JP4401288B2 - ヨモギ花粉由来のアレルゲン - Google Patents
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Description
(1)第一の曝露の際、アレルゲン性のタンパク質は、B細胞によるIgE合成を誘導する(VercelliおよびGeha,1989,J.Allergy Clin.Immunol.9:75〜83)。次いで、これらの特異的IgE抗体が、高親和性Fcεレセプター(FcεRI)を介して肥満細胞および好塩基球の表面に結合する。
(2)その後の曝露の際、アレルゲンは、これらの特異的IgE抗体に結合し架橋して、これが、予め形成された、そして新規に合成された炎症性メディエーター(例えば、ヒスタミン)および走化性物質(例えば、血小板活性化因子)の放出をもたらす。
(1)の段階では、Bリンパ球によるアレルゲン特異的IgEの産生には、アレルゲンの直鎖状ペプチドフラグメントによって活性化される、Tリンパ球の「補助(help)」が必要である(Vercelli and Geha,1989,J.Allergy Clin.Immunol.9:75〜83)。これらのペプチドは、抗原のプロセシングを通じて抗原提示細胞によって作製されて、主要組織適合複合体(MHC)の分子とともに細胞表面に提示されて、ここでT細胞レセプターに対する認識および結合が可能になる(Schwartz,1985,Annu Rev.Immunol.3:237〜255;Rothbartら,1989.Int.Immunol.1:479〜486)。(2)の段階では、B細胞によって生成されたアレルゲン特異的IgE抗体は循環して、肥満細胞および好塩基球上のFcεRIレセプターに結合し、それによって、このアレルゲンについてのレセプターとして働く。これらの細胞表面結合したIgE抗体のアレルゲンによる架橋は、予め形成された、そして新規に合成された炎症性メディエーターおよび走化性物質の放出のためのシグナルであって、代表的なアレルギー性の炎症反応をもたらす。
第二の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、上記の本発明によるポリペプチドをコードする。
40.9kDaのヨモギ花粉アレルゲンをコードするcDNAクローンの単離を以下の方法で行なった。
40.9kDaのヨモギアレルゲンcDNAを含む発現プラスミドをベクターpHis−パラレル2中で構築した(図4を参照のこと)。クローニング処置のために、2つの隣接するクローニングプライマーを構築した。完全なcDNA配列を、5’末端において、推定シグナルペプチドをコードする60ヌクレオチドまでに短縮した。この方法では、成熟型のタンパク質のみがE.coli中で生成した。
40.9kDaのヨモギアレルゲンの組み換え作成のために、コンピテントなE.coli株であるBL21(DE3,ストラタジーン、カリフォルニア、アメリカ合衆国)を、発現プラスミドpHis−パラレル−2−M4で形質転換して、100mg/lのアンピシリンを含むLBプレート上で選択した。単一の形質転換コロニーを採集し、アンピシリン含有LB培地を用いて、25ml中で一晩前培養して、600nmで0.6の光学密度まで細菌を増殖した。LB−amp培地を250mlになるまで加えて、イソプロピル−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度1mMまで添加し、37℃で7時間培養を続けた。この細菌細胞を、遠心分離によって回収して、ペレットを、300mM NaClおよび10mM イミダゾールを含有する50mMのリン酸緩衝液(pH8)中に再懸濁した。次いで、液体窒素中での凍結とそれに続く37℃での解凍の3サイクルによって細胞を破壊した。5.500rpmでの25分間の遠心分離後、この上清を除去して(可溶性画分)、そして6M尿素をこのペレットに添加した。遠心分離後、この上清を除去して(不溶性画分)、可溶性画分および不溶性画分の両方をSDS−PAGEによって解析した。組み換えの40.9kDaヨモギタンパク質を不溶性画分において回収し、次にこれを抗Amb a 1抗体(図5B、レーン4)および雑草花粉のアレルギー性患者由来の血清IgE(図6、レーン3および4)を用いた免疫ブロット法に用いた。コントロールとして、インサートなしのpHis−パラレル−2を用いて形質転換したE.coli株BL21を上記のとおり処理して、不溶性画分を上記免疫ブロット実験に用いた(図6、レーン5および6)。
イムノアフィニティークロマトグラフィーによって、ヨモギ花粉の水性抽出物から天然の40.9kDaのアレルゲンを精製した。精製されたウサギ抗Amb a 1抗体をCNBr活性化セファロースCL4Bに結合して、40.9kDaのアレルゲンの精製のために用いた。次いで、精製された天然の40.9kDaアレルゲンを、抗Amb a 1抗体を用いて(図5A、レーン2)、およびアレルギー患者由来のIgE抗体を用いて(図6、レーン1および2)、免疫ブロット法で試験した。
40.9kDaのヨモギ花粉タンパク質をコードするcDNAを挿入されたpHisパラレル2プラスミドを備えるE.coli BL21−DE3において、タンパク質発現を行なった。培養培地(1%ペプトン、0.5%酵母抽出液、0.5%NaCl、100gグリセリン/1L、2mM MgSO4;20g(NH4)2SO4、10mM PO4、pH7.4に調節)に、3%の飽和した一晩培養物を接種して、150μg/mLのペニシリンG(Biochemie,Kundl,Austria)を含む培養培地中で増殖させた。本培養は10L Bioflow 3000 Fermenter(New Bruswick Scientific Co.,Edison,NJ)中において37℃で行い、このとき7%酸素飽和、200〜400rpm撹拌を用い、光学密度0.8の時点で0.4mM IPTGで誘導した。
全体的収率は4〜6mgタンパク質であった。
異なるアレルギー性患者または感作された患者由来の血清を、新規な40.9kDaのヨモギ花粉アレルゲンに対する反応性について試験した。この試験は、以下のプロトコールに従って行なった:
・分取用15%SDSゲル
・最大80μgの精製された組み換え40.9kDaタンパク質(例えば、実施例5に従って得られる)をロードする。
・SDSゲル電気泳動100V,2.5時間
・ウエスタンブロット:PVDF膜上で2時間、300mA
・一次抗体とのインキュベーション:ヒト血清:ゴールド(gold)緩衝液中に1:10希釈、RT(室温)で少なくとも6時間。
・洗浄工程3×10’ゴールド緩衝液中
・二次抗体とのインキュベーション:放射性標識された[125I]−抗−ヒトIgE(RASTとも呼ばれる)、MedProから供給(カタログ番号VE39020、5.2ml、5μCi)−室温で、1:40(ゴールド緩衝液中)。
・洗浄工程3×10’ゴールド緩衝液中
・メンブレンストリップを率いる白色部位を備えるホスホルイメージャー(phosphor−imager)スクリーンを配置する
・ホスホルイメージャー(phosphoimager)カセット中にスクリーンを24〜48時間曝す。
・このホスホルイメージャー中でこのスクリーンを発色させる。
ブロッキング緩衝液=ゴールド緩衝液(1L):7.5g Na2HPO4
1.0g NaH2PO4
5.0g BSA
5.0ml Tween20
転写緩衝液(5Lあたり): 15.13g Trisベース
72.06g グリシン
1L 無水メタノール
dH2Oを添加する
NIH/USA由来のブタクサ対照血清(レーン1〜3)およびオーストリアのヨモギアレルギー患者(レーン4〜22):ブロットI
オーストリアのヨモギアレルギー患者(レーン23〜44):ブロットII
USA(レーン45〜58)およびオーストリア(レーン59〜63)のヨモギ感受性患者:ブロットIII
ザルツブルグのヨモギアレルギー患者(レーン64〜68)およびArt v 1 T細胞患者(レーン69〜83):ブロットIV
カナダのブタクサアレルギー患者(レーン84〜107):ブロットV
カナダおよびオーストリアのブタクサアレルギー患者(レーン108〜117):ブロットVI
陰性コントロール:ブロットVII(二次抗体のみ)
オーストリアのヨモギアレルギー患者(試験された患者血清の総数=61)
IgE−陽性:36=59%
IgE−陰性:25=41%
IgE−陽性:27=48%
IgE−陰性:29=52%
ヨモギアレルギー患者由来の利用可能な血清の総数:73
IgE−陽性:36=49.4%
IgE−陰性:37=50.6%
IgE−陽性:27=20.8%
IgE−陰性:103=79.2%
Claims (16)
- 配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヨモギ花粉に対してアレルギー性である個体由来のIgE抗体に結合し得るポリペプチドからなるアレルゲン。
- ポリペプチドが配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載のアレルゲン。
- ブタクサ花粉に対してアレルギー性である個体由来のIgE抗体に結合し得ることを特徴とする請求項1または2に記載のアレルゲン。
- a)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;
b)請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
c)配列番号2に示されるヌクレオチド配列または配列番号3に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;および
d)配列番号2に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつヨモギ花粉に対してアレルギー性である個体由来のIgE抗体に結合し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
からなる群より選択されるポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドの相補鎖。 - 請求項4に記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミドまたはベクター。
- 請求項5に記載のプラスミドもしくはベクター、および/または請求項4に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
- 植物細胞、細菌細胞および酵母細胞からなる群より選択される、請求項6に記載の細胞。
- ポリペプチドの発現に適切な条件下で請求項6または7に記載の細胞を培養する工程と、該ポリペプチドを引き続いて回収する工程とを包含する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアレルゲンの調製方法。
- 細胞が開口されて、かつ前記ポリペプチドがアフィニティークロマトグラフィーを用いて回収される、請求項8に記載の方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のアレルゲンに結合し得る抗体。
- Amb a I.1、Amb a I.2、Amb a I.3、およびAmb a 2からなる群より選択されるポリペプチドのうちの1または数個に結合し得る、請求項10に記載の抗体。
- Amb a I.1、Amb a I.2、Amb a I.3、およびAmb a 2からなる群より選択されるポリペプチドのうちのいずれにも結合しない、請求項10に記載の抗体。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のアレルゲン、および/または請求項4に記載のポリヌクレオチド、および/または請求項10〜12のいずれか1項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
- アレルギー疾患の治療または予防または診断のための医薬の調製のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアレルゲン、または請求項4に記載のポリヌクレオチド、または請求項10〜12のいずれか1項に記載の抗体の使用。
- 前記医薬が脱感作されるべき個体に投与される、請求項14に記載の使用。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のアレルゲン、および/または請求項4に記載のポリヌクレオチド、および/または請求項10〜12のいずれか1項に記載の抗体を含む、アレルギー疾患の診断、治療および/または予防のために有用なキット。
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