JP4330372B2 - 胃癌由来の転移癌細胞の検出方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、胃癌由来の転移癌細胞の検出方法の検出方法、より詳細には、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼをマーカーとした、胃癌の腹膜播種又は腹腔内遊離癌細胞のような胃癌由来の転移癌細胞の検出方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
胃癌は、日本と東南アジアでは消化管で最も多くみられる悪性腫瘍であり、癌死亡率では、胃癌が世界で第2位を占めている(Parkin et al. 1999)。胃癌の予後は、診断技術や胃癌の治療法の発達により改善しているが、進行癌の治癒的切除の後に起こる再発の主原因は腹膜播種である。胃漿膜にまで浸潤した胃癌の予後は、5年生存率が35%と低い(Yamazaki et al. 1989)。胃癌細胞のこのような悪性の特性のうちで、腹膜への転移は特に複雑な現象であり、多くのステップと多くの遺伝子が関与している。胃癌の腹膜播種には、接着分子、アポトーシス関連遺伝子および他の遺伝子が深く関与しているという報告があるが(Tahara et al., 1996, 2000; Yawata et al., 1998)、胃癌の転移のメカニズムの解明には、さらなる研究が必要である。癌の転移能に関係すると考えられている遺伝子発現の変化により、原発性腫瘍細胞の基底層からの脱出とアポトーシスへの耐性が高まることがわかっているが、そのメカニズムの詳細は未だ不明である。
【0003】
胃癌の腹膜播種のメカニズムを研究するために、Parkらは、原発病巣からSNU−1、SNU−5、SNU−16およびSNU−719、腹水から他の癌細胞株を樹立した(Park et al., 1990, 1994)。SNU細胞系は特に集中的に研究されている。例えば、SNU−16ではcMETが増幅され、SNU−1、SNU−5およびSNU−16ではTGF−β2型受容体、CEA、CA19−9およびc−erbB2の過剰発現が観察され、KATO−III細胞ではK−samが増幅され(Katoh et al., 1992)、GT3TKBではEカドヘリンの発現が減少する(Tamura et al., 1996)ことが確認されている。しかし、転移性胃癌細胞における遺伝子の共通した変化は、まだ明らかにされていない。
癌転移には、複数の遺伝子が協同して関与することが知られているにもかかわらず、単一の遺伝子又は少数の遺伝子と転移との関連についてのみしか報告されていない。また、癌原発巣の転移能の相違は、発現された遺伝子の組み合わせが異なることに起因するものと考えられている。そのため、転移の程度および転移先の点で異なる転移能を有する胃癌細胞の遺伝子発現の解析は、胃癌腹膜播種のメカニズムの解明に重要である。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
胃癌の予後を改善するために、発明者らは、マイトマイシンC吸着微粒子活性炭(MMC−CH)腹腔内投与による漿膜浸潤陽性胃癌の再発予防を開発している。しかし、MMC−CHなどの腹腔内癌化学療法には、血小板減少、イレウス等の副作用があるため、胃癌細胞の腹腔内への転移可能性を確認し、腹腔内癌化学療法を適用すべきかどうか迅速に決定する必要がある。
消化器系の癌の診断には、一般的にCEA(癌胎児性抗原)がマーカーとして使用され、これを指標にした迅速定量RT−PCRを腹腔内遊離癌細胞の検出に使用することが国内では愛知癌センター等から提案されている。しかし、このマーカーは、上皮性の正常細胞や中皮細胞で弱く発現しているため、擬陽性と判断されるケースが多く、腹腔内の癌細胞の検出には難点がある。
そこで、本発明は、胃癌の腹膜播種又は腹腔内遊離癌細胞のような胃癌由来の転移癌細胞の検出のため、特異性の高い新規マーカーを同定することを目的とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】
胃癌が腹腔転移性であるかどうかを迅速に判断するための特異性の高いマーカーを見つけるために、発明者らは、cDNAマイクロアレイを用いて、胃癌腹膜播種由来の細胞株であるSNU−5、SNU−16、SNU−719、KATO−IIIおよびGT3TKB細胞における約21000個の遺伝子の発現プロフィールを解析した。対照として、胃癌原発巣由来細胞株であるSNU−1を用いた。胃癌の腹膜播種に由来する細胞では特異的に高い発現を示すが、胃癌原発巣由来細胞では発現しないか極めて発現が弱い遺伝子を約20種同定した。
【0006】
さらに、遺伝子の発現の変化とノザンブロッティング又はRT−PCRの解析とを組み合わせることにより、胃癌腹膜播種に由来する細胞に特異的な上記20種の遺伝子が、腹腔内の微小癌細胞の存在診断と術中迅速診断への応用が可能かどうかを検討した。その結果、CEAと同程度、あるいはそれ以上の感度および特異性を有する遺伝子を同定した。
発明者らは、胃癌原発巣細胞には発現しないが、胃癌腹膜播種に由来する細胞で特異的に発現する遺伝子として、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH;aldehyde dehydrogenase)およびドーパデカルボキシラーゼ(DDC;dopa decarboxylase)を同定し、これらの遺伝子が、胃癌由来の転移癌細胞の検出マーカーとして使用できることを見出した。
したがって、本発明は、被験者から生体試料を採取するステップと、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方の存在を被検者の生体試料から検出するステップと、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方が存在する場合には、胃癌由来の転移癌細胞が前記試料中に含まれている可能性が高いと判断するステップとを含む胃癌由来の転移癌細胞の検出方法を提供する。
ここで、「アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼが存在する」とは、少なくともこれらの酵素をコードしている遺伝子がmRNAに転写されていることを意味し、もちろんこれらがタンパク質に翻訳されている場合も含むものとする。
アルデヒドデヒドロゲナーゼ若しくはドーパデカルボキシラーゼ、又はアルデヒドデヒドロゲナーゼとドーパデカルボキシラーゼの両方を腹膜播種のような胃癌由来の転移癌の検出マーカーとして使用することにより、高い検出感度で被検者の腹水、術中腹腔洗浄細胞等のような生体試料から胃癌の腹膜播種細胞を検出することが可能である。
【0007】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの発現をそれらのmRNAの存在により確認することができる。アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのmRNAの存在の有無は、プライマー又はプローブを用いて確認できる。アルデヒドデヒドロゲナーゼのmRNAの存在を確認するためのプライマーとしては、配列番号1および2に記載のプライマー対を例示することができ、ドーパデカルボキシラーゼのmRNAの存在を確認するためのプライマーとしては、配列番号3および4に記載のプライマー対を例示することができる。アルデヒドデヒドロゲナーゼのmRNAの存在を確認するためのプローブとしては、配列番号5に記載のプローブを例示することができ、ドーパデカルボキシラーゼのmRNAの存在を確認するためのプローブとしては、配列番号6に記載のプローブを例示することができる。
【0008】
別の方法として、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの存在を抗体を用いて検出することができる。
さらには、本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのmRNAの存在を検出するためのプライマー、例えば、配列番号1および2、又は配列番号3および4に記載の配列を有する一対のプライマーを提供する。本発明は、また、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのmRNAの存在を検出するためのプローブ、例えば、配列番号5又は6に記載の配列を有するプローブを提供する。またさらに、本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼを検出するための抗体を提供する。
【0009】
これらのプライマー、プローブ若しくは抗体、又はそれらを含んでなる診断キットを用いてアルデヒドデヒドロゲナーゼ若しくはドーパデカルボキシラーゼ、又はアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびドーパデカルボキシラーゼの両方をそのmRNAレベル又はタンパク質レベルで検出することにより、被験者、特に胃癌患者の腹膜転移の有無を迅速かつ確実に検出することができ、腹腔内癌化学療法を適用すべきかの決定のための有力な材料が提供される。
【0010】
被検者の生体試料としては、腹腔内に由来するものであれば特に限定されるものではなく、具体的には、被験者の腹膜のような腹腔の組織、腹水、術中腹腔洗浄中に含まれる細胞、腹腔内洗浄液(腹腔内洗浄に供された後に回収した洗浄液)等を例示できる。特に、腹水、術中腹腔洗浄細胞、腹腔内洗浄液が取得容易であるため好ましい。なお、本明細書では、原発性胃癌細胞に由来した腹腔内に転移した癌細胞を総称して、「転移癌細胞」と呼ぶ。転移癌細胞には、例えば、腹腔内遊離癌細胞、胃癌腹水癌細胞、及び腹膜播種などが含まれる。被験者は、患者、特に、癌患者、好ましくは胃癌の腹膜転移が疑われる患者をいう。
【発明の実施の形態】
【0011】
アルデヒドデヒドロゲナーゼは、細胞内外のアルデヒドからの細胞の防御機構に関連するタンパク質であるとして知られており、正常肝細胞や肝細胞癌での発現が報告されている(Canuto et al., 2001; Deichmann et al., 1999; Canuto et al., 2001)。また、ドーパデカルボキシラーゼは、別名芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼとも呼ばれ、腎臓、肝臓、脳など各組織に分布し、生理活性アミンの生合成系、例えば神経伝達物質のドーパミンやセロトニンの合成に関連している。ドーパデカルボキシラーゼは、神経芽細胞腫や肺小細胞癌において高い発現が報告されている(North et al., 1998; Gilbert et al., 1999)。アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼは、胃癌を除く他の癌での報告が散見されているが、胃癌での発現は報告されていない。また、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびドーパデカルボキシラーゼについて、胃癌を含め、癌のマーカーに使用できるという報告はない。
【0012】
腹膜播種細胞又は胃癌腹水癌細胞を検出するために、本発明では、アルデヒドデヒドロゲナーゼ若しくはドーパデカルボキシラーゼ、又はアルデヒドデヒドロゲナーゼとドーパデカルボキシラーゼをマーカーとして用いるが、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの検出は、mRNAのレベルでもタンパク質のレベルでも行なうことができる。
【0013】
mRNAレベルの検出では、ノザンブロット法、RT−PCR法、TaqManPCR法又はそれらの組み合わせなどの各種の方法を用いることができるが、これらの方法に特に限定されることなく任意の方法によりmRNAを定量的、定性的に測定することができる。例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼのmRNAをノザンブロットにより検出するためのプローブとしては、5’CACTGGCCCTGGTGGTAGAATACCCCATGGTGTGCAAATTCAACAGCATTGTCCAAGTCGGCATCAGCTAACACAAT3’(配列番号5)が、ドーパデカルボキシラーゼのmRNAをノザンブロットにより検出するためのプローブとしては、5’−AAGCACAGCCATCAGGATTCAGGGCTTATCACTGACTACCGGCATTGGCAGATACCACTGGGCAGAAGATTTCGCTCTTTGAAAATGTGGTTTGTATTTAGGATGTATGGAGTCAAAGGACTGCAGGCTTATATCCGCAAGCATGTCCA−3’(配列番号6)がそれぞれ挙げられる。
mRNAの検出には、適当なプローブを用いて行なうことができる。ここで、本発明のプローブは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのmRNA配列の一部と実質的に相補的な配列を有すればよく、プローブ配列の長さおよびmRNAのどの部位と実質的に相補的であるかなどは特に限定されない。ここで、実質的に相補的とは、プローブがアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのmRNAと特異的にハイブリッドできる程度に相補的であればよいことを意味する。さらに、これらのプローブは、5'側又は3'側、又はその両方に、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのmRNA配列と相補的ではない配列を含んでもmRNA配列と特異的にハイブリッドできる限り、本発明のプローブに含まれるものとする。例えば、検出しやすいように、任意の配列を付加したものを用いることができる。また、検出しやすいように5’末端を標識したものを用いることもでき、そのような標識としては、たとえば、ビオチン、蛍光、又は32Pなどが例示できる。
【0014】
本発明のプライマーは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのmRNA又はcDNAのうち、上流および下流の配列の一部と実質的に相補的なプライマー対であればよく、プライマー配列の長さおよびmRNA又はcDNAのどの部位と実質的に相補的であるかなどは特に限定されない。ここで、実質的に相補的とは、mRNA又はcDNAとハイブリッドできる程度に相補的であればよいことを意味する。たとえば、これらのプライマーは、5'側又は3'側、又はその両方に、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのmRNA又はcDNA配列と一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとハイブリッドできる限り、本発明のプライマーに含まれるものとする。また、非特異的な増幅を防ぐためや、適当な制限酵素認識部位を導入するために、これらのmRNA又はcDNAと相補的でないミスマッチ配列を持つプライマーを使用することができる。
【0015】
アルデヒドデヒドロゲナーゼの検出のためのプライマーの例として、配列番号1および2の配列を有するプライマー対、ドーパデカルボキシラーゼの検出のためのプライマーの例として、配列番号3および4の配列を有するプライマー対が挙げられる。
アルデヒドデヒドロゲナーゼの検出のためのプローブの例として、配列番号5の配列を有するプローブ、ドーパデカルボキシラーゼの検出のためのプローブの例として、配列番号6の配列を有するプローブが挙げられる。
【0016】
タンパク質レベルの検出では、抗体を用いて検出することができ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼに対するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、又はそれらの抗原結合性の断片などを用いることができるが、特異性が高い点から、モノクローナル抗体がより好ましい。
上記各種の抗体は、当業者に公知の方法に基づいて作成できる。例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼ、又はそれらの一部のポリペプチドを抗原として用い、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ等の動物に対して通常行われる免疫操作を実施してポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を作成する。通常は、モノクローナル抗体の作成には、ミエローマと脾臓細胞とを融合してハイブリドーマを作成するハイブリドーマ法又はその各種の変法を用いることができる。
【0017】
検出を容易にするために、抗体を標識することが好ましい。例えば、蛍光標識(FITCなど)、フッ素−クロム標識、酵素標識(ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼ、フィコエリトリンなど)、放射標識(32P、125Iなど)、ビオチン標識、緑色蛍光タンパク質(GFP)、金コロイド標識などによる標識が挙げられる。
タンパク質の検出では、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、ELISA、IDAT法、SDS−PAGE、オクタロニー解析、免疫電気泳動、又はそれらの組み合わせなどの各種の方法を用いることができるが、これらの方法に特に限定されることなく任意の方法によりタンパク質を定量的、定性的に測定することができる。
なお、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの存在を酵素活性の測定等により、検出することも可能である。
アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはドーパデカルボキシラーゼのmRNA又はタンパク質の検出の検出は、当業者に公知の方法により行なうことができる(例えば「新遺伝子工学ハンドブック」改定第3版、松村正實、山本雅編集、1999年9月10日、羊土社を参照)。
【0018】
被験者の腹腔内播種の有無の判断には、被験者の生体試料中から、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのmRNA又はタンパク質を検出する。必要に応じて、mRNAとタンパク質の両方のレベルを測定することによって腹膜転移が起こっているかどうかを判断するための材料としてもよい。
検出用キットは、プローブ、プライマー又は抗体のほか、採用する検出方法に応じて任意の試薬、緩衝液、容器等を含んでもよい。例えば、RT−PCR用には、逆転写酵素、緩衝液、dNTP、Taqポリメラーゼなどを含む。
【実施例】
以下に実施例をあげて、本発明をさらに詳細に説明するが、これらにより本発明を制限することを意図するものではない。
実施例1:腹水から得られた胃癌細胞系のcDNAのマイクロアレイによる遺伝子発現解析
高密度cDNAマイクロアレイを用いて、胃癌の腹膜播種に由来する細胞株および胃癌原発巣由来細胞株において21168個の遺伝子の発現を解析し、遺伝子発現プロフィールを比較した。
【0019】
胃癌細胞株SNU−1、SNU−5、SNU−16、SNU−719はPark et al.により樹立された。KATO−III、およびGT3TKBは理研細胞バンク(筑波、日本)より購入した。これらの細胞のうち、SNU−5、SNU−16、SNU−719、KATO−IIIおよびGT3TKBは、胃癌腹膜播種由来の細胞株であり、SNU−1は胃癌原発巣由来細胞株である。GT3TKBは、一定の湿度に保ち、高グルコースDMEM(Sigma, St. Louis, MO)中で、37℃で5%のCO2下で維持した。DMEMには、10%牛胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えた。80〜90%の集密に達した後、冷PBSで洗浄し、迅速にホモジナイズした。各細胞系から抽出したmRNAは、使用説明書に従い、FAST trackキットVer.2(Invitrogen)により精製した。
【0020】
プローブの作成は次のように行なった。各細胞株から精製したmRNAのうち1μgを、ランダムプライム逆転写の間、Cy3を組み込むことにより標識した。各胃癌細胞株から得たcDNAは、Cy5で標識し、全組織について発現レファレンスとして使用した。正常胃粘膜の30サンプルのmRNAを、対照として使用した。標識は、400ユニットのSuperScriptII(GIBCO/BRL);0.1mMのCy3−dUTP(又はCy5−dUTP);0.5mMのdATP、dCTPおよびdGTP各々、0.2mMのdTTP、10mMのDTT、6μlの5×first-strandバッファーおよび6μgのランダムプライマーを含む全体積30μl中において、42℃で1時間行った。不要なヌクレオチドを除くために、標識したcDNAを、500μlの結合バッファー(0.03%ゼラチンおよび2ng/μlのtRNAを含む、5Mのグアニジンチオシアネート/10mMのTris・HCl、pH7.0/0.1mMのEDTA)および50μlのシリカマトリクスバッファー(10%マトリクス/3.5Mグアニジン塩酸塩/20%グリセロール/0.1mMのEDTA/200mMのNaOAc、pH4.8〜5.0)と混合し、GFXカラム(Amersham Pharmacia)に通して、Solvellの遠心分離機(RC-3B plus; H6000A/HBB6 ローター)を用いて15,000rpmで30分間遠心分離した。流出物を廃棄し、カラムを500μlの洗浄バッファーで洗浄した。吸着したプローブを最終容量17μlの蒸留水に溶出した。この標識プローブを、3μlのブロッキング溶液(10μg/μlのオリゴ(dA)、3μlの20μg/μl酵母tRNA、1μlの20μg/μlマウスCot1DNA、5.1μlの20×SSCおよび0.9μlの10%SDS)と混合した(Miki et al., 2001)。
【0021】
アレイハイブリダイゼーションおよびデータ解析は、次のように行なった。標的を含む理研cDNAを、3つのマルチブロックからなる完全アレイ(各マルチブロックは10μlのハイブリダイゼーション溶液を要する)の最終容量30μl中でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの前に、プローブアリコートを95℃で1分間加熱し、その後室温に戻した。カバースリップを65℃でHybdicasette(ArrayIt.comから入手)においてハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後、スライドを2×SSC/0.1%SDS中でカバースリップが外れるまで洗浄し、その後1×SSC中に移し、2分間穏やかに攪拌し、0.1×SSCで2分間洗浄した。洗浄後、スライドをSorvall遠心分離機(RC-3B plus: H6000A/HBB6ローター)により800rpmで遠心した。これらのスライドを、ScanArray5000共焦点レーザースキャナーによりスキャンし、得られた画像をIMAGENE (BioDiscovery: Los Angeles)を用いて解析した。
【0022】
データの正確さを高めるために、2回の別々の反応において同じRNAテンプレートを標識した、2回の実験を行った。データは、ゼロ以外であれば中央観測値(median observed value)を差し引き(ログスペース)することによりレファレンス標準と標準化した。再現可能なデータポイントのみを使用した。信頼度の低いデータを除外するために、ソフトウエア解析の結果、胃癌腹膜播種由来の細胞株と胃癌原発巣由来細胞株の両細胞系に発現しないと判断された遺伝子を除いた。
【0023】
発現した11680〜15151個の遺伝子のなかで、44個の遺伝子が、対照であるSNU−1の発現の2倍の発現を示し、30個が他の細胞系の発現の半分以上の発現を示した。これらの結果を確認するために、ノザンブロット解析を行い、cDNAアレイに関して2倍以上の発現を示した全ての遺伝子を解析した。
ノザンブロットは、以前発明者らが報告した方法(Sakakura et al., 1994, 1996)により行った。簡単に説明すると、全細胞RNAをグアニジンイソチオシアネート−フェノール−クロロホルム法により調整した。ポリ(A)+RNAの選択は、オリゴdTカラムにより行い、1%アガロース/2.2Mのホルムアルデヒドゲルにおいて分画した。プローブには、32Pでランダムプライムにより標識したものを用いた。選択した各々の遺伝子とβアクチンを、プローブとハイブリダイズさせた。各ブロットをBAS2000イメージアナライザーによりシグナル解析し、対照であるSNU−1と比較して過剰発現している度合いを計算した。
【0024】
ノザンブロット解析による発現レベルにおける2倍以上の変化が有意であると考えると、cDNAマイクロアレイ解析との整合性は55%(74個のうちの41個)であるが、27%(74個のうちの20個)は有意な変化を示さず、18%(74個のうちの13個)はcDNAマイクロアレイとは整合しない結果となった。マイクロアレイおよびノザンブロット解析により解析された遺伝子を、表1と2にまとめた。
【0025】
【表1】
【0026】
【表2】
【0027】
実施例2:8個の胃癌細胞系における選択された遺伝子の発現
他の胃癌細胞系について腹膜播種能はこれまでの報告にいくつかまとめられているので、実施例1で調べた6個の細胞株に加えて他の2つの胃癌細胞株MKN7とNUGC−3を用いて、SNU−1と他の胃癌細胞系との間で発現に差を生じる遺伝子が胃癌細胞株の腹膜播種能に相関関係があるかどうかをノザンブロット解析により調べた。KATO−III、SNU−5、SNU−16およびSNU−719の4種の細胞株が、高い播種能を有することを知られているため、ヌードマウスを用いた腹膜播種モデルとしてこれらの細胞株を使用した。MKN7は理研細胞バンク(筑波、日本)より購入した。NUGC−3細胞は、ヒューマンサイエンス研究資源バンク(大阪、日本)から購入した。MKN7およびNUGC−3を10%牛胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えたRPMI1640(Sigma)中で維持した。他の胃癌細胞系は、実施例1に記載のとおり培養した。MKN7およびNUGC−3は、動物実験により接種後4週間後でも腹膜転移を生じないことを確認した。ヌードマウスにおけるGT3TKBの播種能については、報告がない。
【0028】
ノザンブロット解析は、実施例1に記載のとおりに行なった。典型的なデータを図1と図2にまとめた。図1および図2は、8種の胃癌細胞における異なる発現を示す遺伝子のノザンブロット解析である。図1は、原発巣と比べて、胃癌腹膜播種由来の細胞において発現量が増加した遺伝子を示す。図2は、原発巣と比べて、胃癌腹膜播種由来の細胞において発現量が減少した遺伝子を示す。
これらの結果から、細胞は、次の3つのグループに分類できることが明らかになった。(a)腹膜播種についての高いポテンシャルを有する細胞株SNU−5、SNU−16、SNU−719、KATO−IIIおよびGT3KTB、(b)播種についてのポテンシャルがない腫瘍由来細胞系であるSNU−1、(c)播種について低いポテンシャルしか有さないか、ポテンシャルがないMKN7およびNUGC−3。
【0029】
多くの遺伝子、例えばCD44およびケラチンファミリー遺伝子が腹膜播種由来の胃癌細胞に強く発現された。アルデヒドデヒドロゲナーゼやIP3Rのような遺伝子は、播種について高いポテンシャルがある細胞のみにおいて高レベルで発現するが、播種について低いポテンシャルを有する細胞では、低レベルの発現を示すか、ほとんど発現されなかった。これらの遺伝子における発現量の変化は、胃癌腹膜播種について特異的であると考えられる。p27のよう発現量が減少した遺伝子の多くは、他の全ての胃癌細胞系で抑制されたが、IL4Statのようないくつかの遺伝子は、腹膜播種の胃癌細胞において集中的に発現量が減少した。
【0030】
実施例3:臨床検体におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびドーパデカルボキシラーゼのRT−PCR
実施例1および実施例2の結果から、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびドーパデカルボキシラーゼは、原発性胃癌細胞では発現されないか又は極めて発現量が低いが、胃癌腹膜播種由来の細胞では発現量が増加するため、これらの発現を調べることによって、腹腔内の微小癌細胞の存在診断に使用できると考えられた。これらの遺伝子の発現を腹腔内微小癌細胞の存在診断に適用できるかどうかを確かめるため、京都府立医大消化器外科における胃癌手術症例のうち、胃癌癌性腹膜炎患者12例、非癌患者21例をそれぞれポジティブコントロール、ネガティブコントロールとし、実際に腹膜転移しているかどうか不明である漿膜浸潤陽性胃癌患者18例において、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびドーパデカルボキシラーゼの発現をRT−PCRにより確認した。
【0031】
胃癌癌性腹膜炎患者から穿刺吸引した癌性腹水、非癌患者および漿膜浸潤陽性胃癌患者の術中腹腔洗浄水中に含まれる細胞を遠心により集め、AGPC変法によってRNAを抽出後、アルデヒドデヒドロゲナーゼには、配列番号7のセンスプライマー5’−ATTGTGTTAGCTGATGCCGACTT−3’(配列番号7)および配列番号8のアンチセンスプライマー5’−CACTGGCCCTGGTGGTAGAATA−3’(配列番号8)を、ドーパデカルボキシラーゼには、配列番号9のセンスプライマー5’−AAGCACAGCCATCAGGATTCA−3’(配列番号9)および配列番号10のアンチセンスプライマー5’−TGGACATGCTTGCGGATATAAG−3’(配列番号10)をそれぞれ用いて、cDNAを合成した。これらのcDNAを鋳型として、Gene amp5700を使用して定量的RT−PCRを行なった。PCRは、アルデヒドデヒドロゲナーゼには配列番号1のセンスプライマー5’−ATTGTGTTAGCTGATG CCGACTT−3’および配列番号2のアンチセンスプライマー5’−CACTGGCCCTGGTGGTAGAATA−3’を、ドーパデカルボキシラーゼには配列番号3のセンスプライマー5’−AAGCACAGCCATCAGGATTCADDC−AS1217および配列番号4のアンチセンスプライマー5’−TGGACATGCTTGCGGATATAAG−3’をそれぞれ用いた。
アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびドーパデカルボキシラーゼのRT−PCRの結果は、以下のとおりである。
【0032】
【表3】
【0033】
表中、特異性は、胃癌癌性腹膜炎患者12例のうちのアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼが検出された例数を示し、感度は、非癌患者21例のうちのアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼが検出されなかった例数を示す。漿膜浸潤陽性胃癌患者については、18例のうち、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼが検出された例数である。
漿膜浸潤陽性胃癌患者は、その後の再発を確認されていないが、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼが検出された患者は、腹腔内に転移した可能性が極めて高いと推測される。
【0034】
実施例4:アルデヒドデヒドロゲナーゼの感度検定
中皮細胞培養株又は健常者の抹消血リンパ球と胃癌細胞株SNU−5を混合してRT−PCRによりアルデヒドデヒドロゲナーゼの感度検定を行なった。また、正常細胞と胃癌細胞株SNU−5を混合してCEAの感度検定を行い比較した。アルデヒドデヒドロゲナーゼの感度検定に用いたプライマーおよびRT−PCRの条件は実施例3とほぼ同じである。アルデヒドデヒドロゲナーゼの感度検定では、正常リンパ球1×104〜5個中1個の癌細胞を検出でき、中皮細胞培養株1×104〜5個中1個の癌細胞を検出できた。CEAを用いた場合、検出感度は、正常細胞1×104〜5個の癌細胞を検出可能であるが、CEAは中皮細胞では弱く発現しているため、中皮細胞中での検出感度はかなり低下する。したがって、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、CEAに比べて高感度であるといえる。
【0035】
【発明の効果】
本発明によれば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ若しくはドーパデカルボキシラーゼ、又はその両者を、腹腔内の微小癌細胞の存在診断と術中迅速診断への応用が可能な、腹腔内遊離癌細胞の検出用のマーカーに用いることができる。アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼは、従来から検出用マーカーとして用いられているCEAと比べて、上皮性の正常細胞や中皮細胞で発現しないため、その発現を検出することにより、高い特異性および感度で腹腔内遊離癌を検出できる。アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの発現の有無を調べることにより、被験者の腹腔内播種の有無を高い精度で検出して、その後の腹腔内癌化学療法を行なうかどうかの指針の一つとして用いることができる。
【配列表】
【0036】
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【非特許文献54】
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【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、原発巣と比べて、胃癌腹膜播種由来の細胞において発現量が増加した遺伝子についてのノザンブロット解析の結果を示す。
【図2】図2は、原発巣と比べて、胃癌腹膜播種由来の細胞において発現量が減少した遺伝子についてのノザンブロット解析の結果を示す。
Claims (5)
- 被験者の腹腔内に由来する生体試料を調製するステップと、
アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方のmRNA及び/又はタンパク質の存在を被検者の生体試料から検出するステップと、
アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方のmRNA及び/又はタンパク質が存在する場合には、胃癌由来の転移癌細胞が前記試料中に含まれている可能性が高いと判断するステップと
を含む胃癌由来の転移癌細胞の検出方法。 - アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのmRNAの存在を検出することを特徴とする請求項1の転移癌細胞の検出方法。
- アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのタンパク質の存在を、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼに対する抗体により検出することを特徴とする請求項1に記載の転移癌細胞の検出方法。
- アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのmRNAの存在を検出するためのプライマー対又はプローブを含んでなる胃癌由来の転移癌細胞の診断キット。
- アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのタンパク質を検出するための抗体を含んでなる胃癌由来の転移癌細胞の診断キット。
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