌＲＮアーゼＡ）をいれた２ｍｌのエッペンドルフ管に集め、５６℃で１時間培養する。冷却後、ＤＮＡの様々な懸濁液を１ｍｌのフェノール／クロロフォルムを用いて上記の方法で抽出し、染色体ＤＮＡをエタノールで沈殿させる。このＤＮＡをＴＥバッファーを含むエッペンドルフ管内で再懸濁し、単離した各菌株の最終的なＤＮＡ量を２５０μｇ／ｍｌのオーダーとなるようにする。
【００５７】
単離した各菌株の１μｌの分量のＤＮＡを、配列番号：２及び配列番号：３（下記配列表参照）のそれぞれのヌクレオチド配列を有するプライマーを用いて、ベーリンガー社製のＰｗｏポリメラーゼを用いて３０サイクル（９５℃／３０秒、４０℃／３０秒及び７２℃／２分）のＰＣＲで増幅する。ＰＣＲ生成物はキアゲンキアクイックキット（ＱＵＩＡＧＥＮＱＵＩＡｑｕｉｃｋｋｉｔ）を用いて精製し、５０μｌのＴＥバッファーで溶出する。各生成物の試料２０μｌを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩと反応させ、１．６ｋｂの断片をアガロースゲル（１％）上で分離する。それらをキアゲンキアクイックキットを用いて精製し、予めＢａｍＨＩ及びＳａｌＩと反応させさらに脱リン酸した大腸菌ベクターｐＫ１９（Ｒ．Ｄ．Ｐｒｉｄｍｏｒｅ，Ｇｅｎｅ５６，３０９−３１２，１９８７）中にクローニングする。そしてコンピテント細胞大腸菌ＢＺ２３４株（バーゼル大学コレクション、スイス）を各ライゲーション生成物を用いて形質転換した。形質転換体を、５０μｌ／ｍｌのカナマイシン、３０ｎｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＰＴＧを含むＬＢ培地中で３７℃で選択する。形質転換体を含む白色のコロニーを、５０μｌ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地中で１０時間培養し、キアゲンキアクイックキットを用いてプラスミドＤＮＡを単離する。
【００５８】
各プラスミド（１ｐｍｏｌ／μｌ；単離した各菌株より抽出）の４μｌの試料を４μｌの標識したプライマーＩＲＤ−４１（配列決定プライマー：ＭＷＧＢｉｏｔｅｃｈ社）及び１７μｌの水と混合する。単離された４つの各菌株に対し、各６μｌを分配して２００μｌずつの４つのウエル（ｗｅｌｌ）とし、そこへ２μｌの反応液（Ａｍｅｒｓｈａｍ；ＲＰＮ２５３６）を加える。混合液を、ＨｙｂａｉｄＯｍｎ−Ｅシステムを用いて、９５℃／２分で１サイクル、その後９５℃／３０秒、５０℃／３０秒、７２℃／１分で２５サイクルのＰＣＲで増幅する。反応生成物は通常おこなわれるようにポリアクリルアミドゲルで分離し、それぞれの単離された株のＤＮＡ配列を読みとる。このような方法で配列決定されたＤＮＡ断片は、１６ＳリボソームＲＮＡのゲノムの１部を示している。
【００５９】
結果は、単離された全ての菌株が、以下に示す配列表に開示される配列番号１の配列に、近似しているか又は全く同一のヌクレオチド配列を有していることを示す。これらの配列は、ストレプトコッカス属に属する乳酸菌の種に見られる１６ＳリボソームＲＮＡ配列と多数の相同性を有し、このことから、これらの菌株はストレプトコッカス属に分類されることがわかる。
【００６０】
４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲルによる同定
テストは、欧州連合の主催によりベルギーのゲント大学で１９９４年９月１２日から１６日まで開催されたワークショップで、Ｐｏｔらによって発表された方法（細菌の分類と同定のためのフィンガープリンティング技法、全細胞タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理（Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｒｉｃａｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａ，ＳＤＳ−ＰＡＧＥｏｆｗｈｏｌｅｃｅｌｌｐｒｏｔｅｉｎ））に従って行われた。
【００６１】
簡単に述べると、乳酸菌株を培養する際には、１０ｍｌのＭＲＳ培地（Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ及びＳｈａｒｐｅ）に、予めＭＲＳで前培養した新規の新種の乳酸菌の各菌株を植える。また、対照として、できるだけ数多くのストレプトコッカス属の株も培養する。培養液を２８℃で２４時間培養し、次に新しいＭＲＳ−アガー培養液を入れたペトリ皿にまき、２８℃で２４時間培養する。
【００６２】
菌体のタンパク質を含む抽出物を調製するため、０．００８Ｍのリン酸二ナトリウム１２水和物（Ｎａ₂ＨＰＯ₄．１２Ｈ₂Ｏ）、０．００２Ｍのリン酸二ナトリウム２水和物（Ｎａ₂ＨＰＯ₄．２Ｈ₂Ｏ）及び８％の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含むｐＨ７．３のバッファーで、ＭＲＳ−アガー培地を覆う。ゲル化した培地の表面を掻き取って、菌体を回収し、ナイロンガーゼでろ過し、ＧＳＡローターを用いて９０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。ペレットを回収し、前記のバッファー１ｍｌ中にとる。ペレットは、遠心分離−洗い作業を繰り返して洗浄し、最終的に約５０ｍｇの細胞を回収し、それに同量のｐＨ６．８のＳＴＢバッファー（１０００ｍｌ当たり：０．７５ｇのトリス、５ｍｌのＣ₂Ｈ₆ＯＳ、５ｇのグリセロール）を加える。細胞は超音波（Ｌａｂｓｏｎｉｃ２０００）で破砕し、破片は遠心分離し、総タンパク質を含んでいる上清を保存しておく。
【００６３】
厚さ１．５ｍｍのＳＤＳ−ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ−Ｐｒｏｔｅａｎ又はＨｏｅｆｅｒＳＥ６００）を、分離用ゲル（高さ１２．６ｃｍ）の場合は１２％アクリルアミドで、及び濃縮用ゲル（１．４ｃｍ高さ）の場合には５％アクリルアミドで架橋し、あとは一般的な方法で調製する。そのため、２つのゲルの部品の重合は、ゲルの欠陥を出来るだけ少なくし、実験の再現性を最大にするために、特に１９℃の恒温漕の中で、それぞれ２４時間と１時間かけて行う。
【００６４】
次に各抽出物中のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲル上で分離する。そのため、色素が分離用ゲルの先端から９．５ｃｍの距離に到達するまで、２０レーンからなるそれぞれのプレートあたり６ｍＡを流す。次いでタンパク質をゲル上に固定し、染色し、セロファンの上で乾燥し、そのゲルをコンピューターにつないだデンシトメーター（ＬＴＢＵｌｔｒｏｓｃａｎＬａｓｅｒＤｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ、スエーデン）で数値化し、ＧｅｌＣｏｍｐａｒ^TMソフトウエアバージョン４．０（ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈｓ，Ｋｏｒｔｒｉｊｋ、ベルギー）を用いてそれぞれのパターンを互いに比較する。この試験法は充分に標準化されているので、あるライブラリーに含まれているストレプトコッカス属の様々な種から得られたパターンも、この数値比較の中で使用した。
【００６５】
得られた結果は、テストした新規な種に属する菌株の全てが、以下の種のいずれとも異なることを示す：Ｓ．アシドミニムスＳ．アジャセンス、Ｓ．アガラクティアエ、Ｓ．アラクトリティカス、Ｓ．アンギノサス、Ｓ．ボビス、Ｓ．カニス、Ｓ．カプリヌス、Ｓ．カッセリフラヴス、Ｓ．セコルム、Ｓ．コンステラツス、Ｓ．クレモリス、Ｓ．クリセツス、Ｓ．クリスタツス、Ｓ．デフェクティヴス、Ｓ．ディフィシーレ、Ｓ．ドウネイ、Ｓ．ディスガラクティアエｓｓｐ．ディスガラクティアエ、Ｓ．ディスガラクティアエ、ｓｓｐ．エクイシミリス、Ｓ．エクイ、Ｓ．エクイｓｓｐ．エクイ、Ｓ．エクイｓｓｐ．ズーエピデミクス、Ｓ．エクイヌス、Ｓ．フェーカリス、Ｓ．フェシウム、Ｓ．フェルス、Ｓ．ガリナルム、Ｓ．ガロリティクス、Ｓ．ガルヴィアエ、Ｓ．ゴルドニイ、Ｓ．ハンセニイ、Ｓ．ヒオインテスティナリス、Ｓ．ヒオヴァギナリス、Ｓ．イニアエ、Ｓ．インテルメディウス、Ｓ．インテスティナリス、Ｓ．ラクティス、Ｓ．ラクティスクレモリス、Ｓ．ラクティスディアセチラクティス、Ｓ．マカカエ、Ｓ．ミティス、Ｓ．モルビローラム、Ｓ．ミュータンス、Ｓ．オラリス、Ｓ．パラサンギニス、Ｓ．パラウベリス、Ｓ．パルヴラス、Ｓ．フォカエ、Ｓ．プランタールム、Ｓ．プレオモルファス、Ｓ．ニューモニアエ、Ｓ．ポルシヌス、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．ラフィノラクティス、Ｓ．ラッティ、Ｓ．サッカロリティクス、Ｓ．サリバリウス、Ｓ．サンギニス、Ｓ．シロイ、Ｓ．ソブリヌス、Ｓ．スイス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ソラルテンシス、Ｓ．ウベリス、Ｓ．ヴェスチブラリス及びＳ．ヴィリダンス。
【００６６】
全ての結果は、寄託した菌株間のピアーソン相関度が少なくとも８５であることを示す。１例として、Ｆｉｇ．１は、ピアーソン相関度のみでなく、１つの電気泳動ゲルの写真及び系統関係を樹状図形であらわしている（上部左側目盛りで示す）。菌株ＬＡＢ１５５０、ＬＡＢ１５５１及びＬＡＢ１５５３は、詳細には菌株ＣＮＣＭＩ−１９２１，Ｉ−１９２２，Ｉ−１９２５に関連している。菌株ＬＭＧ１５０６１及びＬＡＢ１６０７はＣＮＣＭに寄託されていないが、明らかにこの新規の種の１部を形成する。
【００６７】
即ち、単離された全ての菌株が１つの相同的グループの１部を形成しており、このグループはストレプトコッカス属に属する他の種とは異なるものである。
【００６８】
実施例２中温性／好熱性生物型
実施例１で単離された菌株のあるものは、新規な特別の生物型を表し、中温性及び好熱性の両者の顕著な性質を示す。
【００６９】
この性質は、（１）Ｍ−１７ラクトース培地中で２０−５０℃で同時にいくつかの中温性／好熱性生物型の株を培養し、（２）１６時間培養後、培地の５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、そして（３）吸光度を温度の関数として表すグラフ（グラジサーム）の形で結果をグループ分けすることにより、容易に調べることができる。
【００７０】
Ｆｉｇ．１は、菌株ＣＮＣＭＩ−１９２０について得られたグラジサームを表す。この特別の生物型に属する単離された他の全ての菌株、特に菌株Ｉ−１９２１及びＩ−１９２２も、似たようなグラジサームを与える。
【００７１】
実施例３組織化性生物型
実施例１で単離された菌株のなかには、著しく組織化するという顕著な性質を有するものがある。この性質は、ＢｏｈｌｉｎＶＯＲ回転レオメーター（ＢｏｈｌｉｎＧｍｂＨ社、独）を用いて測定した粘度の、流体力学的パラメーターを用いて調べることができる。
【００７２】
そのために、単離された菌株のあるものを、半脱脂乳中で３８℃でｐＨ５．２になるまで培養する。製造メーカーの指示書に従って、各培地の試料をプレートと同じ直径を有する先端を切り落としたコーン（直径；３０ｍｍ、角度；５．４度、すきま；０．１ｍｍ）の間に入れ、次いで試料を、連続回転するせん断速度勾配下に置いて、強制的に流動させる。そこで試料の粘度を、２９３ｓ^-1のせん断速度で測定する。単離されたいくつかの菌株について行われたこのレオロジーテストの結果は、このようにして発酵した培地が１００ｍＰａ．ｓより大きい粘度、或いは、菌株ＣＮＣＭＩ−１９２２、Ｉ−１９２３、Ｉ−１９２４、Ｉ−１９２５及びＩ−１９２６の場合には、２００ｍＰａ．ｓを超える粘度さえも有するということを示す。
【００７３】
比較のために数値をあげると、ラクトバチルスヘルヴェティクスＣＮＣＭＩ−１４４９、ストレプトコッカステルモフィラスＣＮＣＭＩ−１３５１、ストレプトコッカステルモフィラスＣＮＣＭＩ−１８７９、ストレプトコッカステルモフィラスＣＮＣＭＩ−１５９０、ラクトバチルスブルガリクスＣＮＣＭＩ−８００及びリュウコノストックメセンテロイデスｓｓｐ．クレモリスＣＮＣＭＩ−１６９２の菌株について、同じ条件下で、それぞれ５４、９４、１０４、１５８、１６５ｍＰａ．ｓのオーダーの粘度が得られる。これについては、特許出願ＥＰ６９９６８９、ＥＰ６３８６４２、ＥＰ９７１１１３７９．０、ＥＰ７５００４３、ＥＰ３６７９１８及びＥＰ９７２０１６２８．１にそれぞれ記載されている（菌株ＣＮＣＭＩ−８００及びＩ−１６９２については、高度に組織化する菌株であると言われている）。
【００７４】
実施例４新規なエクソポリサッカライド
実施例１で単離された組織化性生物型に属する菌株のうち、中でも特に菌株ＣＮＣＭＩ−１９２３、Ｉ−１９２４、Ｉ−１９２５及びＩ−１９２６は高分子量を有し、糖の組成が、ヒト母乳中のある種のオリゴサッカライドに見られる糖組成に類似した糖組成を有する、高分子量のＥＰＳを産生する。このポリサッカライドを構成する糖の分析は、以下のようにして行われる。
【００７５】
新種の菌株を、１０％の再調製スキムミルク中で、２規定の水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを５．５に保ちながら、３０℃で２４時間攪拌しながら培養する。菌細胞及びタンパク質は、培地に同容量の２５重量％トリクロロ酢酸溶液を加えて沈殿させ、遠心分離（１０，０００ｇ，１時間）して除去する。ＥＰＳは同容量のアセトンを加え、その後４℃で２０時間静置して沈殿させる。遠心分離してＥＰＳを回収し、ペレットを０．１ＭＮＨ₄ＨＣＯ₃溶液（ｐＨ７）に取り、その懸濁液を水で２４時間透析する。次いで不溶物質を超遠心分離で取り除き、精製したＥＰＳを含有する部分を凍結乾燥する。精製したＥＰＳの量は、グルコース等量のｍｇで表すと、培養液１リットルあたり４０ｍｇのオーダーになる。
【００７６】
ＥＰＳの分子量を、Ｓｔｉｎｇｅｌｅら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７８，１６８０−１６９０（１９９６）に記載されているように、ＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）につないだＳｕｐｅｒｏｓｅ−６カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーで定量した。結果は、菌株ＣＮＣＭＩ−１９２３、Ｉ−１９２４、Ｉ−１９２５及びＩ−１９２６のいずれも、２ｘ１０⁶Ｄａより大きいサイズのＥＰＳを産生することを示す。
【００７７】
１００ｍｇグルコース等量の精製したＥＰＳを、４規定のＴＦＡ中で１２５℃で１時間加水分解し、Ｎｅｅｓｅｒら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４２，５８−６７，１９８４）による記載の方法で、ＧＬＣクロマトグラフィーで分離し分析した。その結果、菌株は、グルコース、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンからなり、その平均の比率がそれぞれ、３：２：１であるＥＰＳを産生することを示す。
【００７８】
実施例５幼児用製品
トリプシンで１８％が加水分解されたホエーを、米国特許第５，０３９，５３２号で推奨されている方法に基づいて調製し、それを従来の熱気流中でのスプレードライ法で乾燥し、これに実施例４に記載の乾燥精製ＥＰＳを０．１から１０％の間で加えた。この製品は水中で迅速に液状化する。このことは、幼児用食品又は乳児用食品として特に好適である。なぜなら、その製品は牛乳に対して低アレルギー性でかつ寛容原性の性質を有する上に、炭水化物組成の観点からバランスがとれているからである。
【００７９】
実施例６幼児用製品
実施例４で得られた乾燥精製ＥＰＳを、０．５規定のトリフロロ酢酸（ＴＦＡ）溶液中で１００℃で３０−９０分間加水分解し、ＴＦＡを蒸発乾固した。加水分解物を水に懸濁し、３−１０単位の糖（６００から２０００Ｄａｌｔｏｎ）を有するオリゴサッカライドを限外ろ過で分離する。
【００８０】
トリプシンで１８％が加水分解されたホエーを、米国特許第５，０３９，５３２号で推奨されている方法に基づいて調製し、それを従来の熱気流中でのスプレードライ法で乾燥し、これに上記の精製オリゴサッカライドを０．１から１０％の間で加えた。この製品は水に迅速に溶解する。このことは、幼児用食品又は乳児用食品として特に好適である。なぜなら、その製品は牛乳に対して低アレルギー性でかつ寛容原性の性質を有する上に、炭水化物組成の観点からバランスがとれているからである。
【００８１】
実施例７医薬用製品
ゼラチンと水で作られたカプセルの形の中に、実施例４の精製ＥＰＳ又は実施例６のオリゴサッカライド５−５０ｍｇを入れた医薬用組成物を調製した。
【００８２】
実施例８医薬用製品
凍結乾燥菌株ＣＮＣＭＩ−１９２４の培養物から成る錠剤を調製し、次いで好適な結合剤と共に圧縮する。この錠剤は、乳酸菌の腸内細菌叢の回復に、また必須複合炭水化物と云われるバランスのよい食品として応えるのに、特に推奨される。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｆｉｇ．１は、新種の数菌株について総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲル上で泳動して得られたパターンを、ストレプトコッカステルモフィルス株について得られたパターンと比較した写真である。それらの菌株の系統関係の度合いは、タンパク質パターンの反対側のピアソン相関目盛りのついた樹形図として示す。（５５から１００のピアソン相関度が示されている。）
【図２】Ｆｉｇ．２は、菌株ＣＮＣＭＩ−１９２０について得られたグラジサームを示す。
【配列表】

Claims

ストレプトコッカス属ＣＮＣＭＩ−１９２０、Ｉ−１９２１、Ｉ−１９２２、Ｉ−１９２３、Ｉ−１９２４、Ｉ−１９２５、及びＩ−１９２６菌株より選ばれる、乳酸菌株。
食品用組成物の調製のための、請求項１に記載の乳酸菌株の使用。
食品用組成物が、酸性化乳製品である、請求項２に記載の乳酸菌株の使用。
食品用組成物の調製のための、請求項１記載のストレプトコッカス属ＣＮＣＭＩ−１９２３、Ｉ−１９２４、Ｉ−１９２５、及びＩ−１９２６菌株より選ばれる乳酸菌株によって分泌されるポリサッカライドの使用。
幼児用食品の調製のための、請求項４記載の使用。
請求項１に記載の乳酸菌株を含有する、食品用組成物。
ストレプトコッカス属ＣＮＣＭＩ−１９２４菌株によって分泌され、構成糖比がそれぞれ３：２：１のグルコース、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンからなるエクソポリサッカライドを含有する、食品用組成物。
請求項７に記載のポリサッカライドの加水分解により得られる、３から１０単位の糖を有するオリゴサッカライドの混合物を含有する、食品用組成物。
組成物が幼児用組成物であることを特徴とする、請求項７又は８に記載の組成物。
組成物が低アレルギー性幼児用組成物である、請求項９に記載の組成物。
ストレプトコッカス属ＣＮＣＭＩ−１９２４菌株によって分泌され、構成糖比がそれぞれ３：２：１のグルコース、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンからなるエクソポリサッカライド。