JP4335315B2 - アスペルギルス属のポルホビリノーゲン合成酵素およびこれをコードする核酸 - Google Patents
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Description
発明の背景
発明の分野
本発明は、アスペルギルス属（Aspergillus）のポルホビリノーゲン合成酵素（porphobilinogen synthase）およびポルホビリノーゲン合成酵素をコードする核酸配列を含んでいる単離核酸断片に関する。本発明はまた、本核酸配列を含んでいる核酸構成体、ベクターおよび宿主細胞、並びにポルホビリノーゲン合成酵素を生産する方法に関する。
関連技術
ヘム、すなわちプロトポルフィリンIXと鉄とのキレート複合体は、ヘムタンパク質の補欠分子族として機能する。プロトポルフィリンIXは、４つのメチル基、２つのビニル基および２つのプロピオン酸基によって置換されたポルフィリン環からなり、鉄を獲得してヘムを形成する。グリシンとスクシニルCoAからのヘムの生合成には、８つの酵素反応が関係している。この経路の２番目の酵素は、２つのアミノレブリン酸の縮合反応を触媒して、ポルホビリノーゲンを形成するポルホビリノーゲン合成酵素（またはアミノレブリン酸脱水酵素）である。ポルホビリノーゲン合成酵素は、ニューロスポラ・クラサ（Neurospora crassa）およびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のヘム生合成経路の律速酵素である。
アポタンパク質からヘムタンパク質への変換は、ヘム生合成経路から供給されるヘムの利用度に依存している。ヘムタンパク質のアポタンパク質型は、ヘムと結合して活性型ヘムタンパク質となる。活性型ヘムタンパク質は、アポタンパク質に比べると、タンパク質分解に対してより安定な構造を獲得する。微生物が生産するヘムの量が、アポタンパク質の生産量に比較して少ない場合は、アポタンパク質が集積し、タンパク質分解を受け、活性ヘムタンパク質の収量が低下する。
この問題を克服するために、Jensenは、ヘムまたはヘム含有物質を発酵培地に加えることによって、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）が生産するペルオキシダーゼの収量が有意に増加することを示した（WO 93/19195）。発酵培地へのヘムの補給は、ヘムタンパク質の収量を有意に改善するが、大規模に実行するのは適切ではなく、費用がかさみ、そして困難である。
サッカロミセス・セレビシエのポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子のクローニングと発現が開示されている（Labbe-Bois and Labbe,1990, In:Dailey.H.A.ed.,Biosynthesis of Heme and Chrorophylls,McGraw-Hill,Inc.,New York,page258）。
本発明の目的は、新しいポルホビリノーゲン合成酵素およびこれをコードする遺伝子を提供することである。
発明の概要
本発明は、アスペルギルス属から得られる、実質上純粋なポルホビリノーゲン合成酵素および、アスペルギルス属のポルホビリノーゲン合成酵素をコードする核酸配列を含んでいる単離核酸断片に関する。本発明はさらに、本発明の核酸断片を含んでいる核酸構成体、ベクターおよび組換え宿主細胞、並びにポルホビリノーゲン合成酵素を生産する方法を提供する。
図の簡単な説明
図１は、プラスミドpAJ005-1の制限酵素地図を示す。
図２は、アスペルギルス・オリゼのポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す（各配列番号１および２）。CAATボックスを下線で示し、そしてTATAボックスを四角で囲む。推定イントロンを点線下線で示し、そして推定のジンクフィンガー領域（zinc finger domain）を破線で示す。ライブラリーのプローブを太線下線で示し、そして活性リジンを丸で囲む。
図３は、B.サブチリス、大腸菌、ヒト、エンドウ、ラット、ホウレンソウ、酵母およびアスペルギルス・オリゼのポルホビリノーゲン合成酵素の推定アミノ酸配列のアライメントを示す（各配列番号22,20,18,21,19,23,17,2）。
図４は、プラスミドpAJ023の制限酵素地図を示す。
図５は、プラスミドpJVi9の作成を示す。
図６は、プラスミドpJeRS6の制限酵素地図を示す。
図７は、プラスミドpJRoC50の制限酵素地図を示す。
発明の詳細な説明
前述したとおり、本発明は、アスペルギルス属の株から得られるポルホビリノーゲン合成酵素、限定はしないが、例えばアスペルギルス・フェチダス（A.foetidus）、アスペルギルス・ジャポニカス（A.japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（A.nidulans）、アスペルギルス・ニガー（A.niger）およびアスペルギルス・オリゼの菌株から得られるポルホビリノーゲン合成酵素に関する。これらの種の菌株は、いくつかの培養コレクション、例えば、the American Type Culture Collection（ATCC）, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSM）, Centraalbureau Voor Schimmelcultures（CBS）, International Mycological Institute（IMI）, Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center（NRRL）,およびInstitute for Fermentation in Osaka, Japan（IFO）から容易に入手できる。
好ましい実施例では、本発明は、アスペルギルス属から得られるポルホビリノーゲン合成酵素に関する。より好ましい実施例では、本発明は、アスペルギルス・オリゼから得られるポルホビリノーゲン合成酵素に関する。最も好ましい実施例では、アスペルギルス・オリゼIFO4177またはその変異株から得られるポルホビリノーゲン合成酵素、例えば配列番号２のアミノ酸配列を有するポルホビリノーゲン合成酵素に関する。
本発明はまた、高ストリンジェント条件（すなわち5X SSPE, 0.3% SDS, 200μg/ml分断変性サーモン***DNA,および50％ホルムアミド中で、45℃でプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションする）で配列番号１の核酸配列にハイブリダイズするプローブによって、同条件でハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされるポルホビリノーゲン合成酵素に関する。この遺伝子またはこれに基づくオリゴヌクレオチドは、アスペルギルス属のいずれかの種の相同遺伝子を単離するために、サザンハイブリダイゼーションのプローブとして用いることができる。特にこれらのプローブは、注目する種の相当するポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子を同定および単離するために、その種のゲノムまたはcDNAをハイブリダイゼーションして、続いて標準的なサザンブロットを行う際に用いることができる。PCR用の縮重プライマー（オリゴヌクレオチド）を用いて、ゲノムDNAまたはcDNA部分から、ポルホビリノーゲン合成酵素特異的な遺伝子領域を増幅することができる。
公に入手できるアスペルギルス属の菌株を用いて、本例に記載された方法によって、本明細書に明記した例以外の起源からポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子を同定および単離することができる。
本発明の目的において、「から得られる」という用語は、特定の起源、例えばアスペルギルス属の菌株、または、その起源のポルホビリノーゲン合成酵素をコードする遺伝子が挿入された細胞によって、ポルホビリノーゲン合成酵素が生産されることを意味する。
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約50％、好ましくは約55％、より好ましくは約60％、より好ましくは約65％、より好ましくは約70％、より好ましくは約75％、より好ましくは約80％、そして最も好ましくは約85％、さらに最も好ましくは約90％、さらに最も好ましくは約95％の相同性を有し、且つ本明細書に記載したポルホビリノーゲン合成酵素と質的に同じ活性を保持するポルホビリノーゲン合成酵素の変異体も含んでいる。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列に比べて３アミノ酸、好ましくは２アミノ酸、そしてより好ましくは１アミノ酸相違するアミノ酸配列を有するポルホビリノーゲン合成酵素の変異体にも向けられている。各相違は、アミノ酸の挿入もしくは除去、または異なるアミノ酸によるアミノ酸残基置換であってよい。上に定義したカテゴリーに含まれる有用な変異体には、例えば、タンパク質活性に有意な影響を与えない保存的なアミノ酸置換が成された変異体が含まれる。保存的置換とは、あるクラスのアミノ酸が、それと同じクラスの他のいずれかのアミノ酸によって置換されてもよいことを意味する。例えば、非極性脂肪性残基、Ala、Val、LeuおよびIleは交換可能で、塩基性残基LysおよびArg、または酸性残基AspおよびGluも交換して良い。同様に、SerおよびThrは互いに保存的置換でき、AsnおよびGlnも同様である。
本発明のポルホビリノーゲン合成酵素の物理化学的性質を、当業界に周知な種々な技法、限定はしないが、例えばSDS-PAGE、等電点電気泳動、および免疫交差同定テスト（cross-reaction immunoidentity test）を用いて決定してよい。本発明のポルホビリノーゲン合成酵素を当業界に既知の方法によって測定してよい。
本発明のポルホビリノーゲン合成酵素を、当業界に既知な種々な方法、限定はしないが、例えばクロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、調製的等電点電気泳動）、分画的溶解（differential solubility）（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）または抽出によって精製してよい（例えば、Protein Purification, J.-C.Janson and Lars Ryden,eds.,VCH Publishers,New York,1989を参照する）。ここで定義するように、「実質上純粋な」ポルホビリノーゲン合成酵素とは、ポルホビリノーゲン合成酵素でない他のタンパク質が本質的に含まれていないポルホビリノーゲン合成酵素のことで、例えば、SDS-PAGEで決定した場合、少なくとも純度約20％、好ましくは純度約40％、より好ましくは純度約60％、さらに好ましくは純度約80％、最も好ましくは純度約90％、そしてさらに最も好ましくは少なくとも純度約95％の場合である。
本発明はまた、本発明のポルホビリノーゲン合成酵素をコードする核酸配列を含んでいる核酸断片、および本発明の核酸断片を含んでいる核酸構成体に関する。
好ましい実施例では、本核酸配列は、アスペルギルス属から得られるポルホビリノーゲン合成酵素をコードする。より好ましい実施例では、本核酸配列は、アスペルギルス・オリゼから得られるポルホビリノーゲン合成酵素をコードする。最も好ましい実施例では、本核酸配列は、アスペルギルス・オリゼIFO4177から得られるポルホビリノーゲン合成酵素をコードしていて、例えば配列番号１の核酸配列である。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列を有するポルホビリノーゲン合成酵素をコードしていて、且つ遺伝子コードの縮重のために配列番号１と異なる核酸配列を含んでいる。本発明の核酸配列は、ここに記載されたゲノム配列、並びにそれに相当するcDNAおよびRNA配列を含み、そしてここで使われている「核酸配列」という用語は、合成DNAを含む全てのこの様な種類の配列を意味している。
本発明はまた、本発明の核酸断片を含んでいる核酸構成体に関する。一般に「核酸構成体」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかで、天然の遺伝子から単離される核酸分子か、または、自然界には存在しない様式に結合および並置された核酸部分を有する様に修飾された核酸分子を意味する。好ましい実施例では、本核酸構成体は、適当な発現宿主において、ポルホビリノーゲン合成酵素の発現を指令することができる調節領域に作用可能に連結されている。
本発明はまた、本発明の核酸構成体を含んでいる組換えベクターを提供する。好ましい実施例では、核酸配列はプロモーター配列に作用可能に連結されている。別の好ましい実施例では、さらに本発明のベクターは、転写停止シグナルおよび／または選択マーカーを含んでいる。
本発明の組換えベクターは、アスペルギルス属の活性型のポルホビリノーゲン合成酵素を遺伝子発現させるために有用である。有用なベクターは、ベクターが宿主細胞ゲノムに安定に組込まれる様にするエレメントか、またはベクターが宿主細胞のゲノムとは独立に宿主細胞中で自律複製できる様にするエレメント、および好ましくは形質転換された宿主細胞を簡単に選択できる様にする１つ以上の表現型マーカーを含んでいる。ベクターはまた、プロモーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルなどの調節配列、および任意に選択マーカーまたは種々のアクチベーター配列もしくはリプレッサー配列を含んでもよい。発現されたタンパク質が分泌される様にするために、シグナル配列をコードする核酸を、本遺伝子のコード配列の前に挿入してもよい。調節配列の指令下に発現させるために、本発明に用いるポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子を調節配列に作用可能に連結して、この様にして調節配列に合致する条件下にコード配列を発現させる。
本発明の核酸構成体を保持するベクターは、組換えDNA技法で都合よく操作できるいかなるベクターであってもよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターを導入する宿主細胞に依存する。ベクターは、自律複製するベクター、すなわち染色体外に存在し、染色体複製から独立して複製するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であってよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入した場合、宿主細胞ゲノムに組込まれ、そして組込まれた染色体と共に複製されるベクターであってもよい。ベクター系は、単一のベクターもしくはプラスミドであるか、または、合計するとゲノムに組み込まれるべき全DNAを有する２つ以上のベクターもしくはプラスミドであってもよい。
ベクターにおいては、DNA配列は、適当なプロモータ配列に作用可能に連結されるべきである。このプロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示すいかなるDNA配列でもよく、そして宿主細胞に固有であるかまたは異種性であるタンパク質をコードする遺伝子から得ることができる。本発明の核酸構成体の転写を指令する適当なプロモーターは、特に細菌宿主においては、例えば大腸菌のlacオペロンのプロモーター、ストレプトミセス・コエリコロ（Streptomyces coelicolor）のアガラーゼ遺伝子dagAのプロモーター、バチルス・リシェニフォルミス（B.licheniformis）のαアミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィラス（B.stearothermophilus）のマルトジェニックアミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター、バチルス・アミロリクエフェイシェンス（B.amyloliquefaciens）のαアミラーゼ遺伝子（amyQ）のプロモーター、バチルス・サブチリス（B.subtilis）のxylAおよびxylB遺伝子のプロモーター、原核生物のβラクタマーゼのプロモーター（Villa-Kamaroff et al.1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA75,3727-3731）またはtacプロモーター（DeBoer et al.1983,Proceedings of the National Academy of Sciences USA80,21-25）である。さらにプロモーターは、”Useful proteins from recombinant bacteria”in Scientific American,1980,242,74-94;およびSambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d ed.Cold Spring Harbor,New York,1989に記載されている。酵母宿主では、有用なプロモーターは、eno-1プロモーターである。真菌宿主では、転写のために有用なプロモーターは、例えばアスペルギルス・オリゼのTAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ（Rhizomucormiehei）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性αアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸に安定なαアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーもしくはアスペルギルス・アワモリ（A.awamori）のグルコアミラーゼ（glaA）、リゾムコール・ミーヘイのリパーゼ、アスペルギルス・オリゼのアルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼのトリオースリン酸イソメラーゼ、またはアスペルギルス・ニデュランスのアセトアミダーゼをコードする遺伝子から得られるプロモーターである。特に好ましいプロモーターは、TAKAアミラーゼ、NA2-tpi、およびglaAのプロモーターである。
本発明のベクターはまた、適当な転写ターミネーター、および真核生物ではポリアデニル化配列を含んでもよく、これらは、本発明のポルホビリノーゲン合成酵素をコードするDNA配列に作用可能に連結される。停止配列およびポリアデニル化配列は、プロモーターの場合と同じ起源から得ることができる。ベクターはさらに、ベクターが該当の宿主細胞中で複製できる様にするDNA配列を含んでもよい。その様な配列の例は、プラスミドpUC19,pACYC177,pUB110,pE194,pAMB1およびpIJ702の複製起点である。
本発明のベクターは、好ましくは、形質転換細胞を容易に選択できる様にする１つ以上の選択マーカーを有する。選択マーカーは、殺生物剤耐性、ウイルス耐性、重金属耐性、および原栄養体から栄養要求体への変換などを付与する生産物の遺伝子である。選択マーカーは、限定しないが、amdS, pyrG, argB, niaD, sC, trpC, barおよびhygBの群中から選択してよい。アスペルギルス属の細胞で用いるには、アスペルギルス・ニデュランスまたはアスペルギルス・オリゼのamdSおよびpyrGマーカー、並びにストレプトミセス・ハイグロスコピカス（S.hygroscopicus）のbarマーカーが好ましい。さらに、WO91/17243に記載のように、選択マーカーが別のベクター中にあり、同時形質転換することによって選択してもよい。
好ましくは、本発明のベクターはまた、シグナルペプチドのコード領域も含み、コードされているアミノ酸配列は本ヘム生合成酵素のアミノ末端に連結されて、ポルホビリノーゲン合成酵素を特定の細胞内部位に局在化できる様にする。シグナルペプチドのコード領域は、ポルホビリノーゲン合成酵素をコードする第一の核酸配列に固有であってもよいし、または外来の起源から得てもよい。第一の核酸配列のコード配列の５’末端は、局在化しているポルホビリノーゲン合成酵素をコードするコード領域部分に翻訳枠内で天然に連結されているシグナルペプチドのコード領域を、元々含んでいてもよい。あるいはこのコード配列の５’末端は、局在化しているポルホビリノーゲン合成酵素をコードするコード配列部分に対して外来的であるシグナルペプチドのコード領域をコードする核酸配列を含んでもよい。シグナルペプチドのコード領域は、ニューロスポラ・クラサのATPase遺伝子（Viebrock et al,,1982,EMBO Journal 1,565-571）またはサッカロミセス・セレビシエのチトクロームｃペルオキシダーゼ遺伝子（Kaput et al.,1982,Journal of Biological Chemistry257,15054-15058）から得ることができる。しかし本発明においては、選択した糸状真菌宿主においてポルホビリノーゲン合成酵素を局在化できる様にするいかなるシグナルペプチドのコード領域を用いてもよい。
細胞破壊をしないで発現させたポルホビリノーゲン合成酵素を得るために、そして発現させたポルホビリノーゲン合成酵素の細胞内での潜在的な分解量を最小限にするために、ポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子が発現すると、生産物が細胞外に分泌されることが好ましい。この目的で、本発明のポルホビリノーゲン合成酵素は、発現されたタンパク質が培地中へ分泌される様にするプレ領域を含んでよい。このプレ領域は、本発明のポルホビリノーゲン合成酵素に固有であってもよいし、または、異なるプレ領域もしくはシグナル配列を用いて置換されてもよく、各プレ領域をコードするDNA配列によって都合よく置換することができる。プレ領域は、例えば、アスペルギルス属の種のグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝子、バチルス属の種のアミラーゼ遺伝子、リゾムコール・ミーヘイのリパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエのα因子遺伝子、または子ウシのプレプロキモシン遺伝子から得ることができる。特に、アスペルギルス・オリゼのTAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性アミラーゼ、バチルス属NCIB11837のマルトジェニックアミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラスのαアミラーゼ、またはバチルス・リシェニフォルミスのサブチリシンのプレ領域が好ましい。真菌宿主において有効なシグナル配列は、アスペルギルス・オリゼのTAKAアミラーゼのシグナル、リゾムコール・ミーヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼのシグナール、またはリゾムコール・ミーヘイのリパーゼのシグナルである。
本発明の核酸構成体、プロモーター、ターミネーターおよびその他のエレメントを連結する方法、および、それらを複製に必要な情報を有する適切なベクターに挿入する方法は、同業者に周知である（例えば、前記Sambrook et al.を参照する）。
本発明はまた、本発明の核酸構成体または発現ベクターを含んでいる宿主細胞に関し、これは、本発明のポルホビリノーゲン合成酵素の組換え体の生産において有利に用いられる。本発明の核酸構成体を宿主細胞の染色体に組込むことによって、都合よくその細胞を形質転換できる。この配列は細胞内で安定に保持される可能性が高いので、一般的には、この組込みは有益であると思われる。この構成体の宿主染色体への組込みは、通常の方法、例えば相同または非相同組換えによって達成されるだろう。あるいは、種々のタイプの宿主細胞に関して、以下に記載する発現ベクターによって細胞を形質転換できる。
宿主細胞およびベクターの選択は、ポルホビリノーゲン合成酵素およびその起源に大きく依存する。宿主細胞は、原核生物細胞、例えば細菌細胞から選択してよい。適当な細菌の例は、バチルス・サブチリス、バチルス・リシェニフォルミス、バチルス・レンタス（B.lentus）、バチルス・ブレビス（B.brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・アルカロフィラス（B.alkalophilus）、バチルス・アミロリクエフェイシェンス、バチルス・コアグランス（B.coagulans）、バチルス・シルクランス（B.circulans）、バチルス・ラウタス（B.lautus）、バチルス・メガテリウム（B.megaterium）、バチルス・チューリンゲネシス（B.thuringiensis）、または、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）もしくはストレプトミセス・ムリヌス（S.murinus）などのグラム陽性細菌か、あるいは大腸菌などのグラム陰性細菌である。細菌の形質転換は、例えば、周知のプロトプラスト形質転換によるか、またはコンピテント細胞を利用して行うことができる。
宿主細胞は、好ましくは真核生物、例えば哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞であるか、または好ましくは酵母および糸状真菌を含む真菌細胞である。例えば、有用な哺乳類細胞にはCHO細胞またはCOS細胞がある。酵母宿主細胞は、サッカロミセス属またはシゾサッカロミセス属の種、例えばサッカロミセス・セレビシエから選択してよい。有用な糸状真菌は、アスペルギルス属の種、例えばアスペルギルス・オリゼまたはアスペルギルス・ニガーから選択してよい。あるいはフサリウム（Fusarium）属の種の菌株、例えばフサリウム・オキシスポラム（F.oxysporum）またはフサリウム・グラミネラム（F.graminearum）を宿主細胞として用いてもよい。真菌細胞を、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生からなる周知の方法によって形質転換することができる。アスペルギルス属の宿主細胞の形質転換に適した方法は、EP 238 023に記載されている。フサリウム属の種を形質転換するのに適した方法は、Malardier et al.1989,Gene 78,147-156またはUS Serial No.08/269449に記載されている。
特に好ましい実施例では、ポルホビリノーゲン合成酵素の遺伝子発現は、アスペルギルス属などの真菌宿主細胞において達成される。ポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子を、好ましくはアスペルギルス・オリゼのTAKAアミラーゼのプロモーターまたはアスペルギルス・ニガーの中性アミラーゼNA2のプロモーター、および選択マーカーとしてamdSまたはpyrGを有するプラスミド内に連結する。あるいは、選択マーカーは別のプラスミド上にあって、同時形質転換において用いてもよい。これらのプラスミドを用いて、Yelton et al.1984,Proceedings of the National Academy Sciences USA 81,1470-1474に記載された方法に従って、アスペルギルス属の種の宿主細胞、例えばアスペルギルス・オリゼまたはアスペルギルス・ニガーを形質転換する。
本発明はまた、本発明のポルホビリノーゲン合成酵素を生産する方法で、（ａ）ポルホビリノーゲン合成酵素を生産させるために栄養培地中でアスペルギルス属の菌株を培養し、そして（ｂ）ポルホビリノーゲン合成酵素を回収することを含んでいる方法に関する。
本発明はまた、本発明のポルホビリノーゲン合成酵素を組換えによって生産する方法で、（ａ）酵素の生産を誘導する条件下で、ポルホビリノーゲン合成酵素をコードする核酸配列を含んでいる核酸構成体を含んでいる宿主細胞を培養し、そして（ｂ）ポルホビリノーゲン合成酵素を回収することを含んでいる方法に関する。発現系が、ポルホビリノーゲン合成酵素を発酵培地に分泌する場合には、この酵素を培地から直接回収できる。組換えポルホビリノーゲン合成酵素が分泌されない場合には、これを細胞溶解物から回収する。
本発明のポルホビリノーゲン合成酵素を発現または単離するために、当業界に既知のいずれかの細胞培養法を用いることができる。例えば、培養とは、適切な培地中で、ポルホビリノーゲン合成酵素を発現または単離することができる条件下で実施するもので、振とうフラスコ培養、実験室用または工業用発酵槽中での小規模または大規模発酵（例えば連続式、バッチ式、給送バッチ（fed-batch）式、または固相式による発酵）を含んでいる。当業界に既知の方法を用いて、炭素源および窒素源、並びに無機塩を含んでいる適切な栄養培地中で発酵を行う（例えばBennet,J.W.and LaSure,L.（eds）,More Gene Manipulations in Fungi,Academic Press,CA,1991を参照する）。適切な培地は、企業から入手するか、または公表されている組成に従い調製することもできる（例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログを参照する）。
前記の方法で生産したポルホビリノーゲン合成酵素を、通常の方法、限定しないが、例えば遠心、濾過、噴霧乾燥（spray-drying）、蒸発または沈殿によって発酵培地から回収できる。回収したタンパク質をさらに、様々なクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィーなどによって精製できる。
本発明はまた、ポルホビリノーゲン合成酵素を用いる方法にも向けられている。
本発明のポルホビリノーゲン合成酵素は、ポルホビリノーゲン合成酵素がヘム生産の律速段階である宿主細胞において、ポルホビリノーゲン合成酵素をコードする核酸配列をこの宿主細胞で過剰発現させることによって、この宿主細胞が生産するヘムタンパク質の収量を増加させることに用いることができる。この方法は、（ａ）ポルホビリノーゲン合成酵素の発現を指令することができる調節領域に作用可能に連結されている、ポルホビリノーゲン合成酵素をコードする核酸配列の一つ以上のコピーを、ヘムタンパク質を生産することができる宿主細胞に導入し；（ｂ）ヘムタンパク質およびポルホビリノーゲン合成酵素の生産に適する栄養培地中で細胞を培養し；そして（ｃ）この細胞の栄養培地からヘムタンパク質を回収することを含んでいる。
本発明を、次の実施例によってさらに記載するが、これを本発明の範囲を限定するように解釈するべきではない。
実施例
例１：アスペルギルス・オリゼ株A1560のゲノムDNAの抽出
アスペルギルス・オリゼ株A1560（IFO4177）を0.5%酵母エキス−2%グルコース（YEG）培地25ml中で、24時間、32℃、250回転で増殖させた。次に菌糸体をMiracloth（Calbiochem,La Jolla,CA）を通して濾過することで集菌し、10mMトリス−1mM EDTA（TE）緩衝液25mlを用いて１回洗った。過剰の緩衝液を菌糸体から流し去り、続いて液体窒素で凍結した。凍結した菌糸体を電気コヒーひき器でひいて細粉末にし、これを、使い捨てプラスティック遠心チューブ内で、20mlのTE緩衝液と５mlの20%（w/v）ドデシル硫酸ナトリウムに加えた。混合物を穏やかに数回反転して完全に混合させ、そして等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1v/v/v）によって２回抽出した。3M酢酸ナトリウム溶液を終濃度0.3Mになる様に加え、続いて2.5倍量の氷冷エタノールを加えて核酸を沈殿させた。それから15000gで30分間チューブを遠心することで核酸をペレットにした。ペレットを30分間風乾させて、0.5mlのTE緩衝液に再縣濁した。デオキシリボヌクレアーゼ非混在のリボヌクレアーゼＡを濃度100μg/mlになる様に加えて、この混合液を37℃で30分間放置した。それからプロテアーゼＫを濃度200μg/mlになる様に加えて、この混合液をさらに１時間37℃で放置した。最後に、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1v/v/v）によって混合液を２回抽出し、前述した様に酢酸ナトリウムおよびエタノールによってDNAを沈殿させた。DNAペレットを真空乾燥した後、TE緩衝液に再縣濁して、次の使用まで4℃で保存した。
例２：PCRによるゲノム用hemBプローブの作成
アスペルギルス・オリゼ株のポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子（porphobilinogen synthase gene）hemBの126bpのフランキング断片（Jesper Vind,1994,PhD Dissertation,University of Coperhargen,Copenhargen, Denmark）、ならびに酵母およびヒトのhemBクローンの相同部位（Myers et al.,1987,Journal of Biological Chemistry 262,16822-16829; Wetmur et al.,1986,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 83,7703-7707）のアミノ酸配列に基づいてPCR用の縮重したプライマーを設計した。Applied Biosystems社のモデル394DNA/RNAシンセサイザーを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。センスプライマー5’-GT（AGCT）GC（AGCT）CC（AGCT）（AT）（CG）（AGCT）GA（CT）ATGATGGA-3’（配列番号３）、およびアンチセンスプライマー5’-GC（AG）TC（AGTC）CGT（AG）AA（AGTC）CC（AG）TA-3’（配列番号４）、並びに鋳型としてpJVi60（Vind,1994前述）を用いて、hemB断片をPCRで増幅した。PCR反応液（50μl）は次の成分からなる：10mMトリス塩酸pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01%（w/v）ゼラチン,各200μMのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP,500ngのpJVi60,および各50pmolの前記PCR用プライマー。反応液を95℃で３分間加熱した後、80℃まで冷却した。それからTaqポリメラーゼ５単位を加えた。反応は、Perkin-Elmer社の9600サーマルサイクラーによって、95℃30秒間、45℃１分間、および72℃１分間のサイクルを35サイクル行った。最終サイクル後に、反応液を72℃で５分間放置した。予測したhemBの126bpのPCR産物を、pCRIIベクターにクローン化して、プラスミドpAJ005-1（図１）を作成した。
例３：アスペルギルス・オリゼ株A1560のDNAライブラリーの作成およびポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子（hemB）クローンの同定
アスペルギルス・オリゼ株A1560のゲノムDNAライブラリーを、取扱い説明書に従って、バクテリオファージクローニングベクターλZipLox（Life Technologies,Gaithersburg,MD）を用いて作成した。プレーティングおよび組換えバクテリオファージの精製用の宿主として、大腸菌Y1090ZL細胞を使用し、各pZL1-hemAクローンの取り出し用の宿主として、大腸菌DH10Bzipを使用した。例１の記載どおりに細胞から調製した総DNAをTsp509Iによって部分切断し、1%アガロースゲル上で、50mMトリス−50mMホウ酸塩−1mMEDTA2ナトリウム塩（TBE）緩衝液を用いてサイズ分画した。４−７kbのサイズ範囲に移動したDNA断片を切りだし、Prep-a-Gene試薬（BioRad Laboratories,Hercules,CA）を使ってゲルから抽出した。EcoRIで切断した後に脱リン酸化したλZipLoxベクター用アームを、抽出したDNA断片に連結した。その連結混合液を、市販のパッケージング抽出液（Stratagene,La Jolla,CA）を用いてパッケージングした。パッケージングされたDNAライブラリーをプレーティングし、大腸菌Y1090ZL細胞中で増幅させた。増幅前のゲノムライブラリーは1X 106pfu/mlであった。
約8X 104プラークのバクテリオファージDNAを、円形のNytran Plus膜（Schleicher & Schuell,Keene, NH）２枚に転写し、Mertz and Rashtchian（1994,Analytical Biochemistry 221,160-165）の方法に従い、pAJ005-1からPCR増幅して、32Ｐ標識したhemB断片をプローブにしてスクリーニングした。増幅反応液（50μl）は次の成分を含む：10mMトリス塩酸pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01%（w/v）ゼラチン,各0.04mMのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP, ５μlの32P-dCTP（3000Ci/mmole,3.3μM; Amersham,Arlington Heights,IL）,各50pmolのセンスプライマー5’-GTGGCTCCGAGTGATAT-3’（配列番号５）およびアンチセンスプライマー5’-GCATCGCGAAAAGGACCG-3’（配列番号６）。反応液を95℃で３分間加熱した後、Taqポリメラーゼ５単位を加えた。反応は、Perkin-Elmer社のサーマルサイクラーによって、95℃１分間、55℃１分間、および72℃１分間のサイクルを30サイクル行った。反応溶液をセファデックスＧ50カラム（Pharmacia,Alameda,CA）に通して未反応ヌクレオチドを除き、その後変性させ、ハイブリダイゼーション緩衝液に加えた。変性プローブ（106cpm/ml）をハイブリダイゼーション緩衝液に加え、プレハイブリダイズした膜と一緒にして一晩放置した。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、5X SSC, 50mMリン酸ナトリウムpH7, 5Xデンハルト溶液,0.1%（w/v）SDS, 5mM EDTA pH8, 10μg/ml変性サーモン***DNAおよび50％ホルムアミド中で、42℃で行った。その膜を、42℃で15分間、0.1X SSC, 0.1% SDSで４回洗った。陽性シグナルを示す１次プラークを、２次スクリーニングにかけ、取り扱い説明書に従って精製した。取り扱い説明書に従って、陽性シグナルを示す10個のゲノムクローンを、pZL誘導体としてλZipLoxベクターから切り出して（Bethesda Research Laboratories,Inc.,Bethesda, MD）、そしてHattori and Sakaki（1986,Analytical Biochemistry 152,232-237）の方法に従って配列決定した。各pZL誘導体を、pAJ007-1からpAJ007-10と命名した。制限酵素マッピングから、3.7kbのゲノム断片を有する大腸菌DH5αのpAJ007-6クローンをさらに解析した。
例４：ポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子（hemB）の特徴
例３の大腸菌DH5αpAJ007-6のDNA配列を、例３の方法に従って決定した。クローン化したアスペルギルス・オリゼ株A1560のhemB遺伝子のヌクレオチド配列は、図２（配列番号１）に示すとおり、1308ヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有し、図２（配列番号２）に示すとおり、374アミノ酸からなるポリペプチドをコードして、予想分子量は40kDaであることが判明した。文献（Unkles,1992,Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi,Chapter2, J.R.Kinghorn and G.Turner,editors,Blackie Academic and Professional Publications）から予測されるように、このヌクレオチド配列には、一つの48bpの推定イントロンがあり、このイントロンはスプライシング部位の共通配列によって挟まれていて、そして内部共通配列を含んでいる。3’スプライシング部位（TAG）は、開始Metの下流254bpに位置しており、5’スプライシング部位（GTCCGC）は、3’スプライシング部位の上流46bpに位置して、そして内部共通配列（TCTAAC）は、5’スプライシング部位の下流30bpに位置している。5’非翻訳領域には、-377および-233の位置に２つのCAATモチーフがあり、転写調節において重要な働きをすると思われる（Gurr et al.1987前出）。さらに、3’非翻訳領域には（-117,-208,-650）、いくつかのTATA様ボックスが推定された。植物以外の生物では、hemB産物は細胞質性であるので、予想通り、hemBのＮ末端にはリーダー配列がないようである（Bottemley and Muller-Eberhard,1988,Seminars in Hematology 25,282-302）。
アスペルギルス・オリゼのhemB遺伝子のアミノ酸配列（配列番号２）と、他のhemB遺伝子のアミノ酸配列とのアライメントを図３に示す。アスペルギルス・オリゼのhemBのアミノ酸配列に対して、酵母（配列番号17;Myers et al.,1987前出）、ヒト（配列番号18;Wetmur et al.,1986前出）、ラット（配列番号19 ;Bishop et al.,1989,Nucleic Acids Research 14,10115）および大腸菌（配列番号20 ;Li et al.,2989,Gene 75,177-184）のhemBの推定アミノ酸配列は、各々63％、55％、55％および40％の同一性を有する。エンドウ（配列番号21;Bsese et al.,1991,Journal of Biological Chemistry 266,17060-17066）、バチルス・サブチリス（配列番号22;Hansson et al.,1991,Journal of Bacteriology 173,2590-2599）およびホウレンソウ（配列番号23;Scharmburg and Schneider-Poetsch,1991,EMBL Data Library）のhemBの推定アミノ酸配列との相同性はより低い（各同一性40％、39％および33％）。しかし、エンドウおよびホウレンソウのhemBの両アミノ酸配列には、Ｎ末端にクロロプラストシグナル配列があるので、これらの成熟型ポリペプチドをアライメントすれば、アスペルギルス・オリゼのhemBのアミノ酸配列に対する相同性は、有意に増加するだろう。これらのアライメントに基づくと、アスペルギルス・オリゼのhemB産物の活性リシン部位は、アミノ酸残基299に位置し（Jaffe,1995, Journal of Bioenergetics and Biomembranes 27,169-179）、そしてBerg,1986,Nature319,264-265によって予想された保存性のジンクフィンガー様ドメインは、アミノ酸残基166-180に位置している。ジンクフィンガーは、Zn2+と結合することで、活性部位のスルフヒドリル基の酸化を防ぐことが示唆されている（Jaffe,1995前出）。植物のhemBの相当するドメインは、Zn2+よりMg2+と結合すると提唱されている（Bsese et al.,1991前出）。興味深いことに、hemBのフィンガードメインの最初の残基は、Thr（位置166）であり、植物のこの金属結合ドメインのこの位置においても保存されている。しかし、hemBのジンクフィンガードメインの残りの位置は、保存されている。
例５：プラスミドpAJ023の作成
PCR増幅したアスペルギルス・オリゼのhemAのコード領域を、アスペルギルス・オリゼの発現ベクターpBANe6にサブクローニングして、プラスミドpAJ023を作成した（図４）。pBANe6へのクローン化を容易にするために、増幅産物の5’末端にSwaIそして3’末端にPacIの制限部位を有する様に設計した。増幅反応液（50μl）は次の成分からなる：10mMトリス塩酸pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01%（w/v）ゼラチン,各200μMのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP, 200ngのpAJ007-6のDNA,および各50pmolの以下のプライマー：
PBG10およびPBG11Aの下線領域は、各々SwaIおよびPacIの制限部位配列を示す。反応液を95℃３分間加熱した後、80℃まで冷却し、それからPWO（BM）ポリメラーゼ５単位を加えた。反応は、Perkin-Elmer社の9600サーマルサイクラーによって、95℃30秒間、57℃１分間、および72℃１分間のサイクルを30サイクル行った。最終サイクル後に、72℃で５分間放置した。最終PCR産物をゲルで精製して、SwaIおよびPacIによって切断してから、SwaIおよびPacIによって切断したベクターpBANe6に連結して、pAJ023を作成した。
例６：アスペルギルス・オリゼ株JRoC50.3.18Aの作成
次の様にしてプラスミドpJRoC50を含んでいるアスペルギルス・オリゼ株JRoC50.3.18Aを作成した。コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）IFO8371のペルオキシダーゼのcDNA断片をPCRによって調製した。コプリヌス・マクロルヒザス（Coprinus macrorhizus）のペルオキシダーゼのアミノ酸配列（Baunsgaard et al.1993,European Journal of Biochemistry 213,605-611）に基づいて作成した、以下に示す特異的オリゴヌクレオチドプライマー（Saiki et al.1988,Science 239,487-491）を用いた：
Gene Amp Kitおよび装置（Perkin Elmer Centus,Norwalk,CT）を用いて、取り扱い説明書に従ってPCRを行った。ただし、（コプリヌス・シネレウス株IFO8371から得たmRNAから調製した）cDNAの第一ストランドへのハイブリダイゼーョンをより良くするために、最初の３サイクルは28℃で行い、続いて65℃で30サイクルPCR反応させた。
プライマーを次の組み合わせで用いた：１および２；３および４；５および７；６および７；１および４；そして３および７。PCR断片の5’末端にEcoRI部位、そして3’末端にBamHI部位を付加して伸長した。1%アガロース/TBEゲルを用いて分析したところ、全反応において期待どおりのサイズのバンドが見つかった。それらのバンドがペルオキシダーゼ特異的配列に相当することを確認するために、このゲルについて、プライマー３とプライマー４との間に位置する、次の配列のオリゴヌクレオチドをプローブにしてサザンブロットを行った：
このプローブが、約130bp, 420bp, 540bpおよび240bpのバンドにハイブリダイズすることがわかり、観察されたDNAバンドがペルオキシダーゼの配列に相当することが確認された。
種々のPCR反応で得たDNAをEcoRIおよびBamHIで切断して、プラスミドpUC19（New England Biolabs,Beverly,MA）にクローン化した。適格なPCR断片を含むコロニーを、前記オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号16）を用いたハイブリダイゼーションによって同定した。陽性コロニーから得たDNAについて、制限酵素地図を作成し、Sanger et al.の方法で（1977,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74,5463-5467）DNAの部分配列を決定して分析した。プライマー１および４を使って得られたクローンのひとつから得た430bp断片を用いて、コプリヌス・シネレウスcDNAライブラリーを下記のとおりスクリーニングした。
Boel et al.（1984,EMBO Journal 3,1097-1102）およびChirgwin et al（1979,Biochemistry 18,5294-5299）の方法に従い、ペルオキシダーゼ活性の最大時に集菌して、ホモジナイズしたコプリヌス・シネレウス株IFO8371の菌糸体から、総RNAを抽出した。Aviv and Leder（1972,Proceedings of the National Academy of Sciences USA69,1408-1412）の方法で、オリゴ（dT）セルロースの親和性クロマトグラフィーを２回繰り返して、ポリ（Ａ）含有RNAを得た。取り扱い説明書に従ってcDNA合成キット（Invitrogen,San Diego,CA）を用いてcDNAを合成した。コプリヌス・シネレウスのcDNAライブラリーから約50000個の大腸菌組換え体をワットマン540ペーパーフィルターに転写した。Gerger et al.（1979,Nucleic Acids Research 7,2115-2135）の方法で、コロニーを溶解して固定化した。32Ｐ標識した430bpのペルオキシダーゼ特異的プローブを用いて、0.2X SSC-0.1%SDS中で、フィルターをハイブリダイズした。フィルターのハイブリダイゼーションおよび洗浄は65℃で行い、その後増感スクリーンを使って24時間オートラジオグラフィーした。このオートラジオグラフィー後、温度を上げてフィルターを洗浄し直して、増感スクリーンを使って24時間オートラジオグラフィーした。この様にして、50個超の陽性クローンを同定した。標準の方法で（Birnboim and Doly,1979,Nucleic Acids Research7,1513-1523）、ハイブリダイズしたコロニーからプラスミドDNAを少量調製して、挿入されているcDNAのDNA配列を、サンガーのダイデオキシ法で決定した（Sanger et al.1977, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74,5463-5467）。この中からひとつのコロニーを選択し、このベクターをpCiPとした。このベクターをBamHI/XhoIで切断して、ペルオキシダーゼcDNA断片を切りだし、アガロースゲル電気泳動によって分離した後、電気抽出し、連結反応に備えた。このcDNA断片を、BamHI/XhoIで切断したpHD414に連結して、pJVi9を作成した。このベクター内のcDNAは、図５に示す様にアスペルギルス・オリゼのTAKAプロモーターおよびアスペルギルス・ニガーのAMGTM（Novo Nordisk A/S,Bagsvard,Denmark）ターミネーターの転写調節下にある。
コプリヌス・シネレウスのペルオキシダーゼをコードするcDNAを、BamHI/XhoI断片としてプラスミドpJVi9から切りだし、プラスミドpJeRS6（図６）にクローン化してプラスミドpJRoC50（図７）を作成した。このプラスミドは、選択マーカーとしてpyrG、TAKAプロモーターおよびamgターミネーターを含んでいる。
５μgの精製プラスミドpJRoC50を用いて、アスペルギルス・オリゼ株HowB425の形質転換体を、次の点を変更して下記のとおりに作成した。アガーの重層を省略し、最小培地プレート上に直接プロトプラストをまいた。形質転換は、濃度2X 107プロトプラスト/mlのプロトプラストを用いて行った。プロトプラスト100μlを５μgのDNAと混ぜて氷上で30分間放置した。SPTC（40%PEG4000, 0.8Mソルビトール, 0.05MトリスpH8.0, 0.05M CaCl2）1mlを加え、このプロトプラストを34℃で20分間放置した。この形質転換液を、最小培地のプレート上に直接プレーティングした。最小培地（pH6.5）は、1Lあたり6g NaNO3, 0.52g KCl, 1.52g KH2PO4,微量金属液1ml, 1gグルコース, 500mg MgSO4-7H2O, 342.3gスクロースおよび20g Nobleアガーから作成した。微量金属液（1000倍）は、1Lあたり22g ZnSO4-7H2O, 11g H3BO3, 5g MnCl2-4H2O, 5g FeSO4-7H2O, 1.6g CoCl2-5H2O, 1.6g（NH4）6Mo7O24および50g Na4EDTAから作成した。プレートを34℃で５−７日間放置した。形質転換体を、同じ培地のプレートに転写し、37℃で３−５日間放置した。
次の酵素測定法で、66個の形質転換体のペルオキシダーゼ活性を測定した：基質緩衝液［0.1Mリン酸カリウム塩20ml, 0.01%Tween 80 pH7.0, 2,2’-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate）（ABTS）溶液（22mg/ml）250μlおよび30%過酸化水素２μl］180μlを、1:900に希釈した培養上清20μlに加え、すばやくMolecular Devices社のサーモマックスマイクロプレートリーダー（Molecular Devices,Sunnyvale,CA）を用いて、25℃で405nmの吸光を測定した。測定結果を２分間かく拌しながら10秒毎に記録し、SOFT maxプログラム（Molecular Devices,Sunnyvale,CA）を用いて、Vmax値を計算した。1mlあたりのペルオキシダーゼ活性単位（POXU）は、即知量のシネレウス・コプリヌスのペルオキシダーゼを基準として作成した標準曲線から推定した。1 POXUは、0.88mM H2O2, 1.67mM ABTS, 0.1Mリン酸塩pH7.0において、30℃で１分間に1.0μmoleの変換を触媒する酵素量として定義した。前記と同じ条件下で、同じプレート上で胞子を画線培養し、独立したコロニーをひろって、発現レベルが最も高い４つの形質転換体を単離した。
各形質転換体の胞子約5X 106を、1%酵母エキス, 2.5%マルトース, 0.2%尿素および1X MY塩pH6.5を含んだMY25培地25mlに接種し、振とうフラスコで培養して最終評価した。1X MY塩は、1Lあたり2g MgSO4-7H2O, 2g K2PO4, 10g KH2PO4, 2gクエン酸、微量金属液0.5mlおよび10% CaCl2-2H2O 1mlから作成した。微量金属液は、1Lあたり13.9g FeSO4-7H2O, 8.5g MnSO4-H2O, 14.28g ZnSO4-7H2O, 1.63g CuSO4, 0.24g NiCl2-6H2Oおよび3.0gクエン酸から作成した。50mM NaOHで調製した新鮮な10mg/mlの保存液から、ヘミンを終濃度0.01mg/mlになる様に加えた。この振とうフラスコを34℃で７−８日間200回転で培養した。ペルオキシダーゼを最も多く生産する菌体をJRoC50.3.18Aとした。
例７：pAJ023によるアスペルギルス・オリゼJRoC50.3.18Aの形質転換
アスペルギルス・オリゼのhemB遺伝子の過剰発現によってペルオキシダーゼの生産が増加するかどうか決定するために、アスペルギルス・オリゼ株JRoC50.3.18AをpAJ023によって形質転換した。
形質転換は、濃度2X 107プロトプラスト/mlのプロトプラストを用いて行った。プロトプラスト100μlを10μｇのDNAおよび200μlの60%PEG4000-10mM HEPES-10mM CaCl2液と混ぜて、氷上で30分間放置した。SPTC（40%PEG4000, 0.8Mソルビトール, 0.05MトリスpH8.0, 0.05M CaCl2）1mlを加え、このプロトプラストを34℃で20分間放置した。amdSによる形質転換体を選択するために、形質転換液0.25mlを、重層用COVEアガー（0.7%低融点アガーを加えたCOVE培地と同じ）15mlに加えて、COVE形質転換用プレート（1Lあたり0.52g KCl, 0.52g MgSO4-7H2O, 1.52g KH2PO4,例６の微量金属液1ml, 342.3gスクロース,25g Nobleアガー, 1Mアセトアミド10mlおよび3M CsCl 10ml）上にプレーティングした。プレートを室温で５−７日間放置した。形質転換体を、同じ培地のプレートに転写し、37℃で３−５日間放置した。同条件下で同じプレート上で胞子を画線培養し、独立したコロニーをひろい、形質転換体を単離した。
例８：hemBの１次形質転換体によるペルオキシダーゼの生産
総計20個のアスペルギルス・オリゼのhemB形質転換体、および42個の対照形質転換体（アスペルギルス・オリゼのhemBを欠いた発現ベクターによって形質転換したアスペルギルス・オリゼ株JRoC50.3.18A）を、24ウエルプレート上で培養して、例６の記載どおりにペルオキシダーゼの生産を測定した。
ペルオキシダーゼ測定の結果から、測定した全形質転換体において、対照形質転換体に比べてより高いレベルのペルオキシダーゼ活性を示すものがないことが判明した。
微生物の寄託
ブタペスト条約に従い、次の株を、Agricultural Research Service Patent Culture Collection（NRRL）, Northern Regional Research Laboratory, 1815 University Street, Peoria, Illinois 61604, USAに寄託した。
本明細書に記載して請求した発明は、ここに開示した具体例によって範囲を限定されない。なぜなら、この具体例は本発明のいくつかの点を説明することを意図しているからである。全ての相当な具体例は、本発明の範囲に含まれる。実際、本発明の様々な改修は、前記載から当業者にとっては明かであろう。この様な改修も請求の範囲に含まれる。
本明細書に引用した様々な参考の内容を、引用により本明細書に組み込む。
配列表
（１）一般情報
（ii）発明の名称：アスペルギルス属のポルホビリノーゲン合成酵素およびこれをコードする核酸
（iii）配列数：23
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：1807塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号１：
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：375アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：タンパク質
（ｖ）断片型：内部
（xi）配列記載：配列番号２：
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号３：
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号４：
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号５：
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号６：
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：33塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号７：
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：30塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号８：
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：33塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号９：
（２）配列番号10の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号10：
（２）配列番号11の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：28塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号11：
（２）配列番号12の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：26塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号12：
（２）配列番号13の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：21塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号13：
（２）配列番号14の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：22塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号14：
（２）配列番号15の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号15：
（２）配列番号16の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：cDNA
（xi）配列記載：配列番号16：
（２）配列番号17の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：342アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：なし
（xi）配列記載：配列番号17：
（２）配列番号18の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：330アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：なし
（xi）配列記載：配列番号18：
（２）配列番号19の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：330アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：なし
（xi）配列記載：配列番号19：
（２）配列番号20の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：323アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：なし
（xi）配列記載：配列番号20：
（２）配列番号21の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：398アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：なし
（xi）配列記載：配列番号21：
（２）配列番号22の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：323アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：なし
（xi）配列記載：配列番号22：
（２）配列番号23の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：424アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：なし
（xi）配列記載：配列番号23：
発明の分野
本発明は、アスペルギルス属（Aspergillus）のポルホビリノーゲン合成酵素（porphobilinogen synthase）およびポルホビリノーゲン合成酵素をコードする核酸配列を含んでいる単離核酸断片に関する。本発明はまた、本核酸配列を含んでいる核酸構成体、ベクターおよび宿主細胞、並びにポルホビリノーゲン合成酵素を生産する方法に関する。
関連技術
ヘム、すなわちプロトポルフィリンIXと鉄とのキレート複合体は、ヘムタンパク質の補欠分子族として機能する。プロトポルフィリンIXは、４つのメチル基、２つのビニル基および２つのプロピオン酸基によって置換されたポルフィリン環からなり、鉄を獲得してヘムを形成する。グリシンとスクシニルCoAからのヘムの生合成には、８つの酵素反応が関係している。この経路の２番目の酵素は、２つのアミノレブリン酸の縮合反応を触媒して、ポルホビリノーゲンを形成するポルホビリノーゲン合成酵素（またはアミノレブリン酸脱水酵素）である。ポルホビリノーゲン合成酵素は、ニューロスポラ・クラサ（Neurospora crassa）およびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のヘム生合成経路の律速酵素である。
アポタンパク質からヘムタンパク質への変換は、ヘム生合成経路から供給されるヘムの利用度に依存している。ヘムタンパク質のアポタンパク質型は、ヘムと結合して活性型ヘムタンパク質となる。活性型ヘムタンパク質は、アポタンパク質に比べると、タンパク質分解に対してより安定な構造を獲得する。微生物が生産するヘムの量が、アポタンパク質の生産量に比較して少ない場合は、アポタンパク質が集積し、タンパク質分解を受け、活性ヘムタンパク質の収量が低下する。
この問題を克服するために、Jensenは、ヘムまたはヘム含有物質を発酵培地に加えることによって、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）が生産するペルオキシダーゼの収量が有意に増加することを示した（WO 93/19195）。発酵培地へのヘムの補給は、ヘムタンパク質の収量を有意に改善するが、大規模に実行するのは適切ではなく、費用がかさみ、そして困難である。
サッカロミセス・セレビシエのポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子のクローニングと発現が開示されている（Labbe-Bois and Labbe,1990, In:Dailey.H.A.ed.,Biosynthesis of Heme and Chrorophylls,McGraw-Hill,Inc.,New York,page258）。
本発明の目的は、新しいポルホビリノーゲン合成酵素およびこれをコードする遺伝子を提供することである。
発明の概要
本発明は、アスペルギルス属から得られる、実質上純粋なポルホビリノーゲン合成酵素および、アスペルギルス属のポルホビリノーゲン合成酵素をコードする核酸配列を含んでいる単離核酸断片に関する。本発明はさらに、本発明の核酸断片を含んでいる核酸構成体、ベクターおよび組換え宿主細胞、並びにポルホビリノーゲン合成酵素を生産する方法を提供する。
図の簡単な説明
図１は、プラスミドpAJ005-1の制限酵素地図を示す。
図２は、アスペルギルス・オリゼのポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す（各配列番号１および２）。CAATボックスを下線で示し、そしてTATAボックスを四角で囲む。推定イントロンを点線下線で示し、そして推定のジンクフィンガー領域（zinc finger domain）を破線で示す。ライブラリーのプローブを太線下線で示し、そして活性リジンを丸で囲む。
図３は、B.サブチリス、大腸菌、ヒト、エンドウ、ラット、ホウレンソウ、酵母およびアスペルギルス・オリゼのポルホビリノーゲン合成酵素の推定アミノ酸配列のアライメントを示す（各配列番号22,20,18,21,19,23,17,2）。
図４は、プラスミドpAJ023の制限酵素地図を示す。
図５は、プラスミドpJVi9の作成を示す。
図６は、プラスミドpJeRS6の制限酵素地図を示す。
図７は、プラスミドpJRoC50の制限酵素地図を示す。
発明の詳細な説明
前述したとおり、本発明は、アスペルギルス属の株から得られるポルホビリノーゲン合成酵素、限定はしないが、例えばアスペルギルス・フェチダス（A.foetidus）、アスペルギルス・ジャポニカス（A.japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（A.nidulans）、アスペルギルス・ニガー（A.niger）およびアスペルギルス・オリゼの菌株から得られるポルホビリノーゲン合成酵素に関する。これらの種の菌株は、いくつかの培養コレクション、例えば、the American Type Culture Collection（ATCC）, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSM）, Centraalbureau Voor Schimmelcultures（CBS）, International Mycological Institute（IMI）, Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center（NRRL）,およびInstitute for Fermentation in Osaka, Japan（IFO）から容易に入手できる。
好ましい実施例では、本発明は、アスペルギルス属から得られるポルホビリノーゲン合成酵素に関する。より好ましい実施例では、本発明は、アスペルギルス・オリゼから得られるポルホビリノーゲン合成酵素に関する。最も好ましい実施例では、アスペルギルス・オリゼIFO4177またはその変異株から得られるポルホビリノーゲン合成酵素、例えば配列番号２のアミノ酸配列を有するポルホビリノーゲン合成酵素に関する。
本発明はまた、高ストリンジェント条件（すなわち5X SSPE, 0.3% SDS, 200μg/ml分断変性サーモン***DNA,および50％ホルムアミド中で、45℃でプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションする）で配列番号１の核酸配列にハイブリダイズするプローブによって、同条件でハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされるポルホビリノーゲン合成酵素に関する。この遺伝子またはこれに基づくオリゴヌクレオチドは、アスペルギルス属のいずれかの種の相同遺伝子を単離するために、サザンハイブリダイゼーションのプローブとして用いることができる。特にこれらのプローブは、注目する種の相当するポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子を同定および単離するために、その種のゲノムまたはcDNAをハイブリダイゼーションして、続いて標準的なサザンブロットを行う際に用いることができる。PCR用の縮重プライマー（オリゴヌクレオチド）を用いて、ゲノムDNAまたはcDNA部分から、ポルホビリノーゲン合成酵素特異的な遺伝子領域を増幅することができる。
公に入手できるアスペルギルス属の菌株を用いて、本例に記載された方法によって、本明細書に明記した例以外の起源からポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子を同定および単離することができる。
本発明の目的において、「から得られる」という用語は、特定の起源、例えばアスペルギルス属の菌株、または、その起源のポルホビリノーゲン合成酵素をコードする遺伝子が挿入された細胞によって、ポルホビリノーゲン合成酵素が生産されることを意味する。
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約50％、好ましくは約55％、より好ましくは約60％、より好ましくは約65％、より好ましくは約70％、より好ましくは約75％、より好ましくは約80％、そして最も好ましくは約85％、さらに最も好ましくは約90％、さらに最も好ましくは約95％の相同性を有し、且つ本明細書に記載したポルホビリノーゲン合成酵素と質的に同じ活性を保持するポルホビリノーゲン合成酵素の変異体も含んでいる。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列に比べて３アミノ酸、好ましくは２アミノ酸、そしてより好ましくは１アミノ酸相違するアミノ酸配列を有するポルホビリノーゲン合成酵素の変異体にも向けられている。各相違は、アミノ酸の挿入もしくは除去、または異なるアミノ酸によるアミノ酸残基置換であってよい。上に定義したカテゴリーに含まれる有用な変異体には、例えば、タンパク質活性に有意な影響を与えない保存的なアミノ酸置換が成された変異体が含まれる。保存的置換とは、あるクラスのアミノ酸が、それと同じクラスの他のいずれかのアミノ酸によって置換されてもよいことを意味する。例えば、非極性脂肪性残基、Ala、Val、LeuおよびIleは交換可能で、塩基性残基LysおよびArg、または酸性残基AspおよびGluも交換して良い。同様に、SerおよびThrは互いに保存的置換でき、AsnおよびGlnも同様である。
本発明のポルホビリノーゲン合成酵素の物理化学的性質を、当業界に周知な種々な技法、限定はしないが、例えばSDS-PAGE、等電点電気泳動、および免疫交差同定テスト（cross-reaction immunoidentity test）を用いて決定してよい。本発明のポルホビリノーゲン合成酵素を当業界に既知の方法によって測定してよい。
本発明のポルホビリノーゲン合成酵素を、当業界に既知な種々な方法、限定はしないが、例えばクロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、調製的等電点電気泳動）、分画的溶解（differential solubility）（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）または抽出によって精製してよい（例えば、Protein Purification, J.-C.Janson and Lars Ryden,eds.,VCH Publishers,New York,1989を参照する）。ここで定義するように、「実質上純粋な」ポルホビリノーゲン合成酵素とは、ポルホビリノーゲン合成酵素でない他のタンパク質が本質的に含まれていないポルホビリノーゲン合成酵素のことで、例えば、SDS-PAGEで決定した場合、少なくとも純度約20％、好ましくは純度約40％、より好ましくは純度約60％、さらに好ましくは純度約80％、最も好ましくは純度約90％、そしてさらに最も好ましくは少なくとも純度約95％の場合である。
本発明はまた、本発明のポルホビリノーゲン合成酵素をコードする核酸配列を含んでいる核酸断片、および本発明の核酸断片を含んでいる核酸構成体に関する。
好ましい実施例では、本核酸配列は、アスペルギルス属から得られるポルホビリノーゲン合成酵素をコードする。より好ましい実施例では、本核酸配列は、アスペルギルス・オリゼから得られるポルホビリノーゲン合成酵素をコードする。最も好ましい実施例では、本核酸配列は、アスペルギルス・オリゼIFO4177から得られるポルホビリノーゲン合成酵素をコードしていて、例えば配列番号１の核酸配列である。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列を有するポルホビリノーゲン合成酵素をコードしていて、且つ遺伝子コードの縮重のために配列番号１と異なる核酸配列を含んでいる。本発明の核酸配列は、ここに記載されたゲノム配列、並びにそれに相当するcDNAおよびRNA配列を含み、そしてここで使われている「核酸配列」という用語は、合成DNAを含む全てのこの様な種類の配列を意味している。
本発明はまた、本発明の核酸断片を含んでいる核酸構成体に関する。一般に「核酸構成体」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかで、天然の遺伝子から単離される核酸分子か、または、自然界には存在しない様式に結合および並置された核酸部分を有する様に修飾された核酸分子を意味する。好ましい実施例では、本核酸構成体は、適当な発現宿主において、ポルホビリノーゲン合成酵素の発現を指令することができる調節領域に作用可能に連結されている。
本発明はまた、本発明の核酸構成体を含んでいる組換えベクターを提供する。好ましい実施例では、核酸配列はプロモーター配列に作用可能に連結されている。別の好ましい実施例では、さらに本発明のベクターは、転写停止シグナルおよび／または選択マーカーを含んでいる。
本発明の組換えベクターは、アスペルギルス属の活性型のポルホビリノーゲン合成酵素を遺伝子発現させるために有用である。有用なベクターは、ベクターが宿主細胞ゲノムに安定に組込まれる様にするエレメントか、またはベクターが宿主細胞のゲノムとは独立に宿主細胞中で自律複製できる様にするエレメント、および好ましくは形質転換された宿主細胞を簡単に選択できる様にする１つ以上の表現型マーカーを含んでいる。ベクターはまた、プロモーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルなどの調節配列、および任意に選択マーカーまたは種々のアクチベーター配列もしくはリプレッサー配列を含んでもよい。発現されたタンパク質が分泌される様にするために、シグナル配列をコードする核酸を、本遺伝子のコード配列の前に挿入してもよい。調節配列の指令下に発現させるために、本発明に用いるポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子を調節配列に作用可能に連結して、この様にして調節配列に合致する条件下にコード配列を発現させる。
本発明の核酸構成体を保持するベクターは、組換えDNA技法で都合よく操作できるいかなるベクターであってもよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターを導入する宿主細胞に依存する。ベクターは、自律複製するベクター、すなわち染色体外に存在し、染色体複製から独立して複製するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であってよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入した場合、宿主細胞ゲノムに組込まれ、そして組込まれた染色体と共に複製されるベクターであってもよい。ベクター系は、単一のベクターもしくはプラスミドであるか、または、合計するとゲノムに組み込まれるべき全DNAを有する２つ以上のベクターもしくはプラスミドであってもよい。
ベクターにおいては、DNA配列は、適当なプロモータ配列に作用可能に連結されるべきである。このプロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示すいかなるDNA配列でもよく、そして宿主細胞に固有であるかまたは異種性であるタンパク質をコードする遺伝子から得ることができる。本発明の核酸構成体の転写を指令する適当なプロモーターは、特に細菌宿主においては、例えば大腸菌のlacオペロンのプロモーター、ストレプトミセス・コエリコロ（Streptomyces coelicolor）のアガラーゼ遺伝子dagAのプロモーター、バチルス・リシェニフォルミス（B.licheniformis）のαアミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィラス（B.stearothermophilus）のマルトジェニックアミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター、バチルス・アミロリクエフェイシェンス（B.amyloliquefaciens）のαアミラーゼ遺伝子（amyQ）のプロモーター、バチルス・サブチリス（B.subtilis）のxylAおよびxylB遺伝子のプロモーター、原核生物のβラクタマーゼのプロモーター（Villa-Kamaroff et al.1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA75,3727-3731）またはtacプロモーター（DeBoer et al.1983,Proceedings of the National Academy of Sciences USA80,21-25）である。さらにプロモーターは、”Useful proteins from recombinant bacteria”in Scientific American,1980,242,74-94;およびSambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d ed.Cold Spring Harbor,New York,1989に記載されている。酵母宿主では、有用なプロモーターは、eno-1プロモーターである。真菌宿主では、転写のために有用なプロモーターは、例えばアスペルギルス・オリゼのTAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ（Rhizomucormiehei）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性αアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸に安定なαアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーもしくはアスペルギルス・アワモリ（A.awamori）のグルコアミラーゼ（glaA）、リゾムコール・ミーヘイのリパーゼ、アスペルギルス・オリゼのアルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼのトリオースリン酸イソメラーゼ、またはアスペルギルス・ニデュランスのアセトアミダーゼをコードする遺伝子から得られるプロモーターである。特に好ましいプロモーターは、TAKAアミラーゼ、NA2-tpi、およびglaAのプロモーターである。
本発明のベクターはまた、適当な転写ターミネーター、および真核生物ではポリアデニル化配列を含んでもよく、これらは、本発明のポルホビリノーゲン合成酵素をコードするDNA配列に作用可能に連結される。停止配列およびポリアデニル化配列は、プロモーターの場合と同じ起源から得ることができる。ベクターはさらに、ベクターが該当の宿主細胞中で複製できる様にするDNA配列を含んでもよい。その様な配列の例は、プラスミドpUC19,pACYC177,pUB110,pE194,pAMB1およびpIJ702の複製起点である。
本発明のベクターは、好ましくは、形質転換細胞を容易に選択できる様にする１つ以上の選択マーカーを有する。選択マーカーは、殺生物剤耐性、ウイルス耐性、重金属耐性、および原栄養体から栄養要求体への変換などを付与する生産物の遺伝子である。選択マーカーは、限定しないが、amdS, pyrG, argB, niaD, sC, trpC, barおよびhygBの群中から選択してよい。アスペルギルス属の細胞で用いるには、アスペルギルス・ニデュランスまたはアスペルギルス・オリゼのamdSおよびpyrGマーカー、並びにストレプトミセス・ハイグロスコピカス（S.hygroscopicus）のbarマーカーが好ましい。さらに、WO91/17243に記載のように、選択マーカーが別のベクター中にあり、同時形質転換することによって選択してもよい。
好ましくは、本発明のベクターはまた、シグナルペプチドのコード領域も含み、コードされているアミノ酸配列は本ヘム生合成酵素のアミノ末端に連結されて、ポルホビリノーゲン合成酵素を特定の細胞内部位に局在化できる様にする。シグナルペプチドのコード領域は、ポルホビリノーゲン合成酵素をコードする第一の核酸配列に固有であってもよいし、または外来の起源から得てもよい。第一の核酸配列のコード配列の５’末端は、局在化しているポルホビリノーゲン合成酵素をコードするコード領域部分に翻訳枠内で天然に連結されているシグナルペプチドのコード領域を、元々含んでいてもよい。あるいはこのコード配列の５’末端は、局在化しているポルホビリノーゲン合成酵素をコードするコード配列部分に対して外来的であるシグナルペプチドのコード領域をコードする核酸配列を含んでもよい。シグナルペプチドのコード領域は、ニューロスポラ・クラサのATPase遺伝子（Viebrock et al,,1982,EMBO Journal 1,565-571）またはサッカロミセス・セレビシエのチトクロームｃペルオキシダーゼ遺伝子（Kaput et al.,1982,Journal of Biological Chemistry257,15054-15058）から得ることができる。しかし本発明においては、選択した糸状真菌宿主においてポルホビリノーゲン合成酵素を局在化できる様にするいかなるシグナルペプチドのコード領域を用いてもよい。
細胞破壊をしないで発現させたポルホビリノーゲン合成酵素を得るために、そして発現させたポルホビリノーゲン合成酵素の細胞内での潜在的な分解量を最小限にするために、ポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子が発現すると、生産物が細胞外に分泌されることが好ましい。この目的で、本発明のポルホビリノーゲン合成酵素は、発現されたタンパク質が培地中へ分泌される様にするプレ領域を含んでよい。このプレ領域は、本発明のポルホビリノーゲン合成酵素に固有であってもよいし、または、異なるプレ領域もしくはシグナル配列を用いて置換されてもよく、各プレ領域をコードするDNA配列によって都合よく置換することができる。プレ領域は、例えば、アスペルギルス属の種のグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝子、バチルス属の種のアミラーゼ遺伝子、リゾムコール・ミーヘイのリパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエのα因子遺伝子、または子ウシのプレプロキモシン遺伝子から得ることができる。特に、アスペルギルス・オリゼのTAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性アミラーゼ、バチルス属NCIB11837のマルトジェニックアミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラスのαアミラーゼ、またはバチルス・リシェニフォルミスのサブチリシンのプレ領域が好ましい。真菌宿主において有効なシグナル配列は、アスペルギルス・オリゼのTAKAアミラーゼのシグナル、リゾムコール・ミーヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼのシグナール、またはリゾムコール・ミーヘイのリパーゼのシグナルである。
本発明の核酸構成体、プロモーター、ターミネーターおよびその他のエレメントを連結する方法、および、それらを複製に必要な情報を有する適切なベクターに挿入する方法は、同業者に周知である（例えば、前記Sambrook et al.を参照する）。
本発明はまた、本発明の核酸構成体または発現ベクターを含んでいる宿主細胞に関し、これは、本発明のポルホビリノーゲン合成酵素の組換え体の生産において有利に用いられる。本発明の核酸構成体を宿主細胞の染色体に組込むことによって、都合よくその細胞を形質転換できる。この配列は細胞内で安定に保持される可能性が高いので、一般的には、この組込みは有益であると思われる。この構成体の宿主染色体への組込みは、通常の方法、例えば相同または非相同組換えによって達成されるだろう。あるいは、種々のタイプの宿主細胞に関して、以下に記載する発現ベクターによって細胞を形質転換できる。
宿主細胞およびベクターの選択は、ポルホビリノーゲン合成酵素およびその起源に大きく依存する。宿主細胞は、原核生物細胞、例えば細菌細胞から選択してよい。適当な細菌の例は、バチルス・サブチリス、バチルス・リシェニフォルミス、バチルス・レンタス（B.lentus）、バチルス・ブレビス（B.brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・アルカロフィラス（B.alkalophilus）、バチルス・アミロリクエフェイシェンス、バチルス・コアグランス（B.coagulans）、バチルス・シルクランス（B.circulans）、バチルス・ラウタス（B.lautus）、バチルス・メガテリウム（B.megaterium）、バチルス・チューリンゲネシス（B.thuringiensis）、または、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）もしくはストレプトミセス・ムリヌス（S.murinus）などのグラム陽性細菌か、あるいは大腸菌などのグラム陰性細菌である。細菌の形質転換は、例えば、周知のプロトプラスト形質転換によるか、またはコンピテント細胞を利用して行うことができる。
宿主細胞は、好ましくは真核生物、例えば哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞であるか、または好ましくは酵母および糸状真菌を含む真菌細胞である。例えば、有用な哺乳類細胞にはCHO細胞またはCOS細胞がある。酵母宿主細胞は、サッカロミセス属またはシゾサッカロミセス属の種、例えばサッカロミセス・セレビシエから選択してよい。有用な糸状真菌は、アスペルギルス属の種、例えばアスペルギルス・オリゼまたはアスペルギルス・ニガーから選択してよい。あるいはフサリウム（Fusarium）属の種の菌株、例えばフサリウム・オキシスポラム（F.oxysporum）またはフサリウム・グラミネラム（F.graminearum）を宿主細胞として用いてもよい。真菌細胞を、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生からなる周知の方法によって形質転換することができる。アスペルギルス属の宿主細胞の形質転換に適した方法は、EP 238 023に記載されている。フサリウム属の種を形質転換するのに適した方法は、Malardier et al.1989,Gene 78,147-156またはUS Serial No.08/269449に記載されている。
特に好ましい実施例では、ポルホビリノーゲン合成酵素の遺伝子発現は、アスペルギルス属などの真菌宿主細胞において達成される。ポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子を、好ましくはアスペルギルス・オリゼのTAKAアミラーゼのプロモーターまたはアスペルギルス・ニガーの中性アミラーゼNA2のプロモーター、および選択マーカーとしてamdSまたはpyrGを有するプラスミド内に連結する。あるいは、選択マーカーは別のプラスミド上にあって、同時形質転換において用いてもよい。これらのプラスミドを用いて、Yelton et al.1984,Proceedings of the National Academy Sciences USA 81,1470-1474に記載された方法に従って、アスペルギルス属の種の宿主細胞、例えばアスペルギルス・オリゼまたはアスペルギルス・ニガーを形質転換する。
本発明はまた、本発明のポルホビリノーゲン合成酵素を生産する方法で、（ａ）ポルホビリノーゲン合成酵素を生産させるために栄養培地中でアスペルギルス属の菌株を培養し、そして（ｂ）ポルホビリノーゲン合成酵素を回収することを含んでいる方法に関する。
本発明はまた、本発明のポルホビリノーゲン合成酵素を組換えによって生産する方法で、（ａ）酵素の生産を誘導する条件下で、ポルホビリノーゲン合成酵素をコードする核酸配列を含んでいる核酸構成体を含んでいる宿主細胞を培養し、そして（ｂ）ポルホビリノーゲン合成酵素を回収することを含んでいる方法に関する。発現系が、ポルホビリノーゲン合成酵素を発酵培地に分泌する場合には、この酵素を培地から直接回収できる。組換えポルホビリノーゲン合成酵素が分泌されない場合には、これを細胞溶解物から回収する。
本発明のポルホビリノーゲン合成酵素を発現または単離するために、当業界に既知のいずれかの細胞培養法を用いることができる。例えば、培養とは、適切な培地中で、ポルホビリノーゲン合成酵素を発現または単離することができる条件下で実施するもので、振とうフラスコ培養、実験室用または工業用発酵槽中での小規模または大規模発酵（例えば連続式、バッチ式、給送バッチ（fed-batch）式、または固相式による発酵）を含んでいる。当業界に既知の方法を用いて、炭素源および窒素源、並びに無機塩を含んでいる適切な栄養培地中で発酵を行う（例えばBennet,J.W.and LaSure,L.（eds）,More Gene Manipulations in Fungi,Academic Press,CA,1991を参照する）。適切な培地は、企業から入手するか、または公表されている組成に従い調製することもできる（例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログを参照する）。
前記の方法で生産したポルホビリノーゲン合成酵素を、通常の方法、限定しないが、例えば遠心、濾過、噴霧乾燥（spray-drying）、蒸発または沈殿によって発酵培地から回収できる。回収したタンパク質をさらに、様々なクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィーなどによって精製できる。
本発明はまた、ポルホビリノーゲン合成酵素を用いる方法にも向けられている。
本発明のポルホビリノーゲン合成酵素は、ポルホビリノーゲン合成酵素がヘム生産の律速段階である宿主細胞において、ポルホビリノーゲン合成酵素をコードする核酸配列をこの宿主細胞で過剰発現させることによって、この宿主細胞が生産するヘムタンパク質の収量を増加させることに用いることができる。この方法は、（ａ）ポルホビリノーゲン合成酵素の発現を指令することができる調節領域に作用可能に連結されている、ポルホビリノーゲン合成酵素をコードする核酸配列の一つ以上のコピーを、ヘムタンパク質を生産することができる宿主細胞に導入し；（ｂ）ヘムタンパク質およびポルホビリノーゲン合成酵素の生産に適する栄養培地中で細胞を培養し；そして（ｃ）この細胞の栄養培地からヘムタンパク質を回収することを含んでいる。
本発明を、次の実施例によってさらに記載するが、これを本発明の範囲を限定するように解釈するべきではない。
実施例
例１：アスペルギルス・オリゼ株A1560のゲノムDNAの抽出
アスペルギルス・オリゼ株A1560（IFO4177）を0.5%酵母エキス−2%グルコース（YEG）培地25ml中で、24時間、32℃、250回転で増殖させた。次に菌糸体をMiracloth（Calbiochem,La Jolla,CA）を通して濾過することで集菌し、10mMトリス−1mM EDTA（TE）緩衝液25mlを用いて１回洗った。過剰の緩衝液を菌糸体から流し去り、続いて液体窒素で凍結した。凍結した菌糸体を電気コヒーひき器でひいて細粉末にし、これを、使い捨てプラスティック遠心チューブ内で、20mlのTE緩衝液と５mlの20%（w/v）ドデシル硫酸ナトリウムに加えた。混合物を穏やかに数回反転して完全に混合させ、そして等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1v/v/v）によって２回抽出した。3M酢酸ナトリウム溶液を終濃度0.3Mになる様に加え、続いて2.5倍量の氷冷エタノールを加えて核酸を沈殿させた。それから15000gで30分間チューブを遠心することで核酸をペレットにした。ペレットを30分間風乾させて、0.5mlのTE緩衝液に再縣濁した。デオキシリボヌクレアーゼ非混在のリボヌクレアーゼＡを濃度100μg/mlになる様に加えて、この混合液を37℃で30分間放置した。それからプロテアーゼＫを濃度200μg/mlになる様に加えて、この混合液をさらに１時間37℃で放置した。最後に、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1v/v/v）によって混合液を２回抽出し、前述した様に酢酸ナトリウムおよびエタノールによってDNAを沈殿させた。DNAペレットを真空乾燥した後、TE緩衝液に再縣濁して、次の使用まで4℃で保存した。
例２：PCRによるゲノム用hemBプローブの作成
アスペルギルス・オリゼ株のポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子（porphobilinogen synthase gene）hemBの126bpのフランキング断片（Jesper Vind,1994,PhD Dissertation,University of Coperhargen,Copenhargen, Denmark）、ならびに酵母およびヒトのhemBクローンの相同部位（Myers et al.,1987,Journal of Biological Chemistry 262,16822-16829; Wetmur et al.,1986,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 83,7703-7707）のアミノ酸配列に基づいてPCR用の縮重したプライマーを設計した。Applied Biosystems社のモデル394DNA/RNAシンセサイザーを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。センスプライマー5’-GT（AGCT）GC（AGCT）CC（AGCT）（AT）（CG）（AGCT）GA（CT）ATGATGGA-3’（配列番号３）、およびアンチセンスプライマー5’-GC（AG）TC（AGTC）CGT（AG）AA（AGTC）CC（AG）TA-3’（配列番号４）、並びに鋳型としてpJVi60（Vind,1994前述）を用いて、hemB断片をPCRで増幅した。PCR反応液（50μl）は次の成分からなる：10mMトリス塩酸pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01%（w/v）ゼラチン,各200μMのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP,500ngのpJVi60,および各50pmolの前記PCR用プライマー。反応液を95℃で３分間加熱した後、80℃まで冷却した。それからTaqポリメラーゼ５単位を加えた。反応は、Perkin-Elmer社の9600サーマルサイクラーによって、95℃30秒間、45℃１分間、および72℃１分間のサイクルを35サイクル行った。最終サイクル後に、反応液を72℃で５分間放置した。予測したhemBの126bpのPCR産物を、pCRIIベクターにクローン化して、プラスミドpAJ005-1（図１）を作成した。
例３：アスペルギルス・オリゼ株A1560のDNAライブラリーの作成およびポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子（hemB）クローンの同定
アスペルギルス・オリゼ株A1560のゲノムDNAライブラリーを、取扱い説明書に従って、バクテリオファージクローニングベクターλZipLox（Life Technologies,Gaithersburg,MD）を用いて作成した。プレーティングおよび組換えバクテリオファージの精製用の宿主として、大腸菌Y1090ZL細胞を使用し、各pZL1-hemAクローンの取り出し用の宿主として、大腸菌DH10Bzipを使用した。例１の記載どおりに細胞から調製した総DNAをTsp509Iによって部分切断し、1%アガロースゲル上で、50mMトリス−50mMホウ酸塩−1mMEDTA2ナトリウム塩（TBE）緩衝液を用いてサイズ分画した。４−７kbのサイズ範囲に移動したDNA断片を切りだし、Prep-a-Gene試薬（BioRad Laboratories,Hercules,CA）を使ってゲルから抽出した。EcoRIで切断した後に脱リン酸化したλZipLoxベクター用アームを、抽出したDNA断片に連結した。その連結混合液を、市販のパッケージング抽出液（Stratagene,La Jolla,CA）を用いてパッケージングした。パッケージングされたDNAライブラリーをプレーティングし、大腸菌Y1090ZL細胞中で増幅させた。増幅前のゲノムライブラリーは1X 106pfu/mlであった。
約8X 104プラークのバクテリオファージDNAを、円形のNytran Plus膜（Schleicher & Schuell,Keene, NH）２枚に転写し、Mertz and Rashtchian（1994,Analytical Biochemistry 221,160-165）の方法に従い、pAJ005-1からPCR増幅して、32Ｐ標識したhemB断片をプローブにしてスクリーニングした。増幅反応液（50μl）は次の成分を含む：10mMトリス塩酸pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01%（w/v）ゼラチン,各0.04mMのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP, ５μlの32P-dCTP（3000Ci/mmole,3.3μM; Amersham,Arlington Heights,IL）,各50pmolのセンスプライマー5’-GTGGCTCCGAGTGATAT-3’（配列番号５）およびアンチセンスプライマー5’-GCATCGCGAAAAGGACCG-3’（配列番号６）。反応液を95℃で３分間加熱した後、Taqポリメラーゼ５単位を加えた。反応は、Perkin-Elmer社のサーマルサイクラーによって、95℃１分間、55℃１分間、および72℃１分間のサイクルを30サイクル行った。反応溶液をセファデックスＧ50カラム（Pharmacia,Alameda,CA）に通して未反応ヌクレオチドを除き、その後変性させ、ハイブリダイゼーション緩衝液に加えた。変性プローブ（106cpm/ml）をハイブリダイゼーション緩衝液に加え、プレハイブリダイズした膜と一緒にして一晩放置した。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、5X SSC, 50mMリン酸ナトリウムpH7, 5Xデンハルト溶液,0.1%（w/v）SDS, 5mM EDTA pH8, 10μg/ml変性サーモン***DNAおよび50％ホルムアミド中で、42℃で行った。その膜を、42℃で15分間、0.1X SSC, 0.1% SDSで４回洗った。陽性シグナルを示す１次プラークを、２次スクリーニングにかけ、取り扱い説明書に従って精製した。取り扱い説明書に従って、陽性シグナルを示す10個のゲノムクローンを、pZL誘導体としてλZipLoxベクターから切り出して（Bethesda Research Laboratories,Inc.,Bethesda, MD）、そしてHattori and Sakaki（1986,Analytical Biochemistry 152,232-237）の方法に従って配列決定した。各pZL誘導体を、pAJ007-1からpAJ007-10と命名した。制限酵素マッピングから、3.7kbのゲノム断片を有する大腸菌DH5αのpAJ007-6クローンをさらに解析した。
例４：ポルホビリノーゲン合成酵素遺伝子（hemB）の特徴
例３の大腸菌DH5αpAJ007-6のDNA配列を、例３の方法に従って決定した。クローン化したアスペルギルス・オリゼ株A1560のhemB遺伝子のヌクレオチド配列は、図２（配列番号１）に示すとおり、1308ヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有し、図２（配列番号２）に示すとおり、374アミノ酸からなるポリペプチドをコードして、予想分子量は40kDaであることが判明した。文献（Unkles,1992,Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi,Chapter2, J.R.Kinghorn and G.Turner,editors,Blackie Academic and Professional Publications）から予測されるように、このヌクレオチド配列には、一つの48bpの推定イントロンがあり、このイントロンはスプライシング部位の共通配列によって挟まれていて、そして内部共通配列を含んでいる。3’スプライシング部位（TAG）は、開始Metの下流254bpに位置しており、5’スプライシング部位（GTCCGC）は、3’スプライシング部位の上流46bpに位置して、そして内部共通配列（TCTAAC）は、5’スプライシング部位の下流30bpに位置している。5’非翻訳領域には、-377および-233の位置に２つのCAATモチーフがあり、転写調節において重要な働きをすると思われる（Gurr et al.1987前出）。さらに、3’非翻訳領域には（-117,-208,-650）、いくつかのTATA様ボックスが推定された。植物以外の生物では、hemB産物は細胞質性であるので、予想通り、hemBのＮ末端にはリーダー配列がないようである（Bottemley and Muller-Eberhard,1988,Seminars in Hematology 25,282-302）。
アスペルギルス・オリゼのhemB遺伝子のアミノ酸配列（配列番号２）と、他のhemB遺伝子のアミノ酸配列とのアライメントを図３に示す。アスペルギルス・オリゼのhemBのアミノ酸配列に対して、酵母（配列番号17;Myers et al.,1987前出）、ヒト（配列番号18;Wetmur et al.,1986前出）、ラット（配列番号19 ;Bishop et al.,1989,Nucleic Acids Research 14,10115）および大腸菌（配列番号20 ;Li et al.,2989,Gene 75,177-184）のhemBの推定アミノ酸配列は、各々63％、55％、55％および40％の同一性を有する。エンドウ（配列番号21;Bsese et al.,1991,Journal of Biological Chemistry 266,17060-17066）、バチルス・サブチリス（配列番号22;Hansson et al.,1991,Journal of Bacteriology 173,2590-2599）およびホウレンソウ（配列番号23;Scharmburg and Schneider-Poetsch,1991,EMBL Data Library）のhemBの推定アミノ酸配列との相同性はより低い（各同一性40％、39％および33％）。しかし、エンドウおよびホウレンソウのhemBの両アミノ酸配列には、Ｎ末端にクロロプラストシグナル配列があるので、これらの成熟型ポリペプチドをアライメントすれば、アスペルギルス・オリゼのhemBのアミノ酸配列に対する相同性は、有意に増加するだろう。これらのアライメントに基づくと、アスペルギルス・オリゼのhemB産物の活性リシン部位は、アミノ酸残基299に位置し（Jaffe,1995, Journal of Bioenergetics and Biomembranes 27,169-179）、そしてBerg,1986,Nature319,264-265によって予想された保存性のジンクフィンガー様ドメインは、アミノ酸残基166-180に位置している。ジンクフィンガーは、Zn2+と結合することで、活性部位のスルフヒドリル基の酸化を防ぐことが示唆されている（Jaffe,1995前出）。植物のhemBの相当するドメインは、Zn2+よりMg2+と結合すると提唱されている（Bsese et al.,1991前出）。興味深いことに、hemBのフィンガードメインの最初の残基は、Thr（位置166）であり、植物のこの金属結合ドメインのこの位置においても保存されている。しかし、hemBのジンクフィンガードメインの残りの位置は、保存されている。
例５：プラスミドpAJ023の作成
PCR増幅したアスペルギルス・オリゼのhemAのコード領域を、アスペルギルス・オリゼの発現ベクターpBANe6にサブクローニングして、プラスミドpAJ023を作成した（図４）。pBANe6へのクローン化を容易にするために、増幅産物の5’末端にSwaIそして3’末端にPacIの制限部位を有する様に設計した。増幅反応液（50μl）は次の成分からなる：10mMトリス塩酸pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01%（w/v）ゼラチン,各200μMのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP, 200ngのpAJ007-6のDNA,および各50pmolの以下のプライマー：
例６：アスペルギルス・オリゼ株JRoC50.3.18Aの作成
次の様にしてプラスミドpJRoC50を含んでいるアスペルギルス・オリゼ株JRoC50.3.18Aを作成した。コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）IFO8371のペルオキシダーゼのcDNA断片をPCRによって調製した。コプリヌス・マクロルヒザス（Coprinus macrorhizus）のペルオキシダーゼのアミノ酸配列（Baunsgaard et al.1993,European Journal of Biochemistry 213,605-611）に基づいて作成した、以下に示す特異的オリゴヌクレオチドプライマー（Saiki et al.1988,Science 239,487-491）を用いた：
プライマーを次の組み合わせで用いた：１および２；３および４；５および７；６および７；１および４；そして３および７。PCR断片の5’末端にEcoRI部位、そして3’末端にBamHI部位を付加して伸長した。1%アガロース/TBEゲルを用いて分析したところ、全反応において期待どおりのサイズのバンドが見つかった。それらのバンドがペルオキシダーゼ特異的配列に相当することを確認するために、このゲルについて、プライマー３とプライマー４との間に位置する、次の配列のオリゴヌクレオチドをプローブにしてサザンブロットを行った：
種々のPCR反応で得たDNAをEcoRIおよびBamHIで切断して、プラスミドpUC19（New England Biolabs,Beverly,MA）にクローン化した。適格なPCR断片を含むコロニーを、前記オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号16）を用いたハイブリダイゼーションによって同定した。陽性コロニーから得たDNAについて、制限酵素地図を作成し、Sanger et al.の方法で（1977,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74,5463-5467）DNAの部分配列を決定して分析した。プライマー１および４を使って得られたクローンのひとつから得た430bp断片を用いて、コプリヌス・シネレウスcDNAライブラリーを下記のとおりスクリーニングした。
Boel et al.（1984,EMBO Journal 3,1097-1102）およびChirgwin et al（1979,Biochemistry 18,5294-5299）の方法に従い、ペルオキシダーゼ活性の最大時に集菌して、ホモジナイズしたコプリヌス・シネレウス株IFO8371の菌糸体から、総RNAを抽出した。Aviv and Leder（1972,Proceedings of the National Academy of Sciences USA69,1408-1412）の方法で、オリゴ（dT）セルロースの親和性クロマトグラフィーを２回繰り返して、ポリ（Ａ）含有RNAを得た。取り扱い説明書に従ってcDNA合成キット（Invitrogen,San Diego,CA）を用いてcDNAを合成した。コプリヌス・シネレウスのcDNAライブラリーから約50000個の大腸菌組換え体をワットマン540ペーパーフィルターに転写した。Gerger et al.（1979,Nucleic Acids Research 7,2115-2135）の方法で、コロニーを溶解して固定化した。32Ｐ標識した430bpのペルオキシダーゼ特異的プローブを用いて、0.2X SSC-0.1%SDS中で、フィルターをハイブリダイズした。フィルターのハイブリダイゼーションおよび洗浄は65℃で行い、その後増感スクリーンを使って24時間オートラジオグラフィーした。このオートラジオグラフィー後、温度を上げてフィルターを洗浄し直して、増感スクリーンを使って24時間オートラジオグラフィーした。この様にして、50個超の陽性クローンを同定した。標準の方法で（Birnboim and Doly,1979,Nucleic Acids Research7,1513-1523）、ハイブリダイズしたコロニーからプラスミドDNAを少量調製して、挿入されているcDNAのDNA配列を、サンガーのダイデオキシ法で決定した（Sanger et al.1977, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74,5463-5467）。この中からひとつのコロニーを選択し、このベクターをpCiPとした。このベクターをBamHI/XhoIで切断して、ペルオキシダーゼcDNA断片を切りだし、アガロースゲル電気泳動によって分離した後、電気抽出し、連結反応に備えた。このcDNA断片を、BamHI/XhoIで切断したpHD414に連結して、pJVi9を作成した。このベクター内のcDNAは、図５に示す様にアスペルギルス・オリゼのTAKAプロモーターおよびアスペルギルス・ニガーのAMGTM（Novo Nordisk A/S,Bagsvard,Denmark）ターミネーターの転写調節下にある。
コプリヌス・シネレウスのペルオキシダーゼをコードするcDNAを、BamHI/XhoI断片としてプラスミドpJVi9から切りだし、プラスミドpJeRS6（図６）にクローン化してプラスミドpJRoC50（図７）を作成した。このプラスミドは、選択マーカーとしてpyrG、TAKAプロモーターおよびamgターミネーターを含んでいる。
５μgの精製プラスミドpJRoC50を用いて、アスペルギルス・オリゼ株HowB425の形質転換体を、次の点を変更して下記のとおりに作成した。アガーの重層を省略し、最小培地プレート上に直接プロトプラストをまいた。形質転換は、濃度2X 107プロトプラスト/mlのプロトプラストを用いて行った。プロトプラスト100μlを５μgのDNAと混ぜて氷上で30分間放置した。SPTC（40%PEG4000, 0.8Mソルビトール, 0.05MトリスpH8.0, 0.05M CaCl2）1mlを加え、このプロトプラストを34℃で20分間放置した。この形質転換液を、最小培地のプレート上に直接プレーティングした。最小培地（pH6.5）は、1Lあたり6g NaNO3, 0.52g KCl, 1.52g KH2PO4,微量金属液1ml, 1gグルコース, 500mg MgSO4-7H2O, 342.3gスクロースおよび20g Nobleアガーから作成した。微量金属液（1000倍）は、1Lあたり22g ZnSO4-7H2O, 11g H3BO3, 5g MnCl2-4H2O, 5g FeSO4-7H2O, 1.6g CoCl2-5H2O, 1.6g（NH4）6Mo7O24および50g Na4EDTAから作成した。プレートを34℃で５−７日間放置した。形質転換体を、同じ培地のプレートに転写し、37℃で３−５日間放置した。
次の酵素測定法で、66個の形質転換体のペルオキシダーゼ活性を測定した：基質緩衝液［0.1Mリン酸カリウム塩20ml, 0.01%Tween 80 pH7.0, 2,2’-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate）（ABTS）溶液（22mg/ml）250μlおよび30%過酸化水素２μl］180μlを、1:900に希釈した培養上清20μlに加え、すばやくMolecular Devices社のサーモマックスマイクロプレートリーダー（Molecular Devices,Sunnyvale,CA）を用いて、25℃で405nmの吸光を測定した。測定結果を２分間かく拌しながら10秒毎に記録し、SOFT maxプログラム（Molecular Devices,Sunnyvale,CA）を用いて、Vmax値を計算した。1mlあたりのペルオキシダーゼ活性単位（POXU）は、即知量のシネレウス・コプリヌスのペルオキシダーゼを基準として作成した標準曲線から推定した。1 POXUは、0.88mM H2O2, 1.67mM ABTS, 0.1Mリン酸塩pH7.0において、30℃で１分間に1.0μmoleの変換を触媒する酵素量として定義した。前記と同じ条件下で、同じプレート上で胞子を画線培養し、独立したコロニーをひろって、発現レベルが最も高い４つの形質転換体を単離した。
各形質転換体の胞子約5X 106を、1%酵母エキス, 2.5%マルトース, 0.2%尿素および1X MY塩pH6.5を含んだMY25培地25mlに接種し、振とうフラスコで培養して最終評価した。1X MY塩は、1Lあたり2g MgSO4-7H2O, 2g K2PO4, 10g KH2PO4, 2gクエン酸、微量金属液0.5mlおよび10% CaCl2-2H2O 1mlから作成した。微量金属液は、1Lあたり13.9g FeSO4-7H2O, 8.5g MnSO4-H2O, 14.28g ZnSO4-7H2O, 1.63g CuSO4, 0.24g NiCl2-6H2Oおよび3.0gクエン酸から作成した。50mM NaOHで調製した新鮮な10mg/mlの保存液から、ヘミンを終濃度0.01mg/mlになる様に加えた。この振とうフラスコを34℃で７−８日間200回転で培養した。ペルオキシダーゼを最も多く生産する菌体をJRoC50.3.18Aとした。
例７：pAJ023によるアスペルギルス・オリゼJRoC50.3.18Aの形質転換
アスペルギルス・オリゼのhemB遺伝子の過剰発現によってペルオキシダーゼの生産が増加するかどうか決定するために、アスペルギルス・オリゼ株JRoC50.3.18AをpAJ023によって形質転換した。
形質転換は、濃度2X 107プロトプラスト/mlのプロトプラストを用いて行った。プロトプラスト100μlを10μｇのDNAおよび200μlの60%PEG4000-10mM HEPES-10mM CaCl2液と混ぜて、氷上で30分間放置した。SPTC（40%PEG4000, 0.8Mソルビトール, 0.05MトリスpH8.0, 0.05M CaCl2）1mlを加え、このプロトプラストを34℃で20分間放置した。amdSによる形質転換体を選択するために、形質転換液0.25mlを、重層用COVEアガー（0.7%低融点アガーを加えたCOVE培地と同じ）15mlに加えて、COVE形質転換用プレート（1Lあたり0.52g KCl, 0.52g MgSO4-7H2O, 1.52g KH2PO4,例６の微量金属液1ml, 342.3gスクロース,25g Nobleアガー, 1Mアセトアミド10mlおよび3M CsCl 10ml）上にプレーティングした。プレートを室温で５−７日間放置した。形質転換体を、同じ培地のプレートに転写し、37℃で３−５日間放置した。同条件下で同じプレート上で胞子を画線培養し、独立したコロニーをひろい、形質転換体を単離した。
例８：hemBの１次形質転換体によるペルオキシダーゼの生産
総計20個のアスペルギルス・オリゼのhemB形質転換体、および42個の対照形質転換体（アスペルギルス・オリゼのhemBを欠いた発現ベクターによって形質転換したアスペルギルス・オリゼ株JRoC50.3.18A）を、24ウエルプレート上で培養して、例６の記載どおりにペルオキシダーゼの生産を測定した。
ペルオキシダーゼ測定の結果から、測定した全形質転換体において、対照形質転換体に比べてより高いレベルのペルオキシダーゼ活性を示すものがないことが判明した。
微生物の寄託
ブタペスト条約に従い、次の株を、Agricultural Research Service Patent Culture Collection（NRRL）, Northern Regional Research Laboratory, 1815 University Street, Peoria, Illinois 61604, USAに寄託した。
本明細書に引用した様々な参考の内容を、引用により本明細書に組み込む。
配列表
（１）一般情報
（ii）発明の名称：アスペルギルス属のポルホビリノーゲン合成酵素およびこれをコードする核酸
（iii）配列数：23
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：1807塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号１：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：375アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：タンパク質
（ｖ）断片型：内部
（xi）配列記載：配列番号２：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号３：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号４：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号５：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号６：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：33塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号７：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：30塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号８：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：33塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号９：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号10：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：28塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号11：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：26塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号12：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：21塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号13：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：22塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号14：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列記載：配列番号15：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：cDNA
（xi）配列記載：配列番号16：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：342アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：なし
（xi）配列記載：配列番号17：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：330アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：なし
（xi）配列記載：配列番号18：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：330アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：なし
（xi）配列記載：配列番号19：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：323アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：なし
（xi）配列記載：配列番号20：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：398アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：なし
（xi）配列記載：配列番号21：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：323アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：なし
（xi）配列記載：配列番号22：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：424アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：なし
（xi）配列記載：配列番号23：
Claims (24)
- （ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するか；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１、２若しくは３個のアミノ酸が挿入、除去若しくは置換されたアミノ酸配列を有するか；または
（ｃ）高ストリンジェント条件で配列番号１の核酸配列にハイブリダイズするプローブを用いて、同じ条件でハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされる、ポルホビリノーゲン合成酵素。 - 配列番号２のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号２のアミノ酸配列において１、２若しくは３個のアミノ酸が挿入、除去若しくは置換されたアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポルホビリノーゲン合成酵素。
- 配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項２のポルホビリノーゲン合成酵素。
- 高ストリンジェント条件で配列番号１の核酸配列にハイブリダイズするプローブを用いて、同じ条件でハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされている、請求項１のポルホビリノーゲン合成酵素。
- 請求項１のポルホビリノーゲン合成酵素をコードする核酸配列を含んでいる、単離された核酸断片。
- 核酸配列が、配列番号１に示されている、請求項５の核酸断片。
- 配列番号２のアミノ酸配列を有するか又は配列番号２のアミノ酸配列において１、２若しくは３個のアミノ酸が挿入、除去若しくは置換されたアミノ酸配列を有するポルホビリノーゲン合成酵素をコードする核酸配列を含んでいる、請求項５の核酸断片。
- 高ストリンジェント条件で配列番号１の核酸配列にハイブリダイズするプローブを用いて、同じ条件でハイブリダイズすることができる、請求項５の核酸断片。
- 適切な発現宿主においてポルホビリノーゲン合成酵素の発現を指令することができる調節領域に作用可能に連結された請求項５の核酸断片を含んでいる、核酸構成体。
- 請求項９の核酸構成体を含んでいる、組換えベクター。
- 核酸配列が、プロモーター配列に作用可能に連結されている、請求項１０のベクター。
- さらに転写停止シグナルを含んでいる、請求項１１のベクター。
- さらに選択マーカーを含んでいる、請求項１１のベクター。
- 請求項９の核酸構成体を含んでいる、組換え宿主細胞。
- 核酸構成体がベクター上に含まれている、請求項１４の宿主細胞。
- 宿主細胞が細菌細胞である、請求項１４の宿主細胞。
- 宿主細胞が真菌細胞である、請求項１４の宿主細胞。
- 真菌細胞が糸状真菌細胞である、請求項１７の宿主細胞。
- 糸状真菌細胞が、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、フサリウム属（Fusarium）、ヒュミコラ属（Humicola）、マイセリオフトラ属（Myceliophthora）、ムコール属（Mucor）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペニシリウム属（Penicillium）、シーラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）またはトリコデルマ属（Trichoderma）の種の細胞である、請求項１８の宿主細胞。
- 真菌細胞が酵母細胞である、請求項１７の宿主細胞。
- 酵母細胞がサッカロミセス属（Saccharomyces）またはシゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）の菌株である、請求項２０の宿主細胞。
- 核酸構成体が宿主細胞ゲノムに組込まれている、請求項１４の宿主細胞。
- （ａ）ポルホビリノーゲン合成酵素を生産させるためにアスペルギルス属の株を培養して；そして（ｂ）ポルホビリノーゲン合成酵素を回収することを含んでいる、請求項１のポルホビリノーゲン合成酵素を生産する方法。
- （ａ）ポルホビリノーゲン合成酵素の発現を誘導する条件で、ポルホビリノーゲン合成酵素をコードする核酸配列を含んでいる核酸構成体を含んでいる宿主細胞を培養して；そして（ｂ）ポルホビリノーゲン合成酵素を回収することを含んでいる、請求項１のポルホビリノーゲン合成酵素を生産する方法。
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