JP4304505B2

JP4304505B2 - 神経突起の伸長及び神経栄養効果の活性を増強するＣｉｓｔａｎｃｈｅｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａＹ．Ｃ．ＭＡ抽出物を含有する組成物

Info

Publication number: JP4304505B2
Application number: JP2004527440A
Authority: JP
Inventors: ソン−ユキム; ジン−ヨンホ; ソン−キョンジョン
Original assignee: キュンヒユニヴァーシティ
Priority date: 2002-08-12
Filing date: 2003-08-12
Publication date: 2009-07-29
Anticipated expiration: 2023-08-12
Also published as: CN1649608A; WO2004014410A1; CN100348218C; US20040219233A1; JP2005538131A; KR100500584B1; KR20040014757A; AU2003251198A1; US20070178174A1

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経成長因子（NGF）に類似の活性（nerve growth factor (NGF) similar activity）を有するCistanche deserticola Y.C. MA

抽出物ならびに退行変性脳疾患（degenerative brain disease）の予防及び処置を有する（having）該抽出物を含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
20世紀において、生命科学及び医学の急速な発展に伴って人間の平均寿命が延長されるにつれ、老人の人口比率の増加を含む新たな社会問題が顕著になっており、特に、神経系の致命的な機能障害である脳卒中、アルツハイマー病（AD）、パーキンソン病（PD）等の老人神経性疾患（geriatric neuronal disease）が増加してきている。
【０００３】
神経系における神経細胞の成長、分化及び死は、正常な発生（general development）、組織特異的機能の確立及び恒常性の維持においてそれぞれ重要な制御プロセスである。
【０００４】
神経細胞の死は、アポトーシス及び壊死の2つのタイプに分類される：神経壊死（neuronal necrosis）は、細胞内のイオン濃度の急激な不均衡、細胞質及びミトコンドリアの膨張ならびに細胞質溶解後の核膜の細胞溶解（cell lysis of nuclear membrane）によって引き起こされ、これは、虚血性貧血（ischemic anemia）、低体温症、脳卒中等の突然の物理的又は化学的損傷による急性の細胞死を意味する（Tomei et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, pp853-857, 1993）。それは、タンパク質合成抑制剤によって影響を受けず、また、神経系において生じるその代表例は、イオン性グルタミン酸受容体の活性化の傷害によって生じる。アポトーシスは、プログラム化された細胞死と呼ばれ、続いて、ミトコンドリアの機能の損失を伴い、膜に囲まれた小さな構造であるアポトーシス小体（apoptotic body）を細胞に形成させる、細胞収縮、細胞膜膨張（membrane blebbing）及び細胞骨格の崩壊等の膜変化、ならびにクロマチン凝縮等の核変化を含む独特の形態変化がおきる（Kerr J. F., J. Pathol., 107(3), pp217-219, 1972: Arends M. J. & Morris R. G., Am. J. Pathol., 136(30), pp593-608,1990）。この形成されたアポトーシス小体は、細胞質の内容物の滲出によって誘発される炎症反応なしに、隣接する細胞又はマクロファージの食作用によって完全に除去される。
【０００５】
細胞増殖、分化及び遊走（migration）等の多細胞生物における全ての挙動（behaviors）は、細胞外に存在する制御因子によって制御されている。また、神経細胞も、中枢神経系（CNS, Central Nervous System）及び末梢神経系（PNS, Peripheral Nervous System）における神経細胞の成長、分化及び生存に影響する標的細胞から放出された全てのタンパク質を含む、このような制御因子を必要とする。そこには、5つの関係因子（involving factor）：NGF（神経成長因子）、BDNF（脳由来神経栄養因子）、NT-3（ニューロトロフィン3）、NT-4及びNT-5が存在し、再生産の起源（the origin of reproduction）、分化及び発現の様子（the expression appearance）ならびに標的部位に関して互いに異なるが、種間でのアミノ酸配列を構成するアレンジメント（arrangement）に類似する。神経栄養因子は、神経系においてアポトーシスを抑制する。神経栄養因子が欠乏しているときに起こるアポトーシスは、新たなタンパク質合成及び細胞死関連遺伝子の殆どに依存する（dependent to）細胞死の1つである。神経栄養因子が、神経系の発達において神経細胞のあらかじめ定められた死を抑制することが、明らかにされている。
【０００６】
それらの機能を有する上記の神経栄養因子（NFs）の1つであるNGFは、1950年代初めにLevi-Montalciniによってヘビ毒又はマウス肉腫から抽出及び単離され、ヒヨコ（chic）の交感神経節ニューロン（sympathetic ganglia neurons）の神経突起の成長が、上記NF抽出物中におけるインキュベーションによって数倍促進されることが報告されている（Levi-Montalcini R., Birth Defects Orig. Artic. Ser. 19(4), pp3-22, 1983）。
【０００７】
上記NGFは、現在まで、神経分化を促進すると報告されてきたが、最近、神経変性死を抑制し、結果として神経細胞数の減少を防止することが新たに見出された。NGFsの受容体は、求心性感覚神経節、脳及び交感神経支配を受ける臓器（synthetic nerve-governing organ）に存在する。NGFsは、in vivoにおいて心臓等の交感神経支配を受ける臓器において生合成され、ニューロンの終末で吸収され、軸索から逆方向に神経細胞へ伝達され、そしてNGFsがタンパク質合成を促進すると報告されている（Mahalik T. J., Investig. Dermatol. Symp. Proc., Aug; 2(1) pp14-18, 1997）。
【０００８】
CNSにおける神経細胞傷害からのNGFの防御機能について、多くの報告が存在する：例えば、フィムブリア−フォルニックス（Fimbria-fornix）のコリン作動性軸索切断（cholinergic axotomy）は、コリン作動性神経細胞を徐々に変性させる、前脳基底のコリン作動性神経細胞からの海馬へのコリナージックアディション（cholinergic addition）を防止し、軸索切断（axotomy）後にそこにNGFが添加されれば、コリン作動性神経細胞の変性は、完全に抑制される。高濃度のBDNFが添加されれば、コリン作動性軸索切断からNGFと同様の効果が得られる（Hefti, F. J., Neurosci., Aug. ;6(8) pp2155-2162, 1986）。NGFと末梢神経間の相関関係に関し、成熟した動物におけるNGFのはたらきは完全には解明されていないが、抗NGF抗体を注射すると、交感神経節の破壊が起き、チロシンヒドロキシラーゼ及びドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ等のノルエピネフリン合成酵素の活性も低下することが報告されている（Levi-Montalcinin et al. ; Bull. Soc. Sci. Med. Grand Duche Luxemb, 115(2), pp69-74, 1978）。
【０００９】
NGFを細胞外に注射すれば、生存したNGF感受性細胞数及び対応する臓器に対するニューロン支配の程度が増加し、成長変化が減弱するという報告に基づいて、NGFは、神経細胞傷害後のニューロン再生プロセスにおいて重要な役割を果たしている可能性がある（Zettler C. et. al., Brain Res., 538(2), pp251-262, 1991）。これらの結果は、臓器におけるNGFの支配の程度は、交感神経ニューロンの支配と密接に相互に関係していることを示す。
【００１０】
神経系での正常な発達過程において発達しているニューロンの約50%は、アポトーシス及び標的細胞から分泌されたNFによって除去され、神経細胞の生存を決定づけると報告されている（Barres B.A et al: Development, 118(1), pp283-95, 1993）。
【００１１】
NGFs等のNFsは、正常状態において神経細胞が生存、成長及び分化をするために必須である。しかし、それらのNGFsは、高分子量であるためにBBB（血液脳関門）を通過することができなかった。従って、それらは、退行変性脳疾患の処置に満足な治療効果を示すことができなかった。NGF合成がさらに誘導されるべきであり、現在、NGFに類似のはたらきをする代替品の開発が、早急に必要とされている。
【００１２】
Cistanche deserticola Y.C. MAは、Orobanchaceae（ハマウツボ科）に属し、アルカリ性の土地、乾川（dried river）及び砂地の地域に分布する。それは、滋養強壮剤（restorative）として漢方薬の材料として使用され、様々な酵素、ファティリピッド(fatty lipid)、トレースアルカロイド（trace alkaloid）及び結晶性中性物質（crystalline neutral substance）を含有すると報告されている（Chung B.S. 及びShin M.K.; HyangyakDaesacheon, Youngrimsa., pp888-889, 1998）。
【００１３】
シスタノシド（cistanoside）、シスタノシドF（cistanoside）、ツブロシド（tubuloside）A、ツブロシドB、2’-アセチルアセトシド（2’-acetylacetoside）、エチナコシド(echinacoside)、3’-α-ラムノピラノシド(3’-alpha-rhamnopyranoside)、イソアセテオシド(isoaceteoside)、アセトシド(acetoside)、シリンガリド(syringalide)A 成分がCistanche deserticola Y.C. MAから単離されたという、いくつかの報告がある（Wang YM, et al.; Yao Xue Bao, 35(11), pp839-842, 2000）。
【００１４】
しかし、Cistanche deserticola Y.C. MAの脳疾患に対する治療効果については、その開示内容が本明細書の参考として援用される、上記のいずれの引用文献にも報告又は開示されていない。
【００１５】
様々な生化学的試験を通じたCistanche deserticola Y.C. MAの神経成長及び分化への効果を調べるため、ならびに粗抽出物、非極性溶媒可溶性抽出物が、退行変性脳疾患の主な原因である神経細胞アポトーシスの抑制及びNGF誘導の促進において重要な役割を果たすかどうかを確認するため、本発明者らは、細胞株の培養を通した微細観察（micro-observation）と共に様々な分子生物学的試験を集中的に行い、ついに、粗抽出物及び非極性溶媒可溶性抽出物が神経細胞アポトーシスを抑制し、NGFsの産生を促進し、そして神経細胞保護活性を示すことを確認することによって本発明を完成した。
【００１６】
本発明のこれら及び他の目的は、以下に示される本発明の詳細な説明から明らかにされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、神経細胞の保護による退行変性脳疾患の治療及び予防のための有効量のCistanche deserticola Y.C. MAの粗抽出物を、有効成分として含有する薬学的組成物を提供する。
【００１８】
また、本発明は、哺乳類又はヒトにおける神経細胞の保護による退行変性脳疾患の治療及び予防用薬学的組成物の調製のための上記抽出物の使用を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、神経細胞保護による退行変性脳疾患の予防又は緩和のための上記抽出物を含有する健康食品又は食品添加物を提供する。
【００２０】
従って、神経細胞の保護による退行変性脳疾患の処置及び予防のための、Cistanche deserticola Y.C. MAの粗抽出物、極性溶媒可溶性又は非極性溶媒可溶性抽出物を有効成分として含有する薬学的組成物を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記の粗抽出物は、植物材料を水、メタノール、エタノール等の低級アルコール、好ましくはメタノール等、又はそれらの混合溶液で抽出することによって調製された抽出物を含む。
【００２２】
上記極性溶媒可溶性抽出物は、上記粗抽出物を、例えば、水、メタノール、エタノール等の低級アルコール、好ましくはブタノール等、又はそれらの混合溶液で抽出することによって調製され得る。
【００２３】
上記非極性溶媒可溶性抽出物は、上記粗抽出物を、非極性溶媒、例えば、ヘキサン、酢酸エチル又はジクロロメタン、好ましくは酢酸エチルで抽出することによって調製され得る。
【００２４】
ヒト又は哺乳類における、神経細胞の保護による退行変性脳疾患の処置及び予防のための治療剤の調製用のCistanche deserticola Y.C. MAの粗抽出物、極性溶媒可溶性又は非極性溶媒可溶性抽出物の使用を提供することが、本発明の目的である。
【００２５】
その薬学的に許容される担体と共にCistanche deserticola Y.C. MAの粗抽出物、極性溶媒可溶性又は非極性溶媒可溶性抽出物の有効量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類における神経細胞の保護による退行変性脳疾患の処置又は予防方法を提供することが、本発明の目的である。
【００２６】
神経細胞の保護による退行変性脳疾患の予防及び改善のため、食品学的に許容される添加物と共に、上記抽出物を含有する健康食品又は食品添加物を提供することが、本発明の他の目的である。
【００２７】
上記退行変性脳疾患は、脳卒中、アルツハイマー病（AD）、パーキンソン病（PD）、老年痴呆等を含む。
【００２８】
上記粗抽出物は、Cistanche desericola, C. salsa又はC. ambigua等のCistanche属の植物のいずれかから抽出され得る。
【００２９】
本発明の薬学的組成物は、該組成物の総重量に対し、上記抽出物を約0.01〜50重量%含有し得る。
【００３０】
本発明の健康食品は、該組成物の総重量に対し、上記組成物を0.01〜80重量%、好ましくは1〜50重量%として含有し得る。
【００３１】
上記健康食品は、健康食品、健康飲料等に含有され得、また、粉末、顆粒、タブレット、チューイングタブレット、カプセル、飲料等として使用され得る。
【００３２】
Cistanche deserticola Y.C. MAから単離された本発明の抽出物（inventive extract）は、以下の好ましい実施態様に従って調製され得る。
【００３３】
以下、本発明を詳細に記載する。
【００３４】
Cistanche deserticola Y.C. MAの本発明の抽出物は、詳しくは以下の手段によって調製され得る。
【００３５】
Cistanche deserticola Y.C. MAの本発明の粗抽出物は、以下のように抽出され得る；Cistanche deserticola Y.C. MAを乾燥し、切断し、破砕し、そして5〜25倍容量、好ましくはおよそ10倍容量の蒸留水、メタノール、エタノール、ブタノール等の低級アルコール等、又はそれらの混合溶液、好ましくはメタノールと混合する；該溶液を、20〜100℃、好ましくは60〜100℃の温度範囲の温水で、1〜24時間の間、温水、冷水での抽出、還流抽出又は超音波抽出による抽出方法で1〜5回、好ましくは2〜3回連続での抽出方法で処理する；20〜100℃、好ましくは50〜70℃の温度範囲にてロータリーエバポレーターで濃縮する上清を得るため、その残渣を濾過し、その後、水、低級アルコール又はそれらの混合溶液に可溶性のCistanche deserticola Y.C. MAの乾燥粗抽出物粉末を得るため、真空凍結乾燥、熱風乾燥又はスプレードライによって乾燥する。
【００３６】
加えて、本発明の極性溶媒可溶性及び非極性溶媒可溶性抽出物は、以下の手順によって調製され得る；上記のステップによって調製された粗抽出物を、水に懸濁し、その後、1〜100倍、好ましくは1〜5倍容量の酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサン等の非極性溶媒と混合する；この非極性溶媒可溶性層を、本発明の非極性溶媒可溶性抽出物を得るために採取し、残りの極性溶媒可溶性層を、水、低級アルコール、又はそれらの混合溶液に可溶性の本発明の極性溶媒可溶性抽出物を得るために採取する。また、上記の手順を修飾することができ、又は、当該技術分野において周知の慣習的な手順、例えば文献（Harbone J. B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis. 3^rd Ed. pp6-7, 1998）に開示される手順によって、より強力な画分又は化合物を分画又は単離するためのさらなるステップにかけることができる。
【００３７】
細胞株の培養を通した微細観察と共に、様々な生化学的試験を通したCistanche deserticola Y.C. MAの神経成長及び分化に対する効果を調べるため、ならびに該粗抽出物及び非極性溶媒可溶性抽出物が、退行変性脳疾患の主な原因である神経細胞のアポトーシスの抑制において、また、NGF誘導の促進において重要な役割を果たすかどうかを確認するため、該粗抽出物、極性溶媒可溶性及び非極性溶媒可溶性抽出物が、神経細胞のアポトーシスを抑制し、NFsの産生を促進し、そして神経細胞保護活性を示すことが確認された。
【００３８】
本発明の他の側面によれば、神経細胞の保護により退行変性脳疾患の治療及び予防のための上記の調製方法によって調製されたCistanche deserticola Y.C. MAの粗抽出物、極性溶媒可溶性又は非極性溶媒可溶性抽出物を、有効成分として含有する薬学的組成物が提供される。
【００３９】
上記調製方法によって調製された前記抽出物を含有する薬学的組成物を、ヒトを含む哺乳類の退行変性脳への投与を含む治療方法及び予防方法を提供することは、本発明の他のものである。
【００４０】
神経細胞の保護による退行変性脳疾患の治療及び予防のための本発明の組成物は、該組成物の総重量に対して、0.01〜50重量%として上記抽出物を含有し得る。
【００４１】
本発明の組成物は、加えて、当該技術分野における周知の使用方法に従って、従来の担体、アジュバント又は希釈剤を含有することができる。前期担体は、使用及び適用方法によって適当な物質として使用されることが好ましいが、それに限定されない。適当な希釈剤は、Remingyton’s Pharmaceutical Science （Mack Publishing co, Easton PA）の教科書に列挙されている。
【００４２】
以下、下記の処方方法及び賦形剤は、単に例示であり、本発明を限定するものではない。
【００４３】
本発明に従う組成物は、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、スターチ、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイル等の薬学的に許容される担体、アジュバント又は希釈剤を含有する薬学的組成物として提供され得る。この処方は、加えて、充填剤、抗凝集剤、滑沢剤、湿潤剤、矯味矯臭剤、乳化剤、保存剤等を含むことができる。本発明の組成物は、当該技術分野において周知のあらゆる手段の利用によって患者に投与された後、有効成分の迅速、持続型又は遅延型の放出を提供するように処方され得る。
【００４４】
例えば、本発明の組成物は、注射剤の製造に通常使用される油、プロピレングリコール又は他の溶媒に溶解され得る。担体の好適な例は、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物油、ミリスチン酸イソプロピル等を含むが、それらに限定されない。局所投与には、本発明の抽出物は、軟膏及びクリームの形態で処方され得る。
【００４５】
本発明の組成物を含有する薬学的処方は、経口投薬形態（散剤、錠剤、カプセル、軟カプセル、水性薬剤、シロップ、エリキシルピル、粉末、サシェ（sachet）、顆粒剤）又は局所製剤（クリーム、軟膏、ローション、ゲル、バーム（balm）、パッチ、ペースト、スプレー溶液、エアゾール等）、或いは注射剤用処方（溶液、懸濁液、エマルション）等のあらゆる形態に調製され得る。
【００４６】
薬学的投薬形態における本発明の組成物は、それらの薬学的に許容される塩の形態で使用され得、また、単独又は適当に関連して、並びに他の薬学的に活性な化合物と組み合わせて使用され得る。
【００４７】
本発明の抽出物又は組成物の望ましい用量は、被験者の状態及び体重、重篤度、薬物の形態、投与の経路及び期間によって異なり、当業者によって選択され得る。しかし、望ましい効果を得るため、一般的に、一日、体重あたり10g/kg、好ましくは1〜3g/kgの範囲量の本発明の抽出物又は本発明のコンパウンド(compound)を投与することが推奨される。この用量を、1日1回又は数回に分けて投与することができる。組成物に関しては、本発明の抽出物の量は、該組成物の総重量に対して0.01〜50重量%、好ましくは0.5〜40重量％存在し得る。
【００４８】
本発明の薬学的組成物は、哺乳類（ラット、マウス、家畜又はヒト）等の被験動物に様々な経路で投与することができる。全ての投与方法を考慮すると、例えば、投与は、経口、経直腸的又は経静脈、筋肉内、皮下、皮内、髄腔内（intrathecal）、硬膜外（epidural）又は脳室内注射で行うことができることを意図する。
【００４９】
また、本発明は、上記の抽出物を0.01〜80重量％、アミノ酸0.001〜5重量％、ビタミン0.001〜2重量%、糖分0.001〜20重量%、有機酸0.001~10重量%及び適当な量の甘味料及び香料を加える、神経細胞の保護による退行変性脳疾患の予防及び改善のための健康飲食品の組成物を提供する。
【００５０】
上記Cistanche deserticola Y.C. MAの抽出物を、神経細胞の保護による退行変性脳疾患の予防及び改善のための食品及び飲料に加えることができる。
【００５１】
健康食品の開発のため、上記の本発明の抽出物を添加できる食品（addable food）の例は、様々な食品、飲料、ガム、ビタミン複合体（vitamin complex）、健康増進食品等があり、また、粉末、顆粒、タブレット、チューイングタブレット、カプセル又は飲料等として使用され得る。
【００５２】
また、本発明の抽出物は、調製粉乳、成長期用調製粉乳、成長期用調製食品等の小児用及び新生児用食品に含有させることで、アレルギー性疾患及び非アレルギー性炎症性疾患を予防及び改善することができるであろう。
【００５３】
そこに含まれる（therein）上記の組成物を、食品、添加物又は飲料に加えることができ、ここで、食品又は飲料中の上記抽出物の量は、一般的に、健康食品組成物の食品の総重量に対して0.1〜80w/w%、好ましくは1~50w/w%の範囲であり、100mlの健康飲料組成物に対して1~30g、好ましくは3~10gの比率である。
【００５４】
前記の比率において必須の成分として、本発明の健康飲料組成物に上記の抽出物を含んでいれば、他の液体成分に対して特定の限定はなく、ここで、他の成分は、従来の飲料等の、様々なデオドラント（deodorant）又は天然炭水化物であってもよい。前記の天然炭水化物の例としては、グルコース、フルクトース等のモノサッカリド；マルトース、スクロース等のジサッカリド；デキストリン、シクロデキストリン等の従来の糖；ならびにキシリトール及びエリスリトール等の糖アルコール等である。上記以外のデオドラントとしては、タウマチン（taumatin）、レバウジオシドA（levaudioside A）、グリチルリチン（grycyrrhizin）等のステビア抽出物等の天然デオドラント、ならびにサッカリン、アスパルテーム（aspartam）等の合成デオドラントが好ましく使用される。上記の天然炭水化物の量は、一般的に、本発明の飲料組成物100mlに対し、1~20g、好ましくは5〜12gの比率範囲である。
【００５５】
上記組成物以外の成分は、様々な栄養素、ビタミン、ミネラル又は電解質、合成着香料、着色料ならびにチーズチョコレート等の場合における改良剤（improving agent）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護コロイド粘着剤、pH調整剤、安定化剤、保存剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤（cabonizing agent）等である。上記以外の成分としては、天然果汁、果汁飲料及び野菜飲料の調製のための果汁があげられ、ここで、該成分を、単独又は組み合わせて使用することができる。該組成物の比率は特に重要ではないが、一般的に、本発明の組成物100w/w%に対して約0〜20w/w%の範囲である。上記の抽出物をそこに添加できる食品（addable food）の例としては、様々な食品、飲料、ガム、ビタミン複合体、健康増進食品等である。
【００５６】
本発明の組成物は、加えて、クエン酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸、リンゴ酸等の有機酸；ホスフェート、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、アシッドピロホスフェート（acid pyrophosphate）、ポリホスフェート等のホスフェート；ポリフェノール、カテキン、α-トコフェロール、ローズマリー抽出物、ビタミンC、緑茶抽出物、リコリスルート抽出物、キトサン、タンニン酸、フィチン酸等の天然抗酸化物質を1種または2種以上を含むことができる。
【００５７】
上記Cistanche deserticola Y.C. MA抽出物は、20〜90%の高濃縮液、粉末又は顆粒タイプであってもよい。
【００５８】
同様に、上記Cistanche deserticola Y.C. MA抽出物は、加えて、ラクトース、カゼイン、デキストロース、グルコース、スクロース及びソルビトールを1種または2種以上含んでもよい。
【発明の効果】
【００５９】
本発明の抽出物は、毒性及び副作用がないため、安全に使用され得る。
【００６０】
本発明の精神及び範囲から離れることなく、本発明の組成物、使用及び調製において様々な改良及び変化を加えることができることが、当業者に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本発明の精神及び範囲から離れることなく、本発明の組成物、使用及び処方において様々な改良及び変化を加えることができることが、当業者に明らかになるであろう。
【００６２】
本発明は、以下の実施例によってさらに具体的に説明される。しかし、いかなる方法によっても、本発明はこれらの実施例に限定されないことが理解されるべきである。
【００６３】
以下の参照例、実施例及び実験例は、本発明の範囲を限定することなく、本発明をさらに説明するものである。
【実施例１】
【００６４】
［Cistanche deserticola の粗抽出物の調製］
ソウルの京東市場（Kyung -dong market）で購入した乾燥Cistanche deserticola 1kgを切り刻み、1.5 Lの85 %メタノール（水：メタノール＝15：85）と混合し、該混合物を1日間室温にて放置した。
【００６５】
そして、該混合物を1時間の超音波抽出（Branson Co. アメリカ合衆国）に2度かけ、残渣を除去するため、この抽出物を濾紙で濾過した。
【００６６】
この濾液をプールし、減圧下にて55〜65℃でロータリーエバポレーター（N-1000，Eyela Co. 日本）によって濃縮し、凍結乾燥機（Speed Spec 3000, Bio-Rad Co. アメリカ合衆国）で乾燥して455 gの乾燥粗抽出物を得た。この乾燥粉末を蒸留水（100mg/ml）に溶解させた。
【実施例２】
【００６７】
この濾液をプールし、減圧下にて55〜65℃でロータリーエバポレーター（N-1000，Eyela Co. 日本）によって濃縮し、凍結乾燥機（Speed Spec 3000, Bio-Rad Co. アメリカ合衆国）で乾燥して455 gの乾燥粗抽出物を得た。この乾燥粉末を蒸留水（100mg/ml）に溶解させた。

【実施例２】
【００６８】
［2-1．酢酸エチル可溶性画分の調製］
実施例1で得られた粗抽出物455 gに300 mlの蒸留水を加えた。そこに3000 mlのクロロホルムを分液漏斗中に加え、酢酸エチル可溶性の層と水溶性の層に分けるため、激しく振とう（shaken vigorously）した。
【００６９】
上記の水溶性の層を、等量の酢酸エチルと混合し、その後、酢酸エチル可溶性の層と、水溶性の層に分けた。この分画工程を4-5回行った。
【００７０】
上記の酢酸エチル可溶性の層を、ロータリーエバポレーターによって濃縮し、8.2 gの酢酸エチル可溶性抽出物を得るため、凍結乾燥機で乾燥した。
【００７１】
［2-2．ブタノール／水可溶性画分の調製］
水溶性の層を、ブタノールと混合することによって分画し、最後に、以下の試験において試料として使用するための11.83gのブタノール可溶性抽出物及び26 gの水溶性抽出物を得た。
【参照例１】
【００７２】
［試料の調製］
実施例1及び2で調製された粗抽出物及び酢酸エチル可溶性抽出物を、それぞれ、1.0 mg/mlの濃度でPBS（pH 7.2）に懸濁し、各懸濁液を、バクテリアの除去のために0.2 μmメンブランフィルター（Milipore Co., Ltd.）で濾過した。試料が完全に溶解していない場合、最終濃度＞0.1%としてDMSO（Sigma Co., Ltd）中に懸濁し、上記の方法の通り滅菌するために濾過した。
【参照例２】
【００７３】
［細胞培養］
3×10⁴のPC12細胞を、直径100 mmの培養ディッシュ（TPP Co., Ltd., スイス）上にて、2.0 g/liter炭酸水素ナトリウム（NaHCO₃）、5%ウマ血清、使用前に55℃にて30分間不活性化された10 %ウシ胎児血清及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン抗生物質（1000 U/ml）を添加したDMEM（Gibco BRL Co., Ltd., アメリカ合衆国）中で、加湿インキュベーター内で37℃、5% CO₂及び95%空気条件で成長させた。
【００７４】
使用された培地は、週に4回、10 mlの新しいDMEMと交換され、細胞を週に3-4回継代培養した。
【参照例３】
【００７５】
［試料を用いた処理］
10mm培養ディッシュ上の細胞（1×10⁷細胞／ウェル）を、ディッシュから分離するために500 μlのトリプシン−EDTA（Gibco BRL Co., Ltd., アメリカ合衆国）で処理し、トリプシン−EDTA溶液を中和するように、そこに10 mlの新しい培地を加え、細胞懸濁液を得た。
【００７６】
細胞計測のため、リン酸緩衝生理食塩水に希釈された0.4%トリパンブルー（trypan blue）を、20 μlの該細胞懸濁液に添加し、細胞計測器によって生きている細胞の数を計測した。
【００７７】
細胞接着酵素、PBS緩衝液に希釈された50 μg/mlのポリ-D-リシン（Sigma Chemical Co., セントルイス, ミズーリ州，アメリカ合衆国）を、6ウェル細胞培養プレートに2 mlずつ等分し、37℃にて1時間インキュベーションを行い、そしてPBS（pH 7.2）で洗浄した。6ウェルプレートを乾燥させ、以下の試験で使用した。
【００７８】
上記の手段によって調製された細胞（1×10⁵細胞／ウェル）を、6ウェルプレートに播種し、24時間インキュベーションを行った。細胞を、実施例1のCistanche deserticola粗抽出物（10 μg/ml）又はNGF（50 ng/ml）で処理し、加湿インキュベーター内で37℃、5% CO₂及び95%空気条件にて6日間、2日毎に培地を交換してインキュベーションを行った。
【実験例１】
【００７９】
［Cistanche deserticola抽出物の生理学的活性］
Cistanche deserticola抽出物の生理学的活性を評価するため、実施例1及び実施例2の本発明の抽出物10 μg/mlを、PC12細胞（Korea Cell line Bank, the Cancer Research Institute of the Seoul National University College of Medicine）に処理した。
【００８０】
NGFの最も有効な濃度を決定するため、様々な濃度のNGFを細胞に処理し、それによって選ばれたNGFを、神経突起の伸長を確認するためのコントロールとして使用した。
【００８１】
2日後、それは、神経突起を形成し始め、6日目には、ニューロフィラメントに分化するための神経突起の伸長が起きた。そして、実施例2で調製された酢酸エチル可溶性抽出物は、神経突起の成長に対して最も高い効果を示した（図1a、図1b、図1c、図1d及び図2）。
【実験例２】
【００８２】
［神経突起の伸長に対するCistanche deserticola画分の効果］
各抽出物10 μg/mlを、PC12細胞に24時間処理した。24時間のインキュベーションの後、この培地を50 ng/mlのNGF、1% FBS及び2% HSを含む新しい培地と交換し、神経細胞体の神経突起を観察し、位相差顕微鏡（model CK-25, Olympus Co., アメリカ合衆国）を用いて毎日、一定間隔で撮影した。神経突起の長さを、写真（photography）上で計測した。
【００８３】
神経突起の伸長は、神経突起が見られない場合は0、神経突起の長さと細胞体の直径が等しい場合は1、神経突起の長さが細胞体の直径の2倍長い場合は2、そして神経突起の長さが3倍より長い場合は3として評価した（図1a、図1b、図1c、図1d及び図2）。コントロール群において、50 ng/mlのNGFを、同様に処理した。全てのデータは、平均値±S.D.として表される。統計的有意性の評価を、スチューデントt検定によって決定した（**p<0.01，図2及び表2）。
【００８４】
本発明のCistanche deserticola抽出物は、神経突起の伸長に対し、優れた効果を示した（*p<0.01）。
【００８５】
【表１】

【実験例３】
【００８６】
［Cistanche deserticola抽出物のLDH放出アッセイ］
それらによるアポトーシスの程度を計測するために、本発明の抽出物のLDH（乳酸デヒドロゲナーゼ）阻害効果を調べた。
【００８７】
NGFの無い状態において培地中に放出されるLDHを測定するため、PC12細胞を、実施例2の酢酸エチル可溶性抽出物で処理した。
【００８８】
実験群として、同様に、PC12細胞を実施例2の酢酸エチル可溶性抽出物10 μg/mlで6日間処理し、さらに24時間、新しい培地で培養し、そして30 μlの培養培地を96ウェルプレートに移した。
【００８９】
LDH放出アッセイ（Kim et al., J. Neurosci. Res., 53, pp426-432, 1998）を行うため、96ウェルプレート中の培地及び30 μlの1 mg/ml NADH（0.75 mMのピルビン酸ナトリウムに溶解）を37℃にて30分間インキュベーションを行い、続いて、染色試薬及びこの混合物を、37℃にて20分間さらにインキュベーションを行った。0.4 Nの水酸化ナトリウムを反応混合物に加えることで反応をクエンチした（quencing）後、上記溶液のUV吸光度を405 nmにて測定した。
【００９０】
図5に示されるように、酢酸エチル可溶性抽出物−回収（withdrawn）群のLDHレベルは、アポトーシスのために減少した。
【実験例４】
【００９１】
［MTTアッセイ］
Cistanche deserticola抽出物のアポトーシス効果（apoptotic effect）を調べるため、（3-［4, 5-ジメチルチアゾール-2-イル］-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（MTT）アッセイ法によって測定した。
【００９２】
PC12細胞（2×10⁴細胞／ウェル）を、NGFの無い条件下にて96ウェルプレートに播種し、24時間のインキュベーションの後、細胞を10 μg/mlのCistanche deserticolaの酢酸エチル可溶性抽出物で、さらに48時間処理した。2日後、培地を廃棄し、150μlのMTT溶液（0.05 mg/ml 培地に懸濁，Sigma Co.）をこの細胞に加え、37℃にて反応させた。4時間後、MTTを除去し、結晶を溶解するために150μlのDMSOを各ウェルに滴下した。570 nmにて、マイクロプレートリーダー（ELISA reader, Molecular devices Co., アメリカ合衆国）によってUV吸光度を測定して細胞生存率を計算した。
【００９３】
図5に示されるように、結果は、Cistanche deserticola抽出物処理群において、細胞生存率は減少し、アポトーシスは、顕著に増加したことを示した。
【実験例５】
【００９４】
［Cistanche deserticola抽出物のアポトーシスアッセイ］
本発明の酢酸エチル可溶性抽出物が除去された場合、アポトーシスが起きるかどうかを試験するため、DNAフラグメンテーションアッセイ（DNA fragmentation assay）を行った。
【００９５】
PC12細胞（2.5-5×10⁶細胞／ウェル）を、直径100 mmの培養ディッシュ上でDMEM中にて24時間成長させ、培地を吸引し、細胞をPBSで洗浄した。試料を含む新しい培地をそこに加え、加湿インキュベーター内で37℃、5% CO₂及び95%空気条件にて6日間、インキュベーションを行った。培地を、2日毎に本発明の抽出物を含む新しいDMEM培地と交換した。
【００９６】
細胞を、0.25%トリプシン−EDTAを添加することによって回収し、その上清を除去するために1000 rpmの速度にて5分間遠心分離した。細胞沈殿物を、1.5 mlのエッペンドルフチューブを用いて、溶解緩衝液（5 mol/リットル Tris-HCl (pH 7.4), 5 mmol/リットル EDTA, 0.5 % Triton X-100）に再懸濁し、15分後、この混合溶液を12,00rpmにて20分間遠心分離した。結果として生じた上清を、新しいチューブに移し、1.0 μlのRNaseと混合し、37℃にて1時間インキュベーションを行った。インキュベーションの後、1 μlのプロテイナーゼ及びSDS（最終濃度1%）をそこに加え、この反応混合物を50℃にてさらに2時間インキュベーションを行った。この混合物を、フェノール−クロロホルム抽出にかけた。上記の混合物と等量のフェノール−クロロホルム溶媒混合液を、このチューブに入れ、15秒間ボルテックスを行い、12,000 rpmにて10分間遠心分離を行った。新しいチューブに入った上清を、1/10容量の3 M酢酸ナトリウム及び2容量の無水エタノールと混合し、室温で30分間インキュベーションし、続いて速度12,000 rpm、温度4℃にて10分間遠心分離を行った。その時、上清を廃棄し、20 μlのTAE緩衝液に懸濁するために、ペレットを完全に乾燥させた。
【００９７】
上記の精製されたDNA断片を調べるため、アガロース（Gibco BRL Co., アメリカ合衆国）ゲル及び1×TAE緩衝液を用いて、電気泳動を行った。
【００９８】
染色溶液と混合された10 μlの精製されたDNAを等分し、アガロースゲルにロード（loaded）し、100ボルトで40分間電気泳動にかけた。DNAの断片化を、Gel-DOC（Model Gel DOC 2000, Bio-Rad, アメリカ合衆国）を用いて計測した。
【００９９】
図6aの結果において、レーン1は50 ng/μl NGF処理群、レーン2は10 μg/ml Cistanche deserticolaの粗抽出物処理群、レーン3は10 μg/ml Cistanche deserticolaの酢酸エチル可溶性抽出物処理群及びレーン4はFBS欠乏（deprivation）群である。本発明の粗抽出物及び酢酸エチル可溶性抽出物で処理され、除去された細胞において、細胞アポトーシスが起こったことを意味するDNAの断片化を検出した。
【０１００】
図6aの結果において、レーン1は50 ng/ml NGF処理群、レーン2は10 μg/ml Cistanche deserticolaの粗抽出物処理群、レーン3は10 μg/ml Cistanche deserticolaの酢酸エチル可溶性抽出物処理群及びレーン4はFBS欠乏（deprivation）群である。本発明の粗抽出物及び酢酸エチル可溶性抽出物で処理され、除去された細胞において、細胞アポトーシスが起こったことを意味するDNAの断片化を検出した。
【０１０１】
図6bは、アポトーシスを生じる血清の除去（serum deprivation）後に本発明の抽出物で処理された細胞から単離された、断片化したDNAsを示す。レーン1は50 ng/ml NGF処理群、レーン2は10 μg/ml粗抽出物処理群、レーン3は10 μg/ml酢酸エチル可溶性抽出物処理群及びレーン4はFBS処理群である。該粗抽出物及び酢酸エチル可溶性抽出物を細胞に処理した場合、DNAの断片化は起こらなかった。
【０１０２】
［蛍光を用いた細胞のアポトーシスに対するCistanche deserticolaの効果］
Cistanche deserticolaの細胞のアポトーシスに対する効果を測定するため、この試験においてFACS解析を行った。
【０１０３】
PC12細胞を24時間の間、完全培地にて成長させた。24時間後、培地は、2%ウマ血清を含む血清欠乏培地（serum-depriving medium）と交換され、そして1%FBSおよびNFG又は実施例2-1で調製された酢酸エチル可溶性抽出物を、そこに加えた。さらに24時間のインキュベーションにかけた。細胞懸濁液を、200×gで5分間、遠心分離を行い、この上清を廃棄した。細胞ペレットを、10 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM 塩化ナトリウム、5 mM塩化カリウム、1 mM塩化マグネシウム及び1.8 mM塩化カルシウムを含む緩衝液に溶解させた100 μlのアネキシンV-FITC溶液に懸濁し、室温にて5分間、暗所でインキュベーションを行った。その際、FACSマイクロチューブ中に100 μlのHEPES緩衝液を滴下し、そこに20 μlのプロピジウムアイオダイド（PI、HEPES緩衝溶液中に100 μg/ml）を加えた。
【０１０４】
蛍光染料の1種であるPIは、アポトーシスが起きた場合、細胞のDNAに結合し、それぞれの細胞について結合したDNA量が測定され得る。
【０１０５】
最終的に、FACS解析は、アポトーシス誘導の程度を定量するために行われた。
【０１０６】
多くの生きた細胞があれば、生きた細胞を表すドットが、グラフの左下に位置づけられる。アポトーシス細胞を表すドットは、グラフの右下に位置づけられ、そして、壊死細胞を表すドットは、グラフの右上に位置づけられる。アポトーシスが起きた場合、ドットは、結果のグラフの左下に移動する。
【０１０７】
酢酸エチル可溶性抽出物が培地から除かれた場合、時間が経つにつれて、細胞を表すドットは、グラフの右下に移動し、これはアポトーシスが起きていることを意味する。
【０１０８】
酢酸エチル可溶性抽出物又はＮＧＦが除去された4時間後、細胞はプログラム化された細胞死を始め、12時間後、アポトーシスの状態にある細胞の数は最大となる（図7a、図7b、図7c及び図7d）。
【実験例７】
【０１０９】
［NGFの遺伝子発現］
［7-1. RT-PCR法を用いた遺伝子発現アッセイ］
細胞のトータルRNAを、Trizol B試薬（Gibco BRL Co.）によって抽出した。1 mlのTrizol Bを加えることによって溶解された細胞を、セルスクレーパー（cell scraper）によって回収した。細胞懸濁液を、1.5 mlのマイクロチューブに移し、21Gの針のついたシリンジを用いて細胞をバラバラにする（disrupt）ため、数回、ピペッティングを行った。細胞溶解液を、12,000 rpmにて4℃で10分間、遠心分離した。この上清を、クロロホルムと混合し、そして、この混合溶液を激しく振とうし（shaked vigorously）、続けて室温にて15分間インキュベーションを行った。この混合溶液を、再び12,000 rpmにて4℃で15分間、遠心分離した。RNAを含む上清を、新しいマイクロチューブに移し、繰り返しさかさまにすること（repeated inversion）によって100%イソプロパノールと混合した。この試料を、室温にてインキュベーションさせ、12,000 rpmにて4℃で15分間、遠心分離した。上清を除去することによって得られたRNAペレットを、1.0 mlの75%エタノールで洗浄し、12,000 rpmにて4℃で5分間、遠心分離した。室温にてペレットを完全に乾燥させた後、ペレットを、DEPC（ジエチルピロカルボネート）処理した水に再懸濁し、分光光度計（Bio-Rad, アメリカ合衆国）を用いて、260 nm及び240 nm にてUV吸光度を測定した。
【０１１０】
相補DNA（cDNA）を、逆転写酵素によって合成し、そしてTaqポリメラーゼ（Takara Co., 日本）によるポリメラーゼ連鎖反応を行った。
【０１１１】
上記で調製したRNA 1 μgを、RNA鎖を分離するため、65℃にて15分間熱処理を行った。反応試薬（4 μlの5×反応緩衝液、1 μlの10 mM dNTP混合液、1 μlの20 μM オリゴ (dT)₁₅ プライマー、0.2 μlのM-MLV逆転写酵素（200 U/μl）、2 μlの0.1 Mジチオスレイトール、DEPC処理水で20 μlに調製）を、RNA試料に加え、37℃にて60分間インキュベーションを行い、その後、相補DNAを合成するために72℃にて１５分間、再びインキュベーションを行った。
【０１１２】
ポリメラーゼ連鎖反応のため、上記で調製されたcDNA 1 μlを、反応溶液（2 μlの10×反応緩衝液、2 μlの2.5 mM dNTP混合物、0.2 μlのTaqポリメラーゼ（5 U/μl）、1 μlの10 μMセンスプライマー、1 μlの10 μMアンチセンスプライマー、DEPC処理水で25 μlに調製）と混合し、表3に示される以下の条件の通り、サーモサイクラー（Perkin Elmer Co.）を用いて30サイクルのPCRを行った。
【０１１３】
【表２】

【０１１４】
10 μlのRT-PCR産物を1.5%アガロース（Gibco BRL Co., アメリカ合衆国）ゲル上にロードし（loaded）、その電気泳動解析を1×TAE緩衝液中で、100ボルトにて30分間行った。アガロースゲルを、エチジウムブロマイド溶液中で20分間染色し、蒸留水中で10分間、脱染色（destain）を行った。ゲルのDNAバンドは、UV光ボックス上にて観察され、その後、Gel-DOC（Bio-Rad Co.）を用いて写真を撮影した（図8a）。これは、電気泳動の評価された結果（evaluated result）を表す（図8b）。
【０１１５】
250 bpのGAPDHを、各群、すなわち、未処理群、50 ng/ml NGF処理群、10 μg/ml 粗抽出物処理群及び10 μg/ml酢酸エチル可溶性抽出物処理群のNGF遺伝子発現を比較するためのスタンダードとして使用した。
【０１１６】
図8a及び図8bに示されるように、本発明の抽出物は、NGF受容体発現を増加したことが確認された。
【０１１７】
［7-2. 免疫細胞化学法を用いた遺伝子発現アッセイ］
NGF受容体としてのp75受容体の発現に対する本発明の抽出物の効果を確認するため、この実験において免疫細胞化学法を用いた。
【０１１８】
PC12細胞を、ガラスカバースリップ（coverslip）（22 mm×22 mm）上の完全培地中で成長させた。24時間後、培養細胞を、10 μg/mlの酢酸エチル可溶性抽出物又は10 ng/mlのNGFでそれぞれ処理した。さらに48時間後、細胞を、リン酸緩衝液（pH 7.4）に溶解した2%パラホルムアルデヒドで、室温にて30分間固定し、その後、PBSで洗浄した。2%BSA及び0.1%Triton-X-100を含む溶液を、非特異的反応を除去し、細胞膜の浸透性を高めるため、細胞上に滴下し、そしてカバースリップを氷上に30分間維持した。この細胞を、PBS及び1%BSAの混合物で10分間 3回リンスし、抗p75一次抗体（1:2000希釈, Chemicon International Co.）をそこに加え、1時間インキュベーションを行った。
【０１１９】
その後、細胞をPBS及び1%BSAの混合物で10分間 3回リンスし、Texas Redに結合させた（Texas Red conjugated）抗マウスIgG二次抗体（1:5000希釈，WithLab Co.）をさらに1時間インキュベーションを行うために、そこに加えた。反応後、二次抗体を除去し、PBSで洗浄した。
【０１２０】
受容体発現の結果を、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【０１２１】
NGF処理群及び酢酸エチル可溶性抽出物処理群において、コントロール群に比べ、p75受容体発現の増加があった（図9a、図9b及び図9c）。
【０１２２】
本発明の抽出物は、受容体発現の増加につながるNGF合成を増加させることが確認され、それにより、本発明の抽出部がPC12細胞の成長及び分化を誘導することが推定され得る。また、酢酸エチル可溶性抽出物と受容体の直接的な相互作用によって、NGF遺伝子発現を活性化したとも考えられる。
【実験例８】
【０１２３】
［受動的回避試験（Passive Avoidance Test）］
受動的回避試験のため、スコポラミン誘導性健忘症の前に、マウスに酢酸エチル可溶性抽出物を投与した。
【０１２４】
神経細胞の成長に伴う学習及び記憶に対する該抽出物の影響を確認するため、シャトルボックス（shuttle box）を備えた自動化システムを使用した。
【０１２５】
回避シャトルボックス（Avoidance shuttle box）（40×20×20 cm，Gemini Co., アメリカ合衆国）は、同じサイズの2つのチャンバー（chamber）に分けられ、箱の床上に0.5 cm間隔で3 mmの厚さのグリッドを有した。ライトチャンバー（light chamber）は、照明器が装備された。体重25〜30 gの雄のマウスを、最初にライトチャンバーに置いた。
【０１２６】
スコポラミンを、マウスに腹腔内注射した。30分後、暗闇を好むマウスがライトチャンバーから出て、ダークチャンバー（dark chamber）に入った場合、グリッド床を通してマウスに電気フットショック（electrical foot shock）（1 mA／体重10g）を与える、習得訓練（acquisition training）を行った。
【０１２７】
習得試験（acquisition trial）の24時間後、ライトチャンバーに滞在する滞在時間（latency time）を計測するため、マウスで同一の試験を再び行った。データは、電気ショックによる以前の訓練に対する記憶を意味するインデックスとして評価された。ダークコンパートメント（compartment）に入る待ち時間（latency）を、180秒間計測した。それがカットオフ時間（180秒）内に暗い部屋に入らなければ、180秒の値がその待ち時間として記録された（assigned）。
【０１２８】
図10に示されるように、スコポラミン誘導性健忘症マウスにおいて、待ち時間が最も短かった。酢酸エチル可溶性抽出物処理マウスの待ち時間は、増加した。
【０１２９】
この結果は、本発明の抽出物は、記憶及び認識能力を改善し、NGF発現の増加によって受動的回避認識機能を高め得ることを示唆する。
【０１３０】
本発明のCistanche deserticola抽出物は、効果的な抗痴呆薬として有用であり得ることが確認された。
【実験例９】
【０１３１】
［毒性試験］
［方法（１）］
実施例1の抽出物を用い、ICRマウス（平均体重25±5 g）及びSprague-Dawleyラット（235±10 g, Jung-Ang Lab Animal Inc.）に対して、急性毒性試験を行った。10匹のマウス又はラットからなる4つの群に、250 mg/kg、500 mg/kg、1000 mg/kg、及び5000 mg/kgの試験試料又は溶媒（0.2 ml, i.p.）を、それぞれ経口腹腔内（orally intraperitoneally）投与し、2週間観察した。
【０１３２】
［方法（２）］
実施例1の抽出物を用い、ICRマウス及びSprague-Dawleyラットに対して急性毒性試験を行った。10匹のマウス又はラットからなる4つの群に、25 mg/kg、250 mg/kg 、500 mg/kg及び725 mg/kg1の試験試料又は溶媒（0.2 ml, i.p.）を、それぞれ腹腔内投与し、24時間観察した。
【０１３３】
［結果］
どの群又はどちらの性別においても、死亡率、臨床的兆候、体重変化及び全体所見（gross finding）に対して、処理に関連する影響はなかった。これらの結果は、本発明において調製された抽出物は、効果があり、安全であることが示唆された。
【０１３４】
以下、処方方法及び賦形剤の種類を記載するが、本発明はそれらに限定されない。代表的な調製例は、以下の通りである。
【０１３５】
［粉末の調製］
実施例2-1の乾燥粉末 50 mg
ラクトース 100 mg
タルク 10 mg
粉末製剤は、上記成分を混合し、密閉容器に充填することで調製された。
【０１３６】
［タブレットの調製］
実施例2-1の乾燥粉末 50 mg
コーンスターチ 100 mg
ラクトース 100 mg
ステアリン酸マグネシウム 2 mg
タブレット製剤は、上記成分を混合し、打錠（entablet）することで調製された。
【０１３７】
［カプセル剤の調製］
実施例2-1の乾燥粉末 50 mg
コーンスターチ 100 mg
ラクトース 100 mg
ステアリン酸マグネシウム 2 mg
タブレット製剤は、上記成分を混合し、従来のゼラチン調製方法によってゼラチンカプセルに充填することで調製された。
【０１３８】
［カプセル剤の調製］
実施例2-1の乾燥粉末 50 mg
コーンスターチ 100 mg
ラクトース 100 mg
ステアリン酸マグネシウム 2 mg
カプセル製剤は、上記成分を混合し、従来のゼラチン調製方法によってゼラチンカプセルに充填することで調製された。
【０１３９】
［液剤の調製］
実施例1の乾燥粉末 0.1〜80g
糖 5〜10g
クエン酸 0.05〜0.3%
カラメル 0.005〜0.02%
ビタミンC 0.1〜1%
蒸留水 79〜94%
CO₂ガス 0.5〜0.82%
液状製剤は、活性成分を溶解させ、全ての成分を充填し、そして従来の液剤調製方法によって滅菌することで調製された。
【０１４０】
［健康食品の調製］
実施例１の抽出物 1000 mg
ビタミン混合物最適量
ビタミンＡアセテート 70 μg
ビタミンE 1.0 mg
ビタミンB₁ 0.13 mg
ビタミンB₂ 0.15 mg
ビタミンB6 0.5 mg
ビタミンB12 0.2 μg
ビタミンC 10 mg
ビオチン 10 μg
ニコチン酸アミド 1.7 mg
葉酸 50 μg
パントテン酸カルシウム 0.5 mg
ミネラル混合物適量
硫酸鉄(II) 1.75 mg
酸化亜鉛 0.82 mg
炭酸マグネシウム 25.3 mg
モノカリウムリン酸塩 15 mg
ジカルシウムホスフェート 55 mg
クエン酸カリウム 90 mg
炭酸カルシウム 100 mg
塩化マグネシウム 24.8 mg
上記のビタミン及びミネラル混合物は、様々に異なってもよい。そのような変化は、本発明の精神及び範囲から離れるものと見なされない。
【０１４１】
［健康飲料の調製］
実施例１の抽出物 1000 mg
クエン酸 1000 mg
オリゴ糖 100 g
アプリコット濃縮液 2 g
タウリン 1 g
蒸留水 900 ml
健康飲料製剤は、活性成分を溶解、混合、85 ℃にて1時間攪拌し、濾過した後、全成分を1000 mlアンプルに充填し、従来の健康飲料の調製方法によって滅菌することで調製された。
【０１４２】
本発明は、上記に記載したように、様々に異なることが明らかである。そのような変化は、本発明の精神及び範囲から離れるものと見なされず、当業者にとって自明であろう全てのそのような変化は、上の請求項の範囲内に含まれることを意図する。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明において記載されるように、Cistanche deserticolaから単離された抽出物は、神経突起の伸長の促進及び神経成長因子としてのはたらきによる強力な神経細胞保護活性を有し、従って、神経退行変性脳疾患の処置及び予防のための治療剤又は健康食品として使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
本発明の上記及び他の目的、特徴ならびに他の利点は、添付の図面と併せて上記の詳細な記載からさらに明確に理解され、ここで；
【図１】図1は、本発明の抽出物又はNGFで処理されたPC12細胞株の神経突起の成長の写真を、顕微鏡における倍率×200で示す。
【図２】図2は、本発明の抽出物またはNGFで処理した神経突起の成長の効果を示す。
【図３】図3は、様々な濃度のNGFで処理された神経突起の成長を、顕微鏡における倍率×200で示す。
【図４】図4は、NGFの神経突起の成長の効果を表す。
【図５】図5は、LDH及びMTTアッセイによって観察された10 μg/mlの酢酸エチル可溶性抽出物で処理された細胞の細胞生存率を表す。
【図６】図6は、10μg/mlの酢酸エチル可溶性抽出物で処理された細胞におけるDNA断片化を示す。
【図７ａ】図7aは、50 ng/mlのNGFで処理された細胞の写真である。
【図７ｂ】図7bは、50 ng/mlのNGFで処理された細胞及び回収された（withdrawn cell）細胞の写真である。
【図７ｃ】図7cは、10 μg/mlの酢酸エチル可溶性抽出物で処理された細胞及び回収された細胞の写真である。
【図７ｄ】図7dは、血清を除去し、10 μg/mlの酢酸エチル可溶性抽出物で処理された細胞の写真である。
【図８ａ】図8aは、電気泳動によって観察されたNGF遺伝子発現を表す。
【図８ｂ】図8bは、発現レベルを示すグラフを表す。
【図９】図9は、PC12細胞におけるNGF受容体発現の免疫細胞化学アッセイを表す。
【図１０】図10は、スコポラミン誘発性健忘症マウスに投与されたときの、本発明の酢酸エチル抽出物の、受動的認識（passive recognition）に対する効果を表す。

Claims

Cistanche deserticola Y.C. MAの酢酸エチル可溶性抽出物を有効成分として含有し、神経細胞を保護することによってアルツハイマー病の治療及び予防するための薬学的組成物。