JP4331942B2 - 副腎皮質刺激ホルモン放出因子受容体を使用して筋量又は機能を調節する化合物を同定する方法 - Google Patents
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Description
現在、2つの副腎皮質刺激ホルモン放出因子受容体(CRF1R及びCRF2R)が識別されており、これらはGタンパク質結合受容体(GPCR)分類に属する。CRF1R又はCRF2Rの作動薬活性化は、アデニル酸シクラーゼのGαs活性化を引き起こす。アデニル酸シクラーゼは、前記cAMPの形成に触媒作用を及ぼし、それが次には、タンパク質キナーゼAの活性化、細胞内カルシウム放出、及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPキナーゼ)の活性化を含む、多数の効果を有する。他の研究では、CRF受容体の作動薬活性化後の細胞内イノシトール3リン酸合成の向上から、CRFRもまたGαqに結合することが示唆される。
骨格筋は、動作に関する生理的要求又は代謝的需要の変化に容易に適合する塑性組織である。肥大とは、骨格筋量の増加を指し、骨格筋萎縮とは、骨格筋量の減少を指す。急性の骨格筋萎縮は、手術、ベッド休養、又は骨折による不使用;脊髄損傷、自己免疫疾患、又は感染病による神経除去/神経損傷;無関係条件に対する糖質コルチコイド使用;感染又は他の原因による敗血症;病気又は飢餓による栄養制限;及び宇宙旅行を含めて、様々な原因を追跡可能であるが、これだけに限るものではない。骨格筋萎縮は、正常な生物学的プロセスを通じて起こるが、ある医療状況では、この正常な生物学的プロセスが衰弱レベルの筋萎縮を引き起こす。例えば、急性の骨格筋萎縮は、これだけに限るものではないが、整形外科的処置に付随するものを含め、患者の運動抑制状態からのリハビリテーションにおける顕著な制限を与える。このような場合、骨格筋萎縮を改善するのに必要なリハビリテーション期間は、しばしば、本来の損傷を修復するのに要する期間よりもはるかに長くなる。既に筋機能及び筋量に加齢性のかなりの欠損を患っている可能性のある高齢者では、このような急性の不使用萎縮は、永久的な障害及び早過ぎる死をまねくことがあるので特に問題である。
筋ジストロフィーには、臨床的に骨格筋の衰弱部の選択的分散によって区別される、遺伝性の進行性筋肉疾患群が包含される。筋ジストロフィーの最も一般的な二形態は、デュシェンヌ型(Duchenne)及びベッカー型(Becker)ジストロフィーであり、それぞれ、Xp21座に位置するジストロフィン遺伝子における突然変異の遺伝に起因する。他のジストロフィーには、p94カルパイン、アドハリン、γ−サルコグリカン、及びβ−サルコグリカン座を含む多数の遺伝子座の突然変異に起因する肢帯筋ジストロフィー;顔面肩甲上腕(ランドゥジー・デジュリン(Landouzy-Dejerine))筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、及びエメリー・ドレーフス型(Emery-Dreifuss)筋ジストロフィーが挙げられるが、これらだけに限るものではない。もっぱら男性のみに生じるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの症状には、アヒル歩行、つま先立ち歩行、脊柱前湾、頻繁な転倒、ならびに立ち上がり及び階段昇降の困難が挙げられる。症状は約3〜7歳で始まり、ほとんどの患者が10〜12歳で車椅子に制限され、多くが呼吸器合併症のために約20歳で死亡する。デュシェンヌ筋ジストロフィーの現在の処置には、プレドニゾン(副腎皮質ホルモン薬)の投与が挙げられ、これは治療するものではないが、筋肉の強度の衰退を緩やかにし、能力喪失を遅らせる。プレドニゾンのような副腎皮質ホルモンは、疾病に起因する筋繊維の損傷によって助長される免疫細胞の活性化及び浸潤を妨害することによって作用すると考えられている。残念なことに、副腎皮質ホルモン処置もまた骨格筋萎縮をまねき、それがこれらの患者の免疫応答を妨害する潜在的な利益の一部を無効化する。したがって、筋ジストロフィー患者において筋繊維の損傷を緩やかにし、能力喪失の開始を遅らせるが、現在の治療ほどの骨格筋萎縮を引き起こさない治療薬を同定することが必要とされている。
配列表に含まれるCRFRヌクレオチド及びタンパク質配列又はCRF類似体タンパク質配列を、それぞれ、対応する遺伝子バンク(Genbank)又はダウエント(Derwent)受入番号ならびにクローン元である動物種と併せて表Iに示す。また、配列表に示す配列と同一又はほぼ同一のアミノ酸配列をコード化する関連ヌクレオチド配列の受入番号も示す。これらの関連配列は、主に示した5’又は3’未翻訳配列の量が異なる。
以下は、本明細書で使用する用語に関する定義の一覧である。
本発明を利用すると、従来技術における情報及び以下の教示が与えられることが当業者には認識される。本明細書に記載する結果から、骨格筋萎縮モデルにおいて、CRF1R及びCRF2R(非選択的CRFR作動薬)の両方を活性化するCRF受容体作動薬を投与すると、神経除去、不使用、又はデキサメタゾン処置の骨格筋萎縮誘発効果を妨害及び/又は阻害することが実証される。さらに、データから、CRF2RノックアウトマウスではCRFR作動薬がこの抗萎縮効果を示さないことが示される。また、CRF1Rによって媒介されるHPA軸が副腎の除去(外科的副腎摘出術)によって遮断されたラットでは、非選択的CRFR作動薬でこれらの動物を処置すると抗萎縮効果が示され、CRF2Rが抗萎縮効果を媒介することが示唆される。さらに、これらの結果から、非選択的CRFR作動薬を投与すると肥大誘発効果を示すことが実証される。合わせて、これらのデータから、骨格筋萎縮プロセスにおけるCRF2Rの調整的役割が実証される。生体内におけるCRFRの具体的な役割は、以下に記載する多様な骨格筋萎縮モデルにおいて、CRFRの選択的作動薬であるソーバジン(バッケム・バイオサイエンス社(Bachem Biosciences,Inc.)、ペンシルベニア州キングオブプルージア)及びウロコルチン(バッケム・バイオサイエンス社(Bachem Biosciences,Inc.))という薬剤を使用して調査された。これらの薬剤は、十分に特徴付けられており、科学文献に記載されている。
CRF1R、CRF2R、CRF、及びCRF類似体は、抗体の生成、本発明のスクリーニング・アッセイでにおける試薬としての使用、及び骨格筋萎縮の処置のための医薬品試薬としての使用を含めて、様々な使用に関して調製することができるが、これに限るものではない。本発明のある種の実施形態には精製ポリペプチドが最も有用であり、他の実施形態にはポリペプチドを発現する細胞株が最も有用であることが、当業者には明白である。例えば、CRFRの構造的及び機能的特徴を保持することが重要な状況、例えばCRFRを活性化する候補化合物を同定するスクリーニング方法においては、機能的CRFRを発現する細胞を使用することが望ましい。
CRFRの1つ以上のエピトープを選択的に認識する抗体も、本発明に包含される。このような抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、Fab発現ライブラリを用いて産生された分子、トランスジェニックマウスで産生されたヒト抗体(ポリクローナル又はモノクローナル抗体)、及び前述のいずれかの断片に結合するエピトープが挙げられる。治療的な使用の場合、キメラ抗体又はヒト抗体が好ましく、ヒト抗体が最も好ましい。
本発明のアッセイにしたがってスクリーニングできる化合物としては、植物又は動物抽出物のような天然産物、合成化学物質、タンパク質、ランダムペプチドライブラリのメンバ、D−又はL−型アミノ酸からなる順列組み合わせ的化学由来の分子ライブラリ、ホスホペプチドを含むが、これに限定されない(ランダム又は部分的に変性した指向性ホスホペプチドライブラリのメンバを含むが、これには限定されない)可溶性ペプチドのようなペプチド、抗体(ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト、抗イディオタイプ、又は短鎖抗体、及びFab、F(ab’)2及びFab発現ライブラリ断片ならびにこれらのエピトープ結合断片を含むが、これには限定されない)、有機及び無機分子を含む生物学的活性材料を含め、既知の化合物ライブラリを挙げられるが、これに限るものではない。
CRF2Rが骨格筋萎縮を調節する役割を果たすことがわかったことで、骨格筋萎縮の予防的又は治療的処置に最終的に使用し得る候補化合物を同定するための1つ以上の試験化合物をスクリーニングする多様な方法が可能になる。本発明は、CRF2Rに結合し、CRF2Rを活性化し、作動薬によって誘発されるCRF2R又はCRF2Rシグナルトランスダクション経路の活性化を持続又は増大させ、あるいはCRF2R又はCRF遺伝子の発現を増加させる能力に関して、試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。
前述のように、生体外アッセイによって、1つ以上の試験化合物から選択される候補化合物を、骨格筋萎縮及び/又は肥大モデル系で骨格筋量又は機能を調節する能力についてさらに試験を実施することができる。このような骨格筋萎縮又は肥大モデルには、骨格筋萎縮の生体外細胞培養モデルと生体内動物モデルの両方が含まれる。このような追加的なレベルのスクリーニングは、追加的な調査、例えば候補化合物の範囲をさらに狭めるのに有用である。
骨格筋萎縮の生体外モデルは、当該技術分野において既知である。このようなモデルについては、例えば、バンデンブルフ(Vandenburgh)H.H.の生体外(In Vitro)24:609〜619(1988);バンデンブルフ(Vandenburgh)H.H.らの生体力学雑誌(J of Biomechanics)、24Suppl 1:91〜99(1991);バンデンブルフ(Vandenburgh)H.H.らの生体外細胞発展生物学(In Vitro Cell.Dev.Biol.)、24(3):166〜174(1988);クロミアック(Chromiak)J.A.らの生体外細胞発展生物学・動物学(In Vitro Cell.Dev.Biol.Anim.)、34(9):694〜703(1998);シャンスキー(Shansky)J.らの生体外細胞発展生物学・動物学(In Vitro Cell.Dev.Biol.Anim.)、33(9):659〜661(1997);ペロン(Perrone)C.E.らの生化学雑誌(J.Biol.Chem.)270(5):2099〜2106(1995);クロミアック(Chromiac)J.A.及びバンデンブルフ(Vandenburgh)H.H.の細胞生理学雑誌(J.Cell.Physiol.)159(3):407〜414(1994);ならびにバンデンブルフ(Vandenburgh)H.H.及びカーリッシュ(Karlisch)P.の生体外細胞発展生物学(In Vitro Cell.Dev.Biol.)25(7):607〜616(1989)に記載されている。このようなモデルは、前述の生体外スクリーニングにしたがって動物モデルでの試験に値する候補化合物の範囲をさらに狭めるのに有用であるが、必ずしも必要ではない。細胞培養モデルを候補化合物によって処置し、処置に対するモデルの応答を、筋肉タンパク質合成又は分解、骨格筋量、又は収縮機能における変化など、筋肉マーカの変化を評価することによって測定する。筋肉マーカで有意な変化を誘発する化合物には、典型的には、骨格筋萎縮の動物モデルでさらにスクリーニングを実施する。
候補化合物をヒト以外の動物に投与し、例えば、骨格筋量、骨格筋機能、筋肉又は筋線維断面積、収縮タンパク質含量、収縮タンパク質含量、非収縮タンパク質含量、あるいは骨格筋量又は機能変化と相関のある生化学又は遺伝子マーカのような、萎縮又は肥大のマーカの変化を評価することによって、動物の応答性を監視する。骨格筋肥大を誘発し、又は骨格筋萎縮のいかなる側面も防止する候補化合物は、ヒトの骨格筋萎縮を処置するための見込み治療用候補と見込むものとして考えるべきであり、本明細書では治療用候補化合物と呼ぶ。候補化合物が骨格筋萎縮を調節する能力の評価に加えて、毒性のような望ましくない副作用もまた、このようなスクリーニングで検出することができる。許容不可能な高レベルの副作用がないことを、治療用候補化合物の選択のためのさらなる基準として使用してよい。
CRF2Rの全体的な活性は、適切な組織中でCRF2R(CRF2Rの発現を増加させるために)又は構成的活性型CRF2Rについて遺伝子を過剰発現させることによって増加させることができる。CRFレベルは、同様にCRF遺伝子を過剰発現させることによって生体内で増加させることができる。これらの遺伝子の過剰発現は、総細胞CRF2R活性を高め、したがって骨格筋萎縮を調節する。関心ある1つ又はそれ以上の遺伝子を、被験体での発現に好適なベクターに挿入する。これらのベクターには、DNAを細胞内に導入する他の粒子(例えば、リポソーム、金粒子など)、又は関心ある遺伝子を含有するDNA発現ベクターのヒト組織(例えば筋肉)への直接注射に加えて、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、レトロウイルス及びヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これだけに限るものではない。
本明細書に記載するスクリーニング方法によって同定される候補化合物又は治療用候補化合物は、骨格筋萎縮を処置するために、あるいは骨格筋肥大を誘発させるために、個体に投与することができる。このために、本発明は、手術、ベッド休養、骨折による不使用;神経除去/脊髄損傷による神経損傷;自己免疫疾患;感染病;無関係条件での糖質コルチコイド使用;感染症又は他の原因による敗血症;病気又は飢餓による栄養制限;癌性悪液質;慢性炎症;AIDS性悪液質;COPD;うっ血性心不全;サルコペニア及び遺伝病;例えば、筋ジストロフィー、神経変性病によって誘発される骨格筋萎縮を含むが、これに限るものではない、骨格筋萎縮を変調させるための方法及び組成物を包含する。CRF2Rの作動薬は、骨格筋萎縮を阻害するために使用することができる。有効な化合物が必ずしもCRFRに絶対的特異性を示す必要はない。他の病変受容体の特異的拮抗薬を、有効であるが特異性のない作動薬と併せて共投与できることも企図されている。あるいは、単独投薬又は投薬計画の調節によって、この特異性の欠如に対処してもよい。
CRFRに害を与える化合物の安全性及び治療的有効性は、生体外又は生体内技術を用いる標準的な手順によって判定することができる。大きい治療指数を示す化合物が好ましいが、副作用のレベルが許容可能であれば、治療指数の低い化合物も有用である。生体外及び生体内の毒性学的及び薬理学的技術から得られるデータを使用して、有用な可能性のあるヒトの用量範囲を配合することができる。好ましい用量は、化合物の循環濃度が許容可能な安全性を備えて治療的に最大限になる範囲内にある。化合物の循環濃度は、投薬形態、投薬後の時間、投与経路などに応じて変更してよい。副作用が許容可能であれば、この範囲から外れる用量も有用である。患者の年齢や体重などの事項を使用して、従来の方式でこのような事項を判定することができる。薬理遺伝学的手法が、臨床群における化合物の選択、用量、及び投薬計画の最適化に有用な可能性がある。
本発明による骨格筋萎縮の調節で使用するための医薬品組成物は、薬学的に許容可能な担体及び賦形剤を使用し、従来の方法を用いて配合することができる。本発明の組成物は、単位剤形で提供することが好ましい。本明細書で使用するとき、「単位剤形」とは、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト被験体への投与に好適な、優良医療基準による1回用量のCRF2R作動薬の量を含有する本発明の組成物である。医薬品組成物は、例えば、経鼻投与、経皮投与、吸入投与、非経口投与、皮膚投与、経口投与、又は直腸投与による送達のために配合してよい。経口投与の場合、医薬品組成物は、薬理学的に活性な化合物、ならびに結合剤、充填剤、潤沢剤、崩壊剤、又は湿潤剤を含むが、これに限定されない添加物を含有する錠剤又はカプセル剤形にしてもよい。錠剤は、コーティングしてよい。経口投与のための液体製剤には、薬理学的に活性な化合物、ならびに、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル、防腐剤、緩衝塩、香料、着色剤、甘味剤などを含むが、これに限定されない添加物を含有する、シロップ、懸濁液、又は使用前に液体で再構成する乾燥製品が含まれるが、これだけに限るものではない。経口投与用の医薬品組成物は、口、胃、又は腸管における薬理学的活性化合物の放出を制御するように配合してよい。
CRF2Rの発現又は活性に対する化合物(例えば薬物)の影響の監視は、基本的な薬物スクリーニングだけでなく、治験においても実施することができる。例えば、スクリーニング・アッセイによってCRF2R受容体活性活性又はCRF2R受容体発現を増加させると判定された化合物の効果については、骨格筋萎縮の患者又は骨格筋萎縮の危険性のある患者の治験において評価することができる。試験化合物又は擬薬投与後の多様な時点で、例えば、骨格筋量、骨格筋機能、筋肉破壊の生化学的マーカ、又は生活水準指標の変化を観察することによって、患者に対する化合物の効果を判定することができる。ヒト被験体で骨格筋量を測定する方法は、当該技術分野においては既知であり、例えば、手足の周囲の測定;例えばコンピュータ・断層撮影法、MRI、又は超音波による筋肉の厚さの測定;あるいは、形態学的・生化学的パラメータ(例えば、線維面積の断面積、線維直径、又は酵素活性)を検査するための筋肉生検などが挙げられる。さらに、骨格筋量が骨格筋機能と相関があるので、筋機能は、筋量の代替的なマーカとして使用でき、筋量は、機能的測定、例えば、強度、協力筋群の力、又は筋電計記録で見られる収縮特徴を使用して評価することができる。加えて、筋萎縮の結果生じる筋肉タンパク質喪失は、被験体の尿又は血液中のアミノ酸又はアミノ酸誘導体、すなわち3−メチルヒスチジンのレベルの定量化によって測定することができる。このような方法の概観については、アッペル(Appell)のスポーツ医学(Sports Med.)10:42−58(1990)を参照のこと。生活水準指標としては、椅子からの立ち上がりの容易さ、疲労前の歩数、又は階段昇降能力が挙げられるが、これだけに限るものではない。
(ヒトCRF2R受容体の発現のためのベクターの構築)
ヒトCRF2R(hCRF2R)DNA配列(受入番号E12752)を取り出し、1つが開始コドンで開始する遺伝子の5’端を含み(5’オリゴヌクレオチド)、1つが停止コドンを含有する遺伝子の3’端を含む(3’オリゴヌクレオチド)、2つのオリゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドは、5’オリゴヌクレオチド内に1つのユニーク部位を有し、3’オリゴヌクレオチドに異なる制限エンドヌクレアーゼのユニーク部位を有する、hCRF2R遺伝子には存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を含むように設計される。さらに、3’オリゴヌクレオチドは、ポリアデニル化添加信号配列を含有する。ヒト骨格筋由来の二重鎖cDNAは、ユニバーサル・クイック・クローン・cDNAコレクション(Universal QUICK−Clone cDNA collection)(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)から購入される。前述の5’及び3’オリゴヌクレオチドを使用して、hCRF2R cDNAが、アドバンタックPCRキット(AdvanTaq PCR kit)(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)を使用したヒト骨格筋cDNAのPCRによって増幅される。hCRF2R遺伝子PCR産物は、アガロースゲル電気泳動によってPCRアーチファクトから精製され、hCRF2R遺伝子DNA断片は、ヌクレオトラップ(NucleoTrap)(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)などの精製製品を使用してアガロースゲルから精製される。
(受容体結合アッセイ)
化合物の受容体結合分析は、実施例1のHEK293/CRE−LUC/pIRESneo/hCRF2R細胞を96ウェル・ポリリシンコーティングプレートで平板培養することによって細胞全体に実施する。細胞を、37℃の5%二酸化炭素/95%周囲空気中で、10%ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、L−グルタミン、非必須アミノ酸を含むDMEM培地に播種し、一晩インキュベートする。培養培地を取り除き、MEM(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)メリーランド州ロックビル)中のユーロピウム(Eu−CRF)+10%シーブロック(Seablock)(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)で共有結合的に標識した適切な量のCRFを添加する。細胞をEu−CRFと共に室温で90分インキュベートし、次いでマグネシウムとカルシウムを含まないリン酸緩衝液(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)メリーランド州ロックビル)で4回洗浄する。最後の洗浄の後、強化溶液(ワラック社(Wallac Inc.)メリーランド州ゲイサーズバーグ)を添加し、バイオワークス・ユーロピウム・プログラム(BioWorks Europium program)を使用してワラック・プレート・リーダ(Wallac plate reader)(ワラック社(Wallac Inc.)メリーランド州ゲイサーズバーグ)でプレートを読み取る。飽和結合分析の場合、10(−12)〜10(−3)Mの範囲のEu−CRFのlog用量を細胞に添加し、非特異的結合の評価のために、非標識CRFの飽和濃度を含まない環境と含む環境の両方で結合を分析する。競合的結合の場合、関心ある化合物の濃度の変更に加えて、結合の間に最大値の半分であるEu−CRF濃度を添加する。
(受容体活性化アッセイ)
受容体活性化分析は、実施例1のHEK293/CRE−LUC/pIRESneo/hCRF2R細胞をパッカード・ビュー・プレート(Packard View Plate)−96(パッカード社(Packard Inc.)カリフォルニア州)に播種して実施する。細胞を、37℃の5%二酸化炭素/95%周囲空気中で、10%ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、L−グルタミン、非必須アミノ酸を含むDMEM培地に播種し、一晩インキュベートする。次いで培地を取り除き、関心ある化合物を含有する、0.01%ウシアルブミン断片V(シグマ(SIGMA)ミズーリ州セントルイス)を含むDMEM(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)メリーランド州ロックビル)で置き換える。次いで、細胞を37℃の5%二酸化炭素/95%周囲空気中で4時間インキュベートし、その後培地を取り除いて、ハンクス平衡食塩水溶液(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)メリーランド州ロックビル)で細胞を2回洗浄する。次いで、溶解試薬(Lysis Reagent)(プロメガ社(Promega Inc.)ウィスコンシン州マジソン)を洗浄した細胞に加え、細胞を37℃の5%二酸化炭素/95%周囲空気中で20分間インキュベートする。次いで、細胞を−80℃に20分間置き、その後37℃の5%二酸化炭素/95%周囲空気中で20分間インキュベートする。このインキュベーションの後、ルシフェラーゼ分析緩衝液及びルシフェラーゼ分析基質(プロメガ社(Promega Inc.)ウィスコンシン州マジソン)を細胞溶解物に加え、照度計を使用してルシフェラーゼ活性を定量化する。化合物暴露後の増加を、化合物暴露後の、hCRF2RなしでCRE−LUC構成を含有するHEK細胞中のルシフェラーゼのレベルと比較することによって、化合物の相対的な活性を評価する。10倍超過のhCRF2R拮抗薬を含む環境及び含まない環境で、hCRF2R/CRE−LUC HEK細胞の化合物へのルシフェラーゼ応答を評価することによって、応答の特異性についても確認する。
(CRF2R及び/又はCRF2受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続又は増大させる候補化合物を同定するためのスクリーニング)
作動薬によって誘発されるCRF2R又はCRF2Rシグナルトランスダクション経路の活性化を持続又は増大させる化合物の同定は、実施例3で説明した受容体活性化アッセイの変形形態に関する。具体的には、このアッセイは、HEK293/CRE−LUC/pIRESneo/hCRF2R受容体細胞をパッカード・ビュー・プレート(Packard View Plate)−96(パッカード社(Packard Inc.)カリフォルニア州)に播種することによって実施する。細胞を、37℃の5%二酸化炭素/95%周囲空気中で、10%ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、L−グルタミン、非必須アミノ酸、及びCRFの飽和量を含むDMEM培地に播種し、48時間インキュベートする。次いで、培地を取り除き、関心ある化合物に加えて0.01%ウシアルブミン断片V(シグマ(SIGMA)ミズーリ州セントルイス)及びCRFを含むDMEM(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)メリーランド州ロックビル)で置き換える。次いで、細胞を37℃の5%二酸化炭素/95%周囲空気中で4時間インキュベートし、その後培地を取り除いて、ハンクス平衡食塩水溶液(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)メリーランド州ロックビル)で細胞を2回洗浄する。次いで、溶解試薬(Lysis Reagent)(プロメガ社(Promega Inc.)ウィスコンシン州マジソン)を洗浄した細胞に加え、細胞を37℃の5%二酸化炭素/95%周囲空気中で20分間インキュベートする。次いで、細胞を−80℃に20分間置き、その後37℃の5%二酸化炭素/95%周囲空気中で20分間インキュベートする。このインキュベーション後、ルシフェラーゼ分析緩衝液及びルシフェラーゼ分析基質(プロメガ社(Promega Inc.)ウィスコンシン州マジソン)を細胞溶解物に加え、照度計を使用してルシフェラーゼ活性を定量化する。細胞密度のばらつき補正後、対照の未処置細胞のレベルを有意に超えて蛍光発色を刺激する試験化合物を、骨格筋量又は機能を調節する候補化合物とする。最も関心のある化合物は、相対的に高レベルの蛍光を誘発するものである。
(CRF2Rに特異的な候補化合物を同定するためのスクリーニング)
CRF2Rを活性化する化合物を実施例3のように同定する。CRF1RよりもCRF2Rに選択性を示す化合物を選択するために、これらの化合物もCRF1Rに対してスクリーニングする。HEK293/CRE−LUC/pIRESneo/hCRF1R細胞は、初期のPCR増幅にヒトCRF1R(hCRF1R)DNA配列、受入番号X72304が使用されることを除き、本質的には実施例1に記載したように生成される。CRF1Rに対する化合物の活性がどの程度であるか判定するには、プレートに播種するのにHEK293/CRE−LUC/pIRESneo/hCRF1R細胞が使用されることを除き、本質的に実施例3に記載したように活性化アッセイを実施する。CRF2Rを発現する細胞中の化合物によって刺激される蛍光の量を、CRF1Rを発現する細胞中の化合物によって刺激される蛍光の量と比較する。次いで、CRF1Rを発現する細胞よりも、CRF2Rを発現する細胞に10倍高い応答性(モル数を基準にして)を示す化合物を、クローンのばらつきによる差異をなくすために応答性の特異性にについてさらに調査する。HEK293/CRE−LUC/pIRESneo/hCRF2R細胞に、10倍を超過するCRF2R拮抗薬である抗ソーバジン−30の存在する環境又は存在しない環境で、化合物によってアッセイを実施する。CRF2Rに10倍より高い選択性を示し、その活性が抗ソーバジン−30によって阻害される化合物を候補化合物として選択する。
(hCRF2Rの発現を増加させる候補化合物を同定するためのスクリーニング)
適切な組織中のhCRF2R遺伝子の生理的発現に必要なすべての調節エレメントを含むように、転写開始部位の十分に上流で開始するhCRF2R遺伝子のプロモーター領域を含有する配列をヒトゲノムのデータベースから読み出す。一方がプロモーター領域の5’端を含有し(5’オリゴヌクレオチド)、他方が転写開始部位を含むプロモーター領域の3’端を含有する(3’オリゴヌクレオチド)、2つのオリゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドは、5’オリゴヌクレオチド内に1つのユニーク部位を有し、3’オリゴヌクレオチド内に異なる制限エンドヌクレアーゼのユニーク部位を有する、hCRF2R遺伝子調節領域には存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。5’及び3’オリゴヌクレオチドは、PCRキットである、アドバンテージ(Advantage)(登録商標)ゲノムPCRキット(Genomic PCR kit)(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)を使用してヒトDNA由来のhCRF2R遺伝子調節領域(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)のPCR増幅のために使用する。hCRF2R遺伝子調節領域PCR産物は、アガロースゲル電気泳動によってPCRから精製され、hCRF2R遺伝子調節領域DNA断片は、ヌクレオトラップ(NucleoTrap)(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)などの精製製品を使用してアガロースゲルから精製される。hCRF2R遺伝子調節領域PCR産物のpECFP−1ベクター(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)へのクローニングは、5’及び3’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備が完了するように、hCRF2R遺伝子調節領域PCR産物及びpECFP−1ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼによって初めに切断することによって達成される。pECFP−1ベクターDNAのhCRF2R遺伝子調節領域PCR産物DNAへのライゲーションは、製造業者の推奨にしたがって、アドバンテージ(AdvantAge)(商標)PCRクローニング・キット(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)からのDNAリガーゼを使用して達成される。次いで、ライゲーションしたベクター及び挿入構成を使用して、TOP10F’を適格大腸菌(E.coli)細胞(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)に形質転換させる。細胞をLB及びカナマイシン含有寒天上で平板培養し、さらなる分析のためにカナマイシン耐性コロニーを選択する。カナマイシン耐性クローンをカナマイシン含有LB培地で培養し、ヌクレオボンドDNA精製システム(NucleoBond DNA Purification System)(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)を用いてプラスミドDNAを単離し、hVPAC2遺伝子調節領域を含有する構成をDNA配列法によって分析して、構成の正確性及び一体性を確実にする。次いで、hCRF2R遺伝子調節領域を含有する精製された構成プラスミドDNAを、カルフォス(CalPhos)(商標)哺乳類トランスフェクションキット(Mammalian Transfection Kit)(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)を用い、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションを使用して、HEK293細胞中にトランスフェクションする。トランスフェクションした細胞クローンを、G418を用いて選択し、単離して、37℃の5%二酸化炭素/95%周囲空気中で、10%ウシ胎児血清(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)メリーランド州ロックビル)、L−グルタミン(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)メリーランド州ロックビル)、非必須アミノ酸(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)メリーランド州ロックビル)、及びG418(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)メリーランド州ロックビル)を含むDMEM(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)メリーランド州ロックビル)中で増殖させる。G418耐性クローンは、それがhCRF2R遺伝子プロモーター配列を確実に含有するように、サザン・ブロッティング(Southern blotting)によって特徴化し、さらにhCRF2R遺伝子調節領域の活性化を適切な刺激剤を用いて分析する。次いで、適切なレベルでhCRF2R遺伝子調節領域−ECFPを発現する細胞を、以下のようにhCRF2R遺伝子調節領域の活性を変調させることのできる化合物を評価するように設計されたアッセイで使用する。調節領域活性化分析は、hCRF2R遺伝子調節領域−ECFP含有HEK293細胞を、適切な密度で、黒・透明底96ウェル・マイクロタイタープレートに播種し、一晩成長させることによって実施する。翌日、培地を取り除き、試験化合物を新しい成長培地に加える。細胞を、37℃で5%二酸化炭素/95%周囲空気中で16時間インキュベートし、その後蛍光を測定する(蛍光光度計(バイオルミン(biolumin)(商標)960、モルキュラー・ダイナミクス/アマーシャム・ファーマシア・バイオテック(Molecular Dynamics/Amersham Pharmacia Biotech)ニュージャージー州ピスカタウェイ)使用、検出放射475(501)nmによる励起433(453)nm)。細胞密度のばらつき補正後、対照の未処置細胞のレベルを有意に超えて蛍光発色を刺激する試験化合物を、骨格筋量又は機能を調節する候補化合物とする。最も関心のある化合物は、相対的に高レベルの蛍光を誘発するものである。
(ヒトCRF発現を増加させる化合物を同定するためのスクリーニング)
ヒトCRF(hCRF)発現を増加させる化合物を同定するための方法は、調節領域がhCRF遺伝子のために使用されるものであることを除き、本質的にはhVPAC2受容体の発現を増加させる化合物を同定するための方法と同一である。適切な組織中のhCRF遺伝子の生理学的発現に必要なすべての調節エレメントを含むように、転写開始部位の十分に上流で開始するhCRF遺伝子の調節領域を含有する配列をヒトゲノムのデータベースから読み出す。一方が調節領域の5’端を含有し(5’オリゴヌクレオチド)、他方が転写開始部位を含む調節領域の3’端を含有する(3’オリゴヌクレオチド)、2つのオリゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドはまた、5’オリゴヌクレオチド内に1つのユニーク部位を有し、3’オリゴヌクレオチド内に異なる制限エンドヌクレアーゼユニーク部位を有する、hCRF遺伝子調節領域には存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。5’及び3’オリゴヌクレオチドは、アドバンテージ(Advantage)(登録商標)ゲノムPCRキットを使用して(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)ヒトDNA由来のhCRF遺伝子調節領域(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)のPCR増幅のために使用される。hCRF遺伝子調節領域PCR産物は、アガロースゲル電気泳動によってPCRアーチファクトから精製され、hCRF遺伝子調節領域DNA断片は、精製製品であるヌクレオトラップ(NucleoTrap)(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)を使用してアガロースゲルから精製される。hCRF遺伝子調節領域PCR産物のpECFP−1ベクター(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)へのクローニングは、5’及び3’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備が完了するように、hCRF遺伝子調節領域PCR産物及びpECFP−1ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼによって初めに切断することによって達成される。 pECFP−1ベクターDNAのhCRF遺伝子調節領域PCR産物DNAへのライゲーションは、製造業者の推奨にしたがって、アドバンテージ(AdvantAge)(商標)PCRクローニング・キット(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)からのDNAリガーゼを使用して達成される。次いで、ライゲーションしたベクター及び挿入構成を使用して、TOP10F’を適格大腸菌(E.coli)細胞(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)に形質転換させる。細胞をLB及びカナマイシン含有寒天上で平板培養し、さらなる分析のためにカナマイシン耐性コロニーを選択する。カナマイシン耐性クローンをカナマイシン含有LB培地で培養し、ヌクレオボンドDNA精製システム(NucleoBond DNA Purification System)(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)を使用してプラスミドDNAを単離し、hCRF遺伝子調節領域を含有する構成をDNA配列法によって分析して、構成の正確性及び一体性を確実にする。次いで、hCRF遺伝子調節領域を含有する精製された構成プラスミドDNAを、カルフォス(CalPhos)(商標)哺乳類トランスフェクションキット(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)を用いるリン酸カルシウム媒介トランスフェクションを使用して、HEK293細胞中にトランスフェクションする。トランスフェクションした細胞クローンを、G418を使用して選択し、単離して、37℃の5%二酸化炭素/95%周囲空気中で、10%ウシ胎児血清(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)メリーランド州ロックビル)、L−グルタミン(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)メリーランド州ロックビル)、非必須アミノ酸(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)メリーランド州ロックビル)、及びG418(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)メリーランド州ロックビル)を含むDMEM(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)メリーランド州ロックビル)中で増殖させる。G418耐性クローンは、それがhCRF遺伝子調節領域配列を確実に含有するように、サザン・ブロッティング(Southern blotting)によって特徴化し、さらに、適切な刺激剤を使用してhCRF遺伝子調節領域の活性化を分析する。次いで、適切なレベルでhCRF遺伝子調節領域−ECFPを発現する細胞を、以下のように、hCRF遺伝子調節領域の活性を変調させることのできる化合物を評価するように設計されたアッセイで使用する。調節領域活性化分析は、hCRF遺伝子調節領域構成を含有するクローンを使用することを除いて実施例5と同様に実施する。
(hCRF2Rを活性化するヒト抗体の製造方法)
hCRF2Rを活性化する完全なヒトモノクローナル抗体は、以下のように最初に組換えhCRF2Rタンパク質を形成することによって製造する。実施例1からの手順を続けて、hCRF2R PCR産物を得る。次いで、このhCRF2R PCR産物を、5’及び3’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備を完了するように初めにhCRF2R遺伝子PCR産物及びpHAT20ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼによって切断することによって、pHAT20ベクター(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)にクローニングする。pHAT20ベクターDNAのhCRF2R遺伝子PCR産物DNAへのライゲーションは、製造業者の推奨にしたがって、アドバンテージ(AdvantAge)(商標)PCRクローニング・キット(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)からのDNAリガーゼを使用して達成される。次いで、ライゲーションしたベクター/挿入構成を使用して、TOP10F’を適格大腸菌(E.coli)細胞(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)に形質転換させる。形質転換させた細胞をLB及びアンピシリン含有寒天上で平板培養し、さらなる分析のためにアンピシリン耐性コロニーを選択する。陽性のクローンをアンピシリン含有LB培地で培養し、ヌクレオボンドDNA精製システム(NucleoBond DNA Purification System)(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)を使用してプラスミドDNAを単離し、hCRF2R遺伝子を含有する構成をDNA配列法によって分析して、構成の正確性及び一体性を確実にする。次いで、hCRF2R−pHAT20ベクターDNAを、HAT配列の開始部とhCRF2R−pHAT20構成には存在しない制限エンドヌクレアーゼ単一部位を含む5’オリゴヌクレオチド、ならびに既に使用した3’hCRF2Rオリゴヌクレオチドを使用することによって、さらなるPCRクローニングに使用する。オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、hCRF2R−pHAT20構成からのHAT−hCRF2R融合遺伝子をPCR増幅し、前述のようにPCR産物を精製する。次いで、HAT−hCRF2R融合遺伝子PCR産物を、クローンテック製BacPAKバキュロウイルス発現システム(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)を用いて、pBacPAK8ベクターへのクローニングに使用する。HAT−−hCRF2R融合遺伝子のpBacPAK8ベクターへのライゲーションは、本質的には前述の通りである。次いで、hCRF2R/HAT−pBacPAK8構成をTOP10’F適格大腸菌(E.coli)細胞にトランスフェクションし、アンピシリン耐性細胞を選択し、プラスミドDNAを単離して前述のように構成の一体性に関して確認する。次いで、カルフォス(CalPhos)(商標)哺乳類トランスフェクションキット(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)を用いて、この構成を線形化BacPAK6DNAと併せてSf21昆虫宿主細胞に共トランスフェクションする。次いで、昆虫細胞を2〜3日インキュベートし、その後、個々の明確なプラークからウイルスを採取する。その後、すべて、製造業者(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)の推奨にしたがって、BacPAK昆虫細胞培地を使用し、ウイルスをsf21細胞内で増幅させ、採取したウイルスを力価測定し、力価測定したウイルスをSf21細胞の大規模感染に使用する。次いで、製造業者が推奨する条件を用いて、TALON(登録商標)クローンテック製CellThru精製キット(クローンテック社(Clonetech Inc.)米国カリフォルニア州パロアルト)を使用して、組換えHAT−CRF2R融合タンパク質を精製する。簡潔には、感染の48時間後に、感染させたSf21細胞を採取し、抽出/ローディング緩衝液内で超音波分解する。次いで、細胞溶解物をTALON(登録商標)CellThruカラムの中に押し込む。カラムを抽出/ローディング緩衝液で2度洗浄し、結合したHAT−hCRF2Rタンパク質を溶出緩衝液で溶出させる。溶出したタンパク質を、製造業者(Bio−Radラボラトリーズ(Bio-Rad Laboratories)カリフォルニア州ハーキュレス)の推奨にしたがって、Bio−Rad SDS−PAGEシステム及びタンパク質定量化システムを使用し、一体性に関してSDS−PAGEによって分析し、タンパク質濃度を定量化する。その後、精製したHAT−hCRF2R融合タンパク質を、以下のようにヒトモノクローナル抗体製造のために異種マウス(XenoMouse)動物の免疫化に使用する。10μgの精製した組換えHAT−hCRF2R融合タンパク質を、25μgの補助剤モノホスホリル脂質A(シグマ(Sigma)ミズーリ州セントルイス)と組み合わせて使用して、8週を超える期間にわたって何度も10匹の異種マウス(XenoMouse)動物に接種する。接種した動物から血清を取得し、HAT−hCRF2R融合タンパク質を含むコーティングポリスチレンELISAプレート(コーニング・グラス・ワークス(Corning Glass Works)ニューヨーク州コーニング)によって、精製したHAT−hCRF2R融合タンパク質を用いる抗原回収ELISAで使用して、HAT−hCRF2Rタンパク質に対する抗体を検出し、PBS−1%BSAでブロッキングし、洗浄して、血清試料の1:50希釈液と共に37℃で1時間インキュベートする。PBSで5回洗浄後、ヒト免疫グロブリンGに対するアルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗体と共に、37℃で1時間インキュベートする。次いで、プレートをPBSで5回洗浄し、緩衝液中のp−ニトロフェニルホスフェート基質(シグマ(Sigma)ミズーリ州セントルイス)によって抗体を検出する。プレート・リーダを使用して405nmでの光学密度を測定し、信号を定量化した。高い抗体産生が実証されたマウスを、ハイブリドーマ形成のために使用する。ハイブリドーマは、異種マウス(XenoMouse)動物からの脾臓細胞と非分泌骨髄腫細胞株NSA−bcl2を、30%ポリエチレングリコールPEG450の存在下で、比率4:1の脾臓細胞とNSA−bcl2細胞を使用して融合させることによって生成される。融合細胞を、96ウェルプレートに制限希釈して、10%ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、L−グルタミン、100U/mlペニシリン−ストレプトマイシン、及びヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジンを含むRPMI−1640培地内で培養することによって、個々にクローニングする(すべてライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)(メリーランド州ロックビル)から入手)。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン選択ハイブリドーマからの上清を、前述のようにELISAによってヒト抗体産生に関してスクリーニングした。HAT−hCRF2R融合タンパク質に対するヒト抗体を産生するハイブリドーマは、大規模な抗体産生のため選択される。モノクローナル抗体を、タンパク質G−セファロース(Sepharose)クロマトグラフィーによって精製する。簡潔には、培養したハイブリドーマクローンからの上清を、ローディング培養液中でタンパク質G−セファロースカラム(シグマ(SIGMA)ミズーリ州セントルイス)上に置き、3回洗浄し、IgGを溶出緩衝液で溶出させる。次いで、これらの抗体を、hCRF2R活性化(作動性)潜在能力を評価するためのスクリーニングで使用する。これは、実施例3で概略した方法を使用して実施する。hCRF2Rに対する作動薬活性を示すヒトモノクローナル抗体は、指定される候補化合物である。
(筋肉の絶対力の測定値の判定)
ギプス固定したマウスの肢から、長指伸筋(EDL)及びヒラメ筋を腱間で摘出する。
(hCRF2R受容体の作動薬であるヒト抗体を使用した骨格筋萎縮の治療的処置)
体重50kgの、長期のベッド休養による腕及び肢の重度筋萎縮を患うヒト男性被験者に、骨格筋萎縮を改善させるための処置を行った。3ヶ月間、週に1度、CRF2R受容体の活性化抗体を含むpH6の水溶液15mlを、静脈注射を介して被験者に投与する。
(hCRF2R受容体の作動薬であるヒト抗体を使用した骨格筋萎縮の予防的処置)
体重55kgのヒト女性被験者に、1ヶ月以内に臀部関節置換手術を計画する。術後回復時の筋肉不使用による骨格筋萎縮のレベルを最終的に低減させるために、手術の前と後に被験者に骨格筋量を増加させるための処置をする。具体的には、手術前の1か月間及び手術後の2ヶ月間、週に1度、CRF2R受容体の活性化抗体を含むpH6の水溶液18mlを、静脈注射を介して被験者に投与する。この溶液は、以下を含む:
(CRF2R受容体の作動薬であるヒト抗体を使用した骨格筋萎縮の予防的処置)
体重45kgのヒト女性被験者に、落下後の上腕の単純骨折を処置するためにギプス固定術を実施する。被験者に、骨折治癒時の不使用及び制限使用による患部の腕と肩の骨格筋萎縮を防止する処置を実施する。具体的には、ギプス固定の日から開始して、週に1度、抗hCRF2R受容体を含むpH6の水溶液13mlを、静脈注射を介して被験者に投与する。この溶液は、以下を含む:
(ウロコルチン−IIを使用した骨格筋萎縮の予防的処置)
昏睡状態の体重60kgのヒト女性被験者を病院に収容する。被験者に、この方法によって、昏睡状態における不使用による全身の骨格筋萎縮を防止するための処置を実施する。具体的には、昏睡状態の間、1日に1度、次の原液5mlを滅菌食塩水500mlに加えることによって調製される水溶液約500mlを、緩やかな静脈注射を介して被験者に投与する:
(CRFを使用したデュシェンヌ筋ジストロフィー患者の治療的処置)
デュシェンヌ筋ジストロフィーと診断されている体重40kgの男性被験者を、同様の用量範囲にわたってCRF1−R及びCRF2−R作動性を示す化合物で処置する。被験者は、疾病が進行する間の筋強度及び機能を改善又は保持するために、化合物の持続放出性デポー製剤で処置する。具体的には、月に1度、筋肉注射を介して、以下を含むpH6.0の水溶液3mlを被験者に投与する:
Claims (20)
- 骨格筋量又は機能を調節する候補化合物を同定する方法であって、次の工程を含むことを特徴とする方法:
(a)試験化合物をCRF2Rに接触させる工程;
(b)前記試験化合物が前記CRF2Rに結合するかどうか判定する工程;
(c)前記CRF2Rに結合するこれらの化合物を選択し、さらに、骨格筋萎縮のモデル系で、前記試験化合物が骨格筋量又は機能を増加させるかどうか判定する工程;及び、
(d)骨格筋量又は機能を調節する候補化合物として、骨格筋量又は機能を調節するこれらの試験化合物を同定する工程。 - 前記請求項1の(a)から(d)の工程で特定される候補化合物の一覧を形成する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の候補化合物同定方法。
- 前記CRF2Rが、配列識別番号10の配列と80%より多く同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1に記載の候補化合物同定方法。
- 前記CRF2Rが、配列識別番号10の配列と90%より多く同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1に記載の候補化合物同定方法。
- 前記CRF2Rが、配列識別番号10、配列識別番号12、配列識別番号14、配列識別番号18、配列識別番号20、配列識別番号24、又は配列識別番号26のアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1に記載の候補化合物同定方法。
- 骨格筋量又は機能を調節する候補化合物を同定する方法であって、次の工程を含むことを特徴とする方法:
(a)試験化合物を、機能的CRF2Rを発現する細胞に接触させる工程;
(b)前記試験化合物が前記CRF 2 Rを活性化させるかどうかを判定する工程;
(c)前記CRF2Rを活性化するそれらの化合物を選択し、さらに、骨格筋萎縮のモデル系で、前記試験化合物が骨格筋量又は機能を増加させるかどうか判定する工程;ならびに、
(d)骨格筋量又は機能を調節する候補化合物として、骨格筋量又は機能を調節するこれらの試験化合物を同定する工程。 - 前記請求項6の(a)から(d)の工程で特定される候補化合物の一覧を形成する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項6に記載の候補化合物同定方法。
- 前記CRF2Rが、配列識別番号10の配列と80%より多く同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項6に記載の候補化合物同定方法。
- 前記CRF2Rが、配列識別番号10の配列と90%より多く同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項6に記載の候補化合物同定方法。
- 前記CRF2Rが、配列識別番号10、配列識別番号12、配列識別番号14、配列識別番号18、配列識別番号20、配列識別番号24、又は配列識別番号26のアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項6に記載の候補化合物同定方法。
- 前記CRF2Rが、真核生物の細胞中で発現されていることを特徴とする、請求項6に記載の候補化合物同定方法。
- CRF2Rを活性化する前記試験化合物の判定が、細胞性cAMPレベルの測定を含む、請求項6に記載の候補化合物同定方法。
- 前記細胞がcAMP応答性エレメントに操作可能に会合されたレポーター遺伝子をさらに含んでおり、前記細胞性cAMPレベルの測定が前記レポーター遺伝子の発現の測定を含むことを特徴とする、請求項6に記載の候補化合物同定方法。
- 骨格筋量又は機能を調節する候補化合物を同定する方法であって、次の工程を含むことを特徴とする方法:
(a)試験化合物を、機能的CRF2Rを発現する細胞に接触させ、前記試験化合物とCRF2Rとの相互作用から生じるCRF2Rの活性化レベルを判定する工程;
(b)前記試験化合物を、機能的CRF1Rを発現する細胞に接触させ、前記試験化合物とCRF1Rの相互作用から生じるCRF1Rの活性化レベルを判定する工程;
(c)前記CRF2R活性化レベルと前記CRF1R活性化レベルとを比較する工程;
(d)CRF1RよりもCRF2Rを選択的に活性化するこれらの試験化合物を選択する工程;
(e)さらに、骨格筋萎縮のモデル系で、前記試験化合物が骨格筋量又は機能を増加させるかどうかを判定する工程;および
(f)骨格筋量又は機能を調節する候補化合物として、骨格筋量又は機能を調節するこれらの試験化合物を同定する工程。 - 前記候補化合物がCRF2Rに100倍以上の選択性を示すことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 前記候補化合物がCRF2Rに1000倍以上の選択性を示すことを特徴とする、請求項15に記載の方法。
- 前記候補化合物がCRF2Rに1倍〜100倍の間の選択性を示すことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 骨格筋量又は機能を調節する候補化合物を同定する方法であって、次の工程を含むことを特徴とする方法:
(a)試験化合物をCRF2R、または機能的CRF2Rを発現する細胞と接触させる工程;
(b)前記試験化合物が前記CRF2Rに結合するか、または前記CRF2Rを活性化するかどうか判定する工程;及び、
(c)前記CRF2Rに結合するこれらの化合物を選択し、さらに、骨格筋萎縮の細胞培養モデル及び/又はヒト以外の動物で、前記試験化合物が骨格筋量又は機能を調節するかどうか判定する工程。 - 請求項18に記載の方法であって、次の工程を含むことを特徴とする方法:
(a)試験化合物を、機能的CRF2Rを発現する細胞に接触させ、前記試験化合物から生じる前記CRF2Rの活性化レベルを判定する工程;
(b)前記同じ試験化合物を、機能的CRF1Rを発現する細胞に接触させ、前記試験化合物から生じる前記CRF1Rの活性化レベルを判定する工程;次に、
(c)細胞培養モデル又はヒト以外の動物で、前記試験化合物が骨格筋量又は機能を調節するかどうか判定するためにCRF1RよりもCRF2Rに対して選択性を示す前記同じ試験化合物を選択する工程。 - ヒト以外の動物で、前記試験化合物が骨格筋量又は機能を調節するかどうか判定する工程を含むことを特徴とする、請求項18または19に記載の方法。
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