JP4388660B2 - Experimental animal having specific bacteria as intestinal flora and method for producing the same - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定細菌を腸内菌叢として有する新規な実験用動物の作出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトや動物の腸内には、数100種にも及ぶ微生物が生息しており、互いに共生あるいは拮抗しながら腸内菌叢を構成している。この腸内菌叢は、加齢と共に変化するものの、宿主の健康が維持されている限りにおいては、その構成は極めて安定しているとされている。その反面、ストレスや疾病等の要因により健康が損なわれた場合には、腸内菌叢のバランスが崩れていることが少なくない。
【０００３】
一方で、無菌動物と通常動物との比較等から、この腸内菌叢が、宿主動物の栄養生理や感染防御、すなわち健康と疾病とに大きく影響することが明らかにされてきている。
【０００４】
近年では、この腸内菌叢の宿主への影響を積極的に利用することで、健康に寄与させることも試みられており、腸内菌叢を制御する目的で、宿主の有する常在菌叢の一員であり、かつ宿主に対して明確な有用性を示す微生物であるところの「プロバイオティクス」や、これらプロバイオティクスを含む腸内の有用微生物に選択的に利用され得る物質であるところの「プレバイオティクス」の探索が積極的に行われている。
【０００５】
また、各種薬剤が腸内環境に多大な影響を与えることも多く、場合により下痢等の様な副作用を誘発することも少なくない。これらの副作用は時として患者の容体に強く関わってくることがあるだけに、薬剤の安全性は腸内菌叢との関わりの面でも検討されている。
【０００６】
ところで、これらプロバイオティクス及びプレバイオティクスの検索や、薬剤の安全性の検討には、ヒトを用いて試験することが最も望ましいが、倫理上、或はコストの面で問題があった。そのため、これまでは試験管内でヒトの腸内細菌を連続培養した人工消化管モデルや、マウスやラット等の実験用動物が使用されていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、試験管を用いたヒト消化管モデルで検討できる内容は腸内菌叢の応答にかぎられており、生体での応答を検討するには不十分であった。また、ヒトとマウスやラット等の実験用動物とでは保有する常在菌叢に差異があり、この動物実験で得られた結果がヒトでは再現されない場合も往々にして存在した。
【０００８】
これらの問題点を考慮した方法として、無菌条件下で飼育し、全く腸内菌叢の存在しない動物に、ヒト由来の腸内細菌を投与した実験用動物も考案されるが、腸内の菌叢はヒトのものであっても、腸の生理的及び環境的状態は無菌動物と同様未成熟のままであり、正常な腸内環境を反映するとは言い難いものであった。
【０００９】
本発明は、特定細菌を腸内菌叢として常在させる実験用動物及びその作出方法を得ることを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載された発明に係る特定細菌を腸内菌叢として有する実験用動物は、無菌動物に、該動物と同種の動物から得られたセグメント細菌と、予め定められた複数種の属からなる腸内細菌とが投与されてなる実験用動物であって、
前記無菌動物が、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、又は、ヒツジの何れかから選ばれ、
前記腸内細菌が、ヒト腸内菌叢由来のものであることを特徴とする特定細菌を腸内菌叢として有するものである。
【００１２】
請求項２に記載された発明に係る特定細菌を腸内菌叢として有する実験用動物は、請求項１に記載された無菌動物が、マウスである。
【００１４】
請求項３に記載された発明に係る特定細菌を腸内菌叢として有する実験用動物の作出方法は、無菌動物に、予め用意された該動物と同種の動物から得られたセグメント細菌と、定着させることを目的とする予め定められた複数種の属からなる腸内細菌の菌液とを経口投与した後、常法により飼育する実験用動物の作出方法であって、
前記無菌動物が、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、又は、ヒツジの何れかから選ばれ、
前記腸内細菌が、ヒト腸内菌叢由来のものであることを特徴とする方法である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明においては、無菌動物に、該動物と同種の動物から得られたセグメント細菌と、ヒトを含む動物由来の予め定められた複数種の属からなる腸内細菌とが投与されてなるものであるため、目的の予め定められた複数種の属からなる腸内細菌を腸内菌叢として常在させる実験用動物を得ることができる。
【００１６】
本発明における無菌動物とは、目的の予め定められた複数種の属からなる腸内細菌を投与する際に、この腸内細菌を腸内菌叢として常在させることを妨げる腸内細菌が存在しない、更には、口腔、咽頭等の消化器官中に細菌が存在しない動物を指す。例えば、薬剤等で腸内細菌等の消化器官中の細菌を一掃した動物や、より好ましくは無菌飼育下で成育した動物など、通常、実験用動物に供される動物を指す。また、市販の動物はもとより、作出された新しい系統のものであってもよく、その系統、製造メーカー等に関係なく使用することができる。
【００１７】
無菌動物として、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、又は、ヒツジの何れかから選ばれる。より好ましくは無菌飼育が容易なマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタから選ばれ、更に好ましくはコストの面又は汎用性から特にマウス及びラットが望ましい。
【００１８】
本発明で付言したセグメント細菌とは、繊維状の形態的特徴を有する動物の腸内に常在細菌の一つであり、本発明では宿主となる無菌動物と同種の動物から得られたセグメント細菌を用いる。より好ましくは、本発明者らが提案した方法（特開平８−２１４８７３号公報）を用いて単離、培養及び継代された、繊維状の形態的特徴を持つセグメント細菌を用いる。
【００１９】
尚、このセグメント細菌は、特定の動物の小腸上皮細胞を採取し、無菌の同種の動物に無菌的に投与し、飼育する操作を繰り返すことにより単離することができることが確認されている（特開平８−２１４８７３号公報）。しかしながら、生体外で培養するための有効な培養方法が確立されておらず、現行の寄託制度のもとでは寄託機関に寄託することが不可能である。
【００２０】
従って、株式会社ヤクルト本社中央研究所（所在地；東京都国立市谷保１７９６ 電話番号；０４２５−７７−８９６０）において、マウス由来セグメント細菌を、セグメント細菌ＢＡＬ０１として、分譲可能な状態に保存されており、必要に応じて第三者が入手することができるようになっている。
【００２１】
また、セグメント細菌の調製法、あるいは動物への投与法は、本発明者らが提案した方法（特開平８−２１４９００号公報）に従えばよい。
【００２２】
本発明で用いる腸内細菌は、ヒトを含む動物由来のものであれば良い。従って、宿主動物と同種の動物以外の動物であっても、腸内菌叢を形成することが可能となる。特に、ヒト腸内菌叢由来の腸内細菌を用いることにより、マウス、ラット等の実験動物に投与して、ヒト腸内菌叢を腸内に有する実験動物を得ることが可能となり、プロバイオティクス及びプレバイオティクスの検索や、薬剤の安全性の検討を図れる。
【００２３】
また、腸内細菌はどのような方法で得たものを使用しても良く、糞便の懸濁液、あるいは直接腸管から採取するなどの方法がある。また、目的に合わせて、特定の疾病患者から入手したものを使用しても良く、得られた菌株をすべて使用しても良いが、得られた菌株から特定の菌株を選択して使用することもできる。
【００２４】
本発明の実験用動物の作出方法は、無菌動物に、前記のセグメント細菌及び、定着させることを目的とする１種以上の腸内細菌の菌液を常法により経口的に投与した後、常法により飼育すれば良い。菌液投与後、約７〜14日後にヒト腸内細菌が最優勢な腸内菌叢を有する実験用動物を作成することができる。
【００２５】
尚、セグメント細菌と、定着させることを目的とする複数種の属からなる腸内細菌との投与する順番も特に規定されず、同時に投与しても良いが、好ましくは先にセグメント細菌を投与し、定着を確認した後に、目的とする複数種の属からなる腸内細菌を投与する順番が良い。
【００２６】
また、ラクトバチルス属菌などの定着し難いとされる細菌の場合は、セグメント細菌の定着後、まず目的とする１種以上の腸内細菌群から単離したラクトバチルス属菌などの定着し難いとされる細菌のみを定着させ、その後目的とする他の複数種の属からなる腸内細菌を投与する順番が良い場合がある。
【００２７】
【実施例】
次に試験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（ヒト型腸内菌叢を有する実験用動物の作出）
雌１６〜１７週齢の無菌マウス（BALB／c）１６匹に、予め調製されたセグメント細菌およびヒト腸内細菌を経口投与した。投与後１４、３０日後に糞便の塗抹標本を作成し、セグメント細菌およびヒト腸内細菌の定着を確認した。
【００２８】
該無菌マウス糞便中のセグメント細菌の菌数の測定は、上記により作成した糞便の塗抹標本をグラム染色し、直接鏡検によって行った。また、ヒト腸内細菌の菌数の測定は、各種選択培地を用いて行った。投与後１４日後の結果を次の表１に示す。尚、３０日後の結果は１４日後の結果と同様であった。
【００２９】
【表１】

【００３０】
表１に示した通り、投与後14日後で、糞便中にセグメント細菌、およびヒト腸内細菌の定着を確認した。
【００３１】
詳しくは、ヒト腸内細菌としては、バクテロイデス群（Bacteroidaceae）、ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacteria）、大腸菌群（Enterobacteriaceae）、腸球菌（Enterococci）、クロストリジウム属菌（Clostridia）が確認できた。通常、ビフィドバクテリウム属菌は、人糞便中では他の菌に比べて優勢であるが、逆にマウス糞便中では劣勢である。一方、クロストリジウム属菌は人糞便中では劣勢であるが、逆にマウス糞便中では優勢であるとされている。
【００３２】
本試験においても、各種選択培地を用いて測定したバクテロイデス群およびビフィドバクテリウム属菌は優勢であり、クロストリジウム属菌は劣勢を示し、人と同様の傾向を示した。また、糞便の塗抹標本をグラム染色し、直接鏡検した結果からも投与したマウス由来のセグメント細菌が定着していることが確認された。
【００３３】
実施例２（ヒト型腸内菌叢を有する実験用動物の生理作用）
ヒト型腸内菌叢を有するマウスの生理作用を検証した。実施例１で得られたヒト型腸内菌叢を有するマウスを断頭放血して開腹し、腸を取り出した。パイエル板、腸間膜を除き、腸を切り開いて、冷ＰＢＳで内容物を充分に洗浄した。小腸を１〜1.5 ｃｍに切り刻み、0.45ｍＭジチオスレイトール（dithiothreitol）を含むカルシウムおよびマグネシウム不含ハンクス平衡塩類溶液（ハンクス液；シグマ社製）を２０ｍｌ／ｈｅａｄ加えて往復型シェーカー（１００ｒｐｍ、２５℃）で振盪し、５分毎に５回培地を交換した。
【００３４】
その後、２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した上記培地に加えて、３７℃、１３０ｒｐｍで１０分毎に３回振盪した。その後の腸上皮細胞を含む上部液を集めて１０００ｒｐｍ、１０分の遠心を行った。沈殿物を５％ＦＣＳ・ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁して３７℃で２時間加温した。大きな凝集物を除き、残りを綿カラム（０．１５ｇ／ｔｕｂｅ）で濾過した。３０％パコール密度勾配遠心を行い、沈殿物を回収し再度密度勾配遠心を行い、４４／７０％の界面に腸上皮細胞間リンパ球（ＩＥＬ）を回収した。
【００３５】
表面抗原の解析は、フローサイトメトリーにより行った。調製した腸上皮細胞間リンパ球（ＩＥＬ）標品を顕微鏡下で計測した後、２×１０^５ の細胞を抗−ｐａｎαβＴＣＲ（H57-597，Pharmingen社，USA）、抗−ｐａｎγδＴＣＲ（GL3，Pharmingen社，USA）、抗マウスＣＤ８α（Pharmingen社，USA）、抗マウスＣＤ８β（Pharmingen社，USA）で０℃で３０分反応後、ハンクス液を加えて遠心し、必要な場合はその沈殿物にアビジン−ＦＩＴＣ、アビジン−ＰＥ、又はアビジン−サイクローム等の標識化合物（抗体）を加えて０℃、３０分反応させた。
【００３６】
染色終了後の細胞は２％パラホルムアルデヒドで固定後、ハンクス液で２倍稀釈して、分析まで４℃で保存した。蛍光分析はＥＰＩＣＳ−Ｅｌｉｔｅ（COULTER社、USA）を用いて前方散乱と側方散乱でリンパ球区分にゲートを設定して（２カラー又は３カラー）分析を行った。
【００３７】
主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスII分子の解析は、免疫組織染色法によりおこなった。回盲部より約５ｃｍの回腸、または遠位結腸をテッシュマウントを用いて−８０℃で包埋し、クライオトームで５μｍの凍結切片を作成した。組織片を冷アセトンで５分固定し、１％メタ過ヨウ素酸ナトリウムで５〜１０分処理した後、牛血清アルブミンで３０分ブロッキングを行い、ビオチン化モノクローナル抗体抗Ｉ−Ａ^ｂ （Ｉ−Ａ^ｋ に交差）とＩ−Ｅ^ｄ （Ｉ−Ｅ^ｋ に交差）の混合液、パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジンで反応させ、3,3'ジアミノベンチジンで発色させた。
【００３８】
ＩｇＡ産生細胞数の解析は、免疫染色法によりおこなった。回盲部より約５ｃｍの回腸をテッシュマウントを用いて−８０℃で包埋し、クライオトームで５μｍの凍結切片を作成した。組織片を冷アセトンで５分固定した後、牛血清アルブミンで３０分ブロッキングを行い、ビオチン化抗マウスＩｇＡ抗体（Pharmingen，USA）、パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジンで反応させ、3,3'ジアミノベンチジンで発色させた。染色後、顕微鏡下で一定面積あたりの陽性細胞数を測定した。結果を次の表２に示す。
【００３９】
【表２】

【００４０】
表２に示した通り、回腸を調べると投与後３０日目には、αβＴ細胞受容体を持った腸上皮細胞間リンパ球（αβ ＩＥＬ）の割合がコンベンショナル群と同等の値にまで増加することが分かった。また、上皮細胞におけるＭＨＣ classIIもコンベンショナル群と同様に発現し、ＩｇＡ産生細胞数もコンベンショナル群と同等の値にまで増加することがわかった。
【００４１】
一方、ヒト腸内菌叢投与群の結腸上皮にはＭＨＣクラスII分子が発現しており、炎症様状態を呈していたが、セグメント細菌およびヒト腸内菌叢投与群ではコンベンショナル群と同様に発現は認められなかった。
【００４２】
尚、本実施例では、ヒト型腸内菌叢を有する実験用動物を作出したが、他の動物由来の１種以上の腸内細菌においても同様に腸内菌叢を形成することができる。
【００４３】
また、本実施例では、マウスについて行ったが、その他、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、又は、ヒツジの何れの動物についても、この動物と同種の動物からセグメント細菌を得た上で、無菌の宿主動物に複数種の属からなる腸内細菌と共に投与することで各動物についての特定細菌を腸内菌叢として有する実験用動物を得ることが可能である。
【００４４】
まとめ
以上に詳述したように、作出されたヒト型腸内菌叢を有する実験用動物では、次のような効果が得られる。
（１）ヒト型腸内菌叢が定着し、かつ腸が生理的および環境的に成熟した実験用動物を簡便に作出し得る。
（２）本実験用動物を用いることにより、細菌や物質などの外部からの直接的な影響や、ストレス等の間接的な影響による、腸内菌叢及び腸の生理活性について基礎研究に有用な実験用動物を作出し得る。
（３）本実験用動物を用いることにより、ヒト腸内菌叢を改善する生菌製剤、食品等の開発、効果、及び安全性等を、よりヒトに近い環境で検討し得る。
（４）本実験用動物を用いることにより、食品及び医薬品等の素材の検索、効果及び安全性等を、よりヒトに近い環境で検討し得る。
（５）本方法を用いることにより、個人の腸内菌叢を有する実験動物を作出することができ、個人間の違いに起因する食品及び医薬品等の素材の効果の違いを検討することができる。
（６）本方法を用いることにより、特定疾患患者の腸内菌叢を有する実験動物を作出することができ、トランスジェニック動物や疾患モデル動物と組合せることにより、特定の疾患に対する食品及び医薬品等の素材の効果を検討することができる。
【００４５】
【発明の効果】
本発明は以上説明した通り、特定細菌を腸内菌叢として常在させる実験用動物及びその作出方法を得ることができるという効果がある。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a novel experimental animal having a specific bacterium as an intestinal flora.
[0002]
[Prior art]
In the intestines of humans and animals, hundreds of types of microorganisms inhabit, and constitute intestinal flora while symbiotic or antagonizing each other. Although this intestinal microflora changes with aging, as long as the health of the host is maintained, its composition is considered to be extremely stable. On the other hand, when health is impaired by factors such as stress and illness, the gut microbiota is often unbalanced.
[0003]
On the other hand, it has been clarified that the intestinal flora has a great influence on the nutritional physiology and defense of the host animal, that is, health and disease, by comparing a sterile animal with a normal animal.
[0004]
In recent years, attempts have been made to contribute to health by actively utilizing the effects of the intestinal flora on the host. For the purpose of controlling the intestinal flora, the resident flora of the host "Probiotics" that are members of the group and that have a clear usefulness to the host, and substances that can be selectively used for useful microorganisms in the intestines containing these probiotics The search for “prebiotics” is actively underway.
[0005]
In addition, various drugs often have a great influence on the intestinal environment, and in some cases, side effects such as diarrhea are often induced. Because these side effects are sometimes strongly related to the patient's condition, the safety of the drug is also being investigated in relation to the gut microbiota.
[0006]
By the way, in order to search for these probiotics and prebiotics and to examine the safety of drugs, it is most desirable to conduct tests using humans, but there are problems in terms of ethics or cost. For this reason, an artificial digestive tract model in which human intestinal bacteria are continuously cultured in a test tube and experimental animals such as mice and rats have been used so far.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, the contents that can be examined in the human digestive tract model using a test tube are limited to the response of the intestinal flora, which is insufficient for examining the response in the living body. In addition, there are differences in the resident bacterial flora possessed by humans and laboratory animals such as mice and rats, and the results obtained in these animal experiments often existed in humans.
[0008]
As a method that takes these problems into consideration, experimental animals are also devised in which human-derived intestinal bacteria are administered to animals that are kept under aseptic conditions and have no intestinal flora. Even though the flora was human, the physiological and environmental conditions of the intestines remained immature as in sterile animals, and it was difficult to say that they reflected the normal intestinal environment.
[0009]
An object of the present invention is to obtain an experimental animal in which a specific bacterium is resident as an intestinal flora and a method for producing the same.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
A laboratory animal having the specific bacterium according to the invention described in claim 1 as an intestinal flora includes a sterile bacterium, a segment bacterium obtained from the same species as the animal, and a plurality of predetermined genera. An experimental animal administered with an enteric bacterium comprising :
The sterile animal is selected from mouse, rat, guinea pig, rabbit, dog, cat, pig, cow, or sheep;
The intestinal bacterium has a specific bacterium characterized by being derived from human intestinal flora as the intestinal flora.
[0012]
The laboratory animal having the specific bacterium according to the invention described in claim 2 as the intestinal flora is the sterile animal described in claim 1 being a mouse.
[0014]
A method for producing an experimental animal having the specific bacterium according to the invention described in claim 3 as an intestinal flora includes a sterile bacterium, a segmented bacterium obtained from an animal of the same kind as the animal prepared in advance, and colonization A method for producing an experimental animal to be bred in a conventional manner after orally administering a bacterial solution of intestinal bacteria consisting of a plurality of predetermined genera for the purpose of
The sterile animal is selected from mouse, rat, guinea pig, rabbit, dog, cat, pig, cow, or sheep;
The intestinal bacterium is derived from human intestinal flora .
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, a sterile animal is administered with a segmental bacterium obtained from the same species as the animal and an enteric bacterium consisting of a plurality of predetermined genera derived from animals including humans. For this reason, it is possible to obtain an experimental animal in which intestinal bacteria consisting of a plurality of predetermined genera of interest are resident as intestinal flora.
[0016]
The sterile animal in the present invention is the presence of enterobacteria that prevent the intestinal bacteria from being resident as intestinal flora when administering the intestinal bacteria comprising a plurality of predetermined genera of interest. Furthermore, it refers to an animal in which bacteria are not present in digestive organs such as the oral cavity and pharynx. For example, it refers to an animal that is usually used as a laboratory animal, such as an animal in which bacteria in the digestive organs such as enteric bacteria have been wiped out with a medicine or the like, and more preferably an animal grown in a sterile breeding environment. Moreover, it may be a new strain created as well as a commercially available animal, and can be used regardless of the strain, manufacturer, etc.
[0017]
The sterile animal is preferably selected from mouse, rat, guinea pig, rabbit, dog, cat, pig, cow, or sheep. More preferably, it is selected from mice, rats, guinea pigs, rabbits, and pigs that can be sterilized easily, and more preferably mice and rats from the viewpoint of cost or versatility.
[0018]
The segmented bacterium added in the present invention is one of the resident bacteria in the intestine of an animal having a fibrous morphological characteristic. In the present invention, the segmented bacterium is obtained from an animal of the same kind as the host aseptic animal. Is used. More preferably, a segmented bacterium having a fibrous morphological characteristic, isolated, cultured and passaged using the method proposed by the present inventors (Japanese Patent Laid-Open No. 8-214873) is used.
[0019]
It has been confirmed that this segmental bacterium can be isolated by repeating the procedure of collecting small intestinal epithelial cells of a specific animal, aseptically administering it to the same animal of the same type, and raising it (specialty). (Kaihei 8-214873). However, an effective culture method for in vitro culture has not been established, and it is impossible to deposit with a depository under the current deposit system.
[0020]
Therefore, in the Yakult Central Research Institute, Inc. (location: 1796, National Ichiya, Tokyo, phone number: 0425-77-8960), the mouse-derived segmented bacteria are stored in a state that can be distributed as the segmented bacteria BAL01. It can be obtained by a third party as needed.
[0021]
In addition, the method for preparing segment bacteria or the method for administration to animals may follow the method proposed by the present inventors (Japanese Patent Laid-Open No. 8-214900).
[0022]
The enteric bacterium used in the present invention may be derived from animals including humans. Therefore, it is possible to form an intestinal microflora even in animals other than animals of the same species as the host animal. In particular, by using intestinal bacteria derived from human intestinal flora, it is possible to obtain experimental animals having human intestinal flora in the intestine by administration to experimental animals such as mice and rats. Search for tics and prebiotics, and study drug safety.
[0023]
Intestinal bacteria may be obtained by any method, such as stool suspension or directly collected from the intestinal tract. In addition, depending on the purpose, those obtained from patients with specific diseases may be used, and all obtained strains may be used, but specific strains selected from the obtained strains should be used. You can also.
[0024]
In the method for producing an experimental animal of the present invention, a sterile animal is orally administered with the above-mentioned segment bacteria and a bacterial solution of one or more intestinal bacteria intended to be established, after being orally administered in a conventional manner. Breed by the law. About 7 to 14 days after the administration of the bacterial solution, an experimental animal having an intestinal flora in which human intestinal bacteria are most dominant can be prepared.
[0025]
The order of administration of the segment bacteria and the intestinal bacteria consisting of a plurality of species intended for colonization is not particularly defined and may be administered simultaneously, but preferably the segment bacteria are administered first. After confirming colonization, the order of administering enteric bacteria consisting of a plurality of desired genera is good.
[0026]
In addition, in the case of bacteria that are difficult to colonize, such as Lactobacillus spp., It is difficult to colonize Lactobacillus spp. Isolated from one or more desired groups of enteric bacteria after colonization of the segment bacteria. In some cases, the order of intestinal bacteria consisting of a plurality of other desired genera is administered in order to allow only the bacteria to be established.
[0027]
【Example】
Next, although a test example is shown and this invention is demonstrated still in detail, this invention is not limited to these.
Example 1 (Production of laboratory animals having human intestinal flora)
Sixteen 16-17 week old sterile mice (BALB / c) were orally administered with segmented bacteria and human intestinal bacteria prepared in advance. 14 and 30 days after administration, stool smears were prepared, and colonization of segment bacteria and human intestinal bacteria was confirmed.
[0028]
The number of segment bacteria in the aseptic mouse stool was measured by gram-staining the stool smear prepared as described above and directly by microscopic examination. The number of human enteric bacteria was measured using various selective media. The results after 14 days from the administration are shown in the following Table 1. The result after 30 days was the same as the result after 14 days.
[0029]
[Table 1]

[0030]
As shown in Table 1, establishment of segment bacteria and human intestinal bacteria was confirmed in the stool 14 days after administration.
[0031]
Particularly, as a human intestinal bacteria, Bacteroides group (Bacteroidaceae), Bifidobacterium (Bifidobacteria), coliform (Enterobacteriaceae), enterococci (Enterococci), clostridium bacteria (Clostridia) was confirmed. Usually, Bifidobacterium is dominant in human feces compared to other bacteria, but it is inferior in mouse feces. On the other hand, Clostridium spp. Are inferior in human feces, but conversely in mouse feces.
[0032]
Also in this test, Bacteroides group and Bifidobacterium genus measured using various selective media were dominant, Clostridium genus was inferior, and showed the same tendency as humans. In addition, it was confirmed that the segment bacteria derived from the administered mice were established from the results of gram staining of the stool smear and direct microscopic examination.
[0033]
Example 2 (Physiological effects of laboratory animals having human intestinal flora)
The physiological effect of mice with human intestinal flora was examined. The mouse having the human intestinal microbiota obtained in Example 1 was decapitated and opened, and the intestine was taken out. The Peyer's patch and the mesentery were removed, the intestine was cut open, and the contents were thoroughly washed with cold PBS. The small intestine is cut into 1 to 1.5 cm, a calcium and magnesium-free Hank's balanced salt solution containing 0.45 mM dithiothreitol (Hank's solution; manufactured by Sigma) is added at 20 ml / head, and a reciprocating shaker (100 rpm, 25 ° C. The medium was changed 5 times every 5 minutes.
[0034]
Thereafter, in addition to the above medium supplemented with 2 mM EDTA, the mixture was shaken 3 times every 10 minutes at 37 ° C. and 130 rpm. Thereafter, the upper liquid containing the intestinal epithelial cells was collected and centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes. The precipitate was resuspended in 5% FCS • RPMI1640 medium and heated at 37 ° C. for 2 hours. Large agglomerates were removed and the remainder was filtered through a cotton column (0.15 g / tube). 30% Pacoll density gradient centrifugation was performed, the precipitate was collected and density gradient centrifugation was performed again, and intestinal interepithelial cell lymphocytes (IEL) were collected at the interface of 44/70%.
[0035]
The surface antigen was analyzed by flow cytometry. The prepared intestinal epithelial cell lymphocyte (IEL) preparation was measured under a microscope, and 2 × 10 ⁵ cells were anti-panαβTCR (H57-597, Pharmingen, USA) and anti-panγδTCR (GL3, Pharmingen). , USA), anti-mouse CD8α (Pharmingen, USA), anti-mouse CD8β (Pharmingen, USA) for 30 minutes at 0 ° C., added Hanks's solution, centrifuged, and if necessary, avidin- A labeled compound (antibody) such as FITC, avidin-PE, or avidin-cyclochrome was added and reacted at 0 ° C. for 30 minutes.
[0036]
After staining, the cells were fixed with 2% paraformaldehyde, diluted twice with Hank's solution, and stored at 4 ° C. until analysis. Fluorescence analysis was performed using EPICS-Elite (COULTER, USA) with forward scatter and side scatter to set gates for lymphocytes (2 colors or 3 colors).
[0037]
Major histocompatibility complex (MHC) class II molecules were analyzed by immunohistochemical staining. The ileum approximately 5 cm from the ileocecal region or the distal colon was embedded at −80 ° C. using a tissue mount, and a frozen section of 5 μm was prepared with a cryotome. The tissue piece was fixed with cold acetone for 5 minutes, treated with 1% sodium metaperiodate for 5 to 10 minutes, blocked with bovine serum albumin for 30 minutes, and biotinylated monoclonal antibody anti- ^IAb (IA ^k ) and IE- ^d (crossing IE ^k ), peroxidase-labeled streptavidin, and reacted with 3,3 ′ diaminobenzidine.
[0038]
The analysis of the number of IgA producing cells was performed by immunostaining. About 5 cm of the ileum from the ileocecal region was embedded at −80 ° C. using a tissue mount, and a frozen section of 5 μm was prepared using a cryotome. Tissue pieces were fixed with cold acetone for 5 minutes, then blocked with bovine serum albumin for 30 minutes, reacted with biotinylated anti-mouse IgA antibody (Pharmingen, USA) and peroxidase-labeled streptavidin, and 3,3 'diaminobenzidine The color was developed. After staining, the number of positive cells per fixed area was measured under a microscope. The results are shown in Table 2 below.
[0039]
[Table 2]

[0040]
As shown in Table 2, when the ileum was examined, the proportion of intestinal epithelial cell lymphocytes (αβ IEL) having αβ T cell receptor increased to a value equivalent to that of the conventional group on the 30th day after administration. I understood. Further, it was found that MHC class II in epithelial cells was also expressed in the same manner as in the conventional group, and the number of IgA-producing cells was increased to a value equivalent to that in the conventional group.
[0041]
On the other hand, MHC class II molecules were expressed in the colon epithelium of the human intestinal flora-administered group and exhibited an inflammation-like state, but in the segment bacteria and human intestinal flora-administered group, the expression was the same as in the conventional group. Was not recognized.
[0042]
In this example, an experimental animal having a human-type intestinal flora was produced. However, an intestinal flora can be similarly formed in one or more types of intestinal bacteria derived from other animals.
[0043]
In this example, the experiment was carried out on mice. In addition, for any animal such as rats, guinea pigs, rabbits, dogs, cats, pigs, cows, or sheep, segment bacteria were obtained from animals of the same species as this animal. Moreover, it is possible to obtain a laboratory animal having a specific bacterium for each animal as an intestinal flora by administering to a sterile host animal together with an intestinal bacterium comprising a plurality of species .
[0044]
Summary As described in detail above, the following effects can be obtained in the experimental animal having the produced human intestinal flora.
(1) It is possible to easily produce a laboratory animal in which a human type intestinal flora is established and the intestine is physiologically and environmentally mature.
(2) Use of this experimental animal is useful for basic research on the intestinal flora and intestinal physiological activities due to direct external effects such as bacteria and substances, and indirect effects such as stress. Laboratory animals can be created.
(3) By using this experimental animal, the development, effects, safety, etc. of live bacterial preparations, foods, etc. that improve the human intestinal flora can be examined in a more human-like environment.
(4) By using this experimental animal, search for materials such as foods and pharmaceuticals, effects, safety, etc. can be studied in an environment closer to humans.
(5) By using this method, it is possible to create laboratory animals having individual intestinal flora, and to examine differences in the effects of materials such as foods and pharmaceuticals due to differences between individuals. .
(6) By using this method, an experimental animal having an intestinal flora of a patient with a specific disease can be produced. By combining with a transgenic animal or a disease model animal, foods and pharmaceuticals for the specific disease, etc. The effect of the material can be examined.
[0045]
【The invention's effect】
As described above, the present invention has an effect that it is possible to obtain an experimental animal in which a specific bacterium is resident as an intestinal flora and a production method thereof.

Claims (3)

無菌動物に、該動物と同種の動物から得られたセグメント細菌と、予め定められた複数種の属からなる腸内細菌とが投与されてなる実験用動物であって、
前記無菌動物が、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、又は、ヒツジの何れかから選ばれ、
前記腸内細菌が、ヒト腸内菌叢由来のものであることを特徴とする特定細菌を腸内菌叢として有する実験用動物。A laboratory animal in which a sterile bacterium is administered with a segmental bacterium obtained from an animal of the same species as the animal and an enteric bacterium consisting of a plurality of predetermined genera ,
The sterile animal is selected from mouse, rat, guinea pig, rabbit, dog, cat, pig, cow, or sheep;
An experimental animal having a specific bacterium as an intestinal flora, wherein the intestinal bacterium is derived from a human intestinal flora . 前記無菌動物が、マウスであることを特徴とする請求項１に記載された特定細菌を腸内菌叢として有する実験用動物。The laboratory animal having the specific bacteria described in claim 1 as an intestinal flora, wherein the sterile animal is a mouse. 無菌動物に、予め用意された該動物と同種の動物から得られたセグメント細菌と、定着させることを目的とする予め定められた複数種の属からなる腸内細菌の菌液とを経口投与した後、常法により飼育する実験用動物の作出方法であって、
前記無菌動物が、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、又は、ヒツジの何れかから選ばれ、
前記腸内細菌が、ヒト腸内菌叢由来のものであることを特徴とする特定細菌を腸内菌叢として有する実験用動物の作出方法。A sterile animal was orally administered with a segmented bacterium obtained from the same kind of animal as that prepared in advance and a bacterial solution of enteric bacteria consisting of a plurality of predetermined genera intended to be established . Later, it was a method for producing experimental animals to be reared by a conventional method,
The sterile animal is selected from mouse, rat, guinea pig, rabbit, dog, cat, pig, cow, or sheep;
A method for producing an experimental animal having a specific bacterium as an intestinal flora, wherein the intestinal bacterium is derived from a human intestinal flora .