JP4364696B2 - 組織または器官再生用材料 - Google Patents
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Description
特許文献2は、ラットのタイプIコラーゲン溶液、ウサギのタイプIIコラーゲン溶液および軟骨細胞を混合し、培養することで、軟骨移植片を作成する技術が開示されている。
特許文献3には、中央部に細胞が侵入可能な貫通穴を有した材料を、細胞を含有した培養液に浸漬させて培養することで骨移植材を作成する方法の技術思想が開示されている。
(1) 生分解性高分子物質からなる細胞支持体上で播種し、振盪培養された幹細胞からなる組織または器官再生用材料、
(2) さらに多血小板血漿(PRP)とを混合してなる(1)に記載の組織または器官再生用材料、
(3) 幹細胞が、間葉系幹細胞、上皮細胞、線維芽細胞、胚性幹細胞または体性幹細胞である(1)に記載の組織または器官再生用材料、
(4) 生分解性高分子物質が、コラーゲン、ポリペプチド、ポリサッカライドまたはポリエステルである(1)に記載の組織または器官再生用材料、
(5) 細胞支持体が、糸状物の束、織布、不織布、シートまたはスポンジからなる(1)に記載の組織または器官再生用材料、
(6) 細胞支持体が、織布、不織布、シートまたはスポンジの積層体である(1)に記載の組織または器官再生用材料、
(7) 積層体が、生分解性高分子物質で成型された糸状物によって縫製された(6)に記載の組織または器官再生用材料、
(8) コラーゲンからなる糸状物によって縫製された、コラーゲンからなる不織布の積層体上に播種し、振盪培養された間葉系幹細胞からなる組織または器官再生用材料、
(9) 振盪培養後に、さらに多血小板血漿(PRP)を混合して調製することを特徴とする(8)に記載の組織または器官再生用材料、
(10) 生分解性高分子物質からなる細胞支持体に幹細胞を播種し、振盪培養することを特徴とする組織または器官再生用材料の製造方法、
(11) さらに多血小板血漿(PRP)を混合して調製することを特徴とする請求項9に記載の組織または器官再生用材料の製造方法、および、
(12) コラーゲンからなる糸状物によって縫製された、コラーゲンからなる不織布の積層体上に播種し、振盪培養された間葉系幹細胞からなる組織または器官再生用材料を、歯周組織、骨、軟骨、脂肪、神経または腱の再生に使用する組織または器官再生用材料の使用方法に関する。
ブタ由来I型、III型コラーゲン粉末(日本ハム株式会社製、SOFDタイプ、Lot No.020212)を注射用蒸留水(大塚製薬社製)に溶解し、7重量%に調製した。そして、この7重量%コラーゲン水溶液をシリンジ(EFD社製 Disposable Barrels/Pistons、55mL)に充填し、シリンジに装着した針より該コラーゲン水溶液を空気圧によりエタノール槽中に吐出した。この際シリンジには、EFD社製 Ultra Dispensing Tips(27G、ID:Φ0.21mm)の針を装着した。吐出した7重量%コラーゲン水溶液は脱水され糸状になったのち、エタノール槽から引き上げられた。引き上げられたコラーゲン糸状物を、前記エタノール槽とは完全に分離独立した第2のエタノール槽に室温で約30秒間浸漬し、さらに凝固を施した。続いて、第2のエタノール槽から引き上げたコラーゲン糸状物を図1に示す如く15rpmで回転している1辺12cm、厚さ5mmの板状部材に巻き取った。板状部材の直前には、板状部材に均等にコラーゲン糸状物を巻き取っていくためにコラーゲン糸状物の水平位置を周期的に移動させる往復機構が備え付けられており、その往復速度は1.5mm/秒とした(糸状物は約6mmの間隔で巻き取られる)。巻き取り装置は、500回巻き取るたびに板状部材の回転軸を90度方向転換させるようにし、500回の巻き取りを9回繰り返し(合計巻き取り数4500回、9層の層状体)、板状部材の両面にコラーゲン糸状物の層を有するコラーゲン巻き取り物を得た。次にこのコラーゲン巻き取り物を、常温で4時間自然乾燥した後、巻き取り物の端部に沿って裁断し、2枚のコラーゲン層状不織布を得た。そして、得られたコラーゲン不織布をバキュームドライオーブン(EYELA社製:VOS−300VD型)と油回転真空ポンプ(ULVAC社製:GCD135−XA型)を用いて135℃、減圧下(1Torr以下)で24時間熱脱水架橋反応を行い、外層に使用するコラーゲン層状不織布を得た。なお、厚みは約3mmであった。
まず、実施例1に記載する内容と同様の製法に従いコラーゲン層状不織布を作製した。ただし、合計巻き取り数3000回、6層とした。次いで1重量%に調製したコラーゲン溶液に含浸させ、膜状に成型した後、常温で十分に自然乾燥した。その後、バキュームドライオーブンを用いて135℃、減圧下(1Torr以下)で12時間熱脱水架橋反応を行い、バインダー処理を行ったコラーゲン層状不織布を得た。
紡糸環境全域の相対湿度を38%以下に保持した後、この7重量%コラーゲン水溶液を充填したシリンジに、空気圧をかけてシリンジに装着した針より該コラーゲン水溶液を吐出した。吐出した7重量%コラーゲン水溶液は、99.5容量%エタノール3Lを収容したエタノール槽で直ちに糸状に脱水・凝固した。エタノール槽から引き上げられた糸状コラーゲンを、99.5容量%エタノール3Lを収容し前記エタノール槽とは完全に分離独立した第2のエタノール槽に室温で約30秒間浸漬し、さらに脱水・凝固を施した。続いて、第2のエタノール槽から引き上げられた糸状コラーゲンを、その周囲にドライエアーが送り込まれる送風乾燥機を約3秒間で通過させた後、糸が弛まないようにテンションプーリーで張力を保ちつつ、直径78mm、全長200mmのステンレス製ロール状巻き取り具を35rpmで回転させ、巻き取った。このロール状巻き取り具への巻き取りの際、ロール状巻き取り具をロール状巻き取り具の軸方向に1.5mm/sの速度で往復させつつ巻き取り、シリンジに充填した7重量%コラーゲン水溶液が尽きるまで連続紡糸を行った。次いで、ステンレス製ロール状巻き取り具に巻き取られたままの状態で前記と同じバキュームドライオーブンを用いて135℃、減圧下(1Torr以下)で24時間熱脱水架橋反応処理を行い、熱架橋処理が施されたコラーゲン糸状物を得た。
実施例2で作成されたバインダー処理を行った層状不織布(6層)を、実施例1にて作製されたコラーゲン層状不織布(9層)で挟んだ3層の積層体を、実施例3にて作製されたコラーゲン糸状物を2本撚った撚り糸で縫製することで、細胞培養基材を得た。縫製にはミシン(ジャガー株式会社製、Model KM-570)が使用された。縫い模様はピッチが2〜3mmである直線縫いで、コラーゲン不織布の周囲及び不織布の全面に縦横(約1cm間隔)に縫製した。
実施例4にて得られたコラーゲン製細胞培養基材上で、イヌ由来間葉系幹細胞(以下dMSCsと略記する)の培養を行った。培養にはDMEM基礎培地500mL及び間葉系幹細胞成長因子、L−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン混合物50mLを混合した混合培地を用いた。まず、コラーゲン製細胞培養基材をシャーレ(CORNING社製、6ウェル)に静置し、基材表面上に細胞濃度4.0×105個/mLとなるように細胞を懸濁した上記の混合培地1mLを塗布した。その後、シャーレに培地3mLを静かに注入し、その後、37℃、加湿雰囲気下,5%CO2存在下で振盪培養を行った。振盪培養の条件は、約15rpmで行った。培養開始21日後には、間葉系幹細胞は十分に増殖し、分解・吸収の進んだコラーゲン製細胞培養基材は流動性を有する物質になっていた。
約50mlの全血をイヌから採血し、約250U/mlの防腐剤の入っていないヘパリンを含んだ10mlの培地に混ぜた。血液は標準的な研究用遠心器にて約1100rpm、5分間遠心分離した。その後黄色血漿(バフィーコートを含む。これは、血小板と白血球を含むものである。)を長針を用いて吸い上げた。その後、2回目の遠心分離を約2500rpm、5分間の条件で行い、血小板を単一のペレットに集めるとともに、血漿上清(これは血小板希薄血漿(PPP)であり、比較的にわずかな細胞を含んでいる。)を取り除いた。上記操作により得られた血小板のペレット、バフィーコート/血漿画分(PRP)を5mlの血漿残渣に再懸濁し、移植物として用いた。
常法によって得られた間葉系幹細胞を培養した流動性を有する物質約3gと、実施例6で得られた多血漿板血漿(PRP)1mlを混合することで、組織または器官再生用材料を調製した。
本研究における全ての動物実験は、研究動物保護委員会によって承認された厳密なプロトコールに従って行ったものである。
一定期間飼育した2歳の雑種犬4頭に対して、一般的な麻酔下で手術を行った。下顎骨領域にある第一前臼歯、第二前臼歯、第三前臼歯、第四前臼歯を摘出した。下顎骨両側の骨欠損は、直径10mmのトレフィンバーにより作製した。作製した骨欠損に対して
(i)コントロール(欠損のみ)
(ii)層状不織布+dMSCs
(iii)層状不織布+dMSCs+PRP
の3群を各々移植し骨形成についての調査を行った。骨治癒の過程で、移植物を埋め込んだ部位による骨形成の違いが出るのを防ぐために、3つの欠損部位を作製して上記6種の移植物をランダムに埋め込むことで、部位特異性を除外した。移植後2、4および8週後における組織染色の写真を図1〜3に示す。また、骨欠損部の耐性を100%とした場合の移植後8週後の骨再生割合を組織形態計測的分析により評価を行った結果、(iv)14.67%、(vi)50.95%および(iii)62.86%であった。上記3群の中で、(iii)層状不織布+dMSCs+PRPの群が最も良好な骨形成能を有していることが分かった。
Claims (8)
- 生分解性高分子物質からなり、かつ織布、不織布、シートまたはスポンジの積層体である細胞支持体上に間葉系幹細胞、上皮細胞、線維芽細胞、胚性幹細胞または体性幹細胞を含む細胞懸濁液を塗布し、細胞支持体が流動性を有する状態になるまで振盪培養して得られた組織または器官再生用材料。
- さらに多血小板血漿(PRP)と混合してなる請求項1に記載の組織または器官再生用材料。
- 生分解性高分子物質が、コラーゲン、ポリペプチド、ポリサッカライドまたはポリエステルである請求項1に記載の組織または器官再生用材料。
- 積層体が、生分解性高分子物質で成型された糸状物によって縫製された請求項1に記載の組織または器官再生用材料。
- コラーゲンからなる糸状物によって縫製された、コラーゲンからなる不織布の積層体上に間葉系幹細胞を含む細胞懸濁液を塗布し、細胞支持体が流動性を有する状態になるまで振盪培養して得られた組織または器官再生用材料。
- 振盪培養後に、さらに多血小板血漿(PRP)を混合して調製することを特徴とする請求項5に記載の組織または器官再生用材料。
- 生分解性高分子物質からなり、かつ織布、不織布、シートまたはスポンジの積層体である細胞支持体に間葉系幹細胞、上皮細胞、線維芽細胞、胚性幹細胞または体性幹細胞を含む細胞懸濁液を塗布し、細胞支持体が流動性を有する状態になるまで振盪培養することを特徴とする組織または器官再生用材料の製造方法。
- さらに多血小板血漿(PRP)を混合して調製することを特徴とする請求項7に記載の組織または器官再生用材料の製造方法。
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