JP4399171B2 - Glucan separation or fractionation method - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルカンを逆相系分離基材に接触させ、該基材との相互作用を利用することにより重合度に応じて分離するグルカンの新規かつ簡便な分離・分画方法に関する。また、デンプンの枝きり酵素分解物（枝きりデンプン）を重合度別に分離・分画することによってデンプンの構造を簡便に構造解析することができる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
デンプンはα−１，４−グルカンからなる単位鎖がα−１，６−結合で分岐した構造をしている。このデンプンを構成する単位鎖の分布は植物種や品種によって様々であり、デンプンの機能特性と大きく関係していることから、デンプンの特性を評価する上で非常に重要な情報となる。
【０００３】
一般的なデンプンの単位鎖の分析法は、プルラナーゼやイソアミラーゼによりデンプン分子を各単位鎖に加水分解して枝きりデンプンを調製し、それをゲル濾過クロマトグラフィーに供する。このクロマトグラフィーによる溶出曲線が、その単位鎖の分布を表す。この測定には、適当なゲル担体を詰めたカラムによる分離・分画後、各画分の全糖量を求める必要があるが、煩雑な作業かつ長時間の分析を要するという欠点がある。また、高速液体ゲル濾過クロマトグラフィーと示差屈折計を用いた機器分析も行われているが、これも、分析に長時間を費やすことや、高価な機器を要することが難点である。一方で、デンプンの構造に関する情報は、植物種の品種改良の場や食品工業では重要な情報であるため、より簡便且つ安価なデンプン構造の分析法が望まれている。
【０００４】
グルカンにはさまざまな重合度を持つものがあり、その重合度により物性が大きく異なる。例えば、デンプンをα−アミラーゼで分解すると低分子化するが、それに伴ってそのデンプン分解物水溶液の粘度は小さくなる。また、α−１，４−グルカンは脂質と相互作用することが知られているが、その相互作用も重合度によって大きく異なる。これらグルカンを利用する場合には、目的とする機能を高めるために、特定の重合度を持つグルカンを分離・分画する必要があるが、簡便かつ高精度な分離・分画方法が無いのが現状である。
【０００５】
デンプン分子は、ヨウ素やブタノール、脂質などの直鎖状低分子化合物と相互作用をすることが知られている。この作用は、デンプン性製品の品質に影響を与えることから多くの研究がなされている。
【０００６】
脂質の疎水部分と同様の構造を有する逆相系分離基材は、担体に疎水性官能基が結合したものであり、その疎水性を利用して特定成分の分離や濃縮に利用されている。例えば、この基材をカートリッジに充填したものが市販されており、混合液をカートリッジに注入し基材と接触させることで、蛋白質、芳香族などの疎水性を有する物質の除去、あるいは、濃縮、精製が可能となり、幅広く使用されている。
【０００７】
また、この逆相系樹脂は高速液体クロマトグラフィー用のカラムの充填剤として、オリゴ糖などの分析に広く用いられている。この基材としては、表面官能基としてオクタデシル基（Ｃ１８）や、オクチル基（Ｃ８）がシリカに結合したカラム等が広く利用されている。他の逆相系分離基材としては、官能基としてポリスチレンなどが結合したものも市販されている。
【０００８】
しかし、これまで、このような逆相系基材とグルカンとの相互作用については明らかにされておらず、グルカンの分離やデンプン単位鎖の分析の目的で逆相系基材が利用された例は知られていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、グルカンの逆相系分離基材への吸着特性を利用することによって、重合度に応じて、より簡便に精度良く分離または分画する方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、上記方法を用いてデンプン構造を解析する方法を提供することにある。
【００１１】
さらに本発明の他の目的は、特定の重合度分布を有するグルカンを製造する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、逆相系分離基材とグルカンの相互作用について研究を行い、その過程においてグルカンが逆相系分離基材に吸着されること、さらにはデンプンの単位鎖である直鎖α−１，４−グルカンが吸着し、その吸着性が重合度に依存することを見出し、その究明事実に基づき本発明に到達した。
【００１４】
すなわち、本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、グルカンの水溶液を逆相系分離基材に接触させてグルカンを該基材に吸着させ、次いでアルコールおよび水の混合溶媒で所定の重合度を持つ吸着成分を溶離せしめる方法であって、上記グルカンが直鎖アミロースまたは枝きりでんぷんでありそして上記逆相系分離基材がオクチル基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基およびオクタデシル基のうちのいずれかである長鎖アルキル基が化学結合された担体を有するものである、ことを特徴とするグルカンの分離または分画方法によって達成される。
【００１５】
また、本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第２に、グルカンの水溶液を逆相系分離基材に接触させてグルカンを該基材に吸着させ、次いで、アルコールおよび水の混合溶媒で、アルコール濃度を連続的に変えながら、あるいは、アルコール濃度の異なる混合溶媒で断続的に処理して、重合度に応じて吸着成分を溶離せしめる方法であって、上記グルカンが直鎖アミロースまたは枝きりでんぷんでありそして上記逆相系分離基材がオクチル基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基およびオクタデシル基のうちのいずれかである長鎖アルキル基が化学結合された担体を有するものである、ことを特徴とするグルカンの分離または分画方法によって達成される。
【００１６】
また、本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第３に、上記の分離・分画方法を利用して、特定の重合度を有するグルカンを製造することによって達成される。
【００１７】
【発明の好ましい実施形態】
これについて以下に詳述する。
【００１８】
逆相系分離基材として、オクチル基が化学結合されたシリカゲルを充填したカートリッジ（Ｃ８カートリッジと略す）またはオクタデシル基が化学結合されたシリカゲルを充填したカートリッジ（Ｃ１８カートリッジと略す）を用い、グルカンの吸着特性を以下の方法で調べた。
【００１９】
アミロースまたはアミロペクチン（１０ｍｇ）を１Ｍの水酸化ナトリウム（１００μｌ）に溶解し、適量の蒸留水で希釈した後、１Ｍの酢酸（３００μｌ）で中和しｐＨ４．０−４．３とした。２％アジ化ナトリウム（１ｍｌ）を加えて、蒸留水で１００ｍｌに定容した。溶液は２０℃に保ち、実験に用いた。
【００２０】
シリンジを用いて、アミロースまたはアミロペクチン溶液（５ｍｌ）を流速約２ｍｌ／ｍｉｎでカートリッジに通した。この時、カートリッジ内に残留する溶液は空気を注入して回収した。この操作を繰り返し、各画分について、その全糖量をフェノール・硫酸法により測定した。吸着量はカートリッジ通過前後の全糖量の差とした。
【００２１】
図１は加えたアミロースとアミロペクチンに対して各カートリッジに吸着された量を示したものである。図１中、Ｃ８カートリッジについての吸着曲線は、黒塗りの記号で、Ｃ１８カートリッジについての記号はシロ抜きの記号で示されている。また、丸記号はアミロースについてのものであり、三角記号はアミロペクチンについてのものである。いずれのグルカンもカートリッジに明らかに吸着された。吸着量はＣ１８カートリッジがＣ８カートリッジより約３倍多いことが明かとなった。
【００２２】
次に、アルコール水溶液を用いて、Ｃ１８カートリッジに吸着したグルカンの離脱条件を検討した。アルコールとしてはメタノールを用いた。まず、グルカンをカートリッジに吸着後、５％、１０％、２０％、３０％メタノール水溶液で順次溶出した結果、１０％メタノールで溶出した時にアミロースが２４％、アミロペクチンが４７％回収され、最も回収率が良かった。
【００２３】
また、その他のアルコール（エタノール、プロパノールまたはブタノール）の水溶液を用いた場合、回収率はアミロースで２３−２４％、アミロペクチンで２０−２５％であり、他のアルコールでも回収することが可能であった。
【００２４】
先にアミロースとアミロペクチンの吸着性に相違が認められたので、次に、重合度の異なるα−１，４−グルカンおよびグルコースを用いて次の方法で吸着性を調べた。α−１，４−グルカンとして、マルトース、マルトヘプタオース、重合度６３、２１５、４３８、７２２、１９５３の直鎖アミロースを使用した。
【００２５】
グルコースおよびα−１，４−グルカン（１０ｍｇ）を１Ｍ水酸化ナトリウム（１００μｌ）に溶解し、１Ｍ酢酸（３００μｌ）で中和した。２％アジ化ナトリウム（１００μｌ）を加えて，蒸留水で１０ｍｌに定容した。
【００２６】
試料溶液（２．５ｍｌ）を前述の方法と同様に流速約２ｍｌ／ｍｉｎでカートリッジに通した後、蒸留水、１０％メタノール水溶液の順で流速約４ｍｌ／ｍｉｎで通液した。用いた溶液はいずれも２０℃に保った。各画分の全糖量をフェノール・硫酸法により測定し、回収率とした。
【００２７】
図２および図３はα−１，４−グルカン、グルコースをカートリッジに通した後の回収率を示す。図２および図３中、□、
【００２８】
【外１】

【００２９】
および■はそれぞれ未吸着画分、水洗滌画分および１０％メタノール画分を示している。Ｃ８カートリッジの場合（図２）、グルコースとマルトース、マルトヘプタオースは試料注入と蒸留水洗浄画分にほとんど回収され、これらは吸着されないことがわかった。直鎖アミロースは未吸着画分と水洗滌画分の回収量が減少し、重合度１９５３以外では残留するアミロースが１０％メタノール洗浄画分に回収された。Ｃ１８カートリッジでは（図３）、グルコースとマルトースは実質上吸着されず、一方、直鎖アミロースは完全に吸着された。重合度６３と２１５のアミロースは１０％メタノール洗浄画分に完全に回収され、それより長いアミロースの回収率は重合度の増大とともに減少した。これらの結果は、α−１，４−グルカンの逆相カートリッジ吸着性に重合度依存性があることを示唆し、本発明者らは、このことを用いて直鎖アミロースを重合度に基づいて分画することが可能であることを確認した。
【００３０】
次に、Ｃ１８カートリッジによる枝きりデンプンの分画方法の検討を行った。ジメチルスルフォキシド溶解とエタノール沈殿を３回繰り返し行うことによって脱脂トウモロコシデンプンを調製した。このデンプン１０ｍｇを糊化し、それに１ユニット（５μｌ）のイソアミラーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）を加え、１０ｍｌに定容し、４５度で１６時間反応させた後、１０分間煮沸させて枝きりデンプン溶液を調製した。
【００３１】
この枝きりデンプン溶液をＣ１８カートリッジに通液後、蒸留水または異なる濃度（２％、３％、４％、６％、８％、１０％）のメタノール水溶液で連続的に分画し、それぞれの溶出画分について単位鎖分布を高性能陰イオン交換クロマトグラフィーにより分析した。高性能陰イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換樹脂が充填されたカラム（ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１）を用い、検出にはパルスドアンペロメトリー検出器を用いた。試料中のアルコールはカラムを劣化させる恐れがあるため、試料はいったん乾固し、１５０ｍＭ水酸化ナトリウムとなるように再溶解してから分析した。
【００３２】
図４はカートリッジに通液していない枝きりトウモロコシデンプン溶液（未処理デンプン）の単位鎖分布（Ａ）と、枝きりデンプン溶液の注入後メタノール水溶液で洗浄した画分の単位鎖分布を示したものである。図４中、Ｂは水洗滌画分、Ｃは２％メタノール洗滌画分、Ｄは３％メタノール洗滌画分、Ｅは４％メタノール洗滌画分、Ｆは６％メタノール洗滌画分、Ｇは８％メタノール洗滌画分そしてＨは１０％メタノール洗滌画分である。
【００３３】
未処理デンプンの単位鎖分布は，重合度６から検出され，分析６０分付近には二つの長鎖画分が溶出された。分画された枝きりデンプンのクロマトグラムにおいて，試料注入後蒸留水で洗浄した画分は重合度６から１９の単位鎖が検出され，試料注入後２％メタノールで洗浄した画分は重合度６から２６の単位鎖，試料注入後３％メタノールで洗浄した画分は重合度６から３１の単位鎖が検出された。未処理の枝きりデンプンに認められる長鎖画分は６％メタノールにより洗浄したときに初めて溶出され、以後はこの画分の回収量が増加した。このようにメタノール濃度を高くするにつれ，回収される単位鎖の重合度が増大することが明らかとなった。すなわち、分離溶出に用いるメタノール水溶液の濃度を設定することにより、枝切りデンプンの重合度別分画溶出が可能であることを確認した。
【００３４】
次に、５種の枝きりデンプン（トウモロコシデンプン、モチトウモロコシデンプン、コムギデンプン、サツマイモデンプン、ジャガイモデンプン）、枝きりグリコーゲンについて、その水溶液をＣ１８カートリッジに注入後、連続的に３％、８％、１０％メタノールでそれぞれ溶出した。ここでカートリッジを通過した未吸着画分と３％メタノール溶出画分はひとつの画分としてまとめた。図５は、それぞれの枝きりデンプンおよび枝きりグリコーゲンの分画前水溶液と、カートリッジ分画による各画分のゲルろ過溶出曲線を示したものである。図５中、Ａはトウモロコシデンプン、Ｂはコムギデンプン、Ｃはサツマイモデンプン、Ｄはジャガイモデンプン、Ｅはモチトウモロコシデンプン、Ｆはグリコーゲンについてのものである。また、図５中、実線は分画前水溶液、各記号は、３％メタノール溶出画分（○）、８％メタノール溶出画分（△）、１０％メタノール溶出画分（□）である。また、縦の点線は鎖長によってクロマトグラムを画分１，２および３に分けるラインである。
【００３５】
なお、ゲル濾過クロマトグラフィーはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５Ｆ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を充填したカラム（１．４×６６ｃｍ）を用いて行った。カラムは０．２％塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ水酸化ナトリウムを流速３０ｍｌ／ｈｒで溶出し、各画分（２ｍｌ）について全糖量をフェノール・硫酸法で測定した。カラムの較正には、合成直鎖アミロース（重合度＝２１５．６３）、枝きりグリコーゲン（重合度＝１１．２）、マルトヘプタオース、マルトース、グルコースを用いた。
【００３６】
表１に上記枝きりデンプンおよび枝きりグリコーゲンのカラム分離による各画分の割合を示す。うるち種のデンプンの溶出曲線は、高分子画分（表１および図５の画分１）と二つの低分子画分（表１および図５の画分２と画分３）に分けられ、それぞれ主にアミロース由来（画分１）とアミロペクチンを構成する長鎖（画分２）と短鎖由来（画分３）とされている。モチトウモロコシデンプンとグリコーゲンにはアミロース画分は認められなかった。
【００３７】
【表１】

【００３８】
ゲルろ過分析により、未吸着画分と３％メタノール溶出画分に含まれる単位鎖はアミロペクチン由来の短鎖画分（図５の画分３）に対応すること、８％メタノール溶出画分はアミロペクチンの長鎖画分（図５の画分２）に対応すること、１０％メタノール画分は一部のアミロース画分（図５の画分１）に対応することが明らかとなった。
【００３９】
枝切りデンプンは１０％メタノールで完全に回収することはできないが、これは天然のデンプンに長い単位鎖が存在することと一致した。また、コムギデンプンの１０％メタノール画分の回収量はトウモロコシデンプンのものより多く、別のゲルろ過Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂにより、このコムギデンプンのアミロース画分の単位鎖はトウモロコシデンプンより短いことを検証した。さらにサツマイモやジャガイモデンプンのアミロースは平均重合度が穀類デンプンより大きいことが知られており、両デンプンの１０％メタノール回収量が少ないことに矛盾がない。このように１０％メタノール画分の回収量はデンプンを構成する長鎖単位鎖、特にアミロースに関する情報を与えた。
【００４０】
上述の通り、本発明の手法を用いることで、グルカンをその重合度に応じて、簡便に分離・分画することが可能となる。
【００４１】
本発明の分離・分画方法において、分離するグルカンの種類等によって異なるが、使用できる逆相系分離基材としては例えば、表面官能基として長鎖のアルキル基が化学結合されたものが挙げられる。その長鎖アルキル基の中でも例えば、オクチル基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基等が挙げられるが、好ましくは、オクタデシル基、オクチル基である。
【００４２】
また、使用されるアルコールは、グルカンの種類や重合度合いによって異なるが、例えば、低級アルコール、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、２−メチル−１−プロパノール、２−メチル−２−プロパノールが挙げられる。その中でも好ましくは、メタノール、エタノールである。
【００４３】
次に、本発明を実施例によりさらに詳述する。なお、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００４４】
【実施例】
【００４５】
実施例１
本発明の手法を用いて１３種類の枝きりデンプン（１〜１３）の構造解析を行った。各デンプン溶液をイソアミラーゼにより単位鎖に分解（枝きり処理）した後、Ｃ１８カートリッジに通液し、次いで連続的に３％、８％，１０％メタノールで溶出した。このとき、カートリッジを通過した未吸着画分と３％メタノール溶出画分はひとつにとりまとめた（画分Ａ）。そして各溶出画分、すなわち画分Ａ、８％メタノール溶出画分（画分Ｂ）、１０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）の全糖量をフェノール・硫酸法を用いて求めた。また溶出不可能な画分（画分Ｄ）は注入した糖量と溶出した糖量から計算して求めた。その結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】

【００４７】
また、並行して従来のデンプン構造解析方法であるゲルろ過クロマトグラフィーにより解析し、溶出したピークを図５と同様に３画分に分け、各画分について全糖量を求めた。その結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】

【００４９】
図６は、表３に示されるパラメーターの相関を見たものである。ゲル濾過による画分１、２、３の割合は，それぞれカートリッジ分画法による１０％メタノール画分と溶出不可能な画分の合計（画分Ｃ＋画分Ｄ）、８％メタノール画分（画分Ｂ），未吸着画分と３％メタノール画分（画分Ａ）と良好な正相関を示し、本発明によるデンプンの構造解析方法が従来方法と同様にデンプンの構造解析に使用できることが確かめられた。さらに、アミロペクチンの構造指標である画分３と画分２の比は、画分Ａと画分Ｂの比と相関関係を示した。
【００５０】
すなわち、試料の注入後，適切な濃度のメタノール溶液でステップワイズ溶出することにより、ゲル濾過法と同様に、見かけのアミロース含量やアミロペクチンを構成する短鎖と長鎖の割合を知ることが可能であることがわかった。
【００５１】
実施例２
デンプンをα−アミラーゼで分解してマルトデキストリンを調製する際に分解率が低いと、直鎖状の高分子α−１，４−グルカンが僅かに残存し、それが製品の保存中に会合することで白濁が生じ商品価値が無くなることがある。そこで、このマルトデキストリンをオクタデシル基が化学結合した担体を充填したカラムに通液することにより、マルトデキストリン中の微量に存在する高分子α−１，４−グルカンを取り除くことを試みた。
【００５２】
まず、マルトデキストリンの１０％溶液１００Ｌを樹脂が充填した容積１Ｌのカラムに１０℃で、流速１０Ｌ／ｈｒで通液した。
【００５３】
このカラム通液したものとその原液を濃度５０％まで濃縮し、４℃で１０日間保存し、その後、白濁の有無を目視により確認した。その結果、カラムに通液していない原液は白濁が生じたのに対して、カラム通液した方に白濁は認められ無かった。従って、逆相系分離基材を充填したカラムにマルトデキストリンを通液することにより、白濁の原因となっている直鎖状の高分子α−１，４−グルカンを除去することができた。
【００５４】
実施例３
トウモロコシデンプンをイソアミラーゼで枝きりして得た枝きりデンプンの２．５％水溶液１０ｍｌをオクタデシル基が結合した担体が充填されたカラム（容積１００ｍｌ）に流速１ｍｌ／分で通液したのち、蒸留水で洗浄した。次にそのカラムに２％メタノール１０ｍｌを通液し吸着した枝きりデンプンを回収した。それの重合度を分析したところ２０−２６の範囲の重合度をもつ枝きりデンプンであった。
【００５５】
実施例４
タピオカデンプンをα−アミラーゼで分解して得たマルトデキストリン（分解率１０％）を１０ｍｇ／ｍｌになるように水に溶解し、その溶液２ｍｌをＣ１８カートリッジへ注入した。
【００５６】
未吸着画分（カートリッジ素通り画分）を回収した後、次いで５％エタノール溶液２ｍｌを注入し通過した液を回収した。
【００５７】
原液（分画前）、未吸着画分、５％エタノール溶出画分を高速液体ゲル濾過クロマトグラフィーで分析した。その結果を図７に示す。本方法により、マルトデキストリンを重合度によって分離分画することができた。
【００５８】
実施例５
トウモロコシデンプンをα−アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼで分解して得たグルコース高含有糖液を１０ｍｇ／ｍｌになるように水で溶解し、Ｃ１８カートリッジに注入した後、原液（Ｃ１８カートリッジ通液前のぶどう糖溶液）とカートリッジ通過液（Ｃ１８カートリッジ通過後のぶどう糖溶液）の糖組成を高速液体クロマトグラフィーで分析した。その結果を図８に示す。原液は重合度４以上のものが、０．５％含まれていたのに対して、カートリッジ通過液は０．２％に減少していた。それに伴って、グルコース含有量は原液が９５．８％であったのに対して、通過液は９６．１％であり、Ｃ１８カートリッジを通すことによりグルコース含有量を高めることが可能となった。
【００５９】
【発明の効果】
本発明によれば、逆相系分離基材を用いて、グルカンの吸着特性を利用することによって、より簡便且つ安価にグルカンを分離・分画することができる。また、重合度に応じてデンプンの単位鎖を分離することが可能なため、デンプンの構造解析に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｃ８カートリッジとＣ１８カートリッジに対するアミロースとアミロペクチンの吸着曲線。
【図２】逆相カートリッジ（Ｃ８カートリッジ）へのグルコースおよびα−１，４−グルカンの吸着性。各水溶液をＣ８カートリッジに注入し、水洗浄後１０％メタノールで溶出した。
【図３】逆相カートリッジ（Ｃ１８カートリッジ）へのグルコースおよびα−１，４−グルカンの吸着性。各水溶液をＣ１８カートリッジに注入し、水洗後１０％メタノールで溶出した。
【図４】Ｃ１８カートリッジから溶出されたデンプン単位鎖の鎖長分布。
【図５】セファデックスＧ７５ゲルろ過カラムによる枝切りデンプンの鎖長分布とＣ１８カートリッジ分画後の鎖長分布。
【図６】ゲルろ過法とカートリッジ分画法により求めた鎖長分布の相関図。（画分３／画分２）と（画分Ａ／画分Ｂ）の関係の場合はグリコーゲンの値は省いた。一方、内部の図はグリコーゲンの値を含む。
【図７】Ｃ１８カートリッジによるデンプン分解物の分画。
【図８】Ｃ１８カートリッジによるぶどう糖溶液中に含有する高分子の除去。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel and simple method for separation and fractionation of glucan that makes glucan come into contact with a reverse phase separation substrate and separates depending on the degree of polymerization by utilizing the interaction with the substrate. The present invention also relates to a method for easily analyzing the structure of starch by separating and fractionating starch-branched enzyme degradation products (branched starch) according to the degree of polymerization.
[0002]
[Prior art]
Starch has a structure in which unit chains composed of α-1,4-glucan are branched by α-1,6-linkages. The distribution of the unit chains constituting the starch varies depending on the plant species and varieties, and is greatly related to the functional properties of the starch, so it is very important information for evaluating the properties of the starch.
[0003]
A common starch unit chain analysis method is to prepare a branched starch by hydrolyzing starch molecules into each unit chain with pullulanase or isoamylase, and subjecting it to gel filtration chromatography. The chromatographic elution curve represents the distribution of the unit chains. In this measurement, it is necessary to determine the total amount of sugar in each fraction after separation and fractionation using a column packed with an appropriate gel carrier, but this method has the disadvantage of requiring complicated work and long-term analysis. In addition, instrumental analysis using high-performance liquid gel filtration chromatography and a differential refractometer has also been performed, but this also has a difficulty in that it takes a long time for analysis and requires expensive equipment. On the other hand, since the information regarding the structure of starch is important information in the field of plant variety improvement and the food industry, a simpler and less expensive method for analyzing starch structure is desired.
[0004]
Some glucans have various degrees of polymerization, and their physical properties vary greatly depending on the degree of polymerization. For example, when starch is decomposed with α-amylase, the molecular weight is reduced, and accordingly, the viscosity of the aqueous solution of the starch degradation product is reduced. Moreover, although α-1,4-glucan is known to interact with lipids, the interaction varies greatly depending on the degree of polymerization. When these glucans are used, it is necessary to separate and fractionate glucans having a specific degree of polymerization in order to enhance the target function, but there is no simple and highly accurate separation / fractionation method. Currently.
[0005]
Starch molecules are known to interact with linear low molecular weight compounds such as iodine, butanol, and lipids. Many studies have been conducted since this effect affects the quality of starchy products.
[0006]
A reverse phase separation base material having a structure similar to the hydrophobic portion of a lipid is obtained by binding a hydrophobic functional group to a carrier, and is utilized for separation and concentration of a specific component by utilizing the hydrophobicity. For example, a cartridge filled with this base material is commercially available. By injecting a mixed solution into the cartridge and bringing it into contact with the base material, removal of a substance having hydrophobicity such as protein or aromatic, or concentration, Purification is possible and widely used.
[0007]
In addition, this reverse phase resin is widely used for analysis of oligosaccharides as a packing material for a column for high performance liquid chromatography. As this base material, a column in which octadecyl group (C18) or octyl group (C8) is bonded to silica as a surface functional group is widely used. As other reversed phase separation base materials, those having polystyrene or the like as a functional group are commercially available.
[0008]
However, until now, the interaction between such a reverse phase substrate and glucan has not been clarified, and an example of using a reverse phase substrate for the purpose of glucan separation or starch unit chain analysis Is not known.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for separating or fractionating more easily and accurately in accordance with the degree of polymerization by utilizing the adsorption characteristics of glucan to a reverse phase separation substrate.
[0010]
Another object of the present invention is to provide a method for analyzing starch structure using the above method.
[0011]
Still another object of the present invention is to provide a method for producing glucan having a specific polymerization degree distribution.
[0012]
Still other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following description.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have studied the interaction between the reversed-phase separation substrate and glucan, and that glucan is adsorbed on the reversed-phase separation substrate in the process, and further, the linear α which is a unit chain of starch. The present inventors have found that -1,4-glucan is adsorbed and the adsorptivity thereof depends on the degree of polymerization, and arrived at the present invention based on the investigation fact.
[0014]
That is, according to the present invention, the above objects and advantages of the present invention are as follows. First, an aqueous solution of glucan is brought into contact with a reverse phase separation substrate to adsorb the glucan to the substrate, and then mixed with alcohol and water. A method of eluting an adsorbing component having a predetermined degree of polymerization with a solvent, wherein the glucan is linear amylose or branched starch and the reverse phase separation substrate is an octyl group, decyl group, dodecyl group, tetradecyl group It is achieved by a method for separating or fractionating glucan, characterized in that it has a carrier in which a long-chain alkyl group that is one of hexadecyl group and octadecyl group is chemically bonded .
[0015]
In addition, according to the present invention, the above-mentioned objects and advantages of the present invention are as follows. Second, an aqueous solution of glucan is brought into contact with a reverse phase separation substrate to adsorb the glucan to the substrate, and then alcohol and water are used. A method of eluting the adsorbed component according to the degree of polymerization by continuously treating with a mixed solvent at different alcohol concentrations or intermittently with mixed solvents having different alcohol concentrations, wherein the glucan is a linear amylose Or a branch starch, and the reverse phase separation substrate is a carrier in which a long chain alkyl group that is one of octyl group, decyl group, dodecyl group, tetradecyl group, hexadecyl group and octadecyl group is chemically bonded. It is achieved by a method for separating or fractionating glucan characterized by having
[0016]
In addition, according to the present invention, the above objects and advantages of the present invention are thirdly achieved by producing a glucan having a specific degree of polymerization using the above separation / fractionation method.
[0017]
Preferred Embodiment of the Invention
This will be described in detail below.
[0018]
As a reverse phase separation substrate, a cartridge filled with silica gel chemically bonded with octyl groups (abbreviated as C8 cartridge) or a cartridge filled with silica gel chemically bonded with octadecyl groups (abbreviated as C18 cartridge) was used. The adsorption characteristics were examined by the following method.
[0019]
Amylose or amylopectin (10 mg) was dissolved in 1M sodium hydroxide (100 μl), diluted with an appropriate amount of distilled water, and neutralized with 1M acetic acid (300 μl) to pH 4.0-4.3. 2% sodium azide (1 ml) was added, and the volume was adjusted to 100 ml with distilled water. The solution was kept at 20 ° C. and used for the experiment.
[0020]
Using a syringe, amylose or amylopectin solution (5 ml) was passed through the cartridge at a flow rate of about 2 ml / min. At this time, the solution remaining in the cartridge was recovered by injecting air. This operation was repeated, and the total sugar amount of each fraction was measured by the phenol / sulfuric acid method. The amount of adsorption was defined as the difference in total sugar amount before and after passing through the cartridge.
[0021]
FIG. 1 shows the amount adsorbed on each cartridge with respect to the added amylose and amylopectin. In FIG. 1, the adsorption curve for the C8 cartridge is indicated by black symbols, and the symbol for the C18 cartridge is indicated by white symbols. The circle symbol is for amylose and the triangle symbol is for amylopectin. Any glucan was clearly adsorbed on the cartridge. It was revealed that the adsorption amount of the C18 cartridge was about three times that of the C8 cartridge.
[0022]
Next, the separation conditions of glucan adsorbed on the C18 cartridge were examined using an alcohol aqueous solution. Methanol was used as the alcohol. First, after glucan was adsorbed on the cartridge, it was eluted sequentially with 5%, 10%, 20%, and 30% aqueous methanol. As a result, 24% amylose and 47% amylopectin were recovered when eluted with 10% methanol. Was good.
[0023]
Further, when an aqueous solution of other alcohol (ethanol, propanol or butanol) was used, the recovery rate was 23-24% for amylose and 20-25% for amylopectin, and it was possible to recover even other alcohols. .
[0024]
Since a difference was previously observed in the adsorptivity between amylose and amylopectin, the adsorptivity was examined by the following method using α-1,4-glucan and glucose having different degrees of polymerization. As α-1,4-glucan, linear amylose having maltose, maltoheptaose and polymerization degrees of 63, 215, 438, 722, and 1953 was used.
[0025]
Glucose and α-1,4-glucan (10 mg) were dissolved in 1M sodium hydroxide (100 μl) and neutralized with 1M acetic acid (300 μl). 2% sodium azide (100 μl) was added, and the volume was adjusted to 10 ml with distilled water.
[0026]
The sample solution (2.5 ml) was passed through the cartridge at a flow rate of about 2 ml / min in the same manner as described above, and then passed through distilled water and a 10% aqueous methanol solution at a flow rate of about 4 ml / min. All the solutions used were kept at 20 ° C. The total sugar amount of each fraction was measured by the phenol / sulfuric acid method and used as the recovery rate.
[0027]
2 and 3 show the recovery rate after passing α-1,4-glucan and glucose through the cartridge. 2 and 3, □,
[0028]
[Outside 1]

[0029]
And ■ indicate the non-adsorbed fraction, the water-washed fraction and the 10% methanol fraction, respectively. In the case of the C8 cartridge (FIG. 2), it was found that glucose, maltose and maltoheptaose were almost recovered in the sample injection and distilled water washing fractions, and these were not adsorbed. In the linear amylose, the recovered amounts of the unadsorbed fraction and the water-washed fraction decreased, and the remaining amylose was recovered in the 10% methanol-washed fraction except for the degree of polymerization 1953. In the C18 cartridge (FIG. 3), glucose and maltose were substantially not adsorbed, while linear amylose was completely adsorbed. Amylose with a degree of polymerization of 63 and 215 was completely recovered in the 10% methanol wash fraction, and the recovery of longer amylose decreased with increasing degree of polymerization. These results suggest that the reverse phase cartridge adsorptivity of α-1,4-glucan is dependent on the degree of polymerization, and the present inventors use this fact to convert linear amylose based on the degree of polymerization. It was confirmed that fractionation was possible.
[0030]
Next, a method for fractionating starch from branch using a C18 cartridge was examined. Non-fat corn starch was prepared by repeating dimethyl sulfoxide dissolution and ethanol precipitation three times. 10 mg of this starch is gelatinized, to which 1 unit (5 μl) of isoamylase (manufactured by Megazyme) is added, and the volume is made up to 10 ml. After reacting at 45 ° C. for 16 hours, boiling for 10 minutes to make a branched starch solution. Prepared.
[0031]
This branched starch solution was passed through a C18 cartridge and then fractionated successively with distilled water or aqueous methanol solutions of different concentrations (2%, 3%, 4%, 6%, 8%, 10%). The unit chain distribution of the eluted fraction was analyzed by high performance anion exchange chromatography. For high performance anion exchange chromatography, a column (CarboPac PA1) packed with an anion exchange resin was used, and a pulsed amperometric detector was used for detection. Since alcohol in the sample may deteriorate the column, the sample was once dried and redissolved to 150 mM sodium hydroxide before analysis.
[0032]
FIG. 4 shows the unit chain distribution (A) of the branched corn starch solution (untreated starch) not passed through the cartridge, and the unit chain distribution of the fraction washed with an aqueous methanol solution after the branch starch solution was injected. Is. In FIG. 4, B is a water-washed fraction, C is a 2% methanol-washed fraction, D is a 3% methanol-washed fraction, E is a 4% methanol-washed fraction, F is a 6% methanol-washed fraction, and G is 8 % Methanol wash fraction and H is 10% methanol wash fraction.
[0033]
The unit chain distribution of untreated starch was detected from the degree of polymerization of 6, and two long chain fractions were eluted around 60 minutes of analysis. In the fractionated branch starch chromatogram, a unit chain having a polymerization degree of 6 to 19 was detected in the fraction washed with distilled water after sample injection, and the fraction washed with 2% methanol after the sample injection had a degree of polymerization of 6 From the fraction washed with 3% methanol after sample injection, unit chains with a degree of polymerization of 6 to 31 were detected. The long chain fraction found in untreated branch starch was eluted for the first time when washed with 6% methanol, and thereafter the recovered amount of this fraction increased. Thus, it became clear that as the methanol concentration was increased, the degree of polymerization of the recovered unit chains increased. That is, it was confirmed that fraction elution according to the degree of polymerization of debranched starch was possible by setting the concentration of the aqueous methanol solution used for separation and elution.
[0034]
Next, for 5 types of branch starch (corn starch, waxy corn starch, wheat starch, sweet potato starch, potato starch), and branching glycogen, 3%, 8%, Each was eluted with 10% methanol. Here, the non-adsorbed fraction that passed through the cartridge and the 3% methanol-eluted fraction were collected as one fraction. FIG. 5 shows the gel filtration elution curves of the respective fractions of the branched starch and the branched glycogen before fractionation and the cartridge fractionation of each fraction. In FIG. 5, A is corn starch, B is wheat starch, C is sweet potato starch, D is potato starch, E is waxy corn starch, and F is glycogen. In FIG. 5, the solid line is the aqueous solution before fractionation, and each symbol is the 3% methanol elution fraction (◯), 8% methanol elution fraction (Δ), and 10% methanol elution fraction (□). The vertical dotted line is a line that divides the chromatogram into fractions 1, 2, and 3 according to the chain length.
[0035]
Gel filtration chromatography was performed using a column (1.4 × 66 cm) packed with Sephadex G75F (Amersham Bioscience). The column was eluted with 20 mM sodium hydroxide containing 0.2% sodium chloride at a flow rate of 30 ml / hr, and the total sugar amount of each fraction (2 ml) was measured by the phenol / sulfuric acid method. For the calibration of the column, synthetic linear amylose (polymerization degree = 215.63), branched glycogen (polymerization degree = 11.2), maltoheptaose, maltose and glucose were used.
[0036]
Table 1 shows the ratio of each fraction obtained by column separation of the above-mentioned branched starch and branched glycogen. The elution curve of the starch of the glutinous species is divided into a high molecular fraction (Fraction 1 in Table 1 and FIG. 5) and two low molecular fractions (Fraction 2 and Fraction 3 in Table 1 and FIG. 5). These are mainly derived from amylose (fraction 1), the long chain (fraction 2) constituting the amylopectin, and the short chain (fraction 3). No amylose fraction was found in waxy maize starch and glycogen.
[0037]
[Table 1]

[0038]
According to gel filtration analysis, the unit chains contained in the unadsorbed fraction and the 3% methanol elution fraction correspond to the short chain fraction derived from amylopectin (fraction 3 in FIG. 5), and the 8% methanol elution fraction represents the amylopectin. It was revealed that the 10% methanol fraction corresponds to a part of the amylose fraction (fraction 1 in FIG. 5).
[0039]
Although debranched starch cannot be completely recovered with 10% methanol, this was consistent with the presence of long unit chains in natural starch. Moreover, the recovery amount of the 10% methanol fraction of wheat starch was larger than that of corn starch, and it was verified by another gel filtration Sepharose CL-4B that the unit chain of the amylose fraction of this wheat starch was shorter than that of corn starch. . Furthermore, amylose of sweet potato and potato starch is known to have an average degree of polymerization greater than that of cereal starch, and there is no contradiction that the amount of 10% methanol recovered from both starches is small. Thus, the recovered amount of the 10% methanol fraction gave information on the long-chain unit chains constituting starch, particularly amylose.
[0040]
As described above, by using the method of the present invention, glucan can be easily separated and fractionated according to the degree of polymerization.
[0041]
In the separation / fractionation method of the present invention, the reversed-phase separation substrate that can be used varies depending on the type of glucan to be separated, but examples include those in which a long-chain alkyl group is chemically bonded as a surface functional group. . Among the long-chain alkyl groups, for example, an octyl group, a decyl group, a dodecyl group, a tetradecyl group, a hexadecyl group, an octadecyl group, and the like can be mentioned, and an octadecyl group and an octyl group are preferable.
[0042]
The alcohol used varies depending on the type of glucan and the degree of polymerization. For example, lower alcohols such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-1- Examples include propanol and 2-methyl-2-propanol. Among these, methanol and ethanol are preferable.
[0043]
Next, the present invention will be described in further detail with reference to examples. In addition, this invention is not limited to these at all.
[0044]
【Example】
[0045]
Example 1
Structural analysis of 13 types of branch starch (1-13) was performed using the technique of the present invention. Each starch solution was decomposed into unit chains (branching treatment) with isoamylase, passed through a C18 cartridge, and then eluted successively with 3%, 8% and 10% methanol. At this time, the unadsorbed fraction that passed through the cartridge and the 3% methanol-eluted fraction were collected together (fraction A). And the total sugar amount of each elution fraction, ie, fraction A, 8% methanol elution fraction (fraction B), and 10% methanol elution fraction (fraction C) was determined using the phenol / sulfuric acid method. The fraction that cannot be eluted (fraction D) was calculated from the amount of injected sugar and the amount of eluted sugar. The results are shown in Table 2.
[0046]
[Table 2]

[0047]
Moreover, it analyzed by the gel filtration chromatography which is the conventional starch structure analysis method in parallel, and the eluted peak was divided into 3 fractions like FIG. 5, and the total sugar amount was calculated | required about each fraction. The results are shown in Table 3.
[0048]
[Table 3]

[0049]
FIG. 6 shows the correlation of the parameters shown in Table 3. The proportions of fractions 1, 2, and 3 by gel filtration are the sum of the 10% methanol fraction and the fraction that cannot be eluted by the cartridge fractionation method (fraction C + fraction D), and the 8% methanol fraction (fraction), respectively. Fraction B), unadsorbed fraction and 3% methanol fraction (fraction A) showed a good positive correlation, confirming that the starch structure analysis method according to the present invention can be used for starch structure analysis as in the conventional method. It was. Furthermore, the ratio of fraction 3 and fraction 2 as the structural index of amylopectin showed a correlation with the ratio of fraction A and fraction B.
[0050]
In other words, after sample injection, stepwise elution with a methanol solution of an appropriate concentration can be used to know the apparent amylose content and the ratio of short and long chains constituting amylopectin, as in gel filtration. I found out.
[0051]
Example 2
When maltodextrin is prepared by degrading starch with α-amylase, if the degradation rate is low, a small amount of linear polymer α-1,4-glucan remains and associates during storage of the product. As a result, cloudiness may occur and the commercial value may be lost. Therefore, an attempt was made to remove the polymer α-1,4-glucan present in a trace amount in maltodextrin by passing this maltodextrin through a column packed with a carrier chemically bonded with octadecyl groups.
[0052]
First, 100 L of a 10% solution of maltodextrin was passed through a 1 L volume column packed with resin at 10 ° C. at a flow rate of 10 L / hr.
[0053]
The column and its stock solution were concentrated to a concentration of 50%, stored at 4 ° C. for 10 days, and then visually checked for the presence of white turbidity. As a result, the stock solution that did not pass through the column was clouded, whereas no cloudiness was observed in the column. Therefore, by passing maltodextrin through a column packed with a reverse phase separation base material, the linear polymer α-1,4-glucan causing white turbidity could be removed.
[0054]
Example 3
After passing 10 ml of a 2.5% aqueous solution of debranched starch obtained by pruning corn starch with isoamylase through a column (volume 100 ml) packed with a carrier bound with octadecyl group at a flow rate of 1 ml / min, distillation was performed. Washed with water. Next, 10 ml of 2% methanol was passed through the column to recover the adsorbed branch starch. Analysis of the degree of polymerization revealed that it was a branched starch having a degree of polymerization in the range of 20-26.
[0055]
Example 4
Maltodextrin obtained by decomposing tapioca starch with α-amylase (decomposition rate 10%) was dissolved in water to 10 mg / ml, and 2 ml of the solution was injected into a C18 cartridge.
[0056]
After collecting the non-adsorbed fraction (cartridge passing fraction), 2 ml of 5% ethanol solution was then injected and the liquid passed through was collected.
[0057]
The stock solution (before fractionation), the non-adsorbed fraction, and the 5% ethanol elution fraction were analyzed by high performance liquid gel filtration chromatography. The result is shown in FIG. By this method, maltodextrin could be separated and fractionated according to the degree of polymerization.
[0058]
Example 5
A sugar-rich sugar solution obtained by degrading corn starch with α-amylase, pullulanase, and glucoamylase is dissolved in water to 10 mg / ml, poured into a C18 cartridge, and then the stock solution (before the C18 cartridge is passed through). The sugar composition of the glucose solution) and the cartridge passing solution (the glucose solution after passing through the C18 cartridge) were analyzed by high performance liquid chromatography. The result is shown in FIG. The stock solution contained 0.5% of those having a polymerization degree of 4 or more, whereas the solution passing through the cartridge was reduced to 0.2%. Along with this, the glucose content was 95.8% in the stock solution, whereas the passing solution was 96.1%, and it was possible to increase the glucose content by passing through a C18 cartridge.
[0059]
【The invention's effect】
According to the present invention, glucan can be separated and fractionated more easily and inexpensively by utilizing the adsorption characteristics of glucan using a reverse phase separation substrate. In addition, since the starch unit chain can be separated according to the degree of polymerization, it can be used for structural analysis of starch.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 Adsorption curves of amylose and amylopectin for C8 and C18 cartridges.
FIG. 2 shows the adsorptivity of glucose and α-1,4-glucan to a reverse phase cartridge (C8 cartridge). Each aqueous solution was poured into a C8 cartridge, washed with water and eluted with 10% methanol.
FIG. 3 shows the adsorptivity of glucose and α-1,4-glucan to a reverse phase cartridge (C18 cartridge). Each aqueous solution was poured into a C18 cartridge, washed with water and eluted with 10% methanol.
FIG. 4 Chain length distribution of starch unit chains eluted from C18 cartridge.
FIG. 5 shows the chain length distribution of debranched starch by a Sephadex G75 gel filtration column and the chain length distribution after C18 cartridge fractionation.
FIG. 6 is a correlation diagram of chain length distributions determined by gel filtration and cartridge fractionation. In the case of the relationship of (fraction 3 / fraction 2) and (fraction A / fraction B), the value of glycogen was omitted. On the other hand, the inside figure contains the value of glycogen.
FIG. 7 Fractionation of starch degradation product with C18 cartridge.
FIG. 8: Removal of polymer contained in a glucose solution using a C18 cartridge.

Claims (4)

グルカンの水溶液を逆相系分離基材に接触させてグルカンを該基材に吸着させ、次いでアルコールおよび水の混合溶媒で所定の重合度を持つ吸着成分を溶離せしめる方法であって、上記グルカンが直鎖アミロースまたは枝きりでんぷんでありそして上記逆相系分離基材がオクチル基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基およびオクタデシル基のうちのいずれかである長鎖アルキル基が化学結合された担体を有するものである、ことを特徴とするグルカンの分離または分画方法。An aqueous solution of glucan is brought into contact with the reversed phase permeable substrate to adsorb the glucan to the substrate, and then a method in which elution of the adsorbed components with a predetermined degree of polymerization in a mixed solvent of alcohol and water, the glucan A long-chain alkyl group, which is a linear amylose or branched starch and the reverse phase separation substrate is one of an octyl group, a decyl group, a dodecyl group, a tetradecyl group, a hexadecyl group and an octadecyl group, is chemically bonded. A method for separating or fractionating glucan, characterized in that it has a carrier . グルカンの水溶液を逆相系分離基材に接触させてグルカンを該基材に吸着させ、次いで、アルコールおよび水の混合溶媒で、アルコール濃度を連続的に変えながら、あるいは、アルコール濃度の異なる混合溶媒で断続的に処理して、重合度に応じて吸着成分を溶離せしめる方法であって、上記グルカンが直鎖アミロースまたは枝きりでんぷんでありそして上記逆相系分離基材がオクチル基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基およびオクタデシル基のうちのいずれかである長鎖アルキル基が化学結合された担体を有するものである、ことを特徴とするグルカンの分離または分画方法。An aqueous solution of glucan is brought into contact with a reverse phase separation substrate to adsorb the glucan onto the substrate, and then mixed with a mixed solvent of alcohol and water, while continuously changing the alcohol concentration, or mixed solvents having different alcohol concentrations. In which the adsorbed component is eluted according to the degree of polymerization, wherein the glucan is linear amylose or branched starch and the reverse phase separation substrate is an octyl group, a decyl group, A method for separating or fractionating glucan, comprising a carrier having a long-chain alkyl group, which is any one of a dodecyl group, a tetradecyl group, a hexadecyl group, and an octadecyl group, chemically bonded thereto . アルコールが、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール１−ブタノール、２−ブタノール、２−メチル−１−プロパノールおよび２−メチル−２−プロパノールよりなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１または２に記載の方法。  The alcohol is at least one selected from the group consisting of methanol, 1-propanol, 2-propanol 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-1-propanol and 2-methyl-2-propanol. Or the method of 2. 請求項１の方法を用いて、特定の重合度分布を有するグルカンを製造する方法。  A method for producing glucan having a specific polymerization degree distribution using the method of claim 1.

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