JP4371556B2 - Inspection kit - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素反応及び免疫反応を利用した検査キットに関し、より詳細には、被検出物質の有無及び量を特異的な結合反応を利用して簡便にかつ迅速に測定することが可能とされている検査キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、抗原−抗体による特異的反応を利用して、特定の抗原または抗体よりなる被検出物質を検出する免疫測定法が広く用いられている。この種の免疫測定法では、免疫反応により試料中の被検出物質を、微粒子に感作させた抗体または抗原と結合し、結合によって生じる微粒子の凝集状態を測定する凝集法が簡便であり、目視判定が可能であるため一般的に用いられている。
【０００３】
また、試料中の被検出物質に、放射性同位元素、酵素または蛍光物質からなる標識物質により標識した抗体または抗原を免疫反応により結合し、結合した標識物質を測定する放射免疫測定法、酵素免疫測定法または蛍光免疫測定法も使用されている。
【０００４】
これらの免疫測定法の機構としては、競合型反応及びサンドイッチ型反応が広く用いられている。サンドイッチ型反応の測定法としてイムノクロマトグラフ法が知られており、試料中の抗原または抗体よりなる被検出物質を検出するために、各種操作方法が提案されている。
【０００５】
例えば、米国特許第４，１６８，１４６号には、抗体が固定化された多孔質試験小片を用いる方法が開示されている。また、米国特許第４，０９４，６４７号、第４，２３５，６０１号及び４，３６１，５３７号には、免疫学的及び他のタイプの特異的結合アッセイにおいて、試薬をクロマトグラフ溶媒移動させて毛管現象により展開・移動させる方法が開示されている。
【０００６】
この方法では、ニトロセルロースやナイロン等からなる多孔性膜により構成されているクロマトグラフ媒体上に設けられた検体添加部位に検体が加えられ、溶液が展開され、多孔性膜上に設けられた検出部位にて呈示される標識物の着色度合いにより検体中の被検出物質の有無が判定される。
【０００７】
標識物質としては、着色ラテックス粒子、金属コロイド、非金属コロイド、色素、または酵素等が用いられている。着色ラテックス粒子を用いた方法では、例えば、あらかじめ、多孔性膜上に抗原もしくは抗体を固相化しておき、膜の一端に抗体もしくは抗原を結合させた着色ラテックス粒子を載置する。尿や血清等の検体が添加されると、検体中の抗原もしくは抗体と着色ラテックス粒子とが、多孔性膜の有する毛細管現象の作用により順次拡散・移動し、展開する。この場合、免疫反応により生じた抗原もしくは抗体−着色ラテックス粒子複合体が、固相化されていた抗原もしくは抗体に到達し、その部位で抗原抗体反応が起こり、着色ラテックス粒子が捕捉された度合いを色の濃度により目視により観察することができる。
【０００８】
すなわち、クロマトグラフ媒体に形成された反応部位に、固定化された抗体が固定化試薬となり、該固定化試薬に被検出物質である抗原を介して感作標識微粒子が特異的に結合し、その結果、感作標識微粒子が反応部位に捕捉されることにより生じる信号の有無または強度を目視により判定することにより、試料中の検出物質の存在の有無または量が測定される。
【０００９】
上記イムノクロマトグラフ法において、標識微粒子を調製するための微粒子としては従来、金、白金、銅、酸化鉄等のコロイド状金属粒子またはコロイド状酸化物粒子、硫黄等のコロイド状非金属粒子及び染料粒子等が用いられている。このような微粒子としては、一般に、０．００５μｍ〜１０．０μｍの粒子径を有するものが市販されている。
【００１０】
他方、イムノクロマトグラフ法に用いられるクロマトグラフ媒体としての多孔性膜または繊維状膜は、一般には、ガラス繊維状シート、濾紙、ナイロンシート、ニトロセルロースシート、ポリエチレンシート等からなり、これらは、その種類によって、０．０１μｍ〜５０μｍの範囲の孔径を有する多孔性膜や繊維状膜であることが多い。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、標識微粒子として、コロイド状金属粒子、コロイド状金属酸化物粒子またはコロイド状非金属粒子を用いる場合、その調製条件または粒径によって色調が決定される。従って、所望とする鮮明な濃い色調を呈する標識微粒子を得ることができないことがあった。
【００１２】
他方、染料粒子では、その色調及び色の濃さを任意に選択することができ、鮮明な濃い色調を呈する標識微粒子を得ることができる。しかしながら、染料粒子を用いた場合においても、クロマトグラフ媒体上で捕捉された標識微粒子の積み重ねにより形成される捕捉ラインの色調は弱く、検出物が微量の場合には検出が非常に困難であった。また、イムノクロマトグラフ法の反応部位におけるシグナル強度を所望の強度レベルとすることが困難であり、かつ正確な目視判定が困難であり、検出感度を高めることができないという問題があった。
【００１３】
本発明の目的は、上述した従来技術の欠点を解消し、被検出物質の目視による判定を容易にかつ確実に行なうことができ、従って、高い検出感度を実現し得るイムノクロマトグラフ法用の検査キットを提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、検体添加部位と被検出物質捕捉部位とが設けられたメンブランと、酵素と、酵素に対する基質とを備える検査キットであって、前記メンブランには、試料中の検出すべき被検出物質と特異的に結合する物質とビオチン又はアビジンとが固定化された微粒子が保持されており、被検出物質捕捉部位には、被検出物質と特異的に結合する物質が固定化されており、上記酵素にはアビジン又はビオチンが固定化されており、上記微粒子が合成高分子からなるラテックス粒子であり、粒子径が０．０１μｍ〜５．０μｍの範囲であることを特徴とする。
【００１５】
上記微粒子には、好ましくは、アビジンが固定化され、上記酵素にはビオチンが固定化されている。
また、本発明に係る検査キットでは、好ましくは、単糖類または二糖類が含有されている。
【００１６】
本発明に係る検査キットの特定の局面では、上記メンブレンとして、多孔性膜または繊維状膜が用いられる。
以下、本発明の詳細を説明する。
【００１７】
なお、本明細書において、「アビジン」とは、ビオチンに特異的に強く結合し得るタンパク質の総称を意味するものとし、アビジンとしては、より具体的には、卵白アビジン、ストレプトアビジン、遺伝子組み替えアビジン等を挙げることができる。
【００１８】
アビジンは、同一のサブユニット４個から形成されるタンパク質であり、各サブユニットにはビオチン結合部位が一箇所づつ存在する。従って、１分子のアビジンには、４分子のビオチンが結合され得る。また、各サブユニットは共有結合により結合していないため、高い熱が加えられた場合には各サブユニットに開裂することが知られている。そこで、アビジンの各サブユニット間が架橋、すなわち分子内架橋されているものも用いることができる。また、これらのアビジンやビオチンが様々に化学修飾されていてもよく、遺伝子組み替え等によりアミノ酸等が置換されていてもよい。
【００１９】
本発明においては、被検出物質と特異的に接合する物質とアビジン又はビオチンとが固定化された標識微粒子と、被検出物質とがクロマトグラフ上で反応され、あるいはあらかじめ反応されたものをクロマトグラフ上に添加し、クロマトグラフ上の捕捉部位において被検出物質と標識微粒子との複合体を捕捉する。しかる後、ビオチンまたはアビジンで標識された酵素をクロマトグラフ上に展開し、捕捉された微粒子上のアビジンまたはビオチンとの反応により、酵素を捕捉部位に留置させる。同時に、あるいはしかる後、酵素に対する基質がクロマト上に展開され、捕捉部位にて酵素と基質とが反応するので、捕捉ライン上にて発色させることができる。
【００２０】
上記酵素としては、特に限定されるわけではないが、アルカリフォスターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルコール脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、キサンチンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、インベルターゼ、アセテートキナーゼ、グルコース脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ウレアーゼ等が挙げられる。好ましくは、アルカリフォスターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼが用いられる。
【００２１】
本発明において、上記微粒子を構成するためのラテックス粒子としては、ポリスチレン、スチレン−スルホン酸（塩）共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリルニトリル−ブタジエン−スルホン酸共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等からなる合成高分子粒子を挙げることができる。
【００２２】
また、基質としては、上述した酵素の基質となるものを任意に用いることができる。例えば、アルカリフォスターゼに対しては、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ペルオキシダーゼには５−アミノサリチル酸やｏ−フェニレンジアミン、３，３’５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｎｉｚｉｎｅ、２，２’−Ａｚｉｎｏｄｉ−３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｉｌｉｎｅ−６’−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ等を用いることができる。
【００２３】
ラテックス粒子には様々な官能基を付与させることができるので、非検出物質と特異的に接合する物質として、被検出物質に対する抗原または抗体、あるいはリガンド等を容易に結合し、固定化することができる。また、ラテックス粒子にはアビジンまたはビオチンを共有結合等の化学結合等により容易に結合し、固定化することができる。
【００２４】
また、ラテックス粒子は、その表面電荷が、負電荷で０．０１〜０．５ｍｅｑ／ｇであることが好ましい。さらに、表面にスルホン酸基やカルボキシル基等が導入されたラテックス粒子も適宜使用することができる。
【００２５】
本発明における上記ラテックス粒子は、その粒子径が、０．０１μｍ〜５．０μｍの範囲にあることが好ましく、より好ましくは０．０２μｍ〜３．０μｍである。
【００２６】
上記ラテックス粒子は、白色あるいは透明であることが好ましく、また若干着色されている場合においても、酵素の発色による色調を妨害しなければ使用することができる。
【００２７】
ラテックス粒子が液状あるいは乾燥状態で検査キットに設置される場合、検査キットが糖を含有することが好ましい。糖としては、エリスリトール、キシロース、グルコース、フルクトース、ソルビトール、マンニトール、スクロース、トレハロース、マンノース、ラクトース、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ポリデキストロース等及びこれらの修飾体等を挙げることができるが、特に限定されるものではないが、単糖類または二糖類あるいはこれらの修飾体が好適に用いられる。
【００２８】
クロマトグラフ媒体である試験片については、一般に毛細管現象を発現する公知の適宜の材料を用いることができる。例えば、セルロース、ニトロセルロースのようなセルロース修飾体；ナイロン、ポリエチレン、濾紙、ガラス繊維等を挙げることができるが、多孔性膜や繊維状膜からなるクロマトグラフ媒体が好ましく用いられる。特に、好ましくは、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ポリエチレン膜、ガラス繊維膜または濾紙等の多孔性膜もしくは繊維状膜が用いられる。
【００２９】
これらの試験片には、検出ゾーンとして、試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な固定化試薬を含む少なくとも１つの反応部位が設けられている。固定化試薬としては、例えば、被検出物質が抗原の場合、これに対して特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、リガンド、または被検出物質が抗体等の場合には、対応する抗原や抗原性を有するペプチド等を含有する試薬が挙げられる。これらの試薬は、上記クロマトグラフ媒体上に滴下され、あるいは塗布され、乾燥されることにより、固定化することができる。
【００３０】
試験片の大きさについては特に限定されないが、例えば、幅３〜１０ｍｍ×長さ２０〜１５０ｍｍ程度のストリップ状のものが、取り扱い容易であるため好ましい。試験片の厚みは、１０μｍ〜１ｍｍ程度のものがが取り扱い容易であり好ましい。また、吸水力のある濾紙等のパッドを試験片の上部に貼付してもよい。
【００３１】
試験片の一部または全部にウシ血清アルブミン、カゼイン、糖類または界面活性剤等を含有せてもよい。
ラテックス粒子が乾燥され保持されている同時に、ラテックス粒子が保持されている部位に糖を含有させることが好ましい。糖としては、特に限定されないが、前述した各種糖及びその修飾体が用いられ、単糖類または二糖類あるいはこれらの修飾体が好ましく用いられる。
【００３２】
本発明に係る検査キットで用いられる試料については、特に限定されないが、例えば、血液、血清、血漿、唾液、汗、尿、乳汁、胸水、粘膜液、髄液、腹腔液、羊水、糞便等のような生理学的な流体、発酵ブロス、細胞培養または化学反応混合物などから得たもの等、任意である。生物学的流体または生理学的流体の他に、他の液体サンプル、例えば、水や食品の製造検定サンプル、水質・土壌検査サンプル等であってもよい。また、これらの試料は、適宜、緩衝液等で希釈して用いられてもよく、濃縮、濾過、熱処理、凍結融解、抽出操作、妨害成分の不活化あるいは試薬の添加等の前処理を施されたものであってもよい。
【００３３】
また、試薬には、ブロッキング剤、緩衝液、血液凝固抑制剤、または界面活性剤等をあらかじめラテックス粒子とともに乾燥して保持させて含有させておいてもよい。
【００３４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的な実施例及び比較例を挙げることにより、本発明をより詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
（実施例１）
（１）ＨＢｓ抗原固定化多孔性膜の作製
ニトロセルロースメンブレン（日本ミリポア社製、品番：ＳＲＨＦ、厚み１００μｍ，バッキングコートあり）を幅２０ｃｍ×長さ５ｃｍの矩形形状に切断し、得られた矩形のニトロセルロースメンブレンの上端から３０ｍｍの位置に、ＨＢｓ抗原を２．０ｍｇ／ｍｇ濃度で含有する１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１μＬ／ｃｍとなるようにライン状に塗布した。３７℃で２時間乾燥した後、１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン（ＤＩＦＣＯ社製）の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）溶液に１０分間浸漬し、ブロッキング処理を行なった。しかる後、０．１％（ｗ／Ｖ）のラウリル硫酸ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄後、室温にて乾燥した。このようにして、ＨＢｓ抗原固定化多孔製膜を得た。
【００３６】
（２）ＨＢｓ抗原及びアビジン結合ラテックス粒子の作製
カルボキシル基含有ラテックス粒子（積水化学工業社製、白色カルボラテックス、粒子径０．３μｍ）の１％（ｗ／ｖ）の分散液１．０ｍＬに、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）９ｍＬを加え、１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離した。得られた沈渣を２％（ｗ／ｖ）の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロライドを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に懸濁し、３７℃で１時間混和した。しかる後等、混和液を１５０００ｒｐｍで遠心分離し、沈渣を０．２Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）４ｍＬに懸濁させた。得られた懸濁液にＨＢｓ抗原の０．５ｍｇ／ｍL −０．２Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍＬを加え、十分混和し、３７℃で１時間攪拌した。
【００３７】
未反応のＨＢｓ抗原を除去するために、１５００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈渣を０．２Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）４ｍＬに懸濁させ、これにアビジンの１ｍｇ／ｍＬ−０．２Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍＬを加え、十分混和し、３７℃で１時間攪拌した。再度、１５０００ｒｐｍ及び２０分の条件で遠心分離し、沈渣を０．１Ｍのエタノールアミンヒドロクロライド−０．２Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液にて懸濁し、３７℃で１時間攪拌した。攪拌後、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈渣を１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン−１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）溶液５ｍＬに懸濁させ、室温で１時間攪拌し、ブロッキング処理を行なった。
【００３８】
しかる後、ブロッキング処理された液体を１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈渣を１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン−０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍＬに懸濁させ、冷蔵保存した。このようにして、ＨＢｓ抗原及びアビジン結合ラテックス粒子懸濁液を得た。
【００３９】
（３）試験片の作製
上記ＨＢｓ抗原固定化多孔性膜を幅５ｍｍ×長さ２５ｍｍに裁断し、幅５ｍｍ×長さ６０ｍｍの粘着性基材に貼り合わせ、該多孔性膜の上端に幅５ｍｍ×長さ２ｃｍの吸水用濾紙（日本ミリポア社製）を上端が一致するように重ね、透明な粘着テープで固定した。吸水用濾紙の下端にはグラスファイバー片（ワットマンジャパン社製）に上記ラテックス粒子懸濁液を２μＬ含有させ乾燥したものを貼付した。該グラスファイバー片上に、さらにフィルタ濾紙（ワットマンジャパン社製）を重ね透明な粘着テープで固定した。このようにして試験片を得、該試験片をウェル内に入れ、立設した。
【００４０】
（４）抗ＨＢｓ抗体の測定
抗ＨＢｓ抗体の測定陽性サンプルとして、抗ＨＢｓ抗体の濃度が０ｍＩＵ／ｍＬ、５ｍＩＵ／ｍＬ、１０ｍＩＵ／ｍＬ、２０ｍＩＵ／ｍＬ、４０ｍＩＵ／ｍＬ、及び８０ｍＩＵ／ｍＬの濃度の各サンプル５０μＬをウェルに添加し、試験片に吸収させ、反応させた。５分後に１０ｍＭアルカリフォスファータゼ標識ビオチン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０μＬを添加し、さらに５分後に、基質として１０ｍｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸二ナトリウム塩含有溶液５０μＬを添加した。この添加の１０分後に、青色のラインが検出されるかどうかを目視により判定した。ラインの強度は３名の評価者により評価し、その平均値を求めた。結果を下記の表１に示す。
【００４１】
（実施例２）
ＨＢｓ抗原及びアビジン結合ラテックス粒子懸濁液に、さらにトレハロース（林原生物化学研究所製）を１０％（ｗ／ｖ）となるように加えたこと以外は、実施例１と同様にして試験片を作製し、かつ抗ＨＢｓ抗体の測定を行なった。結果を下記の表１に示す。
【００４２】
（実施例３）
ＨＢｓ抗原結合アビジン結合ラテックス粒子懸濁液に、さらにトレハロース（林原生物化学研究所製）を２０％（ｗ／ｖ）となるように加えたこと以外は、実施例１と同様にして試験片を作製し、かつ抗ＨＢｓ抗体の測定を行なった。結果を下記の表１に示す。
【００４３】
（実施例４）
ＨＢｓ抗原結合アビジン結合ラテックス粒子懸濁液に、さらにトレハロース（林原生物化学研究所製）を３０％（ｗ／ｖ）となるように加えたこと以外は、実施例１と同様にして試験片を作製し、かつ抗ＨＢｓ抗体の測定を行なった。結果を下記の表１に示す。
【００４４】
（比較例１）
実施例１において、ＨＢｓ抗原及びアビジン結合ラテックス粒子の作製を、下記のＨＢｓ抗原結合青色着色ラテックス粒子の作製に変更したこと、サンプル滴下後に、１０ｍＭアルカリフォスターゼ標識ビオチン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０μＬを添加しなかったこと、並びに、１０ｍｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸二ナトリウム塩含有溶液５０μＬの添加をしなかったことを除いては、全て実施例１と同様にして行なった。
【００４５】
ＨＢｓ抗原結合青色着色ラテックス粒子の作製
カルボキシル基含有青色着色ラテックス粒子（積水化学工業社製、青色カルボラテックス、粒子径０．３μｍ）の１０％ｗ／ｖ濃度の分散液１．０ｍＬに２０ｍＭにリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）９ｍＬを加え、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。得られた沈渣を、２％（ｗ／ｖ）の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロライドを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に懸濁し、１時間、３７℃で混和した。混和された混濁液を、１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）４ｍＬに懸濁した。この懸濁液に、ＨＢｓ抗原の０．５ｍｇ／ｍＬ−０．２Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）を１ｍＬ加え十分混和し、３７℃で１時間攪拌した。しかる後、未反応のＨＢｓ抗原を除去するために、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。沈渣を０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）４ｍＬに懸濁させた。
【００４６】
上記のようにして得た懸濁液を再度、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。沈渣を０．１Ｍのエタノールアミンヒキドロクロライド−０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて懸濁し、３７℃で１時間攪拌した。しかる後、攪拌された懸濁液を１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。遠心分離後に、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン−１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍＬに懸濁し、室温で１時間攪拌し、ブロッキング処理した。
【００４７】
上記ブロッキング処理後、懸濁液を１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。沈渣を１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン−０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍＬに懸濁させ、冷蔵保存した。このようにして、ＨＢｓ抗原結合青色着色ラテックス粒子含有懸濁液を得た。
【００４８】
【表１】

【００４９】
なお、表１においては、ラインの強度は−、＋、＋＋、＋＋＋の４段階で評価した。
表１から明らかなように、比較例１では、２０ｍＩＵ／ｍＬまでの濃度のサンプルしか検出できなかったのに対し、実施例１では、５ｍＩＵ／ｍＬの濃度のサンプルまで検出することができ、感度の高められることがわかる。また、反応容器内に糖を含有させた実施例２〜４においても、同様に、５ｍＩＵ／ｍＬの濃度の場合でも、検出ラインを確認することができ、感度の高められていることがわかる。
【００５０】
【発明の効果】
本発明に係る検査キットでは、被検出物質と特異的に結合する物質と、ビオチンまたはアビジンとが固定化された微粒子が、合成高分子からなるラテックス粒子であって、粒子径が０．０１〜５．０μｍの範囲にあるので、該微粒子が、被検出物質捕捉部位に捕捉された場合、捕捉後粒子の量が、背景色に妨害されず、また粒子自身の持つ色に妨害されずに測定され得る。従って、合成高分子ラテックス粒子を用いたイムノクロマトグラフ法により、高感度に被検出物質を測定することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a test kit using an enzyme reaction and an immune reaction. More specifically, the presence and amount of a substance to be detected can be easily and rapidly measured using a specific binding reaction. Related to the test kit.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, an immunoassay method for detecting a substance to be detected comprising a specific antigen or antibody by utilizing a specific reaction by an antigen-antibody has been widely used. In this type of immunoassay, an agglutination method is simple, in which a substance to be detected in a sample is bound to an antibody or antigen sensitized to the microparticle by an immune reaction and the aggregation state of the microparticle caused by the binding is measured. Since it can be determined, it is generally used.
[0003]
Also, a radioimmunoassay method or enzyme immunoassay that binds an antibody or antigen labeled with a labeling substance consisting of a radioisotope, enzyme, or fluorescent substance to an analyte in a sample by an immune reaction, and measures the bound labeling substance Methods or fluorescence immunoassays have also been used.
[0004]
As the mechanism of these immunoassays, a competitive reaction and a sandwich reaction are widely used. An immunochromatographic method is known as a measurement method for sandwich reaction, and various operation methods have been proposed for detecting a substance to be detected comprising an antigen or an antibody in a sample.
[0005]
For example, US Pat. No. 4,168,146 discloses a method of using a porous test piece with an antibody immobilized thereon. US Pat. Nos. 4,094,647, 4,235,601, and 4,361,537 also disclose chromatographic solvent transfer in immunological and other types of specific binding assays. A method of developing and moving by capillary action is disclosed.
[0006]
In this method, a sample is added to a sample addition site provided on a chromatographic medium composed of a porous membrane made of nitrocellulose, nylon or the like, a solution is developed, and a detection provided on the porous membrane is detected. Presence / absence of the substance to be detected in the specimen is determined based on the degree of coloring of the label presented at the site.
[0007]
As the labeling substance, colored latex particles, metal colloids, non-metal colloids, dyes, enzymes or the like are used. In the method using colored latex particles, for example, an antigen or antibody is solid-phased on a porous membrane in advance, and the colored latex particles having the antibody or antigen bound thereto are placed on one end of the membrane. When a specimen such as urine or serum is added, the antigen or antibody and the colored latex particles in the specimen are sequentially diffused / moved by the action of the capillary action of the porous membrane and developed. In this case, the antigen or antibody-colored latex particle complex produced by the immune reaction reaches the solid-phased antigen or antibody, the antigen-antibody reaction occurs at that site, and the degree to which the colored latex particles are captured is determined. It can be visually observed according to the color density.
[0008]
That is, the immobilized antibody becomes an immobilization reagent at the reaction site formed in the chromatographic medium, and the sensitized labeling microparticles specifically bind to the immobilization reagent via the antigen that is the detected substance. As a result, the presence / absence or amount of the detection substance in the sample is measured by visually determining the presence / absence or intensity of a signal generated by capturing the sensitized labeled fine particles at the reaction site.
[0009]
In the immunochromatography method, as the fine particles for preparing labeled fine particles, colloidal metal particles or colloidal oxide particles such as gold, platinum, copper and iron oxide, colloidal nonmetal particles such as sulfur, and dye particles are conventionally used. Etc. are used. As such fine particles, those having a particle diameter of 0.005 μm to 10.0 μm are generally commercially available.
[0010]
On the other hand, a porous membrane or a fibrous membrane as a chromatographic medium used in an immunochromatography method is generally composed of a glass fiber sheet, a filter paper, a nylon sheet, a nitrocellulose sheet, a polyethylene sheet, etc. Depending on the case, it is often a porous membrane or a fibrous membrane having a pore diameter in the range of 0.01 μm to 50 μm.
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
However, when colloidal metal particles, colloidal metal oxide particles, or colloidal nonmetal particles are used as the labeled fine particles, the color tone is determined by the preparation conditions or the particle diameter. Therefore, there are cases in which labeled fine particles exhibiting a desired clear dark color tone cannot be obtained.
[0012]
On the other hand, in the dye particles, the color tone and color intensity can be arbitrarily selected, and labeled fine particles exhibiting a clear dark color tone can be obtained. However, even when dye particles are used, the color of the capture line formed by the accumulation of labeled fine particles captured on the chromatographic medium is weak, and detection is very difficult when the amount of detection is small. . In addition, there is a problem that it is difficult to set the signal intensity at the reaction site in the immunochromatography method to a desired intensity level, and accurate visual determination is difficult, and the detection sensitivity cannot be increased.
[0013]
The object of the present invention is to eliminate the above-mentioned drawbacks of the prior art, and to easily and reliably determine the substance to be detected by visual inspection, and therefore, a test kit for an immunochromatographic method capable of realizing high detection sensitivity. Is to provide.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
The present invention is a test kit comprising a membrane provided with a specimen addition site and a target substance capture site, an enzyme, and a substrate for the enzyme, and the membrane includes a target substance to be detected in a sample. A substance that specifically binds to the biotin or avidin is retained, and a substance that specifically binds to the target substance is immobilized at the target substance capture site. Avidin or biotin is immobilized on the enzyme, the fine particles are latex particles made of a synthetic polymer, and the particle diameter is in the range of 0.01 μm to 5.0 μm.
[0015]
Preferably, avidin is immobilized on the fine particles, and biotin is immobilized on the enzyme.
Moreover, the test kit according to the present invention preferably contains a monosaccharide or a disaccharide.
[0016]
In a specific aspect of the test kit according to the present invention, a porous membrane or a fibrous membrane is used as the membrane.
Details of the present invention will be described below.
[0017]
In the present specification, “avidin” means a generic name of proteins that can bind specifically and strongly to biotin. More specifically, as avidin, egg white avidin, streptavidin, genetically modified avidin Etc.
[0018]
Avidin is a protein formed from four identical subunits, and each subunit has one biotin binding site. Accordingly, 4 molecules of biotin can be bound to 1 molecule of avidin. Moreover, since each subunit is not couple | bonded by the covalent bond, when high heat | fever is applied, it is known that it will cleave to each subunit. Therefore, those in which the subunits of avidin are cross-linked, that is, intramolecular cross-linked can also be used. In addition, these avidin and biotin may be variously chemically modified, and amino acids may be substituted by gene recombination or the like.
[0019]
In the present invention, a substance that specifically binds to a substance to be detected, a labeled fine particle on which avidin or biotin is immobilized, and the substance to be detected are reacted on the chromatograph, or a pre-reacted substance is chromatographed. It is added above, and the complex of the substance to be detected and the labeled fine particles is captured at the capture site on the chromatograph. Thereafter, the enzyme labeled with biotin or avidin is developed on a chromatograph, and the enzyme is left at the capture site by reaction with avidin or biotin on the captured microparticles. At the same time or thereafter, the substrate for the enzyme is developed on the chromatograph, and the enzyme and the substrate react at the capture site, so that the color can be developed on the capture line.
[0020]
The enzyme is not particularly limited, but alkaline phosphatase, peroxidase, β-D-galactosidase, alcohol dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, xanthine oxidase, glucose oxidase, invertase, acetate Kinase, glucose dehydrogenase, pyruvate kinase, urease and the like can be mentioned. Preferably, alkaline phosphatase, peroxidase, and β-D-galactosidase are used.
[0021]
In the present invention, latex particles for constituting the fine particles include polystyrene, styrene-sulfonic acid (salt) copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, acrylonitrile-butadiene-sulfonic acid copolymer, vinyl chloride. -Synthetic polymer particles comprising an acrylic ester copolymer, vinyl acetate-acrylic ester copolymer and the like.
[0022]
Moreover, as a substrate, what becomes a substrate of the enzyme mentioned above can be used arbitrarily. For example, for alkaline phosphatase, p-nitrophenyl phosphate, for peroxidase, 5-aminosalicylic acid, o-phenylenediamine, 3,3′5,5′-tetramethylbenzidine, 2,2′-Azinodi-3- Ethylbenzthiaziline-6′-sulfonic acid or the like can be used.
[0023]
Since various functional groups can be added to latex particles, it is possible to easily bind and immobilize antigens or antibodies, or ligands, etc., against substances to be detected as substances that specifically bind to non-detectable substances. it can. Further, avidin or biotin can be easily bound to latex particles by chemical bonds such as covalent bonds, and can be immobilized.
[0024]
The latex particles preferably have a negative surface charge of 0.01 to 0.5 meq / g. Furthermore, latex particles having sulfonic acid groups or carboxyl groups introduced on the surface can also be used as appropriate.
[0025]
The latex particles in the present invention preferably have a particle size in the range of 0.01 μm to 5.0 μm, more preferably 0.02 μm to 3.0 μm.
[0026]
The latex particles are preferably white or transparent, and even when slightly colored, they can be used as long as they do not interfere with the color tone due to the color of the enzyme.
[0027]
When the latex particles are placed in the test kit in a liquid or dry state, the test kit preferably contains sugar. Examples of the sugar include erythritol, xylose, glucose, fructose, sorbitol, mannitol, sucrose, trehalose, mannose, lactose, fructooligosaccharide, galactooligosaccharide, polydextrose and the like, and are particularly limited. Although it is not a thing, monosaccharide or disaccharide or these modified substances are used suitably.
[0028]
For the test piece that is a chromatographic medium, generally known appropriate materials that exhibit capillary action can be used. For example, modified cellulose such as cellulose and nitrocellulose; nylon, polyethylene, filter paper, glass fiber and the like can be mentioned, but a chromatographic medium comprising a porous film or a fibrous film is preferably used. In particular, a porous film or a fibrous film such as a nitrocellulose film, a nylon film, a polyethylene film, a glass fiber film, or a filter paper is preferably used.
[0029]
These test pieces are provided with at least one reaction site containing an immobilizing reagent capable of binding to a substance to be detected in a sample as a detection zone. As the immobilization reagent, for example, when the substance to be detected is an antigen, a specific polyclonal antibody, monoclonal antibody, ligand, or antibody to which the substance to be detected is an antibody or the like, the corresponding antigen or antigenicity is indicated. And a reagent containing the peptide or the like. These reagents can be immobilized by being dropped or applied onto the chromatographic medium and dried.
[0030]
Although it does not specifically limit about the magnitude | size of a test piece, For example, since a strip-shaped thing about 3-10 mm wide x 20-150 mm in length is easy to handle, it is preferable. The thickness of the test piece is preferably about 10 μm to 1 mm because it is easy to handle. Moreover, you may stick a pad, such as a filter paper with water absorption, on the upper part of a test piece.
[0031]
Bovine serum albumin, casein, saccharides or surfactants may be contained in part or all of the test piece.
It is preferable to contain sugar at the site where the latex particles are held at the same time that the latex particles are dried and held. The sugar is not particularly limited, and the above-mentioned various sugars and modified products thereof are used, and monosaccharides, disaccharides, or modified products thereof are preferably used.
[0032]
The sample used in the test kit according to the present invention is not particularly limited, and examples thereof include blood, serum, plasma, saliva, sweat, urine, milk, pleural effusion, mucosal fluid, spinal fluid, peritoneal fluid, amniotic fluid, feces and the like. Such as those obtained from physiological fluids such as fermentation broths, cell cultures or chemical reaction mixtures. In addition to biological fluids or physiological fluids, other liquid samples such as water and food production test samples, water quality / soil test samples, and the like may be used. These samples may be appropriately diluted with a buffer solution or the like, and subjected to pretreatment such as concentration, filtration, heat treatment, freeze-thaw, extraction operation, inactivation of interfering components or addition of reagents. It may be.
[0033]
In addition, the reagent may contain a blocking agent, a buffer solution, a blood coagulation inhibitor, a surfactant, or the like that is dried and held together with the latex particles in advance.
[0034]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by giving specific examples and comparative examples of the present invention. In addition, this invention is not limited to a following example.
[0035]
(Example 1)
(1) Production of HBs antigen-immobilized porous membrane A nitrocellulose membrane (manufactured by Nihon Millipore, product number: SRHF, thickness 100 μm, with backing coating) was cut into a rectangular shape having a width of 20 cm and a length of 5 cm. A 10 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.4) containing HBs antigen at a concentration of 2.0 mg / mg was applied in a line at a position 30 mm from the upper end of the nitrocellulose membrane so as to be 1 μL / cm. After drying at 37 ° C. for 2 hours, a blocking treatment was performed by immersing in a 100 mM phosphate buffer solution (pH 7.5) of 1% (w / v) bovine serum albumin (manufactured by DIFCO) for 10 minutes. Thereafter, it was washed with 100 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.1% (w / V) sodium lauryl sulfate, and dried at room temperature. In this way, an HBs antigen-immobilized porous membrane was obtained.
[0036]
(2) Preparation of HBs antigen and avidin-bound latex particles To 1.0 mL of a 1% (w / v) dispersion of carboxyl group-containing latex particles (Sekisui Chemical Co., Ltd., white carbolatex, particle size 0.3 μm), 9 mL of 20 mM phosphate buffer (pH 5.5) was added and centrifuged at 15000 rpm for 20 minutes. The obtained precipitate was suspended in 20 mM phosphate buffer (pH 5.5) containing 2% (w / v) 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride, and 1 Mix for hours. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15000 rpm, and the sediment was suspended in 4 mL of 0.2 M borate buffer (pH 8.5). 1 mL of 0.5 mg / mL-0.2 M borate buffer (pH 8.5) of HBs antigen was added to the resulting suspension, mixed well, and stirred at 37 ° C. for 1 hour.
[0037]
In order to remove unreacted HBs antigen, it was centrifuged at 1500 rpm for 20 minutes, and the sediment was suspended in 4 mL of 0.2 M borate buffer (pH 8.5), and 1 mg / mL-0.2 M boric acid of avidin was added thereto. 1 mL of buffer solution (pH 8.5) was added, mixed well, and stirred at 37 ° C. for 1 hour. The mixture was centrifuged again at 15000 rpm for 20 minutes, and the precipitate was suspended in a 0.1 M ethanolamine hydrochloride-0.2 M borate buffer (pH 8.5) solution and stirred at 37 ° C. for 1 hour. After stirring, the mixture is centrifuged at 15000 rpm for 20 minutes, and the sediment is suspended in 5 mL of 1% (w / v) bovine serum albumin-100 mM phosphate buffer (pH 7.5) solution, and stirred at room temperature for 1 hour to perform blocking treatment. Was done.
[0038]
Thereafter, the blocking-treated liquid was centrifuged at 15000 rpm for 20 minutes, and the sediment was 100% phosphate buffer (pH 7) containing 1% (w / v) bovine serum albumin-0.1% (w / v) sodium azide. .5) Suspended in 2 mL and stored refrigerated. In this way, a suspension of HBs antigen and avidin-bound latex particles was obtained.
[0039]
(3) Preparation of test piece The HBs antigen-immobilized porous membrane was cut into a width of 5 mm x length of 25 mm, and bonded to an adhesive substrate having a width of 5 mm x length of 60 mm, and a width of 5 mm was attached to the upper end of the porous membrane. X A filter paper for water absorption (manufactured by Nihon Millipore) with a length of 2 cm was overlaid so that the upper ends coincided, and fixed with a transparent adhesive tape. At the lower end of the water-absorbing filter paper, a glass fiber piece (manufactured by Whatman Japan) containing 2 μL of the latex particle suspension and dried was attached. A filter paper (manufactured by Whatman Japan) was further stacked on the glass fiber piece and fixed with a transparent adhesive tape. In this way, a test piece was obtained, and the test piece was placed in a well and erected.
[0040]
(4) Measurement of anti-HBs antibody As a positive sample of anti-HBs antibody , the concentration of anti-HBs antibody was 0 mIU / mL, 5 mIU / mL, 10 mIU / mL, 20 mIU / mL, 40 mIU / mL, and 80 mIU / mL. 50 μL of each sample was added to the well, and the sample was absorbed and reacted. After 5 minutes, 50 μL of 10 mM alkaline phosphatase-labeled biotin-containing phosphate buffer (pH 7.5) was added. After another 5 minutes, 10 mg / mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate as a substrate was added. 50 μL of disodium salt-containing solution was added. 10 minutes after this addition, it was visually determined whether a blue line was detected. The line strength was evaluated by three evaluators, and the average value was obtained. The results are shown in Table 1 below.
[0041]
(Example 2)
A test piece was prepared in the same manner as in Example 1 except that trehalose (manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratories) was further added to the HBs antigen and avidin-bound latex particle suspension so as to be 10% (w / v). The anti-HBs antibody was prepared and measured. The results are shown in Table 1 below.
[0042]
(Example 3)
A test piece was prepared in the same manner as in Example 1 except that trehalose (manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratories) was further added to the HBs antigen-bound avidin-bound latex particle suspension so as to be 20% (w / v). The anti-HBs antibody was prepared and measured. The results are shown in Table 1 below.
[0043]
(Example 4)
A test piece was prepared in the same manner as in Example 1 except that trehalose (produced by Hayashibara Biochemical Laboratories) was further added to the HBs antigen-bound avidin-bound latex particle suspension so as to be 30% (w / v). The anti-HBs antibody was prepared and measured. The results are shown in Table 1 below.
[0044]
(Comparative Example 1)
In Example 1, the preparation of HBs antigen and avidin-binding latex particles was changed to the preparation of the following HBs antigen-binding blue colored latex particles. 5) All performed except that 50 μL was not added and 50 μL of 10 mg / mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate disodium salt containing solution was not added Performed as in Example 1.
[0045]
Preparation of HBs antigen-binding blue colored latex particles Carboxyl group-containing blue colored latex particles (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd., blue carbolatex, particle size 0.3 μm) in 10 mL w / v dispersion 1.0 mL was phosphorylated at 20 mM. 9 mL of acid buffer (pH 5.5) was added and centrifuged at 15000 rpm for 20 minutes. The obtained sediment was suspended in 20 mM phosphate buffer (pH 5.5) containing 2% (w / v) 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride, and 1 hour. Mix at 37 ° C. The mixed turbid solution was centrifuged at 15000 rpm for 20 minutes, and suspended in 4 mL of 0.2 M borate buffer (pH 8.5). To this suspension, 1 mL of 0.5 mg / mL-0.2M borate buffer (pH 8.5) of HBs antigen was added and mixed well, followed by stirring at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, in order to remove unreacted HBs antigen, it was centrifuged at 15000 rpm for 20 minutes. The sediment was suspended in 4 mL of 0.2 M borate buffer (pH 8.5).
[0046]
The suspension obtained as described above was centrifuged again at 15000 rpm for 20 minutes. The precipitate was suspended in 0.1 M ethanolamine hydrochloride-0.2 M borate buffer (pH 8.5) and stirred at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the stirred suspension was centrifuged at 15000 rpm for 20 minutes. After centrifugation, the suspension was suspended in 5 mL of 1% (w / v) bovine serum albumin-100 mM phosphate buffer (pH 7.5), stirred at room temperature for 1 hour, and blocked.
[0047]
After the blocking treatment, the suspension was centrifuged at 15000 rpm for 20 minutes. The precipitate was suspended in 2 mL of 100% phosphate buffer (pH 7.5) containing 1% (w / v) bovine serum albumin-0.01% (w / v) sodium azide, and stored refrigerated. In this way, a suspension containing HBs antigen-binding blue colored latex particles was obtained.
[0048]
[Table 1]

[0049]
In Table 1, the strength of the line was evaluated in four stages:-, +, ++, and ++.
As is apparent from Table 1, in Comparative Example 1, only a sample having a concentration of up to 20 mIU / mL could be detected, whereas in Example 1, a sample having a concentration of 5 mIU / mL could be detected. It can be seen that Moreover, also in Examples 2 to 4 in which sugar is contained in the reaction vessel, the detection line can be confirmed even at a concentration of 5 mIU / mL, and it can be seen that the sensitivity is enhanced.
[0050]
【The invention's effect】
In the test kit according to the present invention, the fine particles to which the substance that specifically binds to the substance to be detected and biotin or avidin are immobilized are latex particles made of a synthetic polymer, and the particle diameter is 0.01 to Since it is in the range of 5.0 μm, when the microparticles are captured at the target substance capture site, the amount of the captured particles is not disturbed by the background color, and is not disturbed by the color of the particles themselves. Can be done. Therefore, the substance to be detected can be measured with high sensitivity by immunochromatography using synthetic polymer latex particles.

Claims (4)

検体添加部位と被検出物質捕捉部位とが設けられたメンブランと、酵素と、前記酵素に対する基質とを備える検査キットであって、
前記メンブランには、試料中の被検出物質と特異的に結合する物質とアビジンとが固定化された微粒子が保持されており、
前記被検出物質捕捉部位には、被検出物質と特異的に結合する物質が固定化されており、
前記酵素にビオチンが固定化されており、
前記微粒子が合成高分子からなるラテックス粒子であり、粒子径が０．０１μｍ〜５．０μｍの範囲であることを特徴とする検査キット。A test kit comprising a membrane provided with a specimen addition site and a target substance capture site, an enzyme, and a substrate for the enzyme,
The membrane holds fine particles in which a substance that specifically binds to a substance to be detected in a sample and avidin are immobilized,
A substance that specifically binds to the detected substance is immobilized on the detected substance capturing site,
Biotin is immobilized on the enzyme,
An inspection kit, wherein the fine particles are latex particles made of a synthetic polymer, and the particle diameter is in the range of 0.01 μm to 5.0 μm. 検体添加部位と被検出物質捕捉部位とが設けられたメンブランと、酵素と、前記酵素に対する基質とを備える検査キットであって、A test kit comprising a membrane provided with a specimen addition site and a target substance capture site, an enzyme, and a substrate for the enzyme,
前記メンブランには、試料中の被検出物質と特異的に結合する物質とビオチンとが固定化された微粒子が保持されており、The membrane holds fine particles in which biotin is immobilized and a substance that specifically binds to the substance to be detected in the sample,
前記被検出物質捕捉部位には、被検出物質と特異的に結合する物質が固定化されており、A substance that specifically binds to the detected substance is immobilized on the detected substance capturing site,
前記酵素にアビジンが固定化されており、Avidin is immobilized on the enzyme,
前記微粒子が合成高分子からなるラテックス粒子であり、粒子径が０．０１μｍ〜５．０μｍの範囲であることを特徴とする検査キット。An inspection kit, wherein the fine particles are latex particles made of a synthetic polymer, and the particle diameter is in the range of 0.01 μm to 5.0 μm. 単糖類または二糖類を含有することを特徴とする請求項１または２に記載の検査キット。  The test kit according to claim 1, comprising a monosaccharide or a disaccharide. 前記メンブレンが、多孔性膜または繊維状膜からなる、請求項１〜３のいずれかに記載の検査キット。  The test kit according to claim 1, wherein the membrane is made of a porous membrane or a fibrous membrane.