JP4312832B2 - In vivo recombination - Google Patents
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Description
本発明の分野
本発明は、相同DNA配列のインビボ組換えのための方法に関する。本法は、有利な特性を有するポリペプチドをコードするDNA配列をもたらす強制人工進化である。
本発明の背景
同一のプラスミド上に置かれたDNA配列間の相同的組換えは、当業者に周知である(Weber and Weissmann, Nucl. Acid. Res.(1983)11, 5661-5669)。EP 252666 B1(Novo Nordisk A/S), WO 95/22625 A1(Affymax Technologies N.V.)、及びWO 9101087は、同一のプラスミド上に置かれた遺伝子のインビボ組換えを開示している。
EP 449923 B1(Setratech)は、部分的に相同なDNA配列のインビボにおける遺伝子間の組換えの方法を開示している。この組換えは、酵素ミスマッチ修復系に欠陥があるところの細胞内で生じる。
J. Biotechnol.(1991)19, 221-240は、B. Amylolique facdensのゲノム内の遺伝子を失活させるための方法を開示している。この方法は、pE194突然変異体の組み込み及び切除を含む。
Chemical Abstracts 118 : 161925(1993)中には、組換えのために必要なホモロジーの最小配列長が測定されている。この測定方法は、グルコース遺伝子を担持するpE194誘導体の組み込みを含む。
J. Bacteriol.(1982)152,524-526中には、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)からの2つのプラスミド、pE194とpUB110を含む、プラスミドpBD9が開示されている。pE194又はpUB110に基づく他のプラスミドも、Molecular and General Genetics(1988), 213, 465-70, Molecular and General Genetics(1984), 195, 374-7, Plasmid(1981), 6, 67-77、及びGenetika,(1986)22, 2750-7中に開示されている。
Yichuan Xuebao(1993), 20, 272-8(Chemical Abstracts 120 : 1670(1994)参照)中に、Chen et. alは、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)からの熱安定性α−アミラーゼ遺伝子がその中に挿入されているところのプラスミドpNW102, pE194誘導体を開示している。pNW102は、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)株BF 7658内に形質転換され、その後、非−許容的温度でインキュベートされて、pNW102とBF 7658のα−アミラーゼ遺伝子間での相同的組換えに供される。上記組換え体から作られたα−アミラーゼは、バチルス・リケニフォルミスからのα−アミラーゼと同じ特性を示す。
しかしながら、関連分野においては、改良された特性、例えば増加された安定性、改善された特異性又はより高い活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を得るために、DNA配列が、組み込み及び削除(cross-out)を繰り返すことによりインビボにおいて組み換えられることができることは全く示されていない。
従って、本発明の問題は、新規DNA配列の改良されたインビボ方法を提供することである。
本発明の簡単な説明
本発明は、新規DNA配列を作製するインビボ方法に向けられている。改善された特性をもつ新規DNA配列は、それぞれ相同DNA配列及び複製起源を含む、少なくとも2つのベクターの間のDNAのインビボ交換に関する方法により少なくとも2つの相同DNA配列から、迅速かつ効率的な方法で、作製されることができる。
本発明の方法は、上記相同配列の交換が、1のベクターから他のベクターへの上記組み込み及び切除を、少なくとも1回インビボにおいて繰り返すことにより、行われるということを特徴とする。
従って、第1の側面においては、本発明は、相同DNA配列のインビボ組換えのための方法であって、以下の工程:
(a)DNA構造物の中の1から他のDNA構造物の中の1への組み込みを好む条件下で、それぞれDNA配列と複製起源を含む、少なくとも2つのDNA構造物を含む細胞をインキュベートして、それによりハイブリッドDNA構造物を作り;
(b)上記DNA構造物からの削除を好む条件下で上記細胞をインキュベートして、それにより、それぞれ組換えDNA配列及び複製起点を含む新規DNA構造物を作り;
(c)少なくとも1回、工程a)〜b)を繰り返す、
を含む、前記方法に関する。
本発明のインビボ組換え方法の利点の中の1は、上記DNA配列間のインビボにおける交換を繰り返すことにより、上記DNA配列間で多数の異なる組換えパターンを得ることができるということである。
これは、本明細書中図1中に示され、図1は、実施例1に記載されるように行われた、2つのDNA配列、サビナーゼ(Savinase)とサビシン(Savisyn)の間のインビボ組換えの結果を示す。
図1中、サビナーゼ/サビシン組換えクローン、例えば、クローン番号3,8,12は、上記2つの配列の間の2以上のインビボ組換え事件から得られる。
【図面の簡単な説明】
図1は、その複製起点が50℃で働くために耐熱性である、プラスミドpTR、及びその複製起点が45℃を超える温度で働かないために温度感受性である、プラスミドpTS上に置かれた2つのDNA配列の組換えを示す。非許容的条件下(すなわち、50℃において)、pTSはpTR内に組み込まれ、ハイブリッド、プラスミドが作られた。
図2は、それぞれ1のプラスミド上に置かれた2つの新規DNA配列を形成する、ハイブリッド・プラスミドからの削除(cross out)を示す。繰り返されたクロッシング・イン及びアウト(crossing in and out)は、例えば、温度サイクリングにより又は単に、温度圧を保ち、そしてpTSの耐性(すなわち、ErmR)について選択することにより、行われることができる。
図3は、繰り返し組み込み及びクロッシング・アウトの後に得られるプラスミドを示す。
さらに、図1と2は、ハイブリッド構造の形成のインビボ計測のために好適であり、そしてそのDNA構造の強制削除を行うために好適であるDNA構造系を示す。
図1:DNA構造pTS:
活性タンパク質の発現を指令する好適な活性プロモーター
ErmR:抗生物質耐性遺伝子
DNA構造pTSは:
GFPの転写を指令するための活性プロモーターを全く含まない。
GFP:緑色蛍光タンパク質
pTS内のErmR抗生物質耐性遺伝子は、上記活性プロモーターのために活性である。
pTR内のGFP遺伝子は不活性である(すなわち、その遺伝子は転写されない)。なぜなら、その遺伝子の発現を駆動するための活性プロモーターが存在しないからである。
図2:本発明に従って上記ハイブリッド構造を形成した後、GFPは、(上記プロモーターに駆動されて)活性となる。このことが、上記ハイブリッド構造の形成をインビボにおいて計測することを可能にする(さらなる細目については以下を参照のこと)。
反対に、ErmR抗生物質耐性遺伝子は不活性になる(すなわち、その遺伝子は転写されない)。なぜなら、その遺伝子の発現を駆動する活性プロモーターが存在しないからである。DNAハイブリッド構造の強制削除は、ErmR抗生物質圧力下で細胞をインキュベートし、それにより上記DNAハイブリッド構造のクロス・アウト強制することにより行われる。なぜなら、上記細胞は、そのDNA構造のクロッシング・アウトが生じた後にのみ、ErmR抗生物質耐性遺伝子を発現することができるからである。
図4及び5は:2つのDNA配列サビナーゼとサビシンをインビボにおいて組換えるために実施例1に記載したように使用された2つのベクターpSX120(図4)とpMB430(図5)を示す。
pSX120は、i)サビナーゼをコードするオープン・リーディング・フレーム、ii)サビナーゼの転写を指令する活性プロモーター、及びiii)クロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子(CamR)を含む。
pMB430は、i)サビジンDNA断片、ii)(その後の領域を通しての転写をもたらさない)ターミネーター、iii)エリスロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子(ErmR)、及びiv)緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするオープン・リーディング・フレーム、を含む。
図6は:実施例1において記載されたように行われたサビナーゼ/サビジンのインビボ組換えの結果を示す。この略図は、シャッフルされ/組換えられた12のクローンを示す。
サビジンにユニークな制限部位の位置を水平に与える。
文字“S”は、その位置における配列がサビナーゼの配列と同一であることを表し、そして文字“Z”は、その配列がサビジン起源であることを表す。配列決定されたクローンの全てが、それらの組換えパターンにおいて相違している。
定 義
本明細書中に使用するとき、以下の用語は、以下の意味をもつ:
用語“DNA配列”は、本発明に従って修飾することが望まれるいずれかのDNA配列、例えば、ポリペプチド、例えば、酵素、医薬として活性なポリペプチド、例えば、インスリン成長ホルモン・ヒトホルモン又は成長調節物質、及びプロモーター、転写又は翻訳レギュレーターその他細胞内ポリヌクレオチド及びポリペプチドの如き配列の如き配列をコードするDNA配列を含む。
用語“相同(homologous)”は、DNA配列が、インビボにおける組換えを許容する、同一ヌクレオチドのいくつかのストレッチを有することを、意味する。そのDNA配列内の上記ストレッチは、少なくとも15の塩基対長、より好ましくは少なくとも25の塩基対長、さらにより好ましくは少なくとも50の塩基対長、そして最も好ましくは少なくとも150以上の塩基対長である。
用語“相同”は、ただ1つのヌクレオチドにおいて相違するDNA配列に60%以上同一であるDNA配列のストレッチを含む。DNA配列のストレッチは、70%以上同一、より好ましくは少なくとも80%、特に90%以上同一であることが好ましく、そしてDNA配列のストレッチは、95%同一、最も好ましくは少なくとも97%同一であることがより好ましい。
着目のDNA配列のストレッチ内で、先に言及したDNA配列のホモロジーが、第2の配列からの第1の配列の派生を示す2つの配列間の同一性の程度として測定される。このホモロジーは、好適には、本分野において知られたコンピューター・プログラム、例えば、GCGプログラム・パッケージ中に提供されたGAP(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D.,(1970), Journal of Molecular Bioligy, 48, 443-453)により、測定されることができる。DNA配列の比較のための以下の設定:5.0のGAP創出ペナルティー、及び0.3のGAP伸長ペナルティー、を用いたGAPを使用して、着目の相同DNA配列は、好ましくは、上記のような同一性の程度(a degree of identity)を示す。
用語“組換えられたDNA配列”は、少なくとも2つのDNA配列の間の組換え事件の結果であるDNA配列を意味する。この組換え事件は、単一の組換え事件であることができ、又は少なくとも2つのDNA配列の間の第1の組換え事件、その後の、第1の組換え事件とは異なる部位におけるクロス・アウトであることができる。
用語“DNA構造物(DNA structure)”は、DNA分子、例えば、ベクター、プラスミド、染色体(例えば、バチルス・サブチリスの染色体)、ウィルス、ファージ、トランスポゾン、又はゲノムを意味する。
用語“ベクター”は、組換えられるべきDNA配列と複製起点を含むことができるいずれかの直鎖状又は環状のDNA分子を意味する。この用語は、当業者に知られたいずれかのベクター、例えば、プラスミド又はファージを含む。このDNA配列は、必ずしもそうではないが、場合により、プロモーターの制御下にある。
用語“細胞”は、本発明のインビボ組換え方法に関して本明細書中に使用するとき、“細胞”と、“細胞集団”の両方を包含することを意図される。
用語“転移(transferring)”とは、上記DNA構造物が細胞内に導入されることを意味する。DNA構造物は、DNAの直接導入のために本分野において知られた技術を使用して、例えば、エレクトロポレーション、コンピテント細胞の形質転換、プロトプラスト形質転換、トランスフェクション、形質導入、接合又は弾道(ballistic)形質転換により導入されることができる。
用語“インキュベーティング”(又は培養、増殖成長))とは、細胞が、その正常細胞機能、特に組換えのために必要な機能が活性であるような方法で、処理されることを意味する。細胞は、固体支持体(寒天ペトリ皿)上でインキュベートされることができ、又は細胞は、浸漬条件下でインキュベートされることができる。上記細胞は、試験管、例えば、エッペンドルフ試験管内でインキュベートされることが好ましい。温度感受性の複製起点の場合には、上記試験管は、便利には、オートマチック・サーモサイクラー内に置かれる。さらに、細胞は、標準的な振とうフラスコ内でインキュベートされることができる。
用語“複製起点”(ori)は、DNA構造物の複製が開始される領域を意味する。複製起点に関して、用語“機能的(functional)”とは、複製が上記起点から開始されることができるということを意味する。用語“非機能的(non-functional)”とは、複製が所定の条件下で開始されないこと、又は複製の開始が、例えば、適当な選択圧の下、マーカー遺伝子及びoriをもつDNA構造物を含む細胞の生存のために十分でないレベルにまで、減少されることを意味する。
用語“温度感受性”は、複製起点又はベクターに関して、ベクターが、例えば上昇した温度で、すなわち、その親細胞の成長を未だ許容する、非許容的(non-permissive)条件において、複製することができないということを意味する。
用語“温度耐性”は、複製起点又はベクターに関して、ベクターが上昇した温度において複製することができるということを意味する。
用語“DNAライブラリー”は、多数の異なるDNA配列を含むライブラリーである。DNAライブラリーは、本分野において知られた標準的な手順に従って、例えば、インビトロDNAシャッフリング/DNA組換え(WO 95/17413, WO 95/22625)及び/又は誤りがちなPCR及びカセット突然変異誘発により、作られることができる。
本明細書中、DNAライブラリーは、2〜20程の低い異なる配列を含むことができ、例えば、ただ1つのアミノ酸が変更されているライブラリーであることができる。
さらに、DNAライブラリーは、多数の異なるDNA配列、例えば、1010までの異なる配列を含むことができる。
本発明の詳細な説明
本発明は、相同DNA配列のインビボ組換えのための方法であって、以下の工程:
(a)i)少なくとも1の複製起点が非機能的であり、そしてii)上記非機能的起点をもつDNA構造物をそれが含む場合にのみその細胞の成長を許容する選択圧下に、その細胞がある条件下で、それぞれがDNA配列と複製起点を含む、少なくとも2つのDNA構造物を含む細胞をインキュベートし(すなわち、DNA構造物の中の1から他のDNA構造物の中の1内への組み込みを支持し、それによりハイブリッドDNA構造物を作り);
(b)上記条件から、工程a)におけるよりも、より少ない複製起点が非機能的である条件へ、変え(すなわち、上記ハイブリッドDNA構造物からのクロッシング・アウトを支持し);
(c)少なくとも1回、工程a)〜b)を繰り返す、
を含む、前記方法を含む。
組換えられたDNA配列は、新たな特性を有する新規のポリペプチドをコードするであろう。そのとき、組換えられたDNA配列の1以上によりコードされた所望の特性について選択し、そして/又はスクリーンするために、本発明の方法に、選択又はスクリーニング系を取り込むことができる。
上記工程(c)における繰り返しの数は、1の繰り返しであることができ、又はそれは、それ以上、例えば、5〜10の繰り返し、又は50〜100又はさらに多数の繰り返しであることができる。
DNA構造物の複製起点が非機能的であるような条件下で細胞をインキュベートすることにより、組み込みが強制され(又はDNA構造物の生存のために好ましくされる)こと、そして再びDNA構造物の複製起点が機能的であるような条件下で細胞をインキュベートすることにより、クロス・アウトを強制することが、好ましい。
工程(a)〜(c)に先に示したルーチンの他の好ましい態様においては、自然にクロス・イン及びクロス・アウトが生じるところの定常条件(例えば、一定温度及び選択圧)下で、上記細胞を維持することが好ましい。すなわち、細胞におけるシャッフリング手順が、上記条件を繰り返して変化させずに、繰り返される。
多数のDNA構造物、例えば、多くのバチルスDNA構造物(ベクター)(バチルス・サブチリス(Bacillus subtitis)その他のグラム陽性バクテリア、Sonensheim et al., 1993, American Society for Microbiology, Washington, D.C.)においては、複製起点は、ori(+)及びori(−)を含む。ori(+)は、第1DNAストランドの複製がどこで開始するかを制御し、そしてori(−)は、第2ストランド上の、複製のための開始点を制御する(Bacillus subtilis及び他のグラム陽性バクテリア、Sonensheim et al., 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.)。
本発明の方法の1の態様においては、少なくとも1のDNA構築物は、ori(−)を含まない(すなわち、ori(+)だけを含む)。好ましくは、ori(−)を含まないDNA構築物は、その起点(すなわち、ここではori(+))が、本発明に従って行われるハイブリッド構造物の形成の間に機能的であるところのDNA構造物である。
本発明の上記態様の1の利点は、そのDNA構造物内でori(+)だけが機能的であるとき、そのDNA構造物が、ori(+)とori(−)の両方を含むDNA構造物に比較して、比較的長い期間、1本鎖の状態にあるということである。この延長された1本鎖状態は、本発明の方法に従うハイブリッドDNA構造物の形成を容易にする。
好ましくは、上記のようなori(−)を含まないDNA構造物は、バチルスの構造物、より好ましくはバチルスのベクターである。
上記コンセプトを説明するために、ori(−)を含まない修飾されたpTR(TR:耐熱性)バチルス・ベクターの1例がある(図1参照)。上記ハイブリッド形成が50℃で行われる場合、pTRの起点だけが機能的である(pTS(TS:温度感受性)の起点は機能的でない)(図1,2参照)。上記DNA構造物pTRはori(+)だけを含み、そしてそれ故、比較的長い期間、1本鎖状態にあり、これは、組換え事件、そしてその後のpTS DNA構造物とのハイブリッド形成を容易にする(図1,2参照)。
1のDNA構造物が、特定の(許容的な)条件下で複製することができ、そして他の(非許容的な)条件下で複製することができないベクターであることが、より好ましい。ベクターは、例えば、複製に関して温度感受性であるものであることができる。従って、ベクターは、その親細胞の成長をさらに許容する、上昇された温度において複製することができないものであることができる。細胞は、ベクターの複製を許容する温度において、最初にインキュベートされ、そしてその後、他のDNA構造物内への組み込みが生じることができた後に、インキュベートされ、そのベクターが、組み込まれない場合にその細胞から失われるように、ベクターの複製を許容しない温度で、インキュベートされる。
ベクターは、さらに選択マーカーを含むことができる。この場合、非許容的温度におけるインキュベーションは、(そのDNA配列と選択マーカーを含む)組み込まれたベクターを含む細胞だけが生き残るであろうことを保証するための、選択的条件下で、行われることができる。
さらに、上記ハイブリッド構造物の形成をインビボにおいて計測することができるような系を構築することが好ましい。
好ましくは、これは、インビボにおいてスクリーンすることができ又は選択することができるタンパク質が、上記ハイブリッド構造物が形成された後にのみ発現されるような系を構築することにより行われる。
好ましくは、上記スクリーン可能なタンパク質は、好適な露光下で蛍光性であるタンパク質であり、そして特に、上記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFP)又はその変異体である。
緑色蛍光タンパク質(GFP)又はその変異体、並びにGFPがどのように活性化されて蛍光を発するかについては、本分野において記載されており、そしてさらなる細目については(Crameri et al. Nature Biotechnology 14 : 315-319(1996);及びCormack et al. GENE 173 : 33-38(1996))を参照することができる。
好適な露光下で蛍光性である上記のようなスクリーン可能なタンパク質、そして特にGFP又はその変異体の使用の利点の中の1は、上記ハイブリッド構造物を含む細胞を選択的に拾い出すための、例えば蛍光−活性化セル・ソーティング(FACS)により、それが可能になるということである。これは、本発明の第1の側面に従って、工程a)を行った後に上記ハイブリッド構造物を含まない、細胞のバックグラウンドを取り除くことができる。
FACSは広く知られたスクリーニング技術であり、そしてさらなる細目のためには(Cormack et al.“FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein(GFP)”GENE 173 : 33-38(1996))を参照することができる。
上記ハイブリッド構造物の形成のインビボにおける計測を可能にする好適な系を説明するために、好適な系の1例を図1と2に示す。
先に討議したようなスクリーン可能なタンパク質の使用に代えて、上記ハイブリッド構造物が形成されるときにのみ、その選択マーカーが転写において活性であるような、選択マーカーを使用することが有利であることができる。
さらに、本発明の第1の側面の工程b)における、上記ハイブリッドDNA構造物からのクロッシング・アウトが、強制クロッシング・アウト事件であることが好ましい。
上記ハイブリッド構造物からの強制クロッシング・アウトは:
i)上記DNAハイブリッド構造物が選択マーカーを発現せず、そして第1側面の工程a)における少なくとも2つのDNA構造物の中の少なくとも1が上記選択マーカーを発現することができるような系を構築し;
ii)上記細胞は、上記DNAハイブリッド構造物のクロッシング・アウトが生じた後にのみ上記マーカー遺伝子を発現することができるので、選択可能な条件下で上記細胞をインキュベートし、それにより上記ハイブリッド構造物のクロス・アウトを強制する、
ことにより行われることができる。
好ましくは、上述の選択マーカー遺伝子は、その複製起点が、上記のように行われたDNAハイブリッド構造物内へのDNA構造物の強制組み込みの間に非機能的であるようなDNA構造物上で発現され、そして好ましくは、その選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子である。好適な選択マーカー遺伝子のさらなる説明については以下を参照のこと。
上記ハイブリッドDNA構造物からの強制クロッシング・アウトのコンセプトを説明するために、好適な系の1例を図1と2に示す。
選択マーカーは、本分野において知られたいずれかのマーカー、例えば、細胞に抗生物質耐性を付与、栄養要求性の株に原栄養性を付与し、又は宿主の欠陥を補足する産物をコードする遺伝子であることができる(例えば、dal−株内に導入されたdal遺伝子;B. Diderichsen(1986), Bacillus : Molecular Genetics and Biotechnology Applications, A.T. Gene san and J.A. Hoch, Eds., Academic Press, pp. 35-46を参照のこと)。選択マーカーは、例えば、知られた源から切除され、又はベクター上に存在し、例えば、本発明の方法において使用されるべきDNA構造物の構築のために使用されるプラスミドであることができる。
この選択は、マーカー遺伝子によりコードされた選択マーカーについての選択圧下で、細胞を培養することにより達成されることができる。
(ベクターがその中に組み込まれるところの)DNA構造物は、例えば、本発明の方法において使用されるべきベクターにより場合により担持されるマーカーに関して先に記載したようないずれかのタイプの、いずれかの選択マーカーをコードする遺伝子を含むことができる。従って、上記マーカー遺伝子は、抗生物質耐性、例えば、カナマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコールに対する耐性、又はさまざまな重金属、例えば、セレン酸塩、アンチモン又はヒ素酸塩に対する耐性をコードすることができる。
好ましい態様においては、上記方法において使用される細胞は、酵素ミスマッチ修復系において欠陥があり又は一時的に失活され、又はミスマッチ修復の減少されたレベルをもつ。DNAの合成においては、エラーが生じることができ、そして得られた非相補性塩基対は、ミスマッチと言われる。DNAにおけるエラー(ミスマッチ)の校正のためのプロセスが存在する。大腸菌(E.coli)においては、これらのエラーは、第3の酵素(MutU)が2つのDNAストランドをほどき、そして第4の酵素(MutH)が、その後にメチル化されたDNAの配列(GATC)自体の上に新しく合成されたストランドを切断することを可能にする、2つの酵素(MutSとMutL)により、ひじょうに速く、かつ、正確に検出される。より徹底的な説明のためには、EP 449923(Setratech)(この内容を引用により本明細書中に取り込む)を参照のこと。
他の好ましい態様においては、上記プロセスにおいて使用される細胞は、AddABの如き主要な組換え酵素において傷つけられ又は妨害される。AddAB遺伝子を傷つけられた株は、より高い頻度の相同的組換えを示す。正統的(legitimate)な及び非正統的な組換え頻度の両方が高められる。しかしながら特に、非正統的組換えのための組換え頻度は、AddAB ATP−依存性ヌクレアーゼにおいて傷つけられ又は妨害された株と働くとき、支持される(Meima, R ; Haijema, BJ ; Dijkstra, H ; Haan, GJ ; Venema, G ; Bron, S(1997)Role of enzymes of homologous recombination in illegitimate plasmid recombination in Bacillus-subtilis. JOURNAL OF BACTERIOLOGY Vol. 179, No. 4 pp. 1219-1229)。
他の好ましい態様においては、上記方法において使用される細胞は、重要な組換え酵素の中の1、recAを過剰発現している。このrecA酵素は、組換え事件のために必要なヘテロ2本鎖分子を形成するためのssDNAの再生を促進することにより相同的組換えに関係し、そしてDNAストランドの交換を開始させる。(PROGRESS IN NUCLEIC ACID RESEARCH AND MOLECULAR BIOLOGY Vol. 56, pp. 129-223(1997))。recAの過剰発現は、宿主株の古典的な突然変異誘発又は高く発現されたrecA遺伝子のクローニングのいずれかにより達成されることができる。
他の好ましい態様においては、上記方法において使用される細胞は、シャッフルされるべき2つの相同遺伝子の間の組換え頻度を増加させるためにUV、X−線又はDNA損傷性の剤に供される。UV、X−線又はDNA損傷性の剤のようなストレスは、SOS応答を介して組換え酵素を誘導し、そしてrecAのような組換えプロセスに関係する酵素を活性化させることが知られている。(BACILLUS SUBTILIS AND OTHER GRAM-POSITIVE BACTERIA, pp. 529-537(1993))。
他の好ましい態様においては、シャッフルされるべき遺伝子の中の1の担体として使用されるpTRベースのプラスミドは、pTRの低−コピー・バージョン又はpWV01,(MOLECULAR AND GENERAL GENETICS Vol. 249, No. 1 pp. 43-50(1995)), pTA1060,(JOURNAL OF BACTERIOLOGY Vol. 142, No. 1 pp. 315-8(1980))又はpAMb1,(JOURNAL OF BACTERIOLOGY Vol. 157, No. 2 pp. 445-53(1984))のような他のB. subtilis適合性の低−コピー・プラスミドのいずれかにより置き替えられる。さらに好ましい態様においては、シャッフルされるべき遺伝子の中の1を含むDNA構造物の中の1は、細胞の染色上に置かれ、そして他のDNA構造物であって、組換えられるべき着目の他の遺伝子を含むものは、プラスミドである。本発明のインビボ組換え方法を行うとき、そのプラスミドは、染色体上のDNA構築物により組換えられるであろう。
上記プラスミドは、例えば、温度感受性プラスミドであることができる。
低−コピーpTR、又はDNA構造物の中の1が上記のように染色体上に置かれているところの系を使用することの利点は、2つの相同遺伝子の組換え後のハイブリッドDNA構造物が細胞内の遺伝子の優勢な形態であろうということである。非組換えpTRプラスミドの高−コピー・バックグラウンドは、第2ラウンドの組換え後に、第1ラウンドにおいて形成された遺伝子ハイブリッドを野生型に不可避的に復帰させ、そしてそれ故、2つの遺伝子のシャッフリングを阻止するであろう。上記遺伝子の中の1の担体としてその染色体を使用するとき、野生型のバックグラウンドは、pTSが相同遺伝子を介して組み込まれているときに、共存することはできない。
上記方法において使用される細胞は、組換えられたDNA配列の産物の大規模生産のために好適な細胞であることが好ましい。細胞は、バクテリア細胞、より好ましくはバチルス細胞、最も好ましくは、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)細胞であることが好ましい。
組換えられるべきDNA配列は、それ自体知られたやり方で上記配列を含む生物から単離/クローン化されることができる。例えば、好適なオリゴヌクレオチド・プローブは、第1の配列に相同な第2の配列を得るために着目の第1のDNA配列に基づき調製されることができる。あるいは、DNA配列は、保存された領域の知識に従って設計されたプライマーに基づいてPCRにより増幅されることができる。
本内容の異なる態様において、用語“1セットの相同DNA配列(“セットA”、“セットB”、“セットC”、等)”、が、例えば、その相同DNA配列が2以上の異なるセットの相同DNA配列(“セットA”、“セットB”、“セットC”、等)から作られ、そして上記相同配列(“セットA”、“セットB”、“セットC”、等)のセットのそれぞれが、本発明に従って異なるDNA構造物(“DNA構造物A”、“DNA構造物B”、“DNA構造物C”、等)内に挿入されるような、本発明に係る方法に関する本発明の1の態様に関して、使用される。
この用語は、本発明のインビボ組換え方法が相同DNA配列の多くの“セット”を組換えるために使用されることができるということを説明するために使用される。相同DNA配列の個々の“セット”のそれぞれは、1だけから多くの(例えば、DNAライブラリーを含む“セット”の)個々の相同DNA配列を、個々に含むことができる。
次に相同DNA配列の上記セット(“セットA”、“セットB”、“セットC”、等)のそれぞれが、本発明に従って異なるDNA構造物(“DNA構造物A”、“DNA構造物B”、“DNA構造物C”、等)内に挿入されることができる。上記の異なるDNA構造物のそれぞれは、好ましくは、本発明に従って、重要なパラメーター、例えば、異なる複製起点、異なる選択マーカー、等において相違する。
次に、上記DNA構造物(“DNA構造物A”、“DNA構造物B”、“DNA構造物C”、等)の全てが、本発明に従って、細胞内に導入されることができ、そして本発明のインビボ組換えのための方法を行うとき、個々のDNA構造物(“DNA構造物A”、“DNA構造物B”、“DNA構造物C”、等)のそれぞれが、次に、本発明に従って、ランダムに組換えられることができる。本発明の方法を2〜3回繰り返した後、これは、本方法において使用された相同DNA配列の全ての“セット”の間でランダムに組換えられた、異なって組換えられたDNA配列の多くの異なる組合せを含む、細胞集団内に、DNA集団を与えるであろう。
さらに、用語“1セットの相同DNA配列(“セットA”、“セットB”、“セットC”、等)は、本明細書中、1,2〜3の、そして/又は多くの(例えば、大きなDNAライブラリー)個々の相同DNA配列を含む相同DNA配列の両セットを組換えるための、その系のフレキシビリティーである、本発明のインビボ組換え方法の利点の中の1を説明するために使用される。
従って、本発明の1の態様は、相同DNA配列の上記セットのそれぞれが、1のDNA配列だけを含むところの本発明に係る方法に関する(すなわち、2以上の相同配列の組換え)。
さらに、本発明の態様においては、組換えられるべき相同DNA配列は、事前に作られたDNAライブラリーから、そして/又は個々の異なる事前に作られたライブラリーから得られる。
上記DNAライブラリーから得られた相同DNAは、本発明に従ってベクター内に挿入される(すなわち、そのDNAライブラリーを代表するDNAがベクター内にライゲート(挿入)される)。
本明細書中に記載するように、本発明の方法は、上記ベクターの強制インビボ組換えを許容する方法において相違する、少なくとも2つのDNA構造物(例えば、ベクター)を含む。
DNAライブラリーを代表する相同DNAは、上記異なるベクターの中の1のみ、そして/又は両者内に挿入されることができる。
すなわち、例えば、1のDNAライブラリーを代表する相同DNAが上記異なるベクターの中の1内に挿入(ライゲート)され、そして他のDNAライブラリーを代表する相同DNAがその他のベクター内に挿入される場合、これは、本発明に係るインビボ組換え方法により2つの異なるライブラリーの間の迅速な、かつ、効率的な組換えを許容するであろう。このコンセプトを説明するために、1のライブラリーを代表するDNAが、pTRベクター内に挿入されることができ(図1参照)、そして他のライブラリーを代表するDNAが、pTSベクター内に挿入されることができる(図1参照)。その後、本発明に係る方法により行われたインビボ組換え事件を2〜3回繰り返すことは、上述の2つのライブラリーの組合せである新規ライブラリーを代表する細胞集団を与えるであろう。
従って、相同DNA配列のセットの中の少なくとも1が事前に作られたDNAライブラリーから得られ、そして相同DNA配列の上記セットの中の少なくとも1が、上記DNAライブラリーに相同であるDNA配列である、本発明に係る方法(すなわち、上記DNAライブラリーに相同であるDNA配列への上記DNAライブラリーのインビボ組換えのための方法をもたらす)に;又は
相同DNA配列の上記セットが同一の事前に作られたDNAライブラリーから得られる、本発明に係る方法(すなわち、上記DNAライブラリーのインビボ組換えのための方法をもたらす)に;又は
相同DNA配列の上記セットが、少なくとも2つの異なる事前に作られたDNAライブラリーから得られる、本発明に係る方法(すなわち、少なくとも2つの異なるDNAライブラリーのインビボ組換えのための方法をもたらす)に、関する。
上記DNA配列間のさらなる組換えを得るために、本発明に従って行われた上記DNA配列のインビボ組換えの第1ラウンド後にDNA構造物の単離を行うことが好ましい。上記の単離された構造物は、次に、細胞内に再形質転換され、そしてインビボ組換えのさらなるプロセス・ラウンドが、その後に行われる。
上記工程の利点を以下の実施例により説明する:
セットAは、DNA配列a,bが個々に上記ベクターA内に導入されているベクターAである(すなわち、ベクターAの集団は、DNA配列aを有するベクターを、そして配列bを有するベクターを含む);そして
セットBは、DNA配列c,dが個々に上記ベクターB内に導入されているベクターBである(すなわち、ベクターBの集団は、DNA配列cを有するベクターを、そして配列dを有するベクターを含む)。
次にベクターAとBは、細胞集団内に形質転換され、そして本発明に従ってインビボにおいて組換えられる。これは、DNA配列ac, ad, bc, bdの間の組換えを与えるであろう。上記の組換えられた配列を含むベクターAとBが単離され、そして上記細胞集団内に再形質転換される。本発明に係るインビボ組換えは、次に、上記4つの(a,b,c,d)DNA配列の可能な全ての組換え、例えば、abc, abdc、等の組換えを与えるであろう。
さらなる態様においては、本発明は、相同DNA配列の2つのセット(“セットA”と“セットB”)がインビボにおいて組換えられる、本発明に係る方法であって、以下の工程:
a)耐熱性の複製起点と第1マーカーのための遺伝子を含む1のベクター内に“セットA”からの配列を挿入し;
b)温度感受性の複製起点と第2マーカーのための遺伝子を含む1のベクター内に“セットB”からの配列を挿入し;
c)上記2つのベクターを細胞内に導入し;
d)場合により、両マーカー遺伝子を有する細胞を好む選択圧下で、両複製起点が機能的であるところの温度で上記細胞をインキュベートし;
e)上記温度を、上記耐熱性複製起点だけが機能的である温度に、シフトさせ;
f)少なくとも1回、工程d)〜e)を繰り返す;
を含む前記方法に、又は
相同DNA配列の2つのセット(“セットA”とセットB”)がインビボにおいて組換えられる、本発明に係る方法であって、以下の工程;
a)耐熱性複製起点と第1マーカーのための遺伝子を含む1のベクター内に“セットA”からの配列を挿入し;
b)温度感受性複製起点と第2マーカーのための遺伝子を含む1のベクター内に“セットB”からの配列を挿入し;
c)上記2つのベクターを細胞内に導入し;
d)場合により両マーカー遺伝子を有する細胞を好む選択圧下で、耐熱性複製起点だけが機能的である温度で上記細胞をインキュベートし;
e)場合により、上記温度を、両複製起点が機能的である温度に、シフトさせ;
f)少なくとも1回、d)〜e)を繰り返す、
を含む前記方法に関する。
さらなる側面においては、本発明は、所望の生物学的活性を有する1以上の組換えタンパク質を製造する方法であって:
a)上記DNA構造物の中の少なくとも1が発現ベクターである、相同DNA配列のインビボ組換えのための方法を行い(この方法は、本明細書中に記載されるように本発明に従って行われる);
b)工程a)からの多くの異なる組換えられたDNA配列によりコードされた多くの異なる組換え体ポリペプチドを発現させ;そして
c)所望の活性を有する1以上の組換えポリペプチドについての好適なスクリーニング又は選択系において、工程b)からの多くの異なる組換えタンパク質をスクリーンし又は選択する、
を含む前記方法に関する。
好ましくは、上記工程a)における発現ベクターは、本発明に係る相同DNA配列のインビボ組換えのための方法に従って行われた強制ハイブリッドDNA形成(すなわち、上記構造物の互いへの組み込み)の間に複製することができない(例えば、非機能的複製起点をもつ)DNA構造物である。これは、本発明に係る上記ハイブリッド構造物のクロッシング・アウト事件後に、発現ベクターが、組換えられた相同DNAを含む確率を改善するであろう。なぜなら、上記発現ベクターが生存していることができる方法においてのみ、強制ハイブリッド形成方法が、上記ハイブリッド構造の形成を強制するために使用される条件下で複製することができる、他のDNA構造物により実際に組換えられることによるからである。
インビボ組換えのための方法が行われた後(上記工程a))、そして上記発現及び上記スクリーニング工程b)とc)の前に、上記発現ベクターだけを含む細胞集団を主に作ることが有利である(すなわち、他のDNA構造物は、上記細胞集団から部分的に又はほぼ完全に除去される。)。これは、上記発現ベクターが上記のように強制されたハイブリッドDNA構造物の形成の間に複製することができないときに、特に有利である。なぜなら、このような細胞集団は、有利にはその後のスクリーニング工程(上記工程c))内にある、着目の非組換えDNA配列のひじょうに制限されたバックグラウンドをもつであろうからである。
発現ベクターだけを含む細胞集団を主に作ることは、本分野において知られた標準的な手順に従って、例えば、他のDNA構造物に比較して、その発現ベクターの複製を選択的に好む条件で上記細胞を培養し;又は上記細胞から上記発現ベクターを選択的に精製し、そしてその後、これを新たな細胞集団内に導入することにより、行われることができる。
上記工程a)における組換えられた配列によりコードされた組換えポリペプチドの発現は、標準的な発現ベクターの使用により行われることができ、そして/又は標準的な発現ベクターは、本発明に係るインビボ組換え方法のために特に好適な要素を含むように修飾されることができる。
上記工程b)から多くの異なる組換えタンパク質をスクリーンし又は選択するための、好適なスクリーニング又は選択系は、その所望の生物学的活性に依存するであろう。
所望の生物学的活性についてスクリーンし又は選択するために好適な多数のスクリーニング又は選択系は、本分野において記載されている。これらの例は、
カルシウム非依存性安定性を有するズブチリシン変異体についてスクリーンするためのスクリーニング系について記載する、Strauberg et al.(Biotechnology 13 : 669-673(1995));
高められた熱安定性を有するプロテアーゼについてスクリーンするためのスクリーニング・アッセイについて記載する、Bryan et al.(Proteins 1 : 326-334(1986));及び
洗濯洗剤中の、改良された洗浄性能を有するリパーゼについてスクリーンするためのスクリーニング・アッセイについて記載するPCT-DK 96/00322、
である。
本発明の好ましい態様は、所望の生物学的活性が皿洗浄又は洗濯洗剤において改良された性能であるところの、組換えタンパク質のスクリーニング又は選択を含む。好適な皿洗浄又は洗濯洗剤の例は、PCT/DK96/00322及びWO 95/30011中に開示されている。
本発明は、許容的条件下で同一細胞内で機能することができる少なくとも2つの異なる複製起点、及びポリペプチドをコードする少なくとも2つの相同DNA配列を含む、1セット(少なくとも2つの)ベクターをも含む。好ましい態様においては、少なくとも1の複製起点は温度感受性である。ベクターは好ましくはプラスミドであることができる。
本発明はさらに、少なくとも、
a)ポリペプチドをコードするDNA配列と複製起点を含む1のベクターA、及び
b)ベクターA内の上記DNA配列に相同なDNA配列、及びベクターA内の上記複製起点とは異なる複製起点を含むベクターB、
を含むベクター系を含む。
上記DNA配列が生物学的な活性を有するポリペプチド、特に酵素、そして特にアミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、フィターゼ(phytase)、及びプロテアーゼの如き酵素、
をコードすることが好ましい。
本発明は、新規、組換え体DNA配列であって、本発明に係る方法により製造されており、又はそれが所望の生物学的活性を有する組換えタンパク質をコードし、ここで、所望の生物学的活性を有する組換えタンパク質が、本発明に従って所望の生物学的活性を有する1以上の組換え体タンパク質のための方法により作られる、ことを特徴とする前記DNA配列を含む。
本発明は、さらに、ポリペプチド、特に酵素の製法であって、i)請求項38に記載の組換えられたDNA配列によりコードされたポリペプチドを発現する細胞を培養し、そしてii)上記発現されたポリペプチドを精製する、ことを含む製法を包含する。
本発明は、さらに、新規のポリペプチド、特に酵素であって、それが本発明に係る方法により製造されることを特徴とするものを包含する。
本発明は、さらに、ポリペプチド、特に酵素であって、それが本発明に係る組換えられたDNA配列によりコードされていることを特徴とするものを包含する。
本発明のポリペプチドは、ペプチドとタンパク質、並びに場合によりグリコシル化されたそれらの形態を含む。これらの例は、酵素、医薬として活性なポリペプチド、例えば、ヒト又は哺乳類ポリペプチドのアナログ、例えば、インスリン、成長ホルモン、ヒト・ホルモン又は成長調節物質である。
本発明を以下の実施例においてさらに詳細に説明する。実施例は、本発明の範囲をいかなる方法においても限定することを意図されていない。
実施例
材料及び方法
株
製造者により推奨されたようにBio-Rad Gene PulserTMを使用して調製され、そして形質転換されたエレクトロコンピテント細胞。
コンピテント細胞を、Yasbin, R.E., Wilson, G.A. and Young, F.E.(1975)Trans formation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis : evidence for selective induction of prophage in competent cells. J. Bacteriol, 121 : 296-304により記載されたように調製し、そして形質転換させた。
B. subtilis PL 1801。この株は、apr及びnpr遺伝子が破壊されているB. subtilis DN 1885である
プラスミド:
pSX120 :(EP 405901及びWO 91/00345中に記載されている)B. subtilis発現ベクター。このベクターは、野生型サビナーゼ遺伝子を含む。
pE194 :(Horinouchi, S and Weisblum, B., 1982, J. Bacteriol. 150 : 804-814)。
(WO 96/34946及びWO 92/19729中に記載されている)B. subtilis発現ベクター。このベクターは、本明細書中サビシン(Savisyn)といわれる合成サビナーゼ(Savinase)遺伝子を含む。サビシン遺伝子中には、pSX120中に含まれる野生型サビナーゼ遺伝子に比較して、多数の制限部位が導入されている。
pUC19 : Yanisch-Perron, C., Vieria, J. and Messing, J.(1985)Gene 33, 103-119。
pF64L-S65 T-GFP ;は、WO 97/11094中に記載されているF64L-S65T-GFPをコードするDNA断片をコードするE.coliプラスミドである。
pMUTIN−4−MCS :このプラスミドは、Laboratoire de Genetique Microbienne, Institut National de la Recherche Agronomique, 78352 Jouy en Josas-CEDEX, Franceから得られることができる。
溶液/培地
(Ausubel, F.M. et al.(eds.)“Current protocols in Molecular Biology”。John Wiley and Sons, 1995中に記載されるような)TY及びLB寒天。
LBPGは、0.5%グルコース及び0.05Mリン酸カリウム、pH7.0を補ったLB寒天である。
LBPGSKプレートは、寒天と1%のスキム・ミルクを含むLBPG培地である。
抗生物質は、6μg/mlのクロラムフェニコール、10μg/mlのカナマイシン、及び5μg/mlのエリスロマイシンの濃度において、異なる培地中で使用される。
(Ausubel, F.M. et al.(eds.)“Current protocols in Molecular Biology”。John Wiley and Sons, 1995中に記載されているような)TE−バッファー。
一般的分子生物学的方法
DNA操作及び形質転換を、分子生物学の標準的な方法(Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY ; Ausubel, F.M. et al.(eds.)“Current protocols in Molecular Biology”。John Wiley and Sons, 1995 : Harwood, C.R., and Cutting, S.M.(eds.)“Molecular Biological Methods for Bacillus”。John Wiley and Sons, 1990)を使用して行った。
DNA操作のための酵素を、供給者の指示書に従って使用した。
DNA操作のための酵素
特にことわらない限り、DNA操作のための全ての酵素、例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、ポリメラーゼ、PCRポリメラーゼ等は、New England Biolabs, Inc.から得られる。
湿度感受性シャッフリング・プラスミドの構築
pMB430を、以下に示すような5工程のクローニング方法において構築した。このDNA配列全体が配列番号:1内に見られる。
1)温度感受性プラスミドpE194を、pE194プラスミドのユニークClaI部位付近に多フローニング部位を導入し、そしてこのようにしてそのClaI部位を破壊することにより修飾した。この導入を、そのプラスミド全体を増幅し、そしていくつかのユニーク・クローニング部位を導入するために、プライマー#22899と24039を使用したPCRにより行った。
このPCRを以下のように行った:
1μlのpE194 Qiaquickプラスミド・プレップを、200μMの各dNTP, 2.5ユニットのAmpliTaqポリメラーゼ(Perkin-Elmer, Cetus, USA)、及び100pmolの各プライマー:
を含むPCRバッファー(10mM Tris-HCl, pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.Ol%(w/v)ゼラチン)中での50μlのPCR増幅のために使用した。
上記PCR反応を、DNAサーマル・サイクラー(Landgraf, Germany)を使用して行った。1分間94℃での1のインキュベーション、その後の40サイクルのPCRが、1分間94℃での変性、1分間55℃でのアニーリング、及び2分間72℃での伸長を使用して行われた。増幅生成物の5μlアリコートを、0.7%アガロース・ゲル(NuSieve, FMC)中の電気泳動により分析した。
PCR断片のサブクローニング
上記のように生成されたPCR生成物の45μlアリコートを、製造者の指示に従ってQIAquick PCR精製キット(Qiagen, USA)を使用して精製した。精製されたDNAを、50μlの10mM Tris-HCl, pH8.5中で溶出させた。50μlの精製されたPCR断片を、BamHIで消化し、0.8%低ゲル化温度のアガロース(Sea Plaque GTG, FMC)ゲル中で電気泳動にかけ、関係のある断片をそのゲルから切除し、そして製造者の指示に従ってQIAquick Gel抽出Kit(Qiagen, USA)を使用して精製した。次に単離されたDNA断片を、BamHI消化されたpUC191にライゲートし、そしてそのライゲーション混合物を、E. coli SJ2を形質転換させるために使用した。
細胞を、X−gal(SIGMA, USA)(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドールイル・アルファーD−ガラクトピラノシド、50μg/ml)を補った、エリスロマイシン(200μg/ml)を含有するLB寒天プレート上にプレーティングした。
陽性クローンの同定及び特徴付け
形質転換された細胞を、X−gal(50μg/ml)を補ったエリスロマイシン(200μg/ml)を含むLB寒天プレート上にプレーティングし、そして一夜37℃でインキュベートした。翌日、白色コロニーを、これらを新鮮なLB−エリスロマイシン寒天プレート上に再画線塗布することにより、レスキューし、そして一夜37℃でインキュベートした。翌日、各クローンの単一コロニーを、エリスロマイシン(200μg/ml)を含む液体LB培地に移し、そして250rpmで振とうしながら37℃で一夜インキュベートした。
プラスミドを、製造者の指示に従ってQIAgenプラスミド精製ミニ・キット(Qiagen, USA)を使用して上記液体培養物から抽出した。上記プラスミドの5μlのサンプルを、BamHIで消化した。この消化を、0.7%アガロース・ゲル(NuSieve, FMC)上の電気泳動によりチェックした。約2.7kbと3.7の2つのDNA断片の外観は、陽性クローンを示した。このクローンを、MB293と命名し、そしてこのプラスミドを、pMB293と命名した。
2)次に、pMB293をEcoRI消化し、そしてその3.8kb断片を0.7%アガロース・ゲル上で、製造者に従ってQiagenからのQiaQuickゲル精製キットを使用してゲル精製した。(上記PCRプライマーに、そしてpUC19のMCSに起因する)挿入された多クローニング部位をもつpE194を構成するこの断片を、ライゲーションにより円形にし、そしてB. subtilis DN1885を形質転換させるために使用し、形質転換された細胞を、5μg/mlのエリスロマイシンを含むLBPGプレート上で選択し、そしてインキュベーションを一夜33℃で行った。この形質転換からのクローンを再画線塗布し、そして5μg/mlのエリスロマイシンを含むTY中で一夜培養した。一夜の培養ブロスから細胞を単離し、そしてプラスミドをQiaquickプラスミド・キットを使用して精製した。これらのプラスミドの制限酵素消化は、上記クローンの正しさを証明した。1のこのようなクローンとプラスミドを、MB333及びpMB333と命名した。
3)次に、pMB333を、いずれのプロモーターをももたないサビジン遺伝子を含むプラスミドの構築のために温度感受性プラスミドとして使用した。この構造物を以下のように作った。
プライマー#21547と#21548及び鋳型としてpSX222を使用したPCRを、上記の条件に従って行った:
1μlのpSX222 Qiaquickプラスミド・プレップを、200μMの各dNTP, 2.5ユニットのAmpliTaqポリメラーゼ(Perkin-Elmer, Cetus, USA)、及び100pmolの各プライマー:
を含むPCRバッファー(10mM Tris-HCl, pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01%(w/v)ゼラチン)中での50μlのPCR増幅のために使用した。
上記PCR反応を、DNAサーマル・サイクラー(Landgraf, Germany)を使用して行った。1分間94℃での1のインキュベーション、その後の40サイクルのPCRが、1分間94℃での変性、1分間55℃でのアニーリング、及び2分間72℃での伸長を使用して行われた。増幅生成物の5μlアリコートを、0.7%アガロース・ゲル(NuSieve, FMC)中の電気泳動により分析した。
PCR断片のサブクローニング
上記のように生成されたPCR生成物の45μlアリコートを、製造者の指示に従ってQIAquick PCR精製キット(Qiagen, USA)を使用して精製した。精製されたDNAを、50μlの10mM Tris-HCl, pH8.5中で溶出させた。50μlの精製されたPCR断片を、BamHIとApaIで消化し、0.8%低ゲル化温度のアガロース(Sea Plaque GTG, FMC)ゲル中で電気泳動にかけ、関係のある断片をそのゲルから切除し、そして製造者の指示に従ってQIAquick Gel抽出Kit(Qiagen, USA)を使用して精製した。精製された断片を、ゲル精製され、BamHI及びApaI消化されたpMB333にライゲートした。そしてそのライゲーションを、B. subtilis DN1885を形質転換させるために使用した。形質転換された細胞を、5μg/mlのエリスロマイシンを含むLBPG寒天プレート上にプレーティングし、そして33℃で一夜インキュベートした。クローンを同様のプレート上で再画線塗布し、そしてプラスミドを、5μg/mlエリスロマイシンを含むTY中で33℃でインキュベートされたクローンの一夜培養物から、製造者により記載されたようにQiaquickプラスミド・キットを使用して単離した。プラスミドを、ApaIとBamHIを使用した酵素消化によりチェックした。1の正しいクローンをMB339と、そしてそのプラスミドをpMB339と命名した。
4)我々は、ハイブリッド・プラスミドが形成されていることをモニタリングする簡単な方法をテストしようと欲した。従って、我々は、2つの別個のプラスミド上の2つの相同遺伝子の間の強制組換えをモニターすることを欲した。これは、GFPをコードするORFに転写的に融合されたプロモーターを欠くサビジンをもつpE194誘導体を構築することにより行われた。この方法においては、2つの相同遺伝子が組換えられず、そしてそれ故、pSX120上にその他の方法で存在するプロモーターの制御下にGFPを置かない場合には、(サビジンそしてそれ故GFP遺伝子の上流にプロモーターを欠くことにより)GFPの発現が存在しないであろう。このプラスミドを、GFP遺伝子をPCR増幅し、そしてpMB339上のサビジン遺伝子の直下流にそれを導入することにより、構築した。
本明細書中に使用するGFPコーディングDNAは元来の野生型遺伝子の誘導体であり、GFPの誘導体は、国際特許出願WO 97/11094中に記載されたように構築された突然変異体F64L-S65T-GFPのDNA構築物からクローン化した。
上記鋳型プラスミドの構築はWO 97/11094中に記載された。F64L-S65T-GFPをコードするDNA断片を、以下のように上記遺伝子をコードするE.coliプラスミドからPCR増幅した:
1μlのpF64L-S65T-GFP Qiaquickプラスミド・プレップを、200μMの各dNTP, 2.5ユニットのAmpliTaqポリメラーゼ(Perkin-Elmer, Cetus, USA)、及び100pmolの各プライマー:
を含むPCRバッファー(10mM Tris-HCl, pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01%(w/v)ゼラチン)中での50μlのPCR増幅のために使用した。
上記PCR反応を、DNAサーマル・サイクラー(Landgraf, Germany)を使用して行った。1分間94℃での1のインキュベーション、その後の40サイクルのPCRが、1分間94℃での変性、1分間55℃でのアニーリング、及び2分間72℃での伸長を使用して行われた。増幅生成物の5μlアリコートを、0.7%アガロース・ゲル(NuSieve, FMC)中の電気泳動により分析した。
PCR断片のサブクローニング
上記のように生成されたPCR生成物の45μlアリコートを、製造者の指示に従ってQIAquick PCR精製キット(Qiagen, USA)を使用して精製した。精製されたDNAを、50μlの10mM Tris-HCl, pH8.5中で溶出させた。このPCR断片とpMB339をClaIとNsiIで消化し、上記のようにゲル精製し、そして一緒にライゲートした。このライゲーション混合物を、DN1885を形質転換させるために使用し、形質転換された細胞を、LBPG 5μg/mlエリスロマイシン上にプレーティングした。18時間のインキュベーションの後、緑色の蛍光細胞が単一コロニーとして見えた。これらの中の1を分析し、そしてMB406として保存し、そして対応のプラスミドをpMB406として保存した。GFPコーディングORFはその転写を駆動する上流のプロモーターをもっていなかったので、GFP発現のための可能な説明は、サビジン−GFP転写融合物のさらに上流のプロモーター、すなわち、repF遺伝子のプロモーターからの読み進まれたということであった。
5)GFPのORF内へのいずれの読み進みをも廃止するために、転写ターミネーターを、repF遺伝子とサビジンDNAの間に挿入した。このターミネーターを、以下のプライマーと条件を使用してpMUTIN−4−MCSプラスミドから増幅した:
1μlのpMUTIN−4−MCS Qiaquickプラスミド・プレップを、200μMの各dNTP, 2.5ユニットのAmpliTaqポリメラーゼ(Perkin-Elmer, Cetus, USA)、及び100pmolの各プライマー:
を含むPCRバッファー(10mM Tris-HCl, pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01%(w/v)ゼラチン)中での50μlのPCR増幅のために使用した。
上記PCR反応を、DNAサーマル・サイクラー(Landgraf, Germany)を使用して行った。60秒間94℃での1のインキュベーション、その後の40サイクルのPCRが、30秒間94℃での変性、30秒間55℃でのアニーリング、及び1分間72℃での伸長のサイクル・プロフィールを使用して行われた。増幅生成物の5μlアリコートを、0.7%アガロース・ゲル(NuSieve, FMC)中の電気泳動により分析した。
増幅されたDNAを上記のように精製し、そして同じくBglII及びKpnI消化されたpMB406内にKpnI−BglII断片としてクローン化した(上記のものと同一の、ゲル精製等のための手順)。このライゲーション混合物をDN1885を形質転換させるために使用し、形質転換された細胞をLBPG 5μg/mlエリスロマイシン上にプレーティングした。18時間のインキュベーションの後、細胞が単一のコロニーとして見られた。これらの中の1を分析し、そしてMB430として保存し、そして同様にそのプラスミドをpMB430として保存した。このクローンは、GFPを全く発現していなかった。このことは、そのクローン化されたターミネーターが実際に予想されたように働いたことを示している。得られたプラスミドpMB430全体配列を、配列番号:1として表す。
MB432株の樹立
PL1801バチルス・サブチリスを、100μlのコンピテントPL1801当り約1μgの各プラスミドを使用して2つのプラスミドpMB430とpSX120で形質転換させた。この形質転換された細胞を、LBPG−5μg/mlエリスロマイシン上にプレーティングし、33℃で一夜インキュベートした。翌日、コロニーを、LBPG−5μg/mlエリスロマイシン+6μg/mlクロラムフェニコール上に再画線塗布し、そして33℃で一夜インキュベートした。コロニーを、液体培養物TY−5μg/mlエリスロマイシン+6μg/mlクロラムフェニコール中で一夜33℃でも培養し、プラスミドを培養ブロスから精製し、そしてPL1801株内の両pMB430とpSX120の存在を証明した。このクローンを保存し、そしてMB432と命名した。
実施例1
サビナーゼのズブチリシン遺伝子をコードする2つの相同配列の配列シャッフリング
ズブチリシン(subtilisin)タイプのプロテアーゼをコードする(pSX120内に含まれる)サビナーゼ野生型遺伝子を、高い相同性をもつ遺伝子のシャッフリングのための標的として選んだ。新たな制限部位を与える多数のサイレント突然変異が導入されているところの、pSX222内に含まれるサビナーゼ遺伝子(以下、サビジンという)の部位指定変異体を、サビナーゼに対するシャッフリング・パートナーとして使用した。上記2つの遺伝子を、本発明に従って2つの別個の適合性プラスミド上でクローン化した。転写活性なサビナーゼ遺伝子を、クロラムフェニコールに対する耐性をコードするpUB110起源に基づくプラスミド(pSX120、図4)上にクローン化した。サビナーゼ遺伝子を欠いたプロモーターを、同じくエリスロマイシンに対する耐性をコードする温度感受性プラスミドpE194の誘導体(pMB430)上にクローン化した。2つの転写ターミネーターを、いずれの読みをも防ぐためにサビジン遺伝子の上流にクローン化した。
pMB430中、緑色蛍光タンパク質(GFP)は、上記2つのプラスミド間のイン−クロス(in-cross)及びアウト・クロス(out-cross)に視覚的に従うことができるように、サビジン遺伝子に転写的に融合された。
2つのプラスミドpSX120とpMB430で形質転換されたB. subtilis株MB432, pL1801は、上記相同遺伝子間の2つの連続的な2重のクロス・オーバー事件を誘導するために2サイクルの温度シフトを通して採取された。相同的組換え及びプラスミド・ハイブリッド形成は、エリスロマイシンの存在下、制限的温度(42〜50℃)においてLBPGプレート上で選択された。これらの制限的条件下、温度感受性プラスミドpMB430は、サビナーゼ/サビジンの領域内での相同組換えにより安定性pSX120プラスミド内に強制される。組換えが生じている上記コロニーも、上記2つのプラスミド間の組換え及びサビジン−GFPオペロンの同時発生活性化の結果として蛍光になる(図2)。アウト・クロス事件は、2日間30℃の許容的温度でLB−ブロス中、上記クローンを培養し、そしてクロラムフェニコールとエリスロマイシンを含むLBPGプレート上で上記細胞をプレーティングすることにより、スクリーニングされた。
非蛍光性コロニーをプレート上で再画線塗布し、そして上記のような第2ラウンドの温度サイクルを通して採取した。
第2ラウンドのシャッフリングの後、プラスミド調製を20の異なるクローンから行った。コンピテントPL1801は、20のプラスミド・プレップの各々で形質転換し、そしてエリスロマイシンを補ったLBPG上でプレートした。これらのプレートを、pSX120とpMB430の両方が形質転換されていた不所望のクローンを同定するために、クロラムフェニコールとエリスロマイシンを含むLBPG上で複製した。pMB430プラスミドだけが形質転換されているクローンを、シャッフリングが生じているかどうかを同定するために、サビジン領域の配列決定について選択した。図6から、2つの遺伝子、サビナーゼとサビジンの間の組換えが生じていたことは明らかである。12の配列決定されたクローンの全てが、ある程度の組換えを示し、そしてこれらの中の4つが、2つの連続的な2重組換え事件の結果として、陽性に同定されることができる。サビナーゼとサビジン配列の交換が、シャッフルされた断片が、サビジンにとってユニークな制限部位に重複している場合にのみ観察されることができるということに注意することが重要である。2つの2重組換えのための陽性の証拠をもつ4つのクローンは、それ故、最小の数である。なぜなら、この組換えは、2つの隣接する制限部位の間で生じることができたであろうからである。
配列表
(2)配列番号:1についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:5313塩基対
(B)タイプ:核酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子タイプ: DNA
(vi)起源:
(A)生物:プラスミドpMB430
(xi)配列番号:1
Field of the invention
The present invention relates to a method for in vivo recombination of homologous DNA sequences. This method is a forced artificial evolution that results in a DNA sequence encoding a polypeptide with advantageous properties.
Background of the invention
Homologous recombination between DNA sequences placed on the same plasmid is well known to those skilled in the art (Weber and Weissmann, Nucl. Acid. Res. (1983) 11, 5661-5669). EP 252666 B1 (Novo Nordisk A / S), WO 95/22625 A1 (Affymax Technologies N.V.), and WO 9101087 disclose in vivo recombination of genes placed on the same plasmid.
EP 449923 B1 (Setratech) discloses a method of recombination between genes in vivo of partially homologous DNA sequences. This recombination occurs in cells where the enzyme mismatch repair system is defective.
J. Biotechnol. (1991) 19, 221-240 discloses a method for inactivating genes in the genome of B. Amylolique facdens. This method involves integration and excision of the pE194 mutant.
In Chemical Abstracts 118: 161925 (1993), the minimum sequence length of homology required for recombination is measured. This measurement method involves the incorporation of a pE194 derivative carrying a glucose gene.
J. Bacteriol. (1982) 152,524-526 discloses plasmid pBD9, which contains two plasmids from Staphylococcus aureus, pE194 and pUB110. Other plasmids based on pE194 or pUB110 are also available in Molecular and General Genetics (1988), 213, 465-70, Molecular and General Genetics (1984), 195, 374-7, Plasmid (1981), 6, 67-77, and Genetika, (1986) 22, 2750-7.
In Yichuan Xuebao (1993), 20, 272-8 (see Chemical Abstracts 120: 1670 (1994)), Chen et. Al described a thermostable α-amylase gene from Bacillus licheniformis. The plasmids pNW102 and pE194 derivatives inserted in are disclosed. pNW102 is transformed into Bacillus subtilis strain BF 7658 and then incubated at a non-permissive temperature and subjected to homologous recombination between the α-amylase genes of pNW102 and BF 7658. The Α-Amylase made from the above recombinant exhibits the same properties as α-Amylase from Bacillus licheniformis.
However, in the related field, DNA sequences are integrated and deleted (cross-linked) to obtain genes encoding polypeptides with improved properties, such as increased stability, improved specificity or higher activity. There is no indication that it can be recombined in vivo by repeating -out).
Therefore, the problem of the present invention is to provide an improved in vivo method for new DNA sequences.
Brief Description of the Invention
The present invention is directed to an in vivo method for generating a novel DNA sequence. Novel DNA sequences with improved properties are obtained in a rapid and efficient manner from at least two homologous DNA sequences by a method for in vivo exchange of DNA between at least two vectors, each containing a homologous DNA sequence and an origin of replication. Can be made.
The method of the present invention is characterized in that the exchange of the homologous sequence is performed by repeating the integration and excision from one vector to another vector at least once in vivo.
Thus, in a first aspect, the present invention is a method for in vivo recombination of homologous DNA sequences comprising the following steps:
(A) incubating cells containing at least two DNA constructs, each containing a DNA sequence and origin of replication, under conditions that favor incorporation from one of the DNA constructs into one of the other DNA constructs; Thereby creating a hybrid DNA structure;
(B) incubating the cells under conditions that favor deletion from the DNA construct, thereby creating a new DNA construct comprising a recombinant DNA sequence and an origin of replication, respectively;
(C) repeating steps a) to b) at least once,
The method.
One of the advantages of the in vivo recombination method of the present invention is that a number of different recombination patterns can be obtained between the DNA sequences by repeating the in vivo exchange between the DNA sequences.
This is shown in FIG. 1 herein, which is an in vivo assembly between two DNA sequences, Savinase and Savisyn, performed as described in Example 1. The result of replacement is shown.
In FIG. 1, sabinase / savicin recombinant clones, such as
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows that plasmid pTR, which is thermostable because its origin of replication works at 50 ° C., and placed on plasmid pTS, which is temperature sensitive because its origin of replication does not work at temperatures above 45 ° C. 2 Shows recombination of two DNA sequences. Under non-permissive conditions (ie at 50 ° C.), pTS was incorporated into pTR and a hybrid, plasmid was created.
FIG. 2 shows the cross out from the hybrid plasmid, forming two new DNA sequences each placed on one plasmid. Repeated crossing in and out can be achieved, for example, by temperature cycling or simply by maintaining temperature pressure and resistance to pTS (ie, ErmR) Can be made by selecting.
FIG. 3 shows the plasmid obtained after repeated integration and crossing out.
In addition, FIGS. 1 and 2 show a DNA structure system that is suitable for in vivo measurement of hybrid structure formation and is suitable for performing forced deletion of the DNA structure.
Figure 1: DNA structure pTS:
Suitable active promoters that direct the expression of active proteins
ErmR: Antibiotic resistance gene
DNA structure pTS:
It does not contain any active promoter to direct GFP transcription.
GFP: Green fluorescent protein
Erm in pTSRAntibiotic resistance genes are active due to the active promoter.
The GFP gene in pTR is inactive (ie the gene is not transcribed). This is because there is no active promoter for driving the expression of the gene.
Figure 2: After forming the hybrid structure according to the present invention, GFP becomes active (driven by the promoter). This allows the formation of the hybrid structure to be measured in vivo (see below for further details).
Conversely, ErmRThe antibiotic resistance gene becomes inactive (ie, the gene is not transcribed). This is because there is no active promoter that drives the expression of the gene. Erm for deletion of DNA hybrid structureRThis is done by incubating the cells under antibiotic pressure, thereby forcing the DNA hybrid structure to cross out. This is because the above cells only have an Erm after crossing out of their DNA structure has occurred.RThis is because an antibiotic resistance gene can be expressed.
Figures 4 and 5: show two vectors pSX120 (Figure 4) and pMB430 (Figure 5) used as described in Example 1 to recombine two DNA sequences sabinase and sabisin in vivo.
pSX120 consists of i) an open reading frame encoding sabinase, ii) an active promoter directing the transcription of sabinase, and iii) a gene conferring resistance to chloramphenicol (CamR)including.
pMB430 is i) a savidin DNA fragment, ii) a terminator (which does not result in transcription through subsequent regions), iii) a gene conferring resistance to erythromycin (ErmRAnd iv) an open reading frame encoding green fluorescent protein (GFP).
FIG. 6: shows the results of in vivo recombination of sabinase / savidin performed as described in Example 1. This schematic shows 12 clones that have been shuffled / recombined.
Gives Sabidine a unique restriction site position horizontally.
The letter “S” indicates that the sequence at that position is identical to that of the savinase, and the letter “Z” indicates that the sequence is of savidin origin. All of the sequenced clones differ in their recombination pattern.
Definition
As used herein, the following terms have the following meanings:
The term “DNA sequence” refers to any DNA sequence that is desired to be modified according to the present invention, eg, a polypeptide, eg, an enzyme, a pharmaceutically active polypeptide, eg, insulin growth hormone / human hormone or a growth regulator. And DNA sequences encoding sequences such as promoters, transcriptional or translational regulators and other sequences such as intracellular polynucleotides and polypeptides.
The term “homologous” means that the DNA sequence has several stretches of identical nucleotides that allow recombination in vivo. The stretch within the DNA sequence is at least 15 base pairs long, more preferably at least 25 base pairs long, even more preferably at least 50 base pairs long, and most preferably at least 150 base pairs long .
The term “homologous” includes stretches of DNA sequences that are 60% or more identical to DNA sequences that differ in only one nucleotide. The stretch of DNA sequence is preferably 70% or more identical, more preferably at least 80%, especially 90% or more, and the DNA sequence stretch is 95% identical, most preferably at least 97% identical. Is more preferable.
Within the stretch of the DNA sequence of interest, the homology of the DNA sequence referred to above is measured as the degree of identity between the two sequences indicating the derivation of the first sequence from the second sequence. This homology is preferably a computer program known in the art, such as the GAP (Program Manual for the Wisconsin Package,
The term “recombined DNA sequence” means a DNA sequence that is the result of a recombination event between at least two DNA sequences. This recombination event can be a single recombination event, or a first recombination event between at least two DNA sequences, followed by a cross-over at a different site than the first recombination event. Can be out.
The term “DNA structure” means a DNA molecule, such as a vector, a plasmid, a chromosome (eg, a Bacillus subtilis chromosome), a virus, a phage, a transposon, or a genome.
The term “vector” means any linear or circular DNA molecule that can contain the DNA sequence to be recombined and an origin of replication. The term includes any vector known to those of skill in the art, such as a plasmid or phage. This DNA sequence is, although not necessarily, optionally under the control of a promoter.
The term “cell”, as used herein with respect to the in vivo recombination methods of the present invention, is intended to encompass both “cells” and “cell populations”.
The term “transferring” means that the DNA structure is introduced into the cell. DNA constructs can be obtained using techniques known in the art for direct introduction of DNA, eg, electroporation, transformation of competent cells, protoplast transformation, transfection, transduction, conjugation or ballistics. (Ballistic) can be introduced by transformation.
The term “incubating” (or culturing, proliferating growth) means that the cells are treated in such a way that their normal cell functions, in particular the functions necessary for recombination, are active. The cells can be incubated on a solid support (agar petri dishes) or the cells can be incubated under soaking conditions. The cells are preferably incubated in a test tube, such as an Eppendorf test tube. In the case of a temperature sensitive replication origin, the test tube is conveniently placed in an automatic thermocycler. In addition, the cells can be incubated in standard shake flasks.
The term “origin of replication” (ori) refers to the region where replication of a DNA structure is initiated. With respect to the origin of replication, the term “functional” means that replication can be initiated from the origin. The term “non-functional” means that replication does not begin under certain conditions, or that the initiation of replication is, for example, a DNA construct with a marker gene and ori under appropriate selection pressure. It is meant to be reduced to a level that is not sufficient for the survival of the containing cells.
The term “temperature sensitive” refers to an origin of replication or a vector that cannot replicate in a non-permissive condition, eg, at an elevated temperature, ie, still allowing the growth of its parent cell. It means that.
The term “temperature tolerance” means that with respect to an origin of replication or vector, the vector can replicate at an elevated temperature.
The term “DNA library” is a library containing a number of different DNA sequences. DNA libraries can be prepared according to standard procedures known in the art, for example by in vitro DNA shuffling / DNA recombination (WO 95/17413, WO 95/22625) and / or error-prone PCR and cassette mutagenesis. Can be made.
As used herein, a DNA library can include as little as 2-20 different sequences, for example, a library in which only one amino acid has been altered.
In addition, a DNA library can contain a number of different DNA sequences, such as 10TenUp to different sequences can be included.
Detailed Description of the Invention
The present invention is a method for in vivo recombination of homologous DNA sequences comprising the following steps:
(A) i) at least one origin of replication is non-functional, and ii) the cell under selective pressure that allows the cell to grow only if it contains a DNA construct with said non-functional origin. Under certain conditions, incubate cells containing at least two DNA structures, each containing a DNA sequence and an origin of replication (ie, from one in the DNA structure into one in the other DNA structure). Supporting the integration of DNA, thereby creating a hybrid DNA structure);
(B) changing from the above conditions to a condition where fewer origins of replication are non-functional than in step a) (ie, supporting crossing out from the hybrid DNA construct);
(C) repeating steps a) to b) at least once,
Including the method.
The recombined DNA sequence will encode a novel polypeptide with new properties. A selection or screening system can then be incorporated into the methods of the present invention to select and / or screen for the desired property encoded by one or more of the recombinant DNA sequences.
The number of repeats in step (c) can be one repeat, or it can be more, for example, 5-10 repeats, or 50-100 repeats or even more.
By incubating the cells under conditions such that the origin of replication of the DNA structure is non-functional, integration is forced (or preferred for DNA structure survival), and again the DNA structure It is preferred to force cross-out by incubating the cells under conditions such that the origin of replication is functional.
In another preferred embodiment of the routine shown above in steps (a) to (c), under steady conditions (eg, constant temperature and selective pressure) where the natural cross-in and cross-out occur, It is preferred to maintain the cells. That is, the shuffling procedure in the cells is repeated without changing the above conditions repeatedly.
In many DNA constructs, such as many Bacillus DNA constructs (vectors) (Bacillus subtitis and other Gram-positive bacteria, Sonensheim et al., 1993, American Society for Microbiology, Washington, DC) The origin of replication includes ori (+) and ori (−). ori (+) controls where replication of the first DNA strand begins, and ori (-) controls the starting point for replication on the second strand (Bacillus subtilis and other Gram positives) Bacteria, Sonensheim et al., 1993, American Society for Microbiology, Washington DC).
In one embodiment of the method of the invention, at least one DNA construct does not contain ori (−) (ie only contains ori (+)). Preferably, an ori (-) free DNA construct is a DNA construct whose origin (i.e., ori (+) here) is functional during the formation of a hybrid construct performed according to the present invention. It is.
One advantage of the above aspect of the invention is that when only ori (+) is functional in the DNA structure, the DNA structure comprises both ori (+) and ori (−). This means that it is in a single-stranded state for a relatively long period of time compared to the object. This extended single-stranded state facilitates the formation of a hybrid DNA structure according to the method of the present invention.
Preferably, the ori (-) free DNA construct as described above is a Bacillus construct, more preferably a Bacillus vector.
To illustrate the above concept, there is an example of a modified pTR (TR: thermostable) Bacillus vector that does not contain ori (−) (see FIG. 1). When the hybridization is performed at 50 ° C., only the origin of pTR is functional (the origin of pTS (TS: temperature sensitivity) is not functional) (see FIGS. 1 and 2). The DNA construct pTR contains only ori (+) and is therefore in a single-stranded state for a relatively long period of time, which facilitates recombination events and subsequent hybridization with the pTS DNA construct (See FIGS. 1 and 2).
More preferably, one DNA construct is a vector that can replicate under certain (permissive) conditions and cannot replicate under other (non-permissive) conditions. The vector can be, for example, one that is temperature sensitive with respect to replication. Thus, the vector can be one that cannot replicate at elevated temperatures, further allowing its parental cell to grow. The cells are first incubated at a temperature that allows replication of the vector, and then incubated after the integration into other DNA constructs can occur, and the vector is Incubate at a temperature that does not allow replication of the vector so that it is lost from the cells.
The vector can further include a selectable marker. In this case, incubation at non-permissive temperatures should be performed under selective conditions to ensure that only cells containing the integrated vector (including its DNA sequence and selectable marker) will survive. Can do.
Furthermore, it is preferable to construct a system that can measure the formation of the hybrid structure in vivo.
Preferably, this is done by constructing a system in which proteins that can be screened or selected in vivo are expressed only after the hybrid structure is formed.
Preferably, the screenable protein is a protein that is fluorescent under suitable exposure, and in particular, the fluorescent protein is green fluorescent protein (GFP) or a variant thereof.
Green fluorescent protein (GFP) or variants thereof, and how GFP is activated to fluoresce has been described in the art and for further details (Crameri et al. Nature Biotechnology 14: 315-319 (1996); and Cormack et al. GENE 173: 33-38 (1996)).
One of the advantages of using a screenable protein as described above that is fluorescent under suitable exposure, and in particular GFP or a variant thereof, is for selectively picking up cells containing the hybrid construct. This is possible, for example, by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This is in accordance with the first aspect of the present invention and can remove the background of cells that do not contain the hybrid structure after step a).
FACS is a well-known screening technique and see (Cormack et al. “FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)” GENE 173: 33-38 (1996)) for further details. be able to.
To illustrate a suitable system that allows in vivo measurement of the formation of the hybrid structure, an example of a suitable system is shown in FIGS.
Instead of using screenable proteins as discussed above, it is advantageous to use a selectable marker such that the selectable marker is active in transcription only when the hybrid structure is formed. be able to.
Furthermore, it is preferable that the crossing out from the hybrid DNA structure in step b) of the first aspect of the present invention is a forced crossing out case.
Forced crossing out from the above hybrid structure:
i) constructing a system in which the DNA hybrid construct does not express a selectable marker and at least one of the at least two DNA constructs in step a) of the first aspect can express the selectable marker And
ii) Since the cell can express the marker gene only after the crossing out of the DNA hybrid structure has occurred, the cell is incubated under selectable conditions, thereby Force a cross-out,
Can be done.
Preferably, the selectable marker gene described above is on a DNA structure whose origin of replication is non-functional during forced integration of the DNA structure into the DNA hybrid structure performed as described above. Expressed and preferably the selectable marker gene is an antibiotic resistance gene. See below for further description of suitable selectable marker genes.
To illustrate the concept of forced crossing out from the hybrid DNA structure, an example of a suitable system is shown in FIGS.
A selectable marker is any marker known in the art, for example, a gene that encodes a product that confers antibiotic resistance to a cell, prototrophy to an auxotrophic strain, or complements a host defect (Eg, the dal gene introduced into the dal-strain; B. Diderichsen (1986), Bacillus: Molecular Genetics and Biotechnology Applications, AT Gene san and JA Hoch, Eds., Academic Press, pp. 35 See -46). A selectable marker can be, for example, a plasmid excised from a known source or present on a vector and used, for example, for the construction of a DNA construct to be used in the methods of the invention.
This selection can be accomplished by culturing the cells under selective pressure for the selectable marker encoded by the marker gene.
The DNA construct (where the vector is incorporated) can be any of the types described above, eg, with respect to the marker optionally carried by the vector to be used in the methods of the invention. A gene encoding a selectable marker. Thus, the marker gene encodes resistance to antibiotics such as kanamycin, tetracycline, ampicillin, erythromycin, chloramphenicol, or resistance to various heavy metals such as selenate, antimony or arsenate. Can do.
In preferred embodiments, the cells used in the method are defective or temporarily inactivated in the enzyme mismatch repair system or have a reduced level of mismatch repair. In the synthesis of DNA, errors can occur and the resulting non-complementary base pairs are referred to as mismatches. There is a process for calibration of errors (mismatches) in DNA. In E. coli, these errors are due to the fact that the third enzyme (MutU) unwinds two DNA strands and the fourth enzyme (MutH) is subsequently sequenced by a methylated DNA ( GATC) is detected very fast and accurately by two enzymes (MutS and MutL) that make it possible to cleave the newly synthesized strand on itself. For a more thorough explanation see EP 449923 (Setratech), the contents of which are incorporated herein by reference.
In other preferred embodiments, the cells used in the process are damaged or blocked by a major recombinant enzyme such as AddAB. Strains damaged by the AddAB gene show a higher frequency of homologous recombination. Both legitimate and illegitimate recombination frequencies are increased. However, in particular, recombination frequencies for illegitimate recombination are supported when working with strains that have been damaged or blocked in AddAB ATP-dependent nucleases (Meima, R; Haijema, BJ; Dijkstra, H; Venema, G; Bron, S (1997) Role of enzymes of homologous recombination in illegitimate plasmid recombination in Bacillus-subtilis. JOURNAL OF BACTERIOLOGY Vol. 179, No. 4 pp. 1219-1229).
In another preferred embodiment, the cells used in the above method overexpress one of the key recombinant enzymes, recA. This recA enzyme is involved in homologous recombination by initiating the regeneration of ssDNA to form the heteroduplex molecules necessary for the recombination event, and initiates DNA strand exchange. (PROGRESS IN NUCLEIC ACID RESEARCH AND MOLECULAR BIOLOGY Vol. 56, pp. 129-223 (1997)). Overexpression of recA can be achieved either by classical mutagenesis of the host strain or by cloning of the highly expressed recA gene.
In another preferred embodiment, the cells used in the above method are subjected to UV, X-ray or DNA damaging agents to increase the frequency of recombination between two homologous genes to be shuffled. . Stresses such as UV, X-ray or DNA damaging agents are known to induce recombinant enzymes through the SOS response and to activate enzymes involved in the recombination process such as recA. Yes. (BACILLUS SUBTILIS AND OTHER GRAM-POSITIVE BACTERIA, pp. 529-537 (1993)).
In another preferred embodiment, the pTR-based plasmid used as one carrier in the gene to be shuffled is a low-copy version of pTR or pWV01, (MOLECULAR AND GENERAL GENETICS Vol. 249, No. 1 pp. 43-50 (1995)), pTA1060, (JOURNAL OF BACTERIOLOGY Vol. 142, No. 1 pp. 315-8 (1980)) or pAMb1, (JOURNAL OF BACTERIOLOGY Vol. 157, No. 2 pp. 445- 53 (1984)) and is replaced by any of the other B. subtilis compatible low-copy plasmids. In a further preferred embodiment, one of the DNA constructs containing one of the genes to be shuffled is placed on the cell stain and is another DNA construct of the subject of interest to be recombined. Those containing other genes are plasmids. When carrying out the in vivo recombination method of the invention, the plasmid will be recombined with a DNA construct on the chromosome.
The plasmid can be, for example, a temperature sensitive plasmid.
The advantage of using a low-copy pTR, or system in which one of the DNA constructs is located on the chromosome as described above, is that the hybrid DNA construct after recombination of two homologous genes is It will be the dominant form of the gene in the cell. The high-copy background of the non-recombinant pTR plasmid inevitably reverts the gene hybrid formed in the first round to the wild type after the second round of recombination, and hence shuffling of the two genes Will be blocked. When the chromosome is used as a carrier in one of the above genes, the wild type background cannot coexist when pTS is integrated via a homologous gene.
The cells used in the above method are preferably cells suitable for large-scale production of recombinant DNA sequence products. The cell is preferably a bacterial cell, more preferably a Bacillus cell, and most preferably a Bacillus subtilis cell.
The DNA sequence to be recombined can be isolated / cloned from the organism containing the sequence in a manner known per se. For example, a suitable oligonucleotide probe can be prepared based on a first DNA sequence of interest to obtain a second sequence that is homologous to the first sequence. Alternatively, the DNA sequence can be amplified by PCR based on primers designed according to the knowledge of the conserved region.
In a different embodiment of the present content, the term “a set of homologous DNA sequences (“ set A ”,“ set B ”,“ set C ”, etc.)”, for example, of two or more different sets of homologous DNA sequences A set of homologous DNA sequences (“Set A”, “Set B”, “Set C”, etc.) and of the above homologous sequences (“Set A”, “Set B”, “Set C”, etc.) The present invention relates to a method according to the present invention such that each is inserted into a different DNA structure (“DNA structure A”, “DNA structure B”, “DNA structure C”, etc.) according to the present invention. Used with respect to one aspect of
This term is used to explain that the in vivo recombination methods of the invention can be used to recombine many “sets” of homologous DNA sequences. Each individual “set” of homologous DNA sequences can individually contain from one to many individual homologous DNA sequences (eg, a “set” comprising a DNA library).
Next, each of the above sets of homologous DNA sequences (“Set A”, “Set B”, “Set C”, etc.) is different from the DNA structure (“DNA structure A”, “DNA structure B” according to the present invention). "," DNA structure C ", etc.). Each of the different DNA constructs described above preferably differ according to the present invention in important parameters such as different origins of replication, different selectable markers, etc.
Next, all of the DNA structures (“DNA structure A”, “DNA structure B”, “DNA structure C”, etc.) can be introduced into cells according to the present invention, and When performing the method for in vivo recombination of the present invention, each individual DNA construct (“DNA construct A”, “DNA construct B”, “DNA construct C”, etc.) According to the present invention, it can be recombined randomly. After repeating the method of the present invention 2 to 3 times, this is due to the different recombined DNA sequences recombined randomly between all “sets” of the homologous DNA sequences used in the method. The DNA population will be given within a cell population, including many different combinations.
Further, the term “a set of homologous DNA sequences (“ set A ”,“ set B ”,“ set C ”, etc.) is used herein to refer to 1, 2 to 3, and / or many (eg, Large DNA library) To illustrate one of the advantages of the in vivo recombination method of the present invention, which is the flexibility of the system for recombining both sets of homologous DNA sequences, including individual homologous DNA sequences Used for.
Accordingly, one aspect of the present invention relates to a method according to the present invention wherein each of the above sets of homologous DNA sequences comprises only one DNA sequence (ie recombination of two or more homologous sequences).
Further, in embodiments of the invention, the homologous DNA sequence to be recombined is obtained from a pre-made DNA library and / or from an individual different pre-made library.
Homologous DNA obtained from the above DNA library is inserted into a vector according to the present invention (that is, DNA representing the DNA library is ligated (inserted) into the vector).
As described herein, the methods of the invention comprise at least two DNA constructs (eg, vectors) that differ in methods that permit forced in vivo recombination of the vectors.
Homologous DNA representing a DNA library can be inserted into only one and / or both of the different vectors.
That is, for example, a homologous DNA representing one DNA library is inserted (ligated) into one of the different vectors, and a homologous DNA representing another DNA library is inserted into another vector. In some cases, this will allow rapid and efficient recombination between two different libraries by the in vivo recombination method according to the invention. To illustrate this concept, DNA representing one library can be inserted into the pTR vector (see Figure 1), and DNA representing the other library is inserted into the pTS vector. (See FIG. 1). Subsequently, repeating the in vivo recombination event performed by the method according to the present invention 2-3 times will give a cell population representative of a novel library that is a combination of the two libraries described above.
Thus, at least one of the set of homologous DNA sequences is obtained from a pre-made DNA library, and at least one of the set of homologous DNA sequences is a DNA sequence that is homologous to the DNA library. A method according to the invention (ie resulting in a method for in vivo recombination of said DNA library into a DNA sequence homologous to said DNA library); or
In a method according to the present invention wherein the set of homologous DNA sequences is obtained from the same pre-made DNA library (i.e. resulting in a method for in vivo recombination of the DNA library); or
The method according to the invention, wherein the set of homologous DNA sequences is obtained from at least two different pre-made DNA libraries (ie resulting in a method for in vivo recombination of at least two different DNA libraries) Related to.
In order to obtain further recombination between the DNA sequences, it is preferred to isolate the DNA construct after the first round of in vivo recombination of the DNA sequences performed according to the present invention. The isolated construct is then retransformed into the cell and a further process round of in vivo recombination is then performed.
The advantages of the above process are illustrated by the following examples:
Set A is a vector A in which DNA sequences a and b are individually introduced into the vector A (ie, the population of vectors A includes a vector having the DNA sequence a and a vector having the sequence b. ); And
Set B is a vector B in which the DNA sequences c and d are individually introduced into the vector B (that is, the population of vectors B includes a vector having the DNA sequence c and a vector having the sequence d. ).
Vectors A and B are then transformed into the cell population and recombined in vivo according to the present invention. This will give recombination between the DNA sequences ac, ad, bc, bd. Vectors A and B containing the recombined sequence are isolated and retransformed into the cell population. In vivo recombination according to the invention will then give all possible recombination of the four (a, b, c, d) DNA sequences, eg abc, abdc, etc.
In a further aspect, the present invention is a method according to the present invention, wherein two sets of homologous DNA sequences (“Set A” and “Set B”) are recombined in vivo, comprising the following steps:
a) inserting the sequence from “Set A” into one vector containing the thermostable origin of replication and the gene for the first marker;
b) inserting the sequence from “Set B” into one vector containing the temperature sensitive origin of replication and the gene for the second marker;
c) introducing the two vectors into the cell;
d) optionally incubating said cells at a temperature at which both origins of replication are functional under selective pressure that favors cells carrying both marker genes;
e) shifting the temperature to a temperature where only the heat-resistant replication origin is functional;
f) Repeat steps d) to e) at least once;
In said method comprising or
A method according to the present invention wherein two sets of homologous DNA sequences ("Set A" and Set B ") are recombined in vivo, comprising the following steps:
a) inserting the sequence from “Set A” into a vector containing the thermostable origin of replication and the gene for the first marker;
b) inserting the sequence from “Set B” into one vector containing the temperature sensitive origin of replication and the gene for the second marker;
c) introducing the two vectors into the cell;
d) incubating the cells at a temperature at which only the thermostable origin of replication is functional, optionally under selective pressure that favors cells with both marker genes;
e) optionally shifting the temperature to a temperature at which both origins of replication are functional;
f) Repeat d) to e) at least once,
The method.
In a further aspect, the present invention is a method for producing one or more recombinant proteins having a desired biological activity:
a) performing a method for in vivo recombination of homologous DNA sequences, wherein at least one of the DNA constructs is an expression vector (this method is performed according to the present invention as described herein) );
b) expressing a number of different recombinant polypeptides encoded by a number of different recombinant DNA sequences from step a); and
c) Screen or select many different recombinant proteins from step b) in a suitable screening or selection system for one or more recombinant polypeptides having the desired activity.
The method.
Preferably, the expression vector in step a) above is during the forced hybrid DNA formation performed according to the method for in vivo recombination of homologous DNA sequences according to the invention (ie the incorporation of the structures into each other). A DNA construct that cannot replicate (eg, has a non-functional origin of replication). This will improve the probability that the expression vector will contain the recombined homologous DNA after the crossing out event of the hybrid structure according to the present invention. Other DNA constructs that can replicate under the conditions used to force the formation of the hybrid structure only when the expression vector can survive This is because it is actually recombined.
After the method for in vivo recombination has been carried out (above step a)) and before the expression and screening steps b) and c), it is advantageous to mainly create a cell population containing only the expression vector. (Ie, other DNA constructs are partially or nearly completely removed from the cell population). This is particularly advantageous when the expression vector is unable to replicate during the formation of the forced hybrid DNA construct as described above. This is because such cell populations will advantageously have a very limited background of the non-recombinant DNA sequence of interest, which is in the subsequent screening step (step c above)).
Mainly creating a cell population that contains only the expression vector is in accordance with standard procedures known in the art, for example, under conditions that selectively favor replication of the expression vector relative to other DNA constructs. This can be done by culturing the cells; or by selectively purifying the expression vector from the cells and then introducing it into a new cell population.
Expression of the recombinant polypeptide encoded by the recombination sequence in step a) above can be performed by use of a standard expression vector and / or a standard expression vector according to the invention It can be modified to include elements that are particularly suitable for in vivo recombination methods.
A suitable screening or selection system for screening or selecting many different recombinant proteins from step b) above will depend on its desired biological activity.
A number of screening or selection systems suitable for screening or selecting for a desired biological activity have been described in the art. These examples are
Describes a screening system for screening for subtilisin variants with calcium-independent stability, Strauberg et al. (Biotechnology 13: 669-673 (1995));
Describes a screening assay to screen for proteases with enhanced thermostability, Bryan et al. (Proteins 1: 326-334 (1986)); and
PCT-DK 96/00322, which describes a screening assay to screen for lipases with improved cleaning performance in laundry detergents
It is.
Preferred embodiments of the invention include screening or selection of recombinant proteins where the desired biological activity is improved performance in dishwashing or laundry detergents. Examples of suitable dishwashing or laundry detergents are disclosed in PCT / DK96 / 00322 and WO 95/30011.
The present invention also comprises a set (at least two) vectors comprising at least two different origins of replication capable of functioning in the same cell under permissive conditions, and at least two homologous DNA sequences encoding the polypeptide. Including. In a preferred embodiment, at least one origin of replication is temperature sensitive. The vector can preferably be a plasmid.
The present invention further comprises at least:
a) a vector A comprising a DNA sequence encoding a polypeptide and an origin of replication; and
b) a vector B comprising a DNA sequence homologous to the DNA sequence in vector A, and a replication origin different from the replication origin in vector A;
A vector system comprising
Polypeptides wherein the DNA sequence has biological activity, in particular enzymes, and in particular enzymes such as amylases, lipases, cutinases, cellulases, oxidases, phytases, and proteases,
Is preferably encoded.
The present invention is a novel, recombinant DNA sequence which is produced by the method according to the present invention or which encodes a recombinant protein having the desired biological activity, wherein the desired organism A recombinant protein having a biological activity comprises said DNA sequence, characterized in that it is made by a method for one or more recombinant proteins having a desired biological activity according to the present invention.
The invention further relates to a process for the production of a polypeptide, in particular an enzyme, i) culturing cells expressing the polypeptide encoded by the recombinant DNA sequence according to claim 38, and ii) said expression A process comprising purifying the produced polypeptide.
The invention further encompasses novel polypeptides, in particular enzymes, characterized in that they are produced by the method according to the invention.
The invention further encompasses a polypeptide, in particular an enzyme, characterized in that it is encoded by a recombinant DNA sequence according to the invention.
The polypeptides of the present invention include peptides and proteins, and optionally their glycosylated forms. Examples of these are enzymes, pharmaceutically active polypeptides, such as analogs of human or mammalian polypeptides, such as insulin, growth hormone, human hormones or growth regulators.
The invention is explained in more detail in the following examples. The examples are not intended to limit the scope of the invention in any way.
Example
Materials and methods
stock
Bio-Rad Gene Pulser as recommended by the manufacturerTMElectrocompetent cells prepared and transformed using
According to Yasbin, RE, Wilson, GA and Young, FE (1975) Trans formation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis: evidence for selective induction of prophage in competent cells. J. Bacteriol, 121: 296-304 Prepared and transformed as described.
B. subtilis PL 1801. This strain is B. subtilis DN 1885 in which the apr and npr genes are disrupted
Plasmid:
pSX120: B. subtilis expression vector (described in EP 405901 and WO 91/00345). This vector contains the wild type sabinase gene.
pE194: (Horinouchi, S and Weisblum, B., 1982, J. Bacteriol.150 : 804-814).
B. subtilis expression vector (described in WO 96/34946 and WO 92/19729). This vector contains a synthetic Savinase gene referred to herein as Savisyn. A number of restriction sites have been introduced into the savicin gene as compared to the wild-type sabinase gene contained in pSX120.
pUC19: Yanisch-Perron, C., Vieria, J. and Messing, J. (1985) Gene 33, 103-119.
pF64L-S65 T-GFP; is an E. coli plasmid encoding a DNA fragment encoding F64L-S65T-GFP described in WO 97/11094.
pMUTIN-4-MCS: This plasmid can be obtained from Laboratoire de Genetique Microbienne, Institut National de la Recherche Agronomique, 78352 Jouy en Josas-CEDEX, France.
Solution / medium
TY and LB agar (Ausubel, F.M. et al. (Eds.) “Current protocols in Molecular Biology” as described in John Wiley and Sons, 1995).
LBPG is LB agar supplemented with 0.5% glucose and 0.05M potassium phosphate, pH 7.0.
The LBPGSK plate is an LBPG medium containing agar and 1% skim milk.
Antibiotics are used in different media at concentrations of 6 μg / ml chloramphenicol, 10 μg / ml kanamycin, and 5 μg / ml erythromycin.
TE-buffer (as described in Ausubel, F.M. et al. (Eds.) “Current protocols in Molecular Biology”. John Wiley and Sons, 1995).
General molecular biology method
DNA manipulation and transformation are performed using standard methods of molecular biology (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, FM et al. (Eds .) “Current protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, 1995: Harwood, CR, and Cutting, SM (eds.) “Molecular Biological Methods for Bacillus”, John Wiley and Sons, 1990) .
Enzymes for DNA manipulation were used according to the supplier's instructions.
Enzymes for DNA manipulation
Unless otherwise stated, all enzymes for DNA manipulation, such as restriction endonucleases, ligases, polymerases, PCR polymerases, etc. are obtained from New England Biolabs, Inc.
Construction of humidity-sensitive shuffling plasmid
pMB430 was constructed in a 5-step cloning method as shown below. The entire DNA sequence is found within SEQ ID NO: 1.
1) The temperature sensitive plasmid pE194 was modified by introducing a multi-flowing site near the unique ClaI site of the pE194 plasmid and thus destroying the ClaI site. This introduction was performed by PCR using primers # 22899 and 24039 to amplify the entire plasmid and introduce several unique cloning sites.
This PCR was performed as follows:
1 μl of pE194 Qiaquick plasmid prep, 200 μM of each dNTP, 2.5 units of AmpliTaq polymerase (Perkin-Elmer, Cetus, USA), and 100 pmol of each primer:
Containing PCR buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% (w / v) gelatin) was used for 50 μl PCR amplification.
The PCR reaction was performed using a DNA thermal cycler (Landgraf, Germany). One incubation at 94 ° C for 1 minute followed by 40 cycles of PCR was performed using denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 55 ° C for 1 minute, and extension at 72 ° C for 2 minutes. A 5 μl aliquot of the amplified product was analyzed by electrophoresis in a 0.7% agarose gel (NuSieve, FMC).
Subcloning of PCR fragments
A 45 μl aliquot of the PCR product generated as described above was purified using a QIAquick PCR purification kit (Qiagen, USA) according to the manufacturer's instructions. The purified DNA was eluted in 50 μl of 10 mM Tris-HCl, pH 8.5. 50 μl of the purified PCR fragment was digested with BamHI, electrophoresed in a 0.8% low gelling temperature agarose (Sea Plaque GTG, FMC) gel, the relevant fragments were excised from the gel, and the manufacturer Purified using QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA) according to instructions. The isolated DNA fragment was then ligated into BamHI digested pUC191 and the ligation mixture was used to transform E. coli SJ2.
Cells contain erythromycin (200 μg / ml) supplemented with X-gal (SIGMA, USA) (5-bromo-4-chloro-3-indoleyl alpha-D-galactopyranoside, 50 μg / ml). Plated on LB agar plates.
Identification and characterization of positive clones
Transformed cells were plated on LB agar plates containing erythromycin (200 μg / ml) supplemented with X-gal (50 μg / ml) and incubated overnight at 37 ° C. The next day, white colonies were rescued by re-streaching them onto fresh LB-erythromycin agar plates and incubated overnight at 37 ° C. The next day, a single colony of each clone was transferred to liquid LB medium containing erythromycin (200 μg / ml) and incubated overnight at 37 ° C. with shaking at 250 rpm.
Plasmid was extracted from the liquid culture using the QIAgen plasmid purification mini kit (Qiagen, USA) according to the manufacturer's instructions. A 5 μl sample of the plasmid was digested with BamHI. This digestion was checked by electrophoresis on a 0.7% agarose gel (NuSieve, FMC). Appearance of two DNA fragments of approximately 2.7 kb and 3.7 indicated positive clones. This clone was named MB293 and this plasmid was named pMB293.
2) pMB293 was then EcoRI digested and the 3.8 kb fragment was gel purified on a 0.7% agarose gel using the QiaQuick gel purification kit from Qiagen according to the manufacturer. This fragment constituting pE194 with the inserted multiple cloning site (due to the PCR primer and MCS of pUC19) was circularized by ligation and used to transform B. subtilis DN1885 The transformed cells were selected on LBPG plates containing 5 μg / ml erythromycin and incubation was performed overnight at 33 ° C. Clones from this transformation were re-streaked and cultured overnight in TY containing 5 μg / ml erythromycin. Cells were isolated from the overnight culture broth and the plasmid was purified using the Qiaquick plasmid kit. Restriction enzyme digestion of these plasmids proved the correctness of the clone. One such clone and plasmid were designated MB333 and pMB333.
3) pMB333 was then used as a temperature sensitive plasmid for the construction of a plasmid containing the savidin gene without any promoter. This structure was made as follows.
PCR using primers # 21547 and # 21548 and pSX222 as template was performed according to the above conditions:
1 μl of pSX222 Qiaquick plasmid prep, 200 μM of each dNTP, 2.5 units of AmpliTaq polymerase (Perkin-Elmer, Cetus, USA), and 100 pmol of each primer:
Containing PCR buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% (w / v) gelatin) for 50 μl PCR amplification.
The PCR reaction was performed using a DNA thermal cycler (Landgraf, Germany). One incubation at 94 ° C for 1 minute followed by 40 cycles of PCR was performed using denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 55 ° C for 1 minute, and extension at 72 ° C for 2 minutes. A 5 μl aliquot of the amplified product was analyzed by electrophoresis in a 0.7% agarose gel (NuSieve, FMC).
Subcloning of PCR fragments
A 45 μl aliquot of the PCR product generated as described above was purified using a QIAquick PCR purification kit (Qiagen, USA) according to the manufacturer's instructions. The purified DNA was eluted in 50 μl of 10 mM Tris-HCl, pH 8.5. 50 μl of the purified PCR fragment was digested with BamHI and ApaI, electrophoresed in a 0.8% low gelling temperature agarose (Sea Plaque GTG, FMC) gel, the relevant fragments were excised from the gel, and Purified using QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA) according to manufacturer's instructions. The purified fragment was ligated to gel purified and BamHI and ApaI digested pMB333. The ligation was then used to transform B. subtilis DN1885. Transformed cells were plated on LBPG agar plates containing 5 μg / ml erythromycin and incubated overnight at 33 ° C. Clones were re-streaked on the same plate and plasmids were obtained from overnight cultures of clones incubated at 33 ° C. in TY containing 5 μg / ml erythromycin from Qiaquick plasmid plasmids as described by the manufacturer. Isolated using kit. The plasmid was checked by enzymatic digestion using ApaI and BamHI. One correct clone was named MB339 and the plasmid was named pMB339.
4) We wanted to test a simple way to monitor the formation of hybrid plasmids. We therefore wanted to monitor forced recombination between two homologous genes on two separate plasmids. This was done by constructing a pE194 derivative with savidin lacking a promoter that was transcriptionally fused to the ORF encoding GFP. In this method, two homologous genes are not recombined and, therefore, if GFP is not placed under the control of a promoter that is otherwise present on pSX120 (upstream of the savidin and hence the GFP gene. GFP expression will be absent (by lacking a promoter). This plasmid was constructed by PCR amplification of the GFP gene and introducing it directly downstream of the Savidin gene on pMB339.
As used herein, the GFP coding DNA is a derivative of the original wild type gene, and the derivative of GFP is a mutant F64L-S65T constructed as described in International Patent Application WO 97/11094. -Cloned from a DNA construct of GFP.
The construction of the template plasmid was described in WO 97/11094. A DNA fragment encoding F64L-S65T-GFP was PCR amplified from the E. coli plasmid encoding the gene as follows:
1 μl of pF64L-S65T-GFP Qiaquick plasmid prep, 200 μM of each dNTP, 2.5 units of AmpliTaq polymerase (Perkin-Elmer, Cetus, USA), and 100 pmol of each primer:
Containing PCR buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% (w / v) gelatin) for 50 μl PCR amplification.
The PCR reaction was performed using a DNA thermal cycler (Landgraf, Germany). One incubation at 94 ° C for 1 minute followed by 40 cycles of PCR was performed using denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 55 ° C for 1 minute, and extension at 72 ° C for 2 minutes. A 5 μl aliquot of the amplified product was analyzed by electrophoresis in a 0.7% agarose gel (NuSieve, FMC).
Subcloning of PCR fragments
A 45 μl aliquot of the PCR product generated as described above was purified using a QIAquick PCR purification kit (Qiagen, USA) according to the manufacturer's instructions. The purified DNA was eluted in 50 μl of 10 mM Tris-HCl, pH 8.5. This PCR fragment and pMB339 were digested with ClaI and NsiI, gel purified as above, and ligated together. This ligation mixture was used to transform DN1885 and the transformed cells were plated on
5) To abolish any reading of GFP into the ORF, a transcription terminator was inserted between the repF gene and the savidin DNA. This terminator was amplified from the pMUTIN-4-MCS plasmid using the following primers and conditions:
1 μl of pMUTIN-4-MCS Qiaquick plasmid prep, 200 μM of each dNTP, 2.5 units of AmpliTaq polymerase (Perkin-Elmer, Cetus, USA), and 100 pmol of each primer:
Containing PCR buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% (w / v) gelatin) for 50 μl PCR amplification.
The PCR reaction was performed using a DNA thermal cycler (Landgraf, Germany). One incubation at 94 ° C for 60 seconds, followed by 40 cycles of PCR using a cycle profile of denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 1 minute It was conducted. A 5 μl aliquot of the amplified product was analyzed by electrophoresis in a 0.7% agarose gel (NuSieve, FMC).
The amplified DNA was purified as above and cloned as a KpnI-BglII fragment into pMB406, also digested with BglII and KpnI (same procedure for gel purification etc. as above). This ligation mixture was used to transform DN1885 and the transformed cells were plated on
Establishment of MB432 strain
PL1801 Bacillus subtilis was transformed with two plasmids pMB430 and pSX120 using approximately 1 μg of each plasmid per 100 μl of competent PL1801. The transformed cells were plated on LBPG-5 μg / ml erythromycin and incubated overnight at 33 ° C. The next day, colonies were re-streaked on LBPG-5 μg / ml erythromycin + 6 μg / ml chloramphenicol and incubated overnight at 33 ° C. Colonies were grown overnight in liquid culture TY-5 μg / ml erythromycin + 6 μg / ml chloramphenicol at 33 ° C., the plasmid was purified from the culture broth, and the presence of both pMB430 and pSX120 in the PL1801 strain was demonstrated. . This clone was saved and named MB432.
Example 1
Sequence shuffling of two homologous sequences encoding the subtilisin gene of sabinase
A sabinase wild type gene (contained within pSX120) encoding a subtilisin type protease was chosen as a target for shuffling of highly homologous genes. A site-directed variant of the sabinase gene (hereinafter referred to as savidin) contained in pSX222, where a number of silent mutations giving new restriction sites were introduced, was used as a shuffling partner for sabinase. The two genes were cloned on two separate compatible plasmids according to the present invention. A transcriptionally active sabinase gene was cloned on a plasmid based on pUB110 origin (pSX120, FIG. 4) encoding resistance to chloramphenicol. A promoter lacking the sabinase gene was cloned on a derivative of temperature sensitive plasmid pE194 (pMB430) which also encodes resistance to erythromycin. Two transcription terminators were cloned upstream of the savidin gene to prevent any reading.
In pMB430, green fluorescent protein (GFP) is transcriptionally transferred to the savidin gene so that it can visually follow the in-cross and out-cross between the two plasmids. It was fused.
B. subtilis strains MB432, pL1801 transformed with two plasmids pSX120 and pMB430 were taken through a two-cycle temperature shift to induce two consecutive double crossover events between the homologous genes. It was. Homologous recombination and plasmid hybridization were selected on LBPG plates at the limiting temperature (42-50 ° C.) in the presence of erythromycin. Under these restrictive conditions, the temperature sensitive plasmid pMB430 is forced into the stable pSX120 plasmid by homologous recombination within the sabinase / savidin region. The colonies that have undergone recombination also become fluorescent as a result of recombination between the two plasmids and the simultaneous activation of the savidin-GFP operon (FIG. 2). Out cross events were screened by culturing the clones in LB-broth at a permissive temperature of 30 ° C. for 2 days and plating the cells on LBPG plates containing chloramphenicol and erythromycin. It was.
Non-fluorescent colonies were re-streaked on the plates and picked through a second round temperature cycle as described above.
After the second round of shuffling, plasmid preparations were made from 20 different clones. Competent PL1801 was transformed with each of the 20 plasmid preps and plated on LBPG supplemented with erythromycin. These plates were replicated on LBPG containing chloramphenicol and erythromycin to identify unwanted clones in which both pSX120 and pMB430 were transformed. Clones in which only the pMB430 plasmid was transformed were selected for sequencing of the savidin region to identify whether shuffling occurred. From FIG. 6, it is clear that recombination between the two genes, sabinase and savidin occurred. All twelve sequenced clones show some degree of recombination, and four of these can be positively identified as a result of two consecutive double recombination events. It is important to note that the exchange of sabinase and savidin sequences can only be observed if the shuffled fragment overlaps with a unique restriction site for savidin. The four clones with positive evidence for two double recombination are therefore the smallest number. This is because this recombination could have occurred between two adjacent restriction sites.
Sequence listing
(2) Information about SEQ ID NO: 1:
(I) Sequence features:
(A) Length: 5313 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: 1 single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: DNA
(Vi) Origin:
(A) Organism: Plasmid pMB430
(Xi) SEQ ID NO: 1
Claims (28)
(a)各々がDNA配列と複製起点を含む、少なくとも2つのDNA構造物を含む細胞を、i)少なくとも1の複製起点が非機能的であり、そしてii)当該細胞が上記非機能的起点をもつDNA構造物を含む場合に当該細胞の成長を唯一許容する選択圧下にあるという条件下で、インキュベートし、それにより、当該DNA構造物のうちの1から他のDNA構造物のうちの1内への組み込みを支持し、そしてそれによりハイブリッドDNA構造物を形成し;
(b)上記条件から、工程a)におけるよりも、より少ない複製起点が非機能的である条件へ、変え、それにより、上記ハイブリッドDNA構造物からのクロッシング・アウト、及び組換えDNA配列と複製起点を含むDNA構造物の形成を支持し;
(c)少なくとも1回、工程a)〜b)を繰り返す、
を含む前記方法。A method for in vivo recombination of homologous DNA sequences comprising the following steps:
(A) a cell containing at least two DNA constructs, each containing a DNA sequence and an origin of replication ; i) at least one origin of replication is non-functional; and ii) the cell has the non-functional origin Incubating under the condition that it is under a selective pressure that only allows growth of the cell when it contains a DNA structure, thereby allowing one of the DNA structures to be within one of the other DNA structures. Support integration into and thereby form a hybrid DNA construct;
(B) changing from the above conditions to a condition where fewer origins of replication are non-functional than in step a), thereby crossing out from the hybrid DNA construct and replicating with the recombinant DNA sequence Support the formation of DNA structures including the origin;
(C) repeating steps a) to b) at least once,
Including said method.
a)異なる複製起点を含む、少なくとも2つの異なるベクター内に上記相同DNA配列を挿入し;
b)上記ベクターを細胞内に導入し;
c)当該細胞を、i)少なくとも1の複製起点が非機能的であり、そしてii)当該細胞が上記非機能的起点をもつDNA構造物を含む場合に当該細胞の成長を唯一許容する選択圧下にあるという条件下で、インキュベートし、それにより、DNA構造物のうちの1から他のDNA構造物のうちの1内への組み込みを支持し、それによりハイブリッドDNA構造物を形成し;
d)上記条件から、工程c)におけるよりも、より少ない複製起点が非機能的である条件へ、変え、それにより、上記ハイブリッドDNA構造物からのクロッシング・アウト、及び組換えDNA配列と複製起点を含むDNA構造物の形成を支持し;
e)適宜多数回であるが、少なくとも1回、工程c)〜d)を繰り返す、
を含む前記方法。A method for in vivo recombination of homologous DNA sequences comprising the following steps:
a) inserting the homologous DNA sequence into at least two different vectors containing different origins of replication;
b) introducing the vector into the cell;
The c) the cell, i) at least one origin of replication is non-functional, and ii) selective pressure for the cells to only permit the growth of the cell if it contains DNA structure having the non-functional origin under the conditions, incubated as in, thereby supporting the integration into the one of the 1 from the other DNA structures of the DNA structure, thereby forming a hybrid DNA structure;
d) changing from the above conditions to a condition where fewer origins of replication are non-functional than in step c), thereby crossing out from the hybrid DNA construct, and the recombinant DNA sequence and origin of replication. Supporting the formation of DNA structures comprising:
e) Repeat multiple times as appropriate, but at least once, steps c) to d),
Including said method.
i)上記DNAハイブリッド構造物が選択マーカーを発現せず、そして請求項1〜15の中のいずれか1に記載の少なくとも2つのDNA構造物の中の少なくとも1が前記選択マーカーを発現することができる系を構築し;
ii)前記細胞は、前記DNAハイブリッド構造物のクロッシング・アウトが生じた後にのみ上記マーカー遺伝子を発現することができるので、選択可能な条件下で前記細胞をインキュベートし、それにより上記ハイブリッド構造物のクロス・アウトを強制する、
ことにより行われる、請求項15に記載の方法。Forced crossing out from the hybrid structure:
i) the DNA hybrid construct does not express a selectable marker and at least one of the at least two DNA constructs of any one of claims 1-15 expresses the selectable marker; Build a system that can
ii) Since the cells can express the marker gene only after the crossing out of the DNA hybrid structure has occurred, the cells are incubated under selectable conditions, thereby Force a cross-out,
16. The method of claim 15, wherein
a)上記DNA構造物の中の少なくとも1が発現ベクターである、請求項1〜27のいずれか1項に記載の相同DNA配列のインビボ組換えのための方法を行い;
b)工程a)からの多くの異なる組換えられたDNA配列によりコードされた多くの異なる組換え体ポリペプチドを発現させ;そして
c)所望の活性を有する1以上の組換えポリペプチドについての好適なスクリーニング又は選択系において、工程b)からの多くの異なる組換えタンパク質をスクリーンし又は選択する、
を含む所望の生物学的活性を有する1以上の組換えタンパク質を製造する方法。 The following steps :
a) performing the method for in vivo recombination of homologous DNA sequences according to any one of claims 1 to 27 , wherein at least one of said DNA constructs is an expression vector;
b) expressing many different recombinant polypeptides encoded by many different recombinant DNA sequences from step a); and c) preferred for one or more recombinant polypeptides having the desired activity Screen or select many different recombinant proteins from step b) in a simple screening or selection system,
A process for producing one or more recombinant proteins having a desired biological activity .
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