JP4401288B2 - ヨモギ花粉由来のアレルゲン - Google Patents

Description

雑草、特に、極めて広範な植物の系統であるキク科（ＣｏｍｐｏｓｉｔａｅまたはＡｓｔｅｒａｃｅａｅ）に属する雑草に由来する花粉の粒子は、世界中で一般的なアレルゲンの供給源である。この系統における３つの最も重要な風媒受粉の属は、ブタクサ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ）（ブタクサ）、パルテニウム属（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）（ナツシロギク）、およびヨモギ属（学名：Ａｒｔｅｍｉｓｉａｖｕｌｇａｒｉｓ）（ヨモギ）である。晩夏および秋には、ヨモギの花粉は、中央ヨーロッパおよびアジアの一部においてアレルギー反応を引き起こす主な原因の１つである（Ｊ．Ｃｈａｒｐｉｎ，Ｒ．Ｓｕｒｉｎｙａｃｈ、およびＡ．Ｗ．Ｆｒａｎｋｌａｎｄ（１９７４）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ Ｐｏｌｌｅｎｓ（Ｐａｒｉｓ：Ｓａｎｄｏｚ））。花粉症に罹患している患者の約１０％が、ヨモギ花粉に感作されている。ブタクサ花粉は、米国およびカナダにおいてアレルギー性タンパク質の主な供給源であり、アトピー性の個体において約５０％の蔓延率である（Ｌ．Ｐ．Ｂｏｕｌｅｔ，Ｈ．Ｔｕｒｃｏｔｔｅ，Ｃ．Ｌａｐｒｉｓｅ，Ｃ．Ｌａｖｅｒｔｕ，Ｐ．Ｍ．Ｂｅｄａｒｄ，Ａ．Ｌａｖｏｉｅ、およびＪ．Ｈｅｂｅｒｔ（１９９７）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｄｅｇｒｅｅ ａｎｄ ｔｙｐｅ ｏｆ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎｄｏｏｒ ａｎｄ ｏｕｔｄｏｏｒ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｉｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｗｉｔｈ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｉｔｉｓ ａｎｄ／ｏｒ ａｓｔｈｍａ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ ２７，５２）。欧州では、ブタクサアレルギーは、花粉症の主な原因ではないが、急速に増大している。ブタクサは、前世紀の初めに欧州に最初に広がり、ハンガリーに限られていた。第二次世界大戦中、ブタクサはフランスに広がり、その後徐々に拡大して現在ではフランスのローヌ渓谷、北イタリア、オーストリア東部、ハンガリーおよびブルガリアにおいて繁茂している（Ｇ．Ｄ’Ａｍａｔｏ、Ｆ．Ｔ．Ｓｐｉｅｋｓｍａ、Ｇ．Ｌｉｃｃａｒｄｉ、Ｓ．Ｊａｇｅｒ、Ｍ．Ｒｕｓｓｏ、Ｋ．Ｋｏｎｔｏｕ−Ｆｉｌｉ、Ｈ．Ｎｉｋｋｅｌｓ、Ｂ．Ｗｕｔｈｒｉｃｈ、およびＳ．Ｂｏｎｉｎｉ（１９９８）Ｐｏｌｌｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｌｌｅｒｇｙ ｉｎ Ｅｕｒｏｐｅ．Ａｌｌｅｒｇｙ ５３，５６７）。

今日では、組み換えアレルゲンが、Ｉ型アレルギーの診断および治療のための有望なツールであると広く認められている。診断のためのこれら分子の価値が詳細に評価されており、組み換えアレルゲンのパネルは、樹木（カバノキ）の花粉および草の花粉のアレルギーを含み、特定の吸入アレルギーの慣用的な診断に既に利用可能である（Ｒ．Ｖａｌｅｎｔａら（１９９２）Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９７，２８７；Ｏ．ＳｃｈｅｉｎｅｒおよびＤ．Ｋｒａｆｔ（１９９５）Ａｌｌｅｒｇｙ ５０，３８４；Ｄ．Ｋｒａｆｔら（１９９８）Ａｌｌｅｒｇｙ ５３，６２；Ｄ．Ｋｒａｆｔら（１９９９）Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１８，１７１）が、雑草の花粉のアレルギーについてはまだ利用可能でない。抗原Ｅ（Ａｍｂ ａ １）および抗原Ｋ（Ａｍｂ ａ ２）として公知のブタクサ花粉の２つの主なアレルギー性化合物が特徴づけられ、約３８，０００Ｄａの酸性タンパク質であることが示された（Ｔ．Ｐ．Ｋｉｎｇ（１９８０）Ａｌｌｅｒｇｙ ３５，１８７）。Ａｍｂ ａ １およびＡｍｂ ａ ２のｃＤＮＡクローニングによって、これらのアレルゲンは互いに高度に相同であり、ペクチン酸リアーゼタンパク質のファミリーに属することが明らかになった（Ｔ．Ｒａｆｎａｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６６，１２２９；Ｂ．Ｌ．Ｒｏｇｅｒｓら（１９９１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７，２５４７）。現在、いずれのヨモギ花粉アレルゲンに関しても、完全な構造についての情報も、分子クローニングのデータも公表されていない。Ａｒｔ ｖ １と命名されたヨモギ花粉アレルゲンが唯一の例外であり、これはＷＯ９９／４９０４５に開示されている。Ａｒｔ ｖ １は、Ａｍｂ ａ １にも、他のいずれの特徴付けが行われたブタクサアレルゲンにも関係しない。いくつかの報告では、ブタクサおよびヨモギの花粉が共通のアレルゲン構造を共有する、すなわち、異なるアレルゲン供給源において交差反応性ＩｇＥ抗体によって認識される抗原を共有するということが実証されている（Ｃ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら（１９９３）Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９２，６６０；Ｒ．Ｈｉｒｓｃｈｗｅｈｒら（１９９８）Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０１，１９６；Ｈ．Ｓ．Ｐａｒｋら（１９９４）Ｊ Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ９，２１３）。このような共通の抗原のＩｇＥ認識は、異なるアレルゲン供給源との接触後に感作された患者においてアレルギー反応を誘発する。従って、ヨモギ花粉アレルゲンの特徴付けおよびブタクサ花粉における共通のアレルゲン構造を同定することにより、雑草の花粉アレルギーの診断および治療に十分な組み換えアレルゲンの選択および生成のための基本的な情報が得られるであろう。

従って、本発明の目的は、Ｉ型アレルギーを誘発するヨモギ花粉由来のアレルゲンを同定することである。

本発明者らは、４０．９ｋＤａのヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の花粉アレルゲンに相当する４つの真の（ｂｏｎａ ｆｉｄｅ）かつ完全なｃＤＮＡクローンを単離することに成功した。新規な４０．９ｋＤａのヨモギ花粉アレルゲンのアミノ酸配列を配列番号１に示す。

従って、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。好ましくは、このポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８５％の同一性、さらになお好ましくは少なくとも９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、該ポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。本明細書において用いる場合、ポリペプチドという用語は、少なくとも７個のアミノ酸長を有するタンパク質および／またはペプチドをいう。

配列番号１に対するアミノ酸配列の同一性の程度は、ＢＬＡＳＴ ２ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ（ｂｌａｓｔｐ）（Ｔａｔｕｓｏｖａら（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｌｅｔｔ．１７４，２４７〜２５０）というプログラムを用いて、該アミノ酸配列と配列番号１を比較することによって決定される。ここで用いられるパラメーターは次のとおりである：マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）ＢＬＯＳＵＭ６２；オープンギャップ（Ｏｐｅｎ ｇａｐ） １１およびエクステンションギャップ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ）１ペナルティー（ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）；ギャップ（ｇａｐ）ｘ＿ドロップオフ（ｄｒｏｐｏｆｆ）５０；期待値 １０．０ ワードサイズ（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）３；フィルター（Ｆｉｌｔｅｒ）：なし。本発明によれば、この配列比較は少なくとも１００アミノ酸、好ましくは少なくとも２００アミノ酸、より好ましくは少なくとも３００アミノ酸、最も好ましくは少なくとも３５０アミノ酸をカバーする。

本発明はさらに、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも１８個のアミノ酸のフラグメントを含むポリペプチドに関する。このようなポリペプチドは、配列番号１に示される配列の少なくとも１８個が連続するアミノ酸を含む。好ましくは、このフラグメントの長さは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも２１個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも２５個のアミノ酸、なおさらに好ましくは少なくとも３５個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸である。

本発明の別の実施形態は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも７個のアミノ酸のフラグメントからなるポリペプチドである。好ましくは、このポリペプチドの長さは、少なくとも１０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸、なおさらに好ましくは少なくとも２５個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも３５個のアミノ酸である。さらなる実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列由来の少なくとも８個または少なくとも９個または少なくとも１１個または少なくとも１２個または少なくとも１３個または少なくとも１４個または少なくとも１８個または少なくとも２１個または少なくとも３０個連続するアミノ酸からなる。さらなる実施形態では、このポリペプチドの長さは、１００または５０または３０個のアミノ酸以下である。少なくとも７個のアミノ酸からなるポリペプチドは、Ｔ細胞（Ｔ細胞エピトープ）によって認識され得る。

本発明のなお別の実施形態は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のフラグメントであってヨモギ花粉に対してアレルギー性である個体由来のＩｇＥ抗体に結合し得るフラグメントを含むポリペプチオｄであるが、「ＩｇＥ抗体」という用語は、それ自体公知のプロセスによって獲得可能である抗体調製物を意味する。感受性のヒトにおいては、アレルゲンに対する曝露は、以下のような二段階の即時型（ＩｇＥ媒介性）のアレルギー性応答をもたらす：
（１）第一の曝露の際、アレルゲン性のタンパク質は、Ｂ細胞によるＩｇＥ合成を誘導する（ＶｅｒｃｅｌｌｉおよびＧｅｈａ，１９８９，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７５〜８３）。次いで、これらの特異的ＩｇＥ抗体が、高親和性Ｆｃεレセプター（ＦｃεＲＩ）を介して肥満細胞および好塩基球の表面に結合する。
（２）その後の曝露の際、アレルゲンは、これらの特異的ＩｇＥ抗体に結合し架橋して、これが、予め形成された、そして新規に合成された炎症性メディエーター（例えば、ヒスタミン）および走化性物質（例えば、血小板活性化因子）の放出をもたらす。
（１）の段階では、Ｂリンパ球によるアレルゲン特異的ＩｇＥの産生には、アレルゲンの直鎖状ペプチドフラグメントによって活性化される、Ｔリンパ球の「補助（ｈｅｌｐ）」が必要である（Ｖｅｒｃｅｌｌｉ ａｎｄ Ｇｅｈａ，１９８９，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７５〜８３）。これらのペプチドは、抗原のプロセシングを通じて抗原提示細胞によって作製されて、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の分子とともに細胞表面に提示されて、ここでＴ細胞レセプターに対する認識および結合が可能になる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，１９８５，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：２３７〜２５５；Ｒｏｔｈｂａｒｔら，１９８９．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：４７９〜４８６）。（２）の段階では、Ｂ細胞によって生成されたアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体は循環して、肥満細胞および好塩基球上のＦｃεＲＩレセプターに結合し、それによって、このアレルゲンについてのレセプターとして働く。これらの細胞表面結合したＩｇＥ抗体のアレルゲンによる架橋は、予め形成された、そして新規に合成された炎症性メディエーターおよび走化性物質の放出のためのシグナルであって、代表的なアレルギー性の炎症反応をもたらす。

ヨモギ花粉に対してアレルギー性である個体とは、ヨモギ花粉タンパク質を認識する特異的ＩｇＥ抗体を示し、かつヨモギ花粉に暴露された場合、代表的なアレルギー性症状（ＩｇＥ媒介性）を有する個体である。このようなアレルギー性反応はまた、他のアレルゲン供給源に存在する相同な抗原に対する曝露によっても誘発され得る。この現象は、交差反応性として定義される。ヨモギ花粉に対してアレルギー性の患者の選択は、代表的な病歴、皮膚プリック試験陽性、および放射性アレルギー吸着試験「ＲＡＳＴ」の数値が３．５を上回ることに従って行なった。

ポリペプチドは、抗体に対するその親和性が、その抗体に結合しない対照組成物の親和性よりも有意に高い場合、その抗体に結合し得る。特定のポリペプチドまたはアレルゲンに対する特定のＩｇＥ抗体の結合は、アレルゲン特異的ＩｇＧ抗体を示さない健常な非アレルギー性の個体（病歴、皮膚プリック試験陰性、ＲＡＳＴ陰性による）由来の血清を対照として用いて、種々の方法、例えば、ＲＡＳＴ、イムノブロット、ＥＬＩＳＡによって決定され得る。

本発明の１つの実施形態において、このポリペプチドは、ブタクサ花粉に対してアレルギー性である個体由来のＩｇＥ抗体に結合し得る。本発明によって、ヨモギ花粉およびブタクサ花粉に共通なアレルゲン構造を同定することが可能になる。この情報は、雑草の花粉のアレルギーの診断および治療に十分である組み換えアレルゲンの選択および作成のために有用である。このような共通のアレルゲン構造を含むペプチドおよびポリペプチドは、本発明に包含される。

天然のＡｍｂ ａ １の精製の間、トリプシン様花粉プロテアーゼがこのアレルゲンを切断する。従って、精製によってしばしば、全長の３８ｋＤａアレルゲンに加えて、それぞれα（アミノ酸１８７〜３９６であって、番号付けにはシグナルペプチドを含む）およびβ（アミノ酸４３〜１８０であって、番号付けにはシグナルペプチドを含む）と命名された２６ｋＤａおよび１２ｋＤａの分子量の２つのフラグメントの単離が生じる。全ての鎖はやはり、ポリクローナルのウサギ抗体およびアレルギー患者由来のヒトＩｇＥと高度に反応性を有する。これらの鎖に相当する天然の４０．９ｋＤａのヨモギアレルゲンのタンパク質分解性フラグメントはまた、アレルギー患者由来のＩｇＥ抗体に結合することが予測される。β鎖に相当する最初の方は、アミノ酸２１〜１８０にまたがり、そしてα鎖に相当する二番目のものは、アミノ酸１８１〜３９６にまたがる。なおこの番号付けは両方とも配列番号１を参照のこと。両方の鎖ともＡｍｂ ａ １鎖にも存在するエピトープを有することが予測され、結果同じＩｇＥ反応性が生じる。本発明は、配列番号１に示されるような配列のフラグメントで、配列番号１に示される配列のアミノ酸２１〜１８０または１８１〜３９６からなるフラグメントを含むポリペプチドに関する。

１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ酸配列ＬＥＮＧＡＩＦＶＡＳＧ（配列番号１０）からなるポリペプチドではない。

好ましい実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり、すなわち、それらは、実質的に純粋な形態である。「実質的に純粋（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ）」とは、他の化合物からのポリペプチドの分離によって、このポリペプチドが少なくとも７５％純粋、好ましくは少なくとも９０％純粋、さらに好ましくは少なくとも９５％純粋であることを意味する。ポリペプチドの純度は、当該分野で公知の技術、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後のタンパク質染色により、当業者によって求めることができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および質量分析法は、ポリペプチドおよび同様に短いペプチドを解析するために適切な方法である。

本発明のポリペプチドは、種々の方法において調製され得る。ポリペプチドは、化学合成によって、好ましくは固相法を適用することによって調製され得る。化学的ペプチド合成の方法は、当業者に公知である（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９，１９６３；Ｓｔｅｗａｒｔら．，「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（第二版），Ｐｅａｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，１９８４、ならびにＢａｙｅｒおよびＲａｐｐ Ｃｈｅｍ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．３：３（１９８６）；ならびにＡｔｈｅｒｔｏｎら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９を参照のこと）。これらの方法は、７〜５０個のアミノ酸長を有する短いポリペプチドの調製に特に適切である。さらに長いポリペプチドは、化学合成によって調製されたペプチドフラグメントを、化学的にまたは酵素的に連結することによって調製され得る。本発明のポリペプチドはまた、宿主細胞におけるＤＮＡ配列の発現によって調製され得る。これらの方法は、以下にさらに詳細に記載される。

本発明はまた、種々のポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ分子であっても、ＲＮＡ分子であっても、またはそれに由来する核酸であってもよい。第一の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるようなアミノ酸をコードする。遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列をコードする多くの異なるポリヌクレオチドが、予想され得る。
第二の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、上記の本発明によるポリペプチドをコードする。

本明細書に記載されるポリヌクレオチドを用いて、任意の種々のタイプのヨモギにおいて同様な配列を同定し、例えば、ヨモギ花粉由来のＤＮＡにハイブリダイズするのに十分な相同性を有する配列を同定または単離することができる。これは、例えば、低ストリンジェントの条件下で実行できる；十分な相同性（ホモロジー）（一般には４０％を上回る）を有するそれらの配列を、さらなる評価のために選択し得る。あるいは、高ストリンジェントな条件を用いることができる。概して高ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨで、特定の配列についての融点（Ｔ_Ｍ）よりも約５℃〜約１０℃低いように選択される。Ｔ_Ｍとは、標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブに（規定のイオン強度およびｐＨのもとで）ハイブリダイズする温度である。代表的な高ストリンジェントな条件とは、塩濃度がｐＨ７で約１５ｍＭのＮａ^＋（０．１×ＳＳＣ）までであり、かつ温度が少なくとも約６０℃という条件である。

この様式では、本発明のＤＮＡを用いて、他のタイプの雑草花粉において、本明細書に記載の４０．９ｋＤａのタンパク質のアミノ酸配列と同様のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする配列を同定すること、そして、このような他のタイプの雑草花粉においてアレルゲンを同定することが可能である。従って、本発明は、４０．９ｋＤａのタンパク質および本発明のＤＮＡ配列によってコードされる他のヨモギアレルゲンを含むだけでなく、本発明のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる他の雑草花粉のアレルゲンも包含する。

従って、第三の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。好ましくは、この同一性は、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である。配列番号２に対するポリヌクレオチド配列の同一性の程度は、「ＢＬＡＳＴ ２ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ（ｂｌａｓｔｎ）」（Ｔａｔｕｓｏｖａら（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｌｅｔｔ．１７４，２４７〜２５０）というプログラムを用いて、このポリヌクレオチド配列および配列番号２を比較することによって決定されたが、これには以下のパラメーターを用いた：マッチのリワード（Ｒｅｗａｒｄ）１；ミスマッチのペナルティー（Ｐｅｎａｌｔｙ）−２；オープンギャップ（Ｏｐｅｎ ｇａｐ）５およびエクステンションギャップ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ）２ペナルティー（ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）；ギャップ（ｇａｐ）ｘ＿ドロップオフ（ｄｒｏｐｏｆｆ）５０；期待値 １０．０ ワードサイズ（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）１１；フィルター（Ｆｉｌｔｅｒ）：なし。本発明によれば、この配列比較は少なくとも、３００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも６００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも９００ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１１００ヌクレオチドをカバーする。

１つの実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列または配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３に示される配列の少なくとも１００、好ましくは少なくとも３００、より好ましくは少なくとも６００、最も好ましくは少なくとも１０００の連続するヌクレオチドを含む。

本発明はまた、上記のポリヌクレオチドに縮重されるポリヌクレオチドを包含する。開示されたポリヌクレオチドのそれぞれの相補鎖は、本発明に包含される。

本発明のポリヌクレオチドは好ましくは単離されたポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは好ましくは、実質的に純粋であり、すなわち、それらは、少なくとも８０％純粋、より好ましくは少なくとも９０％純粋、最も好ましくは少なくとも９５％純粋である。本発明によるポリヌクレオチドは、種々の方法で調製できる（例えば、ＧｌｉｃｋおよびＰａｓｔｅｒｎａｃｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．１９９４；Ｉｔａｋｕｒａら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３〜５６，１９８４およびＣｌｉｍｉｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６３３〜７，１９９０を参照のこと）。それらは、オリゴヌクレオチド合成に通常使用される化学的方法によって合成され得る。ＰＣＲに基づく方法が、ポリヌクレオチド、詳細には長いポリヌクレオチドを合成するために用い得ることができる（例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ １９９７；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．ら．ＰＣＲ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１巻および２巻，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ １９９６を参照のこと）。また、化学的方法を用いて合成されたフラグメントを化学的にまたは酵素的に連結することによって、さらに長いポリヌクレオチドを調製してもよい。

本発明の別の実施形態は、本発明によるポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクターである。このプラスミドは、プラスミドの複製、またはコードされた配列の転写および／もしくは翻訳を容易にする調節配列を含んでもよい。そのような配列としては、プロモーター、ターミネーター配列などが挙げられる。このプラスミドはまた、宿主細胞における発現の際にコードされたポリペプチドの精製を容易にするアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。このような配列の例は、６×Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、およびＧＳＴのような細菌タンパク質をコードする配列である。精製は、それぞれのタグ配列または細菌の配列に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって達成され得る。このようなタグ配列または細菌配列を含むプラスミドおよびベクターは、当業者に公知である。

本発明はさらに、本発明によるプラスミドまたはベクターおよび／またはポリヌクレオチドを含む細胞に関する。この細胞は、植物細胞、細菌細胞、酵母細胞および他の細胞から選択され得る。本発明のポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子の発現を可能にする細胞が好ましい。最も好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。本発明によるプラスミド、ベクターおよび／またはポリヌクレオチドは、それ自体公知の技術、例えば、形質転換、トランスフェクションなどによって細胞に導入されてもよい。この細胞は、それらのゲノムに単に一過性にまたは安定に組み込まれる核酸分子を含んでもよい。詳細には後者の場合、核酸分子は、ゲノムへの取り込みのプロセスに起因して短縮されても、または断片化されてもよい。核酸分子のこのような短縮されるかまたは断片化されたバージョンを含む細胞は、本発明の範囲内である。

この細胞は、本発明のポリペプチドの発現および精製のために用いることができる。従って、本発明は、本発明によるポリペプチドの調製のためのプロセスに関しており、このプロセスは、ポリペプチドの発現に適切な条件下で本発明に記載された細胞を培養する工程と、必要に応じてこのポリペプチドを引き続いて回収する工程とを包含する。細胞は好ましくは、撹拌しながら液体培地中で培養される。必要に応じて、遺伝子発現は、誘導剤、例えばＩＰＴＧによって誘導される。クローニングされたＤＮＡ分子を操作して、種々の宿主細胞に外因性のＤＮＡを導入するための技術、これらの宿主を形質転換するための技術、およびその中にクローニングされた外来のＤＮＡ配列を発現するための技術は、当該分野で周知であって、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９；ならびにＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７に開示されている。

培養後、細胞は、確立された方法を用いて開口されてもよく、そしてこのポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーによって回収され得る。タンパク質精製の他の公知の方法を使用してもよい。例示的な精製工程としては、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除クロマトグラフィー、ＦＰＬＣおよび逆相高速液体クロマトグラフィーを挙げることができる。適切なクロマトグラフィー媒体としては、デキストラン誘導体、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカなどが挙げられる。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー工程を包含する方法によって単離される。この実施形態によれば、本発明のポリペプチドに対する１つ以上の抗体は、固体支持体に固定されてもよい。好ましくは、この抗体は、本発明のポリペプチドを特異的に認識する。抗体分子を支持媒体に結合するための方法は当該分野で周知である。特定の方法の選択は、慣用的な設計の問題であって、部分的には、選択された支持体の特性によって決定される。

別の方法として、固定された金属イオン吸着クロマトグラフィーは、高ヒスチジンタンパク質（ポリヒスチジンタグ含有タンパク質を含む）を精製するために用いられ得る。要するに、ゲルは、キレートを形成するよう二価の金属イオンで最初に荷電される。高ヒスチジンタンパク質は、用いられた金属イオンに依存して、異なる親和性を有するこのマトリックスに吸着されて、競合的溶出、ｐＨを低下すること、または強力なキレート剤の使用によって溶出される。本発明のさらなる実施形態内で、目的のポリペプチドおよびアフィニティータグの融合を構築して、精製を容易にしてもよい。融合タンパク質は、その融合タンパク質の各々の成分を調製することおよびそれらを化学的に結合させることによって、当業者に公知の方法によって調製され得る。あるいは、融合タンパク質の両方の成分を適切な読み枠でコードするポリヌクレオチドは、公知の技術を用いて生成することができ、本明細書に記載の方法によって発現されてもよい。タンパク質精製の方法は、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９０；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ １９９４；Ｄｏｏｎａｎ，Ｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９６に記載されている。

本発明のポリペプチドは、例えば、「精製された」アレルゲンとして用い得ることができる。このような精製されたアレルゲンは、ブタクサアレルギーの診断および治療のための重要な試薬である、アレルゲン抽出物の標準化において有用である。さらに、配列番号１に示されるアミノ酸配列のフラグメントに基づくペプチドを用いることによって、標準的な方法を用いて抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体を作製することができる。本発明の４０．９ｋＤａのタンパク質に対するこれらの血清またはモノクローナル抗体は、アレルゲン抽出物を標準化するために用いることができる。

本発明の別の実施形態は、本発明によるポリペプチドに結合し得る抗体である。この抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。本発明のポリペプチドに対する抗体は、公知の方法で調製できる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ １９８８「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。特定の実施形態では、抗体は、実質的に純粋な形態、すなわち、少なくとも８０％純粋、好ましくは少なくとも９０％純粋である。ポリクローナル抗体の場合、この抗体組成物は、多くの異なる種の抗体分子を含む。

抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的であってもよい。この実施形態では、この抗体は、ブタクサ花粉由来のポリペプチドＡｍｂ ａＩ．１、Ａｍｂ ａ Ｉ．２、Ａｍｂ ａ Ｉ．３およびＡｍｂ ａ ２のいずれにも結合しない。

しかし、別の実施形態では、この抗体は、ブタクサ花粉由来のポリペプチドＡｍｂ ａＩ．１、Ａｍｂ ａ Ｉ．２、Ａｍｂ ａ Ｉ．３およびＡｍｂ ａ ２の１つまたは数個（例えば、２個、３個または４個）に結合し得る。

本発明による抗体は、ヨモギアレルゲンのさらなる成分を単離するために用いることができ、このファミリーのアレルゲンの特徴をさらに定義するために使用することができる。さらに、本発明のポリペプチドに対する抗ペプチド血清またはモノクローナル抗体を用いて、皮膚試験試薬の内容物を標準化および規定することができる。

本発明はさらに、本発明によるポリペプチド、および／またはポリヌクレオチド、および／または抗体を含む医薬組成物に関する。

本明細書において記載される物質、およびこれらの物質を含む組成物は、ヨモギアレルギーを診断、治療および予防するための方法において用いることができ得る。従って、本発明の別の実施形態は、アレルギー障害の治療または予防または診断のための医薬調製のための、本発明によるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドおよび／または抗体の使用である。

この医薬は好ましくは、脱感作されるべき個体に投与される。

本発明のポリペプチドを使用することによって、一貫した、明確に定義された組成物および生物学的活性のアレルゲン調製物を、作製することができ、治療目的で投与することができる（例えば、ヨモギ花粉に対するヨモギ感受性個体のアレルギー応答を緩和するため）。このようなポリペプチドまたはその改変バージョンは、例えば、ヨモギアレルゲンに対するＢ細胞応答、ヨモギアレルゲンに対するＴ細胞応答、またはその両方の応答を緩和することができる。また、精製されたアレルゲンを用いて、未改変の天然に存在するペプチドよりも免疫療法に有用である改変誘導体またはアナログを設計することもできる。

高用量のアレルゲンは一般に、最大の症状緩和をもたらす。しかし、このアレルゲンに対するアレルギー反応のせいで、多くの人は高用量のアレルゲンには耐えられない。天然に存在するアレルゲンの改変は、改変ポリペプチドが生成され、対応する天然に存在するアレルゲンと同じかまたは増強した治療特性を有するが、副作用が低下した、特にアナフィラキシー反応の低下が生じ得るような様式で設計され得る。これらは、例えば、本発明のポリペプチドまたは改変アナログであってもよい（例えば、ポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が変更されて免疫原性が改変されているか、および／またはアレルゲン性が減少されるか、または同じ目的で、ある成分が添加されている、ポリペプチド）。例えば、ポリペプチドは、Ａ．Ｓｅｈｏｎおよび共同研究者らによるポリエチレングリコール法を用いて改変されてもよい。ポリペプチド配列の短いセグメントの欠失またはアミノ酸の置換によって、弱体化した（さらに弱いかまたは全くない）抗体結合が生じる。この改変によって、低いＩｇＥ結合がもたらされ、またこの改変は副作用がさらに弱いために免疫治療に極めて有用である。

脱感作されるべき個体への本発明のペプチドの投与は、公知の技術を用いて実施できる。ペプチドまたは異なるペプチドの組み合わせを、例えば適切な緩衝液、担体および／またはアジュバントを含む組成物中で、個体に投与してもよい。このような組成物は一般に、注射、経口投与、吸入、経皮塗布または直腸投与によって投与される。十分な量でヨモギ感受性の個体に投与された場合、ヨモギアレルゲンに対するその個体のアレルギー性応答を改変するヨモギ花粉ポリペプチドを、現在利用可能な構造的情報を用いて設計することができる。これは、例えば、ヨモギタンパク質の構造を調べること、ヨモギ感受性個体においてＢ細胞および／またはＴ細胞の応答に影響する能力について試験されるべきペプチドを生成すること、および該細胞によって認識される適切なエピトープを選択することによって行なうことができる。このエピトープのアミノ酸配列を模倣し、ヨモギアレルゲンに対するアレルギー性応答を下方制御し得る合成アミノ酸配列もまた用いることができる。

本発明のポリペプチドまたは抗体は、ヨモギアレルギーを検出および診断するためにも用いることもできる。例えば、ヨモギアレルゲンに対する感受性について評価されるべき個体から得られた血液または血液産物と、ヨモギ花粉の単離されたアレルギー性ペプチドとを、血液中の成分（例えば、抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）と該ポリペプチドとの結合について適切な条件下で混合すること、およびこのような結合が生じる程度を決定することによってである。

ヨモギ感受性個体においてヨモギアレルゲンがアレルギー反応を誘導する能力をブロックまたは阻害することができる試薬または薬物を設計することもいまや可能である。このような試薬は、例えば、抗ヨモギＩｇＥに対して結合し、これによってＩｇＥアレルゲン結合とそれに続く肥満細胞の脱顆粒を防止するに設計することができる。あるいは、このような試薬は、免疫系の細胞成分に結合して、ヨモギアレルゲンに対するアレルギー性応答の抑制または脱感作をもたらす。これの非限定的な例は、ヨモギアレルゲンに対するアレルギー応答を抑制するための本発明のｃＤＮＡ／ポリペプチド構造に基づく、適切なＢ細胞およびＴ細胞エピトープペプチド、またはその改変物の使用である。これは、ヨモギ感受性個体由来の血液細胞を用いたインビトロ研究において、Ｂ細胞およびＴ細胞の機能に影響するＢ細胞およびＴ細胞のエピトープペプチドの構造を規定することによって実行できる。

最後に、本発明は、本発明によるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドおよび／または抗体を含む、アレルギー疾患の診断、治療および／または予防のために有用であるキットに関する。本明細書に記載の物質、ならびにこれらの物質を含む組成物およびキットは、ヨモギアレルギーを診断、治療および予防する方法において用いることができる。

本発明は、ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ）花粉の主なアレルゲンであるＡｍｂ ａ １に対して配列相同性を示す４０．９ｋＤａのヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）花粉アレルゲンをコードする組み換えＤＮＡ分子およびそのフラグメントに、またＡｒｔ ｖ１分子またはそのフラグメントの単離のための方法に、ならびに本発明の核酸配列を発現するように形質転換された発現ベクターおよび宿主細胞に基づく。本発明はさらに、雑草花粉のアレルギー患者の診断および治療の方法に関する。上記４０．９ｋＤａのヨモギアレルゲンは、Ａｍｂ ａ １に対する配列相同性を示すので、このヨモギタンパク質は、交差反応性アレルゲンであり得、ヨモギ花粉アレルギーだけでなく雑草花粉アレルギー一般の診断および治療のために使用できる可能性がある。

本出願は、４０．９ｋＤａのヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）花粉アレルゲンに相当する４つの真の（ｂｏｎａ ｆｉｄｅ）かつ完全なｃＤＮＡクローンの単離を記載している。このｃＤＮＡヌクレオチド配列、ならびに派生するクローンＭ４、Ｍ６およびＭ１５のアミノ酸配列は同一であった（図１および２を参照のこと）。クローンＭ８は、他のクローンとは８ヌクレオチド置換、異なるが、これはアミノ酸交換をもたらさなかった（図３を参照のこと）。該クローンは、代表的な真核生物の場合の開始ＡＵＧコドンおよびこの開始コドンの上流のいくつかの配列を含んでいるので、その５’末端で完了する。該クローンは、終止コドンの後ろに９０〜１２０ヌクレオチド、引き続いてポリＡ^＋テールを含んでいるので、３’領域で完了する。オープンリーディングフレームの外側の配列は、図２および３には示していない。クローンＭ４、Ｍ６、Ｍ８およびＭ１５のヌクレオチド配列のアラインメントを、図１.Ａ〜Ｄに示す。クローンＭ４、Ｍ６、およびＭ１５のコード領域のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図２に示す。クローンＭ８のコード領域のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図３に示す。

本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これは限定する目的ではない。

実施例１：精製したウサギ抗Ａｍｂ ａ １抗体を用いたヨモギ花粉ｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニング
４０．９ｋＤａのヨモギ花粉アレルゲンをコードするｃＤＮＡクローンの単離を以下の方法で行なった。

４０．９ｋＤａのアレルゲンのｃＤＮＡクローニングのための第一工程は、ヨモギ花粉からのＲＮＡの単離であったが、これは極めて困難な手順であることが判明した。ＲＮＡ単離のためのいくつかの異なる標準的な手順を用いたところ、色素および他の有機物質が常にＲＮＡと同時に精製され、これはｃＤＮＡ合成のために用いられる酵素を阻害した。しかし、一連のトライアル後、ｃＤＮＡライブラリーを構築するのに十分純粋なｍＲＮＡを単離することが可能であって、これをまた、発現ベクターλＺＡＰにおいても行なった。

Ａｍｂ ａ １を用いて免疫したウサギ由来の血清は、Ｔｅ Ｐｉａｎｏ Ｋｉｎｇ博士（ロックフェラー大学，ＵＳＡ）から提供された。ヨモギｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、本発明者らはまず、アフィニティークロマトグラフィーによって、Ａｍｂ ａ １特異性抗体を精製した。その目的のために、ブタクサ花粉から精製した５ｍｇのＡｍｂ ａ １をＣＮＢｒ活性化セファロース（ファルマシア）に結合させた。ウサギ血清の結合後、樹脂を洗浄してＡｍｂ ａ―１特異性抗体を０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．８）で溶出した。この抗体を中和して、ＰＢＳに対して透析した。これらの精製されたウサギ抗Ａｍｂ ａ １抗体を用いて、λＺＡＰＩＩファージ（ストラタジーン、カリフォルニア、アメリカ合衆国）中で構築したヨモギ花粉ｃＤＮＡライブラリーの４５０，０００個のプラークをスクリーニングした。全部で１３個の陽性のクローンを単離して、Ｕｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクターからのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドのインビボ切除において単一のクローンとして用いた。４つのクローン（Ｍ４，Ｍ６、Ｍ８およびＭ１５）を、ＤＮＡ配列解析のために選択した。この解析は、隣接するプライマーＴ７およびＴ３を含む５つのプライマーを用いる「プライマーウォーキング（Ｐｒｉｍｅｒ ｗａｌｋｉｎｇ）」技術によって実行した。両方の鎖とも２回配列決定を行った。４つのクローンＭ４、Ｍ６、Ｍ８およびＭ１５の整列されたヌクレオチド配列を図１.Ａ〜１.Ｄに示す。クローンＭ４、Ｍ６およびＭ１５のｃＤＮＡ配列は同一であった（図２）。Ｍ８のコード領域におけるｃＤＮＡ配列は、他の３つのクローンとは８塩基異なる（図３）。しかし、４つのクローン全てが、４０．９ｋＤａの計算上の分子量を有する同じタンパク質をもたらす（図２および３）。

最終的に、４０．９ｋＤａのタンパク質の配列を、データベースにおける類似性検索に用いた。ペクチン酸リアーゼ群に属する、ブタクサ花粉由来の主なアレルゲンであるＡｍｂ ａ １に対して、有意な配列相同性が見出された（６３．９％同一性）。

本発明のｃＤＮＡはここで、本明細書に記載の配列情報に基づいて得ることができる。ｃＤＮＡは、プローブとして、化学的合成によって調製されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを用いてｃＤＮＡライブラリーからクローニングされてもよい。あるいは、ｃＤＮＡは、配列番号２由来のプライマーを用いるＰＣＲによって得ることができる。このような方法は当業者に公知である。

（実施例２：発現プラスミドｐＨＩＳ−パラレル−２への４０．９ｋＤａのヨモギアレルゲンのクローニング（クローンＭ４））
４０．９ｋＤａのヨモギアレルゲンｃＤＮＡを含む発現プラスミドをベクターｐＨｉｓ−パラレル２中で構築した（図４を参照のこと）。クローニング処置のために、２つの隣接するクローニングプライマーを構築した。完全なｃＤＮＡ配列を、５’末端において、推定シグナルペプチドをコードする６０ヌクレオチドまでに短縮した。この方法では、成熟型のタンパク質のみがＥ．ｃｏｌｉ中で生成した。

以下のプライマーを用いた：ＰＣＲのためのＭｕｇ−Ｎｃｏ−ｆｗｄ ５’ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＣ ＣＡＴ ＧＧＣ ＴＣＧ ＧＧＣ ＴＧＡ ＣＡＴ ＴＧＧ ＴＧＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＣＧ ３’（配列番号４）および、Ｍｕｇ−Ｘｈｏ−ｒｅｖ ５’ＧＡＧＡＧＡ ＧＡＣ ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＡＡ ＣＡＡ ＧＧＴ ＴＴＴ ＣＣＡ ＧＧＡ ＡＣＧ ＣＡＴ ＴＴＧ ３’（配列番号５）、Ｎｃｏ ＩおよびＸｈｏ Ｉ制限部位を５’末端および３’末端に導入した。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いて消化して、ベクターｐＨｉｓ−パラレル−２の各々の部位に連結した。このクローンをＤＮＡ配列決定によって解析した。

実施例３：Ｅ．ｃｏｌｉにおける組み換え４０．９ｋＤａヨモギアレルゲンの発現
４０．９ｋＤａのヨモギアレルゲンの組み換え作成のために、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ株であるＢＬ２１（ＤＥ３，ストラタジーン、カリフォルニア、アメリカ合衆国）を、発現プラスミドｐＨｉｓ−パラレル−２−Ｍ４で形質転換して、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で選択した。単一の形質転換コロニーを採集し、アンピシリン含有ＬＢ培地を用いて、２５ｍｌ中で一晩前培養して、６００ｎｍで０．６の光学密度まで細菌を増殖した。ＬＢ−ａｍｐ培地を２５０ｍｌになるまで加えて、イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭまで添加し、３７℃で７時間培養を続けた。この細菌細胞を、遠心分離によって回収して、ペレットを、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ イミダゾールを含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）中に再懸濁した。次いで、液体窒素中での凍結とそれに続く３７℃での解凍の３サイクルによって細胞を破壊した。５．５００ｒｐｍでの２５分間の遠心分離後、この上清を除去して（可溶性画分）、そして６Ｍ尿素をこのペレットに添加した。遠心分離後、この上清を除去して（不溶性画分）、可溶性画分および不溶性画分の両方をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。組み換えの４０．９ｋＤａヨモギタンパク質を不溶性画分において回収し、次にこれを抗Ａｍｂ ａ １抗体（図５Ｂ、レーン４）および雑草花粉のアレルギー性患者由来の血清ＩｇＥ（図６、レーン３および４）を用いた免疫ブロット法に用いた。コントロールとして、インサートなしのｐＨｉｓ−パラレル−２を用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１を上記のとおり処理して、不溶性画分を上記免疫ブロット実験に用いた（図６、レーン５および６）。

図５Ａ、レーン１は、花粉から放出された全てのタンパク質（アレルゲンまたは非アレルゲン）を含むヨモギ花粉抽出物を示す。ヨモギ花粉抽出物の調製は以下のとおりである。

１５０ｍｇのヨモギ花粉粒子（Ａｌｌｅｒｇｏｎ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を１ｍｌの水と混合した。花粉懸濁物を室温で１０時間、穏やかに撹拌した。遠心分離後、ヨモギ花粉から放出されたタンパク質のパターンを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色によって解析した。

図５Ａのレーン２は、精製された天然の４０．９ｋＤａヨモギ花粉アレルゲンを示す。その精製は、イムノアフィニティークロマトグラフィー法によって行われた。精製されたウサギ抗Ａｍｂ ａ １抗体を臭化シアン活性化セファロースＣＬ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に結合して、濾過された１０時間花粉抽出物からの天然の４０．９ｋＤａヨモギタンパク質の精製のために用いた。

図５Ａのレーン３は、ブタクサ花粉における主なアレルゲンである、精製された天然のＡｍｂ ａ １を示す。精製は、イムノアフィニティークロマトグラフィー法によって行なった。精製されたウサギ抗Ａｍｂ ａ １抗体を臭化シアン活性化セファロースＣＬ４Ｂ（ファルマシア バイオテック）に結合して、濾過された１０時間のブタクサ花粉抽出物（１０ｍＭプロテーアゼインヒビター、１，１０フェナントロリンを含む）からの天然のＡｍｂ ａ １の精製のために用いた。

（実施例４：ヨモギ花粉からの天然の４０．９ｋＤａアレルゲンの精製）
イムノアフィニティークロマトグラフィーによって、ヨモギ花粉の水性抽出物から天然の４０．９ｋＤａのアレルゲンを精製した。精製されたウサギ抗Ａｍｂ ａ １抗体をＣＮＢｒ活性化セファロースＣＬ４Ｂに結合して、４０．９ｋＤａのアレルゲンの精製のために用いた。次いで、精製された天然の４０．９ｋＤａアレルゲンを、抗Ａｍｂ ａ １抗体を用いて（図５Ａ、レーン２）、およびアレルギー患者由来のＩｇＥ抗体を用いて（図６、レーン１および２）、免疫ブロット法で試験した。

ヨモギにおける精製された天然および組み換えの４０．９ｋＤａタンパク質と、ブタクサに感作した米国の患者との間では交差反応性が存在する。従って、図６Ａおよび図６Ｂにおいて陽性のシグナルを観察することができる。さらに多くの患者がこれらの２つのアレルゲンの間で交差反応性を示すことが見込まれる。

（実施例５：組み換え４０．９ｋＤａヨモギ花粉タンパク質の発現および精製）
４０．９ｋＤａのヨモギ花粉タンパク質をコードするｃＤＮＡを挿入されたｐＨｉｓパラレル２プラスミドを備えるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＤＥ３において、タンパク質発現を行なった。培養培地（１％ペプトン、０．５％酵母抽出液、０．５％ＮａＣｌ、１００ｇグリセリン／１Ｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４；２０ｇ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１０ｍＭ ＰＯ_４、ｐＨ７．４に調節）に、３％の飽和した一晩培養物を接種して、１５０μｇ／ｍＬのペニシリンＧ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ，Ｋｕｎｄｌ，Ａｕｓｔｒｉａ）を含む培養培地中で増殖させた。本培養は１０Ｌ Ｂｉｏｆｌｏｗ ３０００ Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）中において３７℃で行い、このとき７％酸素飽和、２００〜４００ｒｐｍ撹拌を用い、光学密度０．８の時点で０．４ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。

誘導後５時間の遠心分離によって細菌細胞を回収して（１０Ｌの培養物から２０ｇの細胞湿重量）、１００ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓベース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，ｐＨ非調節、細胞１ｇあたり５ｍＬ）中に再懸濁した。新しく溶解されたリゾチームの添加（細胞１ｇあたり１００μｇ）および室温で１時間のインキュベーション後、−７０℃と３７℃の凍結解凍の３サイクルによって細胞を溶解した。ＤＮＡを、ウルトラウラックス（ｕｌｔｒａｕｒａｘ）を用いて剪断した。遠心分離によって可溶性画分の分離を行なって、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて未処理の封入体を２回洗浄して、続いて５０％エタノール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて２回洗浄した。精製された封入体を、５００ｍＬ ８Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解して、同じ溶液で予め平衡化した１５０ｍＬのＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）に製造業者の指示に従って０．１Ｍ ＮｉＣｌ_２を充填した後に、その精製された封入体をこのカラムにロードした。Ｂｉｏｐｌｏｔ ＦＰＬＣシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）において、全てのクロマトグラフィー工程を実行した。０〜５００ｍＭの範囲の直線イミダゾール勾配を用いて、結合されたタンパク質を溶出させた。通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、この画分の純度を解析した。組み換え４０．９ｋＤａヨモギ花粉タンパク質を含む画分の不純（高いバックグラウンド）のため、変性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィーを行なった。

ＣＥＣマトリックス「Ｍａｔｒｅｘ Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃ−５００」（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む１８０ｍＬのカラムを２００ｍＬの１００ｍＭ ＮａＡｃ（ｐＨ５．５）で平衡化した。４００ｍＬの結合緩衝液（５Ｍ尿素、２０ｍＭ ＮａＡｃ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．５）を用いてこのカラムを洗浄した後、５．５のｐＨでそのタンパク質溶液を加えた。

再度、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色によってこの画分を解析した。変性条件および塩基性ｐＨ下でのゲル濾過工程のために、目的のタンパク質を含有する画分をプールして、調製した。

Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラム（寸法５０×１０００ｍｍ）において、６Ｍ尿素、０．３Ｍ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール中でゲル濾過を行なった。純粋な４０．９ｋＤａのヨモギ花粉タンパク質画分を、遠心分離して、５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３を添加しながら、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過デバイス（ミリポア）を通した濾過によって再折り畳みした。
全体的収率は４〜６ｍｇタンパク質であった。

図７、レーン３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色後のＨｉｓ−ｔａｇ（最大３μｇ）を有する精製された組み換え４０．９ｋＤａヨモギ花粉アレルゲンを示す。

（実施例６：組み換え４０．９ｋＤａヨモギ花粉タンパク質を用いたＩｇＥブロット）
異なるアレルギー性患者または感作された患者由来の血清を、新規な４０．９ｋＤａのヨモギ花粉アレルゲンに対する反応性について試験した。この試験は、以下のプロトコールに従って行なった：
・分取用１５％ＳＤＳゲル
・最大８０μｇの精製された組み換え４０．９ｋＤａタンパク質（例えば、実施例５に従って得られる）をロードする。
・ＳＤＳゲル電気泳動１００Ｖ，２．５時間
・ウエスタンブロット：ＰＶＤＦ膜上で２時間、３００ｍＡ
・一次抗体とのインキュベーション：ヒト血清：ゴールド（ｇｏｌｄ）緩衝液中に１：１０希釈、ＲＴ（室温）で少なくとも６時間。
・洗浄工程３×１０’ゴールド緩衝液中
・二次抗体とのインキュベーション：放射性標識された［^１２５Ｉ］−抗−ヒトＩｇＥ（ＲＡＳＴとも呼ばれる）、ＭｅｄＰｒｏから供給（カタログ番号ＶＥ３９０２０、５．２ｍｌ、５μＣｉ）−室温で、１：４０（ゴールド緩衝液中）。
・洗浄工程３×１０’ゴールド緩衝液中
・メンブレンストリップを率いる白色部位を備えるホスホルイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｉｍａｇｅｒ）スクリーンを配置する
・ホスホルイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）カセット中にスクリーンを２４〜４８時間曝す。
・このホスホルイメージャー中でこのスクリーンを発色させる。
ブロッキング緩衝液＝ゴールド緩衝液（１Ｌ）：７．５ｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４
１．０ｇ ＮａＨ_２ＰＯ_４
５．０ｇ ＢＳＡ
５．０ｍｌ Ｔｗｅｅｎ２０
転写緩衝液（５Ｌあたり）： １５．１３ｇ Ｔｒｉｓベース
７２．０６ｇ グリシン
１Ｌ 無水メタノール
ｄＨ_２Ｏを添加する

４０．９ｋＤａのバンドに対応するシグナルがバックグラウンドシグナルを有意に上回った場合、血清は、「ＩｇＥ−陽性（ＩｇＥ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」と分類された。

以下の結果が得られた：
ＮＩＨ／ＵＳＡ由来のブタクサ対照血清（レーン１〜３）およびオーストリアのヨモギアレルギー患者（レーン４〜２２）：ブロットＩ

オーストリアのヨモギアレルギー患者（レーン２３〜４４）：ブロットＩＩ

ＵＳＡ（レーン４５〜５８）およびオーストリア（レーン５９〜６３）のヨモギ感受性患者：ブロットＩＩＩ

ザルツブルグのヨモギアレルギー患者（レーン６４〜６８）およびＡｒｔ ｖ １ Ｔ細胞患者（レーン６９〜８３）：ブロットＩＶ

カナダのブタクサアレルギー患者（レーン８４〜１０７）：ブロットＶ

カナダおよびオーストリアのブタクサアレルギー患者（レーン１０８〜１１７）：ブロットＶＩ

陰性コントロール：ブロットＶＩＩ（二次抗体のみ）

試験された患者血清の結果：
オーストリアのヨモギアレルギー患者（試験された患者血清の総数＝６１）
ＩｇＥ−陽性：３６＝５９％
ＩｇＥ−陰性：２５＝４１％

ＵＳＡ、カナダおよびオーストリアのブタクサアレルギー患者（試験された患者血清の総数＝５６）
ＩｇＥ−陽性：２７＝４８％
ＩｇＥ−陰性：２９＝５２％

全体的結果：
ヨモギアレルギー患者由来の利用可能な血清の総数：７３
ＩｇＥ−陽性：３６＝４９．４％
ＩｇＥ−陰性：３７＝５０．６％

ブタクサレルギー患者由来の利用可能な血清の総数：１３０
ＩｇＥ−陽性：２７＝２０．８％
ＩｇＥ−陰性：１０３＝７９．２％

ヨモギ感受性患者のほぼ５０％およびブタクサ感受性患者の約２０％は、４０．９ｋＤａのアレルゲンに対するＩｇＥ抗体を有する。これは、このヨモギ花粉アレルゲンに対して感作された患者の比較的高い割合である。結果として、これらの患者のアレルギーの治療のためのワクチン調製物に対してこの分子を添加することは重要である。アレルギー治療のための新規なアプローチは、患者に仕立てたワクチン調製物という方向に向かっている。

図１.Ａ、図１.Ｂ、図１.Ｃおよび図１.Ｄは、クローンＭ４、Ｍ６、Ｍ８およびＭ１５のヌクレオチド配列（配列番号６、７、８および９）のアラインメントを示す。コンセンサス配列における大文字は、４つのクローンにおける同一のヌクレオチドを示す。 図２は、クローンＭ４、Ｍ６、およびＭ１５のコード領域のヌクレオチド配列（配列番号２に加えて終止コドン）および推定アミノ酸配列（配列番号１）を示す。 図３は、クローンＭ８のコード領域のヌクレオチド配列（配列番号３に加えて終止コドン）および推定アミノ酸配列（配列番号１）を示す。 図４は、実施例２に用いられるプラスミド「ｐＨｉｓ−パラレル２（ｐＨｉｓ−Ｐａｒａｌｌｅｌ２）」のマルチクローニング部位の構造を示す。また、６×Ｈｉｓタグ、スペーサー領域およびプロテアーゼ切断部位をコードするアミノ酸を示す。 図５Ａは、ゲル電気泳動で分離して、その後にクマシー染色したヨモギ花粉抽出物、精製されたヨモギ花粉アレルゲン、およびブタクサ花粉から精製されたＡｍｂ ａ １を示す。図５Ｂは、ウサギ抗Ａｍｂ ａ １抗体を用いたイムノブロットを示す（実施例３および４を参照のこと）。 図６は、ＩｇＥ抗体を用いたイムノブロットを示す（実施例３および４を参照のこと）。 図７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクマシー染色したゲルを示す。レーン１（左）：分子量マーカーＲＰＮ ７５６（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；レーン２（真ん中）：ヨモギ花粉抽出物；レーン３（右）：精製された組み換え４０．９ｋＤａヨモギ花粉タンパク質、最大３μｇ（実施例５を参照のこと）。

Claims (16)

1. 配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヨモギ花粉に対してアレルギー性である個体由来のＩｇＥ抗体に結合し得るポリペプチドからなるアレルゲン。
2. ポリペプチドが配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のアレルゲン。
3. ブタクサ花粉に対してアレルギー性である個体由来のＩｇＥ抗体に結合し得ることを特徴とする請求項１または２に記載のアレルゲン。
4. ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
   ｂ）請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
   ｃ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列または配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；および
   ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつヨモギ花粉に対してアレルギー性である個体由来のＩｇＥ抗体に結合し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
   からなる群より選択されるポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドの相補鎖。
5. 請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミドまたはベクター。
6. 請求項５に記載のプラスミドもしくはベクター、および／または請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
7. 植物細胞、細菌細胞および酵母細胞からなる群より選択される、請求項６に記載の細胞。
8. ポリペプチドの発現に適切な条件下で請求項６または７に記載の細胞を培養する工程と、該ポリペプチドを引き続いて回収する工程とを包含する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアレルゲンの調製方法。
9. 細胞が開口されて、かつ前記ポリペプチドがアフィニティークロマトグラフィーを用いて回収される、請求項８に記載の方法。
10. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のアレルゲンに結合し得る抗体。
11. Ａｍｂ ａ Ｉ．１、Ａｍｂ ａ Ｉ．２、Ａｍｂ ａ Ｉ．３、およびＡｍｂ ａ ２からなる群より選択されるポリペプチドのうちの１または数個に結合し得る、請求項１０に記載の抗体。
12. Ａｍｂ ａ Ｉ．１、Ａｍｂ ａ Ｉ．２、Ａｍｂ ａ Ｉ．３、およびＡｍｂ ａ ２からなる群より選択されるポリペプチドのうちのいずれにも結合しない、請求項１０に記載の抗体。
13. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のアレルゲン、および／または請求項４に記載のポリヌクレオチド、および／または請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
14. アレルギー疾患の治療または予防または診断のための医薬の調製のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアレルゲン、または請求項４に記載のポリヌクレオチド、または請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の抗体の使用。
15. 前記医薬が脱感作されるべき個体に投与される、請求項１４に記載の使用。
16. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のアレルゲン、および／または請求項４に記載のポリヌクレオチド、および／または請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の抗体を含む、アレルギー疾患の診断、治療および／または予防のために有用なキット。