JP4359497B2 - 核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット及びこれを用いた癌の検査方法 - Google Patents
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Description
本発明は、癌の臨床検査の分野において用いられる、Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（以下、「ＭＧＭＴ」という。）をコードする遺伝子（以下、「ＭＧＭＴ遺伝子」という。）のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別する方法、特に１回の操作で、２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別する方法、これに用いるための核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無の識別キットに関する。
癌は遺伝子病であり、遺伝子変異の蓄積によって発症するという概念が確立されている。この遺伝子変異のうち、遺伝子配列を変化させない変異として、遺伝子にあるＣｐＧ領域に存在するシトシンのメチル化が知られている。即ち、癌患者の多くにおいて、ＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域のシトシンが異常な割合でメチル化されていることが分かっている。そのため、ＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を効率良く、高い精度で検出できる方法が求められている。
こうした、ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出する方法として、ＣｐＧ含有ＤＮＡをＰＣＲで増幅して測定する方法（特許文献１）、プライマーとプローブを併用してメチル化を検出する方法（特許文献２）が知られている。
特表２０００−５１１７７６号公報
特表２００２−５４３８５２号公報
こうした、ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出する方法として、ＣｐＧ含有ＤＮＡをＰＣＲで増幅して測定する方法（特許文献１）、プライマーとプローブを併用してメチル化を検出する方法（特許文献２）が知られている。
しかしながら、上述の特許文献１及び２の技術においては、１つの遺伝子試料のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出するのに、メチル化ＤＮＡを検出するためのＰＣＲと、非メチル化ＤＮＡを検出するためのＰＣＲとの２回のＰＣＲを必要とし、検出効率が低いという問題がある。
さらに、ＭＧＭＴ発現の消失の多くは、ＭＧＭＴ遺伝子のプロモーター領域の分離したＣｐＧ領域のシトシンのメチル化であることが明らかにされている。その意味で、ＭＧＭＴ遺伝子の分離した複数のＣｐＧ領域のメチル化を検出する方法は、ＭＧＭＴ遺伝子の変異に起因する癌の診断において重要な意味があり、かかるＭＧＭＴ遺伝子の分離した複数のＣｐＧ領域のメチル化の検出方法が求められている。
さらに、ＭＧＭＴ発現の消失の多くは、ＭＧＭＴ遺伝子のプロモーター領域の分離したＣｐＧ領域のシトシンのメチル化であることが明らかにされている。その意味で、ＭＧＭＴ遺伝子の分離した複数のＣｐＧ領域のメチル化を検出する方法は、ＭＧＭＴ遺伝子の変異に起因する癌の診断において重要な意味があり、かかるＭＧＭＴ遺伝子の分離した複数のＣｐＧ領域のメチル化の検出方法が求められている。
そこで、本発明の課題は、ＭＧＭＴ遺伝子の２以上のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を効率良く、高い精度で検出する方法として、１回の操作で、ＭＧＭＴ遺伝子の２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化を検出する方法を提供することである。さらに、この検出方法に用いるための核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、検査用試薬キットを提供することである。
かかる実情において、１）ＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域に存在するメチル化されたシトシンを特異的に認識する核酸増幅用プライマー（以下、「メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマー」という。）であって、それぞれの核酸増幅用プライマーが異なるＣｐＧ領域に存在するメチル化されたシトシンを特異的に認識して核酸増幅によりオリゴヌクレオチドを形成するものを２以上、２）当該メチル化の有無によらずＭＧＭＴ遺伝子のいずれかの領域（前記ＣｐＧ領域以外の領域が好ましい。）に結合し、当該ＣｐＧ領域を含む領域で核酸増幅によりオリゴヌクレオチドを形成する核酸増幅用プライマー（以下、「メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマー」という。）を２以上含む核酸増幅用プライマーセットを用いれば、１回の操作で、ＭＧＭＴ遺伝子の２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化を精度よく検出でき、１回の操作で、ＭＧＭＴ遺伝子の２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無を精度よく識別することできることを見出した。
また、これら核酸増幅用プライマーセットとして、２以上のメチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーのそれぞれの融解温度の差を１〜３度以内とし、かつ、２以上のメチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーのそれぞれの融解温度の差を１〜３度以内とするものを用いれば、擬陽性の結果を生ずることを防止できるので好ましい。
また、これら核酸増幅用プライマーセットとして、核酸増幅用プライマー同士のＧＣ含有率（グアニンとシトシンのプライマー中の含有率）の差が２０％以内であるものを用いれば、擬陽性の結果を生ずることを防止できるので好ましい。
また、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質の免疫染色分析（immunohistochemical analysis;以下適宜「ＩＨＣ」という。）を併用することにより、ＭＧＭＴ遺伝子の２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化を精度よく検出でき、１回の操作で、ＭＧＭＴ遺伝子の２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無を精度よく識別することできるので好ましい。
また、本発明においては、２つの前記メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーのみにより増幅された核酸増幅産物の量と、当該メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーと１つの前記メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーにより増幅された核酸増幅産物の量とを比較することにより、ＭＧＭＴをコードする遺伝子における２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の程度を判定することができるので好ましい。
その際、前記メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーの濃度を、前記メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーの濃度より高くすることが好ましい。
また、前記核酸増幅用プライマーセットを含む検査用試薬キットと合わせて本発明を完成した。
本発明に係る核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びこれを用いた検出方法によれば、１回の操作で、ＭＧＭＴ遺伝子の２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を精度よく検出でき、１回の操作で、ＭＧＭＴ遺伝子の２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無を精度よく識別することできる。
（検出原理）
ＭＧＭＴ遺伝子（一本鎖ＤＮＡ）のＣｐＧ領域（主としプロモーター領域）においては、メチル化されたシトシンは重亜硫酸修飾によって脱アミノ化されにくく、シトシンのままで存在するとされる。一方、メチル化されないシトシンは、そのすべて又はその殆んどが重亜硫酸修飾によって一旦ウラシルに転換され、この転換されたウラシルは、これを含む一本鎖ＤＮＡを増幅すると、チミンとして発現される。
ＭＧＭＴ遺伝子（一本鎖ＤＮＡ）のＣｐＧ領域（主としプロモーター領域）においては、メチル化されたシトシンは重亜硫酸修飾によって脱アミノ化されにくく、シトシンのままで存在するとされる。一方、メチル化されないシトシンは、そのすべて又はその殆んどが重亜硫酸修飾によって一旦ウラシルに転換され、この転換されたウラシルは、これを含む一本鎖ＤＮＡを増幅すると、チミンとして発現される。
（２以上のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の一回検出）
そこで、基本的に、（１）いずれかのＣｐＧ領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にシトシンである場合にのみ前記ＭＧＭＴ遺伝子に結合し、前記いずれかのＣｐＧ領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にウラシルに変換されれば当該ＭＧＭＴ遺伝子に結合しなくなるプライマー（前記「メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマー」に相当する。）であって、それぞれの核酸増幅用プライマーが、異なるＣｐＧ領域に存在するシトシンであって、重亜硫酸修飾の後でもシトシンのままであるもの（前記「メチル化されたシトシン」に相当する。）を特異的に認識して核酸増幅によりオリゴヌクレオチドを形成するものを２以上用い、（２）この２以上のメチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーの認識する２以上のＣｐＧ領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にシトシンのままであっても、ウラシル（遺伝子増幅により増幅されたオリゴヌクレオチドにおいては、このウラシルの部位にはチミンが置かれる。）に転換されても，当該ＭＧＭＴ遺伝子に結合し、当該重亜硫酸修飾の後でもシトシンのままであるものの存在するＣｐＧ領域の何れをも含む領域で核酸増幅によりオリゴヌクレオチドを形成するプライマー（前記「メチル化シトシン非特異的プライマー」に相当する。）を２以上用い、（１）で表される核酸増幅用プライマーと（２）で表される核酸増幅用プライマーとの少なくとも２種を用いて、核酸増幅方法にて増幅した産物を検出すると、１のＣｐＧ領域の前記メチル化されたシトシンを含む遺伝子に対しては、１のメチル化シトシン特異的プライマーとメチル化シトシン非特異的プライマー由来の２種の増幅産物（Ｓ１とＮＳ）が検出され、他の１のＣｐＧ領域の前記メチル化されたシトシンを含む遺伝子に対しては、他の１のメチル化シトシン特異的プライマーとメチル化シトシン非特異的プライマー由来の２種の増幅産物（Ｓ２とＮＳ）が検出され、当該１のＣｐＧ領域の前記メチル化されたシトシンと当該他の１のＣｐＧ領域の前記メチル化されたシトシンを含む遺伝子に対しては、１のメチル化シトシン特異的プライマーと、他の１のメチル化シトシン特異的プライマーと、メチル化シトシン非特異的プライマー由来の３種の増幅産物（Ｓ１、Ｓ２、ＮＳ）が検出されるが、メチル化されないシトシンのみを含む遺伝子に対しては、メチル化シトシン非特異的プライマー由来の１種の増幅産物のみが検出される。よって、検出される増幅産物の違いに基づいて、１度の操作で、前記２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出し、１度の操作で、前記２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別することができる。
そこで、基本的に、（１）いずれかのＣｐＧ領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にシトシンである場合にのみ前記ＭＧＭＴ遺伝子に結合し、前記いずれかのＣｐＧ領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にウラシルに変換されれば当該ＭＧＭＴ遺伝子に結合しなくなるプライマー（前記「メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマー」に相当する。）であって、それぞれの核酸増幅用プライマーが、異なるＣｐＧ領域に存在するシトシンであって、重亜硫酸修飾の後でもシトシンのままであるもの（前記「メチル化されたシトシン」に相当する。）を特異的に認識して核酸増幅によりオリゴヌクレオチドを形成するものを２以上用い、（２）この２以上のメチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーの認識する２以上のＣｐＧ領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にシトシンのままであっても、ウラシル（遺伝子増幅により増幅されたオリゴヌクレオチドにおいては、このウラシルの部位にはチミンが置かれる。）に転換されても，当該ＭＧＭＴ遺伝子に結合し、当該重亜硫酸修飾の後でもシトシンのままであるものの存在するＣｐＧ領域の何れをも含む領域で核酸増幅によりオリゴヌクレオチドを形成するプライマー（前記「メチル化シトシン非特異的プライマー」に相当する。）を２以上用い、（１）で表される核酸増幅用プライマーと（２）で表される核酸増幅用プライマーとの少なくとも２種を用いて、核酸増幅方法にて増幅した産物を検出すると、１のＣｐＧ領域の前記メチル化されたシトシンを含む遺伝子に対しては、１のメチル化シトシン特異的プライマーとメチル化シトシン非特異的プライマー由来の２種の増幅産物（Ｓ１とＮＳ）が検出され、他の１のＣｐＧ領域の前記メチル化されたシトシンを含む遺伝子に対しては、他の１のメチル化シトシン特異的プライマーとメチル化シトシン非特異的プライマー由来の２種の増幅産物（Ｓ２とＮＳ）が検出され、当該１のＣｐＧ領域の前記メチル化されたシトシンと当該他の１のＣｐＧ領域の前記メチル化されたシトシンを含む遺伝子に対しては、１のメチル化シトシン特異的プライマーと、他の１のメチル化シトシン特異的プライマーと、メチル化シトシン非特異的プライマー由来の３種の増幅産物（Ｓ１、Ｓ２、ＮＳ）が検出されるが、メチル化されないシトシンのみを含む遺伝子に対しては、メチル化シトシン非特異的プライマー由来の１種の増幅産物のみが検出される。よって、検出される増幅産物の違いに基づいて、１度の操作で、前記２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出し、１度の操作で、前記２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別することができる。
本発明においては、メチル化シトシン特異的プライマーであれ、メチル化シトシン非特異的プライマーであれ、２以上のＣｐＧ領域（その各々のＣｐＧ領域中にメチル化シトシンが存在する）を含むオリゴヌクレオチドを選択する。ここで、プライマーが２以上のＣｐＧ領域を含むオリゴヌクレオチドを選択するとは、そのプライマーが２以上のＣｐＧ領域を含むヌクレオチドのいずれかの領域に結合し、前記２以上のＣｐＧ領域を含むオリゴヌクレオチドを鋳型として、核酸増幅により前記ＣｐＧ領域に対応する領域（一般には前記ＣｐＧ領域に対して相補的である。）を含むオリゴヌクレオチドを形成することをいう。
本発明においては、メチル化シトシン特異的プライマーは、検出しようとするメチル化シトシンの存在するＣｐＧ領域に結合するように設計される。また、本発明においては、それぞれのメチル化シトシン特異的プライマーは、異なるメチル化シトシンの存在する異なるＣｐＧ領域に結合するように設計される。
一方、メチル化シトシン非特異的プライマーは、前記メチル化シトシンの存在するＣｐＧ領域に結合しないように設計されるが、前記メチル化シトシンの存在するＣｐＧ領域に結合するものとなってもよい。
本発明においては、メチル化シトシン特異的プライマーは、検出しようとするメチル化シトシンの存在するＣｐＧ領域に結合するように設計される。また、本発明においては、それぞれのメチル化シトシン特異的プライマーは、異なるメチル化シトシンの存在する異なるＣｐＧ領域に結合するように設計される。
一方、メチル化シトシン非特異的プライマーは、前記メチル化シトシンの存在するＣｐＧ領域に結合しないように設計されるが、前記メチル化シトシンの存在するＣｐＧ領域に結合するものとなってもよい。
本発明においては、ＭＧＭＴ遺伝子（一本鎖ＤＮＡ）のプロモーター領域中で、塩基番号７８１から１４８４の間の領域（配列番号１の１から７００で表されるＭＧＭＴ遺伝子の領域）の２以上のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出できるプライマーセットを見出した。
（プライマーとプライマー用のオリゴヌクレオチド）
本発明においては、メチル化シトシン特異的プライマーは、メチル化解析の対象となるＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域中のシトシンに対応する部位のみがシトシンに対応した塩基であり、前記シトシン以外のシトシンに対応する部位は、ウラシル若しくはチミンに対応するように設計される。一方、メチル化シトシン非特異的プライマーは、ＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域のシトシンがウラシル若しくはチミンに転換された配列、シトシンのままの配列の双方に対応するように設計される。
本発明においては、メチル化シトシン特異的プライマーは、メチル化解析の対象となるＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域中のシトシンに対応する部位のみがシトシンに対応した塩基であり、前記シトシン以外のシトシンに対応する部位は、ウラシル若しくはチミンに対応するように設計される。一方、メチル化シトシン非特異的プライマーは、ＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域のシトシンがウラシル若しくはチミンに転換された配列、シトシンのままの配列の双方に対応するように設計される。
一般に、メチル化特異的ＰＣＲでは、プライマー配列と重亜硫酸修飾後のＤＮＡ配列とが完全に相補的にアニーリングしたときにのみＤＮＡの増幅が起こり、プライマー配列と重亜硫酸修飾後のＤＮＡ配列との間に１塩基以上のミスマッチが存在するときにはＤＮＡの増幅がおこらないようにプライマー及びＰＣＲの反応系を設計する。このことによって、メチル化特異的ＰＣＲでは、１塩基のメチル化の有無も識別することができる。
本発明において核酸増幅用プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、各種の核酸合成反応において必要な特異性を維持しながら相補鎖との塩基対結合を行うことができる。
具体的には、ＭＧＭＴをコードする遺伝子における２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化を１回の操作で検出する検出方法に用いられる核酸増幅用プライマーであって、
以下の１）〜１０）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つを選択する核酸増幅用プライマーである。
１）ＭＧＭＴをコードする遺伝子におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、例えば、生体試料から採取した遺伝子の２本鎖ＤＮＡのうちの重亜硫酸修飾後による１本鎖ＤＮＡ由来のものである。メチル化特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化シトシン特異的プライマーに限られず、メチル化シトシン非特異的プライマーであってもよい。
２）ＭＧＭＴをコードする遺伝子におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、１）で表されるオリゴヌクレオチドを鋳型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列と同じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で鋳型として用いられる。メチル化特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化シトシン特異的プライマーに限られず、メチル化シトシン非特異的プライマーであってもよい。
３）ＭＧＭＴをコードする遺伝子におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域に存在するシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、生体試料から採取した遺伝子の２本鎖ＤＮＡのうちの重亜硫酸修飾後による１本鎖ＤＮＡ由来のものである。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化シトシン非特異的プライマーとされる。
４）ＭＧＭＴをコードする遺伝子におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域に存在するシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、３）で表されるオリゴヌクレオチドを鋳型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列と同じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で鋳型として用いられる。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化シトシン非特異的プライマーとされる。
５）配列番号２〜５に表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。プライマーが別のプライマーを認識して結合すれば、核酸増幅に好適である。
６）ＭＧＭＴをコードする遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、例えば、生体試料から採取した遺伝子の２本鎖ＤＮＡのうちの１）において示した１本鎖ＤＮＡに相補的に結合していた１本鎖（反対鎖）ＤＮＡ由来のものである。メチル化シトシン特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化シトシン特異的プライマーに限られず、メチル化シトシン非特異的プライマーであってもよい。
７）ＭＧＭＴをコードする遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、６）で表されるオリゴヌクレオチドを鋳型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列と同じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で鋳型として用いられる。メチル化シトシン特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化シトシン特異的プライマーに限られず、メチル化シトシン非特異的プライマーであってもよい。
８）ＭＧＭＴをコードする遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域に存在するシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、例えば、生体試料から採取した遺伝子の２本鎖ＤＮＡのうちの３）において示した１本鎖ＤＮＡに相補的に結合していた１本鎖（反対鎖）ＤＮＡ由来のものである。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化シトシン非特異的プライマーとされる。
９）ＭＧＭＴをコードする遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域に存在するシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、８）で表されるオリゴヌクレオチドを鋳型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列と同じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で鋳型として用いられる。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化シトシン非特異的プライマーとされる。
１０）前記１）から９）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち１又は複数のオリゴヌクレオチドについて、１ないし複数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含み、前記２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
具体的には、ＭＧＭＴをコードする遺伝子における２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化を１回の操作で検出する検出方法に用いられる核酸増幅用プライマーであって、
以下の１）〜１０）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つを選択する核酸増幅用プライマーである。
１）ＭＧＭＴをコードする遺伝子におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、例えば、生体試料から採取した遺伝子の２本鎖ＤＮＡのうちの重亜硫酸修飾後による１本鎖ＤＮＡ由来のものである。メチル化特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化シトシン特異的プライマーに限られず、メチル化シトシン非特異的プライマーであってもよい。
２）ＭＧＭＴをコードする遺伝子におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、１）で表されるオリゴヌクレオチドを鋳型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列と同じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で鋳型として用いられる。メチル化特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化シトシン特異的プライマーに限られず、メチル化シトシン非特異的プライマーであってもよい。
３）ＭＧＭＴをコードする遺伝子におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域に存在するシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、生体試料から採取した遺伝子の２本鎖ＤＮＡのうちの重亜硫酸修飾後による１本鎖ＤＮＡ由来のものである。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化シトシン非特異的プライマーとされる。
４）ＭＧＭＴをコードする遺伝子におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域に存在するシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、３）で表されるオリゴヌクレオチドを鋳型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列と同じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で鋳型として用いられる。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化シトシン非特異的プライマーとされる。
５）配列番号２〜５に表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。プライマーが別のプライマーを認識して結合すれば、核酸増幅に好適である。
６）ＭＧＭＴをコードする遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、例えば、生体試料から採取した遺伝子の２本鎖ＤＮＡのうちの１）において示した１本鎖ＤＮＡに相補的に結合していた１本鎖（反対鎖）ＤＮＡ由来のものである。メチル化シトシン特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化シトシン特異的プライマーに限られず、メチル化シトシン非特異的プライマーであってもよい。
７）ＭＧＭＴをコードする遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、６）で表されるオリゴヌクレオチドを鋳型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列と同じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で鋳型として用いられる。メチル化シトシン特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化シトシン特異的プライマーに限られず、メチル化シトシン非特異的プライマーであってもよい。
８）ＭＧＭＴをコードする遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域に存在するシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、例えば、生体試料から採取した遺伝子の２本鎖ＤＮＡのうちの３）において示した１本鎖ＤＮＡに相補的に結合していた１本鎖（反対鎖）ＤＮＡ由来のものである。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化シトシン非特異的プライマーとされる。
９）ＭＧＭＴをコードする遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を２以上含み、この２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域に存在するシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
このオリゴヌクレオチドは、８）で表されるオリゴヌクレオチドを鋳型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列と同じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で鋳型として用いられる。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化シトシン非特異的プライマーとされる。
１０）前記１）から９）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち１又は複数のオリゴヌクレオチドについて、１ないし複数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含み、前記２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
より、具体的には、２以上のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化シトシン特異的プライマーは、２以上のＣｐＧ領域を含み、少なくとも１つのＣｐＧ領域中のシトシン以外のシトシンをウラシル又はチミンに変換した配列を持ったオリゴヌクレオチドを選択するものである。
詳しくは、このプライマーは、当該１つのＣｐＧ領域中のシトシンは重亜硫酸修飾後もシトシンのままで存在して、当該１つのＣｐＧ領域中のシトシン以外のシトシンは、重亜硫酸修飾後にウラシルに変換されても（遺伝子増幅により増幅されたオリゴヌクレオチドにおいては、このウラシルの部位にはチミンが置かれる。）、変換されずにシトシンのままで存在しても、その配列をもったオリゴヌクレオチドを選択するものである。
本実施形態においては、ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化特異的プライマーとしては、配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表されるオリゴヌクレオチドとがある。前者のプライマーは、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列８７６から９０１に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。後者のプライマーは、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列１０７０から１０９２の部位を認識して、その遺伝子に結合する。
詳しくは、このプライマーは、当該１つのＣｐＧ領域中のシトシンは重亜硫酸修飾後もシトシンのままで存在して、当該１つのＣｐＧ領域中のシトシン以外のシトシンは、重亜硫酸修飾後にウラシルに変換されても（遺伝子増幅により増幅されたオリゴヌクレオチドにおいては、このウラシルの部位にはチミンが置かれる。）、変換されずにシトシンのままで存在しても、その配列をもったオリゴヌクレオチドを選択するものである。
本実施形態においては、ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化特異的プライマーとしては、配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表されるオリゴヌクレオチドとがある。前者のプライマーは、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列８７６から９０１に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。後者のプライマーは、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列１０７０から１０９２の部位を認識して、その遺伝子に結合する。
２以上のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化非特異的プライマーは、前記ＣｐＧ領域以外の領域に結合するように設計されることが好ましい。もし、ＣｐＧ領域を含む領域に結合するようにせざるを得ない場合には、前記ＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無によらず、前記ＣｐＧ領域を含む領域に結合するように設計されるものである。
詳しくは、このメチル化非特異的プライマーは、前記ＣｐＧ領域以外の領域に結合するように設計されることが好ましい。もし、前記ＣｐＧ領域を含む領域に結合するようにせざるを得ない場合には、当該ＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無に影響を受けないように、すなわち、ＣｐＧ領域中のシトシンがウラシルに変換された場合、また、シトシンのまま変換されない場合の双方の配列を増幅するように設計されることが好ましい。具体的には、前記ＣｐＧ領域中のシトシンの部位に対応するメチル化非特異的プライマーの部位に混合塩基、またはイノシン３リン酸（ＩＴＰ）由来のイノシン（ヒポキサンチン）を配置した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがこの種のメチル化非特異的プライマーである。
本実施形態においては、２以上のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化非特異的プライマーとしては、配列番号２又は５で表されるオリゴヌクレオチドがある。配列番号２で表されるプライマーは、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列８０２から８２５に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。また、配列番号５で表されるプライマーは、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列１１８２から１２０６に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。
詳しくは、このメチル化非特異的プライマーは、前記ＣｐＧ領域以外の領域に結合するように設計されることが好ましい。もし、前記ＣｐＧ領域を含む領域に結合するようにせざるを得ない場合には、当該ＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無に影響を受けないように、すなわち、ＣｐＧ領域中のシトシンがウラシルに変換された場合、また、シトシンのまま変換されない場合の双方の配列を増幅するように設計されることが好ましい。具体的には、前記ＣｐＧ領域中のシトシンの部位に対応するメチル化非特異的プライマーの部位に混合塩基、またはイノシン３リン酸（ＩＴＰ）由来のイノシン（ヒポキサンチン）を配置した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがこの種のメチル化非特異的プライマーである。
本実施形態においては、２以上のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化非特異的プライマーとしては、配列番号２又は５で表されるオリゴヌクレオチドがある。配列番号２で表されるプライマーは、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列８０２から８２５に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。また、配列番号５で表されるプライマーは、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列１１８２から１２０６に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。
上記配列番号３で表されるメチル化特異的プライマーと、配列番号４で表されるメチル化特異的プライマーと、配列番号２で表されるメチル化非特異的プライマーと、配列番号５で表されるメチル化非特異的プライマーとの合計４種のプライマーセットを用いれば、２以上のＣｐＧ領域の各々の領域のシトシンのメチル化を検出でき、２以上のＣｐＧ領域の各々の領域のシトシンのメチル化の有無を識別できる。
即ち、図１の模式図に示されるように、メチル化シトシン特異的プライマーである配列番号３で表されるＰ１−ＡＳ（メチル化シトシン特異的上流プライマー）と、メチル化シトシン特異的プライマーである配列番号４で表されるＰ２−Ｓ（メチル化シトシン特異的下流プライマー）と、メチル化シトシン非特異的プライマーである配列番号２で表されるＮＳ−Ｓ（メチル化シトシン非特異的上流プライマー）と、メチル化シトシン非特異的プライマーである配列番号５で表されるＮＳ−ＡＳ（メチル化シトシン非特異的下流プライマー）の４種のプライマーを用いて、核酸増幅法にて核酸を増幅する。メチル化の相違による増幅産物の相違は以下のようになる（図２）。
（１）上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されており、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されていない試料においては、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳと、Ｐ１−ＡＳの３種のプライマーが遺伝子に結合する。そして、ＮＳ−ＳとＰ１−ＡＳとから核酸増幅して形成される９６塩基のメチル化断片と、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される４０４塩基の非メチル化断片の２つのＤＮＡ断片が形成される（図２のＰ１で表されるレーン）。
（２）上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されておらず、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されている試料においては、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳと、Ｐ２−Ｓの３種のプライマーが遺伝子に結合する。そして、Ｐ２−ＳとＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される１３６塩基のメチル化断片と、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される４０４塩基の非メチル化断片の２つのＤＮＡ断片が形成される（図２のＰ２で表されるレーン）。
（３）上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されており、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンもメチル化されている試料においては、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳと、Ｐ１−ＡＳと、Ｐ２−Ｓの４種のプライマーが遺伝子に結合する。そして、ＮＳ−ＳとＰ１−ＡＳとから核酸増幅して形成される９６塩基のメチル化断片と、Ｐ２−ＳとＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される１３６塩基のメチル化断片と、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される４０４塩基の非メチル化断片の３つのＤＮＡ断片が形成される（図２のＦで表されるレーン）。
（４）上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されておらず、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンもメチル化されていない試料においては、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳの２種のプライマーが遺伝子に結合する。そして、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される４０４塩基の非メチル化断片のみが形成される（図２のＵで表されるレーン）。
このように、検出される増幅産物の違いに基づいて、前記２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別することができる。
（１）上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されており、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されていない試料においては、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳと、Ｐ１−ＡＳの３種のプライマーが遺伝子に結合する。そして、ＮＳ−ＳとＰ１−ＡＳとから核酸増幅して形成される９６塩基のメチル化断片と、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される４０４塩基の非メチル化断片の２つのＤＮＡ断片が形成される（図２のＰ１で表されるレーン）。
（２）上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されておらず、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されている試料においては、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳと、Ｐ２−Ｓの３種のプライマーが遺伝子に結合する。そして、Ｐ２−ＳとＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される１３６塩基のメチル化断片と、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される４０４塩基の非メチル化断片の２つのＤＮＡ断片が形成される（図２のＰ２で表されるレーン）。
（３）上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されており、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンもメチル化されている試料においては、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳと、Ｐ１−ＡＳと、Ｐ２−Ｓの４種のプライマーが遺伝子に結合する。そして、ＮＳ−ＳとＰ１−ＡＳとから核酸増幅して形成される９６塩基のメチル化断片と、Ｐ２−ＳとＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される１３６塩基のメチル化断片と、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される４０４塩基の非メチル化断片の３つのＤＮＡ断片が形成される（図２のＦで表されるレーン）。
（４）上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されておらず、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンもメチル化されていない試料においては、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳの２種のプライマーが遺伝子に結合する。そして、ＮＳ−Ｓと、ＮＳ−ＡＳとから核酸増幅して形成される４０４塩基の非メチル化断片のみが形成される（図２のＵで表されるレーン）。
このように、検出される増幅産物の違いに基づいて、前記２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別することができる。
オリゴヌクレオチドは、公知の方法により設計することができ、例えば、リン酸トリエステル法や、リン酸アミダイト法、リン酸基部位無保護法といった固相化学的合成法を用いることができる。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（Applied Biosystem社製、Expedite Model 8909）等を用いて合成することができる。また、１ないし複数個の塩基を置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドも公知の固相化学的合成法で合成することができる。
（プライマーセット）
本発明で、ＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域におけるシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられる核酸増幅用プライマーセットにおいては、１）２以上のメチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーのそれぞれの融解温度の差を１〜３度以内とし、かつ、２以上のメチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーのそれぞれの融解温度の差を１〜３度以内とする、及び／又は、２）核酸増幅用プライマー同士のＧＣ含有率（グアニンとシトシンのプライマー中の含有率）の差が２０％以内であるものを用いることも可能である。
本発明で、ＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域におけるシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられる核酸増幅用プライマーセットにおいては、１）２以上のメチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーのそれぞれの融解温度の差を１〜３度以内とし、かつ、２以上のメチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーのそれぞれの融解温度の差を１〜３度以内とする、及び／又は、２）核酸増幅用プライマー同士のＧＣ含有率（グアニンとシトシンのプライマー中の含有率）の差が２０％以内であるものを用いることも可能である。
ここに、プライマーの融解温度とは、プライマーがオリゴヌクレオチドに結合する至適温度のことをいう。２以上のメチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーのそれぞれの融解温度の差を１〜３度以内とし、かつ、２以上のメチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーのそれぞれの融解温度の差を１〜３度以内とすることにより、あるＣｐＧ領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にシトシンでないにもかかわらず、メチル化シトシン特異的プライマーが鋳型のオリゴヌクレオチドと結合して、擬陽性の結果を生ずることを防止することができる。
また、このようにプライマーを設計すればメチル化の有無を考慮しない、ＰＣＲにおけるコントロール産物（すなわち、２種類のメチル化シトシン非特異的プライマーにより合成される産物）を検出しやすくなる。
また、このようにプライマーを設計すればメチル化の有無を考慮しない、ＰＣＲにおけるコントロール産物（すなわち、２種類のメチル化シトシン非特異的プライマーにより合成される産物）を検出しやすくなる。
また、プライマーのＧＣ含有率とは、プライマーの全塩基配列中グアニンとシトシンを合わせた塩基数の割合のことをいう。例えば、１００塩基からなる２つのプライマーがあり、１つ目のプライマーのＧＣの数が４５で、もう１つのプライマーのＧＣの数が５０であればＧＣ含有率の差は５％であるとされる。このとき、プライマーのＧＣ含有率は、メチル化シトシン特異的プライマーの方においてより低くするとよい。このように、プライマーを設計すれば、擬陽性の結果を生ずることを防止することができ、かつ再現性のよい結果を得やすくなるので好ましい。
本発明の検出方法においては、修飾剤を用いてメチル化されていないシトシンを一旦ウラシルに変換し、核酸増幅用プライマーセットにより、遺伝子産物を検出する。前述のように、１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化される毎に、それに対応する断片（以下、適宜「メチル化シトシン特異的断片」という。）が検出される。また、メチル化の有無によらず、それに対応する断片（以下、適宜「メチル化シトシン非特異的断片」という。）が検出される。
例として、試料中の１００ＤＮＡのうちの２０ＤＮＡにおいて、ある１のＣｐＧ領域においてシトシンがメチル化されており、修飾剤により、メチル化されていない８０ＤＮＡのうち７５ＤＮＡがウラシルに変換されたとしても、本発明の検出方法によれば、メチル化シトシン非特異的断片と、メチル化シトシン特異的断片との、強度の比は、ほぼ７５対２５となるであろうことから、このＣｐＧ領域におけるシトシンのメチル化のおおよその程度を判定することができる。
即ち、本発明においては、２つの前記メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーのみにより増幅された核酸増幅産物の量と、当該メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーと１つの前記メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーにより増幅された核酸増幅産物の量とを比較することにより、ＭＧＭＴをコードする遺伝子における２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の程度を判定することができる。
例として、試料中の１００ＤＮＡのうちの２０ＤＮＡにおいて、ある１のＣｐＧ領域においてシトシンがメチル化されており、修飾剤により、メチル化されていない８０ＤＮＡのうち７５ＤＮＡがウラシルに変換されたとしても、本発明の検出方法によれば、メチル化シトシン非特異的断片と、メチル化シトシン特異的断片との、強度の比は、ほぼ７５対２５となるであろうことから、このＣｐＧ領域におけるシトシンのメチル化のおおよその程度を判定することができる。
即ち、本発明においては、２つの前記メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーのみにより増幅された核酸増幅産物の量と、当該メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーと１つの前記メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーにより増幅された核酸増幅産物の量とを比較することにより、ＭＧＭＴをコードする遺伝子における２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の程度を判定することができる。
しかし、前述の場合、ある１のＣｐＧ領域におけるメチル化の割合が大きいと、メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーが、より多くのメチル化シトシン特異的断片の生成に寄与し、メチル化シトシン非特異的断片の生成量が低下し、メチル化の程度を正確に判定することができなくなる恐れがある。
このような不都合を回避するために、当該メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーの濃度を、前記メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーの濃度より高くすることにより、メチル化シトシン非特異的断片の生成量を維持することができ、メチル化の程度を正確に判定することができるようになる。
具体的には、各々のメチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーを同濃度となるように添加し、各々のメチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーをそのメチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーの１．５から２．５倍、好ましくは２倍の濃度となるように添加することにより、メチル化シトシン特異的断片と、メチル化シトシン非特異的断片とを、安定的に生成させることができる。
このような不都合を回避するために、当該メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーの濃度を、前記メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーの濃度より高くすることにより、メチル化シトシン非特異的断片の生成量を維持することができ、メチル化の程度を正確に判定することができるようになる。
具体的には、各々のメチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーを同濃度となるように添加し、各々のメチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーをそのメチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーの１．５から２．５倍、好ましくは２倍の濃度となるように添加することにより、メチル化シトシン特異的断片と、メチル化シトシン非特異的断片とを、安定的に生成させることができる。
（検査方法）
本発明における検査方法は、試料の準備、ＭＧＭＴ遺伝子の抽出、ＭＧＭＴ遺伝子の修飾、プライマーを用いた遺伝子増幅、ＭＧＭＴ遺伝子の検出の過程からなる。
本発明における検査方法は、試料の準備、ＭＧＭＴ遺伝子の抽出、ＭＧＭＴ遺伝子の修飾、プライマーを用いた遺伝子増幅、ＭＧＭＴ遺伝子の検出の過程からなる。
（検査用試料・病理検体の準備）
本発明の検査方法に供される、ヒトの試料はＭＧＭＴ遺伝子を含むものであればよく、特に限定されない。具体的には、生体から採取した組織の他、血液、血清、糞便、***、唾液、脳脊髄液等が挙げられる。生体から採取した組織としては、例えば、手術により切除した大腸癌の組織や、手術前の内視鏡検査等に用いる生体検査材料等が、試料の有効利用の点で好適に用いられる。
本発明の検査方法に供される、ヒトの試料はＭＧＭＴ遺伝子を含むものであればよく、特に限定されない。具体的には、生体から採取した組織の他、血液、血清、糞便、***、唾液、脳脊髄液等が挙げられる。生体から採取した組織としては、例えば、手術により切除した大腸癌の組織や、手術前の内視鏡検査等に用いる生体検査材料等が、試料の有効利用の点で好適に用いられる。
（ＭＧＭＴ遺伝子の抽出）
本発明の検査方法に供される、ヒトの試料は、ブレンダーを用いて組織を破砕し、次いで、フェノール・クロロフォルム法等の公知の遺伝子抽出法により、ＭＧＭＴ遺伝子を抽出し、検査用試料として用いる。
本発明の検査方法に供される、ヒトの試料は、ブレンダーを用いて組織を破砕し、次いで、フェノール・クロロフォルム法等の公知の遺伝子抽出法により、ＭＧＭＴ遺伝子を抽出し、検査用試料として用いる。
（ＭＧＭＴ遺伝子の修飾）
前記ＭＧＭＴ遺伝子は重亜硫酸塩によって修飾される。これにより、メチル化されたシトシンは、シトシンのまま存在するが、メチル化されていないシトシンは、一旦ウラシルに転換された後、チミンとして発現することになる。本発明に使用される重亜硫酸塩は特に限定されないが、重亜硫酸ナトリウムが好適に用いられる。
前記ＭＧＭＴ遺伝子は重亜硫酸塩によって修飾される。これにより、メチル化されたシトシンは、シトシンのまま存在するが、メチル化されていないシトシンは、一旦ウラシルに転換された後、チミンとして発現することになる。本発明に使用される重亜硫酸塩は特に限定されないが、重亜硫酸ナトリウムが好適に用いられる。
（具体的な修飾方法等）
まず、２００ｐｇから５０μｇのＤＮＡをアルカリ条件下にて変性させる。変性の条件は、ＰＣＲの測定系に適した条件であればよいが、例えば、０．２Ｍ〜０．３ＭのＮａＯＨ溶液中にて、３７℃で５〜３０分インキュベーションさせる。次いで、ハイドロキノン溶液及びｐＨ５．０の重亜硫酸ナトリウム溶液を終濃度がそれぞれ０．５ｍＭ及び３．１ｍＭになるように添加し、５０〜５５℃にて１６〜４０時間インキュベートすることで、非メチル化シトシンが修飾される。さらに、段階的な透析を行うことで余剰の重亜硫酸を除去する。透析された試料は、真空オーブンによる濃縮又はエタノール沈殿の後、適当な緩衝液又は純水に溶解し、通常のＰＣＲ又はメチル化特異的ＰＣＲに用いることができる。
まず、２００ｐｇから５０μｇのＤＮＡをアルカリ条件下にて変性させる。変性の条件は、ＰＣＲの測定系に適した条件であればよいが、例えば、０．２Ｍ〜０．３ＭのＮａＯＨ溶液中にて、３７℃で５〜３０分インキュベーションさせる。次いで、ハイドロキノン溶液及びｐＨ５．０の重亜硫酸ナトリウム溶液を終濃度がそれぞれ０．５ｍＭ及び３．１ｍＭになるように添加し、５０〜５５℃にて１６〜４０時間インキュベートすることで、非メチル化シトシンが修飾される。さらに、段階的な透析を行うことで余剰の重亜硫酸を除去する。透析された試料は、真空オーブンによる濃縮又はエタノール沈殿の後、適当な緩衝液又は純水に溶解し、通常のＰＣＲ又はメチル化特異的ＰＣＲに用いることができる。
（遺伝子・核酸増幅）
本発明において、遺伝子増幅方法としては、公知の方法を使用することができ、例えば、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられる。好ましくは、ＰＣＲ法が用いられる。
ＰＣＲ法により増幅された産物の塩基配列を決定する方法としては、Frommer et. al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1827-1831(1992))及び、Clark et. al. (Nucleic Acids Research 22, 2990-2997 (1994))等の方法がある。
本発明において、遺伝子増幅方法としては、公知の方法を使用することができ、例えば、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられる。好ましくは、ＰＣＲ法が用いられる。
ＰＣＲ法により増幅された産物の塩基配列を決定する方法としては、Frommer et. al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1827-1831(1992))及び、Clark et. al. (Nucleic Acids Research 22, 2990-2997 (1994))等の方法がある。
（ＭＧＭＴ遺伝子の検出）
メチル化特異的ＰＣＲによって増幅されたＭＧＭＴ遺伝子の検出は、一般的なアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、ＭＧＭＴ遺伝子の染色によって検出される。染色方法としては、銀染色による方法、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲＲ Ｇｒｅｅｎ等の蛍光性染色剤等による方法がある。また、電気泳動以外の方法として、５’エキソヌクレアーゼアッセイや蛍光共鳴エネルギー転移を利用したホモジニアス検出も可能である。
メチル化特異的ＰＣＲによって増幅されたＭＧＭＴ遺伝子の検出は、一般的なアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、ＭＧＭＴ遺伝子の染色によって検出される。染色方法としては、銀染色による方法、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲＲ Ｇｒｅｅｎ等の蛍光性染色剤等による方法がある。また、電気泳動以外の方法として、５’エキソヌクレアーゼアッセイや蛍光共鳴エネルギー転移を利用したホモジニアス検出も可能である。
（ＭＧＭＴの免疫染色）
本発明の検査方法は、前記ＭＳＩ分析に加えて、ＭＧＭＴの免疫染色分析（ＩＨＣ）を併用することにより、メチル化の有無をさらに精度よく識別することできる。ＭＧＭＴの免疫染色分析においては、ＣｐＧ領域がメチル化されていれば、ＭＧＭＴが発現されにくくなり、免疫染色において陰性となる率が高くなる。一方、ＣｐＧ領域がメチル化されていなければ、ＭＧＭＴは発現されやすくなるので、免疫染色において陽性となる率が高くなる。ＭＧＭＴの免疫染色分析においては、抗体としてＭＧＭＴのモノクローナル抗体を用い、色素としてダイアミノベンチジン（diaminobenzidine）を用いるのが好適である。
本発明の検査方法は、前記ＭＳＩ分析に加えて、ＭＧＭＴの免疫染色分析（ＩＨＣ）を併用することにより、メチル化の有無をさらに精度よく識別することできる。ＭＧＭＴの免疫染色分析においては、ＣｐＧ領域がメチル化されていれば、ＭＧＭＴが発現されにくくなり、免疫染色において陰性となる率が高くなる。一方、ＣｐＧ領域がメチル化されていなければ、ＭＧＭＴは発現されやすくなるので、免疫染色において陽性となる率が高くなる。ＭＧＭＴの免疫染色分析においては、抗体としてＭＧＭＴのモノクローナル抗体を用い、色素としてダイアミノベンチジン（diaminobenzidine）を用いるのが好適である。
（検査用試薬及び検査用試薬キット）
本発明はまた、組織中のＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域におけるＣｐＧのシトシンのメチル化を検出する方法に用いられる検査試薬キットを含む。検査試薬としては、メチル化特異的核酸増幅用のプライマー、エキソヌクレアーゼ、核酸検出用の標識等、本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のいずれであってもよい。
本発明はまた、組織中のＭＧＭＴ遺伝子のＣｐＧ領域におけるＣｐＧのシトシンのメチル化を検出する方法に用いられる検査試薬キットを含む。検査試薬としては、メチル化特異的核酸増幅用のプライマー、エキソヌクレアーゼ、核酸検出用の標識等、本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のいずれであってもよい。
また、検査用試薬キットは、本発明の検出方法に使用されるあらゆる試薬のうち少なくとも２以上をキットとして使用するものであればよい。例えば、ＭＧＭＴ遺伝子（ＤＮＡ）のＣｐＧ領域のメチル化特異的プライマーとメチル化非特異的プライマーセット等が例示される。その他、蛍光標識をプローブしたＤＮＡも本キットに含めてもよい。
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
具体的な実施例として、大腸癌と診断された２２３症例の癌患者について、ＭＧＭＴ遺伝子のプロモーター領域のシトシンのメチル化の状態を調べた。これら被検体生体試料は手術切除後直ちに−８０℃にて凍結保存した。
具体的な実施例として、大腸癌と診断された２２３症例の癌患者について、ＭＧＭＴ遺伝子のプロモーター領域のシトシンのメチル化の状態を調べた。これら被検体生体試料は手術切除後直ちに−８０℃にて凍結保存した。
生体試料からＭＧＭＴ遺伝子は、通常のフェノール・クロロフォルム法で抽出した。
生体試料より抽出したＭＧＭＴ遺伝子１μｇをＤＮＡ修飾キット「ＣｐＧｅｎｏｍｅ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社）」を用いて重亜硫酸ナトリウムによる非メチル化シトシンの修飾を行った。
ＭＧＭＴのプロモーター領域の２つのＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出するために、以下の４つの核酸増幅用プライマーを用いて、核酸増幅法にて核酸を増幅した。
ＮＳ−Ｓ：ＧＡＧＧＡＴＧＩＧＴＡＧＡＴＴＧＴＴＴＴＡＧＧＴ（配列番号２）
Ｐ１−ＡＳ：ＡＡＣＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＡＣＧＡＡＡＣＧ（配列番号３）
Ｐ２−Ｓ：ＴＴＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＴＴＴＣＧＣ（配列番号４）
ＮＳ−ＡＳ：ＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＩＣＣＴＡＣＡＡＡＡＣＣＡＣＴ（配列番号５）
ここに、配列番号２で表されるＮＳ−Ｓは、メチル化シトシン非特異的プライマーであり、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列８０２から８２５に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。
配列番号３で表されるＰ１−ＡＳは、メチル化シトシン特異的プライマーであり、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列８７６から９０１に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。
配列番号４で表されるＰ２−Ｓは、メチル化シトシン特異的プライマーであり、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列１０７０から１０９２に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。
配列番号５で表されるＮＳ−ＡＳは、メチル化シトシン非特異的プライマーであり、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列１１８２から１２０６に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。
上記、塩基の番号は、ＨＳＭＥＴＤＭＥＴ及びＨＳＵ９５０３８から引用された塩基番号に従った。
また、ＮＳ−Ｓにおいては、イノシン酸の代わりにシトシンとチミンの混合塩基を用いてもよく、ＮＳ−ＡＳにおいては、イノシン酸の代わりにグアニンとアデニンの混合塩基を用いてもよい。
ＮＳ−Ｓ：ＧＡＧＧＡＴＧＩＧＴＡＧＡＴＴＧＴＴＴＴＡＧＧＴ（配列番号２）
Ｐ１−ＡＳ：ＡＡＣＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＡＣＧＡＡＡＣＧ（配列番号３）
Ｐ２−Ｓ：ＴＴＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＴＴＴＣＧＣ（配列番号４）
ＮＳ−ＡＳ：ＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＩＣＣＴＡＣＡＡＡＡＣＣＡＣＴ（配列番号５）
ここに、配列番号２で表されるＮＳ−Ｓは、メチル化シトシン非特異的プライマーであり、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列８０２から８２５に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。
配列番号３で表されるＰ１−ＡＳは、メチル化シトシン特異的プライマーであり、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列８７６から９０１に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。
配列番号４で表されるＰ２−Ｓは、メチル化シトシン特異的プライマーであり、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列１０７０から１０９２に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。
配列番号５で表されるＮＳ−ＡＳは、メチル化シトシン非特異的プライマーであり、ＭＧＭＴ遺伝子の塩基配列１１８２から１２０６に相当する部位を認識して、その遺伝子に結合する。
上記、塩基の番号は、ＨＳＭＥＴＤＭＥＴ及びＨＳＵ９５０３８から引用された塩基番号に従った。
また、ＮＳ−Ｓにおいては、イノシン酸の代わりにシトシンとチミンの混合塩基を用いてもよく、ＮＳ−ＡＳにおいては、イノシン酸の代わりにグアニンとアデニンの混合塩基を用いてもよい。
重亜硫酸修飾済みのＭＧＭＴ遺伝子の一部を１倍のＰＣＲ緩衝液（１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）、１．２５ＵのＤＮＡポリメラーゼ「Ａｍｐｌｉ−ＴａｑＧｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎｎ−Ｅｌｍｅｒ社）」、各々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、０．４ｍＭのＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳ、０．２ｍＭのＰ１−ＡＳ、Ｐ２−Ｓを含む５０μｌのＰＣＲ反応液に加え、９５℃／０．５分、５８℃／０．５分、７２℃／０．５分、３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。
（ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の判断）
生体試料から抽出されたＭＧＭＴ遺伝子を用いた場合はＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無によらず、メチル化シトシン非特異的プライマーであるＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物が生成される。
（メチル化されたシトシンを含まない場合）
上述のプロモーター領域の２つのＣｐＧ領域のいずれにも、シトシンのメチル化がなければ、ＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物が生成される。
（５’−側の領域のＣｐＧ領域のみにメチル化されたシトシンを含む場合）
上述のプロモーター領域の２つのＣｐＧ領域の５’−側の領域のＣｐＧ領域のみに、シトシンのメチル化があれば、ＮＳ−Ｓ、Ｐ１−ＡＳよって、９６ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、ＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、合計２種の伝子増幅産物が生成される。
（３’−側の領域のＣｐＧ領域のみにメチル化されたシトシンを含む場合）
上述のプロモーター領域の２つのＣｐＧ領域の３’−側の領域のＣｐＧ領域のみに、シトシンのメチル化があれば、Ｐ２−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、１３６ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、ＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、合計２種の伝子増幅産物が生成される。
（２つのＣｐＧ領域のいずれにもメチル化されたシトシンを含む場合）
上述のプロモーター領域の２つのＣｐＧ領域の５’−側の領域のＣｐＧ領域にも、３’−側の領域のＣｐＧ領域にもシトシンのメチル化があれば、ＮＳ−Ｓ、Ｐ１−ＡＳよって、９６ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、Ｐ２−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、１３６ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、ＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、合計３種の遺伝子増幅産物が生成される。
生体試料から抽出されたＭＧＭＴ遺伝子を用いた場合はＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無によらず、メチル化シトシン非特異的プライマーであるＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物が生成される。
（メチル化されたシトシンを含まない場合）
上述のプロモーター領域の２つのＣｐＧ領域のいずれにも、シトシンのメチル化がなければ、ＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物が生成される。
（５’−側の領域のＣｐＧ領域のみにメチル化されたシトシンを含む場合）
上述のプロモーター領域の２つのＣｐＧ領域の５’−側の領域のＣｐＧ領域のみに、シトシンのメチル化があれば、ＮＳ−Ｓ、Ｐ１−ＡＳよって、９６ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、ＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、合計２種の伝子増幅産物が生成される。
（３’−側の領域のＣｐＧ領域のみにメチル化されたシトシンを含む場合）
上述のプロモーター領域の２つのＣｐＧ領域の３’−側の領域のＣｐＧ領域のみに、シトシンのメチル化があれば、Ｐ２−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、１３６ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、ＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、合計２種の伝子増幅産物が生成される。
（２つのＣｐＧ領域のいずれにもメチル化されたシトシンを含む場合）
上述のプロモーター領域の２つのＣｐＧ領域の５’−側の領域のＣｐＧ領域にも、３’−側の領域のＣｐＧ領域にもシトシンのメチル化があれば、ＮＳ−Ｓ、Ｐ１−ＡＳよって、９６ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、Ｐ２−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、１３６ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、ＮＳ−Ｓ、ＮＳ−ＡＳによって、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物が生成され、合計３種の遺伝子増幅産物が生成される。
実際に生体試料を用いて、メチル化を検出した例を図３に示す。
これによると、Ｕで表されるレーンにおいては、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物のみが検出され、Ｐ１で表されるレーンにおいては、９６ｂｐと４０４ｂｐの遺伝子増幅産物の２種が検出され、Ｐ２で表されるレーンにおいては、１３６ｂｐと４０４ｂｐの遺伝子増幅産物の２種が検出され、Ｆで表されるレーンにおいては、９６ｂｐと、１３６ｂｐと４０４ｂｐの遺伝子増幅産物の３種が検出された。このように、本実施例においては、プロモーター領域の２つのＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を１度の操作で検出することができた。また、４０４ｂｐに対する、９６ｂｐ又は１３６ｂｐの断片の強度を比較することにより、試料のメチル化の度合いを判断することができた。
これによると、Ｕで表されるレーンにおいては、４０４ｂｐの遺伝子増幅産物のみが検出され、Ｐ１で表されるレーンにおいては、９６ｂｐと４０４ｂｐの遺伝子増幅産物の２種が検出され、Ｐ２で表されるレーンにおいては、１３６ｂｐと４０４ｂｐの遺伝子増幅産物の２種が検出され、Ｆで表されるレーンにおいては、９６ｂｐと、１３６ｂｐと４０４ｂｐの遺伝子増幅産物の３種が検出された。このように、本実施例においては、プロモーター領域の２つのＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を１度の操作で検出することができた。また、４０４ｂｐに対する、９６ｂｐ又は１３６ｂｐの断片の強度を比較することにより、試料のメチル化の度合いを判断することができた。
（メチル化と免疫染色分析）
上記の方法による、ＭＧＭＴ遺伝子のメチル化の検出方法により、メチル化の有無を判定した試料（メチル化有り：３２症例、メチル化なし：６１症例）に対し、免疫染色分析を行った。結果を表１に示す。
上記の方法による、ＭＧＭＴ遺伝子のメチル化の検出方法により、メチル化の有無を判定した試料（メチル化有り：３２症例、メチル化なし：６１症例）に対し、免疫染色分析を行った。結果を表１に示す。
表２により、メチル化されたＭＧＭＴ遺伝子においては、ＭＧＭＴの発現の割合が低いのに対し、メチル化されないＭＧＭＴ遺伝子においては、ＭＧＭＴの発現の割合が高いことが分かる。
免疫染色の例を図６に示す。Ａは腫瘍組織のもので、完全に陰性であった。Ｂは腫瘍組織のもので左側が陽性、右側が陰性であった。Ｃは腫瘍組織であり、陽性部分と陰性部分が混在していた。Ｄは非腫瘍細胞のもので、陰性であった。
（塩基配列との関係）
大腸癌患者３５症例の、腫瘍組織と正常粘膜のＭＧＭＴのプロモーター領域（７１３番から１１６８番）の６６のＣｐＧ領域のメチル化を、直接塩基配列決定法（ダイレクト・シークエンス法）により調べた。
大腸癌患者３５症例の、腫瘍組織と正常粘膜のＭＧＭＴのプロモーター領域（７１３番から１１６８番）の６６のＣｐＧ領域のメチル化を、直接塩基配列決定法（ダイレクト・シークエンス法）により調べた。
腫瘍組織のＭＧＭＴのプロモーター領域（７１３番から１１６８番）の６６のＣｐＧ領域のメチル化をメチル化シトシン特異的プライマーを用いて検出したものを図５上欄に示し、正常粘膜のＭＧＭＴのプロモーター領域（７１３番から１１６８番）の６６のＣｐＧ領域のメチル化を上記と同様のプライマーを用いて検出したもの図５下欄に示す。
これによると、腫瘍組織ではＣ領域を除く全域でメチル化されているのに対し、正常粘膜においても、比較的低い割合であるが、Ｃ領域を除く全域でメチル化されていることが分かった。また、一部にはＣ領域の前後のどちらかのＣｐＧ領域にしかメチル化の認められない検体も認められた。
即ち、このことは、腫瘍組織であれ、正常粘膜であれ、Ｃ領域をは挟む２つのＣｐＧ領域のどちらかにメチル化があれば、当該プロモーター領域（７１３番から１１６８番）のＣ領域を除く全域でメチル化されている可能性が高いことを示している。よって、この意味において、本発明に係るＭＧＭＴ遺伝子の２つ以上のＣｐＧ領域における、各々のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の１回検出は、癌の診断方法において、重要な意義を有すると考えられる。
非メチル化シトシン特異的プライマーを用いた場合、メチル化シトシン特異的プライマーにてメチル化を認めた検体においても、メチル化はほとんど検出できなかった。これは、腫瘍が不均一であることを示している。
これによると、腫瘍組織ではＣ領域を除く全域でメチル化されているのに対し、正常粘膜においても、比較的低い割合であるが、Ｃ領域を除く全域でメチル化されていることが分かった。また、一部にはＣ領域の前後のどちらかのＣｐＧ領域にしかメチル化の認められない検体も認められた。
即ち、このことは、腫瘍組織であれ、正常粘膜であれ、Ｃ領域をは挟む２つのＣｐＧ領域のどちらかにメチル化があれば、当該プロモーター領域（７１３番から１１６８番）のＣ領域を除く全域でメチル化されている可能性が高いことを示している。よって、この意味において、本発明に係るＭＧＭＴ遺伝子の２つ以上のＣｐＧ領域における、各々のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の１回検出は、癌の診断方法において、重要な意義を有すると考えられる。
非メチル化シトシン特異的プライマーを用いた場合、メチル化シトシン特異的プライマーにてメチル化を認めた検体においても、メチル化はほとんど検出できなかった。これは、腫瘍が不均一であることを示している。
直接塩基配列決定法（ダイレクト・シークエンス法）による例を図４（ａ）及（ｂ）に示す。メチル化シトシン特異的プライマーを用いて検出したものはＭレーンに、非メチル化シトシン特異的プライマーを用いて検出したものはＵレーンに示されている。
これによると、１１１Ｔ、１７５Ｔの腫瘍組織では、メチル化シトシン特異的プライマーを用いて検出した場合、メチル化は完全に起きている部分もあれば、メチル化が不完全に起こっている部分もあることが示されている。非メチル化シトシン特異的プライマーを用いて検出した場合、メチル化は検出さていない。また、Ｓ１０Ｔではメチル化シトシン特異的プライマー、非メチル化シトシン特異的プライマーを用いてもメチル化はまったく認められていない。Ｓ１０ＴのＭレーンの矢印はメチル化シトシン特異的プライマーのメチル化特異的シトシンを示している。
これによると、１１１Ｔ、１７５Ｔの腫瘍組織では、メチル化シトシン特異的プライマーを用いて検出した場合、メチル化は完全に起きている部分もあれば、メチル化が不完全に起こっている部分もあることが示されている。非メチル化シトシン特異的プライマーを用いて検出した場合、メチル化は検出さていない。また、Ｓ１０Ｔではメチル化シトシン特異的プライマー、非メチル化シトシン特異的プライマーを用いてもメチル化はまったく認められていない。Ｓ１０ＴのＭレーンの矢印はメチル化シトシン特異的プライマーのメチル化特異的シトシンを示している。
（他の遺伝子のメチル化の関係）
大腸癌２２３症例につき、ＭＩＮＴ２、ＭＩＮＴ３、ｐ１６遺伝子のメチル化との相関を調べた。結果を表２に示す。
大腸癌２２３症例につき、ＭＩＮＴ２、ＭＩＮＴ３、ｐ１６遺伝子のメチル化との相関を調べた。結果を表２に示す。
これによると、ＭＧＭＴ遺伝子のメチル化とＭＩＮＴ２、ＭＩＮＴ３１、ｐ１６遺伝子のメチル化は統計的には乖離していることがわかる。一方、ＭＩＮＴ２、ＭＩＮＴ３１、ｐ１６遺伝子の各遺伝子のメチル化との間には相関関係があることが分かる。
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２、コドン１３の突然変異との相関を調べた。結果を表３に示す。
これによると、ＭＩＮＴ２、ＭＩＮＴ３、ｐ１６遺伝子のメチル化との間の相関関係以上に、ＭＧＭＴ遺伝子のメチル化と、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２、コドン１３の突然変異の間には相関があることが分かる。
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２、コドン１３の突然変異の検出例を図７（Ａ及びＢ）に示す。変異があるものをＭｔ、変異がないものをＷｔ、腫瘍組織由来のものをＴ、正常組織由来のものをＮとした。Ｍｔでは２つの断片が検出され、突然変異が起こっているのに対し、Ｗｔでは１つの断片が検出され、突然変異が起こっていないことが分かった。
ＭＩＮＴ２、ＭＩＮＴ３１、ｐ１６遺伝子のメチル化（１箇所のＣｐＧ領域）の検出例を図７（Ｃ）に示す。腫瘍組織由来のものをＴ、正常組織由来のものをＮとした。その結果、２つの断片が検出されたものは、メチル化されているとしてＭで示し、１つの断片が検出されたものは、メチル化されていないとしてＵで示している。このように、メチル化が検出されたものは、ほとんどが腫瘍組織由来のものであることが分かった。
腫瘍の段階とＭＧＭＴ遺伝子のメチル化の頻度との関係を、図８に示す。Ａでは、ＴＮＭ段階１から４（図８中ではギリシャ数字で表示し、数字が大きいほど腫瘍が進行している。）、Ｂでは、進行度Ｔ１からＴ４（数字が大きいほど腫瘍が進行している。）におけるメチル化の度合いを表しており、白はメチル化なし、点部は部分的メチル化、斜線部は、完全メチル化を示す。この結果、腫瘍の進行が進むほどメチル化の度合いはむしろ低くなることが分かった。ＭＧＭＴ遺伝子のメチル化は、腫瘍の発生に密接な関係があるとされるが、腫瘍の進行には、むしろ阻害的に作用する可能性もあることが分かる。
本発明の核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＭＧＭＴ遺伝子のメチル化検出キットの製造は、製薬業界、バイオテクノロジーの分野などで利用することができる。本発明のＭＧＭＴ遺伝子のメチル化の検出方法、この検出方法に用いるための核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＭＧＭＴ遺伝子のメチル化検出キット、医療業において有用に利用することができる。
Claims (10)
- ＭＧＭＴをコードする遺伝子における２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化を１回の操作で検出する検出方法であって、
ＭＧＭＴをコードする遺伝子に修飾剤を接触させることにより、メチル化されていないシトシンを修飾する工程、
メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーとして、配列番号３で表されるメチル化シトシン特異的上流プライマー（Ｐ１−ＡＳ）及び配列番号４で表されるメチル化シトシン特異的下流プライマー（Ｐ２−Ｓ）と、
メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーとして、ＭＧＭＴをコードする遺伝子のＰ１−ＡＳより上流に結合するメチル化シトシン非特異的上流プライマー及びＭＧＭＴをコードする遺伝子のＰ２−Ｓより下流に結合するメチル化シトシン非特異的下流プライマーであって、メチル化シトシン非特異的上流プライマーとメチル化シトシン非特異的下流プライマーとの増幅産物を形成しうる２つのプライマーと
からなる４つのプライマーを含むＰＣＲ反応液中で、当該ＭＧＭＴをコードする遺伝子の断片を核酸増幅する工程、及び
この増幅産物を検出する工程
を含むことを特徴とする検出方法。 - 前記メチル化シトシン非特異的上流プライマーが、配列番号２で表されるメチル化シトシン非特異的上流プライマー（ＮＳ−Ｓ）又は配列番号２で表される配列においてイノシン酸がシトシンとチミンとの混合塩基であるプライマーであり、前記メチル化シトシン非特異的下流プライマーが、配列番号５で表されるメチル化シトシン非特異的下流プライマー（ＮＳ−ＡＳ）又は配列番号５においてイノシン酸がグアニンとアデニンとの混合塩基であるプライマーである、請求項１記載の検出方法。
- 前記メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーが、配列番号２で表されるメチル化シトシン非特異的上流プライマー（ＮＳ−Ｓ）及び配列番号５で表されるメチル化シトシン非特異的下流プライマー（ＮＳ−ＡＳ）である、請求項２記載の検出方法。
- 核酸増幅する工程において、前記メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーの濃度を、前記メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーの濃度より高くする、請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法。
- 増幅産物を検出する工程の後に、２つの前記メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーのみにより増幅された核酸増幅産物の量と、当該メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーと１つの前記メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーにより増幅された核酸増幅産物の量とを比較することにより、ＭＧＭＴをコードする遺伝子における２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の程度を判定することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の検出方法。
- 増幅産物を検出する工程の後に、検出された増幅産物が、
（１）ＮＳ−ＳとＰ１−ＡＳとからの増幅産物及びＮＳ−ＳとＮＳ−ＡＳとからの増幅産物の２つのＤＮＡ断片であれば、ＭＧＭＴ遺伝子の上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されており、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されていない；
（２）Ｐ２−ＳとＮＳ−ＡＳとからの増幅産物及びＮＳ−ＳとＮＳ−ＡＳとからの増幅産物の２つのＤＮＡ断片であれば、ＭＧＭＴ遺伝子の上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されておらず、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されている；
（３）ＮＳ−ＳとＰ１−ＡＳとからの増幅産物、Ｐ２−ＳとＮＳ−ＡＳとからの増幅産物及びＮＳ−ＳとＮＳ−ＡＳとからの増幅産物の３つのＤＮＡ断片であれば、上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されており、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンもメチル化されている；
（４）ＮＳ−ＳとＮＳ−ＡＳとからの増幅産物の１つのＤＮＡ断片のみであれば、上流の１のＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されておらず、下流の１のＣｐＧ領域のシトシンもメチル化されていない
と判定する工程をさらに含む、請求項３〜６のいずれか１項記載の検出方法。 - 請求項１〜６のいずれか１項記載の検出方法において用いられる核酸増幅用プライマーセットであって、
メチル化シトシン特異的核酸増幅用プライマーとして、配列番号３で表されるメチル化シトシン特異的上流プライマー（Ｐ１−ＡＳ）及び配列番号４で表されるメチル化シトシン特異的下流プライマー（Ｐ２−Ｓ）と、
メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーとして、ＭＧＭＴをコードする遺伝子のＰ１−ＡＳより上流に結合するメチル化シトシン非特異的上流プライマー及びＭＧＭＴをコードする遺伝子のＰ２−Ｓより下流に結合するメチル化シトシン非特異的下流プライマーであって、メチル化シトシン非特異的上流プライマーとメチル化シトシン非特異的下流プライマーとの増幅産物を形成しうる２つのプライマーと
からなるプライマーセット。 - 前記メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーが、配列番号２で表されるメチル化シトシン非特異的上流プライマー（ＮＳ−Ｓ）又は配列番号２で表される配列においてイノシン酸がシトシンとチミンとの混合塩基であるプライマー、及び配列番号５で表されるメチル化シトシン非特異的下流プライマー（ＮＳ−ＡＳ）又は配列番号５においてイノシン酸がグアニンとアデニンとの混合塩基であるプライマーである、請求項７記載のプライマーセット。
- 前記メチル化シトシン非特異的核酸増幅用プライマーが、配列番号２で表されるメチル化シトシン非特異的上流プライマー（ＮＳ−Ｓ）及び配列番号５で表されるメチル化シトシン非特異的下流プライマー（ＮＳ−ＡＳ）である、請求項８記載のプライマーセット。
- 請求項７〜９のいずれか１項記載のプライマーセットを含む、ＭＧＭＴをコードする遺伝子における２以上のＣｐＧ領域の各々のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化を１回の操作で検出するための検査用試薬キット。
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