JP4276897B2 - Novel measurement method of nucleic acid by using labeled nucleotide - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の核酸を測定する方法、詳しくは、蛍光色素等の物質で標識されたヌクレオチドを用いて、未知核酸及び／又は既知核酸（標的核酸）の少なくとも１種の核酸を測定することができる核酸の測定方法に関する。又、複数の核酸の場合は同時に測定できる。
【０００２】
【従来の技術】
核酸プローブを用いて標的核酸を測定する方法は数多く知られている。例えば、
（１）FRET（fluorescence resonance energy transfer）現象を利用したプローブを用いる方法（例えば、非特許文献１及び２参照）。
（２）蛍光色素が特定の核酸塩基と相互作用して蛍光発光量を減少させる特性を利用したプローブを用いる方法（例えば、非特許文献３参照）等で代表される方法等、数多くの例を挙げることができる。これらの方法は、均一系で、蛍光色素等で標識された核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせることで及び／又は標的核酸を増幅させることで、核酸プローブに標識された蛍光色素等の光学的キャラクター（蛍光強度）の変化若しくは変化量を測定するものである。以下、本件明細書全体において当該核酸プローブを「均一溶液系核酸プローブ」と呼ぶ。又は単に「核酸プローブ」という場合がある。
【０００３】
しかしながら、上記の方法において必要な均一溶液系核酸プローブは、蛍光物質及び／又はクエンチャー物質でオリゴヌクレオチドを標識する必要がある。又、当該プローブの設計法は、標準化されていない。このことが、時間と費用の浪費に繋がっていた。又、測定感度が改善されてきてはいるが、更なる改善が要望されていた。又、自然界の１つの系内に存在する未知核酸及び／又は既知核酸を含む複数の核酸を同時に、優れた感度で、且つ短時間、簡便、特異的、正確に測定できるものではない。
【０００４】
【非特許文献１】
Morrison et al.,Anal. Biochem.,vol.183,231-244、1989
【非特許文献２】
Xiangnin Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.94, 10756-10761, 1997
【非特許文献３】
KURATA et al.,Nucleic acids Research,2001,vol.29,No.6 e34
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、前記の状況に鑑み、１つの系内に存在する未知核酸及び／又は既知核酸を含む少なくとも１種の核酸を、優れた感度で、且つ短時間、簡便、特異的に正確に測定できる新規方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、核酸の合成を行う過程で、蛍光標識ヌクレオチド或はクエンチャー標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませた場合、標識された蛍光色素の蛍光キャラクターが、取り込ませる前に較べて、著しく変化することを知見した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００７】
即ち、本発明は、
１）（Ａ）少なくとも１種の鋳型としての核酸と、（Ｂ）（ａ）ドナー蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマー及び（ｂ）アクセプター蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマーと、（Ｃ）少なくとも１種の核酸合成酵素を含有してなる核酸重合反応系で核酸重合反応を行い、核酸重合系の光学的キャラクターの変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型として合成された核酸を測定することを特徴とする核酸の測定方法を提供する。
【０００８】
上記本発明の方法においては、
２）核酸重合系が、（Ｄ）標識物質で標識されていない少なくとも１種のヌクレオチドモノマーを含むこと；
３）核酸重合系が、更に、（Ｅ）鋳型核酸に特異的に結合する少なくとも１種のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを含むことが好ましい。
【０００９】
４）また、核酸重合系が、非標識ヌクレオチドを含有すること；
５）上記４）において、ドナー蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマー、アクセプター蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマー又は非標識ヌクレオチドが、グアニン（ｇ）を含有するか及び／又は鋳型核酸が少なくとも１つのグアニン（ｇ）を含有すること；
６）上記４）において、非標識ヌクレオチド、ドナー蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマー又はアクセプター蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマーが、３リン酸体であること；
７）核酸重合系が、（Ｆ）核酸に結合することで蛍光を発する蛍光色素を含有していること；
８）核酸合成酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及びそれらの改変体からなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明を詳細に説明する前に、特許請求の範囲を含む本明細書全体にわたって使用する用語の定義をする。本発明に用いている用語は、特別な断りがない場合、生物学、分子生物学、遺伝学若しくは遺伝子工学、微生物学若しくは微生物工学等で一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【００１３】
ヌクレオチドモノマーとは、少なくとも１種の核酸合成酵素により核酸重合体に取り込まれ得るヌクレオチドのことをいう。好適にはオリゴヌクレオチドの核酸の構成成分のモノヌクレオチドである。好適な例としては、ヌクレオシドモノリン酸体（NMP）、２リン酸体（NDP）及び３リン酸体（NTP）を挙げることができる。より好適な例としては、３リン酸体である。塩基として、核酸構成成分のもの、即ち、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、それらの誘導体、ＲＮＡに含まれる微量成分等を挙げることができる。糖はリボース、デオシキシリボースである。前記のオリゴヌクレオチドは、鋳型核酸にハイブリダイズするものであるならば、エキソヌクレアーゼ活性を有さない核酸合成酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）とリガーゼを用いることにより、核酸重合系で核酸重合体に取り込まれる。
【００１４】
ヌクレオシドモノリン酸体又は２リン酸体が用いられる理由は、核酸重合系に当該リン酸体を３リン酸体にするキナーゼ（kinase）類、ホスホリラーゼ類若しくはそれらの生成系を含んでいてもよいからである。例えば、精製していない粗鋳型核酸若しくは粗核酸合成酵素には、これらの酵素及び／又は生成系を含む例が多い。核酸重合系にＡＴＰが過分に含まれている場合は、ＡＴＰ以外の３リン酸体が形成し易い。即ち、本発明の核酸重合系とは、これらの酵素及び／又は生成系を含むことができると定義する。尚、標識ヌクレオチド及び免疫関連標識ヌクレオチドについても前記と同様で、３リン酸体がより好適である。又、ジデオキシヌクレオチドモノマー及び標識若しくは非標識ジデオキシヌクレオチドについても前記と同様で、３リン酸体がより好適である。
【００１５】
標識ヌクレオチドとは、後記する蛍光色素、クエンチャー物質等の少なくとも一種で標識されたヌクレオチドモノマーのことをいう。そして、蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマーを蛍光標識ヌクレオチドと、又、クエンチャー物質で標識されたヌクレオチドモノマーをクエンチャー標識ヌクレオチドという。更にドナー蛍光色素で標識された蛍光標識ヌクレオチドをドナー標識ヌクレオチドと、又、アクセプター蛍光色素で標識された蛍光標識ヌクレオチドをアクセプター標識ヌクレオチドという。当該標識ヌクレオチドについては、詳しく後記した。
非標識ヌクレオチドとは、前記ような標識物質で標識されないヌクレオチドモノマーのことをいう。
核酸プライマーとは、鋳型核酸に特異的に結合する１種のプライマーのことをいう。又、核酸プライマーが、蛍光色素、及びクエンチャー物質で標識されたものを、順に、蛍光標識核酸プライマー及びクエンチャー標識核酸プライマーという。又、２者を総称して、標識核酸プライマーという。アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミンを順にＡ若しくはａ、Ｇ若しくはｇ、Ｕ若しくはｕ、Ｃ若しくはｃ、Ｔ若しくはｔとした。核酸に結合することで、蛍光を発する蛍光色素を核酸特異的蛍光色素と定義した。
【００１６】
鋳型核酸とは、核酸重合体の鋳型になり得るものである。本発明においては、未知の核酸（「未知核酸」という場合がある。）、既知の核酸（「標的核酸」という場合がある。）、又、それらの混合物を指す。そして、それらはＤＮＡ及び／又はＲＮＡである。即ち、本発明の鋳型核酸とは、測定を目的とした特定の核酸（標的核酸）とは限らず、不特定の核酸をも含む。勿論、遺伝子等を含む。それらの核酸が混在していもよい。又、濃度又は大きさの大小も問わない。即ち、１つの系内に存在する特定及び不特定の核酸をも意味する。即ち、鋳型核酸とは、本発明方法により重合及び／又は増幅されて検出若しくは測定できる核酸のこという。
【００１７】
核酸合成酵素とは、前記の鋳型核酸を鋳型として前記の非標識ヌクレオチド及び／又は標識ヌクレオチドを重合して、核酸重合体を合成する能力を有するものであればどのようなものでもよい。代表的な例として、ＤＮＡポリメラーゼ類、ＲＮＡポリメラーゼ類、逆転写酵素類(reverse transcriptase)、リガーゼ類、各種のキナーゼ類、ヌクレオチド３リン体生成系、及びそれらの遺伝子工学的に改変された改変蛋白質を有する酵素類を挙げることができる。ＤＮＡポリメラーゼ類、ＲＮＡポリメラーゼ類及び逆転写酵素類は、リガーゼ類、各種のキナーゼ類、ヌクレオチド３リン体生成系を含んでいる酵素類は、本発明においては、好適に利用され得る。本発明においては、これらのものが、単独若しくは併用で用いられる。
【００１８】
勿論、酵素は、これら酵素の活性を十分に発揮させる各種因子を含んでいても、いなくともよい。ＤＮＡポリメラーゼの場合は、エキソヌクレアーゼ活性を有していても、有さなくてもよい。精製されたもの若しくはされない粗酵素の状態のどちらでもよい。又、酵素の起源（微生物、動物、植物）については特に限定されない。好適には耐熱性を有するものがよい。好適な具体例として、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたVent(exo-)DNA Polymerase（サーモコッカス・リトラリス由来）、Tgo(exo-) DNA Polymerase、ThermoSequenase DNA Polymerase(Armersham社製）、AmpliTagGold polymerase、T7 Sequenase DNA Polymerase等を挙げることができる。
【００１９】
蛍光色素等で標識された核酸重合体又は核酸プライマーと鋳型核酸又は核酸重合体等の対応核酸とのハイブリダイゼーションによる複合体のことをハイブリッド（又はハイブリット）複合体、核酸重合体・鋳型核酸複合体、核酸プライマー・鋳型核酸複合体、核酸プライマー・核酸重合体複合体という。
【００２０】
本発明において「核酸を測定する」、或いは「核酸濃度を測定する」なる用語は、標的核酸の濃度を定量することは勿論のこと、定量的検出をすること、定性的検出をすること、核酸重合系の蛍光強度を単に測定するか若しくは単にモニタリングすること、単なる検出をすること、又、核酸を分析若しくは解析すること、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析すること等を意味するものとする。又、このようにして得られたデーターを公知の蔵田らの方法（EP特許公開公報、EP1 046 717 A9号）で解析して、１つの系内に存在している濃度（コピー数等）を求める操作等も含めるものとする。又、公知の方法（基礎生化学実験法、第４巻（核酸・遺伝子実験）、日本生化学会編、東京化学同人社）等により塩基配列を決める操作等も含めるものとする。
【００２１】
又、核酸の重合反応とは、単なる重合（合成、又は伸長反応）反応だけでなく、核酸の増幅反応、例えば、ＰＣＲ方法、リアルタイム定量的ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ方法、ＬＡＭＰ方法、ＮＡＳＢＡ方法、ＴＡＭＡ方法、ＬＣＲ方法、それらの方法に伴う、ハイブリダイゼーション反応、伸長、変性等を含める。そして、重合反応の具体的例として以下の例を挙げることができる。
（１）鋳型核酸がＤＮＡで、核酸合成酵素がＤＮＡポリメラーゼ若しくは改変ＲＮＡポリメラーゼで、ヌクレオチドモノマー、蛍光標識ヌクレオチド及びクエンチャー標識ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド体で、核酸重合体がＤＮＡである反応。
（２）鋳型核酸がＤＮＡで、核酸合成酵素がＲＮＡポリメラーゼ若しくは改変ＤＮＡポリメラーゼで、ヌクレオチドモノマー、蛍光標識ヌクレオチド及びクエンチャー標識ヌクレオチドがリボヌクレオチド体で、核酸重合体がＲＮＡである反応。
【００２２】
（３）鋳型核酸がＲＮＡで、核酸合成酵素が逆転写酵素で、ヌクレオチドモノマー、蛍光標識ヌクレオチド及びクエンチャー標識ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド体で、核酸重合体がＤＮＡである反応。
（４）鋳型核酸がＲＮＡで、核酸合成酵素が逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼで、ヌクレオチドモノマー、蛍光標識ヌクレオチド及びクエンチャー標識ヌクレオチドがリボヌクレオチド体及びデオキシリボヌクレオチド体で、核酸重合体がＲＮＡである反応、即ち、ＤＮＡ合成反応を介する反応。
【００２３】
（５）上記の反応系にリガーゼを併用する反応系。
（６）上記の反応系に各種のキナーゼ類及び／又はヌクレオチド３リン体生成系を併用する反応系。
上記において、好ましいものは（１）〜（４）で、より好ましいものは（１）〜（３）で、特に好ましいものが、（１）及び（２）である。
【００２４】
「光学的キャラクター」なる用語は、ヌクレオチドを標識する蛍光色素、クエンチャー物質等の各種の吸収スペクトル、若しくは蛍光発光スペクトル、及びそれらの吸収強度、偏光、蛍光発光、蛍光強度、蛍光寿命、蛍光偏光、蛍光異方性等の光学的特性等のこという（「蛍光強度」で総称する。）。又、標識ヌクレオチド等に標識されている少なくとも１つの蛍光色素等について少なくとも１種以上の測定波長で測定された測定値を総合的に評価して得た性質のこともいう。例えば、核酸の変性反応の蛍光強度曲線等もその１つである。
【００２５】
本発明において、「蛍光強度の変化若しくは変化量から」なる用語は、本発明の核酸重合体に基づく蛍光強度の変化だけでなく、当該核酸重合体に、蛍光色素及び／又はクエンチャーで標識された均一溶液系核酸プローブをハイブリダイズさせたときの、そのハイブリダイゼーション前後の蛍光強度の変化若しくは変化量をも含めるものとする。
【００２６】
又、核酸重合系は、標識又は非標識ジデオキシヌクレオチドを、標識又は非標識ヌクレオチドと共に含むこともできる。この場合の核酸の重合は、当該ジデオキシヌクレオチドが反応に利用された場合は、利用された時点でストップする。１種の標的核酸が鋳型となっている場合は、それを鋳型とする鎖長の異なる核酸重合体が多数得られる。これらの核酸重合体を電気泳動方法、液体クロマト方法等で分析・解析することにより、標的核酸について重要な情報が得られる。このような分析・解析においても前記標識物質の蛍光強度の変化が利用される。
【００２７】
蛍光標識ヌクレオチド、クエンチャー標識ヌクレオチド及び核酸特異的蛍光色素について詳しく記載する。本発明でいう蛍光色素（「蛍光物質」という場合もある。）とは、一般に核酸プローブに標識して、核酸の測定・検出に用いられている蛍光色素の類である。例えば、フルオレセイン（fluorescein）又はその誘導体類｛例えば、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate)(FITC)若しくはその誘導体等｝、Alexa 488、Alexa 532、cy3、cy5、6-joe、EDANS、ローダミン（rhodamine）6G（R6G）又はその誘導体｛例えば、テトラメチルローダミン（teramethylrhodamine）（TMR）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（tetramethylrhodamine isothiocyanate）（TMRITC）、ｘ−ローダミン（x-rhodamine）｝、テキサスレッド（Texas red）、ボデピー（BODIPY）FL｛ボデピー（BODIPY）は商標名、FLは商品名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国；以下同様｝、ボデピー（BODIPY）FL/C3、ボデピー（BODIPY）FL/C6、ボデピー（BODIPY）5-FAM、ボデピー（BODIPY）TMR、又はその誘導体｛例えば、ボデピー（BODIPY）TR、ボデピー（BODIPY）R6G、ボデピー（BODIPY）５６４｝、ボデピー（BODIPY）５８１等を挙げることができる。
【００２８】
上記の中でも、FITC、EDANS、テキサスレッド、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、BODIPY FL/C3、BODIPY R6G、BODIPY FL、Alexa 532、BODIPY FL/C6、BODIPY TMR、5-FAM、BODIPY 493/503、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、Texas red、x-Rhodamine等を好適なものとして挙げることができる。
【００２９】
クエンチャー物質とは、前記蛍光色素に作用して、その発光を抑制若しくは消光する物質である。例えば、Dabcyl、QSY7（モルキュラー・プローブ社製）、QSY33（モルキュラー・プローブ社製）、Ferrocene又はその誘導体、methyl viologen、N,N'-dimethyl-2,9-diazopyrenium等、好適にはDabcyl等を挙げることができる。
【００３０】
本発明の蛍光標識ヌクレオチドとは、少なくとも１種の蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマーである。その標識は５’側の糖部位及び／又はそのリン酸部位、塩基部位、３’側の糖部位及び／又はリン酸部位のどちらでもよい。そして、蛍光色素とは前記に例示されるような色素で、ドナー色素となり得る色素、アクセプター色素となり得る色素の双方を意味するものとする。又、同様に、クエンチャー標識ヌクレオチドとは前記に例示されるようなクエンチャー物質で標識されたヌクレオチドモノマーである。尚、蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドの双方を総称して、「標識ヌクレオチド」という場合がある。蛍光標識ジデオキシヌクレオチド及びクエンチャー標識ジデオキシヌクレオチドについても前記と同様である。この場合は、糖の３’位にＯＨ基がないので、核酸重合に当該ヌクレオチドが反応に利用された場合は、利用された時点で、核酸重合反応がストップする。
【００３１】
標識ヌクレオチドにおいて糖の３’ＯＨ基に標識されている場合は、核酸の重合は、当該ヌクレオチドが反応に利用された場合は、利用された時点で重合がストップする。１種の標的核酸が鋳型となっている場合は、それを鋳型とする鎖長の異なる核酸重合体が多数得られる。これらの核酸重合体を電気泳動方法、液体クロマト方法等で分析・解析することにより標的核酸について重要な情報が得られる。このような分析・解析においても標識物質の蛍光強度の変化が利用される。
【００３２】
ヌクレオチドモノマーに蛍光色素、クエンチャー物質を標識するには、従来公知の標識法のうちの所望のものを利用することができる。標識部位は、５’リン酸部のＯＨ基、塩基のＯＨ基、アミノ基である。アミノ基に標識する場合、キット試薬、例えば、Uni-link aminomodifier(CLONTECH社製、米国）、フルオ・リポターキット（FluoReporter Kit)F-6082、F-6083、F-6084、F-10220（いずれもモルキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）を用いるのが便利である。そして、常法に従って当該ヌクレオチドモノマーに前記標識物質分子を結合させることができる。
【００３３】
ＯＨ基に標識する場合、5'Amino-Modifier C6キット（Glen Research社、米国）等を用いる。例えば、塩基のＯＨ基に前記標識物質分子を結合させる場合は、先ず、常法に従ってＯＨ基にスペーサーとして、例えば、-(CH₂)_n-SHを導入する。この場合、ｎは３〜８、好ましくは６である。このスペーサーにＳＨ基反応性を有する前記標識物質又はそれらの誘導体を結合させることにより標識ヌクレオチドモノマーを合成できる。アミノ基に標識する場合も同様である。リボース及びデオキシリボースの３’位のＯＨ基、リボースの２’位のＯＨ基、又、５’リン酸部位のＯＨ基を前記と同様にして標識することができる。このようにして合成された前記標識物質で標識された各種のヌクレオチドモノマーは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して、本発明で用いる標識ヌクレオチドとすることができる。勿論、委託合成を行って入手してもよい。
【００３４】
本発明で用いる核酸プライマーとは、核酸重合体の前駆体、即ち、プレカーサー(precursor)と成り得るものであり、オリゴヌクレオチドからなるものである。デオキシリボース体、リボース体のどちらでもよい。そして鎖長は公知の核酸合成に利用できるものでよく、特に限定されないが、例示するならば、２〜５０塩基、好適には、３〜４０塩基、より好適には５〜３０塩基である。鋳型核酸に特異的にハイブリダイズする塩基配列を有するもの、又、単に共通の塩基配列若しくはコンセンサス配列だけを有するもののどちらも用いることができる。前者の場合は、特定の鋳型核酸を鋳型とする核酸重合体が得られる。後者の場合は不特定のものが得られる。
【００３５】
本発明の前記プライマーは、前記の蛍光色素、クエンチャー物質で標識されていても、いなくとも用いることができる。標識はこれらの標識物質の少なくとも１種で為されていればよい。そして、好ましい核酸プライマーは５’末端及び／又は鎖中の塩基が標識され、３’末端の糖の３’ＯＨ基が標識されていないものである。この場合は得られる核酸重合体はプライマーを標識した標識物質で標識されたものになる。勿論、３’末端の糖の３’ＯＨ基が標識されたものも用いることができる。この場合は単に核酸プローブとして利用される。
【００３６】
本発明の核酸プライマーのオリゴヌクレオチドは、通常の一般的オリゴヌクレオチドの製造方法で製造できる。例えば、化学合成法、プラスミドベクター、ファージベクター等を使用する微生物法等で製造できる。尚、現在、市販されている核酸合成機を使用するのが好適である。
【００３７】
オリゴヌクレオチドに蛍光色素、クエンチャー物質を標識するには、前記の標識ヌクレオチドモノマーの場合と同様にすればよい。この場合、オリゴヌクレオチドの５’末端塩基、３’末端塩基、鎖中の塩基、５’末端リン酸基、３’末端のリボース、デオキシリボースが標識対象になる。当該オリゴヌクレオチドの合成、当該標識核酸プライマーの合成は、委託合成を行うのが最も簡便な方法である。
【００３８】
本発明において、核酸特異的蛍光色素とは、核酸に結合することで蛍光を発する物質のことである。結合する核酸種は、標識又は非標識の核酸プライマー・鋳型核酸複合体、１本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの２本鎖、２本鎖ＲＮＡ等の核酸であればよく、特に限定されない。核酸特異的蛍光色素としての１例を挙げれば、エチジュウムブロミド、Sybr green 1、Sybr green 2、YOYO、TOTO、YO-PRO-1等のインターカレター類を挙げることができる。しかしながら、本発明においては核酸に結合することで蛍光を発する物質であれば、全ての本発明の方法に適用可能である。
【００３９】
本発明は次の手順からなる核酸の測定方法である。
１）下記｛（１）〜（８）｝、好ましくは｛（６）、（７）及び（８）｝、より好ましくは｛（６）及び（７）｝の何れか１つの核酸重合系で核酸重合反応（単独）、又は核酸重合反応及び核酸増幅反応（双方の反応）を開始する。
（１）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む核酸重合系。
（２）前記（１）において、非標識ヌクレオチドを含む核酸重合系。
（３）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ジデオキシヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む核酸重合系。
（４）上記（３）において、標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含む核酸重合系。
【００４０】
（５）鋳型核酸、非標識ジデオキシヌクレオチド、標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含有する核酸重合系。
（６）上記（１）〜（５）において更に標識核酸プライマー又は非標識核酸プライマーを含む核酸重合系。
（７）鋳型核酸、非標識ヌクレオチド、標識核酸プライマー及び核酸合成酵素を含む核酸重合系。
（８）上記（１）〜（７）の何れか１項において核酸特異的蛍光色素を含む核酸重合系。
【００４１】
２）前記の反応過程で、反応産物である核酸重合体に標識ヌクレオチド及び／又は核酸特異的蛍光色素が取り込まれるので、核酸重合系の蛍光強度が変化する。その変化若しくは変化量を測定する。核酸プローブを存在させた場合は、プローブと核酸重合体とが、ハイブリダイズし、核酸重合反応系の蛍光強度が独特な変化をする。
３）必要に応じて、前記反応物を電気泳動、ＨＰＬＣで分析する。
尚、上記の核酸重合系において、特に、核酸プライマーを含有する（６）のものは、当該核酸重合系の出力である核酸重合体としてＤＮＡの場合が好適である。又、（１）及び（２）のものは、当該核酸重合系の出力である核酸重合体としてＲＮＡの場合が好適である。又、標識又は非標識ジデオキシヌクレオチドを含む系は、後記する多型（ＳＮＰを含む。）又は変異の測定、分析若しくは解析に用いるのが好適である。
【００４２】
本発明において、「少なくとも１種の核酸プライマーを存在させるか存在させずして」の意味は、少なくとも１種の鋳型核酸（例えば粗鋳型核酸）若しくは少なくとも１種の鋳型核酸を含む試料、粗核酸合成酵素類には、鋳型核酸にハイブリダイズして核酸重合体の前駆体になり得るオリゴヌクレオチドが存在する例が多いからである。又、粗鋳型核酸、粗核酸合成酵素類の中に、当該前駆体を合成する酵素類が含まれている例が多い。
又、ＲＮＡ系の核酸重合反応は前記の核酸プライマーが存在させなくとも進む場合がある。
【００４３】
又、少なくとも１種の鋳型核酸（例えば、粗鋳型核酸）若しくは少なくとも１種の鋳型核酸を含む試料中に、核酸合成系が含まれている場合（例えば、各種生物の細胞抽出液）は、核酸合成酵素を添加しなくとも、核酸重合反応がおこる。この場合は、少なくとも１種の蛍光標識ヌクレオチド、クエンチャー標識ヌクレオチド、及び核酸特異的蛍光色素からなる群から選ばれた少なくとも１種のもの、又は、核酸プライマーを反応系に存在させて、反応を開始すればよい。
【００４４】
上記の反応は、公知の反応条件で行ってよいのであるが、例示するならば、温度１０℃〜核酸変性温度未満、具体的には、核酸合成酵素の種類に依存する。例えば、ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、温度１０℃〜核酸変性温度未満、好適には、３０〜９０℃、より好適には３０〜８０℃である。ＲＮＡポリメラーゼを使用する場合は、３０〜６０℃、逆転写酵素を使う場合は、３０〜７０℃である。反応時間は核酸重合系の蛍光強度を時間の関数として、モニタリニグした場合、平衡に達するまでである。例えば、１０秒〜１０時間、好適には１０秒〜２時間、より好適には１０秒〜１時間である。
【００４５】
上記の蛍光強度の変化は、次の現象からなる群の少なくとも１種の現象によって引き起こされるものと推定されている。そして複雑にかみ合っているものである。
（１）核酸特異的蛍光色素と蛍光色素間の相互作用（FRET（fluorescence resonance energy transfer）現象）。
（２）蛍光色素間の相互作用（FRET現象）。
（３）クエンチャー物質と蛍光色素間の相互作用（蛍光消光現象）（前記（２）と同じ）。
（４）グアニン塩基と蛍光色素間の相互作用（蛍光消光現象）。
尚、本発明でいう相互作用とは、一方の励起エネルギーが他方へ移動する反応である。又、”蛍光消光現象”を単に”蛍光消光”と略称する場合がある。
【００４６】
以下、蛍光強度の変化若しくは変化量を測定する好ましい実際的方法は、リアルタイムで核酸重合系の蛍光強度を測定し、測定値を求める方法である。この場合、少なくとも１種の入射光若しくは励起光を出し、且つ少なくとも１種のホトマル等の受光面をもつ、即ち、マルチチャンネルを有する市販装置を使用するのが望ましい。例えば、スマートサイクラー（タカラバイオ株式会社）、ABI PRISM^TM 7700Sequence Detection System(SDS 7700)(PE Applied Biosystems)、LightCycler^TM System(Roche Diagnostics,Mannheim Germany)等を使用すればよい。
【００４７】
実際の測定値を求める場合は、以下の少なくとも何れか１つを実施する。
（１）核酸重合反応の前後の核酸重合系の測定。
（２）核酸合成を行なわせない系（例えば、鋳型核酸又は核酸合成酵素を添加しない系）を対照としての核酸重合系の測定。
（３）核酸合成が平衡に達した系の核酸重合系の蛍光強度を先ず測定し、次いで、核酸重合系の核酸変性処理（例えば、９０〜９８℃での処理）後、測定する。
【００４８】
前記の方法により得られた測定値を、後記するデータ解析方法で処理（解析）することにより、自然界の１つの系内に存在する鋳型核酸（未知核酸、標的核酸）種、及びそれらの核酸が重合若しくは増幅される前のコピー数等の濃度を知ることができる。そしてよりよいデータになる。
【００４９】
以下に本発明の特徴を図面を参照して説明する。
１）本発明方法Ａ（図１参照）
（１）少なくとも１種の蛍光標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませ、取り込まれた蛍光標識ヌクレオチド間の標識された蛍光色素（Ａ）と標識された蛍光色素（Ｂ）間の相互作用に由来する核酸重合系の蛍光キャラクターの変化を測定するか、又はその変化を時間の関数としてモニタリングする（以下、単にモニタリングするという。）ことから、鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することを特徴とする。本方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（１）及び（２）の１例で、特許請求の範囲の請求項１〜３の発明に相当する。
【００５０】
（２）前記（１）において、核酸プライマーを含有する核酸重合系で、核酸重合反応を行う方法である。この場合は、核酸プライマーが核酸重合体の前駆体（プライマー）として利用される。この方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（６）の１例で、特許請求の範囲の請求項５の発明に相当する。
【００５１】
前記（１）及び（２）のように、蛍光標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませた場合、取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドに標識された蛍光色素（Ａ、Ｂ）間の距離が著しく接近し、溶液中に分散した状態では発生しなかった蛍光色素間の相互作用が発生する（図１参照）。蛍光色素間の相互作用に由来する蛍光強度の変化若しくは変化量を測定するか、又はモニタリングすることで鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することが可能となる。
【００５２】
この場合、相互作用し合う蛍光色素の内、一方は、FRET現象の励起エネルギーを与える色素でドナー色素（Ａ）という。そして他方はエネルギーを受けて蛍光発光する色素でアクセプター（Ｂ）という。
【００５３】
又、アクセプター色素は一般にFRET現象において、ドナー色素との対において、アクセプター色素となり得る色素、即ち、ドナー色素からエネルギー転移を受け得る（言葉を換えるとドナー色素に対してクエンチング（消光作用）作用をする）色素であればどのようなものでもよい。そして、ドナー色素は、アクセプター色素に励起エネルギーを転移できるものであれば、どのようなものでもよい。前記色素の中から該当するものを適当に選択することができる。
【００５４】
例えば、好適なドナー色素として、FITC、BODIPY FL、BODIPY FL系の前記色素、BODIPY 493/503、5-FAM、BODIPY 5-FAM、Tetramethylrhodamine、6-TAMRA等を、より好適なものとして、FITC、BODIPY FL、BODIPY 493/503、BODIPY 5-FAM、Tetramethylrhodamine、6-TAMRA等を挙げることができる。
【００５５】
好適なアクセプター色素は、対を形成するドナー色素の種類に依存する。例示するならば、BODIPY FL、BODIPY FL系の前記色素、BODIPY 493/503、5-FAM、BODIPY 5-FAM、Tetramethylrhodamine、6-TAMRA等をドナー色素とするならば、rhodamine X、BODIPY 581/591等をアクセプター色素とすることができる。本方法は、標識ヌクレオチドの蛍光色素、即ち、核酸重合系の特定波長の蛍光強度の増加若しくは減少を測定する。ドナー色素の蛍光強度を測定する場合は蛍光強度の減少、アクセプター色素の蛍光強度を測定する場合は蛍光強度の増加を測定することになる。
【００５６】
２）本発明方法Ｂ（図２参照）
本発明の核酸重合系が、核酸特異的蛍光色素を含有する例である。そして、核酸重合系が前記核酸重合系（８）の１例である。核酸特異的蛍光色素（Ｃ）は、核酸重合体、核酸重合体・鋳型核酸複合体、核酸プライマー・鋳型核酸複合体に結合する。そして核酸重合体に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ｄ）と核酸特異的蛍光色素（Ｃ）間の相互作用が発生する。この相互作用に由来する蛍光強度の変化を測定するか、又はモニタリングすることで鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することが可能となる。この方法は、特許請求の範囲の請求項１５の発明に相当し、核酸特異的蛍光色素（Ｃ）の蛍光強度の減少、又、標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ｄ）の蛍光強度の増加を測定することになる。即ち、核酸重合系の特定波長の蛍光強度の増加若しくは減少を測定する。
【００５７】
前記したように、核酸特異的蛍光色素（Ｃ）の存在下で、蛍光標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませる反応を行う過程で、合成された核酸重合体に核酸特異的蛍光色素（Ｃ）が結合し、この蛍光色素（Ｃ）と、反応過程で取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ｄ）の距離が著しく接近する（図２参照）。このため前記同様の蛍光色素間の相互作用が発生する。
【００５８】
この場合の蛍光色素（Ｄ）としては、前記の蛍光色素がすべて利用できるが、好ましいものはFITC、EDANS、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、BODIPY FL/C3、BODIPY R6G、BODIPY FL、Alexa 532、BODIPY FL/C6、BODIPY TMR、5-FAM、BODIPY 493/503、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、Texas red、x-Rhodamine等を例示できる。又、核酸特異的蛍光色素（Ｃ）の前記したものがすべて利用できるが、好ましいものはSybr green 1及びYO-PRO-1である。好ましい蛍光色素の組合わせは、Syber greenとTexas red、6-joe、TMR、Alexa 532、BODIPY R6G、Alexa 532、BODIPY TMR、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、x-Rhodamineの組み合わせ、及びYO-PRO-1とTexas red、6-joe、TMR、Alexa 532、BODIPY R6G、Alexa 532、BODIPY TMR、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、Texas red、x-Rhodamine等を例示できる。
【００５９】
３）本発明方法Ｃ
非標識核酸プライマーが存在するか、存在せずして、蛍光標識ヌクレオチド、非標識ヌクレオチド、鋳型核酸、核酸合成酵素を含有してなる核酸重合系で核酸重合反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の減少若しくは減少量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法である。そして非標識ヌクレオチドの少なくとも一種がグアニン（ｇ）を含むか及び／又は鋳型核酸が少なくとも１つグアニン（ｇ）を含む場合が好適である。即ち、核酸重合体に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの塩基に対応する鋳型核酸の塩基がｇｃ（ＧＣ）対を形成するか、又は、上記蛍光標識ヌクレオチドの塩基から１乃至３塩基離れて（当該対応塩基を１と数える。）、鋳型核酸中にＧが存在するか若しくは核酸重合体中に塩基がＧである非標識ヌクレオチドが存在し、蛍光強度の変化が蛍光色素（Ｅ）とＧとの相互作用によるものである核酸の測定方法。この方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（２）の１例で、特許請求の範囲の請求項７及び８に相当する発明である。
【００６０】
重合反応系の蛍光強度の減少は、次の何れかの場合におこる。
（１）蛍光標識ヌクレオチドの塩基がシトシン（ｃ）又はグアニン（ｇ）である。
（２）少なくとも一種の非標識ヌクレオチドの塩基がグアニン（ｇ）である。
（３）鋳型核酸が少なくとも１つグアニン（ｇ）を含む。
【００６１】
前記したように、蛍光標識ヌクレオチド及び／又は非標識ヌクレオチドを用いて核酸重合反応を行う過程で、鋳型核酸中のグアニン（ｇ）、又は合成された核酸重合体中の、グアニン（ｇ）を含む非標識ヌクレオチドのグアニン（ｇ）と取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ｅ）との距離が著しく接近する（図３参照）。このため溶液中に分散した状態では発生しなかった、標識された蛍光色素（Ｅ）の励起エネルギーがグアニン（ｇ）塩基に移動するようになる。
【００６２】
この場合の標識される蛍光色素（Ｅ）としては、前記の蛍光色素がすべて利用できるのであるが、好ましいものは、FITC、EDANS、Texas red、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、BODIPY FL/C3、BODIPY R6G、BODIPY FL、Alexa532、BODIPY FL/C6、BODIPY TMR、5-FAM、BODIPY 493/503、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、Texas red、x-Rhodamine等である。
【００６３】
蛍光標識される好ましいヌクレオチドモノマーはシトシン（以下、ｃと略称する。）を塩基とするヌクレオチドモノマー（cytidylic acid、cytidine 5'-phosphate，cytidine 5'-diphosphate,cytidine 5'-triphosphate、若しくはそれらの重合体若しくはcytidylic acidを含有する重合体）であり、そして標識部位は塩基部（アミノ基）、又はリン酸部（ＯＨ基）、又はリボース部（２’又は３’位のＯＨ基）である。好ましい部位は塩基部、又はリン酸部である。
【００６４】
４）本発明方法Ｄ（図４参照）
本発明方法Ａの（１）又は（２）において、蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドとを使用する例である。即ち、蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドとを核酸重合体に取り込ませると、取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）とクエンチャー標識ヌクレオチドのクエンチャー物質（Ｑ）が接近し、相互作用する（図４参照）ことにより核酸重合系の蛍光強度が減少する。この蛍光強度の減少を測定するか、又はその減少をモニタリングすることで鋳型核酸又はそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする。本方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（１）及び／又は（２）の１例で、特許請求の範囲の請求項３及び／又は４の発明に相当する。そして、核酸重合系の蛍光強度の減少を測定することになる。
【００６５】
本方法で利用できるクエンチャー物質（別名として”蛍光消光物質”ともいう。）は、例えば、Dabcyl、QSY7（モルキュラー・プローブ社製）、QSY33（モルキュラー・プローブ社製）又はその誘導体、methyl viologen、N,N'-dimethyl-2,9-diazopyrenium等、好適にはDabcyl等を例示できる。
【００６６】
前記したように、核酸重合系に蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドを存在させて、核酸重合反応を行うと、蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドが核酸重合体に取り込まれる。核酸重合体に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドとクエンチャー標識ヌクレオチドとの距離が著しく接近する。その結果として標識された蛍光色素（Ａ）とクエンチャー物質（Ｑ）の間の距離も著しく接近する（図４参照）。このため溶液中に分散した状態では発生しなかった標識されたクエンチャー物質（Ｑ）と標識された蛍光色素（Ａ）間の相互作用（発光エネルギーの移動現象）が発生するようになる。
【００６７】
５）本発明方法Ｅ（図５及び図６参照）
本発明方法Ａの（２）において、核酸プライマーとして標識核酸プライマーを用いる例である。鋳型核酸の重合を行う過程で、標識ヌクレオチドが核酸重合体に取り込まれる。標識核酸プライマーの蛍光色素（Ａ）或はクエンチャー物質（Ｑ）と標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）或はクエンチャー物質（Ｑ）間の相互作用により蛍光強度が変化する。この変化を測定するか、又はモニタリングすることから鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定する方法である。本方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（６）の１例で、特許請求の範囲の請求項６の発明に相当する。そして、核酸重合系の蛍光強度の増加若しくは減少を測定することになる。この場合、蛍光強度の増加、又は減少は、標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）若しくはクエンチャー物質（Ｑ）と標識核酸プライマーの標識物質の蛍光色素（Ａ）若しくはクエンチャー物質（Ｑ）の組合せに依存する。ドナー色素とアクセプター色素の関係の場合は、本発明方法Ａと同様である。クエンチャー物質と蛍光色素の関係の場合は、本発明方法Ｄと同様である。
【００６８】
前記のように、標識核酸プライマーと蛍光標識ヌクレオチドを用いて本発明方法Ａの（２）のような核酸重合反応を行うと、標識核酸プライマーと蛍光標識ヌクレオチドは核酸重合体に取り込まれる。そして重合体に取り込まれた標識核酸プライマーと蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）或はクエンチャー物質（Ｑ）との距離が著しく接近する（図５、図６参照）。このため溶液中に分散した状態では発生しなかった当該プライマーの蛍光色素（Ａ）或はクエンチャー物質（Ｑ）と標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）或はクエンチャー物質（Ｑ）の間で相互作用が発生する。
【００６９】
本発明で起こり得る物質間相互作用として、（１）標識核酸プライマーの蛍光色素（Ａ）と標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ｂ）間の相互作用、（２）標識核酸プライマーの蛍光色素（Ａ）と標識ヌクレオチドのクエンチャー物質（Ｑ）の間の相互作用、（３）標識核酸プライマーのクエンチャー物質（Ｑ）と標識ヌクレオチドの蛍光色素（Ａ）の間の相互作用の３つのケースが考えられる（図５は（１）のケースを、図６は（３）のケースを図示してある。）。標識核酸プライマーは、公知技術の均一溶液系核酸プローブ（後記した。）とは異なり、鋳型核酸にハイブリダイゼーションした際に、蛍光強度が変化するようにプローブを設計する必要性がない。よって、本方法は実験系の確立が簡便・確実という利点を有する。本方法に用いる好適な蛍光色素は本発明方法Ａと同様である。又、クエンチャー物質は本発明方法Ｄと同様である。
【００７０】
６）本発明方法Ｆ（図７参照）
本発明方法Ａの（２）において、核酸プライマーとして標識核酸プライマーを用い、標識ヌクレオチドの代わりに非標識ヌクレオチドを用いた（即ち、標識ヌクレオチドを用いない）例である。標識核酸プライマーに標識した蛍光色素（Ａ）と、取り込まれたＧ塩基を有する非標識ヌクレオチドのＧ間の相互作用により核酸重合系の蛍光強度が減少する。この蛍光強度の減少を測定するか、又はその減少をモニタリングすることで鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することを特徴とする。この方法は、核酸重合系が前記核酸重合系（７）の１例で、特許請求の範囲の請求項９及び１０に相当する発明である。
【００７１】
即ち、非標識ヌクレオチドがＧを含むものであり、合成された核酸重合体中の蛍光標識核酸プライマーの蛍光色素（Ａ）で標識された塩基から１乃至３塩基離れて（標識された塩基を１と数える。）、新たに重合された（当該プライマーの鎖中の塩基ではないという意味）核酸重合体中に少なくとも１つのＧが存在する場合に起こる（図７参照）。前項で記述した標識核酸プライマーは、公知技術の均一溶液系の核酸プローブとは異なり、鋳型核酸にハイブリダイゼーションした際に、蛍光強度が変化するようにプローブを設計する必要性がない。よって、本発明方法Ｅと同じく、本方法は実験系の確立が簡便・確実という利点を有する。本方法に用いる好適な蛍光色素は本発明方法Ｃと同様である。
【００７２】
７）本発明方法Ｇ（図８参照）
本発明方法Ａ〜Ｆにおいて、蛍光標識ヌクレオチド又はクエンチャー標識ヌクレオチドを用いる代わりに、免疫関連物質、即ち、抗原、抗体及び抗抗体からなる群から選ばれた少なくとも１種で標識されたヌクレオチドモノマー（免疫関連標識ヌクレオチド）を用いた例である。例示して説明すると、前記のヌクレオチドモノマーに標識された抗体には、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合されている、前記の抗原、抗抗体に対応する抗原又は抗抗体が結合する。その結果、蛍光標識ヌクレオチド又はクエンチャー標識ヌクレオチドと同様な作用をする。又、抗原には、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合されている抗体が結合するようになっている。抗抗体には、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合されている抗体が結合するようになっている。その結果、前記免疫関連標識ヌクレオチドは、蛍光標識ヌクレオチド又はクエンチャー標識ヌクレオチドと同様な作用をする。
尚、免疫関連物質、即ち、抗原、抗体及び抗抗体からなる群から選ばれた少なくとも１種でヌクレオチドを標識するには、前記の従来公知の方法により達成出来る。又、前記と同様に委託合成（（株）日本遺伝子研究所（http://www.ngrl.co.jp)を行って入手した方が好適である。
【００７３】
本方法は、前記の通りであるので、免疫関連標識ヌクレオチドは、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合している、前記の免疫関連標識ヌクレオチドの免疫関連物質に対応する免疫関連物質が１つの対を形成する。そしてこの対は、免疫関連標識ヌクレオチドを標識している免疫関連物質は、ヌクレオチドに標識されていなくとも、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合している前記の免疫関連物質と結合し複合体を形成する。それで、この複合体がヌクレオチドを標識している構造になっているとも認識することができる。従って、本発明においては、簡便化のために、この複合体を蛍光色素及びクエンチャー物質と同じものとして扱うことにした。それで、本発明の蛍光色素とは、前記した蛍光色素の他に蛍光色素を含有する前記複合体を含むものと定義する。又、同様にして、本発明のクエンチャー物質とは、前記したクエンチャー物質の他にクエンチャー物質を含有する前記複合体を含むものと定義する。蛍光色素を含有する複合体、即ち免疫関連物質で標識ヌクレオチドを蛍光標識ヌクレオチドの概念の中に入れ、蛍光標識ヌクレオチドと称することにした。クエンチャー物質についても同様にし、クエンチャー物質を含有する免疫関連物質で標識ヌクレオチドをクエンチャー標識ヌクレオチドと称する。又、免疫関連物質で標識した核酸プライマーにおいても前記ヌクレオチドと同様に、蛍光色素を含む免疫関連物質で標識された核酸プライマーを蛍光標識核酸プライマーと、又、クエンチャーを含む免疫関連物質で標識された核酸プライマーをクエンチャー標識核酸プライマーと称することにした。
【００７４】
それで、免疫関連標識ヌクレオチド、免疫関連標識核酸プライマーとは、当該ヌクレオチド、当該プライマーは、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合している、当該ヌクレオチド、当該プライマーの免疫関連物質に対応する免疫関連物質を含むものと定義する。具体的には、当該ヌクレオチド及び／又は当該プライマーと、蛍光色素又はクエンチャー物質が結合している当該免疫関連物質を一緒に核酸重合系に存在せしめて、核酸重合系の蛍光強度を測定することになる。
【００７５】
それで、前記の本発明方法Ａ〜Ｆと同様にして、核酸重合体若しくはその鋳型核酸、又は鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定できる。以上より本方法は、後記する方法を含めて本発明の全てに相当し、核酸重合系の蛍光強度の増加若しくは減少を測定することになる。
【００７６】
前記したように、前述の本発明方法Ａ〜Ｆに示した物質間相互作用の内のいずれかが起こるよう、抗原或は抗体或は抗抗体にてヌクレオチドを標識し、核酸重合反応を行う過程で、核酸重合体にそれらで標識されたヌクレオチドを取り込ませる。図８は、本発明方法Ａで示した蛍光色素間の相互作用を利用している図である。公知技術で示した均一溶液系核酸プローブ（後記に示した。）とは異なり、鋳型核酸にハイブリダイゼーションした際に、蛍光強度が変化するようにプローブを設計する必要性がない。よって、本方法は実験系の確立が簡便・確実という利点を有する。
【００７７】
８）本発明方法Ｈ（図示なし）
本方法は、２つの発明を含む。
ｉ）核酸重合系が前記核酸重合系（３）の１例で、特許請求の範囲の請求項１２〜１５に相当する発明である。鋳型核酸、少なくとも１種の蛍光色素及び／又は少なくとも１種のクエンチャー物質で標識された、少なくとも１種のジデオキシヌクレオチドモノマー（前者を「蛍光標識ジデオキシヌクレオチド」、後者を「クエンチャー標識ジデオキシヌクレオチド」という。両者を総称して「標識ジデオキシヌクレオチド」という。）、及び核酸合成酵素を含有する核酸重合系で核酸重合反応を行い、蛍光強度の変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法である。そして、核酸重合系が、標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含む系である。又、核酸重合系が、非標識核酸プライマーを含む系である。
【００７８】
ii）核酸重合系が前記核酸重合系（７）の１例で、特許請求の範囲の請求項１６に相当する発明である。鋳型核酸、少なくとも１種の蛍光色素及び／又は少なくとも１種のクエンチャー物質で標識されていない、少なくとも１種のジデオキシヌクレオチドモノマー（「非標識ジデオキシヌクレオチド」という。）、標識ヌクレオチド、非標識核酸プライマー、核酸特異的蛍光色素、及び核酸合成酵素を含有する核酸重合系で核酸重合反応を行い、蛍光強度の変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型とする核酸重合体を測定することを特徴とする核酸の測定方法である。上記のｉ）、ii）の発明において、蛍光色素及びクエンチャー物質の概念は、前記の本発明方法Ｇと同様である。
【００７９】
尚、当該方法は、１塩基伸長反応方法と組合せることにより、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析又は分析に好適に利用できる。即ち、核酸プライマーの３’末端塩基が鋳型核酸中の目的の多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異部位の塩基に隣接するように設計してなる核酸プライマーと、鋳型核酸中の目的の多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の塩基に相補する（水素結合出来る。）か若しくは相補しない塩基を有する非標識若しくは標識ジデオキシヌクレオチドを用いて、当該発明の核酸重合反応又は核酸増幅反応を行うと、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の塩基の存在若しくは不存在により、核酸重合系の蛍光強度に差が出る。その差により目的が達成できる。具体的には、実施例５及び実施例６に示した。
【００８０】
９）本発明方法Ｉ（図９参照）
各種核酸合成酵素を用いて、固体表面上に固定化された１種以上の核酸プライマーから鋳型核酸の重合を行うことを特徴とする前述の本発明方法Ａ〜Ｇの何れかに記載の方法である。
【００８１】
前記したように、１種以上の核酸プライマーを固体表面上に固定化し、各種核酸合成酵素により鋳型核酸の重合反応を行う。この際、前述の本発明方法Ａ〜Ｈの内、いずれかの物質間の相互作用が発生するように、核酸プライマー、蛍光標識ヌクレオチド、クエンチャー標識ヌクレオチド、核酸特異的蛍光色素等を用意する。この際に発生する蛍光強度の変化若しくは変化量をモニタリングすることで単に核酸重合体又はその鋳型核酸若しくはそれを鋳型する核酸重合体を測定することが可能となる（図９参照：図中では本発明方法Ａで示した蛍光色素間の相互作用を利用している。）。
【００８２】
本方法は、前記したように、１つの鋳型核酸又は当該鋳型核酸と新たに重合合成された核酸重合体との１つの複合体から観察した場合、新たに重合合成された核酸重合体に複数の蛍光色素を含むようになるので、測定感度が、単数種の蛍光色素の蛍光強度変化に基づく均一溶液系核酸プローブを使用する方法より更に改善される。又、鋳型核酸と非標識若しくは標識核酸プライマー又は新たに重合合成された核酸重合体との複合体に取り込まれた核酸特異的蛍光色素から、標識ヌクレオチドの蛍光色素へのエネルギー移動による蛍光強度の変化に基づく測定方式であるので、測定感度が格段に改善される。しかも、標的遺伝子等を含む１種以上の各種核酸を簡便且つ迅速に同時に測定できるという利点を有する。
【００８３】
尚、前記の本発明方法で得られたデータの解析方法において、核酸重合系のFRET現象におけるドナーとしての役割をもつ蛍光色素若しくは核酸特異的な蛍光色素の蛍光強度値を、アクセプターとしての役割をもつ蛍光色素の蛍光強度値で割るか、又は逆の操作をするとより好ましいデータになる。それで、このデータ処理方法も本発明に含まれる。
【００８４】
本発明方法においては、下記（１）〜（７）の公知の均一溶液系核酸プローブ（鋳型核酸に特異的にハイブリダイズし、蛍光色素又はクエンチャー物質で標識されたオリゴヌクレオチド）、及び公知の核酸測定方法を本発明方法、特に標識核酸プライマーに好適に適用することができる。当該プライマーとして利用される場合は前記した通りである。又、核酸増幅方法に記載した単なるプローブとして利用する場合、核酸合成酵素としてエキソヌクレアーゼを欠いたＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼとリガーゼを用いるのが好適である。均一溶液系核酸プローブが鋳型核酸にハイブリダイズしたとき、本発明の核酸重合体に組み込まれる。又、エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼを用いた場合、分解されてしまう。分解されたヌクレオチドがカイネース等で３リン酸体にされた後、本発明の核酸重合体に組み込まれてしまう。
【００８５】
（１）Morrisonらのプローブ（Morrison et al.,Anal.Biochem.,183:231-244,1989）で代表されるプローブ。
（２）Mergneyらのプローブ（Mergney et al.,Nucleic acid Res.,22:920-928,1994)で代表されるプローブ。
（３）分子ビーコン（molecular beacon)方法（Tyagi et al.,Nature Biotech.,14:303-308,1996;Schofield et al.,Applied and Environ. Microbiol.,63:1143-1147，１９９７）で代表されるプローブ。
（４）Livakらのプローブ（US patent No.5,538,848）で代表されるプローブ。
【００８６】
（５）KURATAらのプローブ（KURATA et al.,Nucleic acids Research,2001,vol.29,No.6 e34）で代表されるプローブ。このプローブは、１本鎖のオリゴヌクレオチドを蛍光色素で標識した均一溶液系核酸プローブであるが、蛍光色素で標識した塩基がＧ又はＣであるか、又は対応核酸の標識塩基に対応する塩基から１乃至３塩基離れて（標識塩基に対応する塩基を１と数える。）Ｇ又はＣが存在する均一溶液系核酸プローブである。
【００８７】
（６）Davisらのプローブ（Davis et al.,Nucleic acids Res.,24:702-706,1996）で代表されるプローブ。
（７）HORNらのプローブ（US Patent Application Publication No.US2001/0009760A1,Pub.Date:Jul.26,2001）で代表されるプローブ。
【００８８】
前記に記載した核酸重合方法が核酸増幅方法である場合について以下に記す。本発明でいう核酸増幅方法とは、インビトロ（in vitro）で核酸を増幅する方法のことをいう。公知、未公知を問わない。例えば、ＰＣＲ方法、ＬＣＲ方法（ligase chain reaction）、ＴＡＳ方法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）方法、ＬＡＭＰ方法、ＮＡＳＲＡ方法、ＲＣＡ方法、ＴＡＭＡ方法、ＵＣＡＮ方法等を全て含めるものとする。
【００８９】
又、このＰＣＲとは、公知の各種のＰＣＲを意味するものである。例えば、リアルタイムモニタリング定量的ＰＣＲ方法、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ-primed ＰＣＲ、Stretch ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、Ａｌｕ配列を利用したＰＣＲ、多重ＰＣＲ、混合プライマーを用いたＰＣＲ、ＰＮＡを用いたＰＣＲ、ＰＣＲにより増幅した核酸について、融解曲線の解析若しくは分析する方法等をも含むものとする。
【００９０】
具体的には、前記した核酸重合系、特に、核酸プライマー若しくは核酸プローブを含む系で、ハイブリダイゼーション反応、核酸重合反応（核酸伸長反応）、変性反応を１サイクルとして従来公知の条件(KURATA et al.,Nucleic acids Research,2001,vol.29,No.6 e34)で核酸増幅反応を行い、各サイクルの蛍光強度若しくは相対蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的に測定することにより、鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数を測定する核酸の測定方法である。そして、各サイクルの蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的に測定することにより、蛍光強度若しくは相対蛍光強度の変化若しくは変化量が観察（目視）され始めるサイクル数Ｃｔ値を求め、当該Ｃｔと標準の鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数の関係から、試料中の鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数を求めることができる。具体的には、実施例４〜１１に記載されている。
【００９１】
前記した均一溶液系核酸プローブを好適に、核酸プライマー（リバース及び／又はフォワードプライマー）として利用できる。この場合、均一溶液系核酸プローブから標識されている蛍光色素及び／又はクエンチャー物質を離脱した非標識の核酸プライマーも好適に利用できる。当該核酸増幅方法で増幅された核酸重合体は少なくとも一種の蛍光色素を含むので、少なくとも一種の測定波長を用いて当該重合体の解離曲線から得られる情報は有用である。
【００９２】
本発明の核酸増幅系は、前記の核酸重合反応のための核酸重合系の｛（１）〜（８）｝、好ましくは｛（６）、（７）及び（８）｝、より好ましくは｛（６）及び（７）｝の何れか１つである。
【００９３】
本発明方法は、又、以下のデータ処理方法も含む。即ち、上記の核酸増幅方法で得られたデータを解析する方法において、鋳型核酸及び／又は核酸合成酵素を含有している核酸重合系の各サイクルの蛍光強度値を、鋳型核酸及び／又は核酸合成酵素が含有していない核酸重合系の各サイクルの蛍光強度値により補正すると、好ましいデータになる。又、核酸重合系のFRET現象におけるドナーとしての役割をもつ蛍光色素若しくは核酸特異的な蛍光色素の、経時的に測定された蛍光強度値を、アクセプターとしての役割をもつ蛍光色素の、経時的に測定された蛍光強度値で割るか、又は逆の操作をして補正したデータは好適なものになる。このような補正をする演算処理過程（以下、補正演算処理過程という。）を有する手順を記録した電子記録媒体も本発明である。測定及び／又はデーター解析装置において当該電子記録媒体を装備したもの、又、当該装置を用いた測定も当然本発明の範囲内である。
【００９４】
本発明の核酸の重合反応を利用したリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られるデータを解析する方法は具体的には以下の通りである。リアルタイム定量的ＰＣＲ方法は、現在、ＰＣＲを行わせる反応装置、蛍光色素の発光を検出する装置、ユーザーインターフェース、即ち、データ解析方法の各手順をプログラム化して、それを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体（別称：Sequence Detection Software System）、及びそれらを制御し、データ解析するコンピュータから構成される装置で、リアルタイムで測定されている。それで、本発明の測定もこのような装置で行われるのがよい。
【００９５】
尚、ＰＣＲ反応装置は、鋳型核酸の熱変性反応、アニーリング反応、核酸の伸長反応を繰り返し行う装置（例えば、温度を９５℃、６０℃、７２℃に繰り返し行うことができる。）である。又、検出システムは、蛍光励起用アルゴンレーザー、スペクトログラフならびにＣＣＤカメラからなっている。更に、データ解析方法の各手順をプログラム化して、それを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体は、コンピュータにインストールされて使用され、コンピュータを介して上記のシステムを制御し、検出システムから出力されたデータを解析処理するプログラムを記録したものである。
【００９６】
コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されているデータ解析用プログラムは、サイクルごとの蛍光強度を測定する過程、測定された蛍光強度を、サイクルの関数として、即ち、ＰＣＲのamplification plotとしてコンピュータのディスプレー上に表示する過程、蛍光強度若しくは相対蛍光強度の変化若しくは変化量が検出され始めるＰＣＲサイクル数（threshold cycle number：Ｃｔ）を算出する過程、Ｃｔ値から試料核酸のコピー数を求める検量線を作成する過程、前記各過程のデータ、プロット値を印字する過程からなっている。ＰＣＲが指数的に進行している場合、ＰＣＲ開始時の測定対象の核酸のコピー数のＬｏｇ値と、Ｃｔとの間には直線関係が成り立つ。従って、既知量のコピー数を用いて検量線を作成し、未知コピー数の鋳型核酸を含有するサンプルのＣｔを検出することにより、鋳型核酸のＰＣＲ開始時の初期コピー数を計算できる。
【００９７】
本発明方法を用いる多型(polymorphism)及び／又は変異(mutation)を測定若しくは解析する方法について、以下に記す。即ち、核酸重合方法及び核酸増幅方法の核酸重合系｛（１）〜（９）｝、好ましくは｛（６）、（７）及び（８）｝、より好ましくは｛（６）及び（７）｝の何れか１つで、核酸重合反応又は核酸増幅反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的若しくは非経時的に測定し、その測定値から多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析することを特徴とする核酸の測定方法である。好適には、当該方法を配列特異的伸長方法と組合せることがよい。具体的には、実施例７〜実施例１０に示した。
【００９８】
この場合、非標識若しくは標識核酸プライマーを、その３’末端塩基若しくは３’末端から２番目の塩基（３’末端塩基を１と数える。）が、鋳型核酸の検出目的の多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の塩基に相補しない（相互の塩基が水素結合できる。）よう（他の塩基は相補する。）に作製してなる、少なくとも一種の非標識若しくは標識核酸プライマーを含有する核酸重合系で核酸重合若しくは核酸増幅反応を行うのが好適である。当該プライマーを含有する核酸重合系では、当該プライマーを前駆体として、核酸重合若しくは核酸増幅反応が進まない場合は、核酸重合系の蛍光強度の変化が起きない。逆に進む場合は、蛍光強度の変化が起きる。尚、反応温度は、一般的には、当該プライマーのＴＭ値以上変性反応温度（例えば、９５℃）未満であるのが好適である。又、当該プライマーの３’末端から３番目の塩基を、鋳型核酸の塩基に相補しない塩基にし、鋳型核酸と当該プライマーとの間で人工的なミスマッチを形成させることで、非特異的な伸長反応が抑えられる。即ち、より正確な多型の判定が可能になる。この場合の反応温度は、当該プライマーのＴＭ値より５℃程低い温度から変性反応温度未満であることが好適である。尚、本発明において、鋳型核酸の多型若しくは変異の塩基とは相補しない塩基を有する当該プライマーをＡ型プライマーと称した場合に、相補する塩基を有する当該プライマーをＢ型プライマーと称することにする。この測定方法において、Ａ型プライマーとＢ型プライマーを併用することにより確かなデータが得られる。
【００９９】
具体的には、以下の方法で行う。
以下の核酸重合系で核酸重合反応若しくは核酸増幅反応を行う。尚、詳しくは実施例７及び８に示した。
１）前記した核酸重合若しくは核酸増幅方法の核酸重合系｛（１）〜（８）｝、好ましくは｛（６）、（７）及び（８）｝、より好ましくは｛（６）及び（７）｝の何れか１つのものである。この場合、好適には、標識又は非標識核酸プライマーとしてＡ型プライマーを少なくとも１種を含有する。
２）前記１）の核酸重合系が、前記同様にＢ型プライマーを少なくとも１種を含有する。
３）前記１）の核酸重合系が、前記同様にＡ型プライマーを少なくとも１種、及びＢ型プライマーを少なくとも１種を含有する（但し、同種の蛍光色素で標識されたＡ型プライマー及びＢ型プライマーを除く。）。
【０１００】
尚、同種の蛍光色素で標識されたＡ型プライマー及びＢ型プライマーを用いた場合は、上記（１）と（２）の反応系で、核酸重合反応、又は核酸増幅反応を行い、経時的若しくは非経時的に蛍光強度の変化若しくは変化量を測定して、その測定値を比較検討することにより、多型（ＳＮＰを含む。）若しくは変異を測定できる。異種の蛍光色素で標識されたＡ型プライマー及びＢ型プライマーを用いた場合、上記（３）の核酸重合系で、核酸重合反応若しくは核酸増幅反応を好適に行うことができる。尚、この場合でも、上記（１）と（２）の核酸重合系で、核酸重合反応若しくは核酸増幅反応を好適に行うことができる。
尚、上記のＡ型若しくはＢ型プライマーの替わりに、鋳型核酸中の目的の多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の塩基に相補する（水素結合出来る。）か又は相補しない塩基を有する非標識若しくは標識ジデオキシヌクレオチドの少なくとも一種を用いることでも、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析することが達成出来ることは、前記した通りである。
【０１０１】
そして、Ａ型プライマーを少なくとも１種及び／又はＢ型プライマーを少なくとも１種、鋳型核酸、核酸合成酵素、非標識ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、免疫関連標識ヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチド及び非標識ジデオキシヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含有することを特徴とする多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析するための反応液、測定キット類又はデバイス類である。
【０１０２】
本発明の核酸の測定方法は、医学、法医学、人類学、古代生物学、生物学、遺伝子工学、分子生物学、農学、植物育種学等の各種の分野で利用できる。又、複合微生物系、共生微生物系といわれ、色々の種類の微生物が混在するか、若しくは少なくとも１種類の微生物が他の動物、植物由来の細胞と共に混在していて相互に単離できない微生物系等に好適に利用できる。又、本発明は各種の核酸測定方法、例えば、ＦＩＳＨ方法、ＬＣＲ方法、ＳＤ方法、ＴＡＳ方法等に好適に適用できる。
本発明は、特許請求の範囲の請求項１〜１８の発明を開示するが、その他に以下に記載する幾つかの好ましい実施形態を開示する。
【０１０３】
［１］下記の何れか１つの核酸重合系で、核酸重合反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の変化若しくは変化量を測定し、その測定値から多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析することを特徴とする核酸の測定方法。
（１）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む。
（２）前記（１）において、非標識ヌクレオチドを含む。
（３）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ジデオキシヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む。
（４）上記（３）において、標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含む。
【０１０４】
（５）鋳型核酸、非標識ジデオキシヌクレオチド、標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含有する。
（６）上記（１）〜（５）において更に標識核酸プライマー又は非標識核酸プライマーを含む。
（７）鋳型核酸、非標識ヌクレオチド、標識核酸プライマー及び核酸合成酵素を含む。
（８）上記（１）〜（７）の何れか１つにおいて核酸特異的蛍光色素を含む。
【０１０５】
［２］下記の何れか１つの核酸重合系で、ハイブリダイゼーション反応（アニーリング反応）、核酸重合反応（核酸伸長反応）、変性反応を１サイクルとして核酸増幅反応を行い、各サイクルの蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的に測定することにより、鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
（１）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む。
（２）前記（１）において、非標識ヌクレオチドを含む。
（３）鋳型核酸、少なくとも１種の標識ジデオキシヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含む。
（４）上記（３）において、標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含む。
【０１０６】
（５）鋳型核酸、非標識ジデオキシヌクレオチド、標識ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を含有する。
（６）上記（１）〜（５）において更に標識核酸プライマー又は非標識核酸プライマーを含む。
（７）鋳型核酸、非標識ヌクレオチド、標識核酸プライマー及び核酸合成酵素を含む。
（８）上記（１）〜（７）の何れか１つにおいて核酸特異的蛍光色素を含む。
【０１０７】
［３］各サイクルの蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的に測定することにより、蛍光強度の変化若しくは変化量が観察され始めるサイクル数Ｃｔ値を求め、当該Ｃｔと鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数の関係から、鋳型核酸の核酸増幅前の濃度若しくはコピー数を測定する前記［２］に記載の核酸の測定方法。
［４］前記［２］に記載の核酸重合系で、核酸増幅反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の変化若しくは変化量を経時的に測定して、その測定値から、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析する前記［２］に記載の核酸の測定方法。
［５］非標識若しくは標識核酸プライマーの３’末端塩基若しくは３’末端から２番目の塩基（３’末端塩基を１と数える。）が鋳型核酸の検出目的の多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の塩基に対応する非標識若しくは標識核酸プライマーを含有する核酸重合系で核酸重合若しくは核酸増幅反応を行い、核酸重合系の蛍光強度の変化若しくは変化量を測定し、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析する前記［１］又は［４］に記載の核酸の測定方法。
【０１０８】
［６］下記の核酸重合系で、核酸重合反応、又は核酸増幅を行い、得られるデータを比較検討することにより、多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析する前記［１］又は［４］に記載の核酸の測定方法。
１）前記した核酸重合系｛（１）〜（８）｝の何れか１つのものが、非標識若しくは標識核酸プライマーの、３’末端塩基若しくは３’末端から２番目の塩基（３’末端塩基を１と数える。）が、対応する鋳型核酸の塩基とは相補しない塩基を有するもの（Ａ型プライマーと称する。）の少なくとも１種を含有する。
２）前記１）の核酸重合系が、非標識若しくは標識核酸プライマーの、３’末端塩基若しくは３’末端から２番目の塩基（３’末端塩基を１と数える。）が、対応する鋳型核酸の塩基とは相補する塩基を有するもの（Ｂ型プライマーと称する。）の少なくとも１種を含有する。
３）前記１）の核酸重合系が、Ａ型プライマーの少なくとも１種、Ｂ型プライマーの少なくとも１種を含有する（但し、同種の蛍光色素で標識されたＡ型プライマー及びＢ型プライマーを除く。）。
【０１０９】
［７］前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［３］の何れか１項で得られたデータを解析する方法において、核酸重合系のFRET現象におけるドナーとしての役割をもつ蛍光色素若しくは核酸特異的蛍光色素の、経時的若しくは非経時的に測定された蛍光強度値を、アクセプターとしての役割をもつ蛍光色素の蛍光強度値で割るか、又は逆の操作をすることを特徴とするデータ処理若しくは解析方法。
［８］前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［３］の何れか１項に記載の方法で得られたデータを解析する方法において、鋳型核酸若しくは核酸合成酵素を含有している核酸重合系の各サイクルの蛍光強度値を、鋳型核酸若しくは核酸合成酵素が含有していない核酸重合系の各サイクルの蛍光強度値により補正することを特徴とするデータ処理若しくは解析方法。
【０１１０】
［９］Ａ型プライマーの少なくとも１種及び／又はＢ型プライマーの少なくとも１種、鋳型核酸、核酸合成酵素、非標識ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチド及び非標識ジデオキシヌクレオチドからなる群から選ばれた少なくとも１種を含有することを特徴とする多型（ＳＮＰを含む。）及び／又は変異の測定、解析、又は分析するための反応液、測定キット類又はデバイス類。
［１０］核酸合成酵素が、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたVent(exo-)DNA Polymerase（サーモコッカス・リトラリス由来）、Tgo(exo-)DNA Polymerase、ThermoSequenase DNA Polymerase(Armersham社製）、AmpliTagGold、Ｔ７ Sequenase DNA Polymeraseである前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［４］のいずれか１項に記載の核酸の測定方法。
【０１１１】
［１１］核酸増幅方法が、ＰＣＲ方法、ＩＣＡＮ方法、ＬＡＭＰ方法、ＮＡＳＢＡ方法、ＲＣＡ方法、ＴＡＭＡ方法、ＬＣＲ方法のいずれかの方法である前記［４］に記載の核酸の測定方法。
［１２］ＰＣＲ方法がリアルタイム定量的ＰＣＲ法である前記［１１］の核酸の測定方法。
［１３］前記請求項５に記載の標識核酸プライマーの少なくとも１種で標識された核酸プライマーを固体表面上に固定化させて、前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［２］の何れか１項に記載の方法を実施できるようにしたことを特徴するデバイス（ＤＮＡチップ）類。
［１４］前記のデバイス（ＤＮＡチップ）類を用いて鋳型核酸の核酸重合反応を行う前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［２］のいずれか１項に記載の核酸の測定方法。
【０１１２】
［１５］前記請求項１、７、９、１２、１６、前記［１］、［２］、［４］のいずれか１項に記載の方法で鋳型核酸又はそれを鋳型とする核酸重合体若しくは核酸増幅体を測定するための、温度を変化させながら蛍光測定可能な装置で、且つ前記［７］、［８］に記載のデータ処理若しくは解析方法の過程を、コンピュータに実行させるための手順をプログラムとして記録したコンピュータ読取可能な記録媒体を組み込んだことを特徴とする測定装置。
［１６］前記請求項１、７、９、１２、前記［２］の何れか１項に記載の方法を用いて、均一溶液系核酸プローブの任意の位置の塩基を蛍光色素で標識する方法。
【０１１３】
【実施例】
次に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。以下の実施例においては、以下のように用語を短略して用いた。
１）「鋳型核酸」を「鋳型」という場合がある。
２）「核酸プライマー」を「プライマー」とした。
３）dNTSs、dATP、dGTP、dTTP、dUTPは現在分子で生物学等で用いられている意味と同じである。
本実施例で用いた、鋳型、標識又は非標識ヌクレオチド及び標識又は非標識プライマーは特別の記載がない限り、委託合成（（株）日本遺伝子研究所（http://www.ngrl.co.jp)を行って入手した。
【０１１４】
本実施例にて使用したプライマー及び塩基配列は以下のものである。尚、塩基配列は右が３’末端で左が５’末端である。
（合成１本鎖ＤＮＡの塩基配列）
プライマー１：CAGACTCGACAGTGTAGACCCG
プライマー２：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
プライマー３：TTGCATGTGTTAGGCCTG
【０１１５】
又、鋳型１〜９は次の塩基配列を有していた。塩基配列は右が３’側で左が５’側である。
鋳型１：
ACACACACACACACTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型２：
TATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型３：
TTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型４：
TTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型５：
TTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
【０１１６】
鋳型６：
TTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型７：
TTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型８：
TTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型９：
TTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型１０：
GCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
鋳型１１：
GCTCCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
【０１１７】
実施例１（本発明方法Ｂ（２））
２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間のFRET現象を利用して鋳型核酸を測定する。
【０１１８】
Ａ）各種方法
１）鋳型ＤＮＡとプライマーの合成
本実施例に鋳型として使用した１本鎖ＤＮＡ（鋳型１〜９）及び２２塩基のプライマー（プライマー１）はＤＮＡ合成機ＡＢＩ３９４（Perkin Elmer社製、米国）で調製した。鋳型１から９はプライマー１と相補的な共通の配列を３´側に有する。又、これらの鋳型は伸長反応の過程で標識されたｄＵＴＰが７つ取り込まれるように設計してある。以下に鋳型１本鎖ＤＮＡとプライマー１との組み合わせの特徴を示す：
・鋳型１とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが１個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型２とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが３個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型３とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが５個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
【０１１９】
・鋳型４とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが７個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型５とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが８個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型６とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが１０個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型７とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが１１個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
・鋳型８とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチドが１３個取り込まれるごとに１つの蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
【０１２０】
２）重合（増幅）反応条件
ＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたサーモコッカス・リトラリス由来のVent(exo-)DNA Polymerase（NEW ENGLAND BioLabs,Beverly，MA）を用いた。蛍光標識ヌクレオチドにCyanine 5-dUTP(650nm/668nm)、Lissamine^TM-5-dUTP(570nm/588nm)、Texas Red(r)-5-dUTP(593nm/612nm)（カッコ内は最大吸収波長／最大蛍光波長、PerkinElmer米国）を用いた。ＤＮＡポリメラーゼにより取り込まれた標識ヌクレオチドへFRET現象を起こさせるためのドナー色素に、２本鎖核酸に特異的に結合し４９７ｎｍに最大励起波長を持ち、５２０ｎｍ付近で最大の蛍光を発するSYBR(r)Green I Nucleic Acid Gel Stain(Molecular probes、米国）を用いた。
【０１２１】
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH₄)₂SO₄ ・2.5mM MgSO₄
・0.1%Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・200nM dATP ・200nM dGTP
・200nM dCTP ・200nM Cyanine5-dUTP若しくはLissamine^TM-5-dUTP若しくはTexas Red(r)-5-dUTP ・1×SYBR(r)Green I ・2nM プライマー
・20nM 合成１本鎖鋳型DNA ・0.1 U（単位） Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１２２】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃で１５秒熱変性させた後、６５℃、１５分間保温した。蛍光の検出にはライトサイクラー^TMシステム（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、ドイツ）を用いた。その際、該システムにあるＦ１（５３０ｎｍ）をSYBR(r)Green Iの検出に、Ｆ２（６４０ｎｍ）をLissamine^TM-5-dUTP若しくはTexas Red(r)-5-dUTPの検出、Ｆ３（７１０ｎｍ）をCyanine 5-dUTPの検出に用いた。又、励起強度は７５％に固定した。
【０１２３】
３）実施した実験系の内容
・モデル１〜９：プライマー１と鋳型１〜９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはCyanine 5-dUTPを使用した。
・モデル１０：プライマー１と鋳型９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはCyanine 5-dUTPを使用しVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル１１〜１９：プライマー１と鋳型１〜９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはLissamine^TM-5-dUTPを使用しVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル２０：プライマー１と鋳型９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはLissamine^TM-5-dUTPを使用しVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル２１〜２９：プライマー１と鋳型１〜９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはTexas Red(r)-5-dUTPを使用した。
・モデル３０：プライマー１と鋳型９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドはTexas Red(r)-5-dUTPを使用しVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル３１〜３９：プライマー１と鋳型１〜９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドは使用しないかわりにdTTPを用いる。
・モデル４０：プライマー１と鋳型９の組み合わせ。蛍光標識ヌクレオチドは使用しないかわりにdTTPを用いる。Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
【０１２４】
結果を図１０〜１６に示した。モデル１〜１０のＦ１蛍光強度変化を図１０に、Ｆ３蛍光強度変化を図１１に示す。モデル１１〜２０のＦ１蛍光強度変化を図１２に、Ｆ２蛍光強度変化を図１３に示す。モデル２１〜３０のＦ１蛍光強度変化を図１４、Ｆ２蛍光強度変化を図１５に示す。モデル３１〜４０のＦ１蛍光強度変化を図１６に示す。
【０１２５】
その結果、モデル１〜９ではＦ１の蛍光が最大で約４０％減少し、Ｆ３の蛍光が最大で約４倍増加した。酵素非添加のモデル１０の反応ではＦ１は若干蛍光強度が減少したものの、Ｆ３の蛍光強度に変化はみられなかった（図１０、１１）。モデル１１〜１９はＦ１の蛍光強度が最大で約４０％減少し、Ｆ２の蛍光強度が最大で約２．５倍増加した。酵素非添加のモデル２０のＦ２の蛍光強度は変化しなかった（図１２、１３）。モデル２１〜２９はＦ１の蛍光強度が最大で約４０％減少し、Ｆ２の蛍光強度が最大で約８倍増加した。酵素非添加のモデル３０ではＦ２の蛍光強度に変化はなかった（図１４、１５）。SYBR(r)Green Iのみのモデル３１〜３９ではＦ１の蛍光強度が最大で３倍増加した（図１６）。
【０１２６】
このように、２本鎖核酸特異的蛍光色素（今回はSYBR(r)Green I）と蛍光標識ヌクレオチドとの間にエネルギー移動現象が観察され、鋳型核酸を測定することができた。即ち、ドナーとなる２本鎖核酸特異的蛍光色素がアクセプターとなる各蛍光標識ヌクレオチドにエネルギーを供与したことで、ドナーの蛍光強度（Ｆ１）が減少し、アクセプターの蛍光強度（Ｆ２若しくはＦ３）が増加した。酵素を入れない系では蛍光強度値の変化はみられなかった。又、蛍光標識ヌクレオチドを入れないSYBR(r)Green Iだけの系では、エネルギー移動は起こらないためにSYBR(r)Green Iの蛍光強度（Ｆ１）のみが増加した。この手法では、エネルギー移動現象におけるドナー側の蛍光強度の減少、又、アクセプター側の蛍光強度の増加のどちらを測定しても鋳型核酸を測定することが可能であった。
【０１２７】
実施例２（本発明方法Ａ）
蛍光標識ヌクレオチド同士のエネルギー移動現象を利用して鋳型核酸を測定する。
１）鋳型ＤＮＡとプライマーの合成
実施例１で使用したプライマーならびに鋳型１本鎖ＤＮＡを用いた。以下に鋳型１本鎖ＤＮＡとプライマー１との組み合わせの特徴を示す。
・鋳型１とプライマー１との組み合わせ：蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型２とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド１個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型３とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド２個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
【０１２８】
・鋳型４とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド３個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型５とプライマー１との組み合わせ：ＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが取り込まれた後、非標識ヌクレオチド３個が取り込まれる。次に、蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。非標識ヌクレオチド４個が取り込まれる。この繰り返しである。非標識ヌクレオチド４個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型６とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド４個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型８とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド５個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
・鋳型９とプライマー１との組み合わせ：非標識ヌクレオチド６個が取り込まれるごとに、蛍光標識ヌクレオチドとＦＩＴＣ標識ヌクレオチドが交互に１つずつ取り込まれる。
【０１２９】
２）重合（増幅）反応条件
蛍光標識ヌクレオチドには、実施例１と同様の蛍光標識ヌクレオチドとしてCyanine 5-dUTP、Lissamine^TM-5-dUTP、Texas Red(r)-5-dUTPを用いた。ＦＩＴＣ標識ヌクレオチドはFITC-dGTP（PerkinElmer、米国）を用いた。
【０１３０】
尚、反応液を以下のように調製した。
・20mM TrisHCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH₄)₂SO₄ ・2.5mM MgSO₄
・0.1% Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・200nM FITC-dGTP（ドナー色素）
・200nM dCTP ・200nM dATP ・200nM Cyanine 5-dUTP若しくはLissamine^TM-5-dUTP若しくはTexas Red(r)-5-dUTP (アクセプター色素） ・2nM プライマー
・20nM 合成１本鎖鋳型DNA ・0.1 U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１３１】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃で１５秒熱変性させた後、６５℃、１５分間保温した。蛍光の検出にはライトサイクラー^TMシステムを用いた。検出はＦ１、Ｆ２、Ｆ３を用い、励起強度は７５％に固定した。
【０１３２】
３）実施した実験系の内容
・モデル１〜７：プライマー１と鋳型１、プライマー１と鋳型２、プライマー１と鋳型３、プライマー１と鋳型４、プライマー１と鋳型６、プライマー１と鋳型８、プライマー１と鋳型９の組み合わせで、Cyanine 5-dUTPを用いる。
・モデル８：プライマー１と鋳型６を使用し、蛍光標識ヌクレオチドにCyanine 5-dUTPを用い、Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル９〜１５：プライマー１と鋳型１、プライマー１と鋳型２、プライマー１と鋳型３、プライマー１と鋳型４、プライマー１と鋳型６、プライマー１と鋳型８、プライマー１と鋳型９の組み合わせで、Lissamine^TM-5-dUTPを用いる。
【０１３３】
・モデル１６：プライマー１と鋳型６を使用し、蛍光標識ヌクレオチドにLissamine^TM-5-dUTPを用い、Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
・モデル１７〜２３：プライマー１と鋳型１、プライマー１と鋳型２、プライマー１と鋳型３、プライマー１と鋳型４、プライマー１と鋳型６。プライマー１と鋳型８、プライマー１と鋳型９の組み合わせで、Texas Red(r)-5-dUTPを用いる。
・モデル２４：プライマー１と鋳型６を使用し、蛍光標識ヌクレオチドにRed(r)-5-dUTPを用い、Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
【０１３４】
結果を図１７〜２２に示した。モデル１〜８のＦ１の蛍光強度変化を図１７に、Ｆ３の蛍光強度変化を図１８に示す。モデル９〜１６のＦ１の蛍光強度変化を図１９に、Ｆ２の蛍光強度変化を図２０に示す。モデル１７〜２４のＦ１の蛍光強度変化を図２１、Ｆ２の蛍光強度変化を図２２に示す。
【０１３５】
その結果、モデル１〜７はＦ１の蛍光強度が最大で約５０％減少し、Ｆ３の蛍光が最大で約５倍増加した。酵素非添加のモデル８の反応では蛍光変化はみられなかった（図１７、１８）。モデル９〜１５はＦ１の蛍光強度が最大で６０％減少し、Ｆ２の蛍光強度が最大で約２．５倍増加した。酵素非添加のモデル１６の蛍光強度は変化しなかった（図１９、２０）。モデル１７〜２３はＦ１の蛍光強度が最大で５０％以上減少し、Ｆ２の蛍光強度が最大で約４．５倍増加した。酵素非添加のモデル２４では変化しなかった（図２１、２２）。
【０１３６】
以上の結果より、ＤＮＡポリメラーゼにより合成された蛍光標識ヌクレオチド同士のエネルギー移動現象によって蛍光強度値の変化から鋳型核酸を測定することができた。即ち、ドナー蛍光色素であるＦＩＴＣ標識ヌクレオチドの蛍光強度（Ｆ１）が減少し、アクセプター蛍光色素となるCyanine5,Lissamine^TM、Texas Red(r)標識ヌクレオチドの蛍光強度（Ｆ２若しくはＦ３）が増加した。酵素を入れない系では蛍光強度の変化はみられなかった。実施例１と同様、ドナー蛍光色素側の蛍光強度の減少、又、アクセプター蛍光色素側の蛍光強度の増加のどちらを測定しても鋳型核酸を測定することが可能であった。よって、アクセプター蛍光色素の蛍光強度値／ドナー蛍光色素の蛍光強度値を求めることで、より高いＳ／Ｎ比を得ることができ、感度の良い鋳型核酸測定法であることがわかった。本結果より、均一溶液系核酸プローブを使用しないで、簡便且つ高感度に鋳型核酸を測定可能であることが示された。
【０１３７】
実施例３（本発明方法Ａ（２））
ＦＩＴＣ標識ヌクレオチドとＣｙ５標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ
１）鋳型の合成
鋳型はPseudomonas fluorescens DSM 50108(PF)16SリボゾーマルＤＮＡの１４００ｂｐのＤＮＡ断片を使用した。該鋳型は以下のようにして調製した。プライマー２、３を使用し、ＰＦゲノムを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。該増幅断片はマイクロコンＰＣＲ（ｒ）（ミリポア社、米国）で精製後、濃度を測定しコピー数に換算した。
【０１３８】
２）ＰＣＲ反応条件
反応液は以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH₄)₂SO₄ ・2.5 mM MgSO₄
・0.1% Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・20μM プライマー対
・最終濃度１×１０⁹〜１×１０⁵コピーの鋳型DNA
・0.2 U Vent(exo-)DNA Polymerase ・6μM dATP、dCTP、dGTP混合物
・2.5μM dTTP ・0.25μM Cy5 5-dUTP ・0.25μM FITC-5-dUTP
【０１３９】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、３０秒間熱変性させた後、変性反応９５℃、１０秒、アニーリング反応５６℃、１０秒、伸長反応７２℃、７０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。蛍光の検出にはライトサイクラー^TMシステム用いた。検出にはＦ１及びＦ３を用い、励起強度は７５％に固定した。
【０１４０】
前記に示した条件でＰＣＲを行い、各サイクルの蛍光強度を実測した。その結果を図２３、２４に示す。即ち、各コピー数の鋳型リボゾーマルＤＮＡについて、各サイクルのアニーリング反応時の蛍光強度を測定し、印字したものである。６サイクル目あたりからＦ１の蛍光強度が減少し、Ｆ３の蛍光強度が増加しているのが観察される。更にＦ１（ドナー蛍光色素）の蛍光強度の減少、Ｆ３（アクセプター蛍光色素）の蛍光強度の増加はコピー数が多い順に起こることがわかる。ここで、鋳型ＤＮＡが添加されていない０コピーのブランクでも、サイクル数を重ねるごとにＦ１蛍光強度が減少している様子が観察される。そこで、この点について蛍光強度値を補正した。即ち、各サイクルのＦ１蛍光強度値を同じサイクル数でのブランク蛍光強度値で割った。
Ｆｎ＝ｆｎ（５６℃）／ｆ’ｎ（５６℃）
但し、Ｆｎ＝各サイクルにおける蛍光強度値の補正値、ｆｎ（５６℃）＝各サイクルにおけるサンプルの５６℃の蛍光強度値、ｆ’ｎ（５６℃）＝各サイクルにおけるブランクの５６℃における蛍光強度値
【０１４１】
又、鋳型リボゾーマルＤＮＡの各コピー数について、初期のサイクル数の蛍光強度値が２様ではないことがわかる。そこで、この点についても蛍光強度値を補正した。即ち、５サイクル目の蛍光強度値を１として各サイクルの蛍光強度値を換算した。
Ｃｎ＝Ｆｎ（５６℃）／Ｆ５（５６℃）
但し、Ｃｎ＝各サイクルにおける蛍光強度値の換算値、Ｆｎ（５６℃）＝各サイクルの５６℃の蛍光強度値、Ｆ５（５６℃）＝５サイクル目の５６℃における蛍光強度値。
以上２点の補正方法は、アニーリング反応後（ここでは５６℃）、若しくは伸長反応後（７２℃）のどちらの蛍光強度値を用いても構わない。
【０１４２】
この方法で処理すると、５サイクル目の蛍光強度値を１として各サイクルの蛍光強度を換算し、その換算値を対応するサイクル数に対してプロットした図となる。前記の過程で処理したデータを図２５、図２６に示す。スレッシュホールド値を設定し、その値に達したサイクル数をＸ軸に、鋳型リボゾーマルDNAの反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットし、検量線を描かせた。実際にはＹ軸がＦ１蛍光強度の時のスレッシュホールド値を０．８５、Ｙ軸がＦ３蛍光強度の時のスレッシュホールド値を１．５とした。これらの過程で処理して求めた相関係数（Ｒ２）は各々０．９９６５（図２７）、０．９９３１（図２８）であった。
【０１４３】
２種類の蛍光標識ヌクレオチドを含んだｄＮＴＰを基質としてＰＣＲを行うと、ＤＮＡポリメラーゼの作用により産物に２種類の蛍光標識ヌクレオチドが標識される。このことを利用し、１分子中に標識された２種類の蛍光標識ヌクレオチド同士のエネルギー移動現象を利用したリアルタイム定量的ＰＣＲを行った。初期とプラトー期の蛍光強度値を比較すると、ドナーの蛍光強度値（ここではＦ１）は約５０％減少、アクセプターの蛍光強度（ここではＦ３）は約３倍に増加した。この蛍光強度値を用い、更にＰＣＲのサイクル数を重ねることで起こる蛍光色素の減退と初期の蛍光強度値のずれを補正することで、正確な鋳型核酸の定量が可能であった。この手法では、ドナー及びアクセプターのどちらの蛍光強度値の変化を測定しても定量可能であった。更にＦ３をＦ１で割ることで、ＳＮ比を高くすることも可能である。
【０１４４】
実施例４
２本鎖核酸特異的蛍光色素とCy5標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ
鋳型とプライマーは実施例５と同様のものを使用した。以下に反応液組成を示す。
・20mM Tris-HCl(pH 8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH₄)₂SO₄ ・2.5mM MgSO₄
・0.1% Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・20μM プライマー対
・最終濃度１×１０⁹〜１×１０⁵コピーの鋳型ＤＮＡ
・0.2 U Vent(exo-)DNA Polymerase ・4μM dATP、dCTP、dGTP混合物
・1μM dTTP ・1μM Cy5-5-dUTP ・1×SYBR(r)Green I
【０１４５】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、３０秒間熱変性させた後、９５℃、１０秒、５６℃、１０秒、７２℃、７０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。蛍光の検出にはライトサイクラー^TMシステムを用いた。検出にはＦ３を用い、励起強度は７５％に固定した。結果を図２９に示す。実施例５と同様の方法で蛍光強度値を補正した。スレッシュホールド値を２でとった場合の相関係数（Ｒ２）は０．９９８４であった（図３０）。
【０１４６】
１種類の蛍光標識ヌクレオチドを含むｄＮＴＰを基質としてＰＣＲを行うと、ＤＮＡポリメラーゼの作用により産物に１種類の蛍光標識ヌクレオチドが標識される。この時、ある種の鋳型核酸に結合する蛍光色素を混ぜておき、この蛍光色素と分子中の蛍光標識ヌクレオチドとの間のエネルギー移動現象を利用してリアルタイム定量的ＰＣＲを行った。初期とプラトー期の蛍光強度値を比較すると、アクセプターの蛍光強度（ここではＦ３）は約４倍に増加した。この蛍光強度値と、更にＰＣＲのサイクル数を重ねることで起こる蛍光色素の蛍光強度の減退と初期の蛍光強度値のずれを補正することで、鋳型核酸の測定（定量）が可能であった。
【０１４７】
実施例５
標識ヌクレオチドを用いた１塩基伸長反応によるＳＮＰの測定
１）鋳型ＤＮＡとプライマーの合成
本実施例に鋳型として使用した２６塩基の１本鎖ＤＮＡ（鋳型１０、１１）ＤＮＡ合成機ABI394で調製した。鋳型１０と１１は５’末端から数えて４塩基目がそれぞれＴ、Ｃであり、その他の配列は同じである。このように、鋳型１０と１１は特定の部位がＴ若しくはＣであるＳＮＰ（single nucleotide polymorphism；１塩基多型、以下ＳＮＰと略す）を含んだＤＮＡ断片と考えることができる。これらの鋳型は３’側にプライマー１と相補的な配列を持ち、該プライマーとハイブリダイズした際、プライマーの３’末端塩基が鋳型のSNP部位の塩基に隣接するように設計してある。尚、蛍光標識ヌクレオチドはTexas Red(r)-5-ddATP(PerkinElmer 米国）、Cy5TM-5-ddGTP(Amersham Biosciences）を用いた。又、核酸重合系にSYBR(r)Green 1を添加した。
【０１４８】
２）１塩基伸長反応
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH 8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH₄)₂SO₄ ・2.5mM MgSO₄
・0.1% Triton X-100 ・0.25mg/ml BSA ・200nM Texas Red(r)-5-ddATP
・200nM Cyanine5TM-5-ddGTP ・1×SYBR(r)Green I ・20nM プライマー
・200nM 合成１本鎖鋳型DNA ・0.1 U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１４９】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１５秒間熱変性させた後、６５℃で１０分間保温した。蛍光の検出には蛍光測定機器パーキンエルマーＬＳ−５０Ｂを用いた。励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長６１０ｎｍ、６７０ｎｍで測定し、スリット幅を１０ｎｍにセットした。
【０１５０】
３）実施した実験系の内容
・モデル１：プライマー１と鋳型１０の組み合わせでVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない（ブランクコントロール）
・モデル２：プライマー１と鋳型１０の組み合わせ（鋳型１０のホモ）でVent(exo-)DNA Polymeraseを添加する。
・モデル３：プライマー１と鋳型１１の組み合わせ（鋳型１１のホモ）でVent(exo-)DNA Polymeraseを添加する。
・モデル４：プライマー１、鋳型１０、１１を１００ｎＭずつ等量加えた組み合わせ（鋳型１０と１１のヘテロ）Vent(exo-)DNA Polymeraseを添加する。
【０１５１】
その結果、モデル１の６１０ｎｍにおける蛍光強度値は０．６０、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．１０であった。モデル２の６１０ｎｍにおける蛍光強度値は２、４０、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．１０であった。モデル３における６１０ｎｍの蛍光強度値は０．５９、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．３１であった。モデル４の６１０ｎｍの蛍光強度値は２．０１、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．２１であった。
【０１５２】
鋳型１０のホモを想定したモデル２は、ブランクと比較して６１０ｎｍの蛍光強度値が約４倍高くなっている。これは鋳型１０のＳＮＰ部位に相補的なTexas Red(r)標識ヌクレオチドが取り込まれた結果、SYBR(r)Green Iとエネルギー移動を起こしTexas Red(r)の６１０ｎｍの蛍光強度値が増加したと考えられる。ＳＮＰ部位に相補的でないCy5TM標識ヌクレオチドは取り込まれない為６７０ｎｍの蛍光強度に変化はなかった。鋳型１１のホモを想定したモデル３はブランクと比較して６７０ｎｍの蛍光強度値が約３倍高い。これは鋳型１１のＳＮＰ部位に相補的なCy5TM標識ヌクレオチドを取り込んだ結果、SYBR(r)Green Iとエネルギー移動を起こしCy5TMの６７０ｎｍの蛍光が増加したと考えられる。ＳＮＰ部位に相補的でないTexas Red(r)標識ヌクレオチドは取り込まれず６１０ｎｍの蛍光強度は変化しなかった。鋳型１０と鋳型１１が等量入ったヘテロの系のモデル４では、６１０ｎｍ、６７０ｎｍどちらの蛍光も約２倍増加した。これはTexas Red(r)標識ヌクレオチド、Cy5TM標識ヌクレオチドの両者が取り込まれた結果である。このように、ＳＮＰの測定のような、１分子につき２つの蛍光標識ヌクレオチドを取り込んだ場合にも、蛍光強度の変化が測定可能であった。更に、二種類の蛍光標識ヌクレオチドを用いて、１つのチューブ内で二種類の鋳型核酸の測定が可能であった。
【０１５３】
実施例６
一塩基伸長反応によるｐ５３遺伝子コドン２８２の一塩基多型検出
（１）鋳型ＤＮＡとプライマーの合成
本実施例に鋳型として使用したＤＮＡは、ＰＣＲ反応にてプライマー１４、１５を用いて調製した。
【０１５４】
（ＰＣＲ反応条件）
反応液は以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.0) ・10mM KCl ・10mM (NH₄)₂SO₄ ・2.5mM MgCl₂
・0.1% Triton X100 ・200nM プライマー対 ・50ng ヒトゲノムDNA
・1U AmpliTaqGold(Applied Biosystems) ・200μM dNTPs
【０１５５】
反応溶液の最終容量２５μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１０分間熱変性させた後、変性反応９５℃、３０秒、アニーリング反応６０℃、３０秒、伸長反応７２℃、３０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。
【０１５６】
（２）ＰＣＲ産物の精製
調製したＰＣＲ産物には大過剰のＰＣＲプライマーとｄＮＴＰが含まれるため、キアゲンＰＣＲ産物精製キット(Qiagen)による精製、若しくは、シュリンプ由来アルカリフォスファターゼ（usb）とエキソヌクレアーゼＩ（usb)をそれぞれ４Ｕ、２０Ｕずつ添加し、３７℃、９０分温置後、８５℃１５分間加熱して酵素を不活性化した溶液を鋳型とした。
【０１５７】
（３）一塩基伸長反応
ジェノタイピングプライマーとして、プライマー１６に示したオリゴヌクレオチドを使用した。ＰＣＲ反応で調製した鋳型とハイブリダイズした際、その３’末端塩基がＳＮＰ部位に隣接するように設計してある。
反応液は以下のように調製した。
・1U Thermo Sequenase I DNA Polymerase(Amersham-Pharmacia Biotech)
・10×Thermo Sequenase I DNA Polymerasｅバッファー
・200nM Texas Red-5-ddATP ・200nM Cy5-5-ddGTP
・1×SYBR Green I ・200nM プライマー
・鋳型ＤＮＡ
【０１５８】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、３０秒間熱変性させた後、５０℃で１分間保温した。これを１サイクルとして、４０サイクル行った。蛍光の検出には蛍光測定機器ＬＳ−５０Ｂ（Perkin Elmer）を用いた。励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長６１０ｎｍ、６７０ｎｍで測定し、スリット幅を１０ｎｍにセットした。
【０１５９】
その結果、Ｃアレルホモ接合体の６１０ｎｍにおける蛍光強度値は０．６０、６７０ｎｍでの蛍光強度値は２．１０であった。Ｔアレルホモ接合体の６１０ｎｍにおける蛍光強度値は２．４０、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．５８であった。ヘテロ接合体における６１０ｎｍの蛍光強度値は１．６０、６７０ｎｍでの蛍光強度値は１．２３であった。鋳型ＤＮＡを添加していないブランク試験の６１０ｎｍの蛍光強度値は０．６１、６７０ｎｍでの蛍光強度値は０．６０であった。尚、用いたサンプルは別の方法（制限断片長多型法）でジェノタイプを判定済みのものを使用した。
【０１６０】
Ｃアレルホモ接合体は、ブランクと比較して６７０ｎｍの蛍光強度値が約５倍高くなっている。これは、CY5標識ヌクレオチドが取り込まれた結果、SYBR Green Iとエネルギー移動を起こしCY5の６７０ｎｍの蛍光強度値が増加したためと考えられる。ＳＮＰ部位に相補的でないTexas Red標識ヌクレオチドは取り込まれない為６１０ｎｍの蛍光強度に変化はなかった。Ｔアレルホモ接合体を鋳型とした場合は、ブランクと比較して６１０ｎｍの蛍光強度値が約４倍高い。これは、ＳＮＰ部位に相補的なTexas Red標識ヌクレオチドを取り込んだ結果、SYBR Green Iとエネルギー移動を起こしTexas Redの６１０ｎｍの蛍光が増加したためと考えられる。ＳＮＰ部位に相補的でないＣＹ５標識ヌクレオチドは取り込まれず６７０ｎｍの蛍光強度は変化しなかった。ヘテロ接合体では、６１０ｎｍ、６７０ｎｍどちらの蛍光も約２倍増加した。これはTexas Red標識ヌクレオチド、Cy5標識ヌクレオチドの両者が取り込まれた結果である。このように、ＰＣＲ産物を鋳型とした場合にも、本発明の方法を用いて、ワンチューブ内での２種類の核酸の検出が可能であった。
【０１６１】
実施例７
アレル特異的プライマーを用いた配列特異的伸長法によるアルデヒドデヒドロゲナーゼ２（ALDH2）遺伝子の一塩基多型検出
ALDH２は、１２番染色体長腕に存在するアルコール代謝関連遺伝子の１つである。日本人に頻繁にみられる変異型アレル（ALDH2*2）は、ALDH2 exon 12中４８７番目のアミノ酸Ｇｌｕ（グルタミン酸）をコードするＧＡＡが、Ｌｙｓ（リジン）をコードするＡＡＡに変異した点突然変異である。
【０１６２】
（１）鋳型の合成
本実施例に使用する鋳型ＤＮＡは、ＰＣＲ反応にてヒトゲノムＤＮＡよりプライマー４、５を用いて調製した。反応溶液の組成は以下のとおりである。
・20mM Tris-HCl(pH8.0) ・10mM KCl ・10mM (NH₄)₂SO₄ ・2.5mM MgCl₂
・0.1% Triton X100 ・200nM プライマー対 ・50ng ヒトゲノムＤＮＡ
・1U AmpliTaqGold ・200μM dNTPs 混合物
【０１６３】
反応溶液の最終容量２５μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１０分間熱変性させた後、変性反応９５℃、３０秒、アニーリング反応６０℃、３０秒、伸長反応７２℃、３０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。
（２）ＰＣＲ産物の精製
調製したＰＣＲ産物を、ＰＣＲ精製キット（Qiagen）、若しくは酵素処理（シュリンプ由来アルカリフォスファターゼとエキソヌクレアーゼＩをそれぞれ４Ｕ、２０Ｕずつ添加し、３７℃、９０分温置後、８５℃、１５分間加熱して酵素を不活性化）した溶液を鋳型として一塩基多型解析に用いた。
【０１６４】
（３）配列特異的伸長反応
３’末端がそれぞれのＳＮＰに相補的なアレル特異的プライマーを合成した。プライマー６は３’末端がＣ、プライマー７はＴであり、その他は鋳型と相補的な同じ配列を有している。配列特異的伸長反応による一塩基多型解析は、プライマーの３’末端にミスマッチが存在すると、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が阻害されるという原理に基づいている。従って３’末端が相補的な場合、伸長反応により取り込まれた２種類の蛍光色素標識ヌクレオチドによりFRETが起き、蛍光強度が変化する。相補的でない場合、蛍光標識ヌクレオチドは取り込まれないため蛍光強度は変化しない。
【０１６５】
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH₄)₂SO₄ ・2.5mM MgSO₄
・2μM dATP ・2μM dGTP ・2μM dTTP ・1.2μM dCTP ・400nM Cy5-5-dCTP
・400nM FITC-5-dCTP ・200nM プライマー ・精製ＰＣＲ産物
・0.1U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１６６】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１５秒間熱変性させた後、アニーリング、６０℃で１分間し、伸長反応、７２℃で２０秒間を１サイクルとし、２０サイクル反応させた。蛍光の検出にはライトサイクラー^TMシステムを用いた。その際、該システムにあるＦ１（５３０ｎｍ）をＦＩＴＣの検出に、Ｆ３（７１０ｎｍ）をCY 5の検出に用いた。又、励起強度は７５％に固定した。
【０１６７】
３種類の遺伝子型（Ｃアレルホモ接合体、Tアレルホモ接合体、ヘテロ接合体）におけるプライマー６を使用した際のFITC及びCY5の蛍光強度変化をそれぞれ図３１、図３２に示した。プライマー７を使用した際のFITC及びCY5の蛍光強度変化をそれぞれ図３３、図３４に示した。Cアレルホモ接合体では、３’末端がCであるプライマー６を添加した場合のみ、蛍光強度が変化した。即ち、ドナーであるFITCの蛍光強度が減少し、アクセプターのCY5の蛍光強度が増加した。３’末端がＴであるプライマー７を添加した場合は、蛍光強度の変化はみられなかった。これは、３’末端が鋳型と相補的なプライマー６を添加した場合にのみ、伸長反応が起こったためと考えられる。Ｔアレルホモ接合体では、３’末端がＴであるプライマー７を添加した場合のみFITCの蛍光強度が減少し、アクセプターであるCY5の蛍光強度が増加した。ヘテロ接合体では、プライマー６及び７のどちらを添加した場合にも蛍光強度の変化がみられた。尚、用いたサンプルは別の方法（制限断片長多型）でジェノタイプを判定済みのものを使用した。従って、本発明の方法と配列特異的伸長法を組み合わせて、一塩基多型解析が可能であることが示された。
【０１６８】
実施例８
ＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）で調製した鋳型を用いた配列特異的伸長法によるALDH2遺伝子の一塩基多型の検出
本実施例に使用する鋳型ＤＮＡは、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、RNaseHを用いる等温の遺伝子増幅方法で調製した。その際使用したプライマーは、プライマー４及び５と同じ塩基配列を有し、その３’末端３塩基がリボヌクレオチドに置き換わっている。
【０１６９】
（１）鋳型DNAの合成
（ＩＣＡＮ反応条件）
・35mM Tris-HCl(pH7.8) ・10mM MgSO₄ ・5% DMSO ・1μM プライマー対
・200ng ヒトゲノムDNA ・2.2U BcaBEST DNA polymerase（宝酒造）
・15U RNase H（宝酒造） ・1mM dNTPs
【０１７０】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、５５℃、６０分反応させた後、９０℃、５分間加熱し、酵素を失活させた。
（２）ＩＣＡＮ増幅産物の酵素処理
シュリンプ由来アルカリフォスファターゼとエキソヌクレアーゼＩをそれぞれ４Ｕ、２０Ｕずつ添加し、３７℃、９０分温置、続いて８５℃、１５分間加熱して酵素を不活性化した。
【０１７１】
（３）配列特異的伸長反応
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH₄)₂SO₄ ・2.5mM MgSO₄ ・2μM dATP
・2μM dGTP ・2μM dTTP ・1.2μM dCTP ・400nM Cy5-5-dCTP ・400nM FITC-5-dCTP
・100nM プライマー6、7 ・ICAN増幅産物 ・0.1U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１７２】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１５秒間熱変性させた後、アニーリング反応、６０℃で１分間し、伸長反応、７２℃で２０秒間を１サイクルとし、２０サイクル反応させた。蛍光の検出にはライトサイクラー^TMシステムを用いた。その際、該システムにあるＦ１（５３０ｎｍ）をＦＩＴＣの検出に、Ｆ３（７１０ｎｍ）をCY5の検出に用いた。又、励起強度は７５％に固定した。
【０１７３】
その結果、Cアレルホモ接合体では、３’末端がＣであるプライマー６を添加した場合のみ、蛍光強度が変化した。即ち、FRET現象のドナーであるFITCの蛍光強度が減少し、アクセプターであるＣＹ５の蛍光強度が増加した。それに対し、３’末端がＴであるプライマー７を添加した場合、変化はみられなかった。Tアレルホモ接合体では、３’末端がＴであるプライマー７を添加した場合のみ蛍光強度が変化した。ヘテロ接合体では、プライマー６及び７のどちらを添加した場合にも蛍光の変化がみられた。従って、ＩＣＡＮ増幅産物を鋳型とした場合にも、一塩基多型検出が可能であることが確認された。
【０１７４】
実施例９
ＬＡＭＰ(Loop-mediated Isothermal Amplification)法で調製した鋳型を用いた、配列特異的伸長法によるProstate-specific antigenの一塩基多型検出
本実施例で使用する鋳型ＤＮＡは、４つのプライマーを使用し、さらに酵素として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用する等温遺伝子増幅法で調製した。
【０１７５】
（１）鋳型ＤＮＡの合成
ＬＡＭＰ反応条件
・10×Thermopol Buffer(NEB) ・2mM MgSO₄ ・200ng ヒトゲノムDNA
・8U Bst DNA polymerase(NEB) ・4M Betaine(Sigma) ・10mM dNTPs
・40pmol プライマー８ ・40pmol プライマー９ ・5pmol プライマー１０
・5pmol プライマー１１
【０１７６】
反応溶液の最終容量２５μｌ。上記反応液を均一に混合し、６５℃、６０分反応させた後、８０℃、１０分間加熱し、酵素を失活させた。
（２）ＬＡＭＰ増幅産物の酵素処理
シュリンプ由来アルカリフォスファターゼとエキソヌクレアーゼＩをそれぞれ４Ｕ、２０Ｕずつ添加し、３７℃、９０分温置、続いて８５℃、１５分間加熱して酵素を不活性化した。
【０１７７】
（３）配列特異的伸長反応
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH₄)₂SO₄ ・2.5mM MgSO₄
・400nM CY5-5-dCTP ・400nM FITC-5-dCTP ・2μM dATP ・2μM dGTP
・2μM dTTP ・1.2μM dCTP ・100nM プライマー12及びプライマー13
・LAMP増幅産物 ・0.1U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１７８】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃、１５秒間熱変性させた後、アニーリング反応、６０℃で１分間し、伸長反応、７２℃で２０秒間を１サイクルとし、２０サイクル反応させた。蛍光の検出にはライトサイクラー^TMシステムを用いた。その際、該システムにあるＦ１（５３０ｎｍ）をFITCの検出に、Ｆ３（７１０ｎｍ）をCY 5の検出に用いた。又、励起強度は７５％に固定した。
【０１７９】
その結果、Ｃアレルホモ接合体では、３’末端がＣであるプライマー１２を添加した場合のみ、蛍光強度が変化した。即ち、FITCの蛍光強度が減少し、CY5の蛍光強度が増加した。Ｔアレルホモ接合体では、３’末端がＴであるプライマー１３を添加した場合のみ蛍光強度が変化した。ヘテロ接合体では、プライマー１２及び１３のどちらを添加した場合にも蛍光の変化がみられた。従って、ＬＡＭＰ法で増幅した産物を鋳型とした場合にも一塩基多型検出が可能であることが示された。
【０１８０】
実施例１０
逆転写酵素を用いたアレル特異的伸長反応による１塩基多型解析
ＬＣＨＡＤ(長鎖３−ヒドロキシアシル コエンザイムＡ デヒドロゲナーゼ）、ＯＡＴ(有機アニオントランスポーター）の一塩基多型を、逆転写酵素を用いた配列特異的伸長法により解析した。
（１）鋳型ＲＮＡの合成
本実施例に鋳型として使用するＲＮＡは以下のように調製した。
後記の配列番号１７、１８、２１、２２のプライマーを用いて２−プレックスＰＣＲを行った。１組のプライマーの一方には５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を付けた。マルチプレックスＰＣＲ反応条件は、Ampli Taq Gold 1U 200nM、プライマー対50ng、ヒトゲノムDNA、Ampli Taq Gold buffer 200μM、dNTPsを均一に混合し、最終容量２５μｌとした。９５℃、１０分間熱変性させた後、変性反応９５℃、３０秒、アニーリング反応６５℃、３０秒、伸長反応７２℃、３０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。続いて、T7 Ampliscribe Kit（Epicentre Technologies）を用いて転写反応を行った。
【０１８１】
（２）マイクロアレイの調製
マイクロアレイは、標準的なマイクロスコープガラススライドを用いた。イソチオシアネートで表面を活性化させた後、ＮＨ₂−修飾オリゴヌクレオチド（配列番号１９、２０、２３、２４）を固定化した。オリゴヌクレオチドは２０μＭになるよう４００ｍＭの炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．０）で溶解した。直径２ｍｍにスポットした後、気化したアンモニアにさらし蒸留水で三回洗浄した。
【０１８２】
（３）配列特異的伸長法
調製した鋳型ＲＮＡを、10mM Tris-HCl、（pH7.4）、1mM EDTA、0.2M NaCl、0.1% Triton X-100に溶解後、１０μｌをアレイに添加し３７℃、２０分間温置してアニーリングさせた。0.1M NaClで洗浄後、逆転写酵素MMLV（Epicentre Technologies)6U、dNTPs（dATP、dGTP、FITC-dUTP、CY5-dCTP）６μＭ、酵素付属バッファーを添加し、５２℃で１時間反応させた。
【０１８３】
（４）シグナルの検出
マイクロスコープ ガラス スライドは、コンフォーカル スキャン アレイ4000(GSI Lumonics)を用いて励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長６５０ｎｍでスキャンした。バックグランドの蛍光強度値を引いた値をジェノタイプの判定に用いた。
【０１８４】
LCHADのＣアレル特異的プライマーであるプライマー１９が固定化されたスライドは、LCHADのＣアレル接合体を含む鋳型をスポッティングした場合のみ、シグナル強度が約９００と高い値を示した。Ｃアレル接合体を含まない鋳型をスポットした場合のシグナルはすべて１００以下であった。LCHADのＧアレル特異的プライマーであるプライマー２０が固定化されたスライドでは、LCHADのＧアレル接合体を含む鋳型をスポットした場合のみ高いシグナル強度（８００付近）が得られた。それに対してＧアレル接合体を含まない鋳型をスポットした場合のシグナルはすべて１００以下であった。OATのＣアレル特異的プライマーであるプライマー２３が固定化されたスライドは、OATのＣアレル接合体を含む鋳型をスポッティングした場合のみ、シグナル強度が約１２００と高い値を示した。Ｃアレル接合体を含まない鋳型をスポットした場合のシグナルはすべて１００以下であった。このように、本発明の核酸検出方法において、逆転写酵素を用いた一塩基多型解析が可能であることが示された。
【０１８５】
実施例１１
フルオレセインクロロトリアジニル−４−ｄＣ（デオキシシチジン）ヌクレオチドモノマーを利用して、グアニンによる消光現象により核酸を検出する。
１）鋳型ＤＮＡとプライマー
プライマー１と、鋳型１２を用いた。
・モデル１：プライマー１と鋳型１２の組み合わせ
・モデル２：プライマー１と鋳型１２の組み合わせでVent(exo-)DNA Polymeraseを添加しない。
【０１８６】
２）増幅反応条件
反応液を以下のように調製した。
・20mM Tris-HCl(pH8.8) ・10mM KCl ・10mM (NH₄)₂SO₄ ・2.5mM MgSO₄
・0.5% Triton X100 ・5% DMSO ・0.25mg/ml BSA
・200nM フルオレセインクロロトリアジニル-4-dC
・200nM dGTP ・200nM dATP ・200nM dUTP ・2nM プライマー
・50nM 合成一本鎖鋳型DNA ・0.1U Vent(exo-)DNA Polymerase
【０１８７】
反応溶液の最終容量２０μｌ。上記反応液を均一に混合し、９５℃で１５秒熱変性させた後、６５℃、１５分間保温した。蛍光の検出にはライトサイクラー^TMシステムを用いた。検出はＦ１を用い、励起強度は７５％に固定した。
【０１８８】
その結果、モデル１ではＦ１の蛍光強度が最大で２４％減少した。酵素非添加のモデル２の反応では蛍光変化はみられなかった。以上の結果より、ＤＮＡポリメラーゼにより合成中の鎖に取り込まれたdC-FITC標識ヌクレオチドが、相補鎖に存在するグアニンと相互作用した結果、蛍光が減少したと考えられる。
【０１８９】
［プライマーの配列］
プライマー４：GTGTAACCCATAACCCCCAAGA
プライマー５：CACCAGCAGACCCTCAAGC
プライマー６：CCCACACTCACAGTTTTCACTTC
プライマー７：CCCACACTCACAGTTTTCACTTT
プライマー８：TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG
プライマー９：TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG
プライマー１０：TGCTTGTGGCCTCTCGTG
プライマー１１：GGGTGTGGGAAGCTGTG
【０１９０】
プライマー１２：TGATCTTGCTGGGTCGGCACAGC
プライマー１３：TGATCTTGCTGGGTCGGCACAGT
プライマー１４：ACCTGATTTCCTTACTGCCTCTTGC
プライマー１５：GTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGT
プライマー１６：TGTGCCTGTCCTGGGAGAGAC
プライマー１７：TTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCTTGCCAGGTGATTGGC
プライマー１８：GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTGTTTCTGTGGTCACGAAGTC
【０１９１】
プライマー１９：CTCTAATAGTGCTGGCTC
プライマー２０：CTCTAATAGTGCTGGCTG
プライマー２１：
TTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCTTTGTAGCTGGGA ACTTC
プライマー２２：
GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTACCAAAACCTGGTAAATACGG
プライマー２３：GAGATAGCAGACAACGTCC
プライマー２４：GAGATAGCAGACAACGTCG
鋳型１２：
TTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
【０１９２】
【発明の効果】
標識ヌクレオチドを核酸重合体に取り込ませる核酸重合反応を行う際に、核酸重合系の蛍光強度変化をモニタリングすることで、ハイブリダイズすることにより蛍光強度の変化する均一溶液系核酸プローブが不要な、簡便・迅速且つ低コストで高感度な核酸の測定方法が実現する。この方法により、自然界の２系内に存在する遺伝子等の全核酸が測定できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明方法Ａの概要：蛍光色素間の相互作用を利用した核酸測定方法。
【図２】 本発明方法Ｂの概要：核酸特異的蛍光色素・蛍光色素間の相互作用を利用した核酸測定方法。
【図３】 本発明方法Ｃの概要：Ｇ塩基・蛍光色素間の相互作用を利用した核酸測定方法。
【図４】 本発明方法Ｄの概要：クエンチャー物質・蛍光色素間の相互作用を利用した核酸測定方法。
【図５】 本発明方法Ｅの概要：標識された特異的プライマーを用いた核酸測定方法（１）。
【図６】 本発明方法Ｅの概要：標識された特異的プライマーを用いた核酸測定方法（２）。
【図７】 本発明方法Ｆの概要：特異的プライマーに標識された蛍光色素とＧ塩基間の相互作用を利用した核酸測定方法。
【図８】 本発明方法Ｇの概要：抗原又は抗体で標識されたヌクレオチドを用いる核酸測定方法。
【図９】 本発明方法Ｈの概要：固体表面上に固定化された特異的プライマーを用いる核酸測定方法。
【図１０】 ２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜１０のＦ１蛍光強度変化。

【図１１】 ２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜１０のＦ３蛍光強度変化。

【図１２】 ２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（ＦＲＥＴ現象）を利用した核酸測定：モデル１１〜２０のＦ１蛍光強度変化。

【図１３】 ２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（ＦＲＥＴ現象）を利用した核酸測定：モデル１１〜２０のＦ２蛍光強度変化。

【図１４】 ２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル２１〜３０のＦ１蛍光強度変化。

【図１５】 ２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル２１〜３０のＦ２蛍光強度変化。

【図１６】 ２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドとの間の相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル３１〜４０のＦ１蛍光強度変化。

【図１７】 ２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜８のＦ１蛍光変化。

【図１８】 ２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１〜８のＦ３蛍光変化。

【図１９】 ２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル９〜１６のＦ１蛍光変化。

【図２０】 ２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（ＦＲＥＴ現象）を利用した核酸測定：モデル９〜１６のＦ２蛍光変化。

【図２１】 ２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１７〜２４のＦ１蛍光変化。

【図２２】 ２種の蛍光標識ヌクレオチド間相互作用（FRET現象）を利用した核酸測定：モデル１７〜２４のＦ２蛍光変化。

【図２３】 ２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（Ｆ１蛍光変化）。

【図２４】 ２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（Ｆ３蛍光変化）。

【図２５】 ２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（データ処理後のＦ１蛍光変化）。

【図２６】 ２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（データ処理後のＦ３蛍光変化）。

【図２７】 ２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ法による検量線（検量線作成に使用したデータ：データ処理後のＦ１蛍光値）。
【図２８】 ２種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ法による検量線（検量線作成に使用したデータ：データ処理後のＦ３蛍光値）。
【図２９】 ２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅産物のリアルタイムモニタリング（データ処理後のＦ３蛍光変化）。

【図３０】 ２本鎖核酸特異的蛍光色素と蛍光標識ヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ法による検量線（データ処理後のＦ３蛍光変化）。
【図３１】 ３種類の遺伝子型（Ｃアレルホモ接合体、Ｔアレルホモ接合体、ヘテロ接合体）におけるプライマー６を使用した際のＦＩＴＣの蛍光強度変化を示す図。
【図３２】 ３種類の遺伝子型（Ｃアレルホモ接合体、Ｔアレルホモ接合体、ヘテロ接合体）におけるプライマー６を使用した際のＣＹ５の蛍光強度変化を示す図。
【図３３】 プライマー７を使用した際のＦＩＴＣの蛍光強度変化を示す図。
【図３４】 プライマー７を使用した際のＣＹ５の蛍光強度変化を示す図。
【符号の説明】
Ｎ：ヌクレオチドモノマー[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for measuring a plurality of nucleic acids, specifically, measuring at least one nucleic acid of unknown nucleic acids and / or known nucleic acids (target nucleic acids) using nucleotides labeled with a substance such as a fluorescent dye. The present invention relates to a method for measuring a nucleic acid capable of In the case of a plurality of nucleic acids, it can be measured simultaneously.
[0002]
[Prior art]
Many methods for measuring a target nucleic acid using a nucleic acid probe are known. For example,
(1) A method using a probe using a FRET (fluorescence resonance energy transfer) phenomenon (for example, see Non-Patent Documents 1 and 2).
(2) Numerous examples such as a method represented by a method using a probe using a characteristic that a fluorescent dye interacts with a specific nucleobase to reduce the amount of fluorescence emission (for example, see Non-Patent Document 3). Can be mentioned. These methods are homogeneous systems, in which a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye or the like is hybridized to a target nucleic acid and / or a target nucleic acid is amplified to obtain an optical signal such as a fluorescent dye or the like labeled on a nucleic acid probe. It measures the change or amount of change in character (fluorescence intensity). Hereinafter, the nucleic acid probe is referred to as a “homogeneous solution nucleic acid probe” throughout the present specification. Or, it may be simply referred to as “nucleic acid probe”.
[0003]
However, the homogeneous solution-based nucleic acid probe necessary in the above method requires labeling the oligonucleotide with a fluorescent substance and / or a quencher substance. In addition, the design method of the probe is not standardized. This led to wasted time and money. Further, although the measurement sensitivity has been improved, further improvement has been demanded. Further, it is not possible to measure unknown nucleic acids and / or a plurality of nucleic acids containing known nucleic acids existing in one natural system at the same time with excellent sensitivity and in a short time, simply, specifically and accurately.
[0004]
[Non-Patent Document 1]
Morrison et al., Anal. Biochem., Vol. 183, 231-244, 1989
[Non-Patent Document 2]
Xiangnin Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.94, 10756-10761, 1997
[Non-Patent Document 3]
KURATA et al., Nucleic acids Research, 2001, vol. 29, No. 6 e34
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the above situation, an object of the present invention is to provide at least one kind of nucleic acid containing an unknown nucleic acid and / or a known nucleic acid existing in one system with excellent sensitivity, in a short time, simply and specifically. It is to provide a new method that can be measured.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors have found that when a fluorescently labeled nucleotide or a quencher labeled nucleotide is incorporated into a nucleic acid polymer in the course of nucleic acid synthesis, the fluorescent character of the labeled fluorescent dye is not incorporated. It was found that it changed significantly compared to. The present invention has been completed based on such findings.
[0007]
That is, the present invention
1) (A) a nucleic acid as at least one template, and (B)(A) a nucleotide monomer labeled with a donor fluorescent dye and (b) a nucleotide monomer labeled with an acceptor fluorescent dye;(C) Nucleic acid polymerization reaction in a nucleic acid polymerization reaction system containing at least one nucleic acid synthesizing enzyme, and a template nucleic acid or a nucleic acid synthesized using it as a template from a change or amount of optical character of the nucleic acid polymerization system A method for measuring a nucleic acid is provided.
[0008]
  In the method of the present invention,
2) The nucleic acid polymerization system includes (D) at least one nucleotide monomer that is not labeled with a labeling substance;
3) The nucleic acid polymerization system further includes (E) a nucleic acid primer comprising at least one oligonucleotide that specifically binds to the template nucleic acid.Togapreferable.
[0009]
4) And the nucleic acid polymerization system contains unlabeled nucleotides;
5)the above4), The nucleotide monomer labeled with the donor fluorescent dye, the nucleotide monomer labeled with the acceptor fluorescent dye or the unlabeled nucleotide contains guanine (g) and / or the template nucleic acid contains at least one guanine (g). Containing;
6)the above4), A nucleotide monomer labeled with an unlabeled nucleotide, a donor fluorescent dye or an acceptor fluorescent dye is a triphosphate;
7) The nucleic acid polymerization system contains (F) a fluorescent dye that emits fluorescence when bound to the nucleic acid;
8It is preferable that the nucleic acid synthase is at least one selected from the group consisting of DNA polymerase, RNA polymerase, reverse transcriptase, and their variants.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail. Before describing the present invention in detail, the terms used throughout this specification, including the claims, are defined. The terms used in the present invention have the same meanings as those commonly used in biology, molecular biology, genetics or genetic engineering, microbiology or microbial engineering unless otherwise specified.
[0013]
  A nucleotide monomer refers to a nucleotide that can be incorporated into a nucleic acid polymer by at least one nucleic acid synthase. Preferably, it is a mononucleotide that is a constituent of an oligonucleotide nucleic acid.TheAs a good exampleTheMay include nucleoside monophosphate (NMP), diphosphate (NDP) and triphosphate (NTP). A more preferred example is triphosphate. Examples of the base include nucleic acid constituents, that is, adenine, guanine, uracil, cytosine, thymine, derivatives thereof, and trace components contained in RNA. The sugar is ribose or deoxyribose. If the oligonucleotide hybridizes to the template nucleic acid, it is incorporated into the nucleic acid polymer in the nucleic acid polymerization system by using a nucleic acid synthesizing enzyme (eg, DNA polymerase) and ligase that does not have exonuclease activity. It is.
[0014]
The reason why nucleoside monophosphate or diphosphate is used is that the nucleic acid polymerization system may include kinases, phosphorylases or their production systems that convert the phosphate into triphosphates. It is. For example, unpurified crude template nucleic acid or crude nucleic acid synthase often includes these enzymes and / or production systems. When ATP is excessively contained in the nucleic acid polymerization system, triphosphates other than ATP are easily formed. That is, the nucleic acid polymerization system of the present invention is defined as including these enzymes and / or production systems. The labeled nucleotide and the immune-related labeled nucleotide are the same as described above, and a triphosphate is more preferable. Also, dideoxynucleotide monomers and labeled or unlabeled dideoxynucleotides are the same as described above, and triphosphates are more preferable.
[0015]
The labeled nucleotide refers to a nucleotide monomer labeled with at least one of a fluorescent dye and a quencher substance described later. A nucleotide monomer labeled with a fluorescent dye is referred to as a fluorescently labeled nucleotide, and a nucleotide monomer labeled with a quencher substance is referred to as a quencher labeled nucleotide. Furthermore, a fluorescently labeled nucleotide labeled with a donor fluorescent dye is referred to as a donor labeled nucleotide, and a fluorescently labeled nucleotide labeled with an acceptor fluorescent dye is referred to as an acceptor labeled nucleotide. The labeled nucleotide will be described later in detail.
An unlabeled nucleotide refers to a nucleotide monomer that is not labeled with a labeling substance as described above.
A nucleic acid primer refers to one type of primer that specifically binds to a template nucleic acid. A nucleic acid primer labeled with a fluorescent dye and a quencher substance is called a fluorescently labeled nucleic acid primer and a quencher labeled nucleic acid primer in this order. The two are collectively referred to as labeled nucleic acid primers. Adenine, guanine, uracil, cytosine, and thymine were A or a, G or g, U or u, C or c, T, or t in this order. A fluorescent dye that emits fluorescence by binding to a nucleic acid was defined as a nucleic acid-specific fluorescent dye.
[0016]
The template nucleic acid can be a template for a nucleic acid polymer. In the present invention, it refers to an unknown nucleic acid (sometimes referred to as “unknown nucleic acid”), a known nucleic acid (sometimes referred to as “target nucleic acid”), or a mixture thereof. And they are DNA and / or RNA. That is, the template nucleic acid of the present invention is not limited to a specific nucleic acid (target nucleic acid) for measurement purposes, but also includes an unspecified nucleic acid. Of course, including genes. Those nucleic acids may be mixed. Moreover, the magnitude | size of a density | concentration or a magnitude | size does not ask | require. That is, it also means specific and nonspecific nucleic acids present in one system. That is, the template nucleic acid refers to a nucleic acid that can be detected and measured by being polymerized and / or amplified by the method of the present invention.
[0017]
Any nucleic acid synthase may be used as long as it has the ability to synthesize a nucleic acid polymer by polymerizing the unlabeled nucleotide and / or the labeled nucleotide using the template nucleic acid as a template. Representative examples include DNA polymerases, RNA polymerases, reverse transcriptases, ligases, various kinases, nucleotide triphosphate production systems, and their genetically engineered modified proteins Enzymes having As the DNA polymerases, RNA polymerases and reverse transcriptases, ligases, various kinases, and enzymes containing a nucleotide triphosphate production system can be suitably used in the present invention. In the present invention, these are used alone or in combination.
[0018]
Of course, the enzyme may or may not contain various factors that sufficiently exert the activity of these enzymes. In the case of DNA polymerase, it may or may not have exonuclease activity. It may be either purified or not crude enzyme. In addition, the origin of the enzyme (microorganism, animal, plant) is not particularly limited. Those having heat resistance are preferred. Preferred examples include Vent (exo-) DNA Polymerase (derived from Thermococcus litoralis), Tgo (exo-) DNA Polymerase, ThermoSequenase DNA Polymerase (Armersham), which lacks 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity, AmpliTag Gold polymerase, T7 Sequenase DNA Polymerase, etc. can be mentioned.
[0019]
Hybrid (or hybrid) complex, nucleic acid polymer / template nucleic acid complex by hybridization of nucleic acid polymer or nucleic acid primer labeled with fluorescent dye or the like and template nucleic acid or corresponding nucleic acid such as nucleic acid polymer , Nucleic acid primer / template nucleic acid complex and nucleic acid primer / nucleic acid polymer complex.
[0020]
In the present invention, the term “measuring nucleic acid” or “measuring nucleic acid concentration” means not only quantifying the concentration of the target nucleic acid, but also quantitative detection, qualitative detection, nucleic acid Simply measure or simply monitor the fluorescence intensity of the polymerization system, simply detect, analyze or analyze nucleic acids, measure or analyze polymorphisms (including SNPs) and / or mutations, or It means to analyze. In addition, the data obtained in this way is analyzed by a known method of Kurata et al. (EP Patent Publication, EP1 046 717 A9), and the concentration (copy number, etc.) existing in one system is analyzed. It also includes the required operations. In addition, an operation for determining a base sequence by a known method (basic biochemical experiment method, volume 4 (nucleic acid / gene experiment), edited by the Japanese Biochemical Society, Tokyo Chemical Dojin Co., Ltd.) or the like is also included.
[0021]
The nucleic acid polymerization reaction is not only a simple polymerization (synthesis or extension reaction) reaction, but also a nucleic acid amplification reaction, for example, PCR method, real-time quantitative PCR method, ICAN method, LAMP method, NASBA method, TAMA method. , LCR methods, hybridization reactions, extension, denaturation, etc. associated with those methods. The following examples can be given as specific examples of the polymerization reaction.
(1) A reaction in which the template nucleic acid is DNA, the nucleic acid synthase is DNA polymerase or modified RNA polymerase, the nucleotide monomer, the fluorescently labeled nucleotide and the quencher labeled nucleotide are deoxyribonucleotides, and the nucleic acid polymer is DNA.
(2) A reaction in which the template nucleic acid is DNA, the nucleic acid synthase is RNA polymerase or modified DNA polymerase, the nucleotide monomer, the fluorescently labeled nucleotide and the quencher labeled nucleotide are ribonucleotides, and the nucleic acid polymer is RNA.
[0022]
(3) A reaction in which the template nucleic acid is RNA, the nucleic acid synthase is reverse transcriptase, the nucleotide monomer, the fluorescently labeled nucleotide and the quencher labeled nucleotide are deoxyribonucleotides, and the nucleic acid polymer is DNA.
(4) Reaction in which the template nucleic acid is RNA, the nucleic acid synthase is reverse transcriptase and RNA polymerase, the nucleotide monomer, the fluorescently labeled nucleotide and the quencher labeled nucleotide are ribonucleotides and deoxyribonucleotides, and the nucleic acid polymer is RNA That is, a reaction through a DNA synthesis reaction.
[0023]
(5) A reaction system in which ligase is used in combination with the above reaction system.
(6) A reaction system in which various kinases and / or nucleotide triphosphate production systems are used in combination with the above reaction system.
In the above, preferred are (1) to (4), more preferred are (1) to (3), and particularly preferred are (1) and (2).
[0024]
The term “optical character” refers to various absorption spectra such as fluorescent dyes for labeling nucleotides, quencher substances, or fluorescence emission spectra, and their absorption intensity, polarization, fluorescence emission, fluorescence intensity, fluorescence lifetime, fluorescence polarization. And optical properties such as fluorescence anisotropy (collectively referred to as “fluorescence intensity”). Further, it also refers to a property obtained by comprehensively evaluating measured values measured at least at one or more measurement wavelengths for at least one fluorescent dye labeled with a labeled nucleotide or the like. For example, a fluorescence intensity curve of a nucleic acid denaturation reaction is one of them.
[0025]
In the present invention, the term “from a change or amount of fluorescence intensity” means not only a change in fluorescence intensity based on the nucleic acid polymer of the present invention, but also the nucleic acid polymer labeled with a fluorescent dye and / or a quencher. In addition, the change or amount of fluorescence intensity before and after the hybridization when the homogeneous solution-based nucleic acid probe is hybridized is also included.
[0026]
The nucleic acid polymerization system can also include a labeled or unlabeled dideoxynucleotide together with a labeled or unlabeled nucleotide. In this case, the polymerization of the nucleic acid is stopped when the dideoxynucleotide is used in the reaction. When one type of target nucleic acid is used as a template, a large number of nucleic acid polymers having different chain lengths using the template as a template can be obtained. By analyzing and analyzing these nucleic acid polymers by an electrophoresis method, a liquid chromatography method or the like, important information about the target nucleic acid can be obtained. In such analysis / analysis, a change in the fluorescence intensity of the labeling substance is also used.
[0027]
Fluorescently labeled nucleotides, quencher labeled nucleotides and nucleic acid specific fluorescent dyes are described in detail. In the present invention, the fluorescent dye (sometimes referred to as “fluorescent substance”) is a type of fluorescent dye that is generally labeled on a nucleic acid probe and used for measurement / detection of nucleic acid. For example, fluorescein or derivatives thereof (eg, fluorescein isothiocyanate (FITC) or derivatives thereof), Alexa 488, Alexa 532, cy3, cy5, 6-joe, EDANS, rhodamine 6G (R6G) or a derivative thereof {eg, tetramethylrhodamine (TMR), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TMRITC), x-rhodamine}, Texas red, bodepy (BODIPY) FL {BODIPY is a trade name, FL is a trade name; manufactured by Molecular Probes, USA; the same applies below}, BODIPY FL / C3, BODIPY FL / C6, BODIPY 5-FAM, BODIPY TMR, or its derivatives {eg, BODIPY TR, BODIPY R6 G, BODIPY 564}, BODIPY 581 and the like.
[0028]
Among the above, FITC, EDANS, Texas Red, 6-joe, TMR, Alexa 488, Alexa 532, BODIPY FL / C3, BODIPY R6G, BODIPY FL, Alexa 532, BODIPY FL / C6, BODIPY TMR, 5-FAM, BODIPY Suitable examples include 493/503, BODIPY 564, BODIPY 581, Cy3, Cy5, Texas red, x-Rhodamine, and the like.
[0029]
A quencher substance is a substance that acts on the fluorescent dye to suppress or quench its emission. For example, Dabcyl, QSY7 (Molecular Probes), QSY33 (Molecular Probes), Ferrocene or derivatives thereof, methyl viologen, N, N'-dimethyl-2,9-diazopyrenium, etc., preferably Dabcyl Can be mentioned.
[0030]
The fluorescently labeled nucleotide of the present invention is a nucleotide monomer labeled with at least one fluorescent dye. The label may be either the 5 'sugar moiety and / or its phosphate moiety, base moiety, 3' sugar moiety and / or phosphate moiety. The fluorescent dye is a dye as exemplified above, and means both a dye that can be a donor dye and a dye that can be an acceptor dye. Similarly, a quencher labeled nucleotide is a nucleotide monomer labeled with a quencher substance as exemplified above. It should be noted that both fluorescently labeled nucleotides and quencher labeled nucleotides may be collectively referred to as “labeled nucleotides”. The same applies to fluorescently labeled dideoxynucleotides and quencher labeled dideoxynucleotides. In this case, since there is no OH group at the 3 'position of the sugar, when the nucleotide is used for the reaction in the nucleic acid polymerization, the nucleic acid polymerization reaction is stopped at the point of use.
[0031]
When the labeled nucleotide is labeled on the 3'OH group of the sugar, the polymerization of the nucleic acid stops when the nucleotide is used in the reaction. When one type of target nucleic acid is used as a template, a large number of nucleic acid polymers having different chain lengths using the template as a template can be obtained. By analyzing and analyzing these nucleic acid polymers by an electrophoresis method, a liquid chromatography method or the like, important information on the target nucleic acid can be obtained. In such analysis / analysis, a change in the fluorescence intensity of the labeling substance is also used.
[0032]
In order to label the nucleotide monomer with a fluorescent dye or a quencher substance, a desired one of conventionally known labeling methods can be used. The labeling site is an OH group of a 5 'phosphate moiety, an OH group of a base, or an amino group. When labeling an amino group, kit reagents such as Uni-link aminomodifier (CLONTECH, USA), Fluo Reporter Kit F-6082, F-6083, F-6084, F-10220 (all Also, it is convenient to use a molecular probe (Molecular Probes, USA). Then, the labeling substance molecule can be bound to the nucleotide monomer according to a conventional method.
[0033]
When labeling an OH group, 5′Amino-Modifier C6 kit (Glen Research, USA) or the like is used. For example, when binding the labeling substance molecule to the OH group of the base, first, as a spacer to the OH group, for example, — (CH₂)_nIntroduce -SH. In this case, n is 3-8, preferably 6. A labeled nucleotide monomer can be synthesized by binding the labeling substance having SH group reactivity or a derivative thereof to this spacer. The same applies when labeling an amino group. The OH group at the 3 'position of ribose and deoxyribose, the OH group at the 2' position of ribose, and the OH group at the 5 'phosphate site can be labeled in the same manner as described above. The various nucleotide monomers labeled with the labeling substance synthesized in this way can be purified by chromatography such as reverse phase and the like to be labeled nucleotides used in the present invention. Of course, you may obtain it by performing consignment synthesis.
[0034]
The nucleic acid primer used in the present invention can be a precursor of a nucleic acid polymer, that is, a precursor, and is composed of an oligonucleotide. Either deoxyribose or ribose may be used. The chain length can be used for known nucleic acid synthesis, and is not particularly limited. However, for example, it is 2 to 50 bases, preferably 3 to 40 bases, and more preferably 5 to 30 bases. Either one having a base sequence that specifically hybridizes to a template nucleic acid or one having only a common base sequence or consensus sequence can be used. In the former case, a nucleic acid polymer using a specific template nucleic acid as a template is obtained. In the latter case, an unspecified one is obtained.
[0035]
The primer of the present invention can be used with or without being labeled with the fluorescent dye or quencher substance. The label may be made of at least one of these labeling substances. A preferred nucleic acid primer is one in which the 5 'end and / or the base in the chain is labeled, and the 3' OH group of the 3 'end sugar is not labeled. In this case, the resulting nucleic acid polymer is labeled with a labeling substance labeled with a primer. Of course, those labeled with the 3'OH group of the 3'-terminal sugar can also be used. In this case, it is simply used as a nucleic acid probe.
[0036]
The oligonucleotide of the nucleic acid primer of the present invention can be produced by an ordinary method for producing an oligonucleotide. For example, it can be produced by a chemical synthesis method, a microbial method using a plasmid vector, a phage vector or the like. It is preferable to use a commercially available nucleic acid synthesizer.
[0037]
In order to label the oligonucleotide with a fluorescent dye or a quencher substance, it may be performed in the same manner as in the case of the labeled nucleotide monomer. In this case, the 5 ′ terminal base, 3 ′ terminal base, base in the chain, 5 ′ terminal phosphate group, 3 ′ terminal ribose and deoxyribose of the oligonucleotide are to be labeled. The most convenient method for synthesizing the oligonucleotide and the labeled nucleic acid primer is to perform consignment synthesis.
[0038]
In the present invention, the nucleic acid-specific fluorescent dye is a substance that emits fluorescence when bound to a nucleic acid. Nucleic acid species to be bound are nucleic acids such as labeled or unlabeled nucleic acid primer / template nucleic acid complex, single-stranded DNA, single-stranded RNA, double-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA, double-stranded RNA, etc. There is no particular limitation as long as it is present. Examples of nucleic acid-specific fluorescent dyes include intercalators such as ethidium bromide, Sybr green 1, Sybr green 2, YOYO, TOTO, and YO-PRO-1. However, in the present invention, any substance that emits fluorescence by binding to a nucleic acid can be applied to all the methods of the present invention.
[0039]
The present invention is a method for measuring a nucleic acid comprising the following procedure.
1) The following {(1) to (8)}, preferably {(6), (7) and (8)}, more preferably {(6) and (7)} The nucleic acid polymerization reaction (alone), or the nucleic acid polymerization reaction and the nucleic acid amplification reaction (both reactions) are started.
(1) A nucleic acid polymerization system comprising a template nucleic acid, at least one labeled nucleotide, and a nucleic acid synthase.
(2) The nucleic acid polymerization system comprising the unlabeled nucleotide in (1).
(3) A nucleic acid polymerization system comprising a template nucleic acid, at least one labeled dideoxynucleotide, and a nucleic acid synthase.
(4) A nucleic acid polymerization system comprising at least one selected from the group consisting of labeled nucleotides and unlabeled nucleotides in (3) above.
[0040]
(5) A nucleic acid polymerization system containing a template nucleic acid, an unlabeled dideoxynucleotide, a labeled nucleotide, and a nucleic acid synthase.
(6) A nucleic acid polymerization system further comprising a labeled nucleic acid primer or an unlabeled nucleic acid primer in (1) to (5) above.
(7) A nucleic acid polymerization system comprising a template nucleic acid, an unlabeled nucleotide, a labeled nucleic acid primer, and a nucleic acid synthase.
(8) A nucleic acid polymerization system comprising the nucleic acid-specific fluorescent dye in any one of (1) to (7) above.
[0041]
2) Since the labeled nucleotide and / or the nucleic acid-specific fluorescent dye is incorporated into the nucleic acid polymer as the reaction product in the reaction process, the fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization system changes. The change or amount of change is measured. When the nucleic acid probe is present, the probe and the nucleic acid polymer are hybridized, and the fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization reaction system changes uniquely.
3) If necessary, the reaction product is analyzed by electrophoresis and HPLC.
In the above-described nucleic acid polymerization system, in particular, (6) containing a nucleic acid primer is preferably DNA as the nucleic acid polymer that is the output of the nucleic acid polymerization system. In the case of (1) and (2), RNA is preferred as the nucleic acid polymer that is the output of the nucleic acid polymerization system. A system containing a labeled or unlabeled dideoxynucleotide is preferably used for measurement, analysis or analysis of polymorphism (including SNP) or mutation described later.
[0042]
In the present invention, the meaning of “with or without at least one nucleic acid primer” means at least one template nucleic acid (eg, crude template nucleic acid) or a sample containing at least one template nucleic acid, crude nucleic acid This is because many synthesizing enzymes have oligonucleotides that can hybridize to a template nucleic acid and become a precursor of a nucleic acid polymer. In many cases, the crude template nucleic acid and the crude nucleic acid synthetase contain enzymes that synthesize the precursor.
In addition, the RNA-based nucleic acid polymerization reaction may proceed without the presence of the nucleic acid primer.
[0043]
When a nucleic acid synthesis system is contained in a sample containing at least one type of template nucleic acid (for example, crude template nucleic acid) or at least one type of template nucleic acid (for example, cell extracts of various organisms), the nucleic acid The nucleic acid polymerization reaction takes place without adding a synthase. In this case, at least one selected from the group consisting of at least one fluorescently labeled nucleotide, a quencher labeled nucleotide, and a nucleic acid-specific fluorescent dye, or a nucleic acid primer is present in the reaction system to carry out the reaction. Just start.
[0044]
The above reaction may be carried out under known reaction conditions. For example, the reaction is performed at a temperature of 10 ° C. to less than the nucleic acid denaturation temperature, specifically, depending on the type of nucleic acid synthase. For example, when DNA polymerase is used, the temperature is 10 ° C. to less than the nucleic acid denaturation temperature, preferably 30 to 90 ° C., and more preferably 30 to 80 ° C. When RNA polymerase is used, it is 30 to 60 ° C., and when reverse transcriptase is used, it is 30 to 70 ° C. The reaction time is until equilibrium is reached when the fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization system is monitored as a function of time. For example, it is 10 seconds to 10 hours, preferably 10 seconds to 2 hours, and more preferably 10 seconds to 1 hour.
[0045]
The change in the fluorescence intensity is estimated to be caused by at least one phenomenon of the group consisting of the following phenomena. And it is intricately engaged.
(1) Interaction between a nucleic acid-specific fluorescent dye and a fluorescent dye (FRET (fluorescence resonance energy transfer) phenomenon).
(2) Interaction between fluorescent dyes (FRET phenomenon).
(3) Interaction between quencher substance and fluorescent dye (fluorescence quenching phenomenon) (same as (2) above).
(4) Interaction between guanine base and fluorescent dye (fluorescence quenching phenomenon).
In the present invention, the interaction is a reaction in which one excitation energy moves to the other. In addition, the “fluorescence quenching phenomenon” is sometimes simply referred to as “fluorescence quenching”.
[0046]
Hereinafter, a preferable practical method for measuring a change or amount of fluorescence intensity is a method of measuring a fluorescence intensity of a nucleic acid polymerization system in real time to obtain a measurement value. In this case, it is desirable to use a commercially available apparatus that emits at least one type of incident light or excitation light and has at least one type of light receiving surface such as a photomultiplier, that is, has a multichannel. For example, Smart Cycler (Takara Bio Inc.), ABI PRISM^TM 7700 Sequence Detection System (SDS 7700) (PE Applied Biosystems), LightCycler^TM System (Roche Diagnostics, Mannheim Germany) or the like may be used.
[0047]
When an actual measurement value is obtained, at least one of the following is performed.
(1) Measurement of the nucleic acid polymerization system before and after the nucleic acid polymerization reaction.
(2) Measurement of a nucleic acid polymerization system using as a control a system in which nucleic acid synthesis is not performed (for example, a system in which no template nucleic acid or nucleic acid synthase is added).
(3) The fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization system in which the nucleic acid synthesis has reached equilibrium is first measured, and then measured after nucleic acid denaturation treatment (for example, treatment at 90 to 98 ° C.) of the nucleic acid polymerization system.
[0048]
By processing (analyzing) the measurement value obtained by the above method using a data analysis method described later, template nucleic acid (unknown nucleic acid, target nucleic acid) species existing in one system in nature, and those nucleic acids The concentration such as the copy number before polymerization or amplification can be known. And it becomes better data.
[0049]
The features of the present invention will be described below with reference to the drawings.
1) Method A of the present invention (see FIG. 1)
(1) At least one type of fluorescently labeled nucleotide is incorporated into a nucleic acid polymer, and is derived from the interaction between the labeled fluorescent dye (A) and the labeled fluorescent dye (B) between the incorporated fluorescently labeled nucleotides. By measuring the change of the fluorescent character of the nucleic acid polymerization system or monitoring the change as a function of time (hereinafter simply referred to as monitoring), measuring the template nucleic acid or the nucleic acid polymer that templated the template nucleic acid Features. In this method, the nucleic acid polymerization system is an example of the nucleic acid polymerization systems (1) and (2), and corresponds to the inventions of claims 1 to 3.
[0050]
(2) In the method (1), a nucleic acid polymerization reaction is performed in a nucleic acid polymerization system containing a nucleic acid primer. In this case, the nucleic acid primer is used as a precursor (primer) of the nucleic acid polymer. In this method, the nucleic acid polymerization system is an example of the nucleic acid polymerization system (6), and corresponds to the invention of claim 5.
[0051]
When the fluorescently labeled nucleotide is incorporated into the nucleic acid polymer as in (1) and (2) above, the distance between the fluorescent dyes (A, B) labeled with the incorporated fluorescently labeled nucleotide is remarkably close, Interaction between fluorescent dyes that did not occur when dispersed in a solution occurs (see FIG. 1). It is possible to measure a template nucleic acid or a nucleic acid polymer that molds the template nucleic acid by measuring or monitoring the change or amount of fluorescence intensity derived from the interaction between fluorescent dyes.
[0052]
In this case, one of the interacting fluorescent dyes is a dye that gives excitation energy of the FRET phenomenon and is called a donor dye (A). The other is a dye that emits fluorescence upon receiving energy and is called an acceptor (B).
[0053]
In addition, acceptor dyes generally can undergo energy transfer from a donor dye, that is, a dye that can be an acceptor dye in a pair with a donor dye in a FRET phenomenon (in other words, quenching (quenching action) action on a donor dye) Any pigment can be used. The donor dye may be any one as long as it can transfer excitation energy to the acceptor dye. Applicable ones can be appropriately selected from the dyes.
[0054]
For example, FITC, BODIPY FL, BODIPY FL-based dye, BODIPY 493/503, 5-FAM, BODIPY 5-FAM, Tetramethylrhodamine, 6-TAMRA, and the like as preferred donor dyes, FITC, BODIPY FL, BODIPY 493/503, BODIPY 5-FAM, Tetramethylrhodamine, 6-TAMRA and the like can be mentioned.
[0055]
Suitable acceptor dyes depend on the type of donor dye that forms the pair. For example, if the donor dye is BODIPY FL, the BODIPY FL dye, BODIPY 493/503, 5-FAM, BODIPY 5-FAM, Tetramethylrhodamine, 6-TAMRA, etc., rhodamine X, BODIPY 581/591 Etc. can be used as acceptor dyes. This method measures the increase or decrease in fluorescence intensity of a specific wavelength of a fluorescent dye of a labeled nucleotide, that is, a nucleic acid polymerization system. When measuring the fluorescence intensity of the donor dye, a decrease in the fluorescence intensity is measured, and when measuring the fluorescence intensity of the acceptor dye, the increase in the fluorescence intensity is measured.
[0056]
2) Invention method B (see FIG. 2)
The nucleic acid polymerization system of the present invention is an example containing a nucleic acid-specific fluorescent dye. A nucleic acid polymerization system is an example of the nucleic acid polymerization system (8). The nucleic acid-specific fluorescent dye (C) binds to a nucleic acid polymer, a nucleic acid polymer / template nucleic acid complex, or a nucleic acid primer / template nucleic acid complex. Then, an interaction occurs between the fluorescent dye (D) of the fluorescently labeled nucleotide incorporated into the nucleic acid polymer and the nucleic acid-specific fluorescent dye (C). By measuring or monitoring the change in fluorescence intensity resulting from this interaction, it is possible to measure the template nucleic acid or the nucleic acid polymer that molds the template nucleic acid. This method corresponds to the invention of claim 15 of the claims, and measures a decrease in the fluorescence intensity of the nucleic acid-specific fluorescent dye (C) and an increase in the fluorescence intensity of the fluorescent dye (D) of the labeled nucleotide. It will be. That is, the increase or decrease in the fluorescence intensity at a specific wavelength of the nucleic acid polymerization system is measured.
[0057]
As described above, the nucleic acid-specific fluorescent dye (C) is added to the synthesized nucleic acid polymer in the process of incorporating the fluorescently labeled nucleotide into the nucleic acid polymer in the presence of the nucleic acid-specific fluorescent dye (C). The distance between the fluorescent dye (C) bound and the fluorescent dye (D) of the fluorescently labeled nucleotide incorporated in the reaction process is remarkably close (see FIG. 2). For this reason, the same interaction between the fluorescent dyes occurs.
[0058]
As the fluorescent dye (D) in this case, all of the above-mentioned fluorescent dyes can be used, but preferred are FITC, EDANS, 6-joe, TMR, Alexa 488, Alexa 532, BODIPY FL / C3, BODIPY R6G, BODIPY FL Alexa 532, BODIPY FL / C6, BODIPY TMR, 5-FAM, BODIPY 493/503, BODIPY 564, BODIPY 581, Cy3, Cy5, Texas red, x-Rhodamine and the like. Moreover, although all the above-mentioned nucleic acid-specific fluorescent dyes (C) can be used, preferred are Sybr green 1 and YO-PRO-1. Preferred fluorescent dye combinations include Syber green and Texas red, 6-joe, TMR, Alexa 532, BODIPY R6G, Alexa 532, BODIPY TMR, BODIPY 564, BODIPY 581, Cy3, Cy5, x-Rhodamine, and YO -PRO-1 and Texas red, 6-joe, TMR, Alexa 532, BODIPY R6G, Alexa 532, BODIPY TMR, BODIPY 564, BODIPY 581, Cy3, Cy5, Texas red, x-Rhodamine and the like.
[0059]
3) Invention method C
The presence or absence of unlabeled nucleic acid primer, the nucleic acid polymerization reaction is carried out in a nucleic acid polymerization system containing fluorescently labeled nucleotides, unlabeled nucleotides, template nucleic acids and nucleic acid synthase, and the fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization system A nucleic acid measurement method comprising measuring a template nucleic acid or a nucleic acid polymer templated from the decrease or decrease amount of the template nucleic acid. It is preferable that at least one of the unlabeled nucleotides contains guanine (g) and / or the template nucleic acid contains at least one guanine (g). That is, the base of the template nucleic acid corresponding to the base of the fluorescently labeled nucleotide incorporated into the nucleic acid polymer forms a gc (GC) pair, or is separated from the base of the fluorescently labeled nucleotide by 1 to 3 bases (corresponding to the corresponding The base is counted as 1.), G is present in the template nucleic acid, or an unlabeled nucleotide having the base G is present in the nucleic acid polymer, and the change in fluorescence intensity is caused by the mutual relationship between the fluorescent dye (E) and G. Method for measuring nucleic acid due to action. In this method, the nucleic acid polymerization system is an example of the nucleic acid polymerization system (2), and the invention corresponds to claims 7 and 8 in the claims.
[0060]
The decrease in the fluorescence intensity of the polymerization reaction system occurs in any of the following cases.
(1) The base of the fluorescently labeled nucleotide is cytosine (c) or guanine (g).
(2) The base of at least one unlabeled nucleotide is guanine (g).
(3) The template nucleic acid contains at least one guanine (g).
[0061]
As described above, guanine (g) in the template nucleic acid or guanine (g) in the synthesized nucleic acid polymer is included in the process of performing the nucleic acid polymerization reaction using the fluorescently labeled nucleotide and / or the unlabeled nucleotide. The distance between the unlabeled nucleotide guanine (g) and the incorporated fluorescently labeled nucleotide fluorescent dye (E) is very close (see FIG. 3). For this reason, the excitation energy of the labeled fluorescent dye (E), which did not occur when dispersed in the solution, is transferred to the guanine (g) base.
[0062]
In this case, as the fluorescent dye (E) to be labeled, all of the above-mentioned fluorescent dyes can be used, but preferred ones are FITC, EDANS, Texas red, 6-joe, TMR, Alexa 488, Alexa 532, BODIPY. FL / C3, BODIPY R6G, BODIPY FL, Alexa532, BODIPY FL / C6, BODIPY TMR, 5-FAM, BODIPY 493/503, BODIPY 564, BODIPY 581, Cy3, Cy5, Texas red, x-Rhodamine and the like.
[0063]
Preferred nucleotide monomers to be fluorescently labeled are nucleotide monomers based on cytosine (hereinafter abbreviated as c) (cytidylic acid, cytidine 5'-phosphate, cytidine 5'-diphosphate, cytidine 5'-triphosphate, or their weights). And a labeling site is a base part (amino group), a phosphoric acid part (OH group), or a ribose part (OH group at the 2 ′ or 3 ′ position). A preferred site is a base moiety or a phosphate moiety.
[0064]
4) Invention method D (see FIG. 4)
This is an example in which a fluorescently labeled nucleotide and a quencher labeled nucleotide are used in (1) or (2) of the method A of the present invention. That is, when a fluorescently labeled nucleotide and a quencher labeled nucleotide are incorporated into a nucleic acid polymer, the fluorescent dye (A) of the incorporated fluorescently labeled nucleotide and the quencher substance (Q) of the quencher labeled nucleotide approach and interact. By doing so (see FIG. 4), the fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization system decreases. By measuring the decrease in the fluorescence intensity or monitoring the decrease, the template nucleic acid or the nucleic acid polymer using the template nucleic acid is measured. In this method, the nucleic acid polymerization system is an example of the nucleic acid polymerization system (1) and / or (2), and corresponds to the invention of claims 3 and / or 4. Then, the decrease in the fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization system is measured.
[0065]
Quencher substances (also called “fluorescence quenchers”) that can be used in this method include, for example, Dabcyl, QSY7 (Molecular Probes), QSY33 (Molecular Probes) or derivatives thereof, methyl viologen, N, N′-dimethyl-2,9-diazopyrenium and the like, preferably Dabcyl and the like can be exemplified.
[0066]
As described above, when a nucleic acid polymerization reaction is carried out in the presence of a fluorescently labeled nucleotide and a quencher labeled nucleotide in the nucleic acid polymerization system, the fluorescently labeled nucleotide and the quencher labeled nucleotide are incorporated into the nucleic acid polymer. The distance between the fluorescently labeled nucleotide incorporated into the nucleic acid polymer and the quencher labeled nucleotide is very close. As a result, the distance between the labeled fluorescent dye (A) and the quencher substance (Q) is also very close (see FIG. 4). For this reason, an interaction (luminescence energy transfer phenomenon) between the labeled quencher substance (Q) and the labeled fluorescent dye (A), which did not occur when dispersed in the solution, occurs.
[0067]
5) Invention method E (see FIGS. 5 and 6)
This is an example of using a labeled nucleic acid primer as a nucleic acid primer in (2) of the method A of the present invention. In the process of polymerizing the template nucleic acid, the labeled nucleotide is incorporated into the nucleic acid polymer. The fluorescence intensity changes due to the interaction between the fluorescent dye (A) or quencher substance (Q) of the labeled nucleic acid primer and the fluorescent dye (A) or quencher substance (Q) of the labeled nucleotide. This is a method of measuring a template nucleic acid or a nucleic acid polymer that molds the template nucleic acid by measuring or monitoring this change. In this method, the nucleic acid polymerization system is an example of the nucleic acid polymerization system (6), and corresponds to the invention of claim 6. Then, an increase or decrease in the fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization system is measured. In this case, the increase or decrease in fluorescence intensity is caused by the combination of the fluorescent dye (A) or quencher substance (Q) of the labeled nucleotide and the fluorescent dye (A) or quencher substance (Q) of the labeled nucleic acid primer. Dependent. The relationship between the donor dye and the acceptor dye is the same as in the method A of the present invention. The relationship between the quencher substance and the fluorescent dye is the same as in the method D of the present invention.
[0068]
As described above, when a nucleic acid polymerization reaction such as (2) of the method A of the present invention is performed using a labeled nucleic acid primer and a fluorescently labeled nucleotide, the labeled nucleic acid primer and the fluorescently labeled nucleotide are incorporated into the nucleic acid polymer. The distance between the labeled nucleic acid primer incorporated into the polymer and the fluorescent dye (A) or quencher substance (Q) of the fluorescently labeled nucleotide is remarkably close (see FIGS. 5 and 6). For this reason, the fluorescent dye (A) or quencher substance (Q) of the primer which was not generated in the state dispersed in the solution and the fluorescent dye (A) or quencher substance (Q) of the labeled nucleotide can interact with each other. Action occurs.
[0069]
As the interaction between substances that can occur in the present invention, (1) the interaction between the fluorescent dye (A) of the labeled nucleic acid primer and the fluorescent dye (B) of the labeled nucleotide, (2) the fluorescent dye (A) of the labeled nucleic acid primer and There are three possible cases: interaction between the quencher substance (Q) of the labeled nucleotide and (3) interaction between the quencher substance (Q) of the labeled nucleic acid primer and the fluorescent dye (A) of the labeled nucleotide ( FIG. 5 shows the case (1), and FIG. 6 shows the case (3). The labeled nucleic acid primer is different from the known solution-type nucleic acid probe (described later), and it is not necessary to design the probe so that the fluorescence intensity changes upon hybridization to the template nucleic acid. Therefore, this method has the advantage that the establishment of an experimental system is simple and reliable. A suitable fluorescent dye used in the present method is the same as in the present method A. The quencher substance is the same as in the method D of the present invention.
[0070]
6) Invention method F (see FIG. 7)
In the method (2) of the method A of the present invention, a labeled nucleic acid primer is used as a nucleic acid primer, and an unlabeled nucleotide is used instead of a labeled nucleotide (that is, no labeled nucleotide is used). The fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization system decreases due to the interaction between the fluorescent dye (A) labeled on the labeled nucleic acid primer and the G of the unlabeled nucleotide having the incorporated G base. By measuring the decrease in the fluorescence intensity or monitoring the decrease, the template nucleic acid or the nucleic acid polymer that templates the template nucleic acid is measured. In this method, the nucleic acid polymerization system is an example of the nucleic acid polymerization system (7), and is an invention corresponding to claims 9 and 10.
[0071]
That is, the unlabeled nucleotide contains G and is separated from the base labeled with the fluorescent dye (A) of the fluorescently labeled nucleic acid primer in the synthesized nucleic acid polymer by 1 to 3 bases (the labeled base is 1 This occurs when there is at least one G in the newly polymerized (meaning not a base in the strand of the primer) nucleic acid polymer (see FIG. 7). The labeled nucleic acid primer described in the previous section does not need to design a probe so that the fluorescence intensity changes when it is hybridized to a template nucleic acid, unlike a known solution-type nucleic acid probe. Therefore, like the method E of the present invention, this method has the advantage that the establishment of an experimental system is simple and reliable. Suitable fluorescent dyes used in the present method are the same as in Method C of the present invention.
[0072]
7) Method G of the present invention (see FIG. 8)
In the methods A to F of the present invention, instead of using fluorescently labeled nucleotides or quencher labeled nucleotides, nucleotide monomers labeled with at least one selected from the group consisting of immune-related substances, that is, antigens, antibodies and anti-antibodies ( This is an example using an immune-related labeled nucleotide). Illustratively, the antibody labeled with the nucleotide monomer is bound with an antigen or anti-antibody corresponding to the antigen, anti-antibody or the like, to which a fluorescent dye or a quencher substance is bound. As a result, it acts in the same manner as fluorescently labeled nucleotides or quencher labeled nucleotides. Further, an antibody to which a fluorescent dye or a quencher substance is bound is bound to the antigen. An antibody to which a fluorescent dye or a quencher substance is bound is bound to the anti-antibody. As a result, the immune-related labeled nucleotide acts in the same manner as a fluorescently labeled nucleotide or a quencher labeled nucleotide.
In addition, labeling nucleotides with at least one selected from the group consisting of immune-related substances, that is, antigens, antibodies and anti-antibodies can be achieved by the above-mentioned conventionally known methods. In addition, it is preferable to obtain them by commissioned synthesis (Japan Genetics Research Institute Co., Ltd. (http://www.ngrl.co.jp)) as described above.
[0073]
Since this method is as described above, the immune-related labeled nucleotide is bound to a fluorescent dye or a quencher substance, and the immune-related substance corresponding to the immune-related substance of the immune-related labeled nucleotide forms one pair. Form. This pair is a complex in which an immune-related substance labeled with an immune-related labeled nucleotide binds to the above-mentioned immune-related substance to which a fluorescent dye or a quencher substance is bound, even though it is not labeled with a nucleotide. To do. Therefore, it can be recognized that this complex has a structure in which nucleotides are labeled. Therefore, in the present invention, for the sake of simplicity, this complex is treated as the same as the fluorescent dye and the quencher substance. Therefore, the fluorescent dye of the present invention is defined to include the complex containing the fluorescent dye in addition to the fluorescent dye described above. Similarly, the quencher substance of the present invention is defined to include the complex containing the quencher substance in addition to the above-described quencher substance. A complex containing a fluorescent dye, i.e., an immunologically related substance, a labeled nucleotide was put into the concept of a fluorescently labeled nucleotide and called a fluorescently labeled nucleotide. The same applies to the quencher substance, and the labeled nucleotide is referred to as a quencher-labeled nucleotide with an immune-related substance containing the quencher substance. In addition, in the case of a nucleic acid primer labeled with an immune-related substance, a nucleic acid primer labeled with an immune-related substance containing a fluorescent dye is labeled with a fluorescent-labeled nucleic acid primer and an immune-related substance containing a quencher in the same manner as the nucleotide. The nucleic acid primer was called a quencher labeled nucleic acid primer.
[0074]
Therefore, the immune-related labeled nucleotide and the immune-related labeled nucleic acid primer are the nucleotide, the primer is an immune-related substance corresponding to the nucleotide and the immune-related substance of the primer to which a fluorescent dye or a quencher substance is bound. It is defined as including. Specifically, the nucleotide and / or primer and the immune-related substance to which a fluorescent dye or a quencher substance is bound are present together in the nucleic acid polymerization system, and the fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization system is measured. become.
[0075]
Thus, in the same manner as in the above-described methods A to F of the present invention, a nucleic acid polymer or a template nucleic acid thereof, or a template nucleic acid or a nucleic acid polymer that uses the template nucleic acid can be measured. As mentioned above, this method corresponds to all of this invention including the method of postscript, and measures the increase or decrease of the fluorescence intensity of a nucleic acid polymerization system.
[0076]
As described above, a process of performing a nucleic acid polymerization reaction by labeling a nucleotide with an antigen, an antibody or an anti-antibody so that any of the substance-to-substance interactions shown in the above-described methods A to F of the present invention occurs. The nucleotides labeled with them are incorporated into the nucleic acid polymer. FIG. 8 is a diagram using the interaction between the fluorescent dyes shown in the method A of the present invention. Unlike the homogeneous solution type nucleic acid probe (shown later) shown in the known technique, there is no need to design the probe so that the fluorescence intensity changes when hybridized to the template nucleic acid. Therefore, this method has the advantage that the establishment of an experimental system is simple and reliable.
[0077]
8) Invention method H (not shown)
The method includes two inventions.
i) A nucleic acid polymerization system is an example of the nucleic acid polymerization system (3), and corresponds to claims 12 to 15 of the claims. At least one dideoxynucleotide monomer labeled with a template nucleic acid, at least one fluorescent dye and / or at least one quencher substance (the former is “fluorescently labeled dideoxynucleotide”, the latter is “quencher-labeled dideoxynucleotide”) Both are collectively referred to as “labeled dideoxynucleotide”), and a nucleic acid polymerization reaction is performed in a nucleic acid polymerization system containing a nucleic acid synthase, and a template nucleic acid or a nucleic acid using the same as a template is determined based on a change or amount of fluorescence intensity. A method for measuring nucleic acid, comprising measuring a polymer. The nucleic acid polymerization system is a system containing at least one selected from the group consisting of labeled nucleotides and unlabeled nucleotides. In addition, the nucleic acid polymerization system is a system including an unlabeled nucleic acid primer.
[0078]
ii) The nucleic acid polymerization system is an example of the nucleic acid polymerization system (7), and corresponds to claim 16 of the claims. At least one dideoxynucleotide monomer (referred to as "unlabeled dideoxynucleotide"), labeled nucleotide, unlabeled nucleic acid primer not labeled with a template nucleic acid, at least one fluorescent dye and / or at least one quencher substance Characterized in that a nucleic acid polymerization reaction is carried out in a nucleic acid polymerization system containing a nucleic acid-specific fluorescent dye and a nucleic acid synthase, and a template nucleic acid or a nucleic acid polymer using the template as a template is measured from a change or amount of fluorescence intensity. This is a method for measuring nucleic acid. In the above inventions i) and ii), the concept of the fluorescent dye and the quencher substance is the same as that of the method G of the present invention.
[0079]
In addition, the said method can be suitably utilized for the measurement, analysis, or analysis of polymorphism (including SNP) and / or mutation by combining with the single base extension reaction method. That is, the nucleic acid primer designed so that the 3 ′ terminal base of the nucleic acid primer is adjacent to the target polymorphism (including SNP) and / or the base of the mutation site in the template nucleic acid, and the target primer in the template nucleic acid Nucleic acid polymerization reaction or nucleic acid amplification reaction of the invention using a non-labeled or labeled dideoxynucleotide having a base that is complementary to polymorphism (including SNP) and / or mutated base (can be hydrogen-bonded) or not complementary When performing the above, there is a difference in the fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization system due to the presence or absence of polymorphisms (including SNPs) and / or mutant bases. The objective can be achieved by the difference. Specifically, it was shown in Example 5 and Example 6.
[0080]
9) Method I of the present invention (see FIG. 9)
The method according to any one of the above methods A to G of the present invention, wherein a template nucleic acid is polymerized from one or more nucleic acid primers immobilized on a solid surface using various nucleic acid synthetases. is there.
[0081]
As described above, one or more nucleic acid primers are immobilized on a solid surface, and a template nucleic acid is polymerized using various nucleic acid synthases. At this time, a nucleic acid primer, a fluorescently labeled nucleotide, a quencher-labeled nucleotide, a nucleic acid-specific fluorescent dye, etc. are prepared so that an interaction between any of the above-described methods A to H of the present invention occurs. By monitoring the change or amount of the fluorescence intensity generated at this time, it is possible to simply measure the nucleic acid polymer or its template nucleic acid or the nucleic acid polymer that templated it (see FIG. 9: The interaction between fluorescent dyes shown in Invention Method A is used.)
[0082]
As described above, when this method is observed from one template nucleic acid or one complex of the template nucleic acid and a newly polymerized and synthesized nucleic acid polymer, a plurality of nucleic acid polymers newly synthesized and synthesized can have a plurality of nucleic acids. Since the fluorescent dye is included, the measurement sensitivity is further improved as compared with the method using the homogeneous solution-based nucleic acid probe based on the fluorescence intensity change of a single kind of fluorescent dye. Changes in fluorescence intensity due to energy transfer from nucleic acid-specific fluorescent dye incorporated in complex of template nucleic acid and unlabeled or labeled nucleic acid primer or newly polymerized nucleic acid polymer to labeled fluorescent dye Therefore, the measurement sensitivity is remarkably improved. Moreover, there is an advantage that one or more kinds of various nucleic acids including a target gene can be simultaneously measured easily and rapidly.
[0083]
In the method for analyzing data obtained by the method of the present invention, the fluorescence intensity value of a fluorescent dye having a role as a donor or a nucleic acid-specific fluorescent dye in a nucleic acid polymerization FRET phenomenon is used as an acceptor. Dividing by the fluorescence intensity value of the fluorescent dye possessed or the reverse operation results in more favorable data. Therefore, this data processing method is also included in the present invention.
[0084]
In the method of the present invention, the following homogeneous solution-type nucleic acid probes (oligonucleotides specifically hybridized to a template nucleic acid and labeled with a fluorescent dye or a quencher substance) of (1) to (7) below, The nucleic acid measurement method can be suitably applied to the method of the present invention, particularly to a labeled nucleic acid primer. When used as the primer, it is as described above. When used as a simple probe described in the nucleic acid amplification method, it is preferable to use DNA or RNA polymerase lacking exonuclease and ligase as a nucleic acid synthesizing enzyme. When the homogeneous solution nucleic acid probe is hybridized to the template nucleic acid, it is incorporated into the nucleic acid polymer of the present invention. In addition, when DNA or RNA polymerase having exonuclease activity is used, it is degraded. After the decomposed nucleotide is converted into a triphosphate with kinase or the like, it is incorporated into the nucleic acid polymer of the present invention.
[0085]
(1) Probes typified by Morrison et al. Probes (Morrison et al., Anal. Biochem., 183: 231-244, 1989).
(2) A probe represented by a probe by Mergney et al. (Mergney et al., Nucleic acid Res., 22: 920-928, 1994).
(3) Representative by molecular beacon method (Tyagi et al., Nature Biotech., 14: 303-308, 1996; Schofield et al., Applied and Environ. Microbiol., 63: 1143-1147, 1997) Probe.
(4) Probes represented by the probe of Livak et al. (US patent No. 5,538,848).
[0086]
(5) A probe represented by a probe of KURATA et al. (KURATA et al., Nucleic acids Research, 2001, vol. 29, No. 6 e34). This probe is a homogeneous solution nucleic acid probe in which a single-stranded oligonucleotide is labeled with a fluorescent dye, but the base labeled with the fluorescent dye is G or C, or from the base corresponding to the labeled base of the corresponding nucleic acid. A homogeneous solution-type nucleic acid probe in which G or C exists 1 to 3 bases away (the base corresponding to the labeled base is counted as 1).
[0087]
(6) A probe represented by the probe of Davis et al. (Davis et al., Nucleic acids Res., 24: 702-706, 1996).
(7) A probe represented by a probe of HORN et al. (US Patent Application Publication No. US2001 / 0009760A1, Pub.Date: Jul. 26, 2001).
[0088]
The case where the nucleic acid polymerization method described above is a nucleic acid amplification method will be described below. The nucleic acid amplification method referred to in the present invention refers to a method for amplifying a nucleic acid in vitro. It does not ask | require well-known and unknown. For example, all including PCR method, LCR method (ligase chain reaction), TAS method, ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids) method, LAMP method, NASRA method, RCA method, TAMA method, UCAN method, etc. And
[0089]
Moreover, this PCR means various well-known PCR. For example, real-time monitoring quantitative PCR method, RT-PCR, RNA-primed PCR, Stretch PCR, reverse PCR, PCR using Alu sequence, multiplex PCR, PCR using mixed primers, PCR using PNA, PCR amplification It also includes a method for analyzing or analyzing a melting curve of the nucleic acid obtained.
[0090]
Specifically, in the above-described nucleic acid polymerization system, in particular, a system including a nucleic acid primer or a nucleic acid probe, the hybridization reaction, nucleic acid polymerization reaction (nucleic acid extension reaction), and denaturation reaction are regarded as one cycle (KURATA et al. , Nucleic acids Research, 2001, vol. 29, No. 6 e34), and measuring the change or amount of fluorescence intensity or relative fluorescence intensity of each cycle over time, This is a nucleic acid measurement method for measuring the concentration or copy number before nucleic acid amplification. Then, by measuring the change or change amount of the fluorescence intensity in each cycle over time, the number of cycles Ct at which the change or change amount of the fluorescence intensity or relative fluorescence intensity starts to be observed (visually) is obtained. From the relationship between the concentration or copy number of the template nucleic acid before nucleic acid amplification, the concentration or copy number of the template nucleic acid in the sample before nucleic acid amplification can be determined. Specifically, it describes in Examples 4-11.
[0091]
The above homogeneous solution nucleic acid probe can be preferably used as a nucleic acid primer (reverse and / or forward primer). In this case, an unlabeled nucleic acid primer from which the fluorescent dye and / or quencher substance labeled from the homogeneous solution system nucleic acid probe has been removed can also be suitably used. Since the nucleic acid polymer amplified by the nucleic acid amplification method contains at least one fluorescent dye, information obtained from the dissociation curve of the polymer using at least one measurement wavelength is useful.
[0092]
The nucleic acid amplification system of the present invention is a nucleic acid polymerization system {(1) to (8)}, preferably {(6), (7) and (8)}, more preferably { (6) and (7)}.
[0093]
The method of the present invention also includes the following data processing method. That is, in the method of analyzing the data obtained by the nucleic acid amplification method described above, the fluorescence intensity value of each cycle of the nucleic acid polymerization system containing the template nucleic acid and / or nucleic acid synthase is determined as the template nucleic acid and / or nucleic acid synthesis. When corrected by the fluorescence intensity value of each cycle of the nucleic acid polymerization system not containing the enzyme, preferable data is obtained. In addition, the fluorescence intensity value measured over time of a fluorescent dye having a role as a donor or a nucleic acid-specific fluorescent dye in the FRET phenomenon of a nucleic acid polymerization system is obtained over time. Data corrected by dividing by the measured fluorescence intensity value or by performing the reverse operation will be suitable. An electronic recording medium that records a procedure having an arithmetic processing process for performing such correction (hereinafter referred to as a correction arithmetic processing process) is also the present invention. A measurement and / or data analysis apparatus equipped with the electronic recording medium and a measurement using the apparatus are naturally within the scope of the present invention.
[0094]
A specific method for analyzing data obtained by the real-time quantitative PCR method using the nucleic acid polymerization reaction of the present invention is as follows. The real-time quantitative PCR method is currently a computer-readable record in which each procedure of a reaction apparatus for performing PCR, an apparatus for detecting luminescence of a fluorescent dye, a user interface, that is, a data analysis method is programmed and recorded. It is measured in real time on a medium (also known as Sequence Detection Software System) and an apparatus composed of a computer that controls and analyzes the data. Therefore, the measurement of the present invention is preferably performed by such an apparatus.
[0095]
The PCR reaction apparatus is an apparatus that repeatedly performs thermal denaturation reaction, annealing reaction, and nucleic acid extension reaction of a template nucleic acid (for example, the temperature can be repeated at 95 ° C., 60 ° C., and 72 ° C.). The detection system includes an argon laser for fluorescence excitation, a spectrograph, and a CCD camera. Further, a computer-readable recording medium on which each procedure of the data analysis method is programmed and recorded is used by being installed in the computer, and the system is controlled via the computer and output from the detection system. A program for analyzing data is recorded.
[0096]
The data analysis program recorded on the computer-readable recording medium is a process for measuring the fluorescence intensity for each cycle, and the measured fluorescence intensity as a function of the cycle, that is, as an amplification plot of PCR, on the computer display. A calibration curve for obtaining the copy number of the sample nucleic acid from the Ct value, the process of calculating the PCR cycle number (threshold cycle number: Ct) at which the change or amount of change in the fluorescence intensity or relative fluorescence intensity is detected, It consists of a process, a process of printing data of each process, and a plot value. When PCR progresses exponentially, a linear relationship is established between the Log value of the copy number of the nucleic acid to be measured at the start of PCR and Ct. Therefore, the initial copy number at the start of PCR of the template nucleic acid can be calculated by preparing a calibration curve using a known amount of copy number and detecting Ct of the sample containing the template nucleic acid with an unknown copy number.
[0097]
A method for measuring or analyzing polymorphism and / or mutation using the method of the present invention will be described below. That is, the nucleic acid polymerization system {(1) to (9)} of the nucleic acid polymerization method and the nucleic acid amplification method, preferably {(6), (7) and (8)}, more preferably {(6) and (7) }, A nucleic acid polymerization reaction or a nucleic acid amplification reaction is performed, and a change or amount of change in fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization system is measured over time or non-time, and a polymorphism (including SNP is included) from the measured value. .) And / or mutation measurement, analysis, or analysis. Preferably, the method is combined with a sequence specific extension method. Specifically, Examples 7 to 10 are shown.
[0098]
In this case, the non-labeled or labeled nucleic acid primer has a 3 ′ terminal base or the second base from the 3 ′ terminal (the 3 ′ terminal base is counted as 1), and a polymorphism (including SNP) for detection of the template nucleic acid. And / or a nucleic acid containing at least one unlabeled or labeled nucleic acid primer prepared so as not to be complementary to the mutated base (mutual bases can hydrogen bond) (other bases are complementary). It is preferable to perform nucleic acid polymerization or nucleic acid amplification reaction in a polymerization system. In the nucleic acid polymerization system containing the primer, when the nucleic acid polymerization or nucleic acid amplification reaction does not proceed using the primer as a precursor, the fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization system does not change. When proceeding in the opposite direction, a change in fluorescence intensity occurs. In general, the reaction temperature is preferably not less than the TM value of the primer and less than the denaturation reaction temperature (for example, 95 ° C.). In addition, the third base from the 3 'end of the primer is a base that is not complementary to the base of the template nucleic acid, and an artificial mismatch is formed between the template nucleic acid and the primer, thereby causing a nonspecific extension reaction. Is suppressed. That is, more accurate polymorphism can be determined. The reaction temperature in this case is preferably from about 5 ° C. lower than the TM value of the primer to below the denaturation reaction temperature. In the present invention, when the primer having a base that is not complementary to the polymorphic or mutated base of the template nucleic acid is referred to as an A-type primer, the primer having a complementary base is referred to as a B-type primer. . In this measurement method, reliable data can be obtained by using the A-type primer and the B-type primer in combination.
[0099]
Specifically, the following method is used.
A nucleic acid polymerization reaction or a nucleic acid amplification reaction is performed in the following nucleic acid polymerization system. Details are shown in Examples 7 and 8.
1) Nucleic acid polymerization system {(1) to (8)} of the nucleic acid polymerization or nucleic acid amplification method described above, preferably {(6), (7) and (8)}, more preferably {(6) and (7 )}. In this case, it preferably contains at least one type A primer as a labeled or unlabeled nucleic acid primer.
2) The nucleic acid polymerization system of 1) contains at least one B-type primer as described above.
3) The nucleic acid polymerization system of 1) contains at least one type A primer and at least one type B primer as described above (provided that the type A primer and the type B labeled with the same type of fluorescent dye) Excluding primers).
[0100]
In addition, when the A-type primer and the B-type primer labeled with the same kind of fluorescent dye are used, a nucleic acid polymerization reaction or a nucleic acid amplification reaction is performed in the reaction system of the above (1) and (2). A polymorphism (including SNP) or mutation can be measured by measuring a change or amount of fluorescence intensity over time and comparing the measured values. When the A-type primer and the B-type primer labeled with different kinds of fluorescent dyes are used, the nucleic acid polymerization reaction or the nucleic acid amplification reaction can be suitably performed in the nucleic acid polymerization system of (3) above. Even in this case, the nucleic acid polymerization reaction or the nucleic acid amplification reaction can be suitably performed in the nucleic acid polymerization systems (1) and (2).
In place of the above A-type or B-type primer, the target polymorphism (including SNP) and / or the base of the mutation in the template nucleic acid is complementary (can be hydrogen-bonded) or has a non-complementary base. As described above, polymorphism (including SNP) and / or mutation can be measured, analyzed, or analyzed by using at least one of unlabeled or labeled dideoxynucleotides.
[0101]
A group consisting of at least one type A primer and / or at least one type B primer, template nucleic acid, nucleic acid synthase, unlabeled nucleotide, labeled nucleotide, immune-related labeled nucleotide, labeled dideoxynucleotide and unlabeled dideoxynucleotide A reaction solution, measurement kit, or device for measuring, analyzing, or analyzing polymorphisms (including SNPs) and / or mutations, comprising at least one selected from the group consisting of:
[0102]
The nucleic acid measurement method of the present invention can be used in various fields such as medicine, forensic medicine, anthropology, ancient biology, biology, genetic engineering, molecular biology, agriculture, plant breeding and the like. Also referred to as complex microbial system or symbiotic microbial system, various kinds of microorganisms are mixed, or at least one microorganism is mixed with cells of other animals and plants and cannot be isolated from each other. Can be suitably used. Further, the present invention can be suitably applied to various nucleic acid measurement methods, for example, FISH method, LCR method, SD method, TAS method and the like.
The present invention discloses the inventions of claims 1 to 18 of the claims, and discloses some preferred embodiments described below.
[0103]
[1] A nucleic acid polymerization reaction is performed in any one of the following nucleic acid polymerization systems, and the change or amount of fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization system is measured, and the polymorphism (including SNP) and / or the measured value. A method for measuring a nucleic acid, comprising measuring, analyzing, or analyzing a mutation.
(1) A template nucleic acid, at least one kind of labeled nucleotide, and a nucleic acid synthase are included.
(2) In the above (1), an unlabeled nucleotide is included.
(3) A template nucleic acid, at least one labeled dideoxynucleotide, and a nucleic acid synthase are included.
(4) In (3) above, at least one selected from the group consisting of labeled nucleotides and unlabeled nucleotides is included.
[0104]
(5) Contains a template nucleic acid, an unlabeled dideoxynucleotide, a labeled nucleotide, and a nucleic acid synthase.
(6) In the above (1) to (5), a labeled nucleic acid primer or an unlabeled nucleic acid primer is further included.
(7) A template nucleic acid, an unlabeled nucleotide, a labeled nucleic acid primer, and a nucleic acid synthase are included.
(8) In any one of the above (1) to (7), a nucleic acid-specific fluorescent dye is included.
[0105]
[2] In any one of the following nucleic acid polymerization systems, a nucleic acid amplification reaction is performed with a hybridization reaction (annealing reaction), a nucleic acid polymerization reaction (nucleic acid extension reaction), and a denaturation reaction as one cycle. Alternatively, a method for measuring a nucleic acid, wherein the concentration or copy number of the template nucleic acid before nucleic acid amplification is measured by measuring the amount of change over time.
(1) A template nucleic acid, at least one kind of labeled nucleotide, and a nucleic acid synthase are included.
(2) In the above (1), an unlabeled nucleotide is included.
(3) A template nucleic acid, at least one labeled dideoxynucleotide, and a nucleic acid synthase are included.
(4) In (3) above, at least one selected from the group consisting of labeled nucleotides and unlabeled nucleotides is included.
[0106]
(5) Contains a template nucleic acid, an unlabeled dideoxynucleotide, a labeled nucleotide, and a nucleic acid synthase.
(6) In the above (1) to (5), a labeled nucleic acid primer or an unlabeled nucleic acid primer is further included.
(7) A template nucleic acid, an unlabeled nucleotide, a labeled nucleic acid primer, and a nucleic acid synthase are included.
(8) In any one of the above (1) to (7), a nucleic acid-specific fluorescent dye is included.
[0107]
[3] By measuring the change or amount of fluorescence intensity in each cycle over time, the number of cycles Ct at which the change or amount of fluorescence intensity starts to be observed is obtained, and the Ct and template nucleic acid before nucleic acid amplification are obtained. The method for measuring a nucleic acid according to [2], wherein the concentration or copy number of the template nucleic acid before nucleic acid amplification is measured from the relationship between the concentration and the copy number.
[4] A nucleic acid amplification reaction is performed in the nucleic acid polymerization system according to [2], and a change or amount of fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization system is measured over time. And / or the method for measuring a nucleic acid according to [2] above, wherein the mutation is measured, analyzed, or analyzed.
[5] The 3 ′ terminal base of the unlabeled or labeled nucleic acid primer or the second base from the 3 ′ terminal (the 3 ′ terminal base is counted as 1) and the polymorphism (including SNP) for detection of the template nucleic acid and Nucleic acid polymerization or nucleic acid amplification reaction is carried out in a nucleic acid polymerization system containing an unlabeled or labeled nucleic acid primer corresponding to the mutated base, the change or amount of fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization system is measured, and the polymorphism (SNP And / or the method for measuring a nucleic acid according to [1] or [4] above, wherein the mutation is measured, analyzed, or analyzed.
[0108]
[6] Measure, analyze, or analyze polymorphisms (including SNPs) and / or mutations by conducting a nucleic acid polymerization reaction or amplification in the following nucleic acid polymerization system and comparing the obtained data. The method for measuring a nucleic acid according to [1] or [4].
1) Any one of the nucleic acid polymerization systems {(1) to (8)} described above is the 3 ′ terminal base or the second base from the 3 ′ terminal (3 ′ terminal base) of the unlabeled or labeled nucleic acid primer 1)) contains at least one of those having a base that is not complementary to the base of the corresponding template nucleic acid (referred to as A-type primer).
2) In the nucleic acid polymerization system of 1) above, the 3 ′ terminal base or the second base from the 3 ′ terminal of the unlabeled or labeled nucleic acid primer (the 3 ′ terminal base is counted as 1) is the corresponding template nucleic acid. The base contains at least one of those having a complementary base (referred to as B-type primer).
3) The nucleic acid polymerization system of 1) above contains at least one type A primer and at least one type B primer (excluding the type A primer and the type B primer labeled with the same type of fluorescent dye). ).
[0109]
[7] In the method for analyzing the data obtained in any one of the above items 1, 7, 9, 12, 16, and [1] and [3], Divide the fluorescence intensity value of the fluorescent dye having the role or the nucleic acid-specific fluorescent dye over time or non-time by the fluorescence intensity value of the fluorescent dye having the role as an acceptor, or perform the reverse operation. A data processing or analysis method characterized by that.
[8] In the method for analyzing data obtained by the method according to any one of [1], [9], [16], and [1], [3], a template nucleic acid or a nucleic acid synthase Data processing or analysis characterized by correcting the fluorescence intensity value of each cycle of a nucleic acid polymerization system containing a nucleic acid by the fluorescence intensity value of each cycle of the nucleic acid polymerization system not containing a template nucleic acid or nucleic acid synthase Method.
[0110]
[9] Selected from the group consisting of at least one type A primer and / or at least one type B primer, template nucleic acid, nucleic acid synthase, unlabeled nucleotide, labeled nucleotide, labeled dideoxynucleotide and unlabeled dideoxynucleotide Reaction solutions, measurement kits or devices for measuring, analyzing, or analyzing polymorphisms (including SNPs) and / or mutations, characterized by containing at least one kind.
[10] Vent (exo-) DNA Polymerase (derived from Thermococcus litoralis), Tgo (exo-) DNA Polymerase, and ThermoSequenase DNA Polymerase (Armersham manufactured by Armersham) in which 3 '→ 5' exonuclease activity is deleted ), AmpliTagGold, T7 Sequenase DNA Polymerase, The method for measuring a nucleic acid according to any one of claims 1, 7, 9, 12, 16, and [1], [4].
[0111]
[11] The method for measuring a nucleic acid according to [4], wherein the nucleic acid amplification method is any one of a PCR method, an ICAN method, a LAMP method, a NASBA method, an RCA method, a TAMA method, and an LCR method.
[12] The method for measuring a nucleic acid according to [11], wherein the PCR method is a real-time quantitative PCR method.
[13] The nucleic acid primer labeled with at least one of the labeled nucleic acid primers according to claim 5 is immobilized on a solid surface, and the above-described [1], 7, 9, 12, 16, and [1] [2] A device (DNA chip) characterized in that the method according to any one of [2] can be performed.
[14] The method according to any one of [1], [2], wherein the nucleic acid polymerization reaction of a template nucleic acid is performed using the device (DNA chip). Method for measuring nucleic acid of
[0112]
[15] The template nucleic acid or the nucleic acid polymer using the template nucleic acid by the method according to any one of [1], [9], [12], [16], [1], [2], [4] An apparatus for measuring a nucleic acid amplification product capable of measuring fluorescence while changing temperature, and a procedure for causing a computer to execute the data processing or analysis method described in [7] and [8] above A measuring apparatus comprising a computer-readable recording medium recorded as a program.
[16] A method for labeling a base at an arbitrary position of a homogeneous solution-based nucleic acid probe with a fluorescent dye, using the method according to any one of [1], [7], [9], [12] and [2].
[0113]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples and comparative examples. In the following examples, terms are abbreviated as follows.
1) “Template nucleic acid” may be referred to as “template”.
2) “Nucleic acid primer” was designated as “primer”.
3) dNTSs, dATP, dGTP, dTTP, and dUTP have the same meaning as used in biology and the like at present.
Unless otherwise specified, the template, labeled or unlabeled nucleotide and labeled or unlabeled primer used in this example were commissioned synthesis (Nippon Genetics Research Institute (http://www.ngrl.co.jp). ) To obtain.
[0114]
The primers and base sequences used in this example are as follows. The base sequence is 3 'end on the right and 5' end on the left.
(Base sequence of synthetic single-stranded DNA)
Primer 1: CAGACTCGACAGTGTAGACCCG
Primer 2: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
Primer 3: TTGCATGTGTTAGGCCTG
[0115]
Moreover, the templates 1-9 had the following base sequences. The nucleotide sequence is 3 'on the right and 5' on the left.
Mold 1:
ACACACACACACACTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
Mold 2:
TATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
Mold 3:
TTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTATTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
Mold 4:
TTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTTATTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
Mold 5:
TTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTTATTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
[0116]
Mold 6:
TTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTTTATTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
Mold 7:
TTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTTTATTTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
Mold 8:
TTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTTTTATTTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
Mold 9:
TTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTTTTTATTTTTTCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
Mold 10:
GCTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
Mold 11:
GCTCCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
[0117]
Example 1 (Invention method B (2))
A template nucleic acid is measured using the FRET phenomenon between a double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye and a fluorescently labeled nucleotide.
[0118]
A) Various methods
1) Template DNA and primer synthesis
Single-stranded DNA (templates 1 to 9) and a 22-base primer (primer 1) used as templates in this example were prepared with a DNA synthesizer ABI394 (manufactured by Perkin Elmer, USA). Templates 1 to 9 have a common sequence complementary to primer 1 on the 3 ′ side. These templates are designed so that seven labeled dUTPs are incorporated during the extension reaction. The characteristics of the combination of template single-stranded DNA and primer 1 are shown below:
-Combination of template 1 and primer 1: One fluorescence-labeled nucleotide is incorporated every time one unlabeled nucleotide is incorporated.
-Combination of template 2 and primer 1: One fluorescence-labeled nucleotide is incorporated whenever three unlabeled nucleotides are incorporated.
Combination of template 3 and primer 1: One fluorescence-labeled nucleotide is incorporated whenever five unlabeled nucleotides are incorporated.
[0119]
Combination of template 4 and primer 1: One fluorescence-labeled nucleotide is incorporated whenever seven unlabeled nucleotides are incorporated.
Combination of template 5 and primer 1: One fluorescence-labeled nucleotide is incorporated whenever eight unlabeled nucleotides are incorporated.
-Combination of template 6 and primer 1: One fluorescence-labeled nucleotide is incorporated every 10 unlabeled nucleotides are incorporated.
-Combination of template 7 and primer 1: One fluorescence-labeled nucleotide is incorporated whenever 11 unlabeled nucleotides are incorporated.
-Combination of template 8 and primer 1: One fluorescence-labeled nucleotide is incorporated whenever 13 unlabeled nucleotides are incorporated.
[0120]
2) Polymerization (amplification) reaction conditions
As the DNA polymerase, Vent (exo-) DNA Polymerase (NEW ENGLAND BioLabs, Beverly, MA) derived from Thermococcus litoralis lacking 3 '→ 5' exonuclease activity was used. Cyanine 5-dUTP (650nm / 668nm), Lissamine as fluorescently labeled nucleotide^TM-5-dUTP (570 nm / 588 nm) and Texas Red (r) -5-dUTP (593 nm / 612 nm) (maximum absorption wavelength / maximum fluorescence wavelength in parentheses, PerkinElmer USA) were used. SYBR (r) that binds specifically to a double-stranded nucleic acid, has a maximum excitation wavelength at 497 nm, and emits maximum fluorescence at around 520 nm, to a donor dye for causing a FRET phenomenon to the labeled nucleotide incorporated by DNA polymerase Green I Nucleic Acid Gel Stain (Molecular probes, USA) was used.
[0121]
The reaction solution was prepared as follows.
・ 20mM Tris-HCl (pH8.8) ・ 10mM KCl ・ 10mM (NH_Four)₂SO_Four  ・ 2.5 mM MgSO_Four
・ 0.1% Triton X-100 ・ 0.25mg / ml BSA ・ 200nM dATP ・ 200nM dGTP
・ 200nM dCTP ・ 200nM Cyanine5-dUTP or Lissamine^TM-5-dUTP or Texas Red (r) -5-dUTP ・ 1 × SYBR (r) Green I ・ 2nM primer
・ 20nM synthetic single-stranded template DNA ・ 0.1 U (unit) Vent (exo-) DNA Polymerase
[0122]
Final volume of reaction solution 20 μl. The above reaction mixture was uniformly mixed, heat-denatured at 95 ° C. for 15 seconds, and then kept at 65 ° C. for 15 minutes. Light cycler for detecting fluorescence^TMThe system (Roche Diagnostics, Germany) was used. At that time, F1 (530 nm) in the system is used for detection of SYBR (r) Green I, and F2 (640 nm) is used for Lissamine.^TMDetection of −5-dUTP or Texas Red (r) -5-dUTP and F3 (710 nm) were used for detection of cyanine 5-dUTP. The excitation intensity was fixed at 75%.
[0123]
3) Details of the experimental system
Model 1-9: Combination of primer 1 and templates 1-9. Cyanine 5-dUTP was used as the fluorescently labeled nucleotide.
Model 10: Combination of primer 1 and template 9. For fluorescently labeled nucleotides, Cyanine 5-dUTP is used and Vent (exo-) DNA Polymerase is not added.
Models 11-19: Combination of primer 1 and templates 1-9. Fluorescently labeled nucleotide is Lissamine^TMUse -5-dUTP and do not add Vent (exo-) DNA Polymerase.
Model 20: Combination of primer 1 and template 9. Fluorescently labeled nucleotide is Lissamine^TMUse -5-dUTP and do not add Vent (exo-) DNA Polymerase.
Model 21-29: Combination of primer 1 and templates 1-9. Texas Red (r) -5-dUTP was used as the fluorescently labeled nucleotide.
Model 30: Combination of primer 1 and template 9. For fluorescently labeled nucleotides, Texas Red (r) -5-dUTP is used and Vent (exo-) DNA Polymerase is not added.
Models 31 to 39: Combination of primer 1 and templates 1 to 9. Instead of using fluorescently labeled nucleotides, dTTP is used.
Model 40: Combination of primer 1 and template 9. Instead of using fluorescently labeled nucleotides, dTTP is used. Do not add Vent (exo-) DNA Polymerase.
[0124]
The results are shown in FIGS. FIG. 10 shows changes in F1 fluorescence intensity of models 1 to 10, and FIG. 11 shows changes in F3 fluorescence intensity. The F1 fluorescence intensity change of the models 11 to 20 is shown in FIG. 12, and the F2 fluorescence intensity change is shown in FIG. The F1 fluorescence intensity change of the models 21 to 30 is shown in FIG. 14, and the F2 fluorescence intensity change is shown in FIG. The F1 fluorescence intensity change of the models 31 to 40 is shown in FIG.
[0125]
As a result, in the models 1 to 9, the fluorescence of F1 decreased about 40% at the maximum, and the fluorescence of F3 increased about 4 times at the maximum. In the reaction of model 10 to which no enzyme was added, although the fluorescence intensity of F1 slightly decreased, the fluorescence intensity of F3 did not change (FIGS. 10 and 11). In the models 11 to 19, the fluorescence intensity of F1 decreased about 40% at the maximum, and the fluorescence intensity of F2 increased about 2.5 times at the maximum. The fluorescence intensity of F2 of the model 20 to which no enzyme was added did not change (FIGS. 12 and 13). In the models 21 to 29, the fluorescence intensity of F1 decreased about 40% at the maximum, and the fluorescence intensity of F2 increased about 8 times at the maximum. In the model 30 to which no enzyme was added, the fluorescence intensity of F2 was not changed (FIGS. 14 and 15). In the models 31 to 39 using only SYBR (r) Green I, the fluorescence intensity of F1 increased 3 times at the maximum (FIG. 16).
[0126]
Thus, an energy transfer phenomenon was observed between the double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye (this time SYBR (r) Green I) and the fluorescently labeled nucleotide, and the template nucleic acid could be measured. That is, when the double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye serving as a donor supplies energy to each fluorescently labeled nucleotide serving as an acceptor, the donor fluorescence intensity (F1) decreases, and the acceptor fluorescence intensity (F2 or F3) decreases. Increased. In the system without enzyme, no change in fluorescence intensity was observed. In addition, in the SYBR (r) Green I-only system in which no fluorescence-labeled nucleotide was inserted, no energy transfer occurred, so only the fluorescence intensity (F1) of SYBR (r) Green I increased. With this technique, it was possible to measure the template nucleic acid by measuring either the decrease in the fluorescence intensity on the donor side or the increase in the fluorescence intensity on the acceptor side in the energy transfer phenomenon.
[0127]
Example 2 (Method A of the present invention)
The template nucleic acid is measured using the energy transfer phenomenon between fluorescently labeled nucleotides.
1) Template DNA and primer synthesis
The primers used in Example 1 and the template single-stranded DNA were used. The characteristics of the combination of template single-stranded DNA and primer 1 are shown below.
-Combination of template 1 and primer 1: Fluorescently labeled nucleotides and FITC labeled nucleotides are alternately incorporated one by one.
-Combination of template 2 and primer 1: Each time one unlabeled nucleotide is incorporated, one fluorescently labeled nucleotide and one FITC labeled nucleotide are alternately incorporated.
-Combination of template 3 and primer 1: Each time two unlabeled nucleotides are incorporated, one fluorescently labeled nucleotide and one FITC labeled nucleotide are incorporated alternately.
[0128]
-Combination of template 4 and primer 1: Each time three unlabeled nucleotides are incorporated, one fluorescently labeled nucleotide and one FITC labeled nucleotide are alternately incorporated.
-Combination of template 5 and primer 1: After FITC-labeled nucleotide is incorporated, 3 unlabeled nucleotides are incorporated. Next, fluorescently labeled nucleotides are incorporated. Four unlabeled nucleotides are incorporated. This is a repetition. Every time four unlabeled nucleotides are incorporated, one fluorescently labeled nucleotide and one FITC labeled nucleotide are incorporated alternately.
-Combination of template 6 and primer 1: Each time four unlabeled nucleotides are incorporated, one fluorescently labeled nucleotide and one FITC labeled nucleotide are alternately incorporated.
-Combination of template 8 and primer 1: Each time five unlabeled nucleotides are incorporated, one fluorescently labeled nucleotide and one FITC labeled nucleotide are alternately incorporated.
Combination of template 9 and primer 1: Each time six unlabeled nucleotides are incorporated, one fluorescently labeled nucleotide and one FITC labeled nucleotide are alternately incorporated.
[0129]
2) Polymerization (amplification) reaction conditions
Examples of fluorescently labeled nucleotides include cyanine 5-dUTP and Lissamine as fluorescently labeled nucleotides similar to Example 1.^TM-5-dUTP and Texas Red (r) -5-dUTP were used. FITC-dGTP (PerkinElmer, USA) was used as the FITC-labeled nucleotide.
[0130]
A reaction solution was prepared as follows.
・ 20mM TrisHCl (pH8.8) ・ 10mM KCl ・ 10mM (NH_Four)₂SO_Four・ 2.5 mM MgSO_Four
・ 0.1% Triton X-100 ・ 0.25mg / ml BSA ・ 200nM FITC-dGTP (donor dye)
・ 200nM dCTP ・ 200nM dATP ・ 200nM Cyanine 5-dUTP or Lissamine^TM-5-dUTP or Texas Red (r) -5-dUTP (Acceptor dye) ・ 2nM primer
・ 20nM single-stranded template DNA ・ 0.1 U Vent (exo-) DNA Polymerase
[0131]
Final volume of reaction solution 20 μl. The above reaction mixture was uniformly mixed, heat-denatured at 95 ° C. for 15 seconds, and then kept at 65 ° C. for 15 minutes. Light cycler for detecting fluorescence^TMThe system was used. For detection, F1, F2, and F3 were used, and the excitation intensity was fixed at 75%.
[0132]
3) Details of the experimental system
Model 1-7: Primer 1 and Template 1, Primer 1 and Template 2, Primer 1 and Template 3, Primer 1 and Template 4, Primer 1 and Template 6, Primer 1 and Template 8, Primer 1 and Template 9 , Cyanine 5-dUTP is used.
-Model 8: Use primer 1 and template 6, use cyanine 5-dUTP as the fluorescently labeled nucleotide, and add no Vent (exo-) DNA Polymerase.
Models 9 to 15: Primer 1 and template 1, primer 1 and template 2, primer 1 and template 3, primer 1 and template 4, primer 1 and template 6, primer 1 and template 8, primer 1 and template 9 , Lissamine^TMUse -5-dUTP.
[0133]
・ Model 16: Using primer 1 and template 6, Lissamine as fluorescently labeled nucleotide^TMUse -5-dUTP and do not add Vent (exo-) DNA Polymerase.
Models 17 to 23: Primer 1 and Template 1, Primer 1 and Template 2, Primer 1 and Template 3, Primer 1 and Template 4, Primer 1 and Template 6. Texas Red (r) -5-dUTP is used in combination of primer 1 and template 8 and primer 1 and template 9.
-Model 24: Use primer 1 and template 6, use Red (r) -5-dUTP as the fluorescently labeled nucleotide, and do not add Vent (exo-) DNA Polymerase.
[0134]
The results are shown in FIGS. FIG. 17 shows changes in the fluorescence intensity of F1 of models 1 to 8, and FIG. 18 shows changes in the fluorescence intensity of F3. FIG. 19 shows changes in the fluorescence intensity of F1 of models 9 to 16, and FIG. 20 shows changes in the fluorescence intensity of F2. Changes in the fluorescence intensity of F1 of models 17 to 24 are shown in FIG. 21, and changes in the fluorescence intensity of F2 are shown in FIG.
[0135]
As a result, in models 1 to 7, the fluorescence intensity of F1 decreased by about 50% at the maximum, and the fluorescence of F3 increased by about 5 times at the maximum. In the reaction of model 8 with no enzyme added, no fluorescence change was observed (FIGS. 17 and 18). In models 9 to 15, the fluorescence intensity of F1 decreased by 60% at the maximum, and the fluorescence intensity of F2 increased by about 2.5 times at the maximum. The fluorescence intensity of model 16 to which no enzyme was added did not change (FIGS. 19 and 20). In models 17 to 23, the fluorescence intensity of F1 decreased by 50% or more at the maximum, and the fluorescence intensity of F2 increased by about 4.5 times at the maximum. There was no change in model 24 with no enzyme added (FIGS. 21 and 22).
[0136]
From the above results, it was possible to measure the template nucleic acid from the change in the fluorescence intensity value due to the energy transfer phenomenon between the fluorescently labeled nucleotides synthesized by the DNA polymerase. That is, the fluorescence intensity (F1) of FITC-labeled nucleotide, which is a donor fluorescent dye, decreases, and cyanine 5, Lissamine, which becomes an acceptor fluorescent dye.^TMThe fluorescence intensity (F2 or F3) of Texas Red (r) labeled nucleotide was increased. The fluorescence intensity did not change in the system without enzyme. As in Example 1, it was possible to measure the template nucleic acid by measuring either the decrease in the fluorescence intensity on the donor fluorescent dye side or the increase in the fluorescence intensity on the acceptor fluorescent dye side. Therefore, it was found that by obtaining the fluorescence intensity value of the acceptor fluorescent dye / the fluorescence intensity value of the donor fluorescent dye, a higher S / N ratio can be obtained, and this is a highly sensitive template nucleic acid measurement method. From this result, it was shown that the template nucleic acid can be measured easily and with high sensitivity without using a homogeneous solution nucleic acid probe.
[0137]
Example 3 (Invention Method A (2))
Real-time quantitative PCR using FITC-labeled nucleotide and Cy5-labeled nucleotide
1) Template synthesis
The mold isPseudomonas fluorescens A 1400 bp DNA fragment of DSM 50108 (PF) 16S ribosomal DNA was used. The template was prepared as follows. PCR reaction was performed using primers 2 and 3 and PF genome as a template. The amplified fragment was purified by Microcon PCR (r) (Millipore, USA), then the concentration was measured and converted to the copy number.
[0138]
2) PCR reaction conditions
The reaction solution was prepared as follows.
・ 20mM Tris-HCl (pH8.8) ・ 10mM KCl ・ 10mM (NH_Four)₂SO_Four  ・ 2.5 mM MgSO_Four
・ 0.1% Triton X-100 ・ 0.25mg / ml BSA ・ 20μM primer pair
・ Final concentration 1 × 10⁹~ 1x10^FiveCopy template DNA
・ 0.2 U Vent (exo-) DNA Polymerase ・ 6μM dATP, dCTP, dGTP mixture
・ 2.5μM dTTP ・ 0.25μM Cy5 5-dUTP ・ 0.25μM FITC-5-dUTP
[0139]
Final volume of reaction solution 20 μl. The above reaction mixture is uniformly mixed and heat-denatured at 95 ° C. for 30 seconds, and then subjected to 40 cycles of denaturation reaction 95 ° C., 10 seconds, annealing reaction 56 ° C., 10 seconds, extension reaction 72 ° C., 70 seconds. It was. Light cycler for detecting fluorescence^TMThe system was used. F1 and F3 were used for detection, and the excitation intensity was fixed at 75%.
[0140]
PCR was performed under the conditions described above, and the fluorescence intensity of each cycle was measured. The results are shown in FIGS. That is, for each copy number of template ribosomal DNA, the fluorescence intensity during the annealing reaction in each cycle was measured and printed. It is observed that the fluorescence intensity of F1 decreases and the fluorescence intensity of F3 increases from around the sixth cycle. Furthermore, it can be seen that the decrease in the fluorescence intensity of F1 (donor fluorescent dye) and the increase in the fluorescence intensity of F3 (acceptor fluorescent dye) occur in order of increasing copy number. Here, it is observed that the F1 fluorescence intensity decreases with each cycle, even in a 0-copy blank to which no template DNA is added. Therefore, the fluorescence intensity value was corrected for this point. That is, the F1 fluorescence intensity value of each cycle was divided by the blank fluorescence intensity value at the same cycle number.
Fn = fn (56 ° C.) / F′n (56 ° C.)
Where Fn = correction value of the fluorescence intensity value in each cycle, fn (56 ° C.) = 56 ° C. fluorescence intensity value of the sample in each cycle, f′n (56 ° C.) = Fluorescence intensity of the blank in each cycle at 56 ° C. value
[0141]
Further, it can be seen that the fluorescence intensity value at the initial cycle number is not two-fold for each copy number of the template ribosomal DNA. Therefore, the fluorescence intensity value was also corrected for this point. That is, the fluorescence intensity value at each cycle was converted with the fluorescence intensity value at the fifth cycle as 1.
Cn = Fn (56 ° C.) / F5 (56 ° C.)
However, Cn = converted value of fluorescence intensity value in each cycle, Fn (56 ° C.) = 56 ° C. fluorescence intensity value in each cycle, F5 (56 ° C.) = Fluorescence intensity value at 56 ° C. in the fifth cycle.
As the correction method for the above two points, either the fluorescence intensity value after the annealing reaction (here, 56 ° C.) or after the extension reaction (72 ° C.) may be used.
[0142]
When processed by this method, the fluorescence intensity value of each cycle is converted with the fluorescence intensity value of the fifth cycle as 1, and the converted value is plotted against the corresponding cycle number. The data processed in the above process are shown in FIGS. A threshold value was set, the number of cycles that reached that value was plotted on the X axis, and the number of copies of the template ribosomal DNA before starting the reaction was plotted on the Y axis to draw a calibration curve. Actually, the threshold value when the Y axis is F1 fluorescence intensity is 0.85, and the threshold value when the Y axis is F3 fluorescence intensity is 1.5. The correlation coefficients (R2) obtained by processing in these processes were 0.9965 (FIG. 27) and 0.9931 (FIG. 28), respectively.
[0143]
When PCR is performed using dNTP containing two kinds of fluorescently labeled nucleotides as a substrate, two kinds of fluorescently labeled nucleotides are labeled on the product by the action of DNA polymerase. Utilizing this fact, real-time quantitative PCR using the energy transfer phenomenon between two kinds of fluorescently labeled nucleotides labeled in one molecule was performed. Comparing the fluorescence intensity values in the initial and plateau phases, the fluorescence intensity value of the donor (here, F1) was reduced by about 50%, and the fluorescence intensity of the acceptor (here, F3) was increased about 3 times. By using this fluorescence intensity value and correcting the decrease in the fluorescent dye and the deviation of the initial fluorescence intensity value caused by further increasing the number of PCR cycles, it was possible to accurately quantify the template nucleic acid. This technique was quantifiable by measuring changes in both the donor and acceptor fluorescence intensity values. Further, by dividing F3 by F1, the SN ratio can be increased.
[0144]
Example 4
Real-time quantitative PCR using double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye and Cy5-labeled nucleotide
The same template and primer as in Example 5 were used. The reaction solution composition is shown below.
・ 20mM Tris-HCl (pH 8.8) ・ 10mM KCl ・ 10mM (NH_Four)₂SO_Four  ・ 2.5 mM MgSO_Four
・ 0.1% Triton X-100 ・ 0.25mg / ml BSA ・ 20μM primer pair
・ Final concentration 1 × 10⁹~ 1x10^FiveCopy template DNA
・ 0.2 U Vent (exo-) DNA Polymerase ・ 4μM dATP, dCTP, dGTP mixture
・ 1μM dTTP ・ 1μM Cy5-5-dUTP ・ 1 × SYBR (r) Green I
[0145]
Final volume of reaction solution 20 μl. The above reaction mixture was uniformly mixed and heat-denatured at 95 ° C. for 30 seconds, and then subjected to 40 cycles of 95 ° C., 10 seconds, 56 ° C., 10 seconds, 72 ° C. and 70 seconds. Light cycler for detecting fluorescence^TMThe system was used. F3 was used for detection, and the excitation intensity was fixed at 75%. The results are shown in FIG. The fluorescence intensity value was corrected in the same manner as in Example 5. The correlation coefficient (R2) when the threshold value was 2 was 0.9984 (FIG. 30).
[0146]
When PCR is performed using dNTP containing one kind of fluorescently labeled nucleotide as a substrate, one kind of fluorescently labeled nucleotide is labeled on the product by the action of DNA polymerase. At this time, a fluorescent dye that binds to a certain type of template nucleic acid was mixed, and real-time quantitative PCR was performed using the energy transfer phenomenon between this fluorescent dye and the fluorescently labeled nucleotide in the molecule. When the fluorescence intensity values at the initial stage and the plateau period were compared, the fluorescence intensity of the acceptor (here, F3) increased by about 4 times. It was possible to measure (quantify) the template nucleic acid by correcting this fluorescence intensity value and the decrease in fluorescence intensity of the fluorescent dye and the deviation of the initial fluorescence intensity value caused by further overlapping the number of PCR cycles.
[0147]
Example 5
Measurement of SNP by 1-base extension reaction using labeled nucleotide
1) Template DNA and primer synthesis
A 26-base single-stranded DNA (templates 10 and 11) used as a template in this example was prepared with a DNA synthesizer ABI394. Templates 10 and 11 have T and C at the fourth base from the 5 'end, respectively, and the other sequences are the same. Thus, the templates 10 and 11 can be considered as DNA fragments containing SNP (single nucleotide polymorphism; hereinafter abbreviated as SNP) whose specific site is T or C. These templates have a sequence complementary to primer 1 on the 3 'side and are designed so that the 3' terminal base of the primer is adjacent to the base of the SNP site of the template when hybridized with the primer. As fluorescently labeled nucleotides, Texas Red (r) -5-ddATP (PerkinElmer USA) and Cy5TM-5-ddGTP (Amersham Biosciences) were used. SYBR (r) Green 1 was added to the nucleic acid polymerization system.
[0148]
2) 1-base extension reaction
The reaction solution was prepared as follows.
・ 20mM Tris-HCl (pH 8.8) ・ 10mM KCl ・ 10mM (NH_Four)₂SO_Four・ 2.5 mM MgSO_Four
・ 0.1% Triton X-100 ・ 0.25mg / ml BSA ・ 200nM Texas Red (r) -5-ddATP
・ 200nM Cyanine5TM-5-ddGTP ・ 1 × SYBR (r) Green I ・ 20nM primer
・ 200nM synthetic single-stranded template DNA ・ 0.1 U Vent (exo-) DNA Polymerase
[0149]
Final volume of reaction solution 20 μl. The above reaction mixture was uniformly mixed, heat-denatured at 95 ° C. for 15 seconds, and then kept at 65 ° C. for 10 minutes. Fluorescence measuring instrument Perkin Elmer LS-50B was used for fluorescence detection. Measurement was performed at an excitation wavelength of 480 nm, a fluorescence wavelength of 610 nm, and 670 nm, and the slit width was set to 10 nm.
[0150]
3) Details of the experimental system
・ Model 1: Vent (exo-) DNA Polymerase is not added with primer 1 and template 10 (blank control)
-Model 2: Vent (exo-) DNA Polymerase is added in a combination of primer 1 and template 10 (homologous to template 10).
-Model 3: Vent (exo-) DNA Polymerase is added in a combination of primer 1 and template 11 (homologous to template 11).
Model 4: A combination (primary 10 and 11 heterogeneous) Vent (exo-) DNA Polymerase is added in which primer 1 and templates 10 and 11 are added in equal amounts of 100 nM.
[0151]
As a result, the fluorescence intensity value at 610 nm of Model 1 was 0.60, and the fluorescence intensity value at 670 nm was 0.10. The fluorescence intensity value at 610 nm of model 2 was 2, 40, and the fluorescence intensity value at 670 nm was 0.10. In model 3, the fluorescence intensity value at 610 nm was 0.59, and the fluorescence intensity value at 670 nm was 0.31. The fluorescence intensity value at 610 nm of Model 4 was 2.01, and the fluorescence intensity value at 670 nm was 0.21.
[0152]
The model 2 that assumes the homogeneity of the template 10 has a fluorescence intensity value at 610 nm that is about four times higher than that of the blank. This is because, as a result of incorporation of a complementary Texas Red (r) -labeled nucleotide into the SNP site of template 10, energy transfer with SYBR (r) Green I caused an increase in the fluorescence intensity value of Texas Red (r) at 610 nm. Conceivable. Since Cy5TM-labeled nucleotides that are not complementary to the SNP site were not incorporated, there was no change in the fluorescence intensity at 670 nm. The model 3 that assumes the homogeneity of the template 11 has a fluorescence intensity value at about 670 nm that is about three times higher than that of the blank. This is probably because Cy5TM-labeled nucleotide complementary to the SNP site of template 11 caused energy transfer with SYBR (r) Green I and increased the fluorescence of Cy5TM at 670 nm. Texas Red (r) -labeled nucleotides that are not complementary to the SNP site were not incorporated and the fluorescence intensity at 610 nm did not change. In heterogeneous model 4 containing equal amounts of template 10 and template 11, both the fluorescence at 610 nm and 670 nm was increased about twice. This is a result of incorporation of both Texas Red (r) labeled nucleotide and Cy5TM labeled nucleotide. Thus, even when two fluorescently labeled nucleotides were incorporated per molecule, such as SNP measurement, changes in fluorescence intensity could be measured. Furthermore, two types of template nucleic acids could be measured in one tube using two types of fluorescently labeled nucleotides.
[0153]
Example 6
Single nucleotide polymorphism detection of p53 gene codon 282 by single nucleotide extension reaction
(1) Template DNA and primer synthesis
The DNA used as a template in this example was prepared using primers 14 and 15 in a PCR reaction.
[0154]
(PCR reaction conditions)
The reaction solution was prepared as follows.
・ 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) ・ 10 mM KCl ・ 10 mM (NH_Four)₂SO_Four ・ 2.5mM MgCl₂
・ 0.1% Triton X100 ・ 200nM primer pair ・ 50ng human genomic DNA
・ 1U AmpliTaqGold (Applied Biosystems) ・ 200μM dNTPs
[0155]
Final volume of reaction solution 25 μl. The above reaction mixture is uniformly mixed and heat-denatured at 95 ° C. for 10 minutes, and then subjected to 40 cycles of denaturation reaction 95 ° C., 30 seconds, annealing reaction 60 ° C., 30 seconds, extension reaction 72 ° C., 30 seconds. It was.
[0156]
(2) Purification of PCR products
Since the prepared PCR product contains a large excess of PCR primers and dNTP, purification by Qiagen PCR product purification kit (Qiagen), or alkaline phosphatase (usb) derived from shrimp and exonuclease I (usb), 4 U and 20 U, respectively. Each solution was added, incubated at 37 ° C. for 90 minutes, and then heated at 85 ° C. for 15 minutes to use a solution inactivated by the enzyme as a template.
[0157]
(3) Single base extension reaction
The oligonucleotide shown in Primer 16 was used as a genotyping primer. It is designed so that the 3 'terminal base is adjacent to the SNP site when hybridized with the template prepared by the PCR reaction.
The reaction solution was prepared as follows.
・ 1U Thermo Sequenase I DNA Polymerase (Amersham-Pharmacia Biotech)
・ 10 × Thermo Sequenase I DNA Polymerase buffer
・ 200nM Texas Red-5-ddATP ・ 200nM Cy5-5-ddGTP
・ 1 × SYBR Green I ・ 200nM primer
・ Template DNA
[0158]
Final volume of reaction solution 20 μl. The above reaction mixture was uniformly mixed, heat-denatured at 95 ° C. for 30 seconds, and then kept at 50 ° C. for 1 minute. This was defined as one cycle, and 40 cycles were performed. A fluorescence measuring instrument LS-50B (Perkin Elmer) was used for the detection of fluorescence. Measurement was performed at an excitation wavelength of 480 nm, a fluorescence wavelength of 610 nm, and 670 nm, and the slit width was set to 10 nm.
[0159]
As a result, the fluorescence intensity value at 610 nm of the C allele homozygote was 0.60, and the fluorescence intensity value at 670 nm was 2.10. The fluorescence intensity value at 610 nm of the T allele homozygote was 2.40, and the fluorescence intensity value at 670 nm was 0.58. The fluorescence intensity value at 610 nm in the heterozygote was 1.60, and the fluorescence intensity value at 670 nm was 1.23. In the blank test to which no template DNA was added, the fluorescence intensity value at 610 nm was 0.61, and the fluorescence intensity value at 670 nm was 0.60. The sample used was a genotype determined by another method (restriction fragment length polymorphism method).
[0160]
The C allele homozygote has a fluorescence intensity value at 670 nm that is about 5 times higher than that of the blank. This is probably because CY5 labeled nucleotide was incorporated, resulting in energy transfer with SYBR Green I and an increase in the fluorescence intensity value of CY5 at 670 nm. There was no change in the fluorescence intensity at 610 nm because Texas Red labeled nucleotides that were not complementary to the SNP site were not incorporated. When the T allele homozygote is used as a template, the fluorescence intensity value at 610 nm is about 4 times higher than that of the blank. This is thought to be due to the fact that Texas Red labeled nucleotide complementary to the SNP site was incorporated, resulting in an energy transfer with SYBR Green I and an increase in Texas Red fluorescence at 610 nm. CY5-labeled nucleotides that are not complementary to the SNP site were not incorporated and the fluorescence intensity at 670 nm did not change. In the heterozygote, both 610 nm and 670 nm fluorescence increased about 2-fold. This is the result of incorporation of both Texas Red labeled nucleotides and Cy5 labeled nucleotides. Thus, even when the PCR product was used as a template, it was possible to detect two types of nucleic acids in one tube using the method of the present invention.
[0161]
Example 7
Single nucleotide polymorphism detection of aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) gene by sequence-specific extension method using allele-specific primer
ALDH2 is one of alcohol metabolism-related genes existing in the long arm of chromosome 12. A mutant allele (ALDH2 * 2) frequently seen in Japanese is a point mutation in which GAA encoding the 487th amino acid Glu (glutamic acid) in ALDH2 exon 12 is mutated to AAA encoding Lys (lysine). is there.
[0162]
(1) Template synthesis
The template DNA used in this example was prepared from human genomic DNA using primers 4 and 5 in a PCR reaction. The composition of the reaction solution is as follows.
・ 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) ・ 10 mM KCl ・ 10 mM (NH_Four)₂SO_Four ・ 2.5mM MgCl₂
・ 0.1% Triton X100 ・ 200nM primer pair ・ 50ng human genomic DNA
・ 1U AmpliTaqGold ・ 200μM dNTPs mixture
[0163]
Final volume of reaction solution 25 μl. The above reaction mixture is uniformly mixed and heat-denatured at 95 ° C. for 10 minutes, and then subjected to 40 cycles of denaturation reaction 95 ° C., 30 seconds, annealing reaction 60 ° C., 30 seconds, extension reaction 72 ° C., 30 seconds. It was.
(2) Purification of PCR products
The prepared PCR product was added to the PCR purification kit (Qiagen) or enzymatic treatment (shrimp-derived alkaline phosphatase and exonuclease I, 4 U and 20 U, respectively, incubated at 37 ° C. for 90 minutes, and then heated at 85 ° C. for 15 minutes. The inactivated enzyme was used as a template for single nucleotide polymorphism analysis.
[0164]
(3) Sequence-specific extension reaction
Allele specific primers whose 3 'ends were complementary to the respective SNPs were synthesized. Primer 6 has C at the 3 'end, primer 7 has T, and the others have the same sequence complementary to the template. Single nucleotide polymorphism analysis by sequence-specific extension reaction is based on the principle that if a mismatch is present at the 3 'end of a primer, the extension reaction by DNA polymerase is inhibited. Therefore, when the 3 'end is complementary, FRET occurs due to two types of fluorescent dye-labeled nucleotides incorporated by the extension reaction, and the fluorescence intensity changes. If not complementary, the fluorescence intensity does not change because the fluorescently labeled nucleotide is not incorporated.
[0165]
The reaction solution was prepared as follows.
・ 20mM Tris-HCl (pH8.8) ・ 10mM KCl ・ 10mM (NH_Four)₂SO_Four ・ 2.5 mM MgSO_Four
・ 2μM dATP ・ 2μM dGTP ・ 2μM dTTP ・ 1.2μM dCTP ・ 400nM Cy5-5-dCTP
・ 400nM FITC-5-dCTP ・ 200nM primer ・ Purified PCR product
・ 0.1U Vent (exo-) DNA Polymerase
[0166]
Final volume of reaction solution 20 μl. The above reaction mixture was uniformly mixed and heat-denatured at 95 ° C. for 15 seconds, and then annealed at 60 ° C. for 1 minute, followed by extension reaction and 20 seconds at 72 ° C. for 20 cycles. Light cycler for detecting fluorescence^TMThe system was used. At that time, F1 (530 nm) in the system was used for FITC detection, and F3 (710 nm) was used for CY 5 detection. The excitation intensity was fixed at 75%.
[0167]
FIG. 31 and FIG. 32 show the changes in the fluorescence intensity of FITC and CY5 when using primer 6 in three genotypes (C allele homozygote, T allele homozygote, and heterozygote), respectively. Changes in the fluorescence intensity of FITC and CY5 when Primer 7 is used are shown in FIGS. 33 and 34, respectively. In the C allele homozygote, the fluorescence intensity was changed only when the primer 6 having C at the 3 'end was added. That is, the fluorescence intensity of FITC as a donor decreased and the fluorescence intensity of CY5 as an acceptor increased. When Primer 7 having a T at the 3 'end was added, no change in fluorescence intensity was observed. This is probably because the extension reaction occurred only when the primer 6 having a 3 'end complementary to the template was added. In the T allele homozygote, the fluorescence intensity of FITC decreased and the fluorescence intensity of CY5 as an acceptor increased only when primer 7 having a T at the 3 'end was added. In the heterozygote, a change in fluorescence intensity was observed when either primer 6 or 7 was added. The sample used was a genotype determined by another method (restriction fragment length polymorphism). Therefore, it was shown that single nucleotide polymorphism analysis is possible by combining the method of the present invention and the sequence-specific extension method.
[0168]
Example 8
Detection of single nucleotide polymorphism of ALDH2 gene by sequence-specific extension method using template prepared by ICAN method (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)
The template DNA used in this example was prepared by an isothermal gene amplification method using RNA-DNA chimera primer, DNA polymerase having strand displacement activity and template exchange activity, and RNaseH. The primer used at that time has the same base sequence as primers 4 and 5, and the 3 'terminal 3 bases are replaced by ribonucleotides.
[0169]
(1) Synthesis of template DNA
(ICAN reaction conditions)
・ 35 mM Tris-HCl (pH 7.8) ・ 10 mM MgSO_Four ・ 5% DMSO ・ 1μM primer pair
・ 200ng human genomic DNA ・ 2.2U BcaBEST DNA polymerase (Takara Shuzo)
・ 15U RNase H (Takara Shuzo) ・ 1mM dNTPs
[0170]
Final volume of reaction solution 20 μl. The above reaction mixture was uniformly mixed and reacted at 55 ° C. for 60 minutes, and then heated at 90 ° C. for 5 minutes to deactivate the enzyme.
(2) Enzymatic treatment of ICAN amplification products
Shrimp-derived alkaline phosphatase and exonuclease I were added at 4 U and 20 U, respectively, incubated at 37 ° C. for 90 minutes, and then heated at 85 ° C. for 15 minutes to inactivate the enzyme.
[0171]
(3) Sequence-specific extension reaction
The reaction solution was prepared as follows.
・ 20mM Tris-HCl (pH8.8) ・ 10mM KCl ・ 10mM (NH_Four)₂SO_Four ・ 2.5 mM MgSO_Four・ 2μM dATP
・ 2μM dGTP ・ 2μM dTTP ・ 1.2μM dCTP ・ 400nM Cy5-5-dCTP ・ 400nM FITC-5-dCTP
・ 100nM primer 6, 7 ・ ICAN amplification product ・ 0.1U Vent (exo-) DNA Polymerase
[0172]
Final volume of reaction solution 20 μl. The above reaction mixture was uniformly mixed and heat-denatured at 95 ° C. for 15 seconds, and then subjected to an annealing reaction, 60 ° C. for 1 minute, an extension reaction, and 20 seconds at 72 ° C. for 20 cycles. Light cycler for detecting fluorescence^TMThe system was used. At that time, F1 (530 nm) in the system was used for detection of FITC, and F3 (710 nm) was used for detection of CY5. The excitation intensity was fixed at 75%.
[0173]
As a result, in the C allele homozygote, the fluorescence intensity was changed only when the primer 6 having a C at the 3 'end was added. That is, the fluorescence intensity of FITC, which is a donor of the FRET phenomenon, decreased, and the fluorescence intensity of CY5, an acceptor, increased. On the other hand, no change was observed when Primer 7 having a T at the 3 'end was added. In the T allele homozygote, the fluorescence intensity changed only when the primer 7 whose 3 'end was T was added. The heterozygote showed a change in fluorescence when either primer 6 or 7 was added. Therefore, it was confirmed that single nucleotide polymorphism can be detected even when the ICAN amplification product is used as a template.
[0174]
Example 9
Detection of single nucleotide polymorphisms in Prostate-specific antigen by sequence-specific extension using template prepared by LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) method
The template DNA used in this example was prepared by an isothermal gene amplification method using four primers and further using a strand displacement type DNA polymerase as an enzyme.
[0175]
(1) Synthesis of template DNA
LAMP reaction conditions
・ 10 × Thermopol Buffer (NEB) ・ 2 mM MgSO_Four ・ 200ng human genomic DNA
・ 8U Bst DNA polymerase (NEB) ・ 4M Betaine (Sigma) ・ 10mM dNTPs
・ 40pmol primer 8 ・ 40pmol primer 9 ・ 5pmol primer 10
・ 5pmol primer 11
[0176]
Final volume of reaction solution 25 μl. The above reaction mixture was uniformly mixed and reacted at 65 ° C. for 60 minutes, and then heated at 80 ° C. for 10 minutes to deactivate the enzyme.
(2) Enzymatic treatment of LAMP amplification products
Shrimp-derived alkaline phosphatase and exonuclease I were added at 4 U and 20 U, respectively, incubated at 37 ° C. for 90 minutes, and then heated at 85 ° C. for 15 minutes to inactivate the enzyme.
[0177]
(3) Sequence-specific extension reaction
The reaction solution was prepared as follows.
・ 20mM Tris-HCl (pH8.8) ・ 10mM KCl ・ 10mM (NH_Four)₂SO_Four ・ 2.5 mM MgSO_Four
・ 400nM CY5-5-dCTP ・ 400nM FITC-5-dCTP ・ 2μM dATP ・ 2μM dGTP
・ 2μM dTTP ・ 1.2μM dCTP ・ 100nM Primer 12 and Primer 13
・ LAMP amplification product ・ 0.1U Vent (exo-) DNA Polymerase
[0178]
Final volume of reaction solution 20 μl. The above reaction mixture was uniformly mixed and heat-denatured at 95 ° C. for 15 seconds, and then subjected to an annealing reaction, 60 ° C. for 1 minute, an extension reaction, and 20 seconds at 72 ° C. for 20 cycles. Light cycler for detecting fluorescence^TMThe system was used. At that time, F1 (530 nm) in the system was used for FITC detection and F3 (710 nm) was used for CY 5 detection. The excitation intensity was fixed at 75%.
[0179]
As a result, in the C allele homozygote, the fluorescence intensity was changed only when the primer 12 having the C at the 3 'end was added. That is, the fluorescence intensity of FITC decreased and the fluorescence intensity of CY5 increased. In the T allele homozygote, the fluorescence intensity changed only when the primer 13 having a T at the 3 'end was added. The heterozygote showed a change in fluorescence when either primer 12 or 13 was added. Therefore, it was shown that single nucleotide polymorphism can be detected even when a product amplified by the LAMP method is used as a template.
[0180]
Example 10
Single nucleotide polymorphism analysis by allele-specific extension reaction using reverse transcriptase
Single nucleotide polymorphisms of LCHAD (long-chain 3-hydroxyacyl coenzyme A dehydrogenase) and OAT (organic anion transporter) were analyzed by a sequence-specific extension method using reverse transcriptase.
(1) Synthesis of template RNA
RNA used as a template in this example was prepared as follows.
2-plex PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 17, 18, 21, and 22 described later. One of the set of primers was attached with a 5 'RNA polymerase promoter sequence. As for the multiplex PCR reaction conditions, Ampli Taq Gold 1U 200 nM, primer pair 50 ng, human genomic DNA, Ampli Taq Gold buffer 200 μM, and dNTPs were mixed uniformly to a final volume of 25 μl. After heat-denaturing at 95 ° C. for 10 minutes, 40 cycles were performed with a denaturation reaction of 95 ° C. for 30 seconds, an annealing reaction of 65 ° C. for 30 seconds, and an extension reaction of 72 ° C. for 30 seconds. Subsequently, a transcription reaction was performed using T7 Ampliscribe Kit (Epicentre Technologies).
[0181]
(2) Preparation of microarray
The microarray was a standard microscope glass slide. After activating the surface with isothiocyanate, NH₂-Modified oligonucleotides (SEQ ID NO: 19, 20, 23, 24) were immobilized. The oligonucleotide was dissolved in 400 mM sodium carbonate buffer (pH 9.0) to 20 μM. After spotting to a diameter of 2 mm, it was exposed to vaporized ammonia and washed three times with distilled water.
[0182]
(3) Sequence-specific extension method
The prepared template RNA was dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 0.2 M NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 μl was added to the array, and incubated at 37 ° C. for 20 minutes for annealing. I let you. After washing with 0.1 M NaCl, reverse transcriptase MMLV (Epicentre Technologies) 6U, dNTPs (dATP, dGTP, FITC-dUTP, CY5-dCTP) 6 μM, and an enzyme-attached buffer were added and reacted at 52 ° C. for 1 hour.
[0183]
(4) Signal detection
Microscope glass slides were scanned using a confocal scan array 4000 (GSI Lumonics) with an excitation wavelength of 480 nm and a fluorescence wavelength of 650 nm. The value obtained by subtracting the background fluorescence intensity value was used for genotype determination.
[0184]
The slide on which the primer 19 which is a C allele specific primer of LCHAD was immobilized showed a high signal intensity of about 900 only when spotting a template containing the LCHAD C allele conjugate. The signal when spotting a template not containing the C allele conjugate was 100 or less. A high signal intensity (around 800) was obtained only on the spot on which the template containing the LCHAD G allele conjugate was spotted on the slide on which the primer 20 which is the LCHAD G allele specific primer was immobilized. On the other hand, all the signals when spotting a template not containing the G allele conjugate were 100 or less. The slide on which the primer 23, which is an OAT C allele-specific primer, was immobilized showed a high signal intensity of about 1200 only when spotting a template containing an OAT C allele conjugate. The signal when spotting a template not containing the C allele conjugate was 100 or less. Thus, it was shown that single nucleotide polymorphism analysis using reverse transcriptase is possible in the nucleic acid detection method of the present invention.
[0185]
Example 11
Using fluorescein chlorotriazinyl-4-dC (deoxycytidine) nucleotide monomer, nucleic acid is detected by the quenching phenomenon by guanine.
1) Template DNA and primers
Primer 1 and template 12 were used.
Model 1: Combination of primer 1 and template 12
-Model 2: Vent (exo-) DNA Polymerase is not added in the combination of primer 1 and template 12.
[0186]
2) Amplification reaction conditions
The reaction solution was prepared as follows.
・ 20mM Tris-HCl (pH8.8) ・ 10mM KCl ・ 10mM (NH_Four)₂SO_Four ・ 2.5 mM MgSO_Four
・ 0.5% Triton X100 ・ 5% DMSO ・ 0.25mg / ml BSA
200nM fluorescein chlorotriazinyl-4-dC
・ 200nM dGTP ・ 200nM dATP ・ 200nM dUTP ・ 2nM Primer
・ 50nM synthetic single-stranded template DNA ・ 0.1U Vent (exo-) DNA Polymerase
[0187]
Final volume of reaction solution 20 μl. The above reaction mixture was uniformly mixed, heat-denatured at 95 ° C. for 15 seconds, and then kept at 65 ° C. for 15 minutes. Light cycler for detecting fluorescence^TMThe system was used. Detection was performed using F1, and the excitation intensity was fixed at 75%.
[0188]
As a result, in model 1, the fluorescence intensity of F1 decreased by 24% at the maximum. There was no change in fluorescence in the reaction of model 2 with no enzyme added. From the above results, it is considered that dC-FITC-labeled nucleotide incorporated into the strand being synthesized by DNA polymerase interacted with guanine present in the complementary strand, resulting in a decrease in fluorescence.
[0189]
[Primer sequence]
Primer 4: GTGTAACCCATAACCCCCAAGA
Primer 5: CACCAGCAGACCCTCAAGC
Primer 6: CCCACACTCACAGTTTTCACTTC
Primer 7: CCCACACTCACAGTTTTCACTTT
Primer 8: TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG
Primer 9: TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG
Primer 10: TGCTTGTGGCCTCTCGTG
Primer 11: GGGTGTGGGAAGCTGTG
[0190]
Primer 12: TGATCTTGCTGGGTCGGCACAGC
Primer 13: TGATCTTGCTGGGTCGGCACAGT
Primer 14: ACCTGATTTCCTTACTGCCTCTTGC
Primer 15: GTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGT
Primer 16: TGTGCCTGTCCTGGGAGAGAC
Primer 17: TTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCTTGCCAGGTGATTGGC
Primer 18: GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTGTTTCTGTGGTCACGAAGTC
[0191]
Primer 19: CTCTAATAGTGCTGGCTC
Primer 20: CTCTAATAGTGCTGGCTG
Primer 21:
TTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCTTTGTAGCTGGGA ACTTC
Primer 22:
GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTACCAAAACCTGGTAAATACGG
Primer 23: GAGATAGCAGACAACGTCC
Primer 24: GAGATAGCAGACAACGTCG
Mold 12:
TTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTCGGGTCTACACTGTCGAGTCTG
[0192]
【The invention's effect】
When performing a nucleic acid polymerization reaction to incorporate a labeled nucleotide into a nucleic acid polymer, by monitoring the change in fluorescence intensity of the nucleic acid polymerization system, there is no need for a homogeneous solution nucleic acid probe in which the fluorescence intensity changes by hybridization. -Realize a method of measuring nucleic acids quickly and at low cost and with high sensitivity. This method makes it possible to measure all nucleic acids such as genes existing in two natural systems.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 Outline of Method A of the Present Invention: Nucleic acid measurement method using interaction between fluorescent dyes.
FIG. 2 Outline of Method B of the Present Invention: Nucleic acid measurement method using interaction between nucleic acid-specific fluorescent dye and fluorescent dye.
FIG. 3 shows an outline of the method C of the present invention: a nucleic acid measurement method using an interaction between a G base and a fluorescent dye.
FIG. 4 Outline of Method D of the Present Invention: Nucleic acid measurement method using interaction between quencher substance and fluorescent dye.
FIG. 5: Outline of the method E of the present invention: a nucleic acid measurement method (1) using a labeled specific primer.
FIG. 6: Outline of the method E of the present invention: a nucleic acid measurement method (2) using a labeled specific primer.
FIG. 7 Outline of Method F of the Present Invention: Nucleic acid measurement method using interaction between a fluorescent dye labeled with a specific primer and a G base.
FIG. 8 Outline of Method G of the Present Invention: Nucleic Acid Measurement Method Using Nucleotides Labeled with Antigen or Antibody
FIG. 9 shows an outline of the method H of the present invention: a nucleic acid measurement method using a specific primer immobilized on a solid surface.
FIG. 10 Nucleic acid measurement using interaction (FRET phenomenon) between a double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye and a fluorescently labeled nucleotide: F1 fluorescence intensity change of models 1-10.

FIG. 11 Nucleic acid measurement using interaction (FRET phenomenon) between a double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye and a fluorescently labeled nucleotide: F3 fluorescence intensity change in models 1-10.

FIG. 12 Nucleic acid measurement using interaction (FRET phenomenon) between a double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye and a fluorescently labeled nucleotide: F1 fluorescence intensity change of models 11-20.

FIG. 13 Nucleic acid measurement using interaction (FRET phenomenon) between a double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye and a fluorescently labeled nucleotide: F2 fluorescence intensity change of models 11-20.

FIG. 14 Nucleic acid measurement using interaction (FRET phenomenon) between a double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye and a fluorescently labeled nucleotide: F1 fluorescence intensity change of models 21-30.

FIG. 15 Nucleic acid measurement using interaction (FRET phenomenon) between a double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye and a fluorescently labeled nucleotide: F2 fluorescence intensity change of models 21-30.

FIG. 16 Nucleic acid measurement using interaction (FRET phenomenon) between a double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye and a fluorescently labeled nucleotide: F1 fluorescence intensity change of models 31-40.

FIG. 17 Nucleic acid measurement using interaction between two kinds of fluorescently labeled nucleotides (FRET phenomenon): F1 fluorescence change of models 1-8.

FIG. 18 Nucleic acid measurement using interaction between two kinds of fluorescently labeled nucleotides (FRET phenomenon): F3 fluorescence change of models 1-8.

FIG. 19 Nucleic acid measurement using interaction between two types of fluorescently labeled nucleotides (FRET phenomenon): F1 fluorescence change in models 9-16.

FIG. 20 Nucleic acid measurement using interaction between two kinds of fluorescently labeled nucleotides (FRET phenomenon): F9 fluorescence change in models 9-16.

FIG. 21 Nucleic acid measurement using interaction between two types of fluorescently labeled nucleotides (FRET phenomenon): F1 fluorescence change of models 17-24.

FIG. 22 Nucleic acid measurement using interaction between two kinds of fluorescently labeled nucleotides (FRET phenomenon): F2 fluorescence change of models 17-24.

FIG. 23: Real-time monitoring of PCR amplification products using two fluorescently labeled nucleotides (F1 fluorescence change).

FIG. 24: Real-time monitoring of PCR amplification products using two fluorescently labeled nucleotides (F3 fluorescence change).

FIG. 25: Real-time monitoring of PCR amplification products using two fluorescently labeled nucleotides (F1 fluorescence change after data processing).

FIG. 26: Real-time monitoring of PCR amplification products using two fluorescently labeled nucleotides (F3 fluorescence change after data processing).

FIG. 27 is a calibration curve by real-time quantitative PCR using two kinds of fluorescently labeled nucleotides (data used for preparing a calibration curve: F1 fluorescence value after data processing).
FIG. 28 is a calibration curve by real-time quantitative PCR using two kinds of fluorescently labeled nucleotides (data used for preparing a calibration curve: F3 fluorescence value after data processing).
FIG. 29: Real-time monitoring of PCR amplification products using a double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye and a fluorescently labeled nucleotide (F3 fluorescence change after data processing).

FIG. 30 is a calibration curve by real-time quantitative PCR method using a double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye and a fluorescently labeled nucleotide (F3 fluorescence change after data processing).
FIG. 31 shows changes in FITC fluorescence intensity when using primer 6 in three types of genotypes (C allele homozygote, T allele homozygote, and heterozygote).
FIG. 32 shows changes in fluorescence intensity of CY5 when using primer 6 in three types of genotypes (C allele homozygote, T allele homozygote, and heterozygote).
FIG. 33 shows changes in FITC fluorescence intensity when primer 7 is used.
FIG. 34 is a graph showing changes in fluorescence intensity of CY5 when primer 7 is used.
[Explanation of symbols]
N: nucleotide monomer

Claims (8)

（Ａ）少なくとも１種の鋳型としての核酸と、（Ｂ）（ａ）ドナー蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマー及び（ｂ）アクセプター蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマーと、（Ｃ）少なくとも１種の核酸合成酵素を含有してなる核酸重合反応系で核酸重合反応を行い、核酸重合系の光学的キャラクターの変化若しくは変化量から鋳型核酸若しくはそれを鋳型として合成された核酸を測定することを特徴とする核酸の測定方法。  (A) at least one nucleic acid as a template; (B) (a) a nucleotide monomer labeled with a donor fluorescent dye; and (b) a nucleotide monomer labeled with an acceptor fluorescent dye; and (C) at least one kind of nucleotide monomer. A nucleic acid polymerization reaction is performed in a nucleic acid polymerization reaction system containing a nucleic acid synthesizing enzyme, and a template nucleic acid or a nucleic acid synthesized using the template as a template is measured from a change or amount of change in the optical character of the nucleic acid polymerization system. A method for measuring nucleic acid. 核酸重合系が、（Ｄ）標識物質で標識されていない少なくとも１種のヌクレオチドモノマーを含む請求項１に記載の核酸の測定方法。  The method for measuring a nucleic acid according to claim 1, wherein the nucleic acid polymerization system comprises (D) at least one nucleotide monomer not labeled with a labeling substance. 核酸重合系が、更に、（Ｅ）鋳型核酸に特異的に結合する少なくとも１種のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを含む請求項１に記載の核酸の測定方法。  The method for measuring a nucleic acid according to claim 1, wherein the nucleic acid polymerization system further comprises (E) a nucleic acid primer comprising at least one oligonucleotide that specifically binds to the template nucleic acid. 核酸重合系が、非標識ヌクレオチドを含有する請求項１に記載の核酸の測定方法。  The method for measuring a nucleic acid according to claim 1, wherein the nucleic acid polymerization system contains unlabeled nucleotides. ドナー蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマー、アクセプター蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマー又は非標識ヌクレオチドが、グアニン（ｇ）を含有するか及び／又は鋳型核酸が少なくとも１つのグアニン（ｇ）を含有する請求項４に記載の核酸の測定方法。A nucleotide monomer labeled with a donor fluorescent dye, a nucleotide monomer labeled with an acceptor fluorescent dye or an unlabeled nucleotide contains guanine (g) and / or the template nucleic acid contains at least one guanine (g) Item 5. The method for measuring a nucleic acid according to Item 4 . 非標識ヌクレオチド、ドナー蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマー又はアクセプター蛍光色素で標識されたヌクレオチドモノマーが、３リン酸体である請求項４に記載の核酸の測定方法。The method for measuring a nucleic acid according to claim 4 , wherein the non-labeled nucleotide, the nucleotide monomer labeled with a donor fluorescent dye, or the nucleotide monomer labeled with an acceptor fluorescent dye is a triphosphate. 核酸重合系が、（Ｆ）核酸に結合することで蛍光を発する蛍光色素を含有している請求項１に記載の核酸の測定方法。  The method for measuring a nucleic acid according to claim 1, wherein the nucleic acid polymerization system contains (F) a fluorescent dye that emits fluorescence when bound to the nucleic acid. 核酸合成酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及びそれらの改変体からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の核酸の測定方法。  The method for measuring a nucleic acid according to claim 1, wherein the nucleic acid synthesizing enzyme is at least one selected from the group consisting of DNA polymerase, RNA polymerase, reverse transcriptase, and variants thereof.

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