JP4370636B2 - 位相差観察装置 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、位相差観察装置、特に生物標本などの無色透明な物体を染色すること無しに観察できる位相差顕微鏡に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
位相差顕微鏡は、被検物体を照明系の開口位置に配した絞りによって制限された照明光で照明し、対物レンズ内に開口絞りと共役位置に位相を変換する位相膜を配して、被検物体(位相物体)によって生じる位相差を光の強弱であるコントラストに変えている。これにより、被検物体の位相差を像の明暗として可視化して観察することができる。この位相差顕微鏡は、1935年にF.Zernikeにより発明され、原理に関しては、例えば応用光学1(培風館、1990、鶴田匡夫、P.256−259位相差法)、又はFundamentals of Optics (4th edition, McGrawhill,1982, Jenkins & white, P.602-604, Phase contrast microscope)に記載されている。
【0003】
図4(a)に示した位相差顕微鏡の構成図を用いて原理を簡単に説明する。不図示の光源からの波長λの照明光が、図下方から輪帯状の開口部を有するリング絞りAPを透過する。絞りAPは、コンデンサレンズGlの前側焦点位置Fに配置されており、被検物体Oを照明する光束を図4(b)に示すように輪帯状に制限する。照明された被検物体Oを透過した光は、対物レンズG2,G3によって像面Iに集光され像が形成される。ここで、対物レンズG2の後ろ側焦点位置F’には位相板PH1が設けられている。リング絞りAPと位相板PH1とは共役な関係となっている。そして、位相板PH1は、リング絞りAPの開口部と共役な形状で透過光に位相差λ/4を与える位相膜PPを有している。また、位相板PH1は、透過光量を弱めるための変調膜NDも有している。
【0004】
被検物体Oを透過する際に、物体で回折された光束は、直接光L1と±1次の回折光L2とに分かれて位相板PH1を通過する。直接光L1と回折光L2とが位相板PH1を透過する際に、直接光L1の通過する部分に位相膜PPを設け、例えば直接光L1の位相がλ/4進むように構成されている。位相がλ/4進んだ直接光Llは、位相がλ/4遅れた回折光L2と像面Iの位置で干渉して弱め合う。これに対して、位相物体が無い部分では回折光が生じないため、直接光Llの明るさの背景となる。これにより、物体Oの位相差を、像の明暗として観察できる。また、±1次の回折光L2の振幅は、ベッセル関数を用いてJ1(B)で表される。そして、位相差量に応じて変化する回折光の強度J1 2(B)に合わせて、位相膜PPに透過光量を弱めるニュートラルデンシティ膜などの透過率変調膜が施されている。透過率変調膜により直接光L1の振幅と回折光L2の振幅とを等しくした場合に、背景光に対し位相物体が最もコントラスト良く観察することができる。
【0005】
ニュートラルデンシティ膜の分光透過率T1は、例えば図5に示すように波長に対してほぼフラット(一定)でほぼ25%となっている。そして、直接光L1の振幅と回折光L2の振幅とが等しい場合に、背景光に対し位相物体が最もコントラスト良く観察できる。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来技術で述べた位相差顕微鏡では、被検物体の位相差が小さい場合は、直接光L2の透過率を低くして位相差量の検出感度を高くした、いわゆる高コントラストタイプが用いられている。この時の位相板PH1上の変調膜NDの透過率は10%〜25%程度であることが望ましい。高コントラストタイプの位相差顕微鏡の場合、微小な位相差量の物体を検出することができる反面、位相差量が大きい物体を観察すると直接光と回折光の振幅量が逆転して、コントラストの反転した像が形成されてしまう。このため、物体像の周囲に、位相差又は構造に応じた隈取り状の光の滲みが生ずる。この現象はハロー(ha1o)と呼ばれる。ハローが生じると良好な観察が妨げられるばかりか、さらに被検物体の構造を誤認して観察するおそれがあり問題である。
【0007】
一方、位相差量の大きい被検物体を観察する際は、ハローが生じにくいように直接光L1の透過率を高くした低コントラストタイプの位相差顕微鏡が用いられている。この時の位相板PH1上の透過率変調膜NDの透過率は25%〜50%程度であることが望ましい。低コントラストタイプの顕微鏡の場合は、ハローが生じにくい代わりに、微小な位相差量の物体を観察した場合に、観察像のコントラストが低くなってしまい、良好な像の検出が困難になるという問題がある。
【0008】
また、上記問題に加えて、白色光を用いて位相差顕微鏡観察を行う場合はさらに以下の問題が生じる。図6に示すような長さd、屈折率n1の位相物体を観察する場合、屈折率は波長によって異なるが、通常の分散の程度であり可視光域では1〜2%の差であるため、ほぼ一定であるとみなせる。そして、位相物体中の光路長は、屈折率nl×長さdで求めることができ、屈折率n2の外部媒質中の光路長n2×dとの差(n1−n2)×dが位相差量になる。位相差量は使用波長を単位として表されるため、同一の被検物体で生じる位相差量は光の波長にほぼ反比例する。例えば、550nmの波長で0.1λの位相差量を有する被検物体の場合、波長400nmでは約0.14λの位相差量になる。このため、例えば波長550nmでハローが生じない被検物体でも波長400nmではハローが生じるという問題がある。
【0009】
この問題を解決するために、位相板PH1上の変調膜NDの透過率T1を波長によって10%〜40%程度の範囲で変えるという方法も考えられる。例えば、図7に示すように変調膜NDの短波長側の透過率を長波長側より高くするという方法である。このような透過率にすることによって短波長側では低コントラストタイプの位相差顕微鏡として作用し、長波長側では高コントラストタイプの位相差顕微鏡として作用するので、短波長側で生じやすいハローを軽滅することができる。しかし、位相板上の変調膜NDの分光透過率特性を単波長側で高い透過率に設定するという方法では、観察像の背景光の分光透過率を変えてしまうために背景に色づきが生じてしまう問題がある。例えば、図7に示すような短波長側で透過率が高い場合は、背景が青色になってしまう現象が生ずる。
【0010】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、被検物体の位相差に関わらず、背景光の色づきを低減し、良好なコントラストの像を観察できる位相差観察装置を提供することを目的とする。
【0011】
【課題を解決する為の手段】
上記課題を解決するために、本発明は、光源と、前記光源からの光束を被検物体に照射するための照明光学系と、開口絞りと、前記被検物体からの光束を集光して像を形成する対物レンズと、前記開口絞りと共役な前記対物レンズ内の位置に設けられている位相変換部とを有する位相差観察装置において、前記位相変換部は、前記開口絞りの開口部と所定倍率で相似な形状を有する第1透過率変調部と、前記第1透過率変調部の周囲を取り囲むように設けられている第2透過率変調部とを有し、前記第2透過率変調部の透過率は、前記第1透過率変調部の透過率よりも大きく、
前記第2透過率変調部の波長400nmにおける透過率をT 400 、
前記第2透過率変調部の波長550nmにおける透過率をT 550 、
前記第2透過率変調部の波長700nmにおける透過率をT 700 とそれぞれしたとき、
T 400 <T 550 <T 700
の条件を満足することを特徴とする位相差観察装置を提供する。
【0013】
また、本発明の別の好ましい態様によれば、前記第2透過率変調部の透過率は、前記第1透過率変調部の透過率よりも大きく、かつ、所定の波長領域においてほぼ直線状に増加することが望ましい。
【0014】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面に基づいて本発明の実施の形態を説明する。図1(a)は、本発明の実施形態にかかる位相差顕微鏡の概略構成を示す図である。図1(a)の構成において、前述した従来技術のものと同じ構成部分については同一の符号を用いている。
【0015】
光源LSからの波長λの照明光が、図下方からリング状の開口部を有するリング絞りAPを透過する。絞りAPは、コンデンサレンズGlの前側焦点位置Fに配置されており、開口絞りとして被検物体Oを照明する光束を図1(b)に示すように輪帯状に制限する。照明された被検物体Oを透過した光は、対物レンズG2,G3によって像面Iに集光され像が形成される。ここで、対物レンズG2の後ろ側焦点位置F’には位相板PHが設けられている。位相板PHのうち、透過率変調部Aとリング絞りAPとは共役な関係となっている。また、透過率変調部Aは、リング絞りAPの開口部と相似な形状であり、かつ透過光に位相差λ/4を与える位相膜PPを有している。また、位相板PHは光量を弱める変調膜NDも有している。
【0016】
位相板PHの構成を図2を用いてさらに詳しく説明する。透過率変調部Aは、リング絞りAPの開口部に対して所定倍率の相似形状である。所定倍率として、コンデンサレンズG1と対物レンズG2との合成倍率、即ち、絞りAPがレンズG1とG2とによりリレーされる倍率であることが望ましい。さらに好ましくは、位相板PHの位置調整の容易性等を考慮して、リング絞りAPの開口部に対応するリレー倍率で定まる幅よりやや広めであることが望ましい。そして、透過率変調部Aの外周及び内周の周囲部分には、透過率変調部Bが透過率変調部Aを取り囲むように設けられている。透過率変調部Bの幅は、透過率変調部Aと同一又は若干広い程度であることが望ましいが、これに限られるものではない。透過率変調部A、Bはいずれも輪帯形状である。
【0017】
透過率変調部Aの透過率TAは、波長400nm〜700nmまでの可視光域全体で25%に設定されている。また、透過率変調部Bの透過率は、波長400nmにおける透過率TB400は30%、波長550nmにおける透過率TB550は40%、波長700nmにおける透過率TB700は50%とそれぞれなるようにニュートラルデンシティ膜などを使用して調整されている。また、図からも明らかなように、波長400nm、550nm、700nmの間の波長領域における透過率は、TB400とTB550とTB700とを通るほぼ直線状に変化している。さらに、位相板PHの最外周部分及び中心部分付近Cは、透過率変調を行なっていない、透過率TCが100%の部分である。
【0018】
次に、本実施形態の位相板PHを用いた場合の、位相差観察の原理について説明する。物体の構造によって生じる回折光L2の回折角θは、使用波長をλ、媒質の屈折率をn、物体構造の周期をdとしたとき、次式で表される。
【0019】
θ=sin-1{0.61λ/(n・d)}
ただし、0≦θ≦π/4である。
【0020】
一般に、生物標本では、位相差量は物体の構造の大きさにほぼ比例するので、位相差量の大きい物体では、構造も大きい、即ち、上式でdが大きいという特徴が存在する。このとき、n、λが定数ならばθが小さくなる。
【0021】
また、回折光L2と直接光L1との距離P(図1参照)は次式で表すことができる。
【0022】
P=f2・sinθ
ここで、f2は対物レンズG2の焦点距離、θは回折角をそれぞれ表している。
【0023】
位相差量の大きい物体(構造の大きな物体)を観察する場合は、回折角θは小さいので、直接光L1と回折光L2との距離Pが小さくなり、直接光L1は透過率変調部A、±1次の回折光L2は透過率変調部Bをそれぞれ通過する。透過率変調部Bの分光透過率は図3で示したように、短波長側で低く、長波長側で高いので、低コントラストタイプの構成と同様の効果となる。即ち、被検物体によって生じる位相差量の波長による違いを、長波長側よりも短波長側でより低コントラストタイプに作用させることでコントラストの調整を良好に行うことが出来る。
【0024】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、電気的なコントラスト変調装置を用いることなく、きわめて単純な構成で、位相差量の大きい構造物でもハローの少ない観察ができ、位相差量の小さい構造物も高いコントラストで観察できる。また、短波長側で顕著に発生するハローを背景光の色づきなしに軽減することができため、被検物体の位相差量の大小にかかわらず、白色光による照明で、検知能力に優れた位相差顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の実施形態にかかる位相差観察装置の概略構成を示す図である。
【図2】位相板の構成を示す図である。
【図3】位相板の分光透過率を示す図である。
【図4】従来の位相差顕微鏡の構成を示す図である。
【図5】従来の位相差顕微鏡の位相板の分光透過率を示す図である。
【図6】位相物体の構造を示す図である。
【図7】従来の位相差顕微鏡の位相板の分光透過率を示す他の図である。
【符号の説明】
A,B,C 透過率変調部
PP 位相膜
ND ニュートラルデンシティ膜
PH,PH1 位相板
AP 開口絞り
G1 照明系レンズ
G2,G3 対物レンズ
O 被検物体
I 観察像(像面)
L1 直接光
L2 回折光
LS 光源
Claims (2)
- 光源と、
前記光源からの光束を被検物体に照射するための照明光学系と、
開口絞りと、
前記被検物体からの光束を集光して像を形成する対物レンズと、
前記開口絞りと共役な前記対物レンズ内の位置に設けられている位相変換部とを有する位相差観察装置において、
前記位相変換部は、前記開口絞りの開口部と所定倍率で相似な形状を有する第1透過率変調部と、
前記第1透過率変調部の周囲を取り囲むように設けられている第2透過率変調部とを有し、
前記第2透過率変調部の透過率は、前記第1透過率変調部の透過率よりも大きく、
前記第2透過率変調部の波長400nmにおける透過率をT 400 、
前記第2透過率変調部の波長550nmにおける透過率をT 550 、
前記第2透過率変調部の波長700nmにおける透過率をT 700 とそれぞれしたとき、
T 400 <T 550 <T 700
の条件を満足することを特徴とする位相差観察装置。 - 前記第2透過率変調部の透過率は、前記第1透過率変調部の透過率よりも大きく、かつ、所定の波長領域においてほぼ直線状に増加することを特徴とする請求項1記載の位相差観察装置。
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Family Applications (1)
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JP15406099A Expired - Lifetime JP4370636B2 (ja) | 1999-06-01 | 1999-06-01 | 位相差観察装置 |
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-
1999
- 1999-06-01 JP JP15406099A patent/JP4370636B2/ja not_active Expired - Lifetime
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