JP4354956B2 - Ph依存性のポリペプチド凝集およびその使用 - Google Patents
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Description
本出願は、その開示があらゆる目的で参照により明確に含まれている、2003年3月25日に出願された正規の国内出願である米国特許出願第10/397,059号の優先権を主張するものである。
伝達性海綿状脳症(TSE)またはプリオン病は、プリオンタンパク質(PrPSc)から構成される従来とは異なる感染物質(プリオン)によって引き起こされる中枢神経系の致死的障害である(Prusiner、S.B.(1998) Prions.Proc Natl Acad Sci U S A 95、13363〜13383)。TSEにおける重要な事象は、プリオン遺伝子PRNPによってコードされる、宿主タンパク質、細胞プリオンタンパク質(PrPC)の、アミロイド線維に凝集し、神経およびリンパ性網皮細胞中に蓄積する神経病理的イソ型PrPScへの立体配座の変化である(Doi、S.、Ito、M.、Shinagawa、M.、Sato、G.、Isomura、H.およびGoto、H.(1988) Western blot detection of scrapie-associated fibril protein in tissues outside the central nervous system from preclinical scrapie-infected mice.J Gen Virol 69 (Pt4)、955〜960 ; Wadsworth、J.D.F.、Joiner、S.、Hill、A.F.、Campbell、T.A.、Desbruslais、M.、Luthert、P.J.およびCollinge、J.(2001) Tissue distribution of protease resistant prion protein in variant Creutzfeldt-Jakob disease using a highly sensitive immunoblotting assay.Lancet 358、171〜180)。したがって、PCRなどの他の感染物質を検出するために使用される診断戦略は無益である。しかしながら、in vivoスクリーニング試験または感染個体の同定法として、臨床症状の初期段階または症状発現前の相での正確な診断法が必要とされている。過去数年多大な努力がなされてきているが、これらの試験はまだ依然として利用可能ではない。
・固有の凝集能力を有するポリペプチドまたはタンパク質は、pHに依存して自在に不規則になるこのポリペプチドのドメイン中に局在するペプチド反復配列の存在および構造によって、オリゴマー化させることができる。
・可逆的なポリペプチドの凝集および/または解離に必要とされるペプチド反復配列は(単独、あるいは自在に不規則になったタンパク質ドメイン部分と共に)元のアミノ酸配列の一部であるか、あるいはポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾によって導入することができる。
・オリゴマー化のみが、ポリペプチドまたはタンパク質の流体環境のpHに依存する。
・新しい種類のスクリーニング試験、ならびにTSE(伝達性海綿状脳症)、特にvCJD(新しい変異型のクロイツフェルトヤコブ病)の臨床症状の初期段階、あるいは症状発現前の期間中の正確な診断法の提供および施用。
・OPRタグ融合タンパク質またはポリペプチドを、樹脂、ガラスビーズなどの固相に固定することによって、新しい種類のOPRタグ融合タンパク質またはポリペプチドの親和性精製、富化または検出を提供および/または施用することができる。
・OPRタグ融合タンパク質またはポリペプチドの提供、およびIT技術用の新しい種類のpH依存性分子変換用、または分子レベルで働く分子センサーまたは機器用のそれらの施用。
・TSEに対する治療剤としてプリオンタンパク質を特異的に認識する、OPRタグ融合タンパク質またはポリペプチドの提供、ならびにvCJDの治療用の遺伝子療法ベクターの提供。
・ポリクローナル、モノクローナル、および/または改変抗体を生成するための、OPRタグ融合タンパク質またはポリペプチドの提供。
・このようなポリペプチド凝集体の三次元構造と選択的に結合するリガンドの提供。このようなリガンドは、プリオンタンパク質(PrPCおよびPrPSC)、抗体、化学分子、およびオクタペプチド含有融合タンパク質を含む。
・化学的(例えば生化学的)および/または物理的(例えば光学的)センサーチップを含めたセンサー技術用のOPRタグ融合タンパク質またはポリペプチドの提供。
1.ヒトプリオンタンパク質の生成および分光学的特徴付け:
本試験用に、以下のポリペプチドを調製した(図1):成熟形のヒトプリオンタンパク質、hPrP(23〜230);1つのオクタペプチドを含むhPrP(81〜230);OPRを完全に欠き、プリオン伝播に必要とされる最小配列に概ね対応するhPrP(90〜230);および充分に構造が知られている球状PrPドメインに対応するhPrP(121〜230)(Zahn他、2002)。この構築物のアレイによって、ヒトプリオンタンパク質の溶液特性に対する、全鎖長の考えられる影響を調べることができた。
hPrPポリペプチドの流体力学半径(RH)は、図2に要約した動的光散乱の測定から決定した。
hPrP(23〜230)のpH依存性の凝集をさらに特徴付けるために、我々は、さまざまな溶液条件で1HNMR実験を行った。1HNMR実験での1H線幅は、全体的な回転相関時間(τc)にほぼ正比例し、したがって分子質量および分子の形状に依存する。
pH6.2におけるN末端セグメント23〜120の骨格アミドプロトンおよび窒素の、配列特異的な帰属を、pH4.5で記録したスペクトルとの化学的シフトの比較に基づく、15N標識hPrP(23〜230)を用いた[15N,1H]-COSY pH-滴定実験から得た(Liu、A.Z.、Riek、R.、Wider、G.、von Schroetter、C.、Zahn、R.およびWuthrich、K.(2000) NMR experiments for resonance assignments of C-13、N-15 doubly-labeled flexible polypeptides: Application to the human prion protein hPrP(23〜230).Journal of Biomolecular Nmr 16、127〜138)。約40%の非混乱状態のヒスチジンが脱プロトン化されるpH6.2では、[15N,1H]-COSYスペクトル中の共鳴線がごくわずかに拡大し、大部分のPrP分子はこれらの条件下においてモノマーであることが示される。骨格の帰属は、三次元の15N-解像[1H,1H]-核Overhauser増大分光(NOESY)スペクトルを使用して確認し、このスペクトルは側鎖プロトンの帰属用に後に使用した。すべてのポリペプチド骨格の共鳴を帰属、OPR領域中のGly残基のそれらと重複する、Gly35、Gly93およびG1y94のアミド窒素およびアミドプロトンは除外した(Liu他、2000)。個々のOPRセグメントの対応する共鳴線は、2つの側面ジペプチドGln52-Gly53およびGly90-Gln91(図1)、すなわち全5個の反復配列に関して同じ頻度で存在するオクタペプチド中の所与の残基由来の所与の原子の共鳴以外、完全に重複する。不安定な側鎖プロトンの中では、全4Asnおよび8Gln残基のアミド基は、Gln59という唯一の例外以外は、残基間NOEを使用して帰属させることができると思われる。3Arg残基のε-プロトン共鳴は、溶媒の交換が速いためにpH6.2では検出することができないと思われる。
NOESYの交差ピークを帰属させるために、我々は、構造計算プログラムDYANAと組み合わせて、自動式NOE帰属ソフトウェアCANDIDを使用した。hPrP(23〜230)中のペプチドセグメント23〜120の構造計算の最初に、合計689のNOESY交差ピークを帰属、pH6.2で記録した15N-解像[1H,1H]-NOESYスペクトルに組み込み、これによって322のNOEの上限の距離的制約を得た。顕著なことに、合計219のNOESYの交差ピークを、pH6.2でのOPR領域のアミド窒素およびプロトンに由来するものとして確認することができたが、一方でわずか98のこのようなピークがpH4.5で観察される(Liu他、2002)。これによって、pH4.5では安定していない、pH6.2でのOPR中の他の構造領域の存在が示された。対照的に、OPR外の残基に関しては、他のNOESYの交差ピークを確認することはできず、pH依存性構造の形成はこの領域に限られることが示される。
HGGGWGQPのNMR構造は、(HGGGWGQP)3中の対応するOPRと同様の全体的な折り畳み構造、およびHGGGWGQPおよびhPrP(23〜230)の残基61〜68に対応する(HGGGWGQP)3のN末端オクタペプチドの、平均的構造中の骨格重原子間で0.32ÅのRMSD値を有する。セグメントHGGGWおよびGWGQは、それぞれループ構造およびβターン構造をとり、この場合βターンは、連続的な型のdNNおよびdONNOE結合、ならびにTrpとGlnの間のdON(i,i+2)NOE結合によって確認される。(HGGGWGQP)3では、オクタペプチドが配列して、三角球体ドメインを形成する(図4B)。この分子構造は反復する水素結合の組によって安定化し:3つのOPRのそれぞれが、3つのオクタペプチド間水素結合His(i)HN-O'Gln(i+6)、Gly(i+2)HN-Nε2His(i)およびTrp(i+3)Hε-O'Gly(i)を含む。3つのOPR間の接触は、型Gly(i+2)HN-O'Pro(i)の2つの水素結合によって安定化する。Gln(i)-Pro(i+1)のペプチド結合はトランス立体配座中に存在する。すべての側鎖原子は、Trpの疎水性残基鎖を含めて大部分が溶媒に露出している(図4B)。OPRの三次元構造から、したがって、溶媒に露出した疎水性残基の対称的な分布は、PrP凝集に重要である可能性がある。
OPR内のpH6.2での三次構造相互作用の形成は、ヘテロ核15N{1H}-NOEの測定によって検出することができる分子間の過渡過程と相関関係がある。pH4.5溶液中での以前の試験では(Zahn他、2002)、hPrP(23〜230)の残基23〜120を含むN末端ドメインは負のNOEのみを示し、球状構造ドメインに典型的な値を示したC末端ドメインとは対照的であった。したがって、有効な回転相関時間τcは、C末端ドメインの骨格15N-1H部分に関しては、少なくとも数ナノ秒であると推定することができると思われ、一方N末端ドメイン中の15N-1H部分は、柔軟なランダムコイル様のポリペプチド鎖に関して予想されたのと同様に、1未満のτcを有するはずである。対照的にpH6.2では、OPRおよびOPR側面の幾つかの残基(図5)を含めた、N末端ドメインの15N-1H部分の幾つかは、約0.2の陽性15N{1H}-NOEを示し、このポリペプチド領域がある程度の移動度で球状構造中に折り畳まれていることが示され、おそらくそれは、さらに折り畳まれていない立体配座で平衡状態にあるからである。
1.オクタペプチド反復配列構造は、新しい構造モチーフを表す:
プログラムDALI(Holm、L.およびSander、C.(1993) Protein-Structure Comparison by Alignment of Distance Matrices.Journal of Molecular Biology 233、123〜138)によって、ここに記載したHGGGWGQPおよび(HGGGWGQP)3の構造と、タンパク質データバンクの任意の以前の寄託物の間に有意な類似性がないことが明らかになり、このOPR構造が新しい構造モチーフを表すことが示された。我々の構造計算の結果は、合成OPRペプチドの以前の構造研究からは逸脱する。pH7.4での円偏光二色性の実験から、このOPRは、ポリ-L-プロリンII型ヘリックスと類似した性質を有する、伸長した立体配座をとることが示唆され(Smith、C.J.、Drake、A.F.、Banfield、B.A.、Bloom-berg、G.B.、Palmer、M.S.、Clarke、A.R.およびCollinge、J.(1997) Conformational properties of the prion octa-repeat and hydrophobic sequences.Febs Letters 405、378〜384)、一方で、pH6.2と6.6の間で行われた近年のNMR試験は、セグメントHGGGWおよびGWGQは、それぞれループ構造およびβターン構造をとることを示唆する(Yoshida、H.、Matsushima、N.、Kumaki、Y.、Nakata、M.およびHikichi、K.(2000) NMR studies of model peptides of PHGGGWGQ repeats within the N-terminus of prion proteins: A loop conformation with histidine and tryptophan in close proximity.Journal of Biochemistry 128、271〜281)。我々はセグメントGWGQに関するターン様の立体配座も観察しているが(図4A)、我々の構造体中のループ状立体配座は異なるものである。なぜなら、Trpの芳香環と非常に近い位置のHisのイミダゾール側鎖は、我々の構造計算からは裏づけされていないからである。1つまたは2つのオクタペプチドを含む環状OPRに関するNMRデータも、HisおよびTrp側鎖の非常に近い位置は裏づけしないので(Yoshida他、2000)、この相互作用は一時的にのみ形成される可能性がある。
意外なことに、HGGGWGQPのNMR構造中のHGGGWループは、pH7.4で増大した結晶から近年決定された銅結合オクタペプチド反復配列セグメントHGGGW-Cu2+の結晶構造中の、対応する残基と同様の骨格の折り畳みを有する(Burns、C.S.他、(2002) Molecular features of the copper binding sites in the octarepeat domain of the prion protein.Biochemistry 41、3991〜4001)。HGGGW-Cu2+の構造(図4C)では、Cu2+は、Hisイミダゾールのδ1-窒素と、その第二のGlyがそのアミドカルボニル酸素にも貢献する、隣の2つのGly残基由来のアミド窒素からの赤道結合とペンタ位置にある。His骨格窒素およびC0以外は、Hisから第三のGlyの窒素までのすべての原子が赤道面にほぼ位置し、銅はこの面の真上に位置し、ペンタ配位錯体と一致する。Trpインドールも水素結合から軸位置の水分子まで関与し、一方グルタミンは、銅結合と関係がない官能基を有する唯一の側鎖である。そのデータからBurnsおよび同僚は、膜結合PrPの2つの「金属サンドウィッチ」オクタペプチド反復配列内の露出したグルタミン側鎖が、PrP分子の間の分子間認識の相互作用部位として働き、これによって銅誘導型エンドサイトーシスを刺激し(Pauly、P.C.およびHarris、D.A.(1998) Copper stimulates endocytosis of the prion protein.J Biol Chem 273、33107〜33110)、あるいはPrPSCの形成を容易にする可能性があるモデルを提案した。
天然のPrPCが組換えhPrPと比較してin vivoで同様に働くと仮定すると、その凝集状態も大部分は環境のpHに依存する可能性がある。したがってHis含有OPRは、シナプス前部の膜表面の脂質ラフト内に多数のPrPC分子を集める、pH依存性凝集部位として作用すると思われる。直径44nmの脂質ラフトは、5nmの直径を有する約80のPrPC分子に充分な表面を与えると思われる。したがって、銅の生理的役割は脂質ラフト内のPrPC分子の数を調節し、それによってシナプス前部の小胞へのPrPCのエンドサイトーシスを刺激することであると思われ、この場合プリオンタンパク質は、局部的に酸性であるpHのためにモノマーに解離すると思われる。このモデルは、銅がPrPC凝集の誘導物質ではなく調節物質として作用すること以外は、Burnsおよび同僚の提案(Burns他、2002)と一致すると思われる。
1.サンプル調製:
非標識形または均一な15N標識を有するhPrPポリペプチドのクローニング、発現および精製を、以前に記載されたのと同様に行った(Zahn、R.、von Schroetter、C.およびWuthrich、K.(1997) Human prion proteins expressed in Escherichia coli and purified by high-affinity column refolding.FEBS Lett 417、400〜404)。タンパク質溶液は、Ultrafree-15遠心分離濾過装置(Millipore)を使用して濃縮した。
4つの無線周波数チャンネル、および遮蔽z-勾配コイルを有する三重共鳴プローブヘッド、および1mMのタンパク質溶液の非標識または15N標識サンプル、20℃において90%H20/10%D20または99.9%D20を備えるBruker DRX500、DRX750およびDRX800分光計で、NMR測定を行った。立体配座の制約をまとめるために、H20中の三次元の15N-解像[1H,1H]-NOESYスペクトルを、T=20℃で混合時間τm=100ms、207(t1)×39(t2)×1024(t3)複合地点、t1,max(1H)=23.0ms、t2,max(15N)=21.4ms、t3,max(1H)=114msで、800MHzにおいて記録し、このデータ組は512×128×2048ポイントにゼロ充填した。スペクトルの処理は、プログラムPROSAを用いて行った(Guntert、P.、Dotsch、V.、Wider、G.およびWuthrich、K.(1992) Processing of Multidimensional Nmr Data with the New Software Prosa.Journal of Biomolecular Nmr 2、619〜629)。1Hおよび15Nの化学的シフトを、2,2-ジメチル-2-シラペンタン-5-スルホン酸ナトリウム塩に対して計算した。
動的光散乱の測定を、タンパク質溶液Ltd.モデル801動的光散乱用装置(Hertford、英国)を使用して20℃において行った。この装置は、散乱光の強度データの自己相関関数から、サンプルセル中の分子の翻訳時の拡散係数DTを計算する。散乱粒子の流体力学半径RHは、KBがボルツマン定数であり、Tがケルビンの絶対温度であり、ηが溶媒の粘度である、ストークス-アインシュタインの関係式:DT=KBT/6πηRHを使用してDTから誘導される。タンパク質濃度は、pH4.5で10mMの酢酸ナトリウム、またはpH7.0で10mMのリン酸ナトリウムを含むバッファー溶液中で4mg/mlであった。タンパク質溶液は、100nm孔サイズのフィルター(Whatman、英国)によって濾過した。気泡または埃による干渉を減らすために、モレキュラーリサーチDYNAMICSからのDynaPro動的光散乱用装置調節ソフトウェア(バージョン4.0)を使用して、実験当たりで30のデータ地点を分析した。流体力学半径RHは、球体モデルを使用して調整ヒストグラム法から計算して、そこからみかけの分子量を、知られている球状タンパク質に関して計算した標準曲線に従い推定した。
Claims (10)
- ポリペプチドを可逆的に凝集および/または解離させるための方法であって、流体環境中において6.2〜7.8のpHでポリペプチドをオリゴマー化するステップおよび/または4.5〜5.5のpHでポリペプチド凝集体を解離させるステップを含み、前記ポリペプチドが、
(i)プリオンタンパク質由来の1つまたは複数のペプチド反復配列構造を含むことを特徴とし、
(ii)前記タンパク質が6.2〜7.8のpHで流体中においてオリゴマー化し、4.5〜5.5のpHでモノマーに解離することを特徴とする方法。 - 前記ペプチド反復配列が、オクタペプチド、PHGGGGWSQ(さまざまな種)、およびPHGGGSNWGQ(有袋動物)からなる群から選択されるオクタペプチド変異体またはヘキサペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記オクタペプチドが、PHGGGWGQ(ヒト)、PHGGSWGQ(マウス)およびPHGGGWSQ(ラット)からなる群から選択される配列を有する、請求項2に記載の方法。
- 前記ヘキサペプチドが、PHNPGY(ニワトリ)、PHNPSY、PHNPGY(カメ)からなる群から選択される配列を有する、請求項2に記載の方法。
- 前記ペプチド反復配列のそれぞれが、C末端βターン構造と結合したN末端ループ構造を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが4個の同一のオクタペプチドを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトまたは動物性プリオンタンパク質を検出するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法の使用。
- 前記ポリペプチドを親和性精製および/または富化するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法の使用。
- 前記ポリペプチドを固相に固定する、請求項7または8に記載の方法の使用。
- 化学的および/または物理的センサー技術用の、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法の使用。
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