JP4276439B2 - Lipid derivatives of polythiourea - Google Patents

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Description

本出願は、２００１年６月１３日出願の米国特許仮出願第６０／２９７，４８２号の利益を主張し、また２００１年５月１４日出願のフランス特許仮出願第０１０６３３０号に基づく優先権を主張するものであって、これら２つの出願の内容は参照してここに組み込まれる。
本発明は、核酸を細胞に導入することを可能にする新規化合物に関する。それらは、インビトロ、半ビボ又はインビボでの様々な細胞型への核酸のトランスフェクションのために有用である。 This application claims the benefit of US Provisional Application No. 60 / 297,482, filed June 13, 2001, and has priority based on French Provisional Application No. 0106330, filed May 14, 2001. The contents of these two applications are hereby incorporated by reference.
The present invention relates to novel compounds that allow nucleic acids to be introduced into cells. They are useful for transfection of nucleic acids into various cell types in vitro, semi-vivo or in vivo.

バイオテクノロジーの発達と共に、核酸を細胞内に有効に導入できることが必要となってきた。それは、例えば組換えタンパク質の生産のために、又は遺伝子の発現の調節、遺伝子のクローニング又はＤＮＡに関わる他の何らかの操作を検討するために研究室において、インビトロで細胞内に核酸を導入することを含みうる。また、例えばトランスジェニック動物の創造、ワクチンの生産、標識試験あるいはまた治療アプローチのために、インビボで細胞内に核酸を導入することも含みうる。また、骨髄移植、免疫療法又はその後の再投与のために生物から採集した細胞への遺伝子の導入に関わる他の方法を含むアプローチにおいて、半ビボで細胞内に核酸を導入することも含みうる。   With the development of biotechnology, it has become necessary to be able to effectively introduce nucleic acids into cells. It introduces nucleic acids into cells in vitro, for example in the laboratory, for the production of recombinant proteins or to study the regulation of gene expression, gene cloning or any other manipulation involving DNA. May be included. It may also include the introduction of nucleic acids into cells in vivo, for example for the creation of transgenic animals, vaccine production, labeling tests or also therapeutic approaches. It may also include the introduction of nucleic acids into cells in vivo in an approach that includes other methods involving the introduction of genes into cells harvested from organisms for bone marrow transplantation, immunotherapy or subsequent re-administration.

外来性遺伝物質の細胞内送達のためにいくつかの方法が提案されてきた。それらの１つは、特に、全く危険性がないとは言えないウイルス法に対して極めて好都合な代替法を構成する、非ウイルスベクターの使用に基づく。これらの合成ベクターは２つの主要な機能を有する：導入される核酸と複合して核酸を緊密化すること、及び形質膜及びおそらくは核エンベロープを横切る核酸の通過を促進すること。   Several methods have been proposed for intracellular delivery of exogenous genetic material. One of them is based in particular on the use of non-viral vectors that constitute a very convenient alternative to viral methods that are not at all dangerous. These synthetic vectors have two major functions: to complex nucleic acids in complex with introduced nucleic acids and to facilitate the passage of nucleic acids across the plasma membrane and possibly the nuclear envelope.

例えばポリマー又は選択的に生化学的ベクター（細胞受容体リガンドと結合したカチオンタンパク質から成る）のように、いくつかのファミリーの合成ベクターが開発されてきたが、重要な進歩は、特にリポフェクタントの開発、より特定するとカチオン脂質の開発によって為された。カチオン脂質は、それらの全体的な正電荷のために、全体として負であるＤＮＡに自発的に干渉して、ヌクレアーゼからＤＮＡを保護すること及びＤＮＡの細胞内放出のために細胞膜に結合することができるヌクレオ脂質複合体を形成することが明らかにされた。   Although several families of synthetic vectors have been developed, such as polymers or selectively biochemical vectors (consisting of cationic proteins coupled with cell receptor ligands), significant advances have been made especially with the development of lipofectants. More specifically, it was made by the development of cationic lipids. Cationic lipids spontaneously interfere with DNA that is totally negative due to their overall positive charge, protecting the DNA from nucleases and binding to the cell membrane for intracellular release of DNA. Has been shown to form nucleolipid complexes capable of

これまでに様々なタイプのカチオン脂質が合成されている：第四級アンモニウム基を含む脂質（例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＬＲＩＥ等）、例えばＤＯＧＳ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ又は選択的に特許願ＷＯ９７／１８１８５号に開示されているリポポリアミンのようなリポポリアミン、第四級アンモニウム基とＤＯＳＰＡのようなポリアミンの両方を含む脂質、又は選択的に様々な他のカチオン単位、特にアミジニウム基を含む脂質（例えばＡＤＰＤＥ、ＡＤＯＤＥ又は特許願ＷＯ９７／３１９３５号の脂質）。   Various types of cationic lipids have been synthesized so far: lipids containing quaternary ammonium groups (eg DOTMA, DOTAP, DMRIE, DLRIE etc.), eg DOGS, DC-Chol or optionally patent application WO 97/18185. Lipids containing both quaternary ammonium groups and polyamines such as DOSPA, or optionally various other cationic units, particularly lipids containing amidinium groups (e.g. ADPDE, ADODE or lipids of patent application WO 97/31935).

しかし、これらのカチオン脂質をトランスフェクション剤として使用することにはまだ数多くの問題があり、それらの効率も改善の余地がある。特に、効率的で安定なヌクレオ脂質複合体を得るためには、一般に、これらの複合体が高度に陽イオン性である必要があることが認められた。しかし、核酸と共に、全体として中性又は陰性である粒子を形成するためには、陽イオン性でないベクターが利用可能であることが望ましいであろう。実際に、核酸とカチオン脂質の間で形成される全体として陽イオン性の複合体は、それらの排出を誘導する細網内皮系によって捕獲される傾向があることが認められている。さらに、形成される複合体の全体的正電荷のために、血漿タンパク質がそれらの表面に吸着する傾向があり、これはトランスフェクション力の低下をもたらす。さらに、局所注入に関して、大きな全体的正電荷の存在は、複合体が細胞外マトリックスに吸着するため、核酸複合体が投与部位から遠くへと拡散するのを妨げる；複合体は、それ故、標的細胞に到達することができず、結果として注入された複合体の量に比べて導入効率の低下を生じさせる。最後に、多くの場合、カチオン脂質は炎症作用を有することも認められている。   However, there are still a number of problems with using these cationic lipids as transfection agents, and there is room for improvement in their efficiency. In particular, it has been observed that in order to obtain efficient and stable nucleolipid complexes, these complexes generally need to be highly cationic. However, it would be desirable to have a non-cationic vector available to form particles that are neutral or negative overall with the nucleic acid. Indeed, it has been observed that the overall cationic complexes formed between nucleic acids and cationic lipids tend to be captured by the reticuloendothelial system that induces their excretion. Furthermore, due to the overall positive charge of the complex formed, plasma proteins tend to adsorb to their surface, which results in a decrease in transfection power. Further, with respect to local injection, the presence of a large overall positive charge prevents the nucleic acid complex from diffusing far from the site of administration because the complex is adsorbed to the extracellular matrix; Inability to reach the cells results in a reduction in transfection efficiency compared to the amount of complex injected. Finally, in many cases, cationic lipids have also been found to have inflammatory effects.

本発明の目的は、明白に、そのポリチオ尿素官能基の故に革新的であり、インビトロ、半ビボ又はインビボでの核酸のトランスフェクションのために効率的に使用することができる新規トランスフェクション化合物を提供することである。これらの新規化合物は、
−それらの構造から正電荷が存在しないことにより、上記で論じたカチオンベクターの使用によって引き起こされる多くの問題を解決することが可能になり、
−カチオン脂質と同じように、核酸と複合して核酸を緊密化することができ、且つそれらのトランスフェクションを促進することができる
ので、特に有益である。 The object of the present invention clearly provides novel transfection compounds that are innovative because of their polythiourea functionality and can be used efficiently for transfection of nucleic acids in vitro, semi-vivo or in vivo. It is to be. These new compounds are
-The absence of a positive charge from their structure makes it possible to solve many of the problems caused by the use of cationic vectors discussed above,
-Like cationic lipids, it is particularly beneficial because it can complex with nucleic acids to consolidate nucleic acids and facilitate their transfection.

本発明の第一の対象は、従って、スペーサーによって脂質に結合されたポリチオ尿素部分から成ることを特徴とするトランスフェクション化合物である。   The first subject of the present invention is therefore a transfection compound characterized in that it consists of a polythiourea moiety bound to a lipid by a spacer.

特に、本発明の対象は、一般式（Ｉ）：   In particular, the subject of the present invention is the general formula (I):

Figure 0004276439
［式中、
・ｌは、０及び１から選択される整数であり、
・ｎは、１、２、３、４、５及び６から選択される整数であり、
・ｍは、２、３及び４から選択される整数であり、ｍは、種々の基−［ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−（ＣＨ）ｍ］−の中で異なる値をとることが可能であり、
・Ｒ’は、一般式（ＩＩ）：
Figure 0004276439
 [Where:
L is an integer selected from 0 and 1;
N is an integer selected from 1, 2, 3, 4, 5 and 6;
M is an integer selected from 2, 3 and 4 and m can take different values among the various groups-[NH-CS-NH- (CH) m ]-;
R ′ is represented by the general formula (II):

Figure 0004276439
［式中、ｑは、１、２、３、４、５及び６から選択される整数であり、及びｐは、２、３及び４から選択される整数であり、ｐは、種々の基−［（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ］−の中で異なる値をとることが可能である］
の基を表わし、
・Ｒは、水素原子又は上記で定義した一般式（ＩＩ）の基のいずれかを表わし、ｎが１であり、及びｌが０であるとき、少なくとも１個のＲ基は式（ＩＩ）であることは明白であり、
・Ｘは、式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、１個から８個の炭素原子を含む飽和又は不飽和直鎖又は環状脂肪族基、メルカプトメチル（−ＣＨ２ＳＨ）基、又は選択的に次の群：
−（ＣＨ２）ｘ−（ＣＨＯＨ）ｕ−Ｈ［式中、ｘは１〜１０から選択される整数であり、及びｕは１、２、３、４、５及び６から選択される整数である］、又は選択的に、
−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖ−Ｈ［式中、ｖは、１、２及び３から選択される整数である］
から選択される親水鎖を表わし、１個以下の置換基Ｘは、式（Ｉ）及び（ＩＩ）の両方において、親水鎖を表わすことは明白であり、
・Ｙはスペーサーを表わし、
・及びＬは、
−Ｎ（Ｒ１）Ｒ２基［式中、Ｒ１とＲ２は、互いに独立して、水素原子又は選択的に脂肪族鎖を表わす］、又は選択的に式−（ＣＨ２）ｔ−ＯＺの基［式中、ｔは、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数を表わし、及びＺは、糖、ポリオール又はＰＥＧを表わす］、但し、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１個は水素原子でないことは明白である、
・若しくは−ＯＲ３基［式中、Ｒ３はステロイド誘導体を表わす］
を表わす］
のトランスフェクション化合物である。
Figure 0004276439
 [Wherein q is an integer selected from 1, 2, 3, 4, 5 and 6 and p is an integer selected from 2, 3 and 4; [(CH 2) p -NH- CS-NH] - it is possible to take different values in the '
Represents the group of
R represents either a hydrogen atom or a group of general formula (II) as defined above, and when n is 1 and l is 0, at least one R group is of formula (II) It is clear that there is
X is a saturated or unsaturated linear or cycloaliphatic group containing 1 to 8 carbon atoms, a mercaptomethyl (—CH 2 SH) group, or selectively in formulas (I) and (II) Next group:
- (CH 2) x - ( CHOH) in u -H [wherein, x is an integer selected from 1 to 10, and u is an integer selected from 2, 3, 4, 5 and 6 Yes, or optionally,
— (OCH 2 CH 2 O) v —H [wherein v is an integer selected from 1, 2, and 3]
It is clear that no more than one substituent X represents a hydrophilic chain in both formulas (I) and (II),
Y represents a spacer,
・ And L are
-N (R 1 ) R 2 group, wherein R 1 and R 2 independently of one another represent a hydrogen atom or optionally an aliphatic chain, or selectively represented by the formula — (CH 2 ) t — A group of OZ wherein t represents an integer selected from 11, 12, 13, 14 or 15 and Z represents a sugar, polyol or PEG, provided that at least one of R 1 and R 2 It is clear that the pieces are not hydrogen atoms,
-Or-OR 3 group [wherein R 3 represents a steroid derivative]
Represents]
The transfection compound.

本発明によれば、「スペーサー」の語は、分子のポリチオ尿素部分と脂質部分の間の結合を提供すること、及びこれら２つの部分の間の望ましくない切断を減弱させるためにそれらを離して保持することの両方を可能にする化学基を意味すると理解される。好ましいスペーサーは、例えば、１個から６個の炭素原子を有するアルキル、ケトン、エステル、エーテル、アミド、アミジン、カルバメート又はチオカルバメート官能基、グリセロール、尿素、チオ尿素、又は芳香環から選択される１個又はそれ以上の化学官能基で構成されうる。例えば、スペーサーは、式：
−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−
又は、−（ＣＨ２）ｉ−Ｗ−（ＣＨ２）ｊ−
［式中、ｉ及びｊは、１から６まで（両端を含む）から選択される整数であり、及びＷは、ケトン、エステル、エーテル、アミド、アミジン、カルバメート又はチオカルバメート官能基、グリセロール、尿素、チオ尿素、又は選択的に芳香環から選択される基である］
の群から選択されうる。 According to the present invention, the term “spacer” refers to providing a bond between the polythiourea part and the lipid part of the molecule and separating them in order to attenuate unwanted cleavage between these two parts. It is understood to mean a chemical group that allows both to be retained. Preferred spacers are, for example, 1 selected from alkyls having 1 to 6 carbon atoms, ketones, esters, ethers, amides, amidines, carbamates or thiocarbamate functional groups, glycerol, urea, thiourea, or aromatic rings. It can be composed of one or more chemical functional groups. For example, the spacer has the formula:
—NH—C (O) —CH 2 —CH 2 —
Or, - (CH 2) i -W- (CH 2) j -
Wherein i and j are integers selected from 1 to 6 (inclusive) and W is a ketone, ester, ether, amide, amidine, carbamate or thiocarbamate functional group, glycerol, urea , Thiourea, or a group optionally selected from aromatic rings]
Can be selected from the group of

本発明のために、「脂肪族鎖」の表現は、脂質特性を示すことを条件として、飽和又は不飽和で、任意に１個又はそれ以上のヘテロ原子を含む、１０個から２２個の炭素原子を有するアルキル基を意味すると理解される。好ましくは、それらは、１０個から２２個の炭素原子及び１、２又は３個の不飽和を含む直鎖又は分枝アルキル基である。好ましくは、前記アルキル基は、１０、１２、１４、１６、１８、２０又は２２個の炭素原子を含む。より特定すると、脂肪族基、−（ＣＨ２）１１ＣＨ３、−（ＣＨ２）１３ＣＨ３、−（ＣＨ２）１５ＣＨ３及び−（ＣＨ２）１７ＣＨ３が挙げられよう。 For the purposes of the present invention, the expression “aliphatic chain” is from 10 to 22 carbons, saturated or unsaturated, optionally containing one or more heteroatoms, provided that they exhibit lipid properties. It is understood to mean an alkyl group having an atom. Preferably they are straight or branched alkyl groups containing 10 to 22 carbon atoms and 1, 2 or 3 unsaturations. Preferably, the alkyl group contains 10, 12, 14, 16, 18, 20, or 22 carbon atoms. More specifically, mention may be made of aliphatic groups, — (CH 2 ) 11 CH 3 , — (CH 2 ) 13 CH 3 , — (CH 2 ) 15 CH 3 and — (CH 2 ) 17 CH 3 .

「糖」の語は、本発明のために、１個又はそれ以上のサッカリドから成る分子を意味すると理解される。例として、ピラノース及びフラノースなどの糖類、例えばグルコース、マンノース、ラムノース、ガラクトース、フルクトース又は選択的にマルトース、ラクトース、サッカロース、スクロース、フコース、セロビオース、アロース、ラミナラビオース、ゲンチオビオース、ソフォロース、メリビオース等が挙げられるであろう。好ましくは、糖（類）は、グルコース、マンノース、ラムノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、サッカロース及びセロビオースから選択される。さらに、この語は、いわゆる「複合」糖質、すなわち互いに共有結合しているいくつかの糖も包含し、各々の糖は、好ましくは上記に列挙したリストから選択される。適切な多糖類として、デキストラン、α−アミロース、アミロペクチン、フルクタン、マンナン、キシラン及びアラビナンが挙げられよう。一部の好ましい糖は、さらに、例えばある種のレクチンのように、細胞受容体と相互作用しうる。   The term “sugar” is understood for the purposes of the present invention to mean a molecule consisting of one or more saccharides. Examples include sugars such as pyranose and furanose, such as glucose, mannose, rhamnose, galactose, fructose or optionally maltose, lactose, saccharose, sucrose, fucose, cellobiose, allose, laminarabiose, gentiobiose, soforose, melibiose, etc. I will. Preferably, the sugar (s) is selected from glucose, mannose, rhamnose, galactose, fructose, lactose, saccharose and cellobiose. Furthermore, the term also encompasses so-called “complex” carbohydrates, ie a number of sugars covalently linked to each other, each sugar preferably being selected from the list listed above. Suitable polysaccharides may include dextran, α-amylose, amylopectin, fructan, mannan, xylan and arabinan. Some preferred sugars can further interact with cellular receptors, such as certain lectins.

本発明によれば、「ポリオール」の語も、少なくとも２個のヒドロキシル官能基を含む直鎖、分枝又は環状炭化水素分子を意味すると理解される。例として、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、テトリトール、ペンチトール、環状ペンチトール（又はケルシトール）、マンニトール、ソルビトール、ダルシトール、環状ヘキシトール又はイノシトールなどのヘキシトール等が挙げられるであろう（Ｓｔａｎｅｋら、Ｔｈｅ Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，６２１−６５５ページ及び７７８−８５５ページ）。好ましい態様に従えば、ポリオールは、一般式：   According to the invention, the term “polyol” is also understood to mean a straight-chain, branched or cyclic hydrocarbon molecule containing at least two hydroxyl functions. Examples would include hexitols such as glycerol, ethylene glycol, propylene glycol, tetritol, pentitol, cyclic pentitol (or queritol), mannitol, sorbitol, dulcitol, cyclic hexitol or inositol (Stanek et al., The Monosaccharides). Academic Press, pages 621-655 and pages 778-855). According to a preferred embodiment, the polyol has the general formula:

Figure 0004276439
［式中、ｓは２、３、４、５及び６から選択される］
のアルコールから選択される。
Figure 0004276439
 [Wherein s is selected from 2, 3, 4, 5 and 6]
Selected from alcohol.

本発明による一般式（Ｉ）の化合物がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を含むとき、後者は一般に２個から１２０個、好ましくは２個から８０個の−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−単位を含む。これは、単純ＰＥＧ、すなわちその鎖がヒドロキシル基で終わるもの、又はその末端基がアルキルから選択される、例えばメチルである、ＰＥＧを包含しうる。 When the compound of general formula (I) according to the invention contains a polyethylene glycol (PEG) group, the latter generally contains 2 to 120, preferably 2 to 80 —OCH 2 CH 2 O— units. This may include simple PEGs, ie those whose chain ends with a hydroxyl group, or PEG whose end group is selected from alkyl, for example methyl.

本発明のために、「ステロイド誘導体」の表現は、コレスタン型の多環式化合物を意味すると理解される。これらの化合物は、天然であるか又はそうでなくてもよく、より好ましくはコレステロール、コレスタノール、３−α−５−シクロ−５−α−コレスタン−６−β−オール、コール酸、ギ酸コレステリル、ギ酸コレスタニル、３α、５−シクロ−５α−コレスタン−６β−イルギ酸塩、コレステリルアミン、６−（１，５−ジメチルヘキシル）−３ａ，５ａ−ジメチルヘキサデカヒドロシクロペンタ［ａ］シクロプロパ［２，３］−シクロペンタ［１，２−ｆ］ナフタレン−１０−イルアミン、又はコレスタニルアミンから選択される。   For the purposes of the present invention, the expression “steroid derivative” is understood to mean a cholestane-type polycyclic compound. These compounds may or may not be natural, more preferably cholesterol, cholestanol, 3-α-5-cyclo-5-α-cholestan-6-β-ol, cholic acid, cholesteryl formate Cholestanyl formate, 3α, 5-cyclo-5α-cholestane-6β-ylformate, cholesterylamine, 6- (1,5-dimethylhexyl) -3a, 5a-dimethylhexadecahydrocyclopenta [a] cyclopropa [2 , 3] -cyclopenta [1,2-f] naphthalen-10-ylamine, or cholestanylamine.

本発明の好ましい変法に従えば、トランスフェクション化合物は、一般式（ＩＩＩ）：   According to a preferred variant of the invention, the transfection compound has the general formula (III):

Figure 0004276439
［式中、Ｘ、ｍ、ｎ及びＹは、ｎが１ではないこと、及びＲ１とＲ２が、互いに独立して、水素原子又は脂肪族鎖を表わすことを除いて、一般式（Ｉ）において定義したとおりであり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１個が水素ではないことは明白である］
を有する。
Figure 0004276439
 [Wherein, X, m, n and Y are represented by the general formula (I), except that n is not 1 and R 1 and R 2 independently of one another represent a hydrogen atom or an aliphatic chain. It is clear that at least one of R 1 and R 2 is not hydrogen]
Have

より好ましくは、本発明のトランスフェクション化合物は、一般式（ＩＶ）：   More preferably, the transfection compound of the present invention has the general formula (IV):

Figure 0004276439
［式中、ｍ、ｎ及びＹは、ｎが１ではないこと、及びＲ１とＲ２が、互いに独立して、水素原子又は脂肪族鎖を表わすことを除いて、一般式（Ｉ）において定義したとおりであり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１個が水素ではないことは明白である］
を有する。
Figure 0004276439
 [Wherein m, n and Y in general formula (I), except that n is not 1 and R 1 and R 2 independently of one another represent a hydrogen atom or an aliphatic chain] It is clear that at least one of R 1 and R 2 is not hydrogen as defined]
Have

本発明がまた、一般式（Ｉ）の生成物の異性体が存在するときには一般式（Ｉ）の生成物の異性体、ならびにそれらの混合物も対象とすることは明白である。   Obviously, the present invention is also directed to product isomers of general formula (I), as well as mixtures thereof, when isomers of products of general formula (I) are present.

本発明による一般式（Ｉ）の化合物の製造は、次の段階を提示されている順序で又は他の何らかの既知の変法及び等しく適切な変法に従って使用して、当業者に周知である、溶液中又は保持体上での従来の有機合成手法を用いて、実施される。   The preparation of the compounds of general formula (I) according to the invention is well known to the person skilled in the art, using the following steps in the order presented or according to any other known and equally suitable variants: It is carried out using conventional organic synthesis techniques in solution or on a support.

１）脂質部分Ｌの製造
一般式（Ｉ）の化合物の脂質部分Ｌが−Ｎ（Ｒ１）Ｒ２基［式中、Ｒ１及び／又はＲ２は脂肪族鎖を表わす］によって表わされるときは、最初に、式ＨＮ（Ｒ１）Ｒ２のアミンを生成する。前記アミンは、一方が置換基Ｒ１を含み、他方が置換基Ｒ２を含む、カルボン酸とアミンを縮合して、対応するアミドを生成し、次にそのようにして得た前記アミドを還元することによって入手しうる。 1) Preparation of lipid moiety L When the lipid moiety L of the compound of general formula (I) is represented by the group -N (R 1 ) R 2 , wherein R 1 and / or R 2 represents an aliphatic chain Initially produces an amine of formula HN (R 1 ) R 2 . The amine, one containing the substituent R 1 and the other containing the substituent R 2 , condenses the carboxylic acid with the amine to produce the corresponding amide, and then reduces the amide so obtained Can be obtained by

アミドの生成は、成分を混合し、当該物質の融点より高い温度、一般には２０℃から２００℃に加熱して融解し、その後媒質を脱水して生成された水を除去することによって、又はより好都合には、例えば五酸化リンのような乾燥剤又は水分を吸収することができる他の何らかの物質の存在下で、好都合に実施される。この中間体アミドの生成はまた、この方法の変法を使用して、若しくはカルボン酸又はそれらの誘導体を含む、アミド（例えばペプチド共役型のような）を生成するためのもう１つ別の方法を使用して、及び当業者に周知の条件及び試薬を変化させて［Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ］実施しうる。   Formation of the amide can be accomplished by mixing the ingredients and melting by heating to a temperature above the material's melting point, typically 20 ° C. to 200 ° C., and then dehydrating the medium to remove the generated water, or more. Conveniently, it is conveniently performed in the presence of a desiccant such as phosphorous pentoxide or some other substance that can absorb moisture. The production of this intermediate amide is also another method for producing amides (such as, for example, peptide conjugates) using variations of this method or containing carboxylic acids or their derivatives. And varying conditions and reagents well known to those skilled in the art [R. C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers].

前記で得たアミドの、式ＨＮ（Ｒ１）Ｒ２のアミンへの還元は、例えば水素化アルミニウムウリチウムなどの還元剤、若しくはこの場合に有効な他の何らかの水素化物又は還元剤を使用して実施しうる。その手順は、好ましくは、溶媒の沸点より低い温度で又は無水及び／又は不活性ガス体下に、非プロトン性溶媒（例えばテトラヒドロフラン又はエーテル）中で実施する。 Reduction of the amide obtained above to an amine of formula HN (R 1 ) R 2 uses a reducing agent such as, for example, aluminum hydride hydride, or any other hydride or reducing agent effective in this case. Can be implemented. The procedure is preferably carried out in an aprotic solvent (eg tetrahydrofuran or ether) at a temperature below the boiling point of the solvent or under anhydrous and / or inert gas bodies.

もう１つの変法に従えば、ＨＮ（Ｒ１）Ｒ２と称される脂質部分は、市販のものを入手してもよい。 According to another variant, the lipid moiety designated HN (R 1 ) R 2 may be obtained commercially.

Ｒ１及び／又はＲ２が式−（ＣＨ２）ｔ−ＯＺの基を表わすとき、手順は、アルキル部分を生成するために上述したように実施し、その後、当業者に既知の従来の手法に従って市販のＰＥＧ、ポリオール又は糖と単純カップリングする。 When R 1 and / or R 2 represents a group of formula — (CH 2 ) t —OZ, the procedure is carried out as described above to produce the alkyl moiety, followed by conventional techniques known to those skilled in the art. Simple coupling with commercially available PEG, polyol or sugar according to

一般式（Ｉ）の化合物の脂質部分Ｌが−ＯＲ３基で表わされるとき、後者は、好ましくは市販の製品から選択される。 When the lipid moiety L of the compound of general formula (I) is represented by a —OR 3 group, the latter is preferably selected from commercially available products.

２）スペーサーＹの連結
次に、先の段階で得た脂質部分Ｌに、当業者に既知の従来の手法に従ってスペーサーＬを結合する。好ましい変法に従えば、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン又は他の何らかのエーテルのような適切な溶媒中、溶媒の沸点より低い温度で、及び無水及び／又は不活性ガス体下に、脂質部分ＬをＮ−アシル化してアミド結合を形成する。この反応は、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンのようなアミン含有塩基の存在下で、若しくはトリエチルアミン又はエチルジイソプロピルアミンのような非求核アミン含有塩基と混合したこの塩基の存在下で実施する。ピリジンも、単独で又はもう１つ別の塩基と混合して使用するか、上述した溶媒の１つで希釈してもよく、若しくはそれ自体を溶媒として使用してもよい。 2) Ligation of spacer Y Next, the spacer L is bound to the lipid portion L obtained in the previous step according to a conventional method known to those skilled in the art. According to a preferred variant, the lipid moiety L is N in a suitable solvent such as dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran or some other ether at a temperature below the boiling point of the solvent and under anhydrous and / or inert gas. Acylation to form an amide bond. This reaction is preferably carried out in the presence of an amine-containing base such as N, N-dimethylaminopyridine or in the presence of this base mixed with a non-nucleophilic amine-containing base such as triethylamine or ethyldiisopropylamine. To do. Pyridine can also be used alone or mixed with another base, diluted with one of the solvents mentioned above, or itself as a solvent.

３）ポリチオ尿素鎖の形成
一般式（Ｉ）の化合物の合成の第三の部分は、チオ尿素単位の連続的な導入である。これは、所望ポリチオ尿素部分を得るために必要な回数だけ反復しうる一連の反応において実施する。好ましい方法によれば、その手順は次のような実施する：
Ａ）最初に、先の段階で得たＹ−Ｃ（Ｏ）−Ｌに、−ＨＮ−（ＣＨＲ）ｍ−基の成員の形態で単位の最初の部分を連結する。そのために、手順は、カップリング剤、例えば、保持されているか又は保持されていない、１−ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１−ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート又はテトラフルオロボレート（ＨＢＴＵ又はＴＢＴＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、又は１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）−３−エチルカルボジイミドヨージドの存在下に、ジアミンを含有する、式Ｈ２Ｎ−（ＣＨＲ）ｍ−ＮＨ２の成員から出発して好都合に実施される。このカップリングは、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン又は他の何らかのエーテルのような適切な溶媒中、溶媒の沸点より低い温度で、及び無水及び／又は不活性ガス体下で実施する。この手順はまた、非求核アミン含有塩基、例えばエチルジイソプロピルアミン、トリエチルアミン又はトリイソプロピルアミンの存在下でも実施される。脂質部分とスペーサーの性質が適合性であれば、ＳＣＮ−（ＣＨＲ）ｍ−型の配列又は前駆体を連結することができ、それによって、下記のＣ）で述べるような段階を通して合成を継続することが可能となる。 3) Formation of polythiourea chains The third part of the synthesis of compounds of general formula (I) is the continuous introduction of thiourea units. This is performed in a series of reactions that can be repeated as many times as necessary to obtain the desired polythiourea moiety. According to a preferred method, the procedure is carried out as follows:
A) First, the first part of the unit is linked to the YC (O) -L obtained in the previous step in the form of a member of the -HN- (CHR) m- group. To that end, the procedure is based on coupling agents such as 1-benzotriazolyloxytris (pyrrolidino) phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), 1-benzotriazolyloxytris (retained or not retained). Dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP), O- (1H-benzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate or tetrafluoroborate (HBTU or TBTU) In the presence of dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC), or 1- (3-trimethylammoniopropyl) -3-ethylcarbodiimide iodide, Containing an amine is conveniently carried out starting from members of the formula H 2 N- (CHR) m -NH 2. This coupling is performed in a suitable solvent such as dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran or some other ether, at a temperature below the boiling point of the solvent and under anhydrous and / or inert gas. This procedure is also carried out in the presence of a non-nucleophilic amine-containing base such as ethyldiisopropylamine, triethylamine or triisopropylamine. If the properties of the lipid moiety and the spacer are compatible, the SCN- (CHR) m -type sequence or precursor can be linked, thereby continuing the synthesis through the steps as described in C) below. It becomes possible.

Ｂ）次に、先の段階で得た生成物を、好ましい手法に従って、二硫化炭素（ＣＳ２）で又はそのような官能性を得るための当業者に既知の他の試薬で処理することによってイソチオシアネートに変換する［Ｈ．Ｕｌｒｉｃｈ，イソシアネートの化学と技術（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ），Ｗｉｌｅｙ（１９９６）、イソシアネートの化学とそのチオ誘導体（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃｙａｎａｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｔｈｉｏ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ），Ｓ．Ｐａｔａｉ編集、Ｗｉｌｅｙ（１９７７）、Ｓ．Ｏｚａｋｉ，イソシアネート化学の近年の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．７２，４５７（１９７２）］。この反応は、例えばテトラヒドロフラン又は他の適合性エーテル溶媒のような溶媒中、冷却混合物の温度から約２０℃までの間の温度で好都合に実施される。この手順はまた、反応を促進する及び／又は反応中に放出される硫化水素を捕獲することができる試薬、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下でも実施される。 B) The product obtained in the previous step is then treated with carbon disulfide (CS 2 ) or with other reagents known to those skilled in the art for obtaining such functionality, according to a preferred procedure. Convert to isothiocyanate [H. Ulrich, Chemistry and Technology of Isocyanates, Wiley (1996), Isocyanate Chemistry and its Thio Derivatives (The Chemistry of Cyanates and the Thier Thiev.). Patai, Wiley (1977), S.A. Ozaki, Recent Advances in Isocyanate Chemistry, Chem. Rev. 72,457 (1972)]. This reaction is conveniently carried out in a solvent such as tetrahydrofuran or other compatible ether solvent at a temperature between the temperature of the cooled mixture and up to about 20 ° C. This procedure is also performed in the presence of a reagent that can accelerate the reaction and / or capture hydrogen sulfide released during the reaction, such as dicyclohexylcarbodiimide (DCC).

Ｃ）次に、適切な場合には、式−（ＣＨＲ）ｍ−のもう１つのセグメントを導入できるように、先の段階で得たイソチオシアネートからチオ尿素単位を生成する。好都合には、任意に保護された、式Ｈ２Ｎ−（ＣＨＲ）ｍ−ＮＨ２のジアミンを、その中性形態又は酸性塩の形態で、先の形態で得たイソチオシアネートと反応させる。この反応は、任意に、非求核アミン含有基、例えばトリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、トリイソプロピルアミン又は１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）の存在下で実施する。その手順は、好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン又は他の適合性のエーテル又は溶媒のような適切な溶媒中、冷却混合物の温度から溶媒の還流温度までの間でありうる温度で実施する。 C) Next, if appropriate, thiourea units are generated from the isothiocyanate obtained in the previous step so that another segment of the formula — (CHR) m — can be introduced. Conveniently, an optionally protected diamine of formula H 2 N— (CHR) m —NH 2 is reacted with the isothiocyanate obtained in the previous form in its neutral or acidic salt form. This reaction is optionally carried out in the presence of a non-nucleophilic amine-containing group such as triethylamine, ethyldiisopropylamine, triisopropylamine or 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU). To do. The procedure is preferably carried out in a suitable solvent such as dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran or other compatible ether or solvent at a temperature that can be between the temperature of the cooled mixture and the reflux temperature of the solvent.

所望単位をｎコピー数分導入できるように、所望構造が得られるまで連続的に必要なだけ上述した段階Ｂ）及びＣ）を反復する。分枝構造を得るには、前記の手順を、適切な時点で、式（ＩＩ）で述べた置換基Ｒを得るために必要な分子を導入することによって同様に実施する。   Steps B) and C) described above are repeated continuously as necessary until the desired structure is obtained so that n copies of the desired unit can be introduced. To obtain a branched structure, the above procedure is similarly performed by introducing the molecules necessary to obtain the substituent R described in formula (II) at the appropriate time.

４）置換基Ｘを導入することによるポリチオ尿素部分の末端
ポリチオ尿素型の鎖の末端を生成する最後の段階は、置換基Ｘを導入することである。そのために、置換基Ｘの性質に従って選択される、当業者に既知である従来の連結方法を使用する。例えば、Ｘがアルキルを表わすときは、必要であれば、例えばトリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、トリイソプロピルアミン又は１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）のような非求核アミン含有塩基の存在下で、アルキルイソチオシアネートを反応させることによって手順を実施する。その反応は、適切な溶媒中、例えばジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン又は他の適合性エーテル中、冷却混合物の温度から溶媒の還流温度までの温度で実施する。 4) End of polythiourea moiety by introducing substituent X The final step in generating the end of the polythiourea type chain is to introduce the substituent X. To that end, conventional linking methods known to those skilled in the art, selected according to the nature of the substituent X, are used. For example, when X represents alkyl, if necessary, a non-ethyl such as triethylamine, ethyldiisopropylamine, triisopropylamine or 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU). The procedure is carried out by reacting the alkyl isothiocyanate in the presence of a nucleophilic amine-containing base. The reaction is carried out in a suitable solvent, such as dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran or other compatible ether, at a temperature from the temperature of the cooled mixture to the reflux temperature of the solvent.

当然ながら、様々な置換基が反応に干渉しうるときには、分子の残りの部分に影響を及ぼすことなく配置し、除去することができる適合性の基であらかじめ保護することが好ましい。そのために、当業者に既知の従来の方法に従って、特にＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＭｃＯｍｉｅ，有機化学における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、又はＰ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ），Ｔｈｉｅｍｅの中で述べられている方法に従って、手順を実施する。   Of course, when various substituents can interfere with the reaction, it is preferable to pre-protect with compatible groups that can be placed and removed without affecting the rest of the molecule. For this purpose, in particular according to conventional methods known to the person skilled in the art W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis (Protective Groups in Organic Synthesis), Wiley-Interscience, McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry (Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum. J. et al. The procedure is performed according to the method described in Kocienski, Protecting Groups, Thimeme.

さらに、製造方法の各々の段階のあとに、適切な場合には、当業者に既知の何らかの方法に従って得た化合物を分離し、精製するための段階を実施してもよい。   Furthermore, after each step of the production process, if appropriate, steps may be performed to separate and purify the compound obtained according to any method known to those skilled in the art.

本発明による好ましい化合物は：
ここではＤＴＴＵ又はＤＴ−３ＴＵと称する、３−（２−｛３−［２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチル｝チオウレイド）エチル］チオウレイド｝エチル）−１−メチルチオ尿素は、一般式（Ｉ）［式中、Ｘ＝−ＣＨ３；ｍ＝２；Ｒ＝Ｈ；ｎ＝３；ｌ＝０；Ｙ＝ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２；及びＬ＝−Ｎ（Ｒ１）Ｒ２［式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｃ１４Ｈ２９］である］に対応する。この化合物のＤＴ−３ＴＵという名称は、その中に含まれる３個のチオ尿素基を指す；さらに、この命名法の例は、４個のチオ尿素を含むＤＴ−４ＴＵ、２個のチオ尿素を含むＤＴ−２ＴＵ等々を含む。 Preferred compounds according to the invention are:
3- (2- {3- [2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] ethyl} thioureido) ethyl] thioureido} ethyl), referred to herein as DTTU or DT-3TU)- 1-methylthiourea has the general formula (I) [wherein X = —CH 3 ; m = 2; R = H; n = 3; l = 0; Y = NH—CO—CH 2 —CH 2 ; Corresponds to L = —N (R 1 ) R 2 , where R 1 = R 2 = C 14 H 29 ]. The name DT-3TU of this compound refers to the three thiourea groups contained therein; further, an example of this nomenclature is DT-4TU containing 4 thioureas, 2 thioureas. Including DT-2TU etc.

３−（２−｛３−［２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［ジテトラデシルカルバモイル］プロピオニルアミノ｝−エチル）−チオウレイド］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−１−メチルチオ尿素又はＤＴ−４ＴＵは、一般式（Ｉ）［式中、Ｘ＝−ＣＨ３；ｍ＝２；Ｒ＝Ｈ；ｎ＝４；ｌ＝０；Ｙ＝ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２；及びＬ＝−Ｎ（Ｒ１）Ｒ２［式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｃ１４Ｈ２９］である］に一致する。 3- (2- {3- [2- (3- {2- [3- (2- {3- [Ditetradecylcarbamoyl] propionylamino} -ethyl) -thioureido] -ethyl} -thioureido) -ethyl] - thioureido} - ethyl) -1-methylthiourea or DT-4TU the general formula (I) [wherein, X = -CH 3; m = 2; R = H; n = 4; l = 0; Y = NH—CO—CH 2 —CH 2 ; and L = —N (R 1 ) R 2 , where R 1 = R 2 = C 14 H 29 ].

ＤＴ−３ＴＵジオール又は［２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［２−（３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−チオウレイド］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−プロパン−１，２−ジオールの合成は、一般式（Ｉ）［式中、   DT-3TU diol or [2- (3- {2- [3- (2- {3- [2- (3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino) -ethyl] -thioureido} -ethyl) -thioureido] -Ethyl} -thioureido) -ethyl] -propane-1,2-diol was synthesized according to the general formula (I) [wherein

Figure 0004276439
Figure 0004276439
に従う。
Figure 0004276439
Figure 0004276439
Follow.

ＤＴ−２ＴＵジオール又は［２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−プロパン−１，２−ジオールは、一般式（Ｉ）［式中、   DT-2TU diol or [2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] -ethyl} -thioureido) -ethyl] -propane-1,2-diol has the general formula (I) [Where:

Figure 0004276439
に一致する。
Figure 0004276439
 Matches.

本発明のもう１つの対象は、本発明によるトランスジェニック化合物と核酸を含有する組成物に関する。各々の成分のそれぞれの量は、使用するトランスフェクション化合物、核酸及び所望適用（特にトランスフェクトする細胞型）に応じて、当業者によって容易に調整されうる。   Another subject of the invention relates to a composition comprising a transgenic compound according to the invention and a nucleic acid. The respective amounts of each component can be readily adjusted by those skilled in the art depending on the transfection compound, nucleic acid used and the desired application (particularly the cell type to be transfected).

本発明のために、「核酸」の表現は、デオキシリボ核酸及びリボ核酸の両方を意味すると理解される。それらは、天然又は人工配列、特にゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡキメロプラスト又は合成又は半合成配列のようなハイブリッド配列、及び修飾された又は修飾されていないオリゴヌクレオチドでありうる。これらの核酸は、ヒト、動物、植物、細菌又はウイルス由来等でありうる。それらは、当業者に既知の何らかの手法によって、特にライブラリーのスクリーニングによって、化学合成によって、又はライブラリーのスクリーニングによって得た配列の化学修飾又は酵素的修飾を含む混合方法によって入手しうる。それらは化学修飾されていてもよい。一般に、それらは少なくとも１０、２０、５０又は１００個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２００個の連続ヌクレオチドを含む。さらに一層好ましくは、それらは少なくとも５００個の連続ヌクレオチドを含む。   For the purposes of the present invention, the expression “nucleic acid” is understood to mean both deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid. They are natural or artificial sequences, in particular genomic DNA (gDNA), complementary DNA (cDNA), messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), ribosomal RNA (rRNA), DNA / RNA chimeroplasts or synthetic or semi-synthetic sequences As well as modified and unmodified oligonucleotides. These nucleic acids can be derived from humans, animals, plants, bacteria or viruses. They can be obtained by any technique known to the person skilled in the art, in particular by screening a library, by chemical synthesis, or by mixed methods involving chemical or enzymatic modification of sequences obtained by library screening. They may be chemically modified. In general, they comprise at least 10, 20, 50 or 100 consecutive nucleotides, preferably at least 200 consecutive nucleotides. Even more preferably, they comprise at least 500 contiguous nucleotides.

より特定のデオキシリボ核酸に関して、それらは一本鎖又は二本鎖のいずれでもよく、ならびに短いオリゴヌクレオチド又はより長い配列のいずれでもよい。特に、該核酸は、好都合にはプラスミド、ベクター、エピソーム、発現カセット等から成る。これらのデオキシリボ核酸は、標的細胞において機能性であるか又はそうでない原核生物又は真核生物複製基点、１個又はそれ以上のマーカー遺伝子、転写又は複製を調節するための配列、治療的重要性を持つ遺伝子、修飾されている又は修飾されていないアンチセンス配列、他の細胞成分に結合するための領域等を担いうる。   For more specific deoxyribonucleic acids, they can be either single stranded or double stranded, as well as either short oligonucleotides or longer sequences. In particular, the nucleic acid conveniently consists of a plasmid, vector, episome, expression cassette and the like. These deoxyribonucleic acids are prokaryotic or eukaryotic replication sites that are functional or not in the target cell, one or more marker genes, sequences for regulating transcription or replication, therapeutic importance. It may carry a gene, a modified or unmodified antisense sequence, a region for binding to other cellular components, and the like.

好ましくは、該核酸は、調節配列の制御下の１個又はそれ以上の治療的重要性を持つ遺伝子、例えば１個又はそれ以上のプロモーター及び標的細胞において活性な転写終結信号を含む。   Preferably, the nucleic acid comprises one or more genes of therapeutic importance under the control of regulatory sequences, such as one or more promoters and a transcription termination signal active in the target cell.

本発明のために、治療的重要性を持つ遺伝子の表現は、特に治療作用を有するタンパク質産物をコードする遺伝子を意味すると理解される。そのようにコードされるタンパク質産物は、特にタンパク質又はペプチドでありうる。このタンパク質産物は、標的細胞に関して外来性、相同性又は内因性でありうる、すなわち標的細胞が病的状態を有していないとき、標的細胞において正常に発現される産物でありうる。この場合、タンパク質の発現は、例えば、細胞における不十分な発現又は修飾のために不活性であるか又は活性が低いタンパク質の発現を補うこと、若しくは前記タンパク質を過剰発現することを可能にする。治療的重要性を有する遺伝子はまた、高い安定性、変化した活性等を有する、細胞タンパク質の突然変異体をコードしうる。前記タンパク質産物はまた、標的細胞に関して非相同でもよい。この場合、発現されるタンパク質は、例えば、細胞において欠損している活性を補足するか又は提供して、細胞が病的状態に対抗することを可能にするか、若しくは免疫応答を刺激しうる。   For the purposes of the present invention, the expression of a gene of therapeutic importance is understood to mean a gene that encodes a protein product that has a particular therapeutic action. The protein product so encoded can in particular be a protein or peptide. The protein product can be foreign, homologous or endogenous with respect to the target cell, i.e., a product that is normally expressed in the target cell when the target cell has no pathological condition. In this case, the expression of the protein makes it possible, for example, to compensate for the expression of a protein that is inactive or less active due to insufficient expression or modification in the cell, or to overexpress the protein. Genes with therapeutic importance can also encode mutants of cellular proteins with high stability, altered activity, and the like. The protein product may also be heterologous with respect to the target cell. In this case, the expressed protein may, for example, complement or provide a deficient activity in the cell, allowing the cell to combat a pathological condition, or stimulate an immune response.

本発明のための治療的生成物の中で、より特定すると、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン及びサイトカインならびにそれらの阻害因子又は拮抗物質：インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ、インターロイキン１の拮抗物質、インターロイキン１又はＴＮＦαの可溶性受容体等（ＦＲ９２／０３１２０号）、成長因子、神経伝達物質又はそれらの前駆体又は合成酵素、栄養因子（ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン等）、アポリポタンパク質（ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ等、ＦＲ９３／０５１２５号）、ジストロフィン又はミニジストロフィン（ＦＲ９１／１１９４７号）、嚢胞性線維症に関連するＣＦＴＲタンパク質、癌抑制遺伝子（ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ等、ＦＲ９３／０４７４５号）、凝固に関わる因子（第ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ因子）をコードする遺伝子、ＤＮＡ修復に関わる遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）、ヘモグロビン又は他のタンパク質担体に関する遺伝子、代謝酵素、異化酵素等が挙げられよう。   Among the therapeutic products for the present invention, more particularly enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines and cytokines and their inhibitors or antagonists: interleukins, interferons, TNF, antagonists of interleukin 1, Soluble receptor for interleukin 1 or TNFα (FR92 / 03120), growth factor, neurotransmitter or precursor or synthetic enzyme thereof, trophic factor (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3 NT5, HARP / pleiotrophin, etc.), apolipoprotein (ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc., FR93 / 05125), dystrophin or minidystrophin (FR91 / 11947), CFTR protein related to cystic fibrosis, tumor suppression Genes encoding genes (p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, etc., FR93 / 04745), factors involved in coagulation (factors VII, VIII, IX), genes involved in DNA repair, suicide genes (thymidine Kinase, cytosine deaminase), hemoglobin or other protein carrier genes, metabolic enzymes, catabolic enzymes and the like.

治療的重要性を持つ核酸はまた、標的細胞におけるその発現が遺伝子の発現又は細胞ｍＲＮＡの転写を制御することを可能にする、遺伝子又はアンチセンス配列又はリボソーム機能を有するＲＮＡをコードするＤＮＡでありうる。そのような配列は、例えば、欧州特許欧州特許第１４０３０８号に述べられている手法に従って、標的細胞内で細胞ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡに転写されて、それらがタンパク質へと翻訳されるのを遮断することができる。治療遺伝子はまた、標的ＲＮＡを選択的に破壊することができるリボザイムをコードする配列を含む（欧州特許第３２１２０１号）。   Nucleic acids of therapeutic importance are also DNA encoding RNAs with gene or antisense sequences or ribosomal functions that allow their expression in target cells to control gene expression or cellular mRNA transcription sell. Such sequences are transcribed into RNA complementary to cellular mRNA in the target cell and block them from being translated into proteins, for example according to the procedures described in European Patent EP 140308 can do. The therapeutic gene also includes a sequence encoding a ribozyme capable of selectively destroying the target RNA (European Patent No. 321201).

上述したように、該核酸はまた、ヒト又は動物において免疫応答を生じることができる抗原性ペプチドをコードする１個又はそれ以上の遺伝子を含みうる。この特定実施形態において、本発明は、ワクチンの生産又は、特に感染、例えばウイルス又は細菌感染、若しくは癌状態を治療する又は予防するために、ヒト又は動物に適用される免疫療法処置の実施を可能にする。それらは特に、エプスタイン−バーウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（欧州特許第１８５５７３号）、仮性狂犬病ウイルス、シンシチウム（合胞体）形成ウイルス、他のウイルスに特異的な抗原性ペプチド、又は腫瘍に特異的な抗原性ペプチド（欧州特許第２５９２１２号）でありうる。   As noted above, the nucleic acid can also include one or more genes that encode antigenic peptides capable of generating an immune response in humans or animals. In this particular embodiment, the present invention allows the production of vaccines, or in particular immunotherapy treatments applied to humans or animals to treat or prevent infections, such as viral or bacterial infections, or cancer conditions. To. They are particularly suitable for Epstein-Barr virus, HIV virus, hepatitis B virus (European Patent No. 185573), pseudorabies virus, syncytium-forming virus, antigenic peptides specific to other viruses, or tumors. It can be a specific antigenic peptide (European Patent No. 259212).

好ましくは、該核酸はまた、所望細胞又は器官において、治療的重要性を持つ遺伝子及び／又は抗原性ペプチドをコードする遺伝子の発現を可能にする配列を含む。それらは本来、これらの配列が感染細胞において機能することができるとき、考慮される遺伝子の発現の責任を担う配列でありうる。それらはまた、異なる由来の（他のタンパク質の発現の責任を担う、又はさらには合成の）配列でありうる。特に、それらは真核生物又はウイルス遺伝子のプロモーター配列でありうる。例えば、それらは、感染を所望する細胞のゲノムから誘導されるプロモーター配列でありうる。同様に、それらはウイルスのゲノムから誘導されるプロモーター配列でありうる。これに関しては、例えば、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ及びＲＳＶ遺伝子のプロモーター等が挙げられるであろう。さらに、これらの発現配列は、活性化配列又は調節配列の付加等によって修飾されうる。そのプロモーターはまた、誘導的又は抑制的でありうる。   Preferably, the nucleic acid also includes sequences that allow expression of genes of therapeutic importance and / or genes encoding antigenic peptides in the desired cell or organ. They can be sequences that are primarily responsible for the expression of the gene under consideration when these sequences are capable of functioning in infected cells. They can also be sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic). In particular, they can be promoter sequences of eukaryotic or viral genes. For example, they can be promoter sequences derived from the genome of the cell in which infection is desired. Similarly, they can be promoter sequences derived from the viral genome. In this regard, for example, promoters of E1A, MLP, CMV and RSV genes may be mentioned. Further, these expression sequences can be modified by adding an activation sequence or a regulatory sequence. The promoter can also be inducible or repressive.

さらに、該核酸はまた、特に治療的重要性を持つ遺伝子の上流に、標的細胞の分泌経路において治療的生成物の合成を指令するシグナル配列を含みうる。このシグナル配列は、治療的生成物の天然シグナル配列でありうるが、他の何らかの機能的シグナル配列又は人工シグナル配列であってもよい。該核酸はまた、合成された治療的生成物を細胞の特定画分へと指令するシグナル配列も含みうる。   In addition, the nucleic acid may also contain a signal sequence that directs synthesis of a therapeutic product in the secretory pathway of the target cell, upstream of a gene of particular therapeutic importance. This signal sequence may be the natural signal sequence of the therapeutic product, but may be some other functional signal sequence or an artificial signal sequence. The nucleic acid can also include a signal sequence that directs the synthesized therapeutic product to a specific fraction of the cell.

本発明による組成物は、さらに、トランスフェクション化合物／核酸複合体と組み合わせて、そのトランスフェクション力を改善することができる１つ又はそれ以上のアジュバントを含有しうる。もう１つの実施形態では、本発明はそれ故、核酸、上記で定義したトランスフェクション化合物、及びトランスフェクション化合物／核酸複合体と組み合わせてそのトランスフェクション力を改善することができる少なくとも１つのアジュバントを含有する組成物に関する。この種のアジュバント（例えば脂質、ペプチド、タンパク質又はポリマー）の存在は、好都合にも、前記化合物のトランスフェクション力を高めることを可能にしうる。これに関して、本発明の組成物は、アジュバントとして、特に脂質凝集物を形成する特性を有する１つ又はそれ以上の中性脂質を含有しうる。「脂質凝集物」の語は、あらゆる種類のリポソーム（単層及び多重膜の両方）ならびにミセル又はより無定形の凝集物を包含する総称名である。   The composition according to the present invention may further contain one or more adjuvants that can be combined with the transfection compound / nucleic acid complex to improve its transfection ability. In another embodiment, the present invention therefore contains at least one adjuvant capable of improving its transfection ability in combination with a nucleic acid, a transfection compound as defined above, and a transfection compound / nucleic acid complex. It relates to a composition. The presence of this type of adjuvant (eg lipid, peptide, protein or polymer) may advantageously allow to increase the transfection power of the compound. In this regard, the composition of the invention may contain one or more neutral lipids as adjuvants, in particular with the property of forming lipid aggregates. The term “lipid aggregate” is a generic name encompassing all types of liposomes (both monolayer and multilamellar) and micelles or more amorphous aggregates.

より好ましくは、本発明の枠内で使用する中性脂質は、２つの脂肪鎖を含む脂質である。特に好都合には、生理的条件下で両性イオン性であるか又はイオン電荷を持たない天然又は合成脂質を使用する。それらは、より特定すると、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジ−ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジ−ミリストイルホスファチジルエタノールアミンならびに１回から３回Ｎ−メチル化されているそれらの誘導体、ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（特にガラクトセレブロシドなど）、スフィンゴ脂質（特にスフィンゴミエリンなど）、又はアシアロガングリオシド（特にアシアロＧＭ１及びＧＭ２など）から選択されうる。好都合には、本発明に関して使用する脂質アジュバントは、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ又はコレステロールから選択される。   More preferably, the neutral lipid used within the framework of the present invention is a lipid comprising two fatty chains. Particularly advantageously, natural or synthetic lipids are used which are zwitterionic under physiological conditions or have no ionic charge. They are more specifically dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), oleoyl palmitoylphosphatidylethanolamine (POPE), di-stearoylphosphatidylethanolamine, di-palmitoylphosphatidylethanolamine, di-myristoylphosphatidylethanolamine and once Derivatives thereof that are N-methylated three times from phosphatidylglycerol, diacylglycerol, glycosyl diacylglycerol, cerebroside (especially galactocerebroside), sphingolipids (especially sphingomyelin), or asialogangliosides (especially asialo GM1 and GM2) Etc.). Conveniently, the lipid adjuvant used in connection with the present invention is selected from DOPE, DOPC or cholesterol.

これらの様々な脂質は、当業者に周知の従来の手法により、合成によって若しくは器官（例えば脳）又は卵からの抽出によって、入手しうる。特に、天然脂質の抽出は有機溶媒によって実施しうる（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙも参照のこと）。   These various lipids can be obtained by conventional techniques well known to those skilled in the art, by synthesis or by extraction from organs (eg brain) or eggs. In particular, the extraction of natural lipids can be carried out with organic solvents (see also Lehninger, Biochemistry).

好ましくは、本発明の組成物は、モル／モルで核酸１当量につき０．０１当量から２０当量のアジュバント、より好ましくは０．５モル当量から５モル当量を含有する。   Preferably, the compositions of the present invention contain 0.01 to 20 equivalents of adjuvant, more preferably 0.5 to 5 molar equivalents per equivalent of nucleic acid in moles / mole.

もう１つの選択法に従えば、本発明による組成物のトランスフェクション力を改善することを可能にする上述したアジュバント、特にペプチド、タンパク質又はポリエチレングリコールのようなある種のポリマーは、本発明によるトランスフェクション化合物と、単に混合するのではなく複合してもよい。この場合、それらは、一般式（Ｉ）における置換基Ｘに、又はアルキル鎖が脂肪族鎖であるときにはアルキル鎖Ｒ１及び／又はＲ２の末端に、共有結合される。また、コレステロールに共有結合したポリエチレングリコール（ｃｈｏｌ−ＰＥＧ）をアジュバントとして使用することも好都合である。実際に、そのようなアジュバントを本発明によるトランスフェクション組成物と共に使用するとき、生じる粒子はより小さなサイズを有しており、それによってそれらの凝集を低下させ、血液循環におけるそれらの半減期を上昇させる。本発明により使用するトランスフェクタントＤＴ−３ＴＵの量は、粒子が５００ｎｍ未満の大きさを有するような量である。使用するＤＴ−３ＴＵの好ましい量は、少なくとも４０ｎｍｏｌの脂質ＤＴ−３ＴＵ／μｇＤＮＡ
に等しい（下記の実施例１１、１３及び１４参照）。 According to another selection method, certain polymers such as the above mentioned adjuvants, in particular peptides, proteins or polyethylene glycol, which make it possible to improve the transfection power of the composition according to the invention, The compound may be combined with the reaction compound instead of simply mixing. In this case, they are covalently bonded to the substituent X in the general formula (I) or to the end of the alkyl chain R 1 and / or R 2 when the alkyl chain is an aliphatic chain. It is also advantageous to use polyethylene glycol (chol-PEG) covalently bound to cholesterol as an adjuvant. Indeed, when such adjuvants are used with the transfection compositions according to the invention, the resulting particles have a smaller size, thereby reducing their aggregation and increasing their half-life in the blood circulation. Let The amount of transfectant DT-3TU used according to the invention is such that the particles have a size of less than 500 nm. The preferred amount of DT-3TU used is at least 40 nmol of lipid DT-3TU / μg DNA
(See Examples 11, 13 and 14 below).

特に好都合な実施形態によれば、本発明の組成物は、さらに、核酸の導入を方向づけることを可能にする標的エレメントを含む。この標的エレメントは、核酸の導入をある種の細胞型又はある種の所望組織（腫瘍細胞、肝細胞、造血細胞等）へと方向づけることを可能にする細胞外標的エレメントでありうる。それはまた、核酸の導入をある種の好ましい細胞画分（ミトコンドリア、核等）へと方向づけることを可能にする細胞内標的エレメントでありうる。標的エレメントは、本発明によるトランスフェクション化合物及び核酸と混合してもよく、この場合、標的エレメントは、好ましくは脂肪アルキル鎖（少なくとも１０個の炭素原子）又はポリエチレングリコールに共有結合する。もう１つの選択法に従えば、標的エレメントは、置換基Ｘ又はスペーサーＹのレベルで、若しくはＲ１及び／又はＲ２が脂肪族鎖を表わすときはＲ１及び／又はＲ２の末端で、本発明によるトランスフェクション化合物に共有結合する。最後に、標的エレメントはまた、上記で規定したとおりである核酸に結合しうる。 According to a particularly advantageous embodiment, the composition according to the invention further comprises a target element which makes it possible to direct the introduction of nucleic acids. This target element can be an extracellular target element that allows the introduction of the nucleic acid to be directed to certain cell types or certain desired tissues (tumor cells, hepatocytes, hematopoietic cells, etc.). It can also be an intracellular targeting element that allows the introduction of nucleic acids to be directed to certain preferred cell fractions (mitochondria, nuclei, etc.). The target element may be mixed with the transfection compound and nucleic acid according to the present invention, in which case the target element is preferably covalently linked to a fatty alkyl chain (at least 10 carbon atoms) or polyethylene glycol. According to another selection method, the target element is at the level of substituent X or spacer Y, or at the end of R 1 and / or R 2 when R 1 and / or R 2 represents an aliphatic chain, Covalently binds to the transfection compound according to the invention. Finally, the target element can also bind to a nucleic acid as defined above.

本発明の枠内で使用しうる標的エレメントの中でも特に、糖、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、脂質、神経伝達物質、ホルモン、ビタミン又はそれらの誘導体が挙げられるであろう。好ましくは、それらは、糖、ペプチド、ビタミン、又は例えば抗体又は抗体フラグメント、細胞受容体のリガンド又はそのフラグメント、受容体又は受容体フラグメントなどのタンパク質である。例えば、それらは、成長因子受容体のリガンド、サイトカイン受容体、細胞レクチン型受容体、葉酸塩受容体、又はインテグリンのような接着タンパク質についての受容体に親和性を有するＲＧＤ配列含有リガンドでありうる。また、トランスフェリン、ＨＤＬ及びＬＤＬについての受容体、又は葉酸輸送体も挙げられよう。標的エレメントはまた、シアリルルイスＸ、又は選択的に抗体のＦａｂフラグメント、又は一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）などの、アシアロ糖タンパク質又はシアリドについての受容体のようなレクチンを標的することを可能にする糖でありうる。   Among the target elements that can be used within the framework of the present invention, mention may be made of sugars, peptides, proteins, oligonucleotides, lipids, neurotransmitters, hormones, vitamins or derivatives thereof. Preferably they are sugars, peptides, vitamins or proteins such as antibodies or antibody fragments, ligands of cell receptors or fragments thereof, receptors or receptor fragments. For example, they can be growth factor receptor ligands, cytokine receptors, cellular lectin-type receptors, folate receptors, or RGD sequence-containing ligands that have an affinity for receptors for adhesion proteins such as integrins. . There may also be receptors for transferrin, HDL and LDL, or folate transporters. The targeting element also allows for targeting lectins such as receptors for asialoglycoproteins or sialides, such as sialyl Lewis X, or alternatively a Fab fragment of an antibody, or a single chain antibody (ScFv) It can be.

本発明の対象はまた、インビトロ、インビボ又は半ビボで核酸を細胞に導入するための、上記で定義したトランスフェクション化合物の使用である。より正確には、本発明の対象は、疾患、特にタンパク質又は核生成物の欠損から生じる疾患を治療することを意図した薬剤の製造のための、本発明によるトランスフェクション化合物の使用である。前記薬剤に含有されるポリヌクレオチドは、前記タンパク質又は核生成物をコードするか、若しくはインビボ又は半ビボで前記疾患を矯正することができる前記核生成物を構成する。   The subject of the present invention is also the use of a transfection compound as defined above for introducing a nucleic acid into a cell in vitro, in vivo or in vivo. More precisely, the subject of the present invention is the use of the transfection compound according to the invention for the manufacture of a medicament intended to treat a disease, in particular a disease resulting from a protein or nucleoproduct deficiency. The polynucleotide contained in the drug encodes the protein or nucleoproduct or constitutes the nucleoproduct capable of correcting the disease in vivo or semi-vivo.

インビボでの使用のために、例えば治療において、若しくは遺伝子の調節又は病的状態の動物モデルの創造を検討するために、本発明による組成物は、局所、皮膚、経口、直腸、膣、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮、気管内又は腹腔内経路等による投与用に製剤することができる。好ましくは、本発明の組成物は、注射用製剤、特に所望器官への直接注射のため、又は局所経路（皮膚及び／又は粘膜上）による投与のための、医薬適合性の賦形剤を含有する。それらは特に等張無菌溶液、又は、場合によって、無菌水又は生理食塩水を添加して注射用溶液に還元することができる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物でありうる。注射のために使用する核酸の用量ならびに投与回数は、様々なパラメータに従って、特に使用する投与様式、該当する病的状態、発現される遺伝子、又は所望治療期間に従って、適合させうる。より特定して投与様式に関しては、組織内への、例えば腫瘍のレベルでの直接注射、又は循環系への注入、又は培養細胞の処理とそれに続く注入又は移植によるインビボでのそれらの再移植のいずれかでありうる。本発明の枠内での該当組織は、例えば、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、膀胱、胃、腸、精巣、卵巣、直腸、神経系、眼、腺、結合組織等である。   For in vivo use, for example in therapy or to consider the regulation of genes or the creation of animal models of pathological conditions, the compositions according to the invention are topical, dermal, oral, rectal, vaginal, parenteral It can be formulated for administration by intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, intratracheal or intraperitoneal route. Preferably, the composition according to the invention contains pharmaceutically acceptable excipients for injectable preparations, in particular for direct injection into the desired organ or for administration by the topical route (on the skin and / or mucosa) To do. They can in particular be isotonic sterile solutions or, in some cases, dry compositions, in particular freeze-dried compositions, which can be reduced to solutions for injection by the addition of sterile water or saline. The dose of nucleic acid used for injection as well as the number of administrations can be adapted according to various parameters, in particular according to the mode of administration used, the relevant pathological condition, the gene expressed or the desired duration of treatment. More specifically, regarding the mode of administration, direct injection into the tissue, eg at the level of a tumor, or infusion into the circulatory system, or treatment of cultured cells followed by their re-implantation by infusion or transplantation. It can be either. The corresponding tissue within the framework of the present invention is, for example, muscle, skin, brain, lung, liver, spleen, bone marrow, thymus, heart, lymph, blood, bone, cartilage, pancreas, kidney, bladder, stomach, intestine, testis Ovary, rectum, nervous system, eye, gland, connective tissue and the like.

本発明のもう１つの対象は、次の段階：
（１）該核酸を本発明によるトランスフェクション化合物と接触させて複合体を形成すること；及び
（２）該細胞を（１）で形成された複合体と接触させること
を含む、核酸を細胞に導入する方法に関する。 Another subject of the present invention is the following stage:
(1) contacting the nucleic acid with a transfection compound according to the present invention to form a complex; and (2) contacting the cell with the complex formed in (1), wherein the nucleic acid is brought into the cell. It relates to the method of introduction.

本発明は、さらに、次の段階：
（１）該核酸を本発明によるトランスフェクション化合物と接触させて複合体を形成すること；及び
（２）ヒト又は動物の身体の細胞を（１）で形成された複合体と接触させること
を含む、ヒト又は動物の身体を治療する方法に関する。 The present invention further comprises the following steps:
(1) contacting the nucleic acid with a transfection compound according to the present invention to form a complex; and (2) contacting cells of the human or animal body with the complex formed in (1). Relates to a method of treating the human or animal body.

該細胞は、前記複合体と共に細胞をインキュベートすることによって（インビトロ又は半ビボでの使用のため）、又は前記複合体を器官内に注入することによって（インビボでの使用のため）、複合体と接触させうる。一般に、投与を意図する核酸の量は、例えば治療する又は予防する疾患、核酸の実際の性質、プロモーターの強さ、核酸によって発現される産物の生物活性、個人又は動物の生理状態（体重、年齢等）、投与様式及び製剤の種類のような、数多くの因子に依存する。一般に、前記のインキュベーションは、好ましくは、例えば１０６細胞につき０．０１μｇから１０００μｇの核酸の存在下で実施する。インビボでの投与については、例えば０．０１ｍｇから５０ｍｇの範囲の核酸用量が使用しうる。投与は、単回投与として実施するか又は間隔をおいて反復しうる。 The cells can be obtained by incubating the cells with the complex (for in vitro or semi-vivo use) or by injecting the complex into the organ (for in vivo use). Can be contacted. In general, the amount of nucleic acid intended for administration depends on, for example, the disease being treated or prevented, the actual nature of the nucleic acid, the strength of the promoter, the biological activity of the product expressed by the nucleic acid, the physiological state of the individual or animal (weight, age). Etc.), depending on a number of factors, such as mode of administration and type of formulation. In general, the incubation is preferably carried out, for example, in the presence of 0.01 μg to 1000 μg of nucleic acid per 10 6 cells. For in vivo administration, a nucleic acid dose in the range, for example, 0.01 mg to 50 mg can be used. Dosing can be performed as a single dose or repeated at intervals.

本発明の組成物が、さらに、上記で定義した１つ又はそれ以上のアジュバントを含む場合、そのアジュバントは、本発明によるトランスフェクション化合物及び／又は核酸とあらかじめ混合しうる。選択的に、ヌクレオ脂質複合体の投与の前にアジュバントを投与してもよい。   Where the composition of the invention further comprises one or more adjuvants as defined above, the adjuvants can be premixed with the transfection compounds and / or nucleic acids according to the invention. Optionally, an adjuvant may be administered prior to administration of the nucleolipid complex.

もう１つの好都合な選択法に従えば、組織を、トランスフェクションを改善することを意図した化学的又は物理的処理に供してもよい。物理的処理の場合は、エレクトロトランスファーの場合のような電気パルス、又はソドポレーション（ｓｏｄｏｐｏｒａｔｉｏｎ）の場合のような機械的力を使用しうる。   According to another convenient selection method, the tissue may be subjected to chemical or physical treatment intended to improve transfection. In the case of physical processing, electrical pulses as in the case of electrotransfer, or mechanical forces as in the case of sodoporation may be used.

本発明は、それ故、インビボで核酸を導入するため、特に疾患の治療のための、タンパク質をコードする又は前記疾患を供することができる核酸に転写されうる核酸のインビボ又はインビトロでの投与を含み、前記核酸が上記で定義した条件下で本発明によるトランスフェクション化合物と結合している、特に好都合な方法を提供する。   The invention therefore includes in vivo or in vitro administration of nucleic acids that can be transcribed into nucleic acids that can encode proteins or be capable of subjecting said diseases to introduce nucleic acids in vivo, in particular for the treatment of diseases. A particularly advantageous method is provided wherein the nucleic acid is bound to a transfection compound according to the invention under the conditions defined above.

本発明のトランスフェクション化合物は、一次細胞又は樹立細胞系に核酸を導入するために特に有用である。それらは、分化した形態又は多能性形態（前駆体）の、線維芽細胞、筋肉細胞、神経細胞（ニューロン、神経膠星状細胞、グリア細胞）、肝細胞、造血細胞（リンパ球、ＣＤ３４、樹状細胞等）、上皮細胞等でありうる。   The transfection compounds of the present invention are particularly useful for introducing nucleic acids into primary cells or established cell lines. They are differentiated or pluripotent (precursor) fibroblasts, muscle cells, neurons (neurons, astrocytes, glial cells), hepatocytes, hematopoietic cells (lymphocytes, CD34, Dendritic cells, etc.) and epithelial cells.

本発明のもう１つの対象はまた、本発明による１つ又はそれ以上のトランスフェクション化合物及び／又はそれらの混合物を含むトランスフェクションキットに関する。そのようなキットは、例えばバイアル又はチューブのような様々な容器を収納するように区画分けされた包装の形態で提供されうる。これらの容器の各々は、個別の又は混合された、トランスフェクションを実施するために必要な様々なエレメント：例えば本発明による１つ又はそれ以上のトランスフェクション化合物、１つ又はそれ以上の核酸、１つ又はそれ以上のアジュバント、細胞等を含む。   Another subject of the present invention also relates to a transfection kit comprising one or more transfection compounds according to the invention and / or mixtures thereof. Such a kit may be provided in the form of a package that is partitioned to contain various containers, such as vials or tubes. Each of these containers is a separate or mixed various elements necessary to carry out the transfection: for example one or more transfection compounds according to the invention, one or more nucleic acids, Including one or more adjuvants, cells and the like.

前記の説明に加えて、本発明はまた、本発明の範囲を限定することなく本発明を例示するものとみなされるべきである、下記の実施例及び図面から生じる他の特徴及び利点も包含する。特に、出願人は、限定を伴わずに、本発明によるトランスフェクション化合物を製造するために使用しうる操作プロトコールならびに反応中間体を提示する。言うまでもなく、このプロトコール又は中間生成物から、これらの同じ化合物に到達するための同様の方法を開発する教示を引き出すことは、当業者の能力の範囲内である。   In addition to the foregoing description, the present invention also encompasses other features and advantages arising from the following examples and drawings, which should be considered as exemplifying the present invention without limiting the scope of the invention. . In particular, Applicants present, without limitation, operational protocols and reaction intermediates that can be used to produce transfection compounds according to the present invention. Of course, it is within the ability of one skilled in the art to derive from this protocol or intermediate product the teachings of developing similar methods to reach these same compounds.

（使用する略語）
ＥｔＢｒ：臭化エチジウム
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＰＰＣ：１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＤＴＴＵ：３−（２−｛３−［２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチル｝チオウレイド）エチル］チオウレイド｝エチル）−１−メチルチオ尿素（ＤＴ−３ＴＵとも称する）
ＥＰＣ：Ｌ−α−ホスファチジルコリン９５％（卵）
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＴＢＥ：トリス−ボレート−ＥＤＴＡ
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
本発明を下記の非制限的実施例によって例示する。 (Abbreviations used)
EtBr: ethidium bromide DCC: dicyclohexylcarbodiimide DPPC: 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DTTU: 3- (2- {3- [2- (3- {2- [3- (ditetra Decylcarbamoyl) propionylamino] ethyl} thioureido) ethyl] thioureido} ethyl) -1-methylthiourea (also referred to as DT-3TU)
EPC: L-α-phosphatidylcholine 95% (egg)
PyBOP: Benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate TBE: Tris-borate-EDTA
TFA: trifluoroacetic acid THF: tetrahydrofuran The invention is illustrated by the following non-limiting examples.

（実施例）
トリエチルアミン、トリフルオロ酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、二硫化炭素、テトラデシルアミン、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート、４−ジメチルアミノピリジン、又はジイソプロピルエチルアミンなどの慣用試薬及び触媒は、市販のものを入手した。 (Example)
Triethylamine, trifluoroacetic acid, p-toluenesulfonic acid, benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), carbon disulfide, tetradecylamine, di-tert-butyldicar Commercially available reagents and catalysts such as bonate, 4-dimethylaminopyridine, or diisopropylethylamine were obtained.

プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ３００、４００及び６００ＭＨｚ分光計で記録した。化学的変化はｐｐｍ（ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ、百万分量単位中の絶対数）で表わし、重複する用語は慣用略語で表わした。 Proton nuclear magnetic resonance ( 1 H NMR) spectra were recorded on a Bruker 300, 400 and 600 MHz spectrometer. Chemical changes are expressed in ppm (parts per million, absolute number in parts per million) and overlapping terms are expressed in conventional abbreviations.

下記の文中で、使用した核酸は、サイトメガロウイルスＣＭＶ Ｅ／Ｐプロモーターの制御下のルシフェラーゼをコードするｌｕｃ遺伝子を含む、出版物「遺伝子治療（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）」（１９９９），１４８２−１４８８ページに述べられているプラスミドｐＸＬ３０３１であった。このプラスミドは図７に示されている。その大きさは３６７１塩基対である。使用したプラスミド溶液は、注射用に水中で１．２６２ｇ／ｌに希釈した。   In the text below, the nucleic acid used includes the luc gene encoding luciferase under the control of the cytomegalovirus CMV E / P promoter, in the publication “Gene Therapy” (1999), pages 1422-1488. It was the plasmid pXL3031 described. This plasmid is shown in FIG. Its size is 3671 base pairs. The plasmid solution used was diluted to 1.262 g / l in water for injection.

ＤＴ−３ＴＵの合成
ここではＤＴＴＵ又はＤＴ−３ＴＵと称する、３−（２−｛３−［２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチル｝チオウレイド）エチル］チオウレイド｝エチル）−１−メチルチオ尿素は、一般式（Ｉ）［式中、Ｘ＝−ＣＨ３；ｍ＝２；Ｒ＝Ｈ；ｎ＝３；ｌ＝０；Ｙ＝ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２；及びＬ＝−Ｎ（Ｒ１）Ｒ２又はＲ１＝Ｒ２＝Ｃ１４Ｈ２９］に対応する。 Synthesis of DT-3TU 3- (2- {3- [2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] ethyl} thioureido) ethyl], referred to herein as DTTU or DT-3TU Thioureido} ethyl) -1-methylthiourea has the general formula (I) [wherein X = —CH 3 ; m = 2; R = H; n = 3; l = 0; Y = NH—CO—CH 2. -CH 2; and L = -N (R 1) R 2 or R 1 = R 2 = corresponding to C 14 H 29].

ａ）ジテトラデシルアミド（１）の合成
テトラデカン酸（３０ｇ）１３１．６ｍｍｏｌ及びテトラデシルアミン（３０ｇ）１４０．８ｍｍｏｌを、乾燥剤（Ｐ２Ｏ５）の入った捕集フラスコに接続された磁気攪拌機を備える丸底フラスコ中で混合した。次のその反応混合物を減圧下で（５０ｍｍＨｇ）１７０℃に４時間加熱した。その粗物質をＴＨＦ（７００ｍｌ；可溶化を助けるためにわずかに加熱した）に可溶化し、その後過剰のアミンに結合するために４当量のＡｍｂｅｒｌｙｓｔ−１５樹脂（８ｇ）を加えた。２０分間攪拌したあと、その溶液をろ過し、ろ液を濃縮して白色固体５５．１１ｇを得た（収率：９９％）。 a) Synthesis of ditetradecyl amide (1) 131.6 mmol of tetradecanoic acid (30 g) and 140.8 mmol of tetradecylamine (30 g) were magnetically connected to a collection flask containing desiccant (P 2 O 5 ). Mix in a round bottom flask equipped with a stirrer. The reaction mixture was then heated to 170 ° C. under reduced pressure (50 mmHg) for 4 hours. The crude material was solubilized in THF (700 ml; slightly heated to aid solubilization) and then 4 equivalents of Amberlyst-15 resin (8 g) was added to bind to excess amine. After stirring for 20 minutes, the solution was filtered, and the filtrate was concentrated to obtain 55.11 g of a white solid (yield: 99%).

Figure 0004276439
Figure 0004276439

ｂ）ジテトラデシルアミン（２）の合成
ジテトラデシルアミド（２０ｇ）４７ｍｍｍｏｌを、冷却機と乾燥管を備えた丸底フラスコ中で、窒素下に、無水ＴＨＦ７００ｍｌに溶解した。その混合物を０℃に冷却し、その後水素化アルミニウムリチウムＬｉＡｌＨ４（３．４ｇ）８９ｍｍｏｌを加えた。添加後、その混合物を、強く攪拌しながら還流下で５時間加熱した。ひとたび反応が完了すれば、水３．４ｍｌ、１Ｎ水酸化ナトリウム６．８ｍｌ及び水３．４ｍｌを連続的に加えることによって加水分解を実施するために、前記混合物を０℃に冷却した。室温で１時間攪拌した後、粗反応物質をブフナー漏斗でろ過し、ろ液を濃縮した。得られた生成物を、次に、攪拌しながら３０分間、ＴＨＦ３００ｍｌ中１．５当量のＡ−１５樹脂（１５ｇ）で精製した。その樹脂をろ過し、ＴＨＦ３００ｍｌに再溶解して、２当量のトリエチルアミン（１９．２ｍｌ）を加えた。３０分間攪拌したあと、その溶液をろ過し、ろ液を濃縮して、白色固体１７．７２ｇを得た（収率：９２％）。 b) Synthesis of ditetradecylamine (2) 47 mmol of ditetradecylamide (20 g) was dissolved in 700 ml of anhydrous THF under nitrogen in a round bottom flask equipped with a cooler and a drying tube. The mixture was cooled to 0 ° C., after which 89 mmol of lithium aluminum hydride LiAlH 4 (3.4 g) was added. After the addition, the mixture was heated under reflux for 5 hours with vigorous stirring. Once the reaction was complete, the mixture was cooled to 0 ° C. in order to carry out the hydrolysis by successively adding 3.4 ml water, 6.8 ml 1N sodium hydroxide and 3.4 ml water. After stirring at room temperature for 1 hour, the crude reaction material was filtered through a Buchner funnel and the filtrate was concentrated. The resulting product was then purified with 1.5 equivalents of A-15 resin (15 g) in 300 ml of THF for 30 minutes with stirring. The resin was filtered, redissolved in 300 ml of THF and 2 equivalents of triethylamine (19.2 ml) was added. After stirring for 30 minutes, the solution was filtered, and the filtrate was concentrated to obtain 17.72 g of a white solid (yield: 92%).

Figure 0004276439
Figure 0004276439

ｃ）Ｎ，Ｎ−ジテトラデシルスクシンアミド酸（３）の合成
無水コハク酸（１．２６６ｇ）１２．６５ｍｍｏｌ、４−ジメチルアミノピリジン（１．５４６ｇ）１２．６５ｍｍｏｌ及びジテトラデシルアミン（４．４０７ｇ）１０．７５ｍｍｏｌを、丸底フラスコ中のジクロロメタン１２５ｍｌに連続的に添加した。その反応混合物を室温で１８時間攪拌した。ひとたび反応が完了すれば、その混合物をジクロロメタンと塩酸（１Ｎ）で抽出した。次にその有機相をブラインで洗い、硫酸マグネシウムで乾燥して、ろ過し、濃縮して、生成物（３）４．２１ｇを得た（収率：６６％）。 c) Synthesis of N, N-ditetradecylsuccinamic acid (3) 12.65 mmol of succinic anhydride (1.266 g), 12.65 mmol of 4-dimethylaminopyridine (1.546 g) and ditetradecylamine (4 .407 g) 10.75 mmol was added continuously to 125 ml dichloromethane in a round bottom flask. The reaction mixture was stirred at room temperature for 18 hours. Once the reaction was complete, the mixture was extracted with dichloromethane and hydrochloric acid (1N). The organic phase was then washed with brine, dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated to give 4.21 g of product (3) (yield: 66%).

Figure 0004276439
Figure 0004276439

ｄ）２−アミノエチルカルバミン酸のｔｅｒｔ−ブチルエステル（４）の合成
ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（４ｇ）１８．６ｍｍｏｌを、窒素下で、クロロホルム（２０ｍｌ）中のエチレンジアミン（６．１７ｇ）１０２．８３ｍｍｏｌの溶液に滴下した。次にその反応混合物を室温で１８時間攪拌した。ひとたび反応が完了すれば、その溶液を濃縮した。生じた油をジクロロメタンに溶解し、飽和炭酸ナトリウム水溶液で洗った。次のその有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過して、濃縮した。その粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール９：１）によって精製し、生成物（４）２．３８ｇを得た（収率：８０％）。 d) Synthesis of tert-butyl ester (4) of 2-aminoethylcarbamic acid 18.6 mmol of di-tert-butyl dicarbonate (4 g) under nitrogen with ethylenediamine (6.17 g) 102 in chloroform (20 ml) Added dropwise to .83 mmol solution. The reaction mixture was then stirred at room temperature for 18 hours. Once the reaction was complete, the solution was concentrated. The resulting oil was dissolved in dichloromethane and washed with saturated aqueous sodium carbonate. The next organic phase was dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated. The crude product was purified by flash chromatography (dichloromethane / methanol 9: 1) to give 2.38 g of product (4) (yield: 80%).

Figure 0004276439
Figure 0004276439

ｅ）２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチルカルバミン酸のｔｅｒｔ−ブチルエステル（５）の合成
ＰｙＢＯＰ（４．６０１ｇ）８．８４ｍｍｏｌ、前の段階で得たアミン（４）（１．５５８ｇ）９．７２ｍｍｏｌ及びジイソプロピルエチルアミン（４．２４ｍｌ）２４．３１ｍｍｏｌを、ジクロロメタン８８ｍｌ中の上記で得た酸（３）（４．５ｇ）８．８４ｍｍｏｌの溶液に連続的に添加した。次にその溶液を室温で４時間攪拌した。反応終了時に、その反応混合物をろ過し、その生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン／酢酸エチル５：５及びその後ヘプタン／酢酸エチル２：８）によって精製した。このようにして該エステル（５）３．７９ｇを得た（収率：６６％）。 e) Synthesis of tert-butyl ester of 2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] ethylcarbamic acid (5) PyBOP (4.601 g) 8.84 mmol, amine (4) obtained in the previous step (4) 1.558 g) 9.72 mmol and diisopropylethylamine (4.24 ml) 24.31 mmol were added sequentially to a solution of the above obtained acid (3) (4.5 g) in 8.84 mmol in 88 ml of dichloromethane. The solution was then stirred at room temperature for 4 hours. At the end of the reaction, the reaction mixture was filtered and the product was purified by flash chromatography (heptane / ethyl acetate 5: 5 and then heptane / ethyl acetate 2: 8). In this way, 3.79 g of the ester (5) was obtained (yield: 66%).

Figure 0004276439
Figure 0004276439
Figure 0004276439
Figure 0004276439

ｆ）２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチルアミン（６）の合成
蒸留したＴＦＡ（０．９４ｍｌ）１２．２ｍｍｏｌを、前の段階で得たエステル（５）（１．５９ｇ）２．４４ｍｌに加えた。２時間後、反応が完了した。その生成物を、低温状態で回転蒸発器においてシクロヘキサンと共に２回同時蒸発させた。その収率は定量的であった。 f) Synthesis of 2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] ethylamine (6) 12.2 mmol of distilled TFA (0.94 ml) was obtained from the ester (5) (1.59 g) obtained in the previous step. Added to 2.44 ml. After 2 hours, the reaction was complete. The product was co-evaporated twice with cyclohexane in a rotary evaporator at low temperature. The yield was quantitative.

Figure 0004276439
Figure 0004276439

ｇ）（（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）アミノ）エチルイソチオシアネート（７）の合成
ＤＣＣ（９．０１５ｇ）４３．６９ｍｍｏｌ、ＴＨＦ２７．５ｍｌ中の二硫化炭素（１７．９ｍｌ）２９７．９ｍｍｏｌを連続的に丸底フラスコに加えた。その混合物を氷と塩化アンモニウムＮＨ４Ｃｌ（４／１）の浴で−７℃に冷却した。次に、無水ＴＨＦ２０．５ｍｌに溶解した、上記で得たアミン（４）（７ｇ）４３．６９ｍｍｏｌを３０分間かけて滴下した。その混合物を室温に戻し、その混合物を２１時間攪拌し続けた。蒸発後、ジエチルエーテルを加え、形成されたジシクロヘキシル尿素を沈殿させた。その溶液をろ過し、ろ液を濃縮して、その後フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン／酢酸エチル８０：２０）によって精製し、所望生成物（７）６．３５７ｇを得た（収率：７２％）。 g) Synthesis of ((1,1-dimethylethoxycarbonyl) amino) ethyl isothiocyanate (7) 43.69 mmol of DCC (9.05 g), 297.9 mmol of carbon disulfide (17.9 ml) in 27.5 ml of THF continuously Was added to a round bottom flask. The mixture was cooled to −7 ° C. with a bath of ice and ammonium chloride NH 4 Cl (4/1). Next, 43.69 mmol of the amine (4) (7 g) obtained above dissolved in 20.5 ml of anhydrous THF was added dropwise over 30 minutes. The mixture was allowed to return to room temperature and the mixture was kept stirring for 21 hours. After evaporation, diethyl ether was added to precipitate the formed dicyclohexylurea. The solution was filtered and the filtrate was concentrated and then purified by flash chromatography (heptane / ethyl acetate 80:20) to give 6.357 g of desired product (7) (yield: 72%).

Figure 0004276439
Figure 0004276439

ｈ）２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチル｝チオウレイド）エチルカルバミン酸のｔｅｒｔ−ブチルエステル（８）の合成
トリエチルアミン（１．３６ｍｌ）９．７６ｍｍｏｌを上記で得たアミン（６）（１．６２ｇ）２．４４ｍｍｏｌに直接加え、その混合物を１５分間攪拌し続けた。その後、ジクロロメタン２４．４ｍｌ及び前の段階で得たイソチオシアネート（７）（０．５９ｇ）２．９２ｍｍｏｌを加えた。その反応混合物を室温で１２時間攪拌した。次にその混合物を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン６：４及びその後酢酸エチル１００％）によって精製した。このようにして所望エステル（８）１．３４３ｇを得た（収率：７３％）。 h) Synthesis of tert-butyl ester (8) of 2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] ethyl} thioureido) ethylcarbamic acid 9.76 mmol of triethylamine (1.36 ml) above Was directly added to 2.44 mmol of the amine (6) obtained in (1.62 g) and the mixture was kept stirring for 15 minutes. Thereafter, 24.4 ml of dichloromethane and 2.92 mmol of isothiocyanate (7) (0.59 g) obtained in the previous step were added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 hours. The mixture was then evaporated and purified by flash chromatography (ethyl acetate / heptane 6: 4 and then ethyl acetate 100%). Thus, 1.343 g of the desired ester (8) was obtained (yield: 73%).

Figure 0004276439
Figure 0004276439

ｉ）２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチル｝チオウレイド）エチルアミン（９）の合成
蒸留したＴＦＡ（０．７６ｍｌ）９．８６ｍｍｏｌを前の段階で得た生成物（８）（１．５ｇ）１．９８ｍｍｏｌに加えた。３時間後、反応が完了した。その生成物を、低温状態で回転蒸発器を用いてシクロヘキサンと共に２回同時蒸発させた。その収率は定量的であった。 i) Synthesis of 2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] ethyl} thioureido) ethylamine (9) Distilled TFA (0.76 ml) 9.86 mmol was obtained in the previous step. Product (8) (1.5 g) was added to 1.98 mmol. After 3 hours, the reaction was complete. The product was co-evaporated twice with cyclohexane using a rotary evaporator at low temperature. The yield was quantitative.

Figure 0004276439
Figure 0004276439

ｊ）２−｛３−［２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチル｝−チオウレイド）エチル］チオウレイド｝エチルカルバミン酸のｔｅｒｔ−ブチルエステル（１０）の合成
トリエチルアミン（１．１ｍｌ）７．９２ｍｍｏｌを前の段階で得たアミン（９）（１．４７ｇ）１．９８ｍｍｏｌに直接加え、その混合物を１５分間攪拌し続けた。その後、ジクロロメタン１９．８ｍｌ及び上記で得たイソチオシアネート（７）（０．４６１ｇ）２．３８ｍｍｏｌを加え、攪拌しながら室温で１２時間反応を進行させた。次にその混合物を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン６：４及びその後酢酸エチル／メタノール９８：２）によって精製した。このようにして所望生成物（１０）１．１３６ｇを得た（収率：６７％）。 j) Synthesis of tert-butyl ester (10) of 2- {3- [2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] ethyl} -thioureido) ethyl] thioureido} ethylcarbamic acid 7.92 mmol of triethylamine (1.1 ml) was added directly to 1.98 mmol of amine (9) (1.47 g) obtained in the previous step and the mixture was kept stirring for 15 minutes. Thereafter, 19.8 ml of dichloromethane and 2.38 mmol of the isothiocyanate (7) (0.461 g) obtained above were added, and the reaction was allowed to proceed at room temperature for 12 hours while stirring. The mixture was then evaporated and purified by flash chromatography (ethyl acetate / heptane 6: 4 and then ethyl acetate / methanol 98: 2). In this way, 1.136 g of the desired product (10) was obtained (yield: 67%).

Figure 0004276439
Figure 0004276439

ｋ）２−｛３−［２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチル｝チオウレイド）エチル］チオウレイド｝エチルアミン（１１）の合成
蒸留したＴＦＡ（０．４５ｍｌ）５．８４ｍｍｏｌを前の段階で得た生成物（１０）（１ｇ）１．１５ｍｍｏｌに加えた。３時間後、反応が完了した。その生成物を、低温状態で回転蒸発器においてシクロヘキサンと共に２回同時蒸発させた。その収率は定量的であった。 k) Synthesis of 2- {3- [2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] ethyl} thioureido) ethyl] thioureido} ethylamine (11) Distilled TFA (0.45 ml) 5.84 mmol was added to 1.15 mmol of product (10) (1 g) obtained in the previous step. After 3 hours, the reaction was complete. The product was co-evaporated twice with cyclohexane in a rotary evaporator at low temperature. The yield was quantitative.

Figure 0004276439
Figure 0004276439

ｌ）ＤＴ−３ＴＵ（１２）の合成
トリエチルアミン（０．１６ｍｌ）１．１２ｍｍｏｌを前の段階で得たアミン（１１）（０．２４ｇ）０．２８ｍｍｏｌに直接加え、その混合物を１５分間攪拌し続けた。その後、ジクロロメタン２．８ｍｌ及びメチルイソチオシアネート（０．０２４ｇ）０．３４ｍｍｏｌを加え、攪拌しながら室温で１２時間反応を進行させた。次にその混合物を蒸発させ、次の勾配：最初は水／メタノール９５：５混合物からメタノール１００％までで、Ｃ４カラムでのＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって精製した。得られた生成物を小さなシリカカラム（酢酸エチル／ヘプタン８０：２０及びその後酢酸エチル１００％）で再び精製した。このようにしてＤＴＴＵ １１８ｍｇを得た（収率：５１％）。 l) Synthesis of DT-3TU (12) 1.12 mmol of triethylamine (0.16 ml) was added directly to 0.28 mmol of amine (11) (0.24 g) obtained in the previous step and the mixture was kept stirring for 15 minutes It was. Thereafter, 2.8 ml of dichloromethane and 0.34 mmol of methyl isothiocyanate (0.024 g) were added, and the reaction was allowed to proceed for 12 hours at room temperature with stirring. Then the mixture is evaporated down, the following gradient: first water / methanol 95: in 5 mixture to 100% methanol, and purified by HPLC (High Performance Liquid Chromatography) on C 4 column. The resulting product was purified again on a small silica column (ethyl acetate / heptane 80:20 and then ethyl acetate 100%). In this way, 118 mg of DTTU was obtained (yield: 51%).

Figure 0004276439
Figure 0004276439

ＤＴ−４ＴＵの合成
３−（２−｛３−［２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［ジテトラデシルカルバモイル］プロピオニルアミノ｝−エチル）−チオウレイド］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−１−メチルチオ尿素又はＤＴ−４ＴＵは、一般式（Ｉ）［式中、Ｘ＝−ＣＨ３；ｍ＝２；Ｒ＝Ｈ；ｎ＝４；及びｌ＝０；Ｙ＝ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２；及びＬ＝−Ｎ（Ｒ１）Ｒ２［式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｃ１４Ｈ２９］］に一致する。 Synthesis of DT-4TU 3- (2- {3- [2- (3- {2- [3- (2- {3- [ditetradecylcarbamoyl] propionylamino} -ethyl) -thioureido] -ethyl}- Thioureido) -ethyl] -thioureido} -ethyl) -1-methylthiourea or DT-4TU is represented by the general formula (I) [wherein X = —CH 3 ; m = 2; R = H; n = 4; l = 0; Y = NH—CO—CH 2 —CH 2 ; and L = —N (R 1 ) R 2 [wherein R 1 = R 2 = C 14 H 29 ]].

ＤＴ−４ＴＵの合成のために、アミン（１１）を出発物質として使用した。   For the synthesis of DT-4TU, amine (11) was used as starting material.

ａ）２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［２−（３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−チオウレイド］−エチル｝−チオウレイド）−エチルカルバミン酸のｔｅｒｔ−ブチルエステル（１３）の合成   a) 2- (3- {2- [3- (2- {3- [2- (3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino) -ethyl] -thioureido} -ethyl) -thioureido] -ethyl}- Synthesis of tert-butyl ester of thioureido) -ethylcarbamic acid (13)

Figure 0004276439
トリエチルアミン（０．６４３ｍｌ、４．６ｍｍｏｌ）を前記アミン（１１）（０．８ｇ、０．９２ｍｍｏｌ）に加え、その混合物を１５分間攪拌し続けた。次に、ＣＨ２Ｃｌ２（９．２ｍｌ）をその混合物に加え、次いでイソチオネート（７）（０．２２４ｇ、１．１０４ｍｍｏｌ）を加えて、その反応混合物を攪拌下に室温で２０時間反応させた。その後、その混合物を蒸発させ、カラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン８：２、次いで酢酸エチル／メタノール９０：１０）で精製して、所望生成物２５２ｍｇを得た（収率４６％）。
Figure 0004276439
 Triethylamine (0.643 ml, 4.6 mmol) was added to the amine (11) (0.8 g, 0.92 mmol) and the mixture continued to stir for 15 minutes. Then CH 2 Cl 2 (9.2 ml) was added to the mixture, followed by isothionate (7) (0.224 g, 1.104 mmol) and the reaction mixture was allowed to react at room temperature for 20 hours with stirring. . The mixture was then evaporated and purified by column chromatography (ethyl acetate / heptane 8: 2, then ethyl acetate / methanol 90:10) to give 252 mg of the desired product (46% yield).

Figure 0004276439
Figure 0004276439
Figure 0004276439
Figure 0004276439

ｂ）２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［２−（３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−チオウレイド］−エチル｝−チオウレイド）−エチルアミン（１４）の合成   b) 2- (3- {2- [3- (2- {3- [2- (3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino) -ethyl] -thioureido} -ethyl) -thioureido] -ethyl}- Synthesis of thioureido) -ethylamine (14)

Figure 0004276439
蒸留したＴＦＡ（０．１４２ｍｌ、１．８４ｍｍｏｌ）を前の段階で得たアミンｂｏｃ（１３）（０．２２ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）に加えた。６時間後、反応が完了した。その生成物を、低温状態で回転蒸発器を用いてシクロヘキサンと共に２回同時蒸発させた。その生成物を一晩デシケーター内で水酸化ナトリウム上に置いた。その収率は定量的であった。
Figure 0004276439
 Distilled TFA (0.142 ml, 1.84 mmol) was added to the amine boc (13) (0.22 g, 0.23 mmol) obtained in the previous step. After 6 hours, the reaction was complete. The product was co-evaporated twice with cyclohexane using a rotary evaporator at low temperature. The product was placed on sodium hydroxide in a desiccator overnight. The yield was quantitative.

Figure 0004276439
Figure 0004276439

ｃ）３−（２−｛３−［２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［ジテトラデシルカルバモイル］プロピオニルアミノ｝−エチル）−チオウレイド］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−１−メチルチオ尿素（ＤＴ−４ＴＵ）（１５）の合成   c) 3- (2- {3- [2- (3- {2- [3- (2- {3- [ditetradecylcarbamoyl] propionylamino} -ethyl) -thioureido] -ethyl} -thioureido)- Ethyl] -thioureido} -ethyl) -1-methylthiourea (DT-4TU) (15)

Figure 0004276439
トリエチルアミン（１．３８ｍｍｏｌ、０．１９ｍｌ）を前の段階で得たアミン（１４）（０．２３ｍｍｏｌ、０．２２４ｇ）に直接加え、その反応混合物を１５分間攪拌し続けた。その後、ＣＨ２Ｃｌ２（２．３ｍｌ）及びメチルイソチオシアネート（０．４６ｍｍｏｌ、０．０３４ｇ）を加え、その反応混合物を攪拌下に室温で１２時間放置した。次にその混合物を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（１００％酢酸エチル、次いで酢酸エチル／メタノール９５：５）によって精製した。このようにしてＤＴ−４ＴＵ １０９ｍｇを得た（収率：５１％）。
Figure 0004276439
 Triethylamine (1.38 mmol, 0.19 ml) was added directly to the amine (14) obtained in the previous step (0.23 mmol, 0.224 g) and the reaction mixture continued to stir for 15 minutes. CH 2 Cl 2 (2.3 ml) and methyl isothiocyanate (0.46 mmol, 0.034 g) were then added and the reaction mixture was left under stirring at room temperature for 12 hours. The mixture was then evaporated and purified by flash chromatography (100% ethyl acetate, then ethyl acetate / methanol 95: 5). In this way, 109 mg of DT-4TU was obtained (yield: 51%).

Figure 0004276439
Figure 0004276439

ＤＴ−２ＴＵジオールの合成
ＤＴ−２ＴＵジオール又は［２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−プロパン−１，２−ジオールは、一般式（Ｉ）［式中、 Synthesis of DT-2TU diol DT-2TU diol or [2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] -ethyl} -thioureido) -ethyl] -propane-1,2-diol is General formula (I) [wherein

Figure 0004276439
Figure 0004276439
に従って定義される。
Figure 0004276439
Figure 0004276439
Defined according to

ａ）４−イソチオシアナトメチル−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキサラン（１６）の合成   a) Synthesis of 4-isothiocyanatomethyl-2,2-dimethyl- [1,3] dioxalane (16)

Figure 0004276439
ＤＣＣ（３．１４６ｇ、１５．２５ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（９．６０７５ｍＬ）中の二硫化炭素（６．２５３ｍｌ、１０４．００５ｍｍｏｌ）を連続的に丸底フラスコに加えた。その混合物を、氷／ＮＨ４Ｃｌ（４：１）浴を用いて−７℃に冷却し、無水ＴＨＦ（７．１６７５ｍＬ）に溶解した２，２−ジメチル−１，２−ジオキサラン−４−メタンアミン（２ｇ、１５．２５ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下した。その反応混合物を室温に戻し、２１時間攪拌し続けた。蒸発後、ジエチルエーテルを加えた。その混合物をろ過し、蒸発させて、クロマトグラフィーによって精製した。
Figure 0004276439
 DCC (3.146 g, 15.25 mmol) and carbon disulfide (6.253 ml, 104.005 mmol) in THF (9.6075 mL) were added continuously to the round bottom flask. The mixture was cooled to −7 ° C. using an ice / NH 4 Cl (4: 1) bath and 2,2-dimethyl-1,2-dioxalane-4-methanamine dissolved in anhydrous THF (7.1675 mL). (2 g, 15.25 mmol) was added dropwise over 30 minutes. The reaction mixture was allowed to warm to room temperature and kept stirring for 21 hours. After evaporation, diethyl ether was added. The mixture was filtered, evaporated and purified by chromatography.

Figure 0004276439
Figure 0004276439
Figure 0004276439
Figure 0004276439

ｂ）２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］−エチル｝−チオウレイド）−エチル｝−４−イルメチル−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキサラン（１７）の合成   b) 2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] -ethyl} -thioureido) -ethyl} -4-ylmethyl-2,2-dimethyl- [1,3] dioxalane (17 )

Figure 0004276439
ジイソプロピルエチルアミン（０．９５ｍｍｏｌ、０．１６５ｍｌ）を前の段階で得たアミン（９）（０．１９ｍｍｏｌ、０．１４６ｇ）に直接加え、その反応混合物を１５分間攪拌し続けた。その後、ＣＨ２Ｃｌ２（１．９ｍｌ）及びイソチオシアネート（１６）（０．２０９ｍｍｏｌ、０．０２７ｇ）を加え、その反応混合物を攪拌下に室温で１２時間反応させた。次にその混合物を蒸発させ、１００％水から１００％アセトニトリルまでの勾配で逆相液体クロマトグラフィーＣ８によって精製した。４９％の収率で生成物（１７）を得た。
Figure 0004276439
 Diisopropylethylamine (0.95 mmol, 0.165 ml) was added directly to the amine (9) obtained in the previous step (0.19 mmol, 0.146 g) and the reaction mixture was kept stirring for 15 minutes. CH 2 Cl 2 (1.9 ml) and isothiocyanate (16) (0.209 mmol, 0.027 g) were then added and the reaction mixture was allowed to react at room temperature for 12 hours with stirring. The mixture was then evaporated and purified by reverse phase liquid chromatography C8 with a gradient from 100% water to 100% acetonitrile. The product (17) was obtained with a yield of 49%.

Figure 0004276439
Figure 0004276439
Figure 0004276439
Figure 0004276439

ｃ）［２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−プロパン−１，２−ジオール（ＤＴ−２ＴＵジオール）（１８）の合成   c) [2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] -ethyl} -thioureido) -ethyl] -propane-1,2-diol (DT-2TU diol) (18) Composition

Figure 0004276439
保護されたジオール（１７）（０．０５ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を室温でＨＣｌ １Ｎ／ＴＨＦ（１／１）１ｍＬに溶解し、その反応混合物を１８時間攪拌した。次にその反応混合物をジクロロメタン（２×５ｍｌ）で抽出し、有機相を一緒に混合して、炭酸水素ナトリウムで中和した。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、その後溶媒を蒸発させた。得られた生成物を１００％水から１００％アセトニトリルまでの勾配で逆相液体クロマトグラフィーＣ８によって精製した。４９％の収率で生成物（１８）を得た。
Figure 0004276439
 The protected diol (17) (0.05 g, 0.05 mmol) was dissolved in 1 mL of HCl 1N / THF (1/1) at room temperature and the reaction mixture was stirred for 18 hours. The reaction mixture was then extracted with dichloromethane (2 × 5 ml) and the organic phases were mixed together and neutralized with sodium bicarbonate. The aqueous phase was extracted with dichloromethane. The organic phase was dried over magnesium sulfate and then the solvent was evaporated. The resulting product was purified by reverse phase liquid chromatography C8 with a gradient from 100% water to 100% acetonitrile. The product (18) was obtained with a yield of 49%.

Figure 0004276439
Figure 0004276439

ＤＴ−３ＴＵジオールの合成
ＤＴ−３ＴＵジオールの合成のために、アミン（１１）を出発物質として使用した。 Synthesis of DT-3TU diol For the synthesis of DT-3TU diol, amine (11) was used as starting material.

ＤＴ−３ＴＵジオール又は｛３−［２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［２−（３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−チオウレイド］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−プロパン−１，２−ジオールの合成は、一般式（Ｉ）［式中、   DT-3TU diol or {3- [2- (3- {2- [3- (2- {3- [2- (3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino) -ethyl] -thioureido} -ethyl) -Thioureido] -ethyl} -thioureido) -ethyl] -propane-1,2-diol was synthesized according to the general formula (I) [wherein

Figure 0004276439
Figure 0004276439
に従う。
Figure 0004276439
Figure 0004276439
Follow.

ａ）２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［２−（３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−チオウレイド］エチル｝−チオウレイド）−エチル−４−イルメチル−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキサラン（１９）の合成   a) 2- (3- {2- [3- (2- {3- [2- (3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino) -ethyl] -thioureido} -ethyl) -thioureido] ethyl} -thioureido ) -Ethyl-4-ylmethyl-2,2-dimethyl- [1,3] dioxalane (19)

Figure 0004276439
ジイソプロピルエチルアミン（０．９５ｍｍｏｌ、０．１６５ｍｌ）を前の段階で得たアミン（１１）（０．１９ｍｍｏｌ、０．１６５ｇ）に直接加え、その反応混合物を１５分間攪拌し続けた。その後、ＣＨ２Ｃｌ２（１．９ｍｌ）及びイソチオシアネート（１６）（０．２０９ｍｍｏｌ、０．０２７ｇ）を加え、その反応混合物を攪拌下に室温で１２時間反応させた。次にその混合物を蒸発させ、１００％水から１００％アセトニトリルまでの勾配で逆相液体クロマトグラフィーＣ８によって精製した。４９％の収率で生成物（１９）を得た。
Figure 0004276439
 Diisopropylethylamine (0.95 mmol, 0.165 ml) was added directly to the amine (11) obtained in the previous step (0.19 mmol, 0.165 g) and the reaction mixture continued to stir for 15 minutes. CH 2 Cl 2 (1.9 ml) and isothiocyanate (16) (0.209 mmol, 0.027 g) were then added and the reaction mixture was allowed to react at room temperature for 12 hours with stirring. The mixture was then evaporated and purified by reverse phase liquid chromatography C8 with a gradient from 100% water to 100% acetonitrile. The product (19) was obtained with a yield of 49%.

Figure 0004276439
Figure 0004276439
Figure 0004276439
Figure 0004276439

ｂ）｛３−［２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［２−（３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−チオウレイド］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−プロパン−１，２−ジオール（ＤＴ−３ＴＵジオール）（２０）の合成   b) {3- [2- (3- {2- [3- (2- {3- [2- (3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino) -ethyl] -thioureido} -ethyl) -thioureido] -Ethyl} -thioureido) -ethyl] -propane-1,2-diol (DT-3TU diol) (20)

Figure 0004276439
保護されたジオール（１９）（０．０５ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を室温でＨＣｌ １Ｎ／ＴＨＦ（１／１）１ｍＬに溶解し、その反応混合物を１８時間攪拌した。次にその反応混合物をジクロロメタン（２×５ｍｌ）で抽出し、有機相を一緒に混合して、炭酸水素ナトリウムで中和した。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、その後溶媒を蒸発させた。得られた生成物を１００％水から１００％アセトニトリルまでの勾配で逆相液体クロマトグラフィーＣ８によって精製した。５５％の収率で生成物（１８）を得た。
Figure 0004276439
 The protected diol (19) (0.05 g, 0.05 mmol) was dissolved in 1 mL HCl 1N / THF (1/1) at room temperature and the reaction mixture was stirred for 18 hours. The reaction mixture was then extracted with dichloromethane (2 × 5 ml) and the organic phases were mixed together and neutralized with sodium bicarbonate. The aqueous phase was extracted with dichloromethane. The organic phase was dried over magnesium sulfate and then the solvent was evaporated. The resulting product was purified by reverse phase liquid chromatography C8 with a gradient from 100% water to 100% acetonitrile. The product (18) was obtained with a yield of 55%.

Figure 0004276439
Figure 0004276439

ＤＴ−３ＴＵの存在下での核酸の緊密化
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が核酸と結合する能力を示すことである。 Consolidation of nucleic acids in the presence of DT-3TU The purpose of this example is to show the ability of the transfection compounds according to the invention to bind to nucleic acids.

これは臭化エチジウムによる蛍光試験によって容易に明らかにすることができる：蛍光が存在しないことは遊離核酸が存在しないことを示唆し、それは核酸がトランスフェクション化合物によって緊密化されたことを意味する。   This can be readily revealed by fluorescence studies with ethidium bromide: the absence of fluorescence suggests that no free nucleic acid is present, which means that the nucleic acid has been intimated by the transfection compound.

該核酸を、核酸の溶液中での様々な力価の脂質溶液の等容量混合によって、漸増量のＤＴ−３ＴＵ（１２）と接触させた。０．０１μｇ／ｍｌの濃度の核酸複合体８００μｌの試料を、漸増量のＤＴ−３ＴＵ（１２）を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中で調製した。   The nucleic acid was contacted with increasing amounts of DT-3TU (12) by equal volume mixing of lipid solutions of various titers in the nucleic acid solution. A sample of 800 μl of nucleic acid complex at a concentration of 0.01 μg / ml was prepared in a 150 mM sodium chloride solution containing increasing amounts of DT-3TU (12).

同様に、該核酸を、核酸の溶液中での様々な力価の脂質溶液の等容量混合によって、漸増量のＥＰＣ（図１参照）又はＤＰＰＣ（図２参照）と接触させることにより、対照を調製した。このようにして、０．０１μｇ／ｍｌの濃度の核酸複合体８００μｌの試料を、漸増量のＥＰＣ又はＤＰＰＣを含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中で調製した（それぞれ図１及び図２）。   Similarly, a control can be obtained by contacting the nucleic acid with increasing amounts of EPC (see FIG. 1) or DPPC (see FIG. 2) by equal volume mixing of lipid solutions of various titers in the solution of nucleic acid. Prepared. In this way, a sample of 800 μl of nucleic acid complex at a concentration of 0.01 μg / ml was prepared in a 150 mM sodium chloride solution containing increasing amounts of EPC or DPPC (FIGS. 1 and 2, respectively).

臭化エチジウム蛍光を、それぞれ２６０ｎｍと５９０ｎｍの励起及び発光波長でＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ−Ｓｐｅｘ）を使用して経時的に測定した（２０℃で測定）。励起と発光のためのスリット幅は５ｎｍに設定した。ＤＮＡ／脂質溶液（０．０１ｍｇＤＮＡ／ｍｌ）１ｍｌにつき臭化エチジウム（１ｇ／ｌ）３μｌを加えた後、蛍光値を記録した。   Ethidium bromide fluorescence was measured over time using FluoroMax-2 (Jobin Yvon-Spex) at excitation and emission wavelengths of 260 nm and 590 nm, respectively (measured at 20 ° C.). The slit width for excitation and emission was set to 5 nm. After adding 3 μl of ethidium bromide (1 g / l) per ml of DNA / lipid solution (0.01 mg DNA / ml), fluorescence values were recorded.

その結果を図１及び２に要約した。   The results are summarized in FIGS.

図１において、四角記号の曲線は、固定量の核酸（８μｇ）に対する漸増量のＤＴ−３ＴＵ／ＥＰＣ脂質混合物（０．７５ｎｍｏｌから２０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ）の添加が、ＤＮＡの塩基対の間への臭化エチジウムの挿入の低下に結びつく蛍光の低下を誘導することを示している。これは、ＤＴ−３ＴＵ／ＥＰＣリポソームとＤＮＡの間の結びつきが、その複合体から臭化エチジウムを排除するのに十分なほど強かったことを示唆する。我々はそれ故、９０％までの蛍光の排除を得ることができ、これは９０％のＤＮＡ−ＤＴ−３ＴＵ／ＥＰＣ脂質結合であった。この脂質／ＤＮＡ結合におけるＤＴ−３ＴＵ脂質の積極的な役割を示すため、対照を調製した。それは、ＥＰＣ脂質とＤＮＡの間の相互作用を観察することであり、ダイアモンド形記号の曲線で表わしている。ＥＰＣを、ＤＴ−３ＴＵ／ＥＰＣ−ＤＮＡ複合体の試験で使用したのと同じ条件下でＤＮＡに接触させたとき、蛍光の弱い低下だけが認められ（約５％）、これは混合物の混濁度の上昇によるものと考えられる。この対照は、それ故、上述した実験条件下でＥＰＣ単独とＤＮＡの結合が存在しないことを反映している。   In FIG. 1, the square curve shows that the addition of increasing amounts of DT-3TU / EPC lipid mixture (0.75 nmol to 20 nmol DT-3TU) to a fixed amount of nucleic acid (8 μg) is between DNA base pairs. It has been shown to induce a decrease in fluorescence that leads to a decrease in ethidium bromide insertion. This suggests that the association between DT-3TU / EPC liposomes and DNA was strong enough to eliminate ethidium bromide from the complex. We could therefore obtain up to 90% fluorescence exclusion, which was 90% DNA-DT-3TU / EPC lipid binding. Controls were prepared to show the positive role of DT-3TU lipids in this lipid / DNA binding. It is to observe the interaction between EPC lipids and DNA and is represented by the curve with diamond symbol. When EPC was contacted with DNA under the same conditions used for testing the DT-3TU / EPC-DNA complex, only a weak decrease in fluorescence was observed (about 5%), which is the turbidity of the mixture This is thought to be due to the rise in This control therefore reflects the absence of EPC alone and DNA binding under the experimental conditions described above.

この実施例は、それ故、核酸に結合するＤＴ−３ＴＵ脂質の能力を示している。   This example therefore demonstrates the ability of DT-3TU lipids to bind to nucleic acids.

同様に、図２において、四角記号の曲線は、同一量の臭化エチジウムを様々な試料に加えたとき、固定量の核酸（８μｇ）に対する漸増量のＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ脂質混合物（０．７５ｎｍｏｌから２０ｎｍｏｌのＤＴＴＵ）の添加が蛍光の低下を誘導することを示している。これは、ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣリポソームとＤＮＡの間の結びつきが、その複合体から臭化エチジウムを排除するのに十分なほど強かったことを示唆する。我々はそれ故、９０％のＤＮＡ−ＤＴＴＵ／ＤＰＰＣ結合に当たる、９０％までの蛍光の排除を得ることができた。この脂質／ＤＮＡ結合におけるＤＴＴＵ脂質の積極的な役割を示すため、対照を調製した。それは、ＤＰＰＣ脂質とＤＮＡの間の相互作用を観察することであり、ダイアモンド形記号の曲線で表わしている。ＤＰＰＣを、ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ−ＤＮＡ複合体の試験で使用したのと同じ条件下でＤＮＡに接触させたとき、蛍光の弱い低下だけが認められた（約５％）。この対照は、それ故、上述した実験条件下でＤＰＰＣ単独とＤＮＡの結合が存在しないことを反映している。   Similarly, in FIG. 2, the squared curve shows increasing amounts of DT-3TU / DPPC lipid mixture (0.75 nmol) to a fixed amount of nucleic acid (8 μg) when the same amount of ethidium bromide was added to the various samples. To 20 nmol DTTU) is shown to induce a decrease in fluorescence. This suggests that the association between DT-3TU / DPPC liposomes and DNA was strong enough to eliminate ethidium bromide from the complex. We were therefore able to obtain up to 90% exclusion of fluorescence, corresponding to 90% DNA-DTTU / DPPC binding. Controls were prepared to show the positive role of DTTU lipids in this lipid / DNA binding. It is to observe the interaction between DPPC lipids and DNA and is represented by the curve with diamond symbol. When DPPC was contacted with DNA under the same conditions used in testing the DT-3TU / DPPC-DNA complex, only a weak decrease in fluorescence was observed (approximately 5%). This control therefore reflects the absence of binding of DPPC alone and DNA under the experimental conditions described above.

この実施例は、それ故、ＤＴ−３ＴＵ脂質の核酸に結合する能力を例示している。   This example therefore illustrates the ability of DT-3TU lipids to bind to nucleic acids.

ＤＴ−３ＴＵ／ＥＰＣ複合体によるＤＮＡの緊密化
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が核酸を緊密化する能力を示すことである。 Consolidation of DNA by DT-3TU / EPC complex The purpose of this example is to show the ability of the transfection compounds according to the present invention to consolidate nucleic acids.

これは、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を使用して視覚化したＤＮＡのアガロースゲル上での電気泳動遅延試験によって容易に明らかにしうる：ゲル上の核酸の移動が存在しないことは核酸の緊密化を示唆する。遊離核酸については、ゲル上での遅延を生じなかった。   This can be readily revealed by an electrophoretic delay test of DNA visualized using ethidium bromide (EtBr) on an agarose gel: the absence of nucleic acid migration on the gel reduces nucleic acid compaction. Suggest. For free nucleic acids, no delay on the gel occurred.

ＤＮＡに対して漸増量のＤＴＴＵ脂質を含む様々なＤＮＡ／ＤＴ−３ＴＵ試料をアガロースゲル（１Ｎ ＴＢＥ中０．８％アガロース）上に沈着させた。電気泳動によってＤＮＡを移動させるため、そのゲルを１時間半７０Ｖ及び７０ｍＡの電流に供した。バンドをＥｔＢｒ及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。その結果を図３に示した。   Various DNA / DT-3TU samples containing increasing amounts of DTTU lipid relative to DNA were deposited on an agarose gel (0.8% agarose in 1N TBE). The gel was subjected to a current of 70 V and 70 mA for one and a half hours to move the DNA by electrophoresis. Bands were revealed by absorption under EtBr and UV light. The results are shown in FIG.

ゲルは、ＤＮＡが脂質と結合しなかったときのＤＮＡの電気泳動移動（ウエル１）、及びＤＮＡが脂質と結合したときの保持率の差を示す。ウエル２〜６は、漸増量のＤＴＴＵ／ＥＰＣリポソーム：０．７５、次いで５、次いで１０、次いで１５及び最後に２０ｎｍｏｌのＤＴＴＵ脂質と結合したＤＮＡ（０．０１ｇ／ｌ）を示す。ウエル１と他のウエルとの比較は、ＤＴ−３ＴＵ脂質の量が高いほど、より多くのＤＮＡがゲル上に保持され、複合体の凝集の範囲である３ｎｍｏｌのＤＴＴＵ／μｇＤＮＡからは全面的に遅滞した。ウエル８−１３はそれぞれ、ＤＮＡ単独（０．１ｇ／ｌ、ゲルについて１μｇ）、脂質／ＤＮＡ比：０．７５又は５又は１０又は１５の、０．１ｇ／ｌ ＤＮＡの濃度で形成されるリポプレックス及び最後に２０ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡに対応する。同様に、インビボ実験と適合性であるＤＮＡのこの濃度では、５ｎｍｏｌ脂質／μｇＤＮＡの割合からＤＮＡが緊密化された。   The gel shows the electrophoretic migration of DNA when DNA is not bound to lipid (well 1) and the difference in retention when DNA is bound to lipid. Wells 2-6 show increasing amounts of DTTU / EPC liposomes: 0.75, then 5, then 10, then 15 and finally 20 nmol of DTTU lipid bound DNA (0.01 g / l). The comparison between well 1 and other wells shows that the higher the amount of DT-3TU lipid, the more DNA is retained on the gel and the overall range from 3 nmol DTTU / μg DNA, which is the extent of complex aggregation. I was late. Wells 8-13 were each made of DNA alone (0.1 g / l, 1 μg for gel), lipo / DNA ratio: 0.75 or 5 or 10 or 15 at a concentration of 0.1 g / l DNA. Corresponds to the plex and finally 20 nmol / μg DNA. Similarly, at this concentration of DNA that is compatible with in vivo experiments, DNA was densified from the 5 nmol lipid / μg DNA ratio.

この実施例は、それ故、ＤＴ−３ＴＵ脂質の核酸を緊密化する能力を示している。   This example therefore demonstrates the ability to consolidate DT-3TU lipid nucleic acids.

ＤＴ−３ＴＵ／ＤＮＡ組成物のζ電位の測定
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が、全体的な陰イオン性、中性又は非常に弱い陽イオン性構造を保持しながら核酸を緊密化する能力を示すことである。 Measurement of the zeta potential of a DT-3TU / DNA composition The purpose of this example is to ensure that the transfection compound according to the present invention does not contain nucleic acids while retaining the overall anionic, neutral or very weak cationic structure. It is to show the ability to close.

これは、ζ電位の測定によって明らかにしうる；ｍＶで表わした測定値は、試料の電気泳動移動度に対する粒子の表面電荷を示す。   This can be revealed by measuring the zeta potential; the measurement expressed in mV indicates the surface charge of the particle with respect to the electrophoretic mobility of the sample.

該核酸を、核酸の溶液中での様々な力価の脂質溶液の等容量混合によって、漸増量のＤＴ−３ＴＵ／ＥＰＣ脂質混合物と接触させた。０．０１ｇ／ｌの濃度の核酸複合体２ｍｌの試料を、漸増量のＤＴ−３ＴＵを含む２０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中で調製した。   The nucleic acid was contacted with increasing amounts of DT-3TU / EPC lipid mixture by equal volume mixing of lipid solutions of various titers in the nucleic acid solution. A 2 ml sample of the nucleic acid complex at a concentration of 0.01 g / l was prepared in a 20 mM sodium chloride solution containing increasing amounts of DT-3TU.

ゼータサイズ測定器３０００ Ｈｓａ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いてζ電位（ｍＶ）の測定を実施した。ＤＴ−３ＴＵ／ＥＰＣ−ＤＮＡ試料２ｍｌに関して電位の値を３回連続して測定した。その結果を図４に要約した。   The zeta potential (mV) was measured using a zeta size measuring device 3000 Hsa (Malvern). The potential value was measured three times in succession for 2 ml of the DT-3TU / EPC-DNA sample. The results are summarized in FIG.

ＤＮＡμｇ当り０．７５ｎｍｏｌから２０ｎｍｏｌ脂質の範囲内でＤＴＴＵ／ＥＰＣリポソームをＤＮＡに加えた。脂質量のこの変動範囲内で、ζ電位は−３５ｍＶから＋１５ｍＶまで変動する。負の部分は図１、２及び３に示すものに相当し、すなわちＤＮＡが完全に緊密化されていないときζ電位は負であった。より多くの脂質を加えるほどより多くのＤＮＡが緊密化され、ζ電位はより一層ゼロに近づき、リポプレックスは事実上ゼロの表面電位を示す。その後ζ電位は８ｎｍｏｌ脂質／μｇＤＮＡ付近から正となる。この測定の相対性については、同じ実験の中の様々な試料の比較を考慮に入れるべきである。従って、弱い正の値までの脂質量の増加の関数としてのζ電位の推移に注目することが重要である。   DTTU / EPC liposomes were added to the DNA in the range of 0.75 nmol to 20 nmol lipid per μg DNA. Within this variation range of lipid mass, the zeta potential varies from -35 mV to +15 mV. The negative part corresponds to that shown in FIGS. 1, 2 and 3, ie the ζ potential was negative when the DNA was not fully compacted. As more lipid is added, more DNA is densified, the zeta potential is even closer to zero, and the lipoplex exhibits a virtually zero surface potential. Thereafter, the ζ potential becomes positive from around 8 nmol lipid / μg DNA. The relativity of this measurement should take into account the comparison of various samples within the same experiment. It is therefore important to note the transition of the zeta potential as a function of the increase in lipid content up to a weak positive value.

この実施例は、それ故、本発明によるトランスフェクション化合物、特にＤＴ−３ＴＵによるＤＮＡの緊密化を確認し、形成されるリポプレックスが中性に近い表面電位を示すことを明らかにしている。   This example therefore confirms DNA compaction by the transfection compounds according to the invention, in particular DT-3TU, and reveals that the lipoplexes formed show a near neutral surface potential.

ＤＴ−３ＴＵ／ＤＮＡ組成物のインビトロでのトランスフェクション
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物がインビトロで細胞をトランスフェクトする能力を示すことである。 In vitro transfection of DT-3TU / DNA composition The purpose of this example is to show the ability of the transfection compounds according to the invention to transfect cells in vitro.

この試験は、様々な量のＤＴ−３ＴＵ：１．５又は５又は１０又は１５又は２０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ／μｇＤＮＡを含むリポプレックスについて実施した。これらの条件の各々を、ウシ胎仔血清と共に及びウシ胎仔血清なしで（「＋血清」又は「−血清」）で試験した。   This test was performed on lipoplexes containing various amounts of DT-3TU: 1.5 or 5 or 10 or 15 or 20 nmol DT-3TU / μg DNA. Each of these conditions was tested with and without fetal calf serum ("+ serum" or "-serum").

細胞培養：ヒト頸部上皮の癌から誘導したＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡを、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０単位／ｍｌのペニシリン及び５０単位／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＭＥＭ（「最小必須培地」）型培地の存在下で培養した。培地及び添加物は、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）より入手した。細胞を、インキュベーターにおいて５％二酸化炭素、３７℃で、フラスコ内で培養した。   Cell culture: HeLa cells derived from cancer of human cervical epithelium (American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA with 2 mM L-glutamine, 50 units / ml penicillin and 50 units / ml streptomycin) The medium and additives were obtained from Gibco-BRL Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA) .The cells were 5% carbon dioxide in an incubator. The cells were cultured in a flask at 37 ° C.

トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、ＨｅＬａ細胞を３０，０００〜５０，０００細胞／穴の細胞数で２４０穴プレートに移した。これらの希釈度は、２４時間後に約８０％の集密度を示す。トランスフェクションのために、細胞を２回洗い、血清を含む（１０％ＦＣＳｖ／ｖ）又は血清を含まない培地５００μｌと共に３７℃でインキュベートした。   Transfection: The day before transfection, HeLa cells were transferred to 240-well plates at a cell number of 30,000-50,000 cells / well. These dilutions show about 80% confluence after 24 hours. For transfection, cells were washed twice and incubated at 37 ° C. with 500 μl of medium with serum (10% FCSv / v) or without serum.

プラスミドＤＮＡ０．５μｇを含む複合体５０μｌを各々の穴に加えた（複合体は少なくとも穴に添加する３０分前に調製した）。３７℃で２時間後、血清を含まないプレートに１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（「ウシ胎仔血清」）を補足した。   50 μl of complex containing 0.5 μg of plasmid DNA was added to each well (prepared at least 30 minutes before addition to the well). After 2 hours at 37 ° C., serum-free plates were supplemented with 10% (v / v) FCS (“Fetal Bovine Serum”).

すべてのプレートを３７℃、５％二酸化炭素で２４時間放置した。   All plates were left at 37 ° C., 5% carbon dioxide for 24 hours.

ルシフェラーゼ活性の定量：簡単に述べると、トランスフェクションした細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝液）５００μｌで２回洗い、その後、試薬（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ＳｙｓｔｅｍキットのＰｒｏｍｅｇａ細胞培養溶解試薬）２５０μｌで溶解した。４℃で５分間遠心分離した（１２，０００×ｇ）溶解産物の上清１０μｌのアリコートをＷａｌｌａｃｅ Ｖｉｃｔｏｒ ２ルミノメーター（１４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｃｏｕｎｔｅｒ）で測定した。   Quantification of luciferase activity: Briefly, transfected cells were washed twice with 500 μl of PBS (phosphate buffer) and then lysed with 250 μl of reagent (Promega cell culture lysis reagent from Luciferase Assay System kit). A 10 μl aliquot of the supernatant of the lysate centrifuged for 5 minutes at 4 ° C. (12,000 × g) was measured with a Wallace Victor 2 luminometer (1420 Multilabel counter).

ルシフェラーゼ活性は、ルシフェリン、補酵素Ａ及びＡＴＰの存在下で発光によって１０秒間検定し、２０００処置細胞に関して表わした。次にルシフェラーゼ活性を相対光単位（ＲＬＵ、ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ）で表わし、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡキット（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて得られた試料中のタンパク質濃度に関して基準化した。   Luciferase activity was assayed for 10 seconds by luminescence in the presence of luciferin, coenzyme A and ATP and expressed for 2000 treated cells. The luciferase activity was then expressed in relative light units (RLU) and normalized with respect to protein concentration in the samples obtained using the Pierce BCA kit (Rockford, IL, USA).

図５に要約する結果は、５又は１０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ／μｇＤＮＡを含むリポプレックスについての最適トランスフェクション効率を示している。血清の存在は、すべての場合に、トランスフェクションの弱い阻害を誘導する。   The results summarized in FIG. 5 show the optimal transfection efficiency for lipoplexes containing 5 or 10 nmol DT-3TU / μg DNA. The presence of serum induces weak inhibition of transfection in all cases.

細胞に対するＤＴＴＵ／ＤＮＡリポプレックスの毒性の測定
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物に毒性がないことを示すことである。 Measuring Toxicity of DTTU / DNA Lipoplexes to Cells The purpose of this example is to show that the transfection compounds according to the invention are not toxic.

トランスフェクション後に該タンパク質レベルを測定した。トランスフェクションのプロトコールは実施例８で述べたのと同じであった。   The protein level was measured after transfection. The transfection protocol was the same as described in Example 8.

タンパク質レベルの定量：簡単に述べると、トランスフェクションした細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝液）５００μｌで２回洗い、その後、試薬（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ＳｙｓｔｅｍキットのＰｒｏｍｅｇａ細胞培養溶解試薬）２５０μｌで溶解した。４℃で５分間遠心分離した（１２，０００×ｇ）溶解産物の上清５０μｌのアリコートを、０．１Ｍヨードアセトアミド５０μｌ、ｐＨ８．２の０．１Ｍ塩酸トリスの入った管に移し、３７℃で１時間放置した。前記溶液２０μｌを９６穴プレートに入れ、「ＢＣＡタンパク質アッセイ」試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍｏｎｔｌｕｓｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）２００μｌを加えた。次にプレートを２５００回転／分で遠心分離し、その後３７℃で３０分間インキュベートした。平行して、試料に関して得た吸光度値を試料中に存在するタンパク質の量と相関させるために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）レンジを調製した。   Protein level quantification: Briefly, transfected cells were washed twice with 500 μl PBS (phosphate buffer) and then lysed with 250 μl reagent (Promega cell culture lysis reagent from Luciferase Assay System kit). A 50 μl aliquot of the supernatant of the lysate centrifuged at 4 ° C. for 5 minutes (12,000 × g) was transferred to a tube containing 50 μl of 0.1 M iodoacetamide, 0.1 M Tris hydrochloride pH 8.2, 37 ° C. And left for 1 hour. 20 μl of the solution was placed in a 96-well plate and 200 μl of “BCA protein assay” reagent (Pierce, Montlucon, France) was added. The plates were then centrifuged at 2500 rpm and then incubated at 37 ° C. for 30 minutes. In parallel, a bovine serum albumin (BSA) range was prepared to correlate the absorbance values obtained for the sample with the amount of protein present in the sample.

図６に要約する結果は、０．７５又は５又は１０又は１５又は２０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ／μｇＤＮＡを含むリポプレックスという使用条件に関わりなく、同様のタンパク質レベルを示している。ＤＴＴＵ脂質の存在は、それ故、細胞に有害な影響を及ぼさず、使用した条件下で毒性を認めなかった。   The results summarized in FIG. 6 show similar protein levels regardless of the use conditions of lipoplexes containing 0.75 or 5 or 10 or 15 or 20 nmol DT-3TU / μg DNA. The presence of DTTU lipids therefore did not have a detrimental effect on the cells and was not toxic under the conditions used.

この実施例は、それ故、本発明によるトランスフェクション化合物の重要な利点の１つ、すなわち、おそらくそれらの構造内に正電荷が存在しないことに結びついた非常に低い毒性を示している。   This example therefore demonstrates one of the important advantages of the transfection compounds according to the invention, i.e. very low toxicity, possibly associated with the absence of a positive charge in their structure.

ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣナノ乳剤による核酸の緊密化
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が核酸と結合する能力を示すことである。 Nucleic acid compaction with DT-3TU / DPPC nanoemulsion The purpose of this example is to show the ability of the transfection compounds according to the invention to bind to nucleic acids.

これは、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を使用して視覚化したＤＮＡのアガロースゲル上での電気泳動遅延試験によって容易に明らかにしうる：ゲル上の核酸の移動が存在しないことは核酸の緊密化を示唆する。遊離核酸については、ゲル上での遅延を生じない。   This can be readily revealed by an electrophoretic delay test of DNA visualized using ethidium bromide (EtBr) on an agarose gel: the absence of nucleic acid migration on the gel reduces nucleic acid compaction. Suggest. For free nucleic acids, there is no delay on the gel.

ＤＮＡに対して種々の製剤のＤＴ−３ＴＵ脂質を含む様々なＤＮＡ／ＤＴ−３ＴＵ試料をアガロースゲル（１Ｎ ＴＢＥ中０．８％アガロース）上に置いた。電気泳動によってＤＮＡを移動させるため、そのゲルを１時間半７０Ｖ及び４０ｍＡの電流に供した。バンドをＴＢＥ及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。その結果を図８に示した。   Various DNA / DT-3TU samples containing various formulations of DT-3TU lipid relative to DNA were placed on an agarose gel (0.8% agarose in 1N TBE). The gel was subjected to a current of 70 V and 40 mA for one and a half hours to move the DNA by electrophoresis. Bands were revealed by absorption under TBE and UV light. The results are shown in FIG.

同様に、アガロースゲル（１Ｎ ＴＢＥ中０．８％アガロース）を使用し、その上に、ＤＮＡに対して種々の製剤のＤＴ−３ＴＵジオール脂質を含むＤＮＡ／ＤＴ−３ＴＵジオールの様々な試料を置いて、ＤＴ−３ＴＵジオール化合物がＤＮＡを緊密化する能力を示す。電気泳動によってＤＮＡを移動させるため、ゲルを１時間半７０Ｖ及び４０ｍＡの電流に供した。バンドを臭化エチジウム及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。   Similarly, an agarose gel (0.8% agarose in 1N TBE) is used on which various samples of DNA / DT-3TU diol containing various formulations of DT-3TU diol lipids are placed on DNA. DT-3TU diol compounds show the ability to consolidate DNA. In order to move the DNA by electrophoresis, the gel was subjected to a current of 70 V and 40 mA for 1.5 hours. Bands were revealed by absorption under ethidium bromide and ultraviolet light.

ゲルは、ＤＮＡが脂質と結合しなかったときのＤＮＡの電気泳動移動（ウエル１）、及びＤＮＡが脂質と結合したときの保持率の差を示す。ウエル２〜５は、カルシウム及びエタノールを含む又は含まないＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ（６０ｎｍｏｌＤＴ−３ＴＵ／μｇＤＮＡ）ナノ乳剤と結合したＤＮＡ（０．０１ｇ／ｌ）を示す。ウエル２は、Ｃａ２＋及びエタノールを含まない６０ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡを示す。ウエル３には、２％のＥｔＯＨを加えた。ウエル４では、６０当量のＣａ２＋／ＰＯ− ＤＮＡを加えた。ウエル５には、２％のＥｔＯＨと６０当量のＣａ２＋を加えた。ウエル１と他のウエルとの比較は、検討した種々のＤＴ−３ＴＵ製剤がゲル上のＤＮＡ移動を遅延させることを示唆している。Ｃａ２＋及びＥｔＯＨの透析後、同じ結果を認めた。 The gel shows the electrophoretic migration of DNA when DNA is not bound to lipid (well 1) and the difference in retention when DNA is bound to lipid. Wells 2-5 show DNA (0.01 g / l) bound to DT-3TU / DPPC (60 nmol DT-3TU / μg DNA) nanoemulsion with or without calcium and ethanol. Well 2 shows 60 nmol / μg DNA without Ca 2+ and ethanol. To well 3, 2% EtOH was added. In well 4, 60 equivalents of Ca 2+ / PO − DNA was added. To well 5, 2% EtOH and 60 equivalents of Ca 2+ were added. Comparison of well 1 with other wells suggests that the various DT-3TU formulations studied retarded DNA migration on the gel. The same results were observed after dialysis of Ca 2+ and EtOH.

この実施例は、それ故、種々の製剤に組み込まれたＤＴ−３ＴＵ脂質が核酸を緊密化する能力を示している。   This example therefore demonstrates the ability of DT-3TU lipids incorporated into various formulations to consolidate nucleic acids.

安定化ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ複合体による核酸の緊密化
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が核酸に結合する能力を示すことである。 Nucleic Acid Tightening with Stabilized DT-3TU / DPPC Complex The purpose of this example is to show the ability of transfection compounds according to the present invention to bind to nucleic acids.

これは、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を使用して視覚化したＤＮＡのアガロースゲル上での電気泳動遅延試験によって容易に明らかにしうる：ゲル上の核酸の移動が存在しないことは核酸の緊密化を示唆する。遊離核酸については、ゲル上での遅延を生じない。   This can be readily revealed by an electrophoretic delay test of DNA visualized using ethidium bromide (EtBr) on an agarose gel: the absence of nucleic acid migration on the gel reduces nucleic acid compaction. Suggest. For free nucleic acids, there is no delay on the gel.

コレステロール−ＰＥＧに結合した又は結合していないＤＮＡに対して漸増量のＤＴ−３ＴＵ脂質を含む様々なＤＮＡ／ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ及びＤＮＡ／ＤＴ−３ＴＵジオール／ＤＰＰＣ試料をアガロースゲル（１Ｎ ＴＢＥ中０．８％アガロース）上に置いた。電気泳動によってＤＮＡを移動させるため、そのゲルを１時間半７０Ｖ及び７０ｍＡの電流に供した。バンドを臭化エチジウム及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。その結果を図９に示す。   Various DNA / DT-3TU / DPPC and DNA / DT-3TU diol / DPPC samples containing increasing amounts of DT-3TU lipid relative to cholesterol-PEG-conjugated or non-conjugated DNA were agarose gel (in 1N TBE). 0.8% agarose). The gel was subjected to a current of 70 V and 70 mA for one and a half hours to move the DNA by electrophoresis. Bands were revealed by absorption under ethidium bromide and ultraviolet light. The result is shown in FIG.

ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ製剤においてコレステロール−ＰＥＧを使用することは、脂質−ＰＥＧが存在しない場合は凝集を導くであろうような脂質の量まで粒子サイズを縮小することを可能にするという利点を持つ。この結果の興味深い点は、インビボで注入するトランスフェクション化合物の量を最適化することである。実際に、血清タンパク質を潜在的対象とするのに必要な粒子の大きさは、血流中での半減期を上昇させるために、主として５００ｎｍ未満でなければならない。この大きさの粒子を得るためには、少なくとも４０ｎｍｏｌの脂質ＤＴ−３ＴＵ／μｇＤＮＡを使用する必要がある。それ故、脂質ＤＴ−３ＴＵの製剤中で脂質−ＰＥＧを使用することは、ＤＮＡを緊密化し、５００ｎｍより小さいサイズの粒子を形成するために必要なＤＴ−３ＴＵの量を低減するという利点を持つ。   The use of cholesterol-PEG in the DT-3TU / DPPC formulation has the advantage of allowing the particle size to be reduced to the amount of lipid that would lead to aggregation in the absence of lipid-PEG. . An interesting aspect of this result is to optimize the amount of transfection compound injected in vivo. In fact, the particle size required to target serum proteins must be primarily less than 500 nm in order to increase the half-life in the bloodstream. In order to obtain particles of this size, it is necessary to use at least 40 nmol of lipid DT-3TU / μg DNA. Therefore, the use of lipid-PEG in the formulation of lipid DT-3TU has the advantage of reducing the amount of DT-3TU required to compact the DNA and form particles of a size smaller than 500 nm. .

ゲルは、ＤＮＡが脂質と結合しなかったときのＤＮＡの電気泳動移動（ウエル１）、及びＤＮＡが脂質と結合したときの保持率の差を示す。ウエル２〜５は、粒子の安定化剤としてコレステロール−ＰＥＧ（２０単位のエチレングリコール）を含む又は含まない、漸増量のＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣナノ乳剤と結合したＤＮＡ（０．０１ｇ／ｌ）を示す。ウエル２は、２０ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡ＋１５％コレステロール−ＰＥＧを示す。ウエル３は、２０ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡ＋２０％コレステロール−ＰＥＧを含む。ウエル４は、３０ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡ＋１５％コレステロール−ＰＥＧを示し、ウエル５は、２０ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡ＋２０％コレステロール−ＰＥＧを示す。ウエル１と他のウエルとの比較は、検討した種々のＤＴ−３ＴＵ製剤がゲル上のＤＮＡ移動を遅延させることを示唆しており、複合体からＤＮＡを遊離させることなく、従って複合体を不安定にすることなく、これらの製剤中にポリエチレングリコールのポリマーが組み込まれている可能性を示している。
この実施例は、それ故、安定化粒子の形態のＤＴ−３ＴＵ脂質が核酸を緊密化する能力を示している。 The gel shows the electrophoretic migration of DNA when DNA is not bound to lipid (well 1) and the difference in retention when DNA is bound to lipid. Wells 2-5 contain increasing amounts of DNA (0.01 g / l) combined with DT-3TU / DPPC nanoemulsion with or without cholesterol-PEG (20 units ethylene glycol) as a particle stabilizer. Show. Well 2 shows 20 nmol / μg DNA + 15% cholesterol-PEG. Well 3 contains 20 nmol / μg DNA + 20% cholesterol-PEG. Well 4 represents 30 nmol / μg DNA + 15% cholesterol-PEG, and well 5 represents 20 nmol / μg DNA + 20% cholesterol-PEG. Comparison of well 1 with the other wells suggests that the various DT-3TU formulations studied retarded DNA movement on the gel, thus freeing the DNA from the complex and thus making the complex uninhibited. It shows the possibility of incorporating polyethylene glycol polymers into these formulations without stabilization.
This example therefore demonstrates the ability of DT-3TU lipids in the form of stabilized particles to consolidate nucleic acids.

ＤＴ−４ＴＵ（１５）の存在下での核酸の緊密化
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が核酸に結合する能力を示すことである。 Nucleic acid compaction in the presence of DT-4TU (15) The purpose of this example is to show the ability of the transfection compounds according to the invention to bind to nucleic acids.

これは臭化エチジウムによる蛍光試験によって容易に明らかにすることができる：蛍光が存在しないことは遊離核酸が存在しないことを示唆し、それは核酸がトランスフェクション化合物によって緊密化されたことを意味する。   This can be readily revealed by fluorescence studies with ethidium bromide: the absence of fluorescence suggests that no free nucleic acid is present, which means that the nucleic acid has been intimated by the transfection compound.

該核酸を、核酸の溶液中での様々な力価の脂質溶液の等容量混合によって、漸増量のＤＴ−４ＴＵと接触させた。０．０１μｇ／ｍｌの濃度の核酸複合体８００μｌの試料を、漸増量のＤＴ−４ＴＵ（１５）を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中で調製した。   The nucleic acid was contacted with increasing amounts of DT-4TU by mixing equal volumes of lipid solutions of various titers in the nucleic acid solution. A sample of 800 μl of nucleic acid complex at a concentration of 0.01 μg / ml was prepared in a 150 mM sodium chloride solution containing increasing amounts of DT-4TU (15).

同様に、３チオ尿素を含む脂質（図２参照）と４チオ尿素を含む脂質の複合体形成の効率を比較するために、該核酸を、核酸の溶液中での様々な力価の脂質溶液の等容量混合により漸増量のＤＴ−３ＴＵ（１２）と接触させることによって対照を調製した。このようにして、０．０１μｇ／ｍｌの濃度の核酸複合体８００μｌの試料を、漸増量のＤＰＰＣを含む５％グルコース溶液中で調製した。   Similarly, to compare the efficiency of complex formation of lipids containing 3 thiourea (see FIG. 2) and lipids containing 4 thiourea, the nucleic acid was added to various titers of lipid solutions in nucleic acid solutions. A control was prepared by contacting with increasing amounts of DT-3TU (12) by equal volume mixing. Thus, a sample of 800 μl of nucleic acid complex at a concentration of 0.01 μg / ml was prepared in a 5% glucose solution containing increasing amounts of DPPC.

臭化エチジウム蛍光を、それぞれ２６０ｎｍと５９０ｎｍの励起及び発光波長でＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ−Ｓｐｅｘ）を使用して測定した。励起と発光のためのスリット幅は５ｎｍに設定した。ＤＮＡ／脂質溶液（０．０１ｇ／ｌ ＤＮＡ）１ｍｌにつき臭化エチジウム（１ｇ／ｌ）３μｌを加えた後、蛍光値を記録した。その結果を図１０に要約する。   Ethidium bromide fluorescence was measured using FluoroMax-2 (Jobin Yvon-Spex) at excitation and emission wavelengths of 260 nm and 590 nm, respectively. The slit width for excitation and emission was set to 5 nm. After adding 3 μl of ethidium bromide (1 g / l) per ml of DNA / lipid solution (0.01 g / l DNA), the fluorescence value was recorded. The results are summarized in FIG.

四角記号の曲線は、固定量の核酸（８μｇ）に対する漸増量のＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ脂質混合物（０．７５ｎｍｏｌから３０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ）の添加が、ＤＮＡの塩基対の間への臭化エチジウムの挿入の低下に結びつく蛍光の低下を誘導することを示している。これは、ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣリポソームとＤＮＡの間の結びつきが、その複合体から臭化エチジウムを排除するのに十分なほど強かったことを示唆する。我々はそれ故、３０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ脂質／μｇＤＮＡを使用して７０％のＤＮＡ緊密化を得ることができた。この脂質／ＤＮＡ結合におけるＤＴ−３ＴＵの積極的な役割は図１及び２に示されている。同様に、漸増量のＤＴ−４ＴＵ／ＤＰＰＣ脂質混合物（０．７５ｎｍｏｌから３０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ）を固定量の核酸（８μｇ）に加えた。この組合せは、ＤＮＡの塩基対の間への臭化エチジウムの挿入の低下に結びつく蛍光の低下を誘導する。これは、ＤＴ−４ＴＵ／ＤＰＰＣリポソームとＤＮＡの間の結びつきが、その複合体から臭化エチジウムを排除するのに十分なほど強かったことを示唆する。我々はそれ故、３０ｎｍｏｌの脂質／μｇＤＮＡに関して６０％のＤＮＡ緊密化を得ることができ（図１０、丸印記号の曲線）、これは同じ条件を使用したＤＴ−３ＴＵ複合体形成の効率と同様であった。   The squared curve shows that the addition of increasing amounts of DT-3TU / DPPC lipid mixture (0.75 nmol to 30 nmol DT-3TU) to a fixed amount of nucleic acid (8 μg) results in ethidium bromide between DNA base pairs. It has been shown to induce a decrease in fluorescence that leads to a decrease in insertion. This suggests that the association between DT-3TU / DPPC liposomes and DNA was strong enough to eliminate ethidium bromide from the complex. We were therefore able to obtain 70% DNA constriction using 30 nmol DT-3TU / DPPC lipid / μg DNA. The active role of DT-3TU in this lipid / DNA binding is illustrated in FIGS. Similarly, increasing amounts of DT-4TU / DPPC lipid mixture (0.75 nmol to 30 nmol DT-3TU) were added to a fixed amount of nucleic acid (8 μg). This combination induces a decrease in fluorescence that leads to a decrease in ethidium bromide insertion between DNA base pairs. This suggests that the association between DT-4TU / DPPC liposomes and DNA was strong enough to eliminate ethidium bromide from the complex. We can therefore obtain 60% DNA constriction for 30 nmol lipid / μg DNA (FIG. 10, circled curve), which is similar to the efficiency of DT-3TU complex formation using the same conditions Met.

この実施例は、それ故、ＤＴ−４ＴＵ脂質が核酸に結合する能力を示している。   This example therefore demonstrates the ability of DT-4TU lipids to bind nucleic acids.

ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ複合体によるデオキシリボヌクレアーゼからのＤＮＡの保護
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が酵素加水分解、すなわちデオキシリボヌクレアーゼから核酸を保護する能力を示すことである。 Protection of DNA from deoxyribonuclease by DT-3TU / DPPC complex The purpose of this example is to show the ability of the transfection compounds according to the present invention to enzymatic hydrolysis, ie to protect nucleic acids from deoxyribonuclease.

これは、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を使用して視覚化したＤＮＡのアガロースゲル上での電気泳動遅延試験によって容易に明らかにしうる。遊離ＤＮＡ又は脂質と複合したＤＮＡを適切な量のデオキシリボヌクレアーゼで処理した。そのＤＮＡを酵素消化混合物から抽出し、アガロースゲル上に置いた。その移動を処理しなかった核酸の移動と比較することによってＤＮＡの完全性を確認した。   This can be readily revealed by an electrophoretic delay test on DNA agarose gel visualized using ethidium bromide (EtBr). Free DNA or DNA complexed with lipids was treated with an appropriate amount of deoxyribonuclease. The DNA was extracted from the enzyme digestion mixture and placed on an agarose gel. The integrity of the DNA was confirmed by comparing the movement with that of untreated nucleic acid.

あらかじめ２×１０−４Ｍのデオキシリボヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ）で処理した様々なＤＮＡ試料をアガロースゲル（１Ｎ ＴＢＥ中０．８％アガロース）上に置いた。遊離ＤＮＡ及びＤＮＡと比較して漸増量のＤＴ−３ＴＵ脂質と複合したＤＮＡに関して、デオキシリボヌクレアーゼによる処理を実施した。電気泳動によってＤＮＡを移動させるため、ゲルを１時間半７０Ｖ及び４０ｍＡの電流に供した。バンドを臭化エチジウム及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。その結果を図１１に示す。 Various DNA samples previously treated with 2 × 10 −4 M deoxyribonuclease (Sigma) were placed on an agarose gel (0.8% agarose in 1N TBE). Treatment with deoxyribonuclease was performed on free DNA and DNA complexed with increasing amounts of DT-3TU lipids compared to DNA. In order to move the DNA by electrophoresis, the gel was subjected to a current of 70 V and 40 mA for 1.5 hours. Bands were revealed by absorption under ethidium bromide and ultraviolet light. The result is shown in FIG.

ゲルは、デオキシリボヌクレアーゼで処理しなかったときのＤＮＡの電気泳動移動（ウエル１）、及び処理後の保持率の差を示す。ウエル２は、２×１０−４Ｍのデオキシリボヌクレアーゼで処理したときの同じ量のＤＮＡ（３μｇ）を示す。この処理（２×１０−４Ｍのデオキシリボヌクレアーゼ、３０分間、３７℃）後、対応するバンドは認められず、ＤＮＡの分解を示唆している。３０及び４０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ脂質／μｇＤＮＡ及び４０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ脂質＋Ｃｈｏｌ−ＰＥＧと複合した核酸を２×１０−４Ｍのデオキシリボヌクレアーゼで処理した。フェノール／クロロホルムの混合物を使用してＤＮＡを抽出し、沈殿させたあと、それぞれウエル３、４及び５のアガロースゲル上に置いた。それらのＤＮＡの移動は、あらかじめデオキシリボヌクレアーゼで処理しなかったＤＮＡの移動と同様であった。これは、前記ＤＮＡが無傷であり、デオキシリボヌクレアーゼでの処理によって損なわれていなかったこと、従ってＤＴ−３ＴＵ脂質がＤＮＡを保護したことを示唆している。ＤＴ−３ＴＵ脂質複合体中のＤＮＡは、従って、酵素加水分解の影響を受けず、核酸はデオキシリボヌクレアーゼの加水分解から保護された。 The gel shows the difference in electrophoretic migration of DNA (well 1) and retention after treatment when not treated with deoxyribonuclease. Well 2 shows the same amount of DNA (3 μg) when treated with 2 × 10 −4 M deoxyribonuclease. After this treatment (2 × 10 −4 M deoxyribonuclease, 30 minutes, 37 ° C.), no corresponding band was observed, suggesting DNA degradation. Nucleic acids conjugated with 30 and 40 nmol DT-3TU lipid / μg DNA and 40 nmol DT-3TU lipid + Chol-PEG were treated with 2 × 10 −4 M deoxyribonuclease. DNA was extracted using a mixture of phenol / chloroform and precipitated, then placed on agarose gels in wells 3, 4 and 5, respectively. The movement of these DNAs was similar to the movement of DNA not previously treated with deoxyribonuclease. This suggests that the DNA was intact and was not impaired by treatment with deoxyribonuclease, thus DT-3TU lipid protected the DNA. The DNA in the DT-3TU lipid complex was therefore not affected by enzymatic hydrolysis and the nucleic acid was protected from deoxyribonuclease hydrolysis.

この実施例は、それ故、ＤＴ−３ＴＵ脂質が核酸を酵素加水分解から保護する能力を示している。   This example therefore demonstrates the ability of DT-3TU lipids to protect nucleic acids from enzymatic hydrolysis.

ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ複合体による血清からのＤＮＡの保護
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が、血清中での分解から核酸を保護する能力を示すことである。 Protection of DNA from serum by DT-3TU / DPPC complex The purpose of this example is to show the ability of the transfection compounds according to the invention to protect nucleic acids from degradation in serum.

これは、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を使用して視覚化したＤＮＡのアガロースゲル上での電気泳動遅延試験によって容易に明らかにしうる。遊離ＤＮＡ又は脂質と複合したＤＮＡを種々の量の血清と共に３７℃でインキュベートした。血清から抽出した後、ＤＮＡをアガロースゲル上に置き、その移動をインキュベートしなかった核酸の移動と比較することによってＤＮＡの完全性を確認した。   This can be readily revealed by an electrophoretic delay test on DNA agarose gel visualized using ethidium bromide (EtBr). Free DNA or DNA complexed with lipids was incubated with various amounts of serum at 37 ° C. After extraction from serum, DNA integrity was confirmed by placing the DNA on an agarose gel and comparing the transfer with the transfer of unincubated nucleic acids.

あらかじめ１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０％及び１００％血清中でインキュベートした様々なＤＮＡ試料をアガロースゲル（１Ｎ ＴＢＥ中０．８％アガロース）上に置いた。遊離ＤＮＡ及びＤＮＡと比較して漸増量のＤＴ−３ＴＵと複合したＤＮＡに関して、塩類溶液及び血清による処理を実施した。電気泳動によってＤＮＡを移動させるため、ゲルを１時間半７０Ｖ及び４０ｍＡの電流に供した。バンドを臭化エチジウム及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。その結果を図１２に示す。   Various DNA samples previously incubated in 150 mM NaCl, 20% and 100% serum were placed on an agarose gel (0.8% agarose in 1N TBE). Treatment with saline and serum was performed on free DNA and DNA complexed with increasing amounts of DT-3TU compared to DNA. In order to move the DNA by electrophoresis, the gel was subjected to a current of 70 V and 40 mA for 1.5 hours. Bands were revealed by absorption under ethidium bromide and ultraviolet light. The result is shown in FIG.

ゲルは、処理しなかったＤＮＡ（ブランク）の電気泳動移動（ウエル１）、遊離ＤＮＡを塩類溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で処理したとき（ウエル２）、ＤＮＡを４０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ脂質／μｇＤＮＡと複合したとき（ウエル３）の保持率の差を示す。塩類溶液から抽出したＤＮＡの移動は２つのウエルにおいて同様であった。これは、ＤＮＡがこれらの条件下で無傷に保持されたことを示唆する。次のウエルは、同じ順序で、２つの異なる血清条件：ウエル４〜５については２０％血清及びウエル６〜７については１００％血清、でのＤＮＡ（ウエル４及び６）、ＤＮＡ＋４０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ脂質（ウエル５及び７）を示す。ＤＮＡが遊離しているとき、上述した両方の血清条件下で、３７℃で３０分後に核酸は完全に分解された（ウエル４及び６）。他方で、ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣナノ乳剤とのＤＮＡ複合体形成は、ＤＮＡに対応する移動バンドが認められたことから、核酸の保護を誘導する（ウエル５及び７）。ＤＴ−３ＴＵ脂質複合体中のＤＮＡは、それ故、遊離ＤＮＡと比較したとき、血清中で分解から保護された。   Gels were electrophoretic transfer of untreated DNA (blank) (well 1), when free DNA was treated in saline (150 mM NaCl) (well 2), the DNA was 40 nmol of DT-3TU lipid / μg DNA. The difference in retention rate when combined with (well 3) is shown. The migration of DNA extracted from the saline solution was similar in the two wells. This suggests that the DNA was kept intact under these conditions. The next well, in the same order, had two different serum conditions: 20% serum for wells 4-5 and 100% serum for wells 6-7, DNA (wells 4 and 6), DNA + 40 nmol DT-3TU Lipids (wells 5 and 7) are shown. When DNA was free, the nucleic acid was completely degraded after 30 minutes at 37 ° C. under both serum conditions described above (wells 4 and 6). On the other hand, DNA complex formation with DT-3TU / DPPC nanoemulsions induces protection of nucleic acids since a migration band corresponding to DNA was observed (wells 5 and 7). The DNA in the DT-3TU lipid complex was therefore protected from degradation in serum when compared to free DNA.

この実施例は、それ故、血清中での分解から核酸を保護するＤＴ−３ＴＵ脂質の能力を示している。   This example therefore demonstrates the ability of DT-3TU lipids to protect nucleic acids from degradation in serum.

ＤＴ−３ＴＵ／ＤＮＡ組成物のインビボトランスフェクション
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物がインビボで生体組織をトランスフェクトする能力を示すことである。 In Vivo Transfection of DT-3TU / DNA Composition The purpose of this example is to show the ability of the transfection compounds according to the present invention to transfect biological tissues in vivo.

これは、ルシフェラーゼについてのコードＤＮＡ複合体を筋肉内注入することによって明らかにしうる。注入の９６時間後に筋肉試料を採取し、ルミノメーター（Ｗａｌｌａｃｅ）を使用してルシフェラーゼの発現レベルを測定した。   This can be revealed by intramuscular injection of the coding DNA complex for luciferase. Muscle samples were taken 96 hours after injection and the expression level of luciferase was measured using a luminometer (Wallace).

漸増量のＤＴ−３ＴＵ脂質／μｇＤＮＡを含む複合体をマウスの脛骨筋及び頭蓋筋に注入し、それに電気パルスを適用するか又は適用しなかった（Ｂｕｒｅａｕ，Ｍ．ら、ＢＢＡ２０００）。   A complex containing increasing amounts of DT-3TU lipid / μg DNA was injected into the tibialis and cranial muscles of mice with or without applying electrical pulses (Bureau, M. et al., BBA2000).

４０ｎｍｏｌ及び６０ｎｍｏｌの漸増量のＤＴ−３ＴＵ脂質／μｇＤＮＡを含む複合体を、３μｇＤＮＡ／動物を含有する３０μＬの容量で脛骨筋及び頭蓋筋に注入した。マウスＣ５７ｂｌ／６には、あらかじめケタミン／キシラジンの混合物で麻酔を施した。注入に続いて、筋の両方の末端に設置した電極を使用して経皮的に電気パルスを適用するか又は適用しなかった（Ｂｕｒｅａｕ，Ｍ．ら、ＢＢＡ２０００）。   Complexes containing 40 nmol and 60 nmol increasing amounts of DT-3TU lipid / μg DNA were injected into the tibial and cranial muscles in a volume of 30 μL containing 3 μg DNA / animal. Mouse C57bl / 6 was previously anesthetized with a mixture of ketamine / xylazine. Following injection, electrical pulses were or were not applied percutaneously using electrodes placed at both ends of the muscle (Bureau, M. et al., BBA2000).

注入の９６時間後、マウスを安楽死させ、筋肉試料を採取して、緩衝溶解溶液１ｍｌ中で摩砕した。遠心分離（１０分間、１２０００ｒｐｍ、４℃）後、上清（１０μｌ）を採取し、９６穴プレートに入れて、ルシフェラーゼ基質５０μｌを加えた後ルシフェラーゼを読み取った。ルミノメーター（Ｗａｌｌａｃｅ，Ｖｉｃｔｏｒ）を使用して上清中の発光のレベルを読み取った。   96 hours after injection, mice were euthanized and muscle samples were taken and triturated in 1 ml of buffered lysis solution. After centrifugation (10 minutes, 12000 rpm, 4 ° C.), the supernatant (10 μl) was collected, placed in a 96-well plate, 50 μl of luciferase substrate was added, and luciferase was read. The level of luminescence in the supernatant was read using a luminometer (Wallace, Victor).

得られた結果を図１３に示す。それらの結果は、核酸と結合した脂質の量、２０ｎｍｏｌ及び４０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ脂質／μｇＤＮＡに対する発現のレベルを表わしている。得られた種々の発現レベルは有意であり、筋を対照としたときに得られたバックラウンドノイズ（５．０×１０４）を上回っていた。種々の量のＤＴ−３ＴＵ脂質と複合したＤＮＡは、それ故、有意のトランスフェクションレベルで筋肉組織をトランスフェクトすることができた。 The obtained result is shown in FIG. The results represent the amount of lipid bound to the nucleic acid, the level of expression for 20 nmol and 40 nmol DT-3TU lipid / μg DNA. The various expression levels obtained were significant and exceeded the background noise (5.0 × 10 4 ) obtained when using muscle as a control. DNA complexed with various amounts of DT-3TU lipid could therefore transfect muscle tissue at significant transfection levels.

この実施例は、本発明によるトランスフェクション化合物がインビボで組織をトランスフェクトする能力を示している。   This example demonstrates the ability of the transfection compounds according to the present invention to transfect tissues in vivo.

ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ／ＤＮＡ複合体のインビボでの生体分布
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が、それらの中性特性のゆえにインビボで血流中により長い時間とどまる能力を示すことである。 In vivo biodistribution of DT-3TU / DPPC / DNA complexes The purpose of this example is to demonstrate the ability of the transfection compounds according to the present invention to remain in the bloodstream in vivo longer due to their neutral properties It is.

これは、蛍光脂質を含むＤＮＡをマウス血流中に注入することによって明らかにしうる。注入後種々の時点で血液試料を採取し、ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ−Ｓｐｅｘ）を用いて血流中の蛍光のレベルを測定した。   This can be revealed by injecting DNA containing fluorescent lipids into the mouse bloodstream. Blood samples were collected at various times after injection and the level of fluorescence in the bloodstream was measured using FluoroMax-2 (Jobin Yvon-Spex).

４０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ脂質／μｇＤＮＡを含む複合体、１モル当量のＤＰＰＣ／ＤＴ−３ＴＵ脂質及び（脂質総量の）０．７％の脂質−ローダミンを、１１μｇＤＮＡ／動物を含有する２００μＬの容量で尾静脈に注入した。マウスＣ５７ｂｌ／６にはケタミン／キシラジンの混合物で麻酔を施した。   Complex containing 40 nmol DT-3TU lipid / μg DNA, 1 molar equivalent of DPPC / DT-3TU lipid and 0.7% lipid-rhodamine (total lipid) in a volume of 200 μL containing 11 μg DNA / animal Infused intravenously. Mouse C57bl / 6 was anesthetized with a mixture of ketamine / xylazine.

注入後、３０分、１時間及び６時間目に、マウスを麻酔した状態で心臓穿刺によって血液試料を採取した。マウスを安楽死させたあと、直ちに肝臓、脾臓及び肺を摘出し、計量して、ＰＢＳ（５μｌ／ｍｇ組織）中で均質化した。血液１００μＬから脂質を抽出し、クロロホルム／メタノール混合物（１／１）３ｍｌを使用して、３０分間強く攪拌し、その後遠心分離することによって器官を均質化した。ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ−Ｓｐｅｘ）を用いてそれぞれ５５０ｎｍと５９０ｎｍの励起及び発光波長で、上清中の蛍光を測定した。励起及び発光のためのスリット幅は５ｎｍに設定した。   At 30 minutes, 1 hour and 6 hours after injection, blood samples were collected by cardiac puncture with the mice anesthetized. Immediately after euthanizing the mice, the liver, spleen and lungs were removed, weighed and homogenized in PBS (5 μl / mg tissue). Lipid was extracted from 100 μL of blood and the organ was homogenized by using 3 ml of chloroform / methanol mixture (1/1) and stirring vigorously for 30 minutes, followed by centrifugation. The fluorescence in the supernatant was measured using FluoroMax-2 (Jobin Yvon-Spex) at excitation and emission wavelengths of 550 nm and 590 nm, respectively. The slit width for excitation and emission was set to 5 nm.

結果を図１４に要約する。それらは、注入後３０分、１時間及び６時間眼に血液、肺及び細網内皮系（肝臓と脾臓を合わせて）から得た注入用量のパーセンテージを表わしている。３０分後の血液中の蛍光の測定値は注入用量の５０％であり、カチオン型のＤＮＡ界面活性剤に関して得られるものをはるかに上回っていた。１時間後には、注入用量の１７％が検出でき、やはりカチオン型複合体と比較して著明な改善を示している。これらの脂質／ＤＮＡ複合体の中性特性（ζ電位は非常に弱い正であった：図４）は、それ故、血清タンパク質に対して潜伏性の（ｆｕｒｔｉｖｅ）粒子を得るための事実上の利点である。中性特性はまた、マクロファージ及び肝臓及び脾臓のクップファー細胞との相互作用も制限するはずであり、このことが、注入後３０分及び１時間目に血液中で認められたリポソームの量を説明すると考えられる。   The results are summarized in FIG. They represent the percentage of infusion dose obtained from blood, lung and reticuloendothelial system (liver and spleen combined) at 30 minutes, 1 hour and 6 hours after injection. Measured fluorescence in the blood after 30 minutes was 50% of the injected dose, far exceeding what was obtained for cationic DNA surfactants. After 1 hour, 17% of the injected dose can be detected, again showing a marked improvement compared to the cationic complex. The neutral nature of these lipid / DNA complexes (ζ potential was very weak positive: FIG. 4), therefore, is the de facto factor to obtain a latent particle for serum proteins. Is an advantage. Neutral properties should also limit interactions with macrophages and liver and spleen Kupffer cells, which explains the amount of liposomes found in the blood 30 minutes and 1 hour after injection. Conceivable.

肺で検出されたリポプレックスの量は、カチオン性リポプレックスを使用したときに認められた量と比較して低かった。リポソームの中性特性は、肺の陰性内皮との非特異的相互作用も低下させるはずである。   The amount of lipoplex detected in the lung was lower compared to the amount observed when using cationic lipoplex. The neutral nature of liposomes should also reduce nonspecific interactions with the negative endothelium of the lung.

この実施例は、本発明によるトランスフェクション化合物が血清タンパク質に対して潜伏性である能力を示している。   This example demonstrates the ability of the transfection compounds according to the present invention to be latent for serum proteins.

核酸μｇ当りのＥＰＣ／ＤＴＴＵ混合物の量（ｎｍｏｌ）の関数として及び核酸μｇ当りのＥＰＣ単独の量（ｎｍｏｌ）（対照混合物）の関数としての、蛍光のレベルの変化（％）。Percent change in fluorescence level as a function of the amount of EPC / DTTU mixture per μg of nucleic acid (nmol) and as a function of the amount of EPC alone per μg of nucleic acid (nmol) (control mixture). 核酸μｇ当りのＤＰＰＣ／ＤＴＴＵ混合物の量（ｎｍｏｌ）の関数として及び核酸μｇ当りのＤＰＰＣ単独の量（ｎｍｏｌ）（対照混合物）の関数としての、蛍光のレベルの変化（％）。% Change in the level of fluorescence as a function of the amount of DPPC / DTTU mixture per μg of nucleic acid (nmol) and as a function of the amount of DPPC alone per μg of nucleic acid (nmol) (control mixture). 使用したＥＰＣ／ＤＴＴＵリポソームの量（ｎｍｏｌ）の関数としてのプラスミドｐＸＬ３０３１の緊密化（μｇ）を示すアガロースゲル（０．８％／ＴＢＥ）。Agarose gel (0.8% / TBE) showing densification (μg) of plasmid pXL3031 as a function of the amount (nmol) of EPC / DTTU liposomes used. 核酸μｇ当りの脂質の量（ｎｍｏｌ）の関数としてのＤＰＰＣ／ＤＴＴＵ−ＤＮＡリポソームの表面の電位に対応するζ（ゼータ）電位（ｍＶ）。Ζ (zeta) potential (mV) corresponding to the surface potential of DPPC / DTTU-DNA liposomes as a function of the amount of lipid per μg of nucleic acid (nmol). 血清を含む又は含まない、様々な脂質／ＤＮＡ比（ｎｍｏｌ／μｇ）でのＤＮＡとＤＴＴＵ／ＤＰＰＣ（１：２）リポソームの間で形成される複合体によるＨｅＬａ細胞のインビトロトランスフェクションの効率。 ｙ軸は、ＲＬＵ／μｇタンパク質でのルシフェラーゼの発現を表わす。 ｘ軸は、ＤＮＡμｇ当りのＤＴＴＵの量（ｎｍｏｌ）を示す。Efficiency of in vitro transfection of HeLa cells with complexes formed between DNA and DTTU / DPPC (1: 2) liposomes at various lipid / DNA ratios (nmol / μg) with or without serum. The y-axis represents luciferase expression on RLU / μg protein. The x-axis shows the amount of DTTU (nmol) per μg of DNA. ＥＰＣ＋様々な脂質／ＤＮＡ比（ｎｍｏｌ／μｇ）のＤＴＴＵ／ＤＮＡリポソームで処理していない又は処理したＨｅＬａ細胞のタンパク質のレベル（吸光度として）。Protein levels (as absorbance) of HeLa cells not treated or treated with DTTU / DNA liposomes with EPC + various lipid / DNA ratios (nmol / μg). プラスミドｐＸＬ３０３１の図式的表示。Schematic representation of plasmid pXL3031. 使用したＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣナノ乳剤の量（ｎｍｏｌ）の関数としてのプラスミドｐＸＬ３０３１の緊密化（μｇ）を示すアガロースゲル（０．８％／ＴＢＥ）。Agarose gel (0.8% / TBE) showing compaction (μg) of plasmid pXL3031 as a function of the amount of DT-3TU / DPPC nanoemulsion used (nmol). 使用したＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ／ｃｈｏｌ−ＰＥＧナノ乳剤の量（ｎｍｏｌ）の関数としてのプラスミドｐＸＬ３０３１の緊密化（μｇ）を示すアガロースゲル（０．８％／ＴＢＥ）。Agarose gel (0.8% / TBE) showing the consolidation (μg) of plasmid pXL3031 as a function of the amount (nmol) of DT-3TU / DPPC / chol-PEG nanoemulsion used. 核酸μｇにつき様々な量のＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ（ｎｍｏｌ）と比較した、核酸μｇ当りのＤＴ−４ＴＵ／ＤＰＰＣの量（ｎｍｏｌ）の関数としての緊密化されたＤＮＡのパーセンテージの変化。Change in the percentage of compacted DNA as a function of the amount of DT-4TU / DPPC per μg of nucleic acid (nmol) compared to various amounts of DT-3TU / DPPC (nmol) per μg of nucleic acid. デオキシリボヌクレアーゼ分解に対するプラスミドｐＸＬ３０３１のＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ混合物（μｇ）による保護を示すアガロースゲル（０．８％／ＴＢＥ）。Agarose gel (0.8% / TBE) showing protection of plasmid pXL3031 by DT-3TU / DPPC mixture (μg) against deoxyribonuclease degradation. 血清中に入れたときのプラスミドｐＸＬ３０３１のＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ混合物（μｇ）による保護を示すアガロースゲル（０．８％／ＴＢＥ）。レーン１は、ＤＮＡに対応する；レーン２及び３は、ＤＮＡ単独、又はＮａＣｌ １５０ｍＭ及び２０％血清中（レーン４及び５）、及び１００％血清中（レーン６及び７）のＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣナノ乳剤１０ｎｍｏｌ／μｇの存在下でのＤＮＡに対応する。Agarose gel (0.8% / TBE) showing protection of plasmid pXL3031 by DT-3TU / DPPC mixture (μg) when placed in serum. Lane 1 corresponds to DNA; lanes 2 and 3 are DT-3TU / DPPC in DNA alone or in NaCl 150 mM and 20% serum (lanes 4 and 5) and 100% serum (lanes 6 and 7). Corresponds to DNA in the presence of 10 nmol / μg nanoemulsion. エレクトロトランスファーを伴って又は伴わずに（ｅ−／ｅ＋）様々な量の脂質／ｎｍｏｌ ＤＮＡ／μｇで存在する、ＤＮＡとＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣリポソームの複合体によるインビボ筋肉トランスフェクションの効率。Efficiency of in vivo muscle transfection with complexes of DNA and DT-3TU / DPPC liposomes present in varying amounts of lipid / nmol DNA / μg with or without electrotransfer (e− / e +). 血液、肺及びＲＥＳ（肝臓及び脾臓）中の、３０分、１時間及び６時間後のＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ／ＤＯＰＥ−Ｒｈ／ＤＮＡ複合体のマウスにおけるインビボ生体分布。この図は、該粒子が潜伏（ｆｕｒｔｉｖｅ）特性を有することを示す：前記複合体の５０％が３０分後に血液循環中で回収される。In vivo biodistribution in mice of DT-3TU / DPPC / DOPE-Rh / DNA complex after 30 minutes, 1 hour and 6 hours in blood, lung and RES (liver and spleen). This figure shows that the particles have a latent property: 50% of the complex is recovered in the blood circulation after 30 minutes.

Claims (28)

式（ＩＩＩ）：
Figure 0004276439
［式中、
ｎは、２、３、４、５、又は６であり、
ｍは、２、３、又は４であり、各々のｍ値は、各々の基−［ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−（ＣＨ）ｍ］−について独立して選択され、
Ｘは、１個から８個の炭素原子を含む飽和又は不飽和直鎖又は環状脂肪族基、メルカプトメチル（−ＣＨ２ＳＨ）基、又は−（ＣＨ２）ｘ−（ＣＨＯＨ）ｕ−Ｈ［式中、ｘは１〜１０から選択される整数であり、ｕは１、２、３、４、５又は６である］もしくは−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖ−Ｈ［式中、ｖは、１、２又は３である］で表される親水鎖であり、
Ｙは１個から６個の炭素原子を有するアルキル、ケトン、エステル、エーテル、アミド、アミジン、カルバメート又はチオカルバメート官能基、グリセロール、尿素、チオ尿素、又は芳香環から選択される少なくとも１個の化学官能基を含むスペーサーであって、
Ｒ１とＲ２は、互いに独立して、水素原子又は脂肪族鎖であり、該脂肪族鎖は１０個から２２個の炭素原子及び任意に少なくとも１つの不飽和を含むアルキル基から選択され、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１個は水素原子ではない］
の化合物、又はその異性体、又はそれらの混合物。Formula (III):
Figure 0004276439
 [Where:
n is 2, 3, 4, 5, or 6;
m is 2, 3, or 4 and each m value is independently selected for each group — [NH—CS—NH— (CH) m ] —
X is a saturated or unsaturated linear or cyclic aliphatic group containing 1 to 8 carbon atoms, a mercaptomethyl (—CH 2 SH) group, or — (CH 2 ) x — (CHOH) u —H [ Wherein x is an integer selected from 1 to 10 and u is 1, 2, 3, 4, 5 or 6] or — (OCH 2 CH 2 O) v —H [wherein v is a hydrophilic chain represented by 1, 2 or 3,
Y is at least one chemistry selected from alkyl, ketone, ester, ether, amide, amidine, carbamate or thiocarbamate functional group having 1 to 6 carbon atoms, glycerol, urea, thiourea, or aromatic ring A spacer containing a functional group,
R 1 and R 2 are independently of one another a hydrogen atom or an aliphatic chain, the aliphatic chain being selected from an alkyl group containing 10 to 22 carbon atoms and optionally at least one unsaturation; At least one of R 1 and R 2 is not a hydrogen atom]
Or an isomer thereof, or a mixture thereof. 式（ＩＶ）：
Figure 0004276439
［式中、ｍ、ｎ及びＹは、請求項１で定義したとおりである］
を含む、請求項１に記載の化合物、又はその異性体、又はそれらの混合物。Formula (IV):
Figure 0004276439
 [Wherein m, n and Y are as defined in claim 1]
The compound of Claim 1 containing this, or its isomer, or mixtures thereof. 前記スペーサーが、式（Ｖ）又は式（ＶＩ）：
−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２− （Ｖ）
又は−（ＣＨ２）ｉ−Ｗ−（ＣＨ２）ｊ− （ＶＩ）
［式中、ｉ及びｊは、１から６までの整数であり、及びＷは、ケトン、エステル、エーテル、アミド、アミジン、カルバメート又はチオカルバメート官能基、グリセロール、尿素、チオ尿素、又は選択的に芳香環である］
の基である、請求項１又は２に記載の化合物。The spacer is represented by formula (V) or formula (VI):
—NH—C (O) —CH 2 —CH 2 — (V)
Or - (CH 2) i -W- ( CH 2) j - (VI)
Wherein i and j are integers from 1 to 6 and W is a ketone, ester, ether, amide, amidine, carbamate or thiocarbamate functional group, glycerol, urea, thiourea, or optionally It is an aromatic ring]
The compound of Claim 1 or 2 which is group of these. 脂肪族鎖が、脂肪族基（ＣＨ２）１１ＣＨ３、（ＣＨ２）１３ＣＨ３、（ＣＨ２）１５ＣＨ３及び（ＣＨ２）１７ＣＨ３から選択される、請求項１に記載の化合物。Aliphatic chain, aliphatic group (CH 2) 11 CH 3, (CH 2) 13 CH 3, is selected from (CH 2) 15 CH 3 and (CH 2) 17 CH 3, according to claim 1 Compound. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物と核酸とを含む核酸を細胞に導入するための組成物。The composition for introduce | transducing into a cell the nucleic acid containing the compound and nucleic acid as described in any one of Claims 1-4 . 前記核酸が、デオキシリボ核酸又はリボ核酸である、請求項５に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。The composition for introducing the nucleic acid according to claim 5 into a cell, wherein the nucleic acid is deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid. 前記核酸が、少なくとも１つの調節配列の制御下の少なくとも１個の治療的重要性を持つ遺伝子を含む、請求項５又は６に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。The composition for introducing a nucleic acid according to claim 5 or 6 , wherein the nucleic acid comprises at least one gene of therapeutic importance under the control of at least one regulatory sequence. 前記核酸が、遺伝子、アンチセンス配列又はリボザイム機能を有するＲＮＡをコードするＤＮＡである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。The composition for introducing the nucleic acid according to any one of claims 5 to 7 , wherein the nucleic acid is a DNA encoding an RNA having a gene, an antisense sequence, or a ribozyme function. 少なくとも１個のアジュバントをさらに含有する、請求項５〜８のいずれか一項に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。Further comprising at least one adjuvant, compositions for introducing nucleic acid according to the cell to any one of claims 5-8. 前記アジュバントが、脂質、ペプチド、タンパク質、又はポリマーである、請求項９に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。The composition for introducing the nucleic acid according to claim 9 into a cell, wherein the adjuvant is a lipid, a peptide, a protein, or a polymer. 前記ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項１０に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。The composition for introduce | transducing the nucleic acid of Claim 10 into a cell whose said polymer is polyethyleneglycol. 前記ポリマーが、コレステロールに共有結合されたポリエチレングリコールである、請求項１０に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。The composition for introducing the nucleic acid according to claim 10 , wherein the polymer is polyethylene glycol covalently bonded to cholesterol. 前記アジュバントが中性脂質から選択される、請求項１０に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。The composition for introducing a nucleic acid according to claim 10 into a cell, wherein the adjuvant is selected from neutral lipids. 前記中性脂質が、天然脂質又は合成脂質であり、前記脂質が、生理的条件下で両性イオン性であるか又はイオン電荷を持たない、請求項１３に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。14. The nucleic acid according to claim 13 , wherein the neutral lipid is a natural lipid or a synthetic lipid, and the lipid is zwitterionic or has no ionic charge under physiological conditions. Composition. 前記中性脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジ−ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジ−ミリストイルホスファチジルエタノールアミン、又は１、２又は３回Ｎ−メチル化されている、前記ホスファチジルエタノールアミンのいずれかの誘導体、ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（特にガラクトセレブロシドなど）、スフィンゴ脂質（特にスフィンゴミエリンなど）、又はアシアロガングリオシド（特にアシアロＧＭ１又はアシアロＧＭ２など）である、請求項１４に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。The neutral lipid is dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), oleoyl palmitoylphosphatidylethanolamine (POPE), di-stearoylphosphatidylethanolamine, di-palmitoylphosphatidylethanolamine, di-myristoylphosphatidylethanolamine, or 1, Any of the above phosphatidylethanolamine derivatives, phosphatidylglycerols, diacylglycerols, glycosyldiacylglycerols, cerebrosides (especially galactocerebrosides), sphingolipids (especially sphingomyelin, etc.), N-methylated 2 or 3 times, or is asialo ganglioside (particularly asialo GM1 or asialo GM2), to introduce a nucleic acid according to the cell in claim 14 Compositions for. 少なくとも１つの細胞外標的エレメント又は少なくとも１つの細胞内標的エレメントをさらに含有する、請求項５〜１５のいずれか一項に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。The composition for introducing the nucleic acid according to any one of claims 5 to 15 , further comprising at least one extracellular target element or at least one intracellular target element. 前記標的エレメントが、糖、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、脂質、神経伝達物質、ホルモン、ビタミン、又はそれらの誘導体である、請求項１６に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。The composition for introducing a nucleic acid according to claim 16 into a cell, wherein the target element is a sugar, peptide, protein, oligonucleotide, lipid, neurotransmitter, hormone, vitamin, or a derivative thereof. 前記標的エレメントが、少なくとも１０個の炭素原子を含む脂肪アルキル鎖又はポリエチレングリコールに共有結合されている、請求項１６に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。17. A composition for introducing a nucleic acid into a cell according to claim 16 , wherein the target element is covalently linked to a fatty alkyl chain comprising at least 10 carbon atoms or polyethylene glycol. 前記標的エレメントが、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物及び前記核酸に共有結合されている、請求項１６に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。The composition for introduce | transducing into the cell the nucleic acid of Claim 16 in which the said target element is covalently couple | bonded with the compound and the said nucleic acid as described in any one of Claims 1-4 . 注射用製剤のための医薬適合性の賦形剤をさらに含有する、請求項５〜１９のいずれか一項に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。20. A composition for introducing a nucleic acid according to any one of claims 5 to 19 , further comprising a pharmaceutically acceptable excipient for an injectable formulation. 皮膚及び／又は粘膜への投与のための医薬適合性の賦形剤をさらに含有する、請求項５〜１９のいずれか一項に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。The composition for introducing the nucleic acid according to any one of claims 5 to 19 , further comprising a pharmaceutically acceptable excipient for administration to the skin and / or mucous membrane. ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける核酸の導入のための請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の使用。Use of a compound according to any one of claims 1 to 4 for the introduction of nucleic acids in vitro. 疾病の治療のための医薬を製造するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の使用。Use of a compound according to any one of claims 1 to 4 for the manufacture of a medicament for the treatment of a disease. ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて核酸を細胞に導入するための方法であって、（１）核酸を請求項１〜４で定義した化合物と接触させることによって複合体を形成すること；及び（２）細胞を前記複合体と接触させること、を含む、核酸を前記細胞に導入するための方法。A method for introducing a nucleic acid into a cell in vitro, comprising: (1) forming a complex by contacting the nucleic acid with a compound as defined in claims 1-4 ; and (2) combining the cell with the complex A method for introducing a nucleic acid into the cell comprising contacting the body. 前記複合体を形成する前に、前記化合物及び／又は前記核酸を、請求項９〜１９で定義した少なくとも１つのアジュバント及び／又は標的エレメントと混合することをさらに含む、請求項２４に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて核酸を細胞に導入するための方法。Prior to forming the complex, the compound and / or the nucleic acid further comprises mixing with at least one adjuvant and / or target element defined in claim 9-19, according to claim 24, A method for introducing a nucleic acid into a cell in vitro. 前記細胞を前記複合体と接触させる前に、請求項９〜１５で定義した少なくとも１つのアジュバントを該細胞に投与する、請求項２４に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて核酸を細胞に導入するための方法。Said cell prior to contacting with said complex, at least one adjuvant as defined in claims 9-15 is administered to the cells, a method for introducing the described nucleic acids in in vitro to cells in claim 24 . 該細胞を、少なくとも１つの化学的処理又は少なくとも１つの物理的処理又はそれらの組合せに供することをさらに含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて核酸を細胞に導入するための方法。Introducing the said cell further comprises subjecting at least one chemical treatment or at least one physical treatment, or a combination thereof, as claimed in any one of claims 24-26, the nucleic acids in in vitro into a cell How to do. 少なくとも１つの請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物及び／又はその混合物を含む、トランスフェクションキット。A transfection kit comprising at least one compound according to any one of claims 1 to 4 and / or a mixture thereof.
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