JP4292208B2 - 乳癌に対するマーカーとしてのタンパク質speeの使用 - Google Patents
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Description
ABTS 2,2'-アジノ-ジ-[3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸(6)]二アンモニウム塩
BSA ウシ血清アルブミン
cDNA 相補DNA
CHAPS (3-[(3-コールアミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパン-スルホン酸)
DMSO ジメチルスルホキシド
DTT ジチオスレイトール
EDTA エチレンジアミン四酢酸
ELISA 酵素結合免疫吸着定量法
HRP ホースラディッシュペルオキシダーゼ
IAA ヨードアセタミド
IgG 免疫グロブリンG
IEF 等電点電気泳動法
IPG 固定化pH勾配
LDS ドデシル硫酸リチウム
MALDI-TOF マトリックス支援レーザ脱離イオン化-飛行時間型質量分析
MES メシチル,2,4,6-トリメチルフェニル
OD 光学密度
PAGE ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PBS リン酸緩衝生理食塩水
PI 等電点
RTS 迅速翻訳装置
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
UICC 国際対癌連合
潜在的な乳癌マーカーとしてのSPEEの同定
組織の供給源
乳癌の潜在的な診断マーカーとして腫瘍特異的なタンパク質を同定するために、プロテオミクス方法を用いて2つの異なる種類の組織の分析を行なう。
0.8〜1.2gの凍結組織を乳鉢に入れ、液体窒素で完全に凍結させる。組織を乳鉢中で粉砕し、10倍容積(w/v)の溶解バッファー(40mM クエン酸Na、5mM MgCl2、1% Genapol X-080、0.02%アジドNa、Complete(登録商標)EDTAフリー [Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号 1 873 580])中に溶解させ、続いてWheaton(登録商標)グラスホモジナイザー(20×ルーズフィッティング、20×タイトフィッティング)でホモジナイズする。3 mlのホモジェネートを1時間、4,500 xgでショ糖密度遠心分離(10〜60%ショ糖)に供する。この遠心分離工程後、3つの画分を得る。グラジェントの上部画分は、可溶性タンパク質を含み、更なる解析に用いる。
凍結乾燥したCNBr活性化セファロース4B(Amersham Biosciences, 17-0430-01)を製造業者の使用説明書に従って再膨潤させ洗浄する。ヒトアルブミンに対するモノクローナル抗体を、0.1 M NaHCO3, pH 8.3, 0.5 M NaClに、10 mg/ml溶解する。1 mlの抗体溶液を1 mlの再膨潤させたCNBr活性化セファロース4Bと混合する。反応時間は1時間である。製造業者の使用説明書に従って、残存活性基のブロッキングおよびゲルの洗浄を行う。
7 mlの抗アルブミンゲルをGenapol X-080を含まない溶解バッファーで平衡にする。ショ糖密度遠心分離の上部画分の7 ml(上記、組織調製参照)をカラムにアプライし、Genapol X-080を含まない溶解バッファーで洗い流す。混合した溶出液を等電点電気泳動実験に用いる。
IEFのために、3 mlのHSAを除去した組織調製液を12 mlの試料バッファー(7M 尿素、2M チオ尿素、2% CHAPS、0.4% IPGバッファー pH4〜7、0.5% DTT)と混合し、1時間インキュベートする。試料をAmicon(登録商標)Ultra-15装置(Millipore GmbH, Schwalbach, Germany)で濃縮し、Bio-Rad(登録商標)タンパク質アッセイ(カタログ番号 500-0006; Bio-Rad Laboratories GmbH, Muenchen, Germany)を用いて供給業者のマニュアルの指示に従ってタンパク質濃度を測定する。1.5 mgのタンパク質試料に相当する容積に、最終体積350μlまでバッファーを加える。この溶液を用いてIPG細片pH4〜7(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)を一晩再水和させる。以下の勾配プロトコルを用いてIEFを行なう:(1.)500Vまで1分;(2.)3500Vまで2時間;(3.)3500Vの一定で22時間、82 kVhを生じさせる。IEF後、細片を-80℃で保存するか、またはSDS-PAGEに直接使用する。
各患者を、ProteomeWeaver(登録商標)ソフトウェア(Definiens AG, Germany, Muenchen)を用いてイメージ分析により別々に分析する。さらに、ゲルの全てのスポットをピッキングロボットにより切り出し、スポットに存在するタンパク質をMALDI-TOFマススペクトロメトリー(UltraflexTMTof/Tof, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)により同定する。各患者について、腫瘍試料由来の4つのゲルを、それぞれの隣接する組織由来の4つのゲルと比較し、特異に発現したタンパク質に対応する独自のスポットについて分析する。この手段により、タンパク質SPEEは腫瘍組織中に特異的に発現するか、強く過剰発現するが、健康な対照組織中では検出されないことが見出される。それゆえ、多くのタンパク質の中でもとりわけ、乳癌の診断に使用するための候補マーカーとして適切である。
乳癌マーカータンパク質SPEEに対する抗体の産生
乳癌マーカータンパク質SPEEに対するポリクローナル抗体を、免疫検出アッセイ、例えば、ウェスタンブロッティングおよびELISAによりSPEEの血清および血漿および血液レベルの測定における抗体のさらなる使用のために産生する。
SPEEに対する抗体を産生するために、免疫原を得るためにタンパク質の組換え発現を行なう。発現は、RTS100発現系と大腸菌の組み合わせを適用して行なう。第一の工程において、DNA配列を分析し、高収率cDNAサイレント変異バリアントおよび個々のPCRプライマー配列の推奨を「ProteoExpert RTS E.coli HY」系を用いて得る。これは商業用のウェブベースサービスである(www.proteoexpert.com)。推奨されたプライマー対を用いて、SPEEタンパク質をコードするヌクレオチド配列のインビトロ転写および発現のためcDNAから直鎖PCRテンプレートを産生するために「RTS 100 E.coli Linear Template Generation Set, His-tag」(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号 3186237)系を使用する。ウェスタンブロット検出およびその後の精製のために、発現タンパク質はHis-tagを含む。最良の発現バリアントを同定する。PCRから発現および検出までの全ての工程を製造業者の使用説明書に従って行なう。全ての必要なT7調節領域(プロモーター、リボソーム結合部位およびT7ターミネーター)を含む各々のPCR産物を、製造業者の使用説明書に従ってpBAD TOPO(登録商標)ベクター(Invitrogen, Karlsruhe, Germany, カタログ番号 K 4300/01)にクローニングする。T7調節配列を用いた発現のために、構築物を大腸菌BL 21(DE 3)に形質転換し(Studier, F.W.ら、Methods Enzymol. 185 (1990)60-89)、形質転換細菌をタンパク質発現のために1lバッチ中で培養する。
ヘテロ二官能性化学(マレイミド/SH化学)を用いて合成を行う。選択されたシステイン含有SPEEペプチドを、Concholepas concholepas由来の3-マレイミドヘキサノイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MHS)活性化ヘモシアニン(Sigma, B-8556)にカップリングさせる。
a)マウスの免疫化
12週齢のA/Jマウスを100μgのSPEEまたはヘモシアニン−ペプチドコンジュゲート(上記参照)で腹腔内に初回免疫する。6週間後、一月間隔で2回のさらなる腹腔内免疫を行なう。この過程において、各マウスに水酸化アルミニウムに吸着した100μgのSPEEまたはヘモシアニン−ペプチドコンジュゲートおよび109個の細菌の百日咳菌を投与する。続いて、最後の2回の免疫を、PBSバッファー中の100μgのSPEEまたはヘモシアニン−ペプチドコンジュゲートを用いて融合の3日前および2日前におのおの静脈内に行う。
a)に従って免疫化したマウスの脾臓細胞をGalfre, G.およびMilstein, C., Methods in Enzymology 73(1981)3-46に従ってミエローマ細胞と融合する。この過程において、免疫化マウスの約1×108個の脾臓細胞を2×107個のミエローマ細胞(P3X63-Ag8-653、ATCC CRL1580)と混合し、遠心分離(300 xgおよび4℃で10分間)する。次いで、細胞をウシ胎仔血清(FCS)を含まないRPMI 1640培地で一度洗浄し、50 mlコニカルチューブ中にて400 xgで再び遠心分離する。上清を廃棄し、細胞沈殿物をタッピングにより穏やかに解し、1 mlのPEG(分子量4000、Merck、Darmstadt)を加え、ピペッティングにより混合する。37℃の水浴中で1分間の後、4〜5分間以内に室温でFCSを含まない5 mlのRPMI 1640を滴下する。その後、10%FCSを含む5 mlのRPMI 1640を約1分以内に滴下し、十分に混合し、培地(RPMI 1640+10% FCS)で50 mlにし、続いて400 xgおよび4℃で10分間遠心分離する。沈殿した細胞を、10% FCSを含むRPMI 1640培地中にとり、ヒポキサンチン-アザセリン選択培地(RPMI 1640+10% FCS中に100 mmol/l ヒポキサンチン、1μg/ml アザセリン)中に播種する。100 U/mlのインターロイキン6を増殖因子として培地に添加する。
得られたハイブリドーマ細胞を、10%FCSを含むRPMI 1640培地中に1 mlあたり1×105個の細胞の密度で播種し、発酵槽(Thermodux Co., Wertheim/Main, Model MCS-104XL, 注文番号 144-050)中で7日間増殖させる。1 mlあたり100μgの平均濃度のモノクローナル抗体が培養物上清中に得られる。培養物上清からのこの抗体の精製を、タンパク質化学における従来の方法(例えば、Bruck, C.ら、Methods in Enzymology 121(1986)587-695による)により行なう。
a)免疫
免疫のために、タンパク質溶液(100μg/ml SPEEまたはヘモシアニン−ペプチドコンジュゲート)および完全フロイントアジュバントの1:1の比の新鮮なエマルジョンを調製する。各ウサギをそれぞれの1 mlのエマルジョンで1、7、14および30、60および90日に免疫する。血液を抜き取り、得られた抗SPEE血清を実施例3および4に記載されるさらなる実験のために使用する。
1容積のウサギ血清を4容積の酢酸バッファー(60 mM、pH4.0)で希釈する。pHを、2 M Tris塩基を用いて4.5に調整する。カプリル酸(希釈試料の25μl/ml)を激しい攪拌下で滴下する。30分後、試料を遠心分離(13,000 xg、30分、4℃)し、ペレットを廃棄し、上清を収集する。上清のpHを2 M Tris塩基を加えることによって7.5に調整し、濾過(0.2μm)する。
ポリクローナルウサギIgGを10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl中に10 mg/mlにする。IgG溶液1 mlあたり、50μlのビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミド(DMSO中に3.6 mg/ml)を加える。室温で30分後、試料をSuperdex 200(10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl)においてクロマトグラフを行う。ビオチン化IgGを含む画分を収集する。モノクローナル抗体を同じ手順に従ってビオチン化する。
ポリクローナルウサギIgGを10mM NaH2PO4/NaOH、30mM NaCl、pH7.5中に10 mg/mlにする。IgG溶液1 mlあたり、50μlのジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, カタログ番号 1 333 054)(DMSO中に3.8 mg/ml)を加える。室温で30分後、試料をSuperdex(登録商標)200(10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl)においてクロマトグラフを行う。ジゴキシゲニン化IgGを含む画分を収集する。モノクローナル抗体を同じ手順に従ってジゴキシゲニンで標識する。
ヒト血清および血漿試料中のSPEEの検出のためのウェスタンブロッティング
SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングをInvitrogen, Karlsruhe, Germanyの試薬および装置を使用して行なう。ヒト血漿試料を還元NuPAGE(登録商標)(Invitrogen)LDS試料バッファーに1:20に希釈し、95℃で5分間加熱する。10μlのアリコートをMESランニングバッファー系中の4〜12% NuPAGE(登録商標)ゲル(Bis-Tris)において泳動する。ゲル分離したタンパク質混合物を、Invitrogen XCell IITM Blot Module(Invitrogen)およびNuPAGE(登録商標)トランスファーバッファー系を使用してニトロセルロース膜上にブロットする。膜をPBS/0.05% Tween-20で3回洗浄し、SuperBlockブロッキングバッファー(Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA)でブロックする。ビオチン化一次抗体をSuperBlockブロッキングバッファーに希釈し(0.01〜0.2μg/ml)、膜とともに1時間インキュベートする。膜をPBS/0.05% Tween-20で3回洗浄する。特異的に結合するビオチン化一次抗体をストレプトアビジンHRPコンジュゲート(SuperBlock ブロッキングバッファー中に20 mUABTS/ml)で標識する。1時間のインキュベーション後、膜をPBS/0.05% Tween-20で3回洗浄する。結合したストレプトアビジンHRPコンジュゲートを化学発光基質(SuperSignal West Femto Substrate, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA)およびオートラジオグラフフィルムを用いて検出する。曝露時間は10分から一晩まで変動する。
ヒト血清および血漿試料中のSPEEの測定のためのELISA
ヒト血清または血漿中のSPEEの検出のために、サンドイッチELISAを開発する。抗原の捕捉および検出のために、抗SPEEポリクローナル抗体のアリコート(実施例2参照)を、ビオチンおよびジゴキゲニンと、それぞれ結合させる。
診断の正確度の点から臨床上の有用性の評価するためのROC分析
正確度を、十分に特徴付けられた患者コホート、すなわち、それぞれ、***撮影に供されてBCを有さないことがわかった50人の患者、それぞれがBCの侵襲性腺管および侵襲性小葉のT1〜3、N0、M0と診断および病期分類された50人の患者、進行したBCを有すると診断され、少なくとも1つの近位リンパ節において少なくとも腫瘍浸潤、またはより重篤な形態の転移を有する50人の患者、それぞれが髄様、粘液性、管状腺または乳頭状乳癌を有すると診断された50人の患者、ならびにDCISを有すると診断された50人の患者から得られた個々の液体試料を分析することによって評価する。市販のアッセイ(Roche Diagnostics, CA 15-3アッセイ(Elecsys(登録商標)システムイムノアッセイアナライザのためのカタログ番号0 304 5838 )によって測定されるCA 15-3および上述のように測定されるSPEEは、これらの患者のそれぞれから得られた血清において定量されてきた。ROC分析は、Zweig, M.H.およびCampbell, 上掲に従って行う。SPEEと確立されたマーカーCA 15-3との組み合わせに関して群Tis〜3、N0、M0の患者を健康な個体と区別する識別能力は、調整された識別分析によって計算される(Friedman, J.H., Regularized Discriminant Analysis, Journal of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175)。
Claims (6)
- a)個体から得た液体試料を提供すること、
b)前記試料と、SPEEに対する特異的な結合試薬とを、前記結合試薬とSPEEの間での複合体の形成に適切な条件下で接触させること、および
c)(b)で形成された複合体の量を乳癌の検出に相関させること
を含む、乳癌の検出方法。 - 前記試料が乳頭吸引液であることをさらに特徴とする、請求項1記載の方法。
- 個体から得た液体試料からの乳癌の検出における、マーカー分子としてのタンパク質SPEEの使用。
- 個体から得た液体試料からの乳癌の早期検出における、マーカー分子としてのタンパク質SPEEの使用。
- 個体から得た液体試料からの乳癌の検出における、乳癌に対する1つ以上のマーカー分子と組み合わせた、乳癌に対するマーカー分子としてのタンパク質SPEEの使用。
- 少なくとも1つの他のマーカー分子がCA 15-3である、請求項5記載の使用。
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