JP4344136B2 - アポリポタンパク質類似体 - Google Patents
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Description
以下、Apo Aまたはアポリポタンパク質Aとは3つのアポリポタンパク質、すなわちアポリポタンパク質A I、アポリポタンパク質A II、またはアポリポタンパク質A IVのいずれかを示すのに用いる。
第1の態様では、本発明は、一般式
apo-A-X
{式中、apo-Aはアポリポタンパク質AI、アポリポタンパク質AII、アポリポタンパク質AIV、その類似体または変異体からなる群から選択されるアポリポタンパク質A成分であり、
Xはアミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物および核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つの化合物を含む異種部分であり、
ただし、この構築物が厳密に同じ2つの天然アポリポタンパク質からなる場合にはこれらは連続的に結合される}
を有する、薬剤として用いられるアポリポタンパク質構築物に関する。
apo-A-X
{式中、apo-Aはアポリポタンパク質AI、アポリポタンパク質AII、アポリポタンパク質AIV、その類似体または変異体からなる群から選択されるアポリポタンパク質成分であり、
Xはオリゴマー形成モジュールおよび末端結合アポリポタンパク質からなる群から選択される異種部分である}
を有するアポリポタンパク質構築物が提供される。
本発明の構築物およびこれら構築物のapo-A成分の機能性は以下に記載のDPMCアッセイによるなど、脂質結合アッセイによって測定することができる。さらに、コレステロール逆輸送に対するin vivo作用はMiyazaki et al (Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 1995; 15:1882-1888)に開示されている方法などの高コレステロール食を与えたウサギまたはApo E欠損マウス(Sha PK et al, Circulation 2001,103:3047-3050)などの実験動物に投与することにより測定することができる。
以下、「apo-A」とは、アポリポタンパク質A-I、アポリポタンパク質A-IIまたはアポリポタンパク質A-IV、同等の脂質結合機能を有するそのいずれかの変異体または類似体を含むいずれかのアポリポタンパク質Aを表すために用いる。
27 P→H(MUNSTER-3C)
27 P→R
28 P→R(MUNSTER-3B)
34 R→L(BALTIMORE)
50 G→R(IOWA)
84 L→R(常染色体優性アミロイドシス)
113 D→E
119 A→D(HITA)
127 D→N(MUNSTER-3A)
131 欠失(MARBURG/MUNSTER-2)
131 K→M
132 W→R(津島)
133 E→K(福岡)
151 R→C(パリ)
160 E→K(NORWAY).
163 E→G
167 P→R(GIESSEN).
168 L→R (ZARAGOZA).
171 E→V
189 P→R
197 R→C(MILANO)
222 E→K(MUNSTER-4)
i) 図1、2aまたは2bの所定のアミノ酸配列もまた認識しうる抗体によって認識されうるアミノ酸配列を含む断片、および/または
ii)ジミリストイルホスファチジルコリンまたはコレステロールなどの脂質と結合しうるアミノ酸配列、および/あるいは図1、2aまたは2bの所定のアミノ酸配列とも結合しうるレセプターを含む断片。
図1、2aまたは2bの天然配列の脂質結合領域を含む断片が特に好ましい。しかし、本発明は脂質結合領域を含む断片に限られるものではない。また、脂質結合領域より小さな領域を含む図1、2aまたは2bの配列の機能的に同等な断片を生じるこのような断片の欠失も本発明に含まれる。本発明の図1、2aまたは2bの配列と機能的に同等なペプチドおよびその断片は脂質結合領域より少ない、または多いアミノ酸残基を含んでもよい。好ましくはこの断片は少なくともapo-A-Iのアミノ酸100〜186番またはその変異体もしくは機能的同等物を含む。この中心ドメインおよびドメイン内のαヘリックスは直接リン脂質との相互作用に関わることが分かっている。よって、この領域はapo-A-Iの機能特性に重要な役割を果たす可能性が高い。
本発明のタンパク質構築物のX成分は実質的に非免疫原性であることが好ましい。例えば成分Xはアミノ酸、炭水化物、核酸配列、不活性タンパク質またはポリペプチドであってもよく、哺乳類に対して生理作用を実質的に示さず、特に、免疫作用を示さない。
二量体:
A-I A-I; A-II AII; A-IV A-IV; A-I A-II; A-I A-IV; A-II A-IV
三量体:
A-I A-II A-IV; A-I A-I A-II; A-I A-I A-I; A-I A-I A-IV; A-II A-II A-I; A-II A-II A-IV; A-II A-II A-II; A-IV A-IV A-IV; A-IV A-IV A-II; A-IV A-IV A-I
本発明の特に好ましい実施形態によれば、異種部分はオリゴマー形成モジュールである。本明細書ではオリゴマー形成モジュールはその他の、類似の、または同一のオリゴマー形成モジュールと相互作用しうるペプチドまたはタンパク質もしくはタンパク質の一部である。この相互作用は多量体タンパク質またはポリペプチドを生じるタイプのものである。このような相互作用は多量体成分間の共有結合、ならびに水素結合力、疎水力、ファンデルワールス力、塩橋によって生じうる。本発明はまた、DNA、RNA、LNAまたはPNAの核酸配列のような非ペプチド系のオリゴマー形成モジュールを包含する。当業者ならばタンパク質および核酸配列を互いに連結する技術を知っている。
本タンパク質構築物はまた、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質類似体と異種部分の間で共有結合しているスペーサー部分を含むのが有利である。スペーサーの作用は構築物の異種部分とアポリポタンパク質部分の間にスペースを設けることである。これにより、アポリポタンパク質部分の二次構造が異種部分の存在によって影響を受けず、アポリポタンパク質部分の生理作用が維持されることが確実となる。このスペーサーはポリペプチド系のものであることが好ましい。このように、スペーサーをコードする核酸配列を構築物のアポリポタンパク質部分をコードする配列、さらには所望により異種部分の配列に連結することができ、構築物全体を同時に作製することができる。
このリンカーはテトラネクチンにおいてβストランドを形成するテトラネクチン残基53〜56、およびテトラネクチンにおいてαターンを形成する残基57〜59を含みうる(Nielsen BB, Kastrup JS, Rasmussen H, Holtet TL, Graversen JH, Etzerodt M, Thogersen HC, Larsen IK, FEBS-Letter 412, 388-396, 1997)。このセグメントの配列はGTKVHMKである。このリンカーは天然テトラネクチンにおいてCRDドメインを有する三量体形成ドメインを架橋することから、一般にこの三量体形成ドメインと別のドメインを接続するのに十分適していると考えられるという利点を有する。また、得られる構築物はリンカーを含まない構築物より免疫原性が高いとは予測されない。このテトラネクチンに基づくリンカーはX成分がTTSEを含む場合に極めて好ましい。
このリンカーはヒトフィブロネクチンの接続ストランド3由来の部分配列として選択することができ、アミノ酸残基1992〜2102に相当する(SWISS-PROTナンバリング、エントリーP02751)。アミノ酸2037〜2049番にわたる配列:PGTSGQQPSVGQQを用いるのが好ましく、この部分配列の中でもアミノ酸残基2038〜2042に相当するセグメントGTSGQがより好ましい。この構築物はタンパク質分解切断を極めて受けにくく、フィブロネクチンが血漿中に高濃度で存在することを考えれば免疫原性が高いとは考えられないという利点を有する。
ネズミIgG3の上部ヒンジ領域に由来する10個のアミノ酸残基配列PKPSTPPGSSはコイルドコイルによって二量体形成した抗体の作製に使用されてきたものであって(Pack P. and Pluckthun, A. Biochemistry 31, pp 1579-1584 (1992))、本発明のスペーサーペプチドとして有用でありうる。ヒトIgG3の上部ヒンジ領域由来の対応する配列がよりいっそう好ましい。
フレキシブルリンカー/スペーサー配列の可能性のある例としては、SGGTSGSTSGTGST、AGSSTGSSTGPGSTTまたはGGSGGAPが挙げられる。これらの配列はデザインされたコイルドコイルと他のタンパク質ドメインとの結合に用いられてきた(Muller, K. M., Arndt, K. M. and Alber, T., Meth. Enzymology, 328, pp 261-281 (2000)。
この構築物の2つの成分は共有結合によってともに結合できる。この結合は成分Xとapo-A成分のCまたはN末端アミノ酸との間で形成しうる。これらの成分はまた1を超える共有結合を介して結合させてもよい。これらの成分間の共有結合はまた、好ましくはシステイン残基間にS-S橋を含んでもよい。これらのシステイン残基はapo-A成分のCまたはN末端、および成分Xの末端または内部に置く。
構築物の他の成分に関わらず、本発明の構築物は炭水化物部分を含んでもよい。
本発明のある特に好ましい実施形態は、テトラネクチン由来三量体形成モジュールによるアポリポタンパク質またはその類似体の三量体形成または部分的三量体形成である。
本発明の発現プラスミドでは、TTSEモジュール(配列番号12)が示されるようにCys50をSerで置換し、C末端リジン残基を含めることにより改変された。SPGT配列はN末端に付加されている。これは三量体形成モジュールに対する接続配列である。この配列はDNA鎖をBgl IIおよびKpn Kで切断する機会を与えることから挿入されている。Bam HIによる切断機会を与える接続GS配列はC末端に付加されている。この改変TTSEはTripAと呼ばれ、配列番号13として開示されている。従って、Apo A構築物の三量体形成モジュールは、この配列、または配列番号13の配列と少なくとも68%の配列同一性を有する(少なくとも75%、少なくとも81%、少なくとも87%、および少なくとも92%など、より高い配列同一性が好ましい)配列を含むのが有利である。
本発明は配列番号2〜11および配列番号14として付属の実施例に開示される特定の配列を包含する。好ましくは本発明は配列番号3〜11および配列番号14を包含する。これらの配列と少なくとも60%の配列同一性、例えば少なくとも70%の配列同一性を有する配列も本発明の範囲内にあり、少なくとも80%の配列同一性、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する配列が好ましい。
タンパク質構築物のペプチド成分を作製するには、この部分をコードするcDNAを発現ベクターに挿入し、宿主細胞へ形質転換する。
本発明の構築物の性能は、天然アポリポタンパク質A-I、A-IIまたはA-IVと結合しうるレセプターまたはHDLタンパク質と結合する構築物の能力を測定することにより分析できる。このようなレセプターおよびタンパク質としては、限定されるものではないが、キュビリン、メガリン、スカベンジャーレセプタークラスBタイプ1(SR-B1)、ATP結合カセット1(ABC1)、レシチン:コレステロールアシルトランスフェラーゼ(LCAT)、コレステリル-エステル転移タンパク質(CETP)、リン脂質転移タンパク質(PLTP)が挙げられる。キュビリンと天然アポリポタンパク質AIの複合体の解離定数Kdは20nMである。本発明のアポリポタンパク質AI三量体はかなり強力にキュビリンを結合することが実験的に調べられている(図12)。
本発明のタンパク質構築物はまた、構築物の精製の際に用いるアフィニティータグを含んでもよい。このようなタグは好ましくはポリヒスチジン配列を含む。この配列はNi2+カラムでの生成物の精製に有利に使用でき、これはポリヒスチジン配列と、またそれによりタンパク質全体と結合する。このポリヒスチジン配列はカラムから溶出させた後に、タンパク質構築物とポリヒスチジン配列との間の構築物へと構築された特異的配列を認識するトロンビンなどのプロテイナーゼによって切断されうる。
本発明の構築物を大腸菌または酵母で発現させる場合、発現タンパク質を細胞内から単離するという労力のかかる方法の代わりに、発現タンパク質が分泌され、細胞周囲の培地から回収できるようにするため発現構築物にシグナルペプチドを含めることが好ましい。本明細書に関して使用でき、酵母および大腸菌での発現のためのシグナルペプチドの具体例としては、酵母におけるApo-AIおよびApo-AIMの発現のためのシグナルペプチドを開示しているWO90/12879(Sirtori et al)ならびに大腸菌におけるApo-AIおよびApo-AIMの発現のためのシグナルペプチドを開示しているWO94/13819(Kabi Pharmacia)に開示されているものが挙げられる。
アポリポタンパク質部分とTTSEを含む構築物を作製するには、アポリポタンパク質部分をコードするcDNAをTTSEをコードするcDNAの3'末端〜5'末端に連結する。さらなるTTSEユニットおよびアポリポタンパク質ユニットを連結してもよい。酵素切断部位をコードする配列をTTSEをコードする配列の3'末端にさらに連結し、最後にポリヒスチジンをコードする配列も連結する。これは従来のPCR技術によって行うことができる。この組み合わせたcDNAを発現ベクターに挿入し、宿主細胞へ形質転換する。
apo-A構築物は医薬組成物の製造のために使用できる。本組成物は医薬上許容される賦形剤、アジュバント、添加剤(リン脂質、コレステロールまたはトリグリセリドなど)を含んでよい。
本発明のapo-A構築物はコレステロール、リン脂質およびトリアシルグリセリドに関する疾病、高コレステロール血症などのLDLおよびHDL障害、ならびにアテローム性動脈硬化症および心筋梗塞などの動脈硬化性疾患の予防および/または治療のために投与することができる。他の適応症としては狭心症、プラーク狭心症、不安定狭心症、頸動脈狭窄、跛行または脳動脈狭窄などの動脈狭窄が挙げられる。さらにまた、本アポリポタンパク質構築物は内毒素の除去にも用いることができる。
本発明はまた遺伝子治療を目的とする本発明のヌクレオチド配列の使用を包含する。
標準的なPCR技術を用い、Apo A-IをコードするcDNAをヒト肝cDNAライブラリー(Clontech)から増幅した。Ubi-A-Iの構築については、用いたプライマーは、5'-CAC GGA TCC ATC GAG GGT AGG GGT GGA GAT GAA CCC CCC CAG AGC-3'および5'-TCC AAG CTT ATT ACT GGG TGT TGA GCT TCT TAG TG-3'であった。この産物を、Bam HIおよびHind IIIクローニング部位を用い、Ellgaard L. et al., Eur. J. Biochem. 1997; 244(2):544-51に記載のベクターpT7H6Ubiへクローニングした。Trip-A-A-Iの構築については、用いたプライマーは、5'-AAG GGA TCC GAT GAA CCC CCC CAG AGC CCC-3'および5'-TCC AAG CTT ATT ACT GGG TGT TGA GCT TCT TAG TG-3'であった。このPCR産物を、Bam HIおよびHind IIIクローニング部位を用い、WO98/56906に記載のpT7H6tripaベクターへクローニングした。Trip-A-I-del43の構築については、用いたプライマーは、5'-AGG GGA TCC CTA AAG CTC CTT GAC AAC TGG G-3'および5'-TCC AAG CTT ATT ACT GGG TGT TGA GCT TCT TAG TG-3'であった。このPCR産物を、Bam HIおよびHind IIIクローニング部位を用い、WO98/56906に記載のpT7H6tripaベクターへクローニングした。Ubi-Cys-A-Iの構築については、用いたプライマーは、5'-GGT GGA TCC ATC GAG GGT AGG GGT GGA TGT GAT GAA CCC CCC C-3'および5'-TCC AAG CTT ATT ACT GGG TGT TGA GCT TCT TAG TG-3'を用いた。この産物を、Bam HIおよびHind IIIクローニング部位を用い、Ellgaard L. et al., Eur. J. Biochem. 1997; 244(2):544-51に記載のベクターpT7H6Ubiへクローニングした。作製されたプラスミドは図4、5、6および7に示されている。
便宜には、Ubi-A-IおよびTrip-A-Iならびにこれらの図面に開示されている他の構築物は大腸菌AV-1細胞(Stratagene Inc.)で発現させる。他の細胞株も同様に使用できる。細胞培養および発現誘導はWO98/56906でテトラネクチンに関して記載されているように行った。
WO98/56906でテトラネクチンに関して記載されているようにフェノール抽出によって粗タンパク質を単離した。6リットルの発現培養物からのペレットを再溶解したものを遠心分離して不溶材料を除去し、次にWO98/56906に記載のようにして調製した50ml Ni2+-NTA-Sepharoseへバッチ吸着させた。このカラム材をカラムに充填した後、500mlの8M尿素、500mM NaCl、50mM Tris-HCl pH8.0で、次に200mlの6Mグアニジニウム-HCl、50mM Tris-HCl pH8.0、最後に300mlの500mM NaCl、50mM Tris-HCl pH8.0で洗浄した。このタンパク質を500mM NaCl、50mM Tris-HCl pH8.0および10mM EDTAで溶出させた。このタンパク質に0.5mgのXa因子を加え、室温で一晩消化した。この目的のためには同様にしてトロンビンを用いてもよい。このタンパク質をG-25 sephadex(Pharmacia)カラムで500mM NaCl、50mM Tris-HCl pH8.0バッファーにてゲル濾過に付した。このタンパク質溶液を、500mM NaCl、50mM Tris-HCl pH8.0で予備洗浄し、次に500mM NaCl、50mM Tris-HCl pH8.0で洗浄したNi2+-NTA-Sepharoseカラムに通すことにより未消化タンパク質を除去した。未消化タンパク質を500mM NaCl、50mM Tris-HCl pH8.0および10mM EDTAで溶出した。Sp Sepharoseイオン交換樹脂を用いてさらなる精製を行ってもよい。
これらのタンパク質を10mM (NH4)2CO3 pH8.8溶液にてゲル濾過に付し、凍結乾燥させた。凍結乾燥タンパク質を25mlの冷1:1メタノール/クロロホルムに再懸濁させ、氷上で30分間インキュベートし、3000gで20分間遠心分離した。このペレットを25mlの1:2冷メタノール/クロロホルムに再懸濁させ、氷上で30分間平衡化し、再び遠心分離した。上清を除去し、ペレットを軽く風乾した後、6Mグアニジニウム-HCl、50mM Tris-HCl pH8.0に一晩溶解した。
架橋
多量体形成は多量体を架橋させた後に分析的SDS-PAGEを行うことによって測定すればよい。
多量体形成はまた、分析的ゲル濾過によって測定してもよい。
本発明の構築物の脂質結合能はジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)との会合など、周知のアッセイを用いて便宜に測定することができる。
このアッセイはKozyraki R, Fyfe J, Kristiansen M, Gerdes C, Jacobsen C, Cui S et alに記載のようにして行った。内因子-ビタミンB12レセプターであるキュビリンは高密度リポタンパク質のエンドサイトーシスを促進する高親和性アポリポタンパク質A-Iレセプターである(Nat Med 1999 ; 5(6):656-661)。アポリポタンパク質構築物の使用濃度は0.5μMとした。結果(図12)はTripA-AIおよびapo A-Iに関してのみ示されている。TripA-AIに関して認められたものと同等の結合がTripA-FN-AIおよびTripA-TN-AIでも認められた。応答はapo A-Iの三量体形成時に増大し、特に単量体と比較して固定化標的と多量体の相互作用という獲得された「アビディティ」に基づき、その割合に応じて低下が認められた(多価性の配当)。apo A-Iが三量体の状態でキュビリンと結合でき、かつ、1を超えるapo A-Iがキュビリンと相互作用しうるコンホメーションであることが示されたことで、この三量体構築物におけるapo A-Iユニットの正確な折りたたみが示される。
各5個体のマウス3群に対してそれぞれ1mgのapo A-I、Trip-A-AIまたはTrip-A-FN-AIの注射を行った。このタンパク質を0.33mg/mlの濃度で下記のバッファー:1xPBS pH7.4および8.9mg/mlジパルミトイルホスファチジルコリンに溶解した。注射後、下記の時間:10分、4時間、24時間および48時間で各マウスから血液サンプルを採取した。
本発明の構築物は以下に開示されるプラスミドを用いて製造できる。
記載の突然変異を有する基本リンカーを含む構築物は、リンカーを含まない構築物と同様に、すなわち、Apo A-I(およびリンカー配列)をPCR増幅し、pT7FxH6-Trip-Aプラスミドへ挿入することにより構築した。リバースプライマーはpT7H6FxTrip-A-AIの構築で用いたものと同じであり、フォワードプライマーは、
pT7H6FX-Trip-A-FN(-2)-AI:
5'-CGC GGATCC TCG GGT CAG GAT GAA CCC CCC CAG AGC CCC-3'であった。
pT7H6FX-Trip-A-TN-AI-Bam-S
5'-cgc gga tcc aag gtg cac atg aag gat gaa ccc ccc cag agc ccc-3'
記載の変異はStratagene製のQuickChangeキットおよび以下のプライマーセット:
pT7H6FX-Trip-FN-AI:
5'-acg gtc tcc ctg aag gga acc tcg ggt cag gat g-3'
5'-cat cct gac ccg agg ttc cct tca ggg aga ccg t-3'
pT7H6FX-Trip-A-TN-AI:
5'-acg gtc tcc ctg aag gga acc aag gtg cac atg aag g-3'
5'-cct tca tgt gca cct tgg ttc cct tca ggg aga ccg t-3'
を用いた部位特異的突然変異誘発によって訂正した。
構築物のさらなる誘導体として、Trip-A 配列のヘパリン結合部位(Lorentsen RH, Graversen JH, et al. Biochemical Journal (2000), 347 pp 83-87)を、Stratagene製の部位特異的突然変異誘発キットおよび以下のプライマーセットを用いて変異させた。
Trip-Aのリジン9の変異に関しては、
5'-cca acc cag aag ccc aag gcg aat gta aat gcc-3'
5'-gtg ttc aca aca tct gcc ttg gca ttt aca atc-3'
Trip-Aのリジン15の変異に関しては、
5'-ggc att tac aat cgc ctt ggg ctt ctg ggt tgg-3'
5'-cca acc cag aag ccc aag gcg att gta aat gcc-3'
まず、プラスミドpT7H6Fx-Hp(α)(図10H)を以下のように構築した。
cDNAライブラリー(Clontech胎児肝臓)からHp-α配列を以下のプライマーセットを用いてPCR増幅した。
アンチセンスプライマー:
5'-cac aag ctt tcc get aga tct ctg cac tgg gtt agc cgg att ctt ggg-3'
センスプライマー:
5'-ggt gga tcc atc gag ggt agg ggt gtg gac tca ggc aat gat gtc acg g-3'
BamHI部位-Hp-α配列-Bgl II部位-Hind III部位
を含んでいた。Hp-α配列では、Hpのβ鎖とジスルフィド架橋しているシステイがアラニンに変異していた。
BamHI部位-Apo AI配列-Hind III部位
を有するPCR産物が得られ、この産物をBamHIおよびHind IIIで消化し、Bgl IIおよびHind IIIで消化した上記のプラスミドへ挿入した。得られたプラスミドpT7H6FX-Hp(α)-Apo AIを配列決定し、大腸菌で発現試験を行った。
このプラスミドは実施例1のようにWO98/56906に記載のプラスミドpT7H6FxtripAを含む。
・SPGTは次にくる三量体形成モジュールへの接続配列である。この配列はBgl IIおよびKpn IによるDNA鎖切断の機会を与えることから挿入されたものである。
・Trip Aはテトラネクチン由来の三量体形成モジュールである。
・GSはBam HIによる切断の機会を与えるもう1つの接続配列である。
このプラスミドはアポリポタンパク質部分がヒトアポリポタンパク質A-I由来のアミノ酸68〜267をコードするcDNAで置換されていること以外は上記と同じ配列を含む。発現、精製したタンパク質は配列番号4に相当する。
この基本プラスミドはEllgaard et al(1997)に記載されている。
このプラスミドは以下の配列を含む:
・発現はT7プロモーターにより支配
・H6:タンパク質構築物の精製のためのヘキサHisアフィニティータグ
・Ubi:大腸菌でこのタンパク質を安定化させるために挿入されたヒトユビキチンをコードするcDNA
・FX:Xa因子の認識配列
・Xa因子による至適切断に必要な、2つのGly残基をコードするDNA
・ApoAI:ヒトアポリポタンパク質A-I由来のアミノ酸25〜267をコードするcDNA
発現、精製したタンパク質は配列番号1に相当する。
2つのグリシン残基をコードする配列の後、アポリポタンパク質A-Iの前に1つのシステイン残基をコードする配列が挿入されていること以外は上記と同じ。発現、精製したタンパク質は配列番号2に相当する。
このプラスミドは以下の配列を含む。
・発現はT7プロモーターにより支配
・H6:タンパク質構築物の精製のためのヘキサHisアフィニティータグ
・FX:Xa因子の認識配列
・Xa因子による至適切断に必要な、2つのGly残基をコードするDNA
・1つのシステイン残基をコードするDNA
・ApoAI:ヒトアポリポタンパク質A-I由来のアミノ酸25〜267をコードするcDNA
発現、精製したタンパク質は配列番号2に相当する。
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Claims (40)
- 一般式
apo-A-X
を有するアポリポタンパク質融合タンパク質構築物を含む医薬組成物、ここで、apo-Aはアポリポタンパク質 A-Iであり、Xはテトラネクチン三量体形成モジュールである。 - apo-A成分とテトラネクチン三量体形成モジュールとの間にスペーサーペプチドをさらに含み、スペーサーペプチドが、GTKVHMK、PGTSGQQPSVGQQ、GTSGQ、PKPSTPPGSS、SGGTSGSTSGTGST、AGSSTGSSTGPGSTTおよびGGSGGAPからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項 1の組成物。
- テトラネクチン三量体形成モジュールがapo-AのN-末端またはC-末端アミノ酸に共有結合により連結されている、請求項 1の組成物。
- テトラネクチン三量体形成モジュールが、2つのその他のテトラネクチン三量体形成モジュールとの安定した三量体複合体の一部である、請求項 1の組成物。
- 安定した三量体複合体がコイルドコイル構造を含む、請求項 4の組成物。
- コイルドコイル構造が三本鎖αヘリカルコイルドコイルである、請求項 5の組成物。
- 安定した三量体複合体がスペーサー部分により連結された2つのテトラネクチン三量体形成モジュールを含み、それにより、2つのテトラネクチン三量体形成モジュールの両方をアポリポタンパク質融合タンパク質構築物の一部ではない第3のテトラネクチン三量体形成モジュールとの複合体の形成に加わらせる、請求項 4の組成物。
- テトラネクチン三量体形成モジュールが、ヒトテトラネクチン、マウステトラネクチンおよびヒト、ウシまたはサメ軟骨のC型レクチンからなる群から選択される請求項 1の組成物。
- テトラネクチン三量体形成モジュールが以下の(a)または(b)である、請求項 1の組成物:
(a)アミノ酸配列が配列番号 12のアミノ酸 1〜51によって表されるモジュール;
(b)(a)のアミノ酸配列において、一または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加により(a)のモジュールとは異なっており、かつ、その他のテトラネクチン三量体形成モジュールと安定した三量体複合体を形成することが出来る、モジュール。 - 配列番号 12の配列における50番目のシステイン残基が、セリン残基、
トレオニン残基、またはメチオニン残基により置換されている、請求項 9の組成物。 - テトラネクチン三量体形成モジュールが以下の(a)または(b)である請求項 1の組成物:
(a)アミノ酸配列が、配列番号 13のアミノ酸 1〜58によって表されるモジュール;
(b) (a)のアミノ酸配列において、一または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加により(a)のモジュールとは異なっており、かつ、その他のテトラネクチン三量体形成モジュールと安定した三量体複合体を形成することが出来る、モジュール。 - 安定した三量体複合体が天然アポリポタンパク質 A-Iの半減期の少なくとも2倍の半減期を有する、請求項 4の組成物。
- 該安定した三量体複合体が、キュビリン、メガリン、スカベンジャーレセプタークラスBタイプ1 (SR-B1)、ATP-結合カセット 1 (ABC1)、レクチン:コレステロールアシルトランスフェラーゼ (LCAT)、コレステリル-エステル転移タンパク質 (CETP)、
およびリン脂質転移タンパク質 (PLTP) からなる群から選択されるレセプターまたはタンパク質に結合することが出来る、請求項 4の組成物。 - 三量体複合体が 以下の (a)または(b)のタンパク質を含む請求項 13の組成物:
(a)アミノ酸配列が、配列番号 2、配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7、配列番号 8、配列番号 9、配列番号 10または配列番号 11の配列のいずれかによって表されるタンパク質;
(b) (a)のアミノ酸配列において一または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加によって(a)のタンパク質とは異なっており、該三量体複合体が、天然アポリポタンパク質 A-Iの半減期よりも長い半減期を有するタンパク質。 - 医薬上許容される賦形剤、アジュバント、または添加剤をさらに含む、
請求項 1の組成物。 - 一般式
apo-A-X
を有する、アポリポタンパク質タンパク質構築物、ここで、apo-Aはアポリポタンパク質 A-Iであり、Xはテトラネクチン三量体形成モジュールである。 - apo-A成分とテトラネクチン三量体形成モジュールとの間にスペーサーペプチドをさらに含み、ここでスペーサーペプチドが、GTKVHMK、PGTSGQQPSVGQQ、GTSGQ、PKPSTPPGSS、SGGTSGSTSGTGST、AGSSTGSSTGPGSTTおよびGGSGGAPからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項 16の構築物。
- テトラネクチン三量体形成モジュールが2つのその他のテトラネクチン三量体形成モジュールとの安定した三量体複合体の一部である、請求項 16の構築物。
- 安定した複合体がコイルドコイル構造を含む、請求項 18の構築物。
- コイルドコイル構造が三本鎖αヘリカルコイルドコイルである、請求項 19の構築物。
- 安定した三量体複合体がスペーサー部分により連結された2つのテトラネクチン三量体形成モジュールを含み、それにより2つのテトラネクチン三量体形成モジュールの両方を、アポリポタンパク質融合タンパク質構築物の一部ではない第3のテトラネクチン三量体形成モジュールとの複合体の形成に加わらせる、請求項 18の構築物。
- テトラネクチン三量体形成モジュールがヒトテトラネクチン、マウステトラネクチンおよびヒト、ウシまたはサメ軟骨のC型レクチンからなる群から選択される請求項 18の構築物。
- テトラネクチン三量体形成モジュールが以下の (a)または(b)である請求項 18の構築物:
(a) アミノ酸配列が、配列番号 12のアミノ酸 1〜51によって表されるモジュール;
(b) (a)のアミノ酸配列において一または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加によって(a)のモジュールとは異なっており、かつ、その他のテトラネクチン三量体形成モジュールと安定した三量体複合体を形成することが出来る、モジュール。 - 配列番号 12の配列における50番目のシステイン残基が、セリン残基、
トレオニン残基、またはメチオニン残基により置換されている、請求項 23の構築物。 - テトラネクチン三量体形成モジュールが、以下の (a)または(b)である請求項 18の構築物:
(a)アミノ酸配列が、配列番号 13のアミノ酸 1〜58によって表されるモジュール;
(b)(a)のアミノ酸配列において一または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加によって(a)のモジュールとは異なっており、かつ、その他のテトラネクチン三量体形成モジュールと安定した三量体複合体を形成することが出来る、モジュール。 - 安定した三量体複合体が、天然アポリポタンパク質 A-Iの半減期の少なくとも 3 倍の半減期を有する、請求項 4の組成物。
- アポリポタンパク質 A-Iが以下の(a)または(b)のタンパク質である請求項 1の組成物:
(a)アミノ酸 配列が配列番号15によって表されるヒトアポリポタンパク質 A-I;
(b) (a)のアミノ酸配列において一または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加により(a)のタンパク質とは異なっており、かつ、ヒトアポリポタンパク質 A-Iの脂質結合機能を保持しているタンパク質。 - タンパク質が、配列番号15によって表されるヒトアポリポタンパク質 A-Iの少なくともアミノ酸100-186を含む、請求項 27の組成物。
- タンパク質が、配列番号15によって表されるヒトアポリポタンパク質 A-Iの少なくともアミノ酸25-267を含む、請求項 27の組成物。
- タンパク質が、配列番号15によって表されるヒトアポリポタンパク質 A-Iのアミノ酸番号68-267である、請求項27の組成物。
- テトラネクチン三量体形成モジュールがアポリポタンパク質 A-IのN-末端またはC-末端アミノ酸に共有結合により連結されている、請求項 16の構築物。
- 安定した三量体複合体が天然アポリポタンパク質 A-Iの半減期の少なくとも 2倍の半減期を有する、請求項 18の構築物。
- 安定した三量体複合体が天然アポリポタンパク質 A-Iの半減期の少なくとも3倍の半減期を有する、請求項 18の構築物。
- アポリポタンパク質 A-Iが、以下の(a)または(b)のタンパク質である請求項 16の構築物:
(a)アミノ酸配列が配列番号15によって表されるヒトアポリポタンパク質 A-I;
(b) (a)のアミノ酸配列において一または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加によって(a)のタンパク質とは異なっており、かつ、ヒトアポリポタンパク質 A-Iの脂質結合機能を保持しているタンパク質。 - タンパク質が、配列番号15によって表されるヒトアポリポタンパク質 A-Iの少なくともアミノ酸 100-186を含む、請求項34の構築物。
- タンパク質が、配列番号15によって表されるヒトアポリポタンパク質 A-Iの少なくともアミノ酸 25-267を含む、請求項 34の構築物。
- タンパク質が、配列番号15によって表されるヒトアポリポタンパク質 A-Iのアミノ酸番号 68-267である、請求項 34の構築物。
- 該安定した三量体複合体が、キュビリン、メガリン、スカベンジャーレセプタークラスBタイプ1 (SR-B1)、ATP-結合カセット 1 (ABC1)、レクチン:コレステロールアシルトランスフェラーゼ (LCAT)、コレステリル-エステル転移タンパク質 (CETP)、
およびリン脂質転移タンパク質 (PLTP) からなる群から選択されるレセプターまたはタンパク質に結合することが出来る、請求項 18の構築物。 - 三量体複合体が以下の (a)または(b)のタンパク質を含む、請求項 38の構築物:
(a)アミノ酸配列が、配列番号 2、配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号7、配列番号 8、配列番号 9、配列番号 10または配列番号 11の配列のいずれかによって表されるタンパク質;
(b) (a)のアミノ酸配列において一または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加によって(a) のタンパク質とは異なっており、かつ、該三量体複合体が、天然アポリポタンパク質 A-Iの半減期より長い半減期を有する、タンパク質。 - 3つのアポリポタンパク質構築物から本質的になり、各構築物が一般式 apo-A-Xを有する三量体複合体であって、ここで、apo-Aが、アポリポタンパク質 A-I、
アポリポタンパク質 A-II、およびアポリポタンパク質 A-IVからなる群から選択されるアポリポタンパク質成分であり、Xがテトラネクチン三量体形成モジュールである、三量体複合体。
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