JP4276439B2 - Lipid derivatives of polythiourea - Google Patents
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Description
本出願は、2001年6月13日出願の米国特許仮出願第60/297,482号の利益を主張し、また2001年5月14日出願のフランス特許仮出願第0106330号に基づく優先権を主張するものであって、これら2つの出願の内容は参照してここに組み込まれる。
本発明は、核酸を細胞に導入することを可能にする新規化合物に関する。それらは、インビトロ、半ビボ又はインビボでの様々な細胞型への核酸のトランスフェクションのために有用である。
This application claims the benefit of US Provisional Application No. 60 / 297,482, filed June 13, 2001, and has priority based on French Provisional Application No. 0106330, filed May 14, 2001. The contents of these two applications are hereby incorporated by reference.
The present invention relates to novel compounds that allow nucleic acids to be introduced into cells. They are useful for transfection of nucleic acids into various cell types in vitro, semi-vivo or in vivo.
バイオテクノロジーの発達と共に、核酸を細胞内に有効に導入できることが必要となってきた。それは、例えば組換えタンパク質の生産のために、又は遺伝子の発現の調節、遺伝子のクローニング又はDNAに関わる他の何らかの操作を検討するために研究室において、インビトロで細胞内に核酸を導入することを含みうる。また、例えばトランスジェニック動物の創造、ワクチンの生産、標識試験あるいはまた治療アプローチのために、インビボで細胞内に核酸を導入することも含みうる。また、骨髄移植、免疫療法又はその後の再投与のために生物から採集した細胞への遺伝子の導入に関わる他の方法を含むアプローチにおいて、半ビボで細胞内に核酸を導入することも含みうる。 With the development of biotechnology, it has become necessary to be able to effectively introduce nucleic acids into cells. It introduces nucleic acids into cells in vitro, for example in the laboratory, for the production of recombinant proteins or to study the regulation of gene expression, gene cloning or any other manipulation involving DNA. May be included. It may also include the introduction of nucleic acids into cells in vivo, for example for the creation of transgenic animals, vaccine production, labeling tests or also therapeutic approaches. It may also include the introduction of nucleic acids into cells in vivo in an approach that includes other methods involving the introduction of genes into cells harvested from organisms for bone marrow transplantation, immunotherapy or subsequent re-administration.
外来性遺伝物質の細胞内送達のためにいくつかの方法が提案されてきた。それらの1つは、特に、全く危険性がないとは言えないウイルス法に対して極めて好都合な代替法を構成する、非ウイルスベクターの使用に基づく。これらの合成ベクターは2つの主要な機能を有する:導入される核酸と複合して核酸を緊密化すること、及び形質膜及びおそらくは核エンベロープを横切る核酸の通過を促進すること。 Several methods have been proposed for intracellular delivery of exogenous genetic material. One of them is based in particular on the use of non-viral vectors that constitute a very convenient alternative to viral methods that are not at all dangerous. These synthetic vectors have two major functions: to complex nucleic acids in complex with introduced nucleic acids and to facilitate the passage of nucleic acids across the plasma membrane and possibly the nuclear envelope.
例えばポリマー又は選択的に生化学的ベクター(細胞受容体リガンドと結合したカチオンタンパク質から成る)のように、いくつかのファミリーの合成ベクターが開発されてきたが、重要な進歩は、特にリポフェクタントの開発、より特定するとカチオン脂質の開発によって為された。カチオン脂質は、それらの全体的な正電荷のために、全体として負であるDNAに自発的に干渉して、ヌクレアーゼからDNAを保護すること及びDNAの細胞内放出のために細胞膜に結合することができるヌクレオ脂質複合体を形成することが明らかにされた。 Although several families of synthetic vectors have been developed, such as polymers or selectively biochemical vectors (consisting of cationic proteins coupled with cell receptor ligands), significant advances have been made especially with the development of lipofectants. More specifically, it was made by the development of cationic lipids. Cationic lipids spontaneously interfere with DNA that is totally negative due to their overall positive charge, protecting the DNA from nucleases and binding to the cell membrane for intracellular release of DNA. Has been shown to form nucleolipid complexes capable of
これまでに様々なタイプのカチオン脂質が合成されている:第四級アンモニウム基を含む脂質(例えばDOTMA、DOTAP、DMRIE、DLRIE等)、例えばDOGS、DC−Chol又は選択的に特許願WO97/18185号に開示されているリポポリアミンのようなリポポリアミン、第四級アンモニウム基とDOSPAのようなポリアミンの両方を含む脂質、又は選択的に様々な他のカチオン単位、特にアミジニウム基を含む脂質(例えばADPDE、ADODE又は特許願WO97/31935号の脂質)。 Various types of cationic lipids have been synthesized so far: lipids containing quaternary ammonium groups (eg DOTMA, DOTAP, DMRIE, DLRIE etc.), eg DOGS, DC-Chol or optionally patent application WO 97/18185. Lipids containing both quaternary ammonium groups and polyamines such as DOSPA, or optionally various other cationic units, particularly lipids containing amidinium groups (e.g. ADPDE, ADODE or lipids of patent application WO 97/31935).
しかし、これらのカチオン脂質をトランスフェクション剤として使用することにはまだ数多くの問題があり、それらの効率も改善の余地がある。特に、効率的で安定なヌクレオ脂質複合体を得るためには、一般に、これらの複合体が高度に陽イオン性である必要があることが認められた。しかし、核酸と共に、全体として中性又は陰性である粒子を形成するためには、陽イオン性でないベクターが利用可能であることが望ましいであろう。実際に、核酸とカチオン脂質の間で形成される全体として陽イオン性の複合体は、それらの排出を誘導する細網内皮系によって捕獲される傾向があることが認められている。さらに、形成される複合体の全体的正電荷のために、血漿タンパク質がそれらの表面に吸着する傾向があり、これはトランスフェクション力の低下をもたらす。さらに、局所注入に関して、大きな全体的正電荷の存在は、複合体が細胞外マトリックスに吸着するため、核酸複合体が投与部位から遠くへと拡散するのを妨げる;複合体は、それ故、標的細胞に到達することができず、結果として注入された複合体の量に比べて導入効率の低下を生じさせる。最後に、多くの場合、カチオン脂質は炎症作用を有することも認められている。 However, there are still a number of problems with using these cationic lipids as transfection agents, and there is room for improvement in their efficiency. In particular, it has been observed that in order to obtain efficient and stable nucleolipid complexes, these complexes generally need to be highly cationic. However, it would be desirable to have a non-cationic vector available to form particles that are neutral or negative overall with the nucleic acid. Indeed, it has been observed that the overall cationic complexes formed between nucleic acids and cationic lipids tend to be captured by the reticuloendothelial system that induces their excretion. Furthermore, due to the overall positive charge of the complex formed, plasma proteins tend to adsorb to their surface, which results in a decrease in transfection power. Further, with respect to local injection, the presence of a large overall positive charge prevents the nucleic acid complex from diffusing far from the site of administration because the complex is adsorbed to the extracellular matrix; Inability to reach the cells results in a reduction in transfection efficiency compared to the amount of complex injected. Finally, in many cases, cationic lipids have also been found to have inflammatory effects.
本発明の目的は、明白に、そのポリチオ尿素官能基の故に革新的であり、インビトロ、半ビボ又はインビボでの核酸のトランスフェクションのために効率的に使用することができる新規トランスフェクション化合物を提供することである。これらの新規化合物は、
−それらの構造から正電荷が存在しないことにより、上記で論じたカチオンベクターの使用によって引き起こされる多くの問題を解決することが可能になり、
−カチオン脂質と同じように、核酸と複合して核酸を緊密化することができ、且つそれらのトランスフェクションを促進することができる
ので、特に有益である。
The object of the present invention clearly provides novel transfection compounds that are innovative because of their polythiourea functionality and can be used efficiently for transfection of nucleic acids in vitro, semi-vivo or in vivo. It is to be. These new compounds are
-The absence of a positive charge from their structure makes it possible to solve many of the problems caused by the use of cationic vectors discussed above,
-Like cationic lipids, it is particularly beneficial because it can complex with nucleic acids to consolidate nucleic acids and facilitate their transfection.
本発明の第一の対象は、従って、スペーサーによって脂質に結合されたポリチオ尿素部分から成ることを特徴とするトランスフェクション化合物である。 The first subject of the present invention is therefore a transfection compound characterized in that it consists of a polythiourea moiety bound to a lipid by a spacer.
特に、本発明の対象は、一般式(I): In particular, the subject of the present invention is the general formula (I):
・lは、0及び1から選択される整数であり、
・nは、1、2、3、4、5及び6から選択される整数であり、
・mは、2、3及び4から選択される整数であり、mは、種々の基−[NH−CS−NH−(CH)m]−の中で異なる値をとることが可能であり、
・R’は、一般式(II):
L is an integer selected from 0 and 1;
N is an integer selected from 1, 2, 3, 4, 5 and 6;
M is an integer selected from 2, 3 and 4 and m can take different values among the various groups-[NH-CS-NH- (CH) m ]-;
R ′ is represented by the general formula (II):
の基を表わし、
・Rは、水素原子又は上記で定義した一般式(II)の基のいずれかを表わし、nが1であり、及びlが0であるとき、少なくとも1個のR基は式(II)であることは明白であり、
・Xは、式(I)及び(II)において、1個から8個の炭素原子を含む飽和又は不飽和直鎖又は環状脂肪族基、メルカプトメチル(−CH2SH)基、又は選択的に次の群:
−(CH2)x−(CHOH)u−H[式中、xは1〜10から選択される整数であり、及びuは1、2、3、4、5及び6から選択される整数である]、又は選択的に、
−(OCH2CH2O)v−H[式中、vは、1、2及び3から選択される整数である]
から選択される親水鎖を表わし、1個以下の置換基Xは、式(I)及び(II)の両方において、親水鎖を表わすことは明白であり、
・Yはスペーサーを表わし、
・及びLは、
−N(R1)R2基[式中、R1とR2は、互いに独立して、水素原子又は選択的に脂肪族鎖を表わす]、又は選択的に式−(CH2)t−OZの基[式中、tは、11、12、13、14又は15から選択される整数を表わし、及びZは、糖、ポリオール又はPEGを表わす]、但し、R1及びR2の少なくとも1個は水素原子でないことは明白である、
・若しくは−OR3基[式中、R3はステロイド誘導体を表わす]
を表わす]
のトランスフェクション化合物である。
Represents the group of
R represents either a hydrogen atom or a group of general formula (II) as defined above, and when n is 1 and l is 0, at least one R group is of formula (II) It is clear that there is
X is a saturated or unsaturated linear or cycloaliphatic group containing 1 to 8 carbon atoms, a mercaptomethyl (—CH 2 SH) group, or selectively in formulas (I) and (II) Next group:
- (CH 2) x - ( CHOH) in u -H [wherein, x is an integer selected from 1 to 10, and u is an integer selected from 2, 3, 4, 5 and 6 Yes, or optionally,
— (OCH 2 CH 2 O) v —H [wherein v is an integer selected from 1, 2, and 3]
It is clear that no more than one substituent X represents a hydrophilic chain in both formulas (I) and (II),
Y represents a spacer,
・ And L are
-N (R 1 ) R 2 group, wherein R 1 and R 2 independently of one another represent a hydrogen atom or optionally an aliphatic chain, or selectively represented by the formula — (CH 2 ) t — A group of OZ wherein t represents an integer selected from 11, 12, 13, 14 or 15 and Z represents a sugar, polyol or PEG, provided that at least one of R 1 and R 2 It is clear that the pieces are not hydrogen atoms,
-Or-OR 3 group [wherein R 3 represents a steroid derivative]
Represents]
The transfection compound.
本発明によれば、「スペーサー」の語は、分子のポリチオ尿素部分と脂質部分の間の結合を提供すること、及びこれら2つの部分の間の望ましくない切断を減弱させるためにそれらを離して保持することの両方を可能にする化学基を意味すると理解される。好ましいスペーサーは、例えば、1個から6個の炭素原子を有するアルキル、ケトン、エステル、エーテル、アミド、アミジン、カルバメート又はチオカルバメート官能基、グリセロール、尿素、チオ尿素、又は芳香環から選択される1個又はそれ以上の化学官能基で構成されうる。例えば、スペーサーは、式:
−NH−C(O)−CH2−CH2−
又は、−(CH2)i−W−(CH2)j−
[式中、i及びjは、1から6まで(両端を含む)から選択される整数であり、及びWは、ケトン、エステル、エーテル、アミド、アミジン、カルバメート又はチオカルバメート官能基、グリセロール、尿素、チオ尿素、又は選択的に芳香環から選択される基である]
の群から選択されうる。
According to the present invention, the term “spacer” refers to providing a bond between the polythiourea part and the lipid part of the molecule and separating them in order to attenuate unwanted cleavage between these two parts. It is understood to mean a chemical group that allows both to be retained. Preferred spacers are, for example, 1 selected from alkyls having 1 to 6 carbon atoms, ketones, esters, ethers, amides, amidines, carbamates or thiocarbamate functional groups, glycerol, urea, thiourea, or aromatic rings. It can be composed of one or more chemical functional groups. For example, the spacer has the formula:
—NH—C (O) —CH 2 —CH 2 —
Or, - (CH 2) i -W- (CH 2) j -
Wherein i and j are integers selected from 1 to 6 (inclusive) and W is a ketone, ester, ether, amide, amidine, carbamate or thiocarbamate functional group, glycerol, urea , Thiourea, or a group optionally selected from aromatic rings]
Can be selected from the group of
本発明のために、「脂肪族鎖」の表現は、脂質特性を示すことを条件として、飽和又は不飽和で、任意に1個又はそれ以上のヘテロ原子を含む、10個から22個の炭素原子を有するアルキル基を意味すると理解される。好ましくは、それらは、10個から22個の炭素原子及び1、2又は3個の不飽和を含む直鎖又は分枝アルキル基である。好ましくは、前記アルキル基は、10、12、14、16、18、20又は22個の炭素原子を含む。より特定すると、脂肪族基、−(CH2)11CH3、−(CH2)13CH3、−(CH2)15CH3及び−(CH2)17CH3が挙げられよう。 For the purposes of the present invention, the expression “aliphatic chain” is from 10 to 22 carbons, saturated or unsaturated, optionally containing one or more heteroatoms, provided that they exhibit lipid properties. It is understood to mean an alkyl group having an atom. Preferably they are straight or branched alkyl groups containing 10 to 22 carbon atoms and 1, 2 or 3 unsaturations. Preferably, the alkyl group contains 10, 12, 14, 16, 18, 20, or 22 carbon atoms. More specifically, mention may be made of aliphatic groups, — (CH 2 ) 11 CH 3 , — (CH 2 ) 13 CH 3 , — (CH 2 ) 15 CH 3 and — (CH 2 ) 17 CH 3 .
「糖」の語は、本発明のために、1個又はそれ以上のサッカリドから成る分子を意味すると理解される。例として、ピラノース及びフラノースなどの糖類、例えばグルコース、マンノース、ラムノース、ガラクトース、フルクトース又は選択的にマルトース、ラクトース、サッカロース、スクロース、フコース、セロビオース、アロース、ラミナラビオース、ゲンチオビオース、ソフォロース、メリビオース等が挙げられるであろう。好ましくは、糖(類)は、グルコース、マンノース、ラムノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、サッカロース及びセロビオースから選択される。さらに、この語は、いわゆる「複合」糖質、すなわち互いに共有結合しているいくつかの糖も包含し、各々の糖は、好ましくは上記に列挙したリストから選択される。適切な多糖類として、デキストラン、α−アミロース、アミロペクチン、フルクタン、マンナン、キシラン及びアラビナンが挙げられよう。一部の好ましい糖は、さらに、例えばある種のレクチンのように、細胞受容体と相互作用しうる。 The term “sugar” is understood for the purposes of the present invention to mean a molecule consisting of one or more saccharides. Examples include sugars such as pyranose and furanose, such as glucose, mannose, rhamnose, galactose, fructose or optionally maltose, lactose, saccharose, sucrose, fucose, cellobiose, allose, laminarabiose, gentiobiose, soforose, melibiose, etc. I will. Preferably, the sugar (s) is selected from glucose, mannose, rhamnose, galactose, fructose, lactose, saccharose and cellobiose. Furthermore, the term also encompasses so-called “complex” carbohydrates, ie a number of sugars covalently linked to each other, each sugar preferably being selected from the list listed above. Suitable polysaccharides may include dextran, α-amylose, amylopectin, fructan, mannan, xylan and arabinan. Some preferred sugars can further interact with cellular receptors, such as certain lectins.
本発明によれば、「ポリオール」の語も、少なくとも2個のヒドロキシル官能基を含む直鎖、分枝又は環状炭化水素分子を意味すると理解される。例として、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、テトリトール、ペンチトール、環状ペンチトール(又はケルシトール)、マンニトール、ソルビトール、ダルシトール、環状ヘキシトール又はイノシトールなどのヘキシトール等が挙げられるであろう(Stanekら、The Monosaccharides Academic Press,621−655ページ及び778−855ページ)。好ましい態様に従えば、ポリオールは、一般式: According to the invention, the term “polyol” is also understood to mean a straight-chain, branched or cyclic hydrocarbon molecule containing at least two hydroxyl functions. Examples would include hexitols such as glycerol, ethylene glycol, propylene glycol, tetritol, pentitol, cyclic pentitol (or queritol), mannitol, sorbitol, dulcitol, cyclic hexitol or inositol (Stanek et al., The Monosaccharides). Academic Press, pages 621-655 and pages 778-855). According to a preferred embodiment, the polyol has the general formula:
のアルコールから選択される。
Selected from alcohol.
本発明による一般式(I)の化合物がポリエチレングリコール(PEG)基を含むとき、後者は一般に2個から120個、好ましくは2個から80個の−OCH2CH2O−単位を含む。これは、単純PEG、すなわちその鎖がヒドロキシル基で終わるもの、又はその末端基がアルキルから選択される、例えばメチルである、PEGを包含しうる。 When the compound of general formula (I) according to the invention contains a polyethylene glycol (PEG) group, the latter generally contains 2 to 120, preferably 2 to 80 —OCH 2 CH 2 O— units. This may include simple PEGs, ie those whose chain ends with a hydroxyl group, or PEG whose end group is selected from alkyl, for example methyl.
本発明のために、「ステロイド誘導体」の表現は、コレスタン型の多環式化合物を意味すると理解される。これらの化合物は、天然であるか又はそうでなくてもよく、より好ましくはコレステロール、コレスタノール、3−α−5−シクロ−5−α−コレスタン−6−β−オール、コール酸、ギ酸コレステリル、ギ酸コレスタニル、3α、5−シクロ−5α−コレスタン−6β−イルギ酸塩、コレステリルアミン、6−(1,5−ジメチルヘキシル)−3a,5a−ジメチルヘキサデカヒドロシクロペンタ[a]シクロプロパ[2,3]−シクロペンタ[1,2−f]ナフタレン−10−イルアミン、又はコレスタニルアミンから選択される。 For the purposes of the present invention, the expression “steroid derivative” is understood to mean a cholestane-type polycyclic compound. These compounds may or may not be natural, more preferably cholesterol, cholestanol, 3-α-5-cyclo-5-α-cholestan-6-β-ol, cholic acid, cholesteryl formate Cholestanyl formate, 3α, 5-cyclo-5α-cholestane-6β-ylformate, cholesterylamine, 6- (1,5-dimethylhexyl) -3a, 5a-dimethylhexadecahydrocyclopenta [a] cyclopropa [2 , 3] -cyclopenta [1,2-f] naphthalen-10-ylamine, or cholestanylamine.
本発明の好ましい変法に従えば、トランスフェクション化合物は、一般式(III): According to a preferred variant of the invention, the transfection compound has the general formula (III):
を有する。
Have
より好ましくは、本発明のトランスフェクション化合物は、一般式(IV): More preferably, the transfection compound of the present invention has the general formula (IV):
を有する。
Have
本発明がまた、一般式(I)の生成物の異性体が存在するときには一般式(I)の生成物の異性体、ならびにそれらの混合物も対象とすることは明白である。 Obviously, the present invention is also directed to product isomers of general formula (I), as well as mixtures thereof, when isomers of products of general formula (I) are present.
本発明による一般式(I)の化合物の製造は、次の段階を提示されている順序で又は他の何らかの既知の変法及び等しく適切な変法に従って使用して、当業者に周知である、溶液中又は保持体上での従来の有機合成手法を用いて、実施される。 The preparation of the compounds of general formula (I) according to the invention is well known to the person skilled in the art, using the following steps in the order presented or according to any other known and equally suitable variants: It is carried out using conventional organic synthesis techniques in solution or on a support.
1)脂質部分Lの製造
一般式(I)の化合物の脂質部分Lが−N(R1)R2基[式中、R1及び/又はR2は脂肪族鎖を表わす]によって表わされるときは、最初に、式HN(R1)R2のアミンを生成する。前記アミンは、一方が置換基R1を含み、他方が置換基R2を含む、カルボン酸とアミンを縮合して、対応するアミドを生成し、次にそのようにして得た前記アミドを還元することによって入手しうる。
1) Preparation of lipid moiety L When the lipid moiety L of the compound of general formula (I) is represented by the group -N (R 1 ) R 2 , wherein R 1 and / or R 2 represents an aliphatic chain Initially produces an amine of formula HN (R 1 ) R 2 . The amine, one containing the substituent R 1 and the other containing the substituent R 2 , condenses the carboxylic acid with the amine to produce the corresponding amide, and then reduces the amide so obtained Can be obtained by
アミドの生成は、成分を混合し、当該物質の融点より高い温度、一般には20℃から200℃に加熱して融解し、その後媒質を脱水して生成された水を除去することによって、又はより好都合には、例えば五酸化リンのような乾燥剤又は水分を吸収することができる他の何らかの物質の存在下で、好都合に実施される。この中間体アミドの生成はまた、この方法の変法を使用して、若しくはカルボン酸又はそれらの誘導体を含む、アミド(例えばペプチド共役型のような)を生成するためのもう1つ別の方法を使用して、及び当業者に周知の条件及び試薬を変化させて[R.C.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers]実施しうる。 Formation of the amide can be accomplished by mixing the ingredients and melting by heating to a temperature above the material's melting point, typically 20 ° C. to 200 ° C., and then dehydrating the medium to remove the generated water, or more. Conveniently, it is conveniently performed in the presence of a desiccant such as phosphorous pentoxide or some other substance that can absorb moisture. The production of this intermediate amide is also another method for producing amides (such as, for example, peptide conjugates) using variations of this method or containing carboxylic acids or their derivatives. And varying conditions and reagents well known to those skilled in the art [R. C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers].
前記で得たアミドの、式HN(R1)R2のアミンへの還元は、例えば水素化アルミニウムウリチウムなどの還元剤、若しくはこの場合に有効な他の何らかの水素化物又は還元剤を使用して実施しうる。その手順は、好ましくは、溶媒の沸点より低い温度で又は無水及び/又は不活性ガス体下に、非プロトン性溶媒(例えばテトラヒドロフラン又はエーテル)中で実施する。 Reduction of the amide obtained above to an amine of formula HN (R 1 ) R 2 uses a reducing agent such as, for example, aluminum hydride hydride, or any other hydride or reducing agent effective in this case. Can be implemented. The procedure is preferably carried out in an aprotic solvent (eg tetrahydrofuran or ether) at a temperature below the boiling point of the solvent or under anhydrous and / or inert gas bodies.
もう1つの変法に従えば、HN(R1)R2と称される脂質部分は、市販のものを入手してもよい。 According to another variant, the lipid moiety designated HN (R 1 ) R 2 may be obtained commercially.
R1及び/又はR2が式−(CH2)t−OZの基を表わすとき、手順は、アルキル部分を生成するために上述したように実施し、その後、当業者に既知の従来の手法に従って市販のPEG、ポリオール又は糖と単純カップリングする。 When R 1 and / or R 2 represents a group of formula — (CH 2 ) t —OZ, the procedure is carried out as described above to produce the alkyl moiety, followed by conventional techniques known to those skilled in the art. Simple coupling with commercially available PEG, polyol or sugar according to
一般式(I)の化合物の脂質部分Lが−OR3基で表わされるとき、後者は、好ましくは市販の製品から選択される。 When the lipid moiety L of the compound of general formula (I) is represented by a —OR 3 group, the latter is preferably selected from commercially available products.
2)スペーサーYの連結
次に、先の段階で得た脂質部分Lに、当業者に既知の従来の手法に従ってスペーサーLを結合する。好ましい変法に従えば、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン又は他の何らかのエーテルのような適切な溶媒中、溶媒の沸点より低い温度で、及び無水及び/又は不活性ガス体下に、脂質部分LをN−アシル化してアミド結合を形成する。この反応は、好ましくは、N,N−ジメチルアミノピリジンのようなアミン含有塩基の存在下で、若しくはトリエチルアミン又はエチルジイソプロピルアミンのような非求核アミン含有塩基と混合したこの塩基の存在下で実施する。ピリジンも、単独で又はもう1つ別の塩基と混合して使用するか、上述した溶媒の1つで希釈してもよく、若しくはそれ自体を溶媒として使用してもよい。
2) Ligation of spacer Y Next, the spacer L is bound to the lipid portion L obtained in the previous step according to a conventional method known to those skilled in the art. According to a preferred variant, the lipid moiety L is N in a suitable solvent such as dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran or some other ether at a temperature below the boiling point of the solvent and under anhydrous and / or inert gas. Acylation to form an amide bond. This reaction is preferably carried out in the presence of an amine-containing base such as N, N-dimethylaminopyridine or in the presence of this base mixed with a non-nucleophilic amine-containing base such as triethylamine or ethyldiisopropylamine. To do. Pyridine can also be used alone or mixed with another base, diluted with one of the solvents mentioned above, or itself as a solvent.
3)ポリチオ尿素鎖の形成
一般式(I)の化合物の合成の第三の部分は、チオ尿素単位の連続的な導入である。これは、所望ポリチオ尿素部分を得るために必要な回数だけ反復しうる一連の反応において実施する。好ましい方法によれば、その手順は次のような実施する:
A)最初に、先の段階で得たY−C(O)−Lに、−HN−(CHR)m−基の成員の形態で単位の最初の部分を連結する。そのために、手順は、カップリング剤、例えば、保持されているか又は保持されていない、1−ベンゾトリアゾリルオキシトリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP)、1−ベンゾトリアゾリルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)、O−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート又はテトラフルオロボレート(HBTU又はTBTU)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミドヒドロクロリド(EDC)、又は1−(3−トリメチルアンモニオプロピル)−3−エチルカルボジイミドヨージドの存在下に、ジアミンを含有する、式H2N−(CHR)m−NH2の成員から出発して好都合に実施される。このカップリングは、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン又は他の何らかのエーテルのような適切な溶媒中、溶媒の沸点より低い温度で、及び無水及び/又は不活性ガス体下で実施する。この手順はまた、非求核アミン含有塩基、例えばエチルジイソプロピルアミン、トリエチルアミン又はトリイソプロピルアミンの存在下でも実施される。脂質部分とスペーサーの性質が適合性であれば、SCN−(CHR)m−型の配列又は前駆体を連結することができ、それによって、下記のC)で述べるような段階を通して合成を継続することが可能となる。
3) Formation of polythiourea chains The third part of the synthesis of compounds of general formula (I) is the continuous introduction of thiourea units. This is performed in a series of reactions that can be repeated as many times as necessary to obtain the desired polythiourea moiety. According to a preferred method, the procedure is carried out as follows:
A) First, the first part of the unit is linked to the YC (O) -L obtained in the previous step in the form of a member of the -HN- (CHR) m- group. To that end, the procedure is based on coupling agents such as 1-benzotriazolyloxytris (pyrrolidino) phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), 1-benzotriazolyloxytris (retained or not retained). Dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP), O- (1H-benzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate or tetrafluoroborate (HBTU or TBTU) In the presence of dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC), or 1- (3-trimethylammoniopropyl) -3-ethylcarbodiimide iodide, Containing an amine is conveniently carried out starting from members of the
B)次に、先の段階で得た生成物を、好ましい手法に従って、二硫化炭素(CS2)で又はそのような官能性を得るための当業者に既知の他の試薬で処理することによってイソチオシアネートに変換する[H.Ulrich,イソシアネートの化学と技術(Chemistry and Technology of Isocyanates),Wiley(1996)、イソシアネートの化学とそのチオ誘導体(The Chemistry of Cyanates and their Thio Derivatives),S.Patai編集、Wiley(1977)、S.Ozaki,イソシアネート化学の近年の進歩(Recent Advances in Isocyanate Chemistry),Chem.Rev.72,457(1972)]。この反応は、例えばテトラヒドロフラン又は他の適合性エーテル溶媒のような溶媒中、冷却混合物の温度から約20℃までの間の温度で好都合に実施される。この手順はまた、反応を促進する及び/又は反応中に放出される硫化水素を捕獲することができる試薬、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)の存在下でも実施される。 B) The product obtained in the previous step is then treated with carbon disulfide (CS 2 ) or with other reagents known to those skilled in the art for obtaining such functionality, according to a preferred procedure. Convert to isothiocyanate [H. Ulrich, Chemistry and Technology of Isocyanates, Wiley (1996), Isocyanate Chemistry and its Thio Derivatives (The Chemistry of Cyanates and the Thier Thiev.). Patai, Wiley (1977), S.A. Ozaki, Recent Advances in Isocyanate Chemistry, Chem. Rev. 72,457 (1972)]. This reaction is conveniently carried out in a solvent such as tetrahydrofuran or other compatible ether solvent at a temperature between the temperature of the cooled mixture and up to about 20 ° C. This procedure is also performed in the presence of a reagent that can accelerate the reaction and / or capture hydrogen sulfide released during the reaction, such as dicyclohexylcarbodiimide (DCC).
C)次に、適切な場合には、式−(CHR)m−のもう1つのセグメントを導入できるように、先の段階で得たイソチオシアネートからチオ尿素単位を生成する。好都合には、任意に保護された、式H2N−(CHR)m−NH2のジアミンを、その中性形態又は酸性塩の形態で、先の形態で得たイソチオシアネートと反応させる。この反応は、任意に、非求核アミン含有基、例えばトリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、トリイソプロピルアミン又は1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク−7−エン(DBU)の存在下で実施する。その手順は、好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン又は他の適合性のエーテル又は溶媒のような適切な溶媒中、冷却混合物の温度から溶媒の還流温度までの間でありうる温度で実施する。 C) Next, if appropriate, thiourea units are generated from the isothiocyanate obtained in the previous step so that another segment of the formula — (CHR) m — can be introduced. Conveniently, an optionally protected diamine of formula H 2 N— (CHR) m —NH 2 is reacted with the isothiocyanate obtained in the previous form in its neutral or acidic salt form. This reaction is optionally carried out in the presence of a non-nucleophilic amine-containing group such as triethylamine, ethyldiisopropylamine, triisopropylamine or 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU). To do. The procedure is preferably carried out in a suitable solvent such as dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran or other compatible ether or solvent at a temperature that can be between the temperature of the cooled mixture and the reflux temperature of the solvent.
所望単位をnコピー数分導入できるように、所望構造が得られるまで連続的に必要なだけ上述した段階B)及びC)を反復する。分枝構造を得るには、前記の手順を、適切な時点で、式(II)で述べた置換基Rを得るために必要な分子を導入することによって同様に実施する。 Steps B) and C) described above are repeated continuously as necessary until the desired structure is obtained so that n copies of the desired unit can be introduced. To obtain a branched structure, the above procedure is similarly performed by introducing the molecules necessary to obtain the substituent R described in formula (II) at the appropriate time.
4)置換基Xを導入することによるポリチオ尿素部分の末端
ポリチオ尿素型の鎖の末端を生成する最後の段階は、置換基Xを導入することである。そのために、置換基Xの性質に従って選択される、当業者に既知である従来の連結方法を使用する。例えば、Xがアルキルを表わすときは、必要であれば、例えばトリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、トリイソプロピルアミン又は1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク−7−エン(DBU)のような非求核アミン含有塩基の存在下で、アルキルイソチオシアネートを反応させることによって手順を実施する。その反応は、適切な溶媒中、例えばジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン又は他の適合性エーテル中、冷却混合物の温度から溶媒の還流温度までの温度で実施する。
4) End of polythiourea moiety by introducing substituent X The final step in generating the end of the polythiourea type chain is to introduce the substituent X. To that end, conventional linking methods known to those skilled in the art, selected according to the nature of the substituent X, are used. For example, when X represents alkyl, if necessary, a non-ethyl such as triethylamine, ethyldiisopropylamine, triisopropylamine or 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU). The procedure is carried out by reacting the alkyl isothiocyanate in the presence of a nucleophilic amine-containing base. The reaction is carried out in a suitable solvent, such as dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran or other compatible ether, at a temperature from the temperature of the cooled mixture to the reflux temperature of the solvent.
当然ながら、様々な置換基が反応に干渉しうるときには、分子の残りの部分に影響を及ぼすことなく配置し、除去することができる適合性の基であらかじめ保護することが好ましい。そのために、当業者に既知の従来の方法に従って、特にT.W.Greene,有機合成における保護基(Protective Groups in Organic Synthesis),Wiley−Interscience、McOmie,有機化学における保護基(Protective Groups in Organic Chemistry),Plenum Press、又はP.J.Kocienski,保護基(Protecting Groups),Thiemeの中で述べられている方法に従って、手順を実施する。 Of course, when various substituents can interfere with the reaction, it is preferable to pre-protect with compatible groups that can be placed and removed without affecting the rest of the molecule. For this purpose, in particular according to conventional methods known to the person skilled in the art W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis (Protective Groups in Organic Synthesis), Wiley-Interscience, McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry (Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum. J. et al. The procedure is performed according to the method described in Kocienski, Protecting Groups, Thimeme.
さらに、製造方法の各々の段階のあとに、適切な場合には、当業者に既知の何らかの方法に従って得た化合物を分離し、精製するための段階を実施してもよい。 Furthermore, after each step of the production process, if appropriate, steps may be performed to separate and purify the compound obtained according to any method known to those skilled in the art.
本発明による好ましい化合物は:
ここではDTTU又はDT−3TUと称する、3−(2−{3−[2−(3−{2−[3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ]エチル}チオウレイド)エチル]チオウレイド}エチル)−1−メチルチオ尿素は、一般式(I)[式中、X=−CH3;m=2;R=H;n=3;l=0;Y=NH−CO−CH2−CH2;及びL=−N(R1)R2[式中、R1=R2=C14H29]である]に対応する。この化合物のDT−3TUという名称は、その中に含まれる3個のチオ尿素基を指す;さらに、この命名法の例は、4個のチオ尿素を含むDT−4TU、2個のチオ尿素を含むDT−2TU等々を含む。
Preferred compounds according to the invention are:
3- (2- {3- [2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] ethyl} thioureido) ethyl] thioureido} ethyl), referred to herein as DTTU or DT-3TU)- 1-methylthiourea has the general formula (I) [wherein X = —CH 3 ; m = 2; R = H; n = 3; l = 0; Y = NH—CO—CH 2 —CH 2 ; Corresponds to L = —N (R 1 ) R 2 , where R 1 = R 2 = C 14 H 29 ]. The name DT-3TU of this compound refers to the three thiourea groups contained therein; further, an example of this nomenclature is DT-4TU containing 4 thioureas, 2 thioureas. Including DT-2TU etc.
3−(2−{3−[2−(3−{2−[3−(2−{3−[ジテトラデシルカルバモイル]プロピオニルアミノ}−エチル)−チオウレイド]−エチル}−チオウレイド)−エチル]−チオウレイド}−エチル)−1−メチルチオ尿素又はDT−4TUは、一般式(I)[式中、X=−CH3;m=2;R=H;n=4;l=0;Y=NH−CO−CH2−CH2;及びL=−N(R1)R2[式中、R1=R2=C14H29]である]に一致する。 3- (2- {3- [2- (3- {2- [3- (2- {3- [Ditetradecylcarbamoyl] propionylamino} -ethyl) -thioureido] -ethyl} -thioureido) -ethyl] - thioureido} - ethyl) -1-methylthiourea or DT-4TU the general formula (I) [wherein, X = -CH 3; m = 2; R = H; n = 4; l = 0; Y = NH—CO—CH 2 —CH 2 ; and L = —N (R 1 ) R 2 , where R 1 = R 2 = C 14 H 29 ].
DT−3TUジオール又は[2−(3−{2−[3−(2−{3−[2−(3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ)−エチル]−チオウレイド}−エチル)−チオウレイド]−エチル}−チオウレイド)−エチル]−プロパン−1,2−ジオールの合成は、一般式(I)[式中、 DT-3TU diol or [2- (3- {2- [3- (2- {3- [2- (3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino) -ethyl] -thioureido} -ethyl) -thioureido] -Ethyl} -thioureido) -ethyl] -propane-1,2-diol was synthesized according to the general formula (I) [wherein
DT−2TUジオール又は[2−(3−{2−[3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ]−エチル}−チオウレイド)−エチル]−プロパン−1,2−ジオールは、一般式(I)[式中、 DT-2TU diol or [2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] -ethyl} -thioureido) -ethyl] -propane-1,2-diol has the general formula (I) [Where:
本発明のもう1つの対象は、本発明によるトランスジェニック化合物と核酸を含有する組成物に関する。各々の成分のそれぞれの量は、使用するトランスフェクション化合物、核酸及び所望適用(特にトランスフェクトする細胞型)に応じて、当業者によって容易に調整されうる。 Another subject of the invention relates to a composition comprising a transgenic compound according to the invention and a nucleic acid. The respective amounts of each component can be readily adjusted by those skilled in the art depending on the transfection compound, nucleic acid used and the desired application (particularly the cell type to be transfected).
本発明のために、「核酸」の表現は、デオキシリボ核酸及びリボ核酸の両方を意味すると理解される。それらは、天然又は人工配列、特にゲノムDNA(gDNA)、相補的DNA(cDNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、DNA/RNAキメロプラスト又は合成又は半合成配列のようなハイブリッド配列、及び修飾された又は修飾されていないオリゴヌクレオチドでありうる。これらの核酸は、ヒト、動物、植物、細菌又はウイルス由来等でありうる。それらは、当業者に既知の何らかの手法によって、特にライブラリーのスクリーニングによって、化学合成によって、又はライブラリーのスクリーニングによって得た配列の化学修飾又は酵素的修飾を含む混合方法によって入手しうる。それらは化学修飾されていてもよい。一般に、それらは少なくとも10、20、50又は100個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも200個の連続ヌクレオチドを含む。さらに一層好ましくは、それらは少なくとも500個の連続ヌクレオチドを含む。 For the purposes of the present invention, the expression “nucleic acid” is understood to mean both deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid. They are natural or artificial sequences, in particular genomic DNA (gDNA), complementary DNA (cDNA), messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), ribosomal RNA (rRNA), DNA / RNA chimeroplasts or synthetic or semi-synthetic sequences As well as modified and unmodified oligonucleotides. These nucleic acids can be derived from humans, animals, plants, bacteria or viruses. They can be obtained by any technique known to the person skilled in the art, in particular by screening a library, by chemical synthesis, or by mixed methods involving chemical or enzymatic modification of sequences obtained by library screening. They may be chemically modified. In general, they comprise at least 10, 20, 50 or 100 consecutive nucleotides, preferably at least 200 consecutive nucleotides. Even more preferably, they comprise at least 500 contiguous nucleotides.
より特定のデオキシリボ核酸に関して、それらは一本鎖又は二本鎖のいずれでもよく、ならびに短いオリゴヌクレオチド又はより長い配列のいずれでもよい。特に、該核酸は、好都合にはプラスミド、ベクター、エピソーム、発現カセット等から成る。これらのデオキシリボ核酸は、標的細胞において機能性であるか又はそうでない原核生物又は真核生物複製基点、1個又はそれ以上のマーカー遺伝子、転写又は複製を調節するための配列、治療的重要性を持つ遺伝子、修飾されている又は修飾されていないアンチセンス配列、他の細胞成分に結合するための領域等を担いうる。 For more specific deoxyribonucleic acids, they can be either single stranded or double stranded, as well as either short oligonucleotides or longer sequences. In particular, the nucleic acid conveniently consists of a plasmid, vector, episome, expression cassette and the like. These deoxyribonucleic acids are prokaryotic or eukaryotic replication sites that are functional or not in the target cell, one or more marker genes, sequences for regulating transcription or replication, therapeutic importance. It may carry a gene, a modified or unmodified antisense sequence, a region for binding to other cellular components, and the like.
好ましくは、該核酸は、調節配列の制御下の1個又はそれ以上の治療的重要性を持つ遺伝子、例えば1個又はそれ以上のプロモーター及び標的細胞において活性な転写終結信号を含む。 Preferably, the nucleic acid comprises one or more genes of therapeutic importance under the control of regulatory sequences, such as one or more promoters and a transcription termination signal active in the target cell.
本発明のために、治療的重要性を持つ遺伝子の表現は、特に治療作用を有するタンパク質産物をコードする遺伝子を意味すると理解される。そのようにコードされるタンパク質産物は、特にタンパク質又はペプチドでありうる。このタンパク質産物は、標的細胞に関して外来性、相同性又は内因性でありうる、すなわち標的細胞が病的状態を有していないとき、標的細胞において正常に発現される産物でありうる。この場合、タンパク質の発現は、例えば、細胞における不十分な発現又は修飾のために不活性であるか又は活性が低いタンパク質の発現を補うこと、若しくは前記タンパク質を過剰発現することを可能にする。治療的重要性を有する遺伝子はまた、高い安定性、変化した活性等を有する、細胞タンパク質の突然変異体をコードしうる。前記タンパク質産物はまた、標的細胞に関して非相同でもよい。この場合、発現されるタンパク質は、例えば、細胞において欠損している活性を補足するか又は提供して、細胞が病的状態に対抗することを可能にするか、若しくは免疫応答を刺激しうる。 For the purposes of the present invention, the expression of a gene of therapeutic importance is understood to mean a gene that encodes a protein product that has a particular therapeutic action. The protein product so encoded can in particular be a protein or peptide. The protein product can be foreign, homologous or endogenous with respect to the target cell, i.e., a product that is normally expressed in the target cell when the target cell has no pathological condition. In this case, the expression of the protein makes it possible, for example, to compensate for the expression of a protein that is inactive or less active due to insufficient expression or modification in the cell, or to overexpress the protein. Genes with therapeutic importance can also encode mutants of cellular proteins with high stability, altered activity, and the like. The protein product may also be heterologous with respect to the target cell. In this case, the expressed protein may, for example, complement or provide a deficient activity in the cell, allowing the cell to combat a pathological condition, or stimulate an immune response.
本発明のための治療的生成物の中で、より特定すると、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン及びサイトカインならびにそれらの阻害因子又は拮抗物質:インターロイキン、インターフェロン、TNF、インターロイキン1の拮抗物質、インターロイキン1又はTNFαの可溶性受容体等(FR92/03120号)、成長因子、神経伝達物質又はそれらの前駆体又は合成酵素、栄養因子(BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、HARP/プレイオトロフィン等)、アポリポタンパク質(ApoAI、ApoAIV、ApoE等、FR93/05125号)、ジストロフィン又はミニジストロフィン(FR91/11947号)、嚢胞性線維症に関連するCFTRタンパク質、癌抑制遺伝子(p53、Rb、Rap1A、DCC、k−rev等、FR93/04745号)、凝固に関わる因子(第VII、VIII、IX因子)をコードする遺伝子、DNA修復に関わる遺伝子、自殺遺伝子(チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ)、ヘモグロビン又は他のタンパク質担体に関する遺伝子、代謝酵素、異化酵素等が挙げられよう。
Among the therapeutic products for the present invention, more particularly enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines and cytokines and their inhibitors or antagonists: interleukins, interferons, TNF, antagonists of
治療的重要性を持つ核酸はまた、標的細胞におけるその発現が遺伝子の発現又は細胞mRNAの転写を制御することを可能にする、遺伝子又はアンチセンス配列又はリボソーム機能を有するRNAをコードするDNAでありうる。そのような配列は、例えば、欧州特許欧州特許第140308号に述べられている手法に従って、標的細胞内で細胞mRNAに相補的なRNAに転写されて、それらがタンパク質へと翻訳されるのを遮断することができる。治療遺伝子はまた、標的RNAを選択的に破壊することができるリボザイムをコードする配列を含む(欧州特許第321201号)。 Nucleic acids of therapeutic importance are also DNA encoding RNAs with gene or antisense sequences or ribosomal functions that allow their expression in target cells to control gene expression or cellular mRNA transcription sell. Such sequences are transcribed into RNA complementary to cellular mRNA in the target cell and block them from being translated into proteins, for example according to the procedures described in European Patent EP 140308 can do. The therapeutic gene also includes a sequence encoding a ribozyme capable of selectively destroying the target RNA (European Patent No. 321201).
上述したように、該核酸はまた、ヒト又は動物において免疫応答を生じることができる抗原性ペプチドをコードする1個又はそれ以上の遺伝子を含みうる。この特定実施形態において、本発明は、ワクチンの生産又は、特に感染、例えばウイルス又は細菌感染、若しくは癌状態を治療する又は予防するために、ヒト又は動物に適用される免疫療法処置の実施を可能にする。それらは特に、エプスタイン−バーウイルス、HIVウイルス、B型肝炎ウイルス(欧州特許第185573号)、仮性狂犬病ウイルス、シンシチウム(合胞体)形成ウイルス、他のウイルスに特異的な抗原性ペプチド、又は腫瘍に特異的な抗原性ペプチド(欧州特許第259212号)でありうる。 As noted above, the nucleic acid can also include one or more genes that encode antigenic peptides capable of generating an immune response in humans or animals. In this particular embodiment, the present invention allows the production of vaccines, or in particular immunotherapy treatments applied to humans or animals to treat or prevent infections, such as viral or bacterial infections, or cancer conditions. To. They are particularly suitable for Epstein-Barr virus, HIV virus, hepatitis B virus (European Patent No. 185573), pseudorabies virus, syncytium-forming virus, antigenic peptides specific to other viruses, or tumors. It can be a specific antigenic peptide (European Patent No. 259212).
好ましくは、該核酸はまた、所望細胞又は器官において、治療的重要性を持つ遺伝子及び/又は抗原性ペプチドをコードする遺伝子の発現を可能にする配列を含む。それらは本来、これらの配列が感染細胞において機能することができるとき、考慮される遺伝子の発現の責任を担う配列でありうる。それらはまた、異なる由来の(他のタンパク質の発現の責任を担う、又はさらには合成の)配列でありうる。特に、それらは真核生物又はウイルス遺伝子のプロモーター配列でありうる。例えば、それらは、感染を所望する細胞のゲノムから誘導されるプロモーター配列でありうる。同様に、それらはウイルスのゲノムから誘導されるプロモーター配列でありうる。これに関しては、例えば、E1A、MLP、CMV及びRSV遺伝子のプロモーター等が挙げられるであろう。さらに、これらの発現配列は、活性化配列又は調節配列の付加等によって修飾されうる。そのプロモーターはまた、誘導的又は抑制的でありうる。 Preferably, the nucleic acid also includes sequences that allow expression of genes of therapeutic importance and / or genes encoding antigenic peptides in the desired cell or organ. They can be sequences that are primarily responsible for the expression of the gene under consideration when these sequences are capable of functioning in infected cells. They can also be sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic). In particular, they can be promoter sequences of eukaryotic or viral genes. For example, they can be promoter sequences derived from the genome of the cell in which infection is desired. Similarly, they can be promoter sequences derived from the viral genome. In this regard, for example, promoters of E1A, MLP, CMV and RSV genes may be mentioned. Further, these expression sequences can be modified by adding an activation sequence or a regulatory sequence. The promoter can also be inducible or repressive.
さらに、該核酸はまた、特に治療的重要性を持つ遺伝子の上流に、標的細胞の分泌経路において治療的生成物の合成を指令するシグナル配列を含みうる。このシグナル配列は、治療的生成物の天然シグナル配列でありうるが、他の何らかの機能的シグナル配列又は人工シグナル配列であってもよい。該核酸はまた、合成された治療的生成物を細胞の特定画分へと指令するシグナル配列も含みうる。 In addition, the nucleic acid may also contain a signal sequence that directs synthesis of a therapeutic product in the secretory pathway of the target cell, upstream of a gene of particular therapeutic importance. This signal sequence may be the natural signal sequence of the therapeutic product, but may be some other functional signal sequence or an artificial signal sequence. The nucleic acid can also include a signal sequence that directs the synthesized therapeutic product to a specific fraction of the cell.
本発明による組成物は、さらに、トランスフェクション化合物/核酸複合体と組み合わせて、そのトランスフェクション力を改善することができる1つ又はそれ以上のアジュバントを含有しうる。もう1つの実施形態では、本発明はそれ故、核酸、上記で定義したトランスフェクション化合物、及びトランスフェクション化合物/核酸複合体と組み合わせてそのトランスフェクション力を改善することができる少なくとも1つのアジュバントを含有する組成物に関する。この種のアジュバント(例えば脂質、ペプチド、タンパク質又はポリマー)の存在は、好都合にも、前記化合物のトランスフェクション力を高めることを可能にしうる。これに関して、本発明の組成物は、アジュバントとして、特に脂質凝集物を形成する特性を有する1つ又はそれ以上の中性脂質を含有しうる。「脂質凝集物」の語は、あらゆる種類のリポソーム(単層及び多重膜の両方)ならびにミセル又はより無定形の凝集物を包含する総称名である。 The composition according to the present invention may further contain one or more adjuvants that can be combined with the transfection compound / nucleic acid complex to improve its transfection ability. In another embodiment, the present invention therefore contains at least one adjuvant capable of improving its transfection ability in combination with a nucleic acid, a transfection compound as defined above, and a transfection compound / nucleic acid complex. It relates to a composition. The presence of this type of adjuvant (eg lipid, peptide, protein or polymer) may advantageously allow to increase the transfection power of the compound. In this regard, the composition of the invention may contain one or more neutral lipids as adjuvants, in particular with the property of forming lipid aggregates. The term “lipid aggregate” is a generic name encompassing all types of liposomes (both monolayer and multilamellar) and micelles or more amorphous aggregates.
より好ましくは、本発明の枠内で使用する中性脂質は、2つの脂肪鎖を含む脂質である。特に好都合には、生理的条件下で両性イオン性であるか又はイオン電荷を持たない天然又は合成脂質を使用する。それらは、より特定すると、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、ジ−ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジ−ミリストイルホスファチジルエタノールアミンならびに1回から3回N−メチル化されているそれらの誘導体、ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド(特にガラクトセレブロシドなど)、スフィンゴ脂質(特にスフィンゴミエリンなど)、又はアシアロガングリオシド(特にアシアロGM1及びGM2など)から選択されうる。好都合には、本発明に関して使用する脂質アジュバントは、DOPE、DOPC又はコレステロールから選択される。 More preferably, the neutral lipid used within the framework of the present invention is a lipid comprising two fatty chains. Particularly advantageously, natural or synthetic lipids are used which are zwitterionic under physiological conditions or have no ionic charge. They are more specifically dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), oleoyl palmitoylphosphatidylethanolamine (POPE), di-stearoylphosphatidylethanolamine, di-palmitoylphosphatidylethanolamine, di-myristoylphosphatidylethanolamine and once Derivatives thereof that are N-methylated three times from phosphatidylglycerol, diacylglycerol, glycosyl diacylglycerol, cerebroside (especially galactocerebroside), sphingolipids (especially sphingomyelin), or asialogangliosides (especially asialo GM1 and GM2) Etc.). Conveniently, the lipid adjuvant used in connection with the present invention is selected from DOPE, DOPC or cholesterol.
これらの様々な脂質は、当業者に周知の従来の手法により、合成によって若しくは器官(例えば脳)又は卵からの抽出によって、入手しうる。特に、天然脂質の抽出は有機溶媒によって実施しうる(Lehninger,Biochemistryも参照のこと)。 These various lipids can be obtained by conventional techniques well known to those skilled in the art, by synthesis or by extraction from organs (eg brain) or eggs. In particular, the extraction of natural lipids can be carried out with organic solvents (see also Lehninger, Biochemistry).
好ましくは、本発明の組成物は、モル/モルで核酸1当量につき0.01当量から20当量のアジュバント、より好ましくは0.5モル当量から5モル当量を含有する。 Preferably, the compositions of the present invention contain 0.01 to 20 equivalents of adjuvant, more preferably 0.5 to 5 molar equivalents per equivalent of nucleic acid in moles / mole.
もう1つの選択法に従えば、本発明による組成物のトランスフェクション力を改善することを可能にする上述したアジュバント、特にペプチド、タンパク質又はポリエチレングリコールのようなある種のポリマーは、本発明によるトランスフェクション化合物と、単に混合するのではなく複合してもよい。この場合、それらは、一般式(I)における置換基Xに、又はアルキル鎖が脂肪族鎖であるときにはアルキル鎖R1及び/又はR2の末端に、共有結合される。また、コレステロールに共有結合したポリエチレングリコール(chol−PEG)をアジュバントとして使用することも好都合である。実際に、そのようなアジュバントを本発明によるトランスフェクション組成物と共に使用するとき、生じる粒子はより小さなサイズを有しており、それによってそれらの凝集を低下させ、血液循環におけるそれらの半減期を上昇させる。本発明により使用するトランスフェクタントDT−3TUの量は、粒子が500nm未満の大きさを有するような量である。使用するDT−3TUの好ましい量は、少なくとも40nmolの脂質DT−3TU/μgDNA
に等しい(下記の実施例11、13及び14参照)。
According to another selection method, certain polymers such as the above mentioned adjuvants, in particular peptides, proteins or polyethylene glycol, which make it possible to improve the transfection power of the composition according to the invention, The compound may be combined with the reaction compound instead of simply mixing. In this case, they are covalently bonded to the substituent X in the general formula (I) or to the end of the alkyl chain R 1 and / or R 2 when the alkyl chain is an aliphatic chain. It is also advantageous to use polyethylene glycol (chol-PEG) covalently bound to cholesterol as an adjuvant. Indeed, when such adjuvants are used with the transfection compositions according to the invention, the resulting particles have a smaller size, thereby reducing their aggregation and increasing their half-life in the blood circulation. Let The amount of transfectant DT-3TU used according to the invention is such that the particles have a size of less than 500 nm. The preferred amount of DT-3TU used is at least 40 nmol of lipid DT-3TU / μg DNA
(See Examples 11, 13 and 14 below).
特に好都合な実施形態によれば、本発明の組成物は、さらに、核酸の導入を方向づけることを可能にする標的エレメントを含む。この標的エレメントは、核酸の導入をある種の細胞型又はある種の所望組織(腫瘍細胞、肝細胞、造血細胞等)へと方向づけることを可能にする細胞外標的エレメントでありうる。それはまた、核酸の導入をある種の好ましい細胞画分(ミトコンドリア、核等)へと方向づけることを可能にする細胞内標的エレメントでありうる。標的エレメントは、本発明によるトランスフェクション化合物及び核酸と混合してもよく、この場合、標的エレメントは、好ましくは脂肪アルキル鎖(少なくとも10個の炭素原子)又はポリエチレングリコールに共有結合する。もう1つの選択法に従えば、標的エレメントは、置換基X又はスペーサーYのレベルで、若しくはR1及び/又はR2が脂肪族鎖を表わすときはR1及び/又はR2の末端で、本発明によるトランスフェクション化合物に共有結合する。最後に、標的エレメントはまた、上記で規定したとおりである核酸に結合しうる。 According to a particularly advantageous embodiment, the composition according to the invention further comprises a target element which makes it possible to direct the introduction of nucleic acids. This target element can be an extracellular target element that allows the introduction of the nucleic acid to be directed to certain cell types or certain desired tissues (tumor cells, hepatocytes, hematopoietic cells, etc.). It can also be an intracellular targeting element that allows the introduction of nucleic acids to be directed to certain preferred cell fractions (mitochondria, nuclei, etc.). The target element may be mixed with the transfection compound and nucleic acid according to the present invention, in which case the target element is preferably covalently linked to a fatty alkyl chain (at least 10 carbon atoms) or polyethylene glycol. According to another selection method, the target element is at the level of substituent X or spacer Y, or at the end of R 1 and / or R 2 when R 1 and / or R 2 represents an aliphatic chain, Covalently binds to the transfection compound according to the invention. Finally, the target element can also bind to a nucleic acid as defined above.
本発明の枠内で使用しうる標的エレメントの中でも特に、糖、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、脂質、神経伝達物質、ホルモン、ビタミン又はそれらの誘導体が挙げられるであろう。好ましくは、それらは、糖、ペプチド、ビタミン、又は例えば抗体又は抗体フラグメント、細胞受容体のリガンド又はそのフラグメント、受容体又は受容体フラグメントなどのタンパク質である。例えば、それらは、成長因子受容体のリガンド、サイトカイン受容体、細胞レクチン型受容体、葉酸塩受容体、又はインテグリンのような接着タンパク質についての受容体に親和性を有するRGD配列含有リガンドでありうる。また、トランスフェリン、HDL及びLDLについての受容体、又は葉酸輸送体も挙げられよう。標的エレメントはまた、シアリルルイスX、又は選択的に抗体のFabフラグメント、又は一本鎖抗体(ScFv)などの、アシアロ糖タンパク質又はシアリドについての受容体のようなレクチンを標的することを可能にする糖でありうる。 Among the target elements that can be used within the framework of the present invention, mention may be made of sugars, peptides, proteins, oligonucleotides, lipids, neurotransmitters, hormones, vitamins or derivatives thereof. Preferably they are sugars, peptides, vitamins or proteins such as antibodies or antibody fragments, ligands of cell receptors or fragments thereof, receptors or receptor fragments. For example, they can be growth factor receptor ligands, cytokine receptors, cellular lectin-type receptors, folate receptors, or RGD sequence-containing ligands that have an affinity for receptors for adhesion proteins such as integrins. . There may also be receptors for transferrin, HDL and LDL, or folate transporters. The targeting element also allows for targeting lectins such as receptors for asialoglycoproteins or sialides, such as sialyl Lewis X, or alternatively a Fab fragment of an antibody, or a single chain antibody (ScFv) It can be.
本発明の対象はまた、インビトロ、インビボ又は半ビボで核酸を細胞に導入するための、上記で定義したトランスフェクション化合物の使用である。より正確には、本発明の対象は、疾患、特にタンパク質又は核生成物の欠損から生じる疾患を治療することを意図した薬剤の製造のための、本発明によるトランスフェクション化合物の使用である。前記薬剤に含有されるポリヌクレオチドは、前記タンパク質又は核生成物をコードするか、若しくはインビボ又は半ビボで前記疾患を矯正することができる前記核生成物を構成する。 The subject of the present invention is also the use of a transfection compound as defined above for introducing a nucleic acid into a cell in vitro, in vivo or in vivo. More precisely, the subject of the present invention is the use of the transfection compound according to the invention for the manufacture of a medicament intended to treat a disease, in particular a disease resulting from a protein or nucleoproduct deficiency. The polynucleotide contained in the drug encodes the protein or nucleoproduct or constitutes the nucleoproduct capable of correcting the disease in vivo or semi-vivo.
インビボでの使用のために、例えば治療において、若しくは遺伝子の調節又は病的状態の動物モデルの創造を検討するために、本発明による組成物は、局所、皮膚、経口、直腸、膣、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮、気管内又は腹腔内経路等による投与用に製剤することができる。好ましくは、本発明の組成物は、注射用製剤、特に所望器官への直接注射のため、又は局所経路(皮膚及び/又は粘膜上)による投与のための、医薬適合性の賦形剤を含有する。それらは特に等張無菌溶液、又は、場合によって、無菌水又は生理食塩水を添加して注射用溶液に還元することができる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物でありうる。注射のために使用する核酸の用量ならびに投与回数は、様々なパラメータに従って、特に使用する投与様式、該当する病的状態、発現される遺伝子、又は所望治療期間に従って、適合させうる。より特定して投与様式に関しては、組織内への、例えば腫瘍のレベルでの直接注射、又は循環系への注入、又は培養細胞の処理とそれに続く注入又は移植によるインビボでのそれらの再移植のいずれかでありうる。本発明の枠内での該当組織は、例えば、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、膀胱、胃、腸、精巣、卵巣、直腸、神経系、眼、腺、結合組織等である。 For in vivo use, for example in therapy or to consider the regulation of genes or the creation of animal models of pathological conditions, the compositions according to the invention are topical, dermal, oral, rectal, vaginal, parenteral It can be formulated for administration by intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, intratracheal or intraperitoneal route. Preferably, the composition according to the invention contains pharmaceutically acceptable excipients for injectable preparations, in particular for direct injection into the desired organ or for administration by the topical route (on the skin and / or mucosa) To do. They can in particular be isotonic sterile solutions or, in some cases, dry compositions, in particular freeze-dried compositions, which can be reduced to solutions for injection by the addition of sterile water or saline. The dose of nucleic acid used for injection as well as the number of administrations can be adapted according to various parameters, in particular according to the mode of administration used, the relevant pathological condition, the gene expressed or the desired duration of treatment. More specifically, regarding the mode of administration, direct injection into the tissue, eg at the level of a tumor, or infusion into the circulatory system, or treatment of cultured cells followed by their re-implantation by infusion or transplantation. It can be either. The corresponding tissue within the framework of the present invention is, for example, muscle, skin, brain, lung, liver, spleen, bone marrow, thymus, heart, lymph, blood, bone, cartilage, pancreas, kidney, bladder, stomach, intestine, testis Ovary, rectum, nervous system, eye, gland, connective tissue and the like.
本発明のもう1つの対象は、次の段階:
(1)該核酸を本発明によるトランスフェクション化合物と接触させて複合体を形成すること;及び
(2)該細胞を(1)で形成された複合体と接触させること
を含む、核酸を細胞に導入する方法に関する。
Another subject of the present invention is the following stage:
(1) contacting the nucleic acid with a transfection compound according to the present invention to form a complex; and (2) contacting the cell with the complex formed in (1), wherein the nucleic acid is brought into the cell. It relates to the method of introduction.
本発明は、さらに、次の段階:
(1)該核酸を本発明によるトランスフェクション化合物と接触させて複合体を形成すること;及び
(2)ヒト又は動物の身体の細胞を(1)で形成された複合体と接触させること
を含む、ヒト又は動物の身体を治療する方法に関する。
The present invention further comprises the following steps:
(1) contacting the nucleic acid with a transfection compound according to the present invention to form a complex; and (2) contacting cells of the human or animal body with the complex formed in (1). Relates to a method of treating the human or animal body.
該細胞は、前記複合体と共に細胞をインキュベートすることによって(インビトロ又は半ビボでの使用のため)、又は前記複合体を器官内に注入することによって(インビボでの使用のため)、複合体と接触させうる。一般に、投与を意図する核酸の量は、例えば治療する又は予防する疾患、核酸の実際の性質、プロモーターの強さ、核酸によって発現される産物の生物活性、個人又は動物の生理状態(体重、年齢等)、投与様式及び製剤の種類のような、数多くの因子に依存する。一般に、前記のインキュベーションは、好ましくは、例えば106細胞につき0.01μgから1000μgの核酸の存在下で実施する。インビボでの投与については、例えば0.01mgから50mgの範囲の核酸用量が使用しうる。投与は、単回投与として実施するか又は間隔をおいて反復しうる。 The cells can be obtained by incubating the cells with the complex (for in vitro or semi-vivo use) or by injecting the complex into the organ (for in vivo use). Can be contacted. In general, the amount of nucleic acid intended for administration depends on, for example, the disease being treated or prevented, the actual nature of the nucleic acid, the strength of the promoter, the biological activity of the product expressed by the nucleic acid, the physiological state of the individual or animal (weight, age). Etc.), depending on a number of factors, such as mode of administration and type of formulation. In general, the incubation is preferably carried out, for example, in the presence of 0.01 μg to 1000 μg of nucleic acid per 10 6 cells. For in vivo administration, a nucleic acid dose in the range, for example, 0.01 mg to 50 mg can be used. Dosing can be performed as a single dose or repeated at intervals.
本発明の組成物が、さらに、上記で定義した1つ又はそれ以上のアジュバントを含む場合、そのアジュバントは、本発明によるトランスフェクション化合物及び/又は核酸とあらかじめ混合しうる。選択的に、ヌクレオ脂質複合体の投与の前にアジュバントを投与してもよい。 Where the composition of the invention further comprises one or more adjuvants as defined above, the adjuvants can be premixed with the transfection compounds and / or nucleic acids according to the invention. Optionally, an adjuvant may be administered prior to administration of the nucleolipid complex.
もう1つの好都合な選択法に従えば、組織を、トランスフェクションを改善することを意図した化学的又は物理的処理に供してもよい。物理的処理の場合は、エレクトロトランスファーの場合のような電気パルス、又はソドポレーション(sodoporation)の場合のような機械的力を使用しうる。 According to another convenient selection method, the tissue may be subjected to chemical or physical treatment intended to improve transfection. In the case of physical processing, electrical pulses as in the case of electrotransfer, or mechanical forces as in the case of sodoporation may be used.
本発明は、それ故、インビボで核酸を導入するため、特に疾患の治療のための、タンパク質をコードする又は前記疾患を供することができる核酸に転写されうる核酸のインビボ又はインビトロでの投与を含み、前記核酸が上記で定義した条件下で本発明によるトランスフェクション化合物と結合している、特に好都合な方法を提供する。 The invention therefore includes in vivo or in vitro administration of nucleic acids that can be transcribed into nucleic acids that can encode proteins or be capable of subjecting said diseases to introduce nucleic acids in vivo, in particular for the treatment of diseases. A particularly advantageous method is provided wherein the nucleic acid is bound to a transfection compound according to the invention under the conditions defined above.
本発明のトランスフェクション化合物は、一次細胞又は樹立細胞系に核酸を導入するために特に有用である。それらは、分化した形態又は多能性形態(前駆体)の、線維芽細胞、筋肉細胞、神経細胞(ニューロン、神経膠星状細胞、グリア細胞)、肝細胞、造血細胞(リンパ球、CD34、樹状細胞等)、上皮細胞等でありうる。 The transfection compounds of the present invention are particularly useful for introducing nucleic acids into primary cells or established cell lines. They are differentiated or pluripotent (precursor) fibroblasts, muscle cells, neurons (neurons, astrocytes, glial cells), hepatocytes, hematopoietic cells (lymphocytes, CD34, Dendritic cells, etc.) and epithelial cells.
本発明のもう1つの対象はまた、本発明による1つ又はそれ以上のトランスフェクション化合物及び/又はそれらの混合物を含むトランスフェクションキットに関する。そのようなキットは、例えばバイアル又はチューブのような様々な容器を収納するように区画分けされた包装の形態で提供されうる。これらの容器の各々は、個別の又は混合された、トランスフェクションを実施するために必要な様々なエレメント:例えば本発明による1つ又はそれ以上のトランスフェクション化合物、1つ又はそれ以上の核酸、1つ又はそれ以上のアジュバント、細胞等を含む。 Another subject of the present invention also relates to a transfection kit comprising one or more transfection compounds according to the invention and / or mixtures thereof. Such a kit may be provided in the form of a package that is partitioned to contain various containers, such as vials or tubes. Each of these containers is a separate or mixed various elements necessary to carry out the transfection: for example one or more transfection compounds according to the invention, one or more nucleic acids, Including one or more adjuvants, cells and the like.
前記の説明に加えて、本発明はまた、本発明の範囲を限定することなく本発明を例示するものとみなされるべきである、下記の実施例及び図面から生じる他の特徴及び利点も包含する。特に、出願人は、限定を伴わずに、本発明によるトランスフェクション化合物を製造するために使用しうる操作プロトコールならびに反応中間体を提示する。言うまでもなく、このプロトコール又は中間生成物から、これらの同じ化合物に到達するための同様の方法を開発する教示を引き出すことは、当業者の能力の範囲内である。 In addition to the foregoing description, the present invention also encompasses other features and advantages arising from the following examples and drawings, which should be considered as exemplifying the present invention without limiting the scope of the invention. . In particular, Applicants present, without limitation, operational protocols and reaction intermediates that can be used to produce transfection compounds according to the present invention. Of course, it is within the ability of one skilled in the art to derive from this protocol or intermediate product the teachings of developing similar methods to reach these same compounds.
(使用する略語)
EtBr:臭化エチジウム
DCC:ジシクロヘキシルカルボジイミド
DPPC:1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン
DTTU:3−(2−{3−[2−(3−{2−[3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ]エチル}チオウレイド)エチル]チオウレイド}エチル)−1−メチルチオ尿素(DT−3TUとも称する)
EPC:L−α−ホスファチジルコリン95%(卵)
PyBOP:ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
TBE:トリス−ボレート−EDTA
TFA:トリフルオロ酢酸
THF:テトラヒドロフラン
本発明を下記の非制限的実施例によって例示する。
(Abbreviations used)
EtBr: ethidium bromide DCC: dicyclohexylcarbodiimide DPPC: 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DTTU: 3- (2- {3- [2- (3- {2- [3- (ditetra Decylcarbamoyl) propionylamino] ethyl} thioureido) ethyl] thioureido} ethyl) -1-methylthiourea (also referred to as DT-3TU)
EPC: L-α-phosphatidylcholine 95% (egg)
PyBOP: Benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate TBE: Tris-borate-EDTA
TFA: trifluoroacetic acid THF: tetrahydrofuran The invention is illustrated by the following non-limiting examples.
(実施例)
トリエチルアミン、トリフルオロ酢酸、p−トルエンスルホン酸、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、二硫化炭素、テトラデシルアミン、ジ−tert−ブチルジカルボネート、4−ジメチルアミノピリジン、又はジイソプロピルエチルアミンなどの慣用試薬及び触媒は、市販のものを入手した。
(Example)
Triethylamine, trifluoroacetic acid, p-toluenesulfonic acid, benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), carbon disulfide, tetradecylamine, di-tert-butyldicar Commercially available reagents and catalysts such as bonate, 4-dimethylaminopyridine, or diisopropylethylamine were obtained.
プロトン核磁気共鳴(1H NMR)スペクトルは、Bruker 300、400及び600MHz分光計で記録した。化学的変化はppm(parts per million、百万分量単位中の絶対数)で表わし、重複する用語は慣用略語で表わした。 Proton nuclear magnetic resonance ( 1 H NMR) spectra were recorded on a Bruker 300, 400 and 600 MHz spectrometer. Chemical changes are expressed in ppm (parts per million, absolute number in parts per million) and overlapping terms are expressed in conventional abbreviations.
下記の文中で、使用した核酸は、サイトメガロウイルスCMV E/Pプロモーターの制御下のルシフェラーゼをコードするluc遺伝子を含む、出版物「遺伝子治療(Gene Therapy)」(1999),1482−1488ページに述べられているプラスミドpXL3031であった。このプラスミドは図7に示されている。その大きさは3671塩基対である。使用したプラスミド溶液は、注射用に水中で1.262g/lに希釈した。 In the text below, the nucleic acid used includes the luc gene encoding luciferase under the control of the cytomegalovirus CMV E / P promoter, in the publication “Gene Therapy” (1999), pages 1422-1488. It was the plasmid pXL3031 described. This plasmid is shown in FIG. Its size is 3671 base pairs. The plasmid solution used was diluted to 1.262 g / l in water for injection.
DT−3TUの合成
ここではDTTU又はDT−3TUと称する、3−(2−{3−[2−(3−{2−[3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ]エチル}チオウレイド)エチル]チオウレイド}エチル)−1−メチルチオ尿素は、一般式(I)[式中、X=−CH3;m=2;R=H;n=3;l=0;Y=NH−CO−CH2−CH2;及びL=−N(R1)R2又はR1=R2=C14H29]に対応する。
Synthesis of DT-3TU 3- (2- {3- [2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] ethyl} thioureido) ethyl], referred to herein as DTTU or DT-3TU Thioureido} ethyl) -1-methylthiourea has the general formula (I) [wherein X = —CH 3 ; m = 2; R = H; n = 3; l = 0; Y = NH—CO—CH 2. -CH 2; and L = -N (R 1) R 2 or R 1 = R 2 = corresponding to C 14 H 29].
a)ジテトラデシルアミド(1)の合成
テトラデカン酸(30g)131.6mmol及びテトラデシルアミン(30g)140.8mmolを、乾燥剤(P2O5)の入った捕集フラスコに接続された磁気攪拌機を備える丸底フラスコ中で混合した。次のその反応混合物を減圧下で(50mmHg)170℃に4時間加熱した。その粗物質をTHF(700ml;可溶化を助けるためにわずかに加熱した)に可溶化し、その後過剰のアミンに結合するために4当量のAmberlyst−15樹脂(8g)を加えた。20分間攪拌したあと、その溶液をろ過し、ろ液を濃縮して白色固体55.11gを得た(収率:99%)。
a) Synthesis of ditetradecyl amide (1) 131.6 mmol of tetradecanoic acid (30 g) and 140.8 mmol of tetradecylamine (30 g) were magnetically connected to a collection flask containing desiccant (P 2 O 5 ). Mix in a round bottom flask equipped with a stirrer. The reaction mixture was then heated to 170 ° C. under reduced pressure (50 mmHg) for 4 hours. The crude material was solubilized in THF (700 ml; slightly heated to aid solubilization) and then 4 equivalents of Amberlyst-15 resin (8 g) was added to bind to excess amine. After stirring for 20 minutes, the solution was filtered, and the filtrate was concentrated to obtain 55.11 g of a white solid (yield: 99%).
b)ジテトラデシルアミン(2)の合成
ジテトラデシルアミド(20g)47mmmolを、冷却機と乾燥管を備えた丸底フラスコ中で、窒素下に、無水THF700mlに溶解した。その混合物を0℃に冷却し、その後水素化アルミニウムリチウムLiAlH4(3.4g)89mmolを加えた。添加後、その混合物を、強く攪拌しながら還流下で5時間加熱した。ひとたび反応が完了すれば、水3.4ml、1N水酸化ナトリウム6.8ml及び水3.4mlを連続的に加えることによって加水分解を実施するために、前記混合物を0℃に冷却した。室温で1時間攪拌した後、粗反応物質をブフナー漏斗でろ過し、ろ液を濃縮した。得られた生成物を、次に、攪拌しながら30分間、THF300ml中1.5当量のA−15樹脂(15g)で精製した。その樹脂をろ過し、THF300mlに再溶解して、2当量のトリエチルアミン(19.2ml)を加えた。30分間攪拌したあと、その溶液をろ過し、ろ液を濃縮して、白色固体17.72gを得た(収率:92%)。
b) Synthesis of ditetradecylamine (2) 47 mmol of ditetradecylamide (20 g) was dissolved in 700 ml of anhydrous THF under nitrogen in a round bottom flask equipped with a cooler and a drying tube. The mixture was cooled to 0 ° C., after which 89 mmol of lithium aluminum hydride LiAlH 4 (3.4 g) was added. After the addition, the mixture was heated under reflux for 5 hours with vigorous stirring. Once the reaction was complete, the mixture was cooled to 0 ° C. in order to carry out the hydrolysis by successively adding 3.4 ml water, 6.8 ml 1N sodium hydroxide and 3.4 ml water. After stirring at room temperature for 1 hour, the crude reaction material was filtered through a Buchner funnel and the filtrate was concentrated. The resulting product was then purified with 1.5 equivalents of A-15 resin (15 g) in 300 ml of THF for 30 minutes with stirring. The resin was filtered, redissolved in 300 ml of THF and 2 equivalents of triethylamine (19.2 ml) was added. After stirring for 30 minutes, the solution was filtered, and the filtrate was concentrated to obtain 17.72 g of a white solid (yield: 92%).
c)N,N−ジテトラデシルスクシンアミド酸(3)の合成
無水コハク酸(1.266g)12.65mmol、4−ジメチルアミノピリジン(1.546g)12.65mmol及びジテトラデシルアミン(4.407g)10.75mmolを、丸底フラスコ中のジクロロメタン125mlに連続的に添加した。その反応混合物を室温で18時間攪拌した。ひとたび反応が完了すれば、その混合物をジクロロメタンと塩酸(1N)で抽出した。次にその有機相をブラインで洗い、硫酸マグネシウムで乾燥して、ろ過し、濃縮して、生成物(3)4.21gを得た(収率:66%)。
c) Synthesis of N, N-ditetradecylsuccinamic acid (3) 12.65 mmol of succinic anhydride (1.266 g), 12.65 mmol of 4-dimethylaminopyridine (1.546 g) and ditetradecylamine (4 .407 g) 10.75 mmol was added continuously to 125 ml dichloromethane in a round bottom flask. The reaction mixture was stirred at room temperature for 18 hours. Once the reaction was complete, the mixture was extracted with dichloromethane and hydrochloric acid (1N). The organic phase was then washed with brine, dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated to give 4.21 g of product (3) (yield: 66%).
d)2−アミノエチルカルバミン酸のtert−ブチルエステル(4)の合成
ジ−tert−ブチルジカルボネート(4g)18.6mmolを、窒素下で、クロロホルム(20ml)中のエチレンジアミン(6.17g)102.83mmolの溶液に滴下した。次にその反応混合物を室温で18時間攪拌した。ひとたび反応が完了すれば、その溶液を濃縮した。生じた油をジクロロメタンに溶解し、飽和炭酸ナトリウム水溶液で洗った。次のその有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過して、濃縮した。その粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール9:1)によって精製し、生成物(4)2.38gを得た(収率:80%)。
d) Synthesis of tert-butyl ester (4) of 2-aminoethylcarbamic acid 18.6 mmol of di-tert-butyl dicarbonate (4 g) under nitrogen with ethylenediamine (6.17 g) 102 in chloroform (20 ml) Added dropwise to .83 mmol solution. The reaction mixture was then stirred at room temperature for 18 hours. Once the reaction was complete, the solution was concentrated. The resulting oil was dissolved in dichloromethane and washed with saturated aqueous sodium carbonate. The next organic phase was dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated. The crude product was purified by flash chromatography (dichloromethane / methanol 9: 1) to give 2.38 g of product (4) (yield: 80%).
e)2−[3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ]エチルカルバミン酸のtert−ブチルエステル(5)の合成
PyBOP(4.601g)8.84mmol、前の段階で得たアミン(4)(1.558g)9.72mmol及びジイソプロピルエチルアミン(4.24ml)24.31mmolを、ジクロロメタン88ml中の上記で得た酸(3)(4.5g)8.84mmolの溶液に連続的に添加した。次にその溶液を室温で4時間攪拌した。反応終了時に、その反応混合物をろ過し、その生成物をフラッシュクロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル5:5及びその後ヘプタン/酢酸エチル2:8)によって精製した。このようにして該エステル(5)3.79gを得た(収率:66%)。
e) Synthesis of tert-butyl ester of 2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] ethylcarbamic acid (5) PyBOP (4.601 g) 8.84 mmol, amine (4) obtained in the previous step (4) 1.558 g) 9.72 mmol and diisopropylethylamine (4.24 ml) 24.31 mmol were added sequentially to a solution of the above obtained acid (3) (4.5 g) in 8.84 mmol in 88 ml of dichloromethane. The solution was then stirred at room temperature for 4 hours. At the end of the reaction, the reaction mixture was filtered and the product was purified by flash chromatography (heptane / ethyl acetate 5: 5 and then heptane / ethyl acetate 2: 8). In this way, 3.79 g of the ester (5) was obtained (yield: 66%).
f)2−[3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ]エチルアミン(6)の合成
蒸留したTFA(0.94ml)12.2mmolを、前の段階で得たエステル(5)(1.59g)2.44mlに加えた。2時間後、反応が完了した。その生成物を、低温状態で回転蒸発器においてシクロヘキサンと共に2回同時蒸発させた。その収率は定量的であった。
f) Synthesis of 2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] ethylamine (6) 12.2 mmol of distilled TFA (0.94 ml) was obtained from the ester (5) (1.59 g) obtained in the previous step. Added to 2.44 ml. After 2 hours, the reaction was complete. The product was co-evaporated twice with cyclohexane in a rotary evaporator at low temperature. The yield was quantitative.
g)((1,1−ジメチルエトキシカルボニル)アミノ)エチルイソチオシアネート(7)の合成
DCC(9.015g)43.69mmol、THF27.5ml中の二硫化炭素(17.9ml)297.9mmolを連続的に丸底フラスコに加えた。その混合物を氷と塩化アンモニウムNH4Cl(4/1)の浴で−7℃に冷却した。次に、無水THF20.5mlに溶解した、上記で得たアミン(4)(7g)43.69mmolを30分間かけて滴下した。その混合物を室温に戻し、その混合物を21時間攪拌し続けた。蒸発後、ジエチルエーテルを加え、形成されたジシクロヘキシル尿素を沈殿させた。その溶液をろ過し、ろ液を濃縮して、その後フラッシュクロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル80:20)によって精製し、所望生成物(7)6.357gを得た(収率:72%)。
g) Synthesis of ((1,1-dimethylethoxycarbonyl) amino) ethyl isothiocyanate (7) 43.69 mmol of DCC (9.05 g), 297.9 mmol of carbon disulfide (17.9 ml) in 27.5 ml of THF continuously Was added to a round bottom flask. The mixture was cooled to −7 ° C. with a bath of ice and ammonium chloride NH 4 Cl (4/1). Next, 43.69 mmol of the amine (4) (7 g) obtained above dissolved in 20.5 ml of anhydrous THF was added dropwise over 30 minutes. The mixture was allowed to return to room temperature and the mixture was kept stirring for 21 hours. After evaporation, diethyl ether was added to precipitate the formed dicyclohexylurea. The solution was filtered and the filtrate was concentrated and then purified by flash chromatography (heptane / ethyl acetate 80:20) to give 6.357 g of desired product (7) (yield: 72%).
h)2−(3−{2−[3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ]エチル}チオウレイド)エチルカルバミン酸のtert−ブチルエステル(8)の合成
トリエチルアミン(1.36ml)9.76mmolを上記で得たアミン(6)(1.62g)2.44mmolに直接加え、その混合物を15分間攪拌し続けた。その後、ジクロロメタン24.4ml及び前の段階で得たイソチオシアネート(7)(0.59g)2.92mmolを加えた。その反応混合物を室温で12時間攪拌した。次にその混合物を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘプタン6:4及びその後酢酸エチル100%)によって精製した。このようにして所望エステル(8)1.343gを得た(収率:73%)。
h) Synthesis of tert-butyl ester (8) of 2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] ethyl} thioureido) ethylcarbamic acid 9.76 mmol of triethylamine (1.36 ml) above Was directly added to 2.44 mmol of the amine (6) obtained in (1.62 g) and the mixture was kept stirring for 15 minutes. Thereafter, 24.4 ml of dichloromethane and 2.92 mmol of isothiocyanate (7) (0.59 g) obtained in the previous step were added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 hours. The mixture was then evaporated and purified by flash chromatography (ethyl acetate / heptane 6: 4 and then ethyl acetate 100%). Thus, 1.343 g of the desired ester (8) was obtained (yield: 73%).
i)2−(3−{2−[3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ]エチル}チオウレイド)エチルアミン(9)の合成
蒸留したTFA(0.76ml)9.86mmolを前の段階で得た生成物(8)(1.5g)1.98mmolに加えた。3時間後、反応が完了した。その生成物を、低温状態で回転蒸発器を用いてシクロヘキサンと共に2回同時蒸発させた。その収率は定量的であった。
i) Synthesis of 2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] ethyl} thioureido) ethylamine (9) Distilled TFA (0.76 ml) 9.86 mmol was obtained in the previous step. Product (8) (1.5 g) was added to 1.98 mmol. After 3 hours, the reaction was complete. The product was co-evaporated twice with cyclohexane using a rotary evaporator at low temperature. The yield was quantitative.
j)2−{3−[2−(3−{2−[3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ]エチル}−チオウレイド)エチル]チオウレイド}エチルカルバミン酸のtert−ブチルエステル(10)の合成
トリエチルアミン(1.1ml)7.92mmolを前の段階で得たアミン(9)(1.47g)1.98mmolに直接加え、その混合物を15分間攪拌し続けた。その後、ジクロロメタン19.8ml及び上記で得たイソチオシアネート(7)(0.461g)2.38mmolを加え、攪拌しながら室温で12時間反応を進行させた。次にその混合物を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘプタン6:4及びその後酢酸エチル/メタノール98:2)によって精製した。このようにして所望生成物(10)1.136gを得た(収率:67%)。
j) Synthesis of tert-butyl ester (10) of 2- {3- [2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] ethyl} -thioureido) ethyl] thioureido} ethylcarbamic acid 7.92 mmol of triethylamine (1.1 ml) was added directly to 1.98 mmol of amine (9) (1.47 g) obtained in the previous step and the mixture was kept stirring for 15 minutes. Thereafter, 19.8 ml of dichloromethane and 2.38 mmol of the isothiocyanate (7) (0.461 g) obtained above were added, and the reaction was allowed to proceed at room temperature for 12 hours while stirring. The mixture was then evaporated and purified by flash chromatography (ethyl acetate / heptane 6: 4 and then ethyl acetate / methanol 98: 2). In this way, 1.136 g of the desired product (10) was obtained (yield: 67%).
k)2−{3−[2−(3−{2−[3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ]エチル}チオウレイド)エチル]チオウレイド}エチルアミン(11)の合成
蒸留したTFA(0.45ml)5.84mmolを前の段階で得た生成物(10)(1g)1.15mmolに加えた。3時間後、反応が完了した。その生成物を、低温状態で回転蒸発器においてシクロヘキサンと共に2回同時蒸発させた。その収率は定量的であった。
k) Synthesis of 2- {3- [2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] ethyl} thioureido) ethyl] thioureido} ethylamine (11) Distilled TFA (0.45 ml) 5.84 mmol was added to 1.15 mmol of product (10) (1 g) obtained in the previous step. After 3 hours, the reaction was complete. The product was co-evaporated twice with cyclohexane in a rotary evaporator at low temperature. The yield was quantitative.
l)DT−3TU(12)の合成
トリエチルアミン(0.16ml)1.12mmolを前の段階で得たアミン(11)(0.24g)0.28mmolに直接加え、その混合物を15分間攪拌し続けた。その後、ジクロロメタン2.8ml及びメチルイソチオシアネート(0.024g)0.34mmolを加え、攪拌しながら室温で12時間反応を進行させた。次にその混合物を蒸発させ、次の勾配:最初は水/メタノール95:5混合物からメタノール100%までで、C4カラムでのHPLC(高速液体クロマトグラフィー)によって精製した。得られた生成物を小さなシリカカラム(酢酸エチル/ヘプタン80:20及びその後酢酸エチル100%)で再び精製した。このようにしてDTTU 118mgを得た(収率:51%)。
l) Synthesis of DT-3TU (12) 1.12 mmol of triethylamine (0.16 ml) was added directly to 0.28 mmol of amine (11) (0.24 g) obtained in the previous step and the mixture was kept stirring for 15 minutes It was. Thereafter, 2.8 ml of dichloromethane and 0.34 mmol of methyl isothiocyanate (0.024 g) were added, and the reaction was allowed to proceed for 12 hours at room temperature with stirring. Then the mixture is evaporated down, the following gradient: first water / methanol 95: in 5 mixture to 100% methanol, and purified by HPLC (High Performance Liquid Chromatography) on C 4 column. The resulting product was purified again on a small silica column (ethyl acetate / heptane 80:20 and then ethyl acetate 100%). In this way, 118 mg of DTTU was obtained (yield: 51%).
DT−4TUの合成
3−(2−{3−[2−(3−{2−[3−(2−{3−[ジテトラデシルカルバモイル]プロピオニルアミノ}−エチル)−チオウレイド]−エチル}−チオウレイド)−エチル]−チオウレイド}−エチル)−1−メチルチオ尿素又はDT−4TUは、一般式(I)[式中、X=−CH3;m=2;R=H;n=4;及びl=0;Y=NH−CO−CH2−CH2;及びL=−N(R1)R2[式中、R1=R2=C14H29]]に一致する。
Synthesis of DT-4TU 3- (2- {3- [2- (3- {2- [3- (2- {3- [ditetradecylcarbamoyl] propionylamino} -ethyl) -thioureido] -ethyl}- Thioureido) -ethyl] -thioureido} -ethyl) -1-methylthiourea or DT-4TU is represented by the general formula (I) [wherein X = —CH 3 ; m = 2; R = H; n = 4; l = 0; Y = NH—CO—CH 2 —CH 2 ; and L = —N (R 1 ) R 2 [wherein R 1 = R 2 = C 14 H 29 ]].
DT−4TUの合成のために、アミン(11)を出発物質として使用した。 For the synthesis of DT-4TU, amine (11) was used as starting material.
a)2−(3−{2−[3−(2−{3−[2−(3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ)−エチル]−チオウレイド}−エチル)−チオウレイド]−エチル}−チオウレイド)−エチルカルバミン酸のtert−ブチルエステル(13)の合成 a) 2- (3- {2- [3- (2- {3- [2- (3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino) -ethyl] -thioureido} -ethyl) -thioureido] -ethyl}- Synthesis of tert-butyl ester of thioureido) -ethylcarbamic acid (13)
b)2−(3−{2−[3−(2−{3−[2−(3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ)−エチル]−チオウレイド}−エチル)−チオウレイド]−エチル}−チオウレイド)−エチルアミン(14)の合成 b) 2- (3- {2- [3- (2- {3- [2- (3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino) -ethyl] -thioureido} -ethyl) -thioureido] -ethyl}- Synthesis of thioureido) -ethylamine (14)
c)3−(2−{3−[2−(3−{2−[3−(2−{3−[ジテトラデシルカルバモイル]プロピオニルアミノ}−エチル)−チオウレイド]−エチル}−チオウレイド)−エチル]−チオウレイド}−エチル)−1−メチルチオ尿素(DT−4TU)(15)の合成 c) 3- (2- {3- [2- (3- {2- [3- (2- {3- [ditetradecylcarbamoyl] propionylamino} -ethyl) -thioureido] -ethyl} -thioureido)- Ethyl] -thioureido} -ethyl) -1-methylthiourea (DT-4TU) (15)
DT−2TUジオールの合成
DT−2TUジオール又は[2−(3−{2−[3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ]−エチル}−チオウレイド)−エチル]−プロパン−1,2−ジオールは、一般式(I)[式中、
Synthesis of DT-2TU diol DT-2TU diol or [2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] -ethyl} -thioureido) -ethyl] -propane-1,2-diol is General formula (I) [wherein
a)4−イソチオシアナトメチル−2,2−ジメチル−[1,3]ジオキサラン(16)の合成 a) Synthesis of 4-isothiocyanatomethyl-2,2-dimethyl- [1,3] dioxalane (16)
b)2−(3−{2−[3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ]−エチル}−チオウレイド)−エチル}−4−イルメチル−2,2−ジメチル−[1,3]ジオキサラン(17)の合成 b) 2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] -ethyl} -thioureido) -ethyl} -4-ylmethyl-2,2-dimethyl- [1,3] dioxalane (17 )
c)[2−(3−{2−[3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ]−エチル}−チオウレイド)−エチル]−プロパン−1,2−ジオール(DT−2TUジオール)(18)の合成 c) [2- (3- {2- [3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino] -ethyl} -thioureido) -ethyl] -propane-1,2-diol (DT-2TU diol) (18) Composition
DT−3TUジオールの合成
DT−3TUジオールの合成のために、アミン(11)を出発物質として使用した。
Synthesis of DT-3TU diol For the synthesis of DT-3TU diol, amine (11) was used as starting material.
DT−3TUジオール又は{3−[2−(3−{2−[3−(2−{3−[2−(3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ)−エチル]−チオウレイド}−エチル)−チオウレイド]−エチル}−チオウレイド)−エチル]−プロパン−1,2−ジオールの合成は、一般式(I)[式中、 DT-3TU diol or {3- [2- (3- {2- [3- (2- {3- [2- (3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino) -ethyl] -thioureido} -ethyl) -Thioureido] -ethyl} -thioureido) -ethyl] -propane-1,2-diol was synthesized according to the general formula (I) [wherein
a)2−(3−{2−[3−(2−{3−[2−(3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ)−エチル]−チオウレイド}−エチル)−チオウレイド]エチル}−チオウレイド)−エチル−4−イルメチル−2,2−ジメチル−[1,3]ジオキサラン(19)の合成 a) 2- (3- {2- [3- (2- {3- [2- (3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino) -ethyl] -thioureido} -ethyl) -thioureido] ethyl} -thioureido ) -Ethyl-4-ylmethyl-2,2-dimethyl- [1,3] dioxalane (19)
b){3−[2−(3−{2−[3−(2−{3−[2−(3−(ジテトラデシルカルバモイル)プロピオニルアミノ)−エチル]−チオウレイド}−エチル)−チオウレイド]−エチル}−チオウレイド)−エチル]−プロパン−1,2−ジオール(DT−3TUジオール)(20)の合成 b) {3- [2- (3- {2- [3- (2- {3- [2- (3- (ditetradecylcarbamoyl) propionylamino) -ethyl] -thioureido} -ethyl) -thioureido] -Ethyl} -thioureido) -ethyl] -propane-1,2-diol (DT-3TU diol) (20)
DT−3TUの存在下での核酸の緊密化
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が核酸と結合する能力を示すことである。
Consolidation of nucleic acids in the presence of DT-3TU The purpose of this example is to show the ability of the transfection compounds according to the invention to bind to nucleic acids.
これは臭化エチジウムによる蛍光試験によって容易に明らかにすることができる:蛍光が存在しないことは遊離核酸が存在しないことを示唆し、それは核酸がトランスフェクション化合物によって緊密化されたことを意味する。 This can be readily revealed by fluorescence studies with ethidium bromide: the absence of fluorescence suggests that no free nucleic acid is present, which means that the nucleic acid has been intimated by the transfection compound.
該核酸を、核酸の溶液中での様々な力価の脂質溶液の等容量混合によって、漸増量のDT−3TU(12)と接触させた。0.01μg/mlの濃度の核酸複合体800μlの試料を、漸増量のDT−3TU(12)を含む150mM塩化ナトリウム溶液中で調製した。 The nucleic acid was contacted with increasing amounts of DT-3TU (12) by equal volume mixing of lipid solutions of various titers in the nucleic acid solution. A sample of 800 μl of nucleic acid complex at a concentration of 0.01 μg / ml was prepared in a 150 mM sodium chloride solution containing increasing amounts of DT-3TU (12).
同様に、該核酸を、核酸の溶液中での様々な力価の脂質溶液の等容量混合によって、漸増量のEPC(図1参照)又はDPPC(図2参照)と接触させることにより、対照を調製した。このようにして、0.01μg/mlの濃度の核酸複合体800μlの試料を、漸増量のEPC又はDPPCを含む150mM塩化ナトリウム溶液中で調製した(それぞれ図1及び図2)。 Similarly, a control can be obtained by contacting the nucleic acid with increasing amounts of EPC (see FIG. 1) or DPPC (see FIG. 2) by equal volume mixing of lipid solutions of various titers in the solution of nucleic acid. Prepared. In this way, a sample of 800 μl of nucleic acid complex at a concentration of 0.01 μg / ml was prepared in a 150 mM sodium chloride solution containing increasing amounts of EPC or DPPC (FIGS. 1 and 2, respectively).
臭化エチジウム蛍光を、それぞれ260nmと590nmの励起及び発光波長でFluoroMax−2(Jobin Yvon−Spex)を使用して経時的に測定した(20℃で測定)。励起と発光のためのスリット幅は5nmに設定した。DNA/脂質溶液(0.01mgDNA/ml)1mlにつき臭化エチジウム(1g/l)3μlを加えた後、蛍光値を記録した。 Ethidium bromide fluorescence was measured over time using FluoroMax-2 (Jobin Yvon-Spex) at excitation and emission wavelengths of 260 nm and 590 nm, respectively (measured at 20 ° C.). The slit width for excitation and emission was set to 5 nm. After adding 3 μl of ethidium bromide (1 g / l) per ml of DNA / lipid solution (0.01 mg DNA / ml), fluorescence values were recorded.
その結果を図1及び2に要約した。 The results are summarized in FIGS.
図1において、四角記号の曲線は、固定量の核酸(8μg)に対する漸増量のDT−3TU/EPC脂質混合物(0.75nmolから20nmolのDT−3TU)の添加が、DNAの塩基対の間への臭化エチジウムの挿入の低下に結びつく蛍光の低下を誘導することを示している。これは、DT−3TU/EPCリポソームとDNAの間の結びつきが、その複合体から臭化エチジウムを排除するのに十分なほど強かったことを示唆する。我々はそれ故、90%までの蛍光の排除を得ることができ、これは90%のDNA−DT−3TU/EPC脂質結合であった。この脂質/DNA結合におけるDT−3TU脂質の積極的な役割を示すため、対照を調製した。それは、EPC脂質とDNAの間の相互作用を観察することであり、ダイアモンド形記号の曲線で表わしている。EPCを、DT−3TU/EPC−DNA複合体の試験で使用したのと同じ条件下でDNAに接触させたとき、蛍光の弱い低下だけが認められ(約5%)、これは混合物の混濁度の上昇によるものと考えられる。この対照は、それ故、上述した実験条件下でEPC単独とDNAの結合が存在しないことを反映している。 In FIG. 1, the square curve shows that the addition of increasing amounts of DT-3TU / EPC lipid mixture (0.75 nmol to 20 nmol DT-3TU) to a fixed amount of nucleic acid (8 μg) is between DNA base pairs. It has been shown to induce a decrease in fluorescence that leads to a decrease in ethidium bromide insertion. This suggests that the association between DT-3TU / EPC liposomes and DNA was strong enough to eliminate ethidium bromide from the complex. We could therefore obtain up to 90% fluorescence exclusion, which was 90% DNA-DT-3TU / EPC lipid binding. Controls were prepared to show the positive role of DT-3TU lipids in this lipid / DNA binding. It is to observe the interaction between EPC lipids and DNA and is represented by the curve with diamond symbol. When EPC was contacted with DNA under the same conditions used for testing the DT-3TU / EPC-DNA complex, only a weak decrease in fluorescence was observed (about 5%), which is the turbidity of the mixture This is thought to be due to the rise in This control therefore reflects the absence of EPC alone and DNA binding under the experimental conditions described above.
この実施例は、それ故、核酸に結合するDT−3TU脂質の能力を示している。 This example therefore demonstrates the ability of DT-3TU lipids to bind to nucleic acids.
同様に、図2において、四角記号の曲線は、同一量の臭化エチジウムを様々な試料に加えたとき、固定量の核酸(8μg)に対する漸増量のDT−3TU/DPPC脂質混合物(0.75nmolから20nmolのDTTU)の添加が蛍光の低下を誘導することを示している。これは、DT−3TU/DPPCリポソームとDNAの間の結びつきが、その複合体から臭化エチジウムを排除するのに十分なほど強かったことを示唆する。我々はそれ故、90%のDNA−DTTU/DPPC結合に当たる、90%までの蛍光の排除を得ることができた。この脂質/DNA結合におけるDTTU脂質の積極的な役割を示すため、対照を調製した。それは、DPPC脂質とDNAの間の相互作用を観察することであり、ダイアモンド形記号の曲線で表わしている。DPPCを、DT−3TU/DPPC−DNA複合体の試験で使用したのと同じ条件下でDNAに接触させたとき、蛍光の弱い低下だけが認められた(約5%)。この対照は、それ故、上述した実験条件下でDPPC単独とDNAの結合が存在しないことを反映している。 Similarly, in FIG. 2, the squared curve shows increasing amounts of DT-3TU / DPPC lipid mixture (0.75 nmol) to a fixed amount of nucleic acid (8 μg) when the same amount of ethidium bromide was added to the various samples. To 20 nmol DTTU) is shown to induce a decrease in fluorescence. This suggests that the association between DT-3TU / DPPC liposomes and DNA was strong enough to eliminate ethidium bromide from the complex. We were therefore able to obtain up to 90% exclusion of fluorescence, corresponding to 90% DNA-DTTU / DPPC binding. Controls were prepared to show the positive role of DTTU lipids in this lipid / DNA binding. It is to observe the interaction between DPPC lipids and DNA and is represented by the curve with diamond symbol. When DPPC was contacted with DNA under the same conditions used in testing the DT-3TU / DPPC-DNA complex, only a weak decrease in fluorescence was observed (approximately 5%). This control therefore reflects the absence of binding of DPPC alone and DNA under the experimental conditions described above.
この実施例は、それ故、DT−3TU脂質の核酸に結合する能力を例示している。 This example therefore illustrates the ability of DT-3TU lipids to bind to nucleic acids.
DT−3TU/EPC複合体によるDNAの緊密化
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が核酸を緊密化する能力を示すことである。
Consolidation of DNA by DT-3TU / EPC complex The purpose of this example is to show the ability of the transfection compounds according to the present invention to consolidate nucleic acids.
これは、臭化エチジウム(EtBr)を使用して視覚化したDNAのアガロースゲル上での電気泳動遅延試験によって容易に明らかにしうる:ゲル上の核酸の移動が存在しないことは核酸の緊密化を示唆する。遊離核酸については、ゲル上での遅延を生じなかった。 This can be readily revealed by an electrophoretic delay test of DNA visualized using ethidium bromide (EtBr) on an agarose gel: the absence of nucleic acid migration on the gel reduces nucleic acid compaction. Suggest. For free nucleic acids, no delay on the gel occurred.
DNAに対して漸増量のDTTU脂質を含む様々なDNA/DT−3TU試料をアガロースゲル(1N TBE中0.8%アガロース)上に沈着させた。電気泳動によってDNAを移動させるため、そのゲルを1時間半70V及び70mAの電流に供した。バンドをEtBr及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。その結果を図3に示した。 Various DNA / DT-3TU samples containing increasing amounts of DTTU lipid relative to DNA were deposited on an agarose gel (0.8% agarose in 1N TBE). The gel was subjected to a current of 70 V and 70 mA for one and a half hours to move the DNA by electrophoresis. Bands were revealed by absorption under EtBr and UV light. The results are shown in FIG.
ゲルは、DNAが脂質と結合しなかったときのDNAの電気泳動移動(ウエル1)、及びDNAが脂質と結合したときの保持率の差を示す。ウエル2〜6は、漸増量のDTTU/EPCリポソーム:0.75、次いで5、次いで10、次いで15及び最後に20nmolのDTTU脂質と結合したDNA(0.01g/l)を示す。ウエル1と他のウエルとの比較は、DT−3TU脂質の量が高いほど、より多くのDNAがゲル上に保持され、複合体の凝集の範囲である3nmolのDTTU/μgDNAからは全面的に遅滞した。ウエル8−13はそれぞれ、DNA単独(0.1g/l、ゲルについて1μg)、脂質/DNA比:0.75又は5又は10又は15の、0.1g/l DNAの濃度で形成されるリポプレックス及び最後に20nmol/μgDNAに対応する。同様に、インビボ実験と適合性であるDNAのこの濃度では、5nmol脂質/μgDNAの割合からDNAが緊密化された。
The gel shows the electrophoretic migration of DNA when DNA is not bound to lipid (well 1) and the difference in retention when DNA is bound to lipid. Wells 2-6 show increasing amounts of DTTU / EPC liposomes: 0.75, then 5, then 10, then 15 and finally 20 nmol of DTTU lipid bound DNA (0.01 g / l). The comparison between
この実施例は、それ故、DT−3TU脂質の核酸を緊密化する能力を示している。 This example therefore demonstrates the ability to consolidate DT-3TU lipid nucleic acids.
DT−3TU/DNA組成物のζ電位の測定
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が、全体的な陰イオン性、中性又は非常に弱い陽イオン性構造を保持しながら核酸を緊密化する能力を示すことである。
Measurement of the zeta potential of a DT-3TU / DNA composition The purpose of this example is to ensure that the transfection compound according to the present invention does not contain nucleic acids while retaining the overall anionic, neutral or very weak cationic structure. It is to show the ability to close.
これは、ζ電位の測定によって明らかにしうる;mVで表わした測定値は、試料の電気泳動移動度に対する粒子の表面電荷を示す。 This can be revealed by measuring the zeta potential; the measurement expressed in mV indicates the surface charge of the particle with respect to the electrophoretic mobility of the sample.
該核酸を、核酸の溶液中での様々な力価の脂質溶液の等容量混合によって、漸増量のDT−3TU/EPC脂質混合物と接触させた。0.01g/lの濃度の核酸複合体2mlの試料を、漸増量のDT−3TUを含む20mM塩化ナトリウム溶液中で調製した。 The nucleic acid was contacted with increasing amounts of DT-3TU / EPC lipid mixture by equal volume mixing of lipid solutions of various titers in the nucleic acid solution. A 2 ml sample of the nucleic acid complex at a concentration of 0.01 g / l was prepared in a 20 mM sodium chloride solution containing increasing amounts of DT-3TU.
ゼータサイズ測定器3000 Hsa(Malvern)を用いてζ電位(mV)の測定を実施した。DT−3TU/EPC−DNA試料2mlに関して電位の値を3回連続して測定した。その結果を図4に要約した。 The zeta potential (mV) was measured using a zeta size measuring device 3000 Hsa (Malvern). The potential value was measured three times in succession for 2 ml of the DT-3TU / EPC-DNA sample. The results are summarized in FIG.
DNAμg当り0.75nmolから20nmol脂質の範囲内でDTTU/EPCリポソームをDNAに加えた。脂質量のこの変動範囲内で、ζ電位は−35mVから+15mVまで変動する。負の部分は図1、2及び3に示すものに相当し、すなわちDNAが完全に緊密化されていないときζ電位は負であった。より多くの脂質を加えるほどより多くのDNAが緊密化され、ζ電位はより一層ゼロに近づき、リポプレックスは事実上ゼロの表面電位を示す。その後ζ電位は8nmol脂質/μgDNA付近から正となる。この測定の相対性については、同じ実験の中の様々な試料の比較を考慮に入れるべきである。従って、弱い正の値までの脂質量の増加の関数としてのζ電位の推移に注目することが重要である。 DTTU / EPC liposomes were added to the DNA in the range of 0.75 nmol to 20 nmol lipid per μg DNA. Within this variation range of lipid mass, the zeta potential varies from -35 mV to +15 mV. The negative part corresponds to that shown in FIGS. 1, 2 and 3, ie the ζ potential was negative when the DNA was not fully compacted. As more lipid is added, more DNA is densified, the zeta potential is even closer to zero, and the lipoplex exhibits a virtually zero surface potential. Thereafter, the ζ potential becomes positive from around 8 nmol lipid / μg DNA. The relativity of this measurement should take into account the comparison of various samples within the same experiment. It is therefore important to note the transition of the zeta potential as a function of the increase in lipid content up to a weak positive value.
この実施例は、それ故、本発明によるトランスフェクション化合物、特にDT−3TUによるDNAの緊密化を確認し、形成されるリポプレックスが中性に近い表面電位を示すことを明らかにしている。 This example therefore confirms DNA compaction by the transfection compounds according to the invention, in particular DT-3TU, and reveals that the lipoplexes formed show a near neutral surface potential.
DT−3TU/DNA組成物のインビトロでのトランスフェクション
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物がインビトロで細胞をトランスフェクトする能力を示すことである。
In vitro transfection of DT-3TU / DNA composition The purpose of this example is to show the ability of the transfection compounds according to the invention to transfect cells in vitro.
この試験は、様々な量のDT−3TU:1.5又は5又は10又は15又は20nmolのDT−3TU/μgDNAを含むリポプレックスについて実施した。これらの条件の各々を、ウシ胎仔血清と共に及びウシ胎仔血清なしで(「+血清」又は「−血清」)で試験した。 This test was performed on lipoplexes containing various amounts of DT-3TU: 1.5 or 5 or 10 or 15 or 20 nmol DT-3TU / μg DNA. Each of these conditions was tested with and without fetal calf serum ("+ serum" or "-serum").
細胞培養:ヒト頸部上皮の癌から誘導したHeLa細胞(American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,MD,USAを、2mM L−グルタミン、50単位/mlのペニシリン及び50単位/mlのストレプトマイシンを添加したMEM(「最小必須培地」)型培地の存在下で培養した。培地及び添加物は、Gibco−BRL Life Technologies(Gaithersburg,MD,USA)より入手した。細胞を、インキュベーターにおいて5%二酸化炭素、37℃で、フラスコ内で培養した。 Cell culture: HeLa cells derived from cancer of human cervical epithelium (American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA with 2 mM L-glutamine, 50 units / ml penicillin and 50 units / ml streptomycin) The medium and additives were obtained from Gibco-BRL Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA) .The cells were 5% carbon dioxide in an incubator. The cells were cultured in a flask at 37 ° C.
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、HeLa細胞を30,000〜50,000細胞/穴の細胞数で240穴プレートに移した。これらの希釈度は、24時間後に約80%の集密度を示す。トランスフェクションのために、細胞を2回洗い、血清を含む(10%FCSv/v)又は血清を含まない培地500μlと共に37℃でインキュベートした。 Transfection: The day before transfection, HeLa cells were transferred to 240-well plates at a cell number of 30,000-50,000 cells / well. These dilutions show about 80% confluence after 24 hours. For transfection, cells were washed twice and incubated at 37 ° C. with 500 μl of medium with serum (10% FCSv / v) or without serum.
プラスミドDNA0.5μgを含む複合体50μlを各々の穴に加えた(複合体は少なくとも穴に添加する30分前に調製した)。37℃で2時間後、血清を含まないプレートに10%(v/v)FCS(「ウシ胎仔血清」)を補足した。 50 μl of complex containing 0.5 μg of plasmid DNA was added to each well (prepared at least 30 minutes before addition to the well). After 2 hours at 37 ° C., serum-free plates were supplemented with 10% (v / v) FCS (“Fetal Bovine Serum”).
すべてのプレートを37℃、5%二酸化炭素で24時間放置した。 All plates were left at 37 ° C., 5% carbon dioxide for 24 hours.
ルシフェラーゼ活性の定量:簡単に述べると、トランスフェクションした細胞をPBS(リン酸緩衝液)500μlで2回洗い、その後、試薬(Luciferase Assay SystemキットのPromega細胞培養溶解試薬)250μlで溶解した。4℃で5分間遠心分離した(12,000×g)溶解産物の上清10μlのアリコートをWallace Victor 2ルミノメーター(1420 Multilabel counter)で測定した。
Quantification of luciferase activity: Briefly, transfected cells were washed twice with 500 μl of PBS (phosphate buffer) and then lysed with 250 μl of reagent (Promega cell culture lysis reagent from Luciferase Assay System kit). A 10 μl aliquot of the supernatant of the lysate centrifuged for 5 minutes at 4 ° C. (12,000 × g) was measured with a
ルシフェラーゼ活性は、ルシフェリン、補酵素A及びATPの存在下で発光によって10秒間検定し、2000処置細胞に関して表わした。次にルシフェラーゼ活性を相対光単位(RLU、relative light units)で表わし、Pierce BCAキット(Rockford,IL,USA)を用いて得られた試料中のタンパク質濃度に関して基準化した。 Luciferase activity was assayed for 10 seconds by luminescence in the presence of luciferin, coenzyme A and ATP and expressed for 2000 treated cells. The luciferase activity was then expressed in relative light units (RLU) and normalized with respect to protein concentration in the samples obtained using the Pierce BCA kit (Rockford, IL, USA).
図5に要約する結果は、5又は10nmolのDT−3TU/μgDNAを含むリポプレックスについての最適トランスフェクション効率を示している。血清の存在は、すべての場合に、トランスフェクションの弱い阻害を誘導する。 The results summarized in FIG. 5 show the optimal transfection efficiency for lipoplexes containing 5 or 10 nmol DT-3TU / μg DNA. The presence of serum induces weak inhibition of transfection in all cases.
細胞に対するDTTU/DNAリポプレックスの毒性の測定
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物に毒性がないことを示すことである。
Measuring Toxicity of DTTU / DNA Lipoplexes to Cells The purpose of this example is to show that the transfection compounds according to the invention are not toxic.
トランスフェクション後に該タンパク質レベルを測定した。トランスフェクションのプロトコールは実施例8で述べたのと同じであった。 The protein level was measured after transfection. The transfection protocol was the same as described in Example 8.
タンパク質レベルの定量:簡単に述べると、トランスフェクションした細胞をPBS(リン酸緩衝液)500μlで2回洗い、その後、試薬(Luciferase Assay SystemキットのPromega細胞培養溶解試薬)250μlで溶解した。4℃で5分間遠心分離した(12,000×g)溶解産物の上清50μlのアリコートを、0.1Mヨードアセトアミド50μl、pH8.2の0.1M塩酸トリスの入った管に移し、37℃で1時間放置した。前記溶液20μlを96穴プレートに入れ、「BCAタンパク質アッセイ」試薬(Pierce,Montluson,France)200μlを加えた。次にプレートを2500回転/分で遠心分離し、その後37℃で30分間インキュベートした。平行して、試料に関して得た吸光度値を試料中に存在するタンパク質の量と相関させるために、ウシ血清アルブミン(BSA)レンジを調製した。 Protein level quantification: Briefly, transfected cells were washed twice with 500 μl PBS (phosphate buffer) and then lysed with 250 μl reagent (Promega cell culture lysis reagent from Luciferase Assay System kit). A 50 μl aliquot of the supernatant of the lysate centrifuged at 4 ° C. for 5 minutes (12,000 × g) was transferred to a tube containing 50 μl of 0.1 M iodoacetamide, 0.1 M Tris hydrochloride pH 8.2, 37 ° C. And left for 1 hour. 20 μl of the solution was placed in a 96-well plate and 200 μl of “BCA protein assay” reagent (Pierce, Montlucon, France) was added. The plates were then centrifuged at 2500 rpm and then incubated at 37 ° C. for 30 minutes. In parallel, a bovine serum albumin (BSA) range was prepared to correlate the absorbance values obtained for the sample with the amount of protein present in the sample.
図6に要約する結果は、0.75又は5又は10又は15又は20nmolのDT−3TU/μgDNAを含むリポプレックスという使用条件に関わりなく、同様のタンパク質レベルを示している。DTTU脂質の存在は、それ故、細胞に有害な影響を及ぼさず、使用した条件下で毒性を認めなかった。 The results summarized in FIG. 6 show similar protein levels regardless of the use conditions of lipoplexes containing 0.75 or 5 or 10 or 15 or 20 nmol DT-3TU / μg DNA. The presence of DTTU lipids therefore did not have a detrimental effect on the cells and was not toxic under the conditions used.
この実施例は、それ故、本発明によるトランスフェクション化合物の重要な利点の1つ、すなわち、おそらくそれらの構造内に正電荷が存在しないことに結びついた非常に低い毒性を示している。 This example therefore demonstrates one of the important advantages of the transfection compounds according to the invention, i.e. very low toxicity, possibly associated with the absence of a positive charge in their structure.
DT−3TU/DPPCナノ乳剤による核酸の緊密化
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が核酸と結合する能力を示すことである。
Nucleic acid compaction with DT-3TU / DPPC nanoemulsion The purpose of this example is to show the ability of the transfection compounds according to the invention to bind to nucleic acids.
これは、臭化エチジウム(EtBr)を使用して視覚化したDNAのアガロースゲル上での電気泳動遅延試験によって容易に明らかにしうる:ゲル上の核酸の移動が存在しないことは核酸の緊密化を示唆する。遊離核酸については、ゲル上での遅延を生じない。 This can be readily revealed by an electrophoretic delay test of DNA visualized using ethidium bromide (EtBr) on an agarose gel: the absence of nucleic acid migration on the gel reduces nucleic acid compaction. Suggest. For free nucleic acids, there is no delay on the gel.
DNAに対して種々の製剤のDT−3TU脂質を含む様々なDNA/DT−3TU試料をアガロースゲル(1N TBE中0.8%アガロース)上に置いた。電気泳動によってDNAを移動させるため、そのゲルを1時間半70V及び40mAの電流に供した。バンドをTBE及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。その結果を図8に示した。 Various DNA / DT-3TU samples containing various formulations of DT-3TU lipid relative to DNA were placed on an agarose gel (0.8% agarose in 1N TBE). The gel was subjected to a current of 70 V and 40 mA for one and a half hours to move the DNA by electrophoresis. Bands were revealed by absorption under TBE and UV light. The results are shown in FIG.
同様に、アガロースゲル(1N TBE中0.8%アガロース)を使用し、その上に、DNAに対して種々の製剤のDT−3TUジオール脂質を含むDNA/DT−3TUジオールの様々な試料を置いて、DT−3TUジオール化合物がDNAを緊密化する能力を示す。電気泳動によってDNAを移動させるため、ゲルを1時間半70V及び40mAの電流に供した。バンドを臭化エチジウム及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。 Similarly, an agarose gel (0.8% agarose in 1N TBE) is used on which various samples of DNA / DT-3TU diol containing various formulations of DT-3TU diol lipids are placed on DNA. DT-3TU diol compounds show the ability to consolidate DNA. In order to move the DNA by electrophoresis, the gel was subjected to a current of 70 V and 40 mA for 1.5 hours. Bands were revealed by absorption under ethidium bromide and ultraviolet light.
ゲルは、DNAが脂質と結合しなかったときのDNAの電気泳動移動(ウエル1)、及びDNAが脂質と結合したときの保持率の差を示す。ウエル2〜5は、カルシウム及びエタノールを含む又は含まないDT−3TU/DPPC(60nmolDT−3TU/μgDNA)ナノ乳剤と結合したDNA(0.01g/l)を示す。ウエル2は、Ca2+及びエタノールを含まない60nmol/μgDNAを示す。ウエル3には、2%のEtOHを加えた。ウエル4では、60当量のCa2+/PO− DNAを加えた。ウエル5には、2%のEtOHと60当量のCa2+を加えた。ウエル1と他のウエルとの比較は、検討した種々のDT−3TU製剤がゲル上のDNA移動を遅延させることを示唆している。Ca2+及びEtOHの透析後、同じ結果を認めた。
The gel shows the electrophoretic migration of DNA when DNA is not bound to lipid (well 1) and the difference in retention when DNA is bound to lipid. Wells 2-5 show DNA (0.01 g / l) bound to DT-3TU / DPPC (60 nmol DT-3TU / μg DNA) nanoemulsion with or without calcium and ethanol. Well 2 shows 60 nmol / μg DNA without Ca 2+ and ethanol. To well 3, 2% EtOH was added. In
この実施例は、それ故、種々の製剤に組み込まれたDT−3TU脂質が核酸を緊密化する能力を示している。 This example therefore demonstrates the ability of DT-3TU lipids incorporated into various formulations to consolidate nucleic acids.
安定化DT−3TU/DPPC複合体による核酸の緊密化
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が核酸に結合する能力を示すことである。
Nucleic Acid Tightening with Stabilized DT-3TU / DPPC Complex The purpose of this example is to show the ability of transfection compounds according to the present invention to bind to nucleic acids.
これは、臭化エチジウム(EtBr)を使用して視覚化したDNAのアガロースゲル上での電気泳動遅延試験によって容易に明らかにしうる:ゲル上の核酸の移動が存在しないことは核酸の緊密化を示唆する。遊離核酸については、ゲル上での遅延を生じない。 This can be readily revealed by an electrophoretic delay test of DNA visualized using ethidium bromide (EtBr) on an agarose gel: the absence of nucleic acid migration on the gel reduces nucleic acid compaction. Suggest. For free nucleic acids, there is no delay on the gel.
コレステロール−PEGに結合した又は結合していないDNAに対して漸増量のDT−3TU脂質を含む様々なDNA/DT−3TU/DPPC及びDNA/DT−3TUジオール/DPPC試料をアガロースゲル(1N TBE中0.8%アガロース)上に置いた。電気泳動によってDNAを移動させるため、そのゲルを1時間半70V及び70mAの電流に供した。バンドを臭化エチジウム及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。その結果を図9に示す。 Various DNA / DT-3TU / DPPC and DNA / DT-3TU diol / DPPC samples containing increasing amounts of DT-3TU lipid relative to cholesterol-PEG-conjugated or non-conjugated DNA were agarose gel (in 1N TBE). 0.8% agarose). The gel was subjected to a current of 70 V and 70 mA for one and a half hours to move the DNA by electrophoresis. Bands were revealed by absorption under ethidium bromide and ultraviolet light. The result is shown in FIG.
DT−3TU/DPPC製剤においてコレステロール−PEGを使用することは、脂質−PEGが存在しない場合は凝集を導くであろうような脂質の量まで粒子サイズを縮小することを可能にするという利点を持つ。この結果の興味深い点は、インビボで注入するトランスフェクション化合物の量を最適化することである。実際に、血清タンパク質を潜在的対象とするのに必要な粒子の大きさは、血流中での半減期を上昇させるために、主として500nm未満でなければならない。この大きさの粒子を得るためには、少なくとも40nmolの脂質DT−3TU/μgDNAを使用する必要がある。それ故、脂質DT−3TUの製剤中で脂質−PEGを使用することは、DNAを緊密化し、500nmより小さいサイズの粒子を形成するために必要なDT−3TUの量を低減するという利点を持つ。 The use of cholesterol-PEG in the DT-3TU / DPPC formulation has the advantage of allowing the particle size to be reduced to the amount of lipid that would lead to aggregation in the absence of lipid-PEG. . An interesting aspect of this result is to optimize the amount of transfection compound injected in vivo. In fact, the particle size required to target serum proteins must be primarily less than 500 nm in order to increase the half-life in the bloodstream. In order to obtain particles of this size, it is necessary to use at least 40 nmol of lipid DT-3TU / μg DNA. Therefore, the use of lipid-PEG in the formulation of lipid DT-3TU has the advantage of reducing the amount of DT-3TU required to compact the DNA and form particles of a size smaller than 500 nm. .
ゲルは、DNAが脂質と結合しなかったときのDNAの電気泳動移動(ウエル1)、及びDNAが脂質と結合したときの保持率の差を示す。ウエル2〜5は、粒子の安定化剤としてコレステロール−PEG(20単位のエチレングリコール)を含む又は含まない、漸増量のDT−3TU/DPPCナノ乳剤と結合したDNA(0.01g/l)を示す。ウエル2は、20nmol/μgDNA+15%コレステロール−PEGを示す。ウエル3は、20nmol/μgDNA+20%コレステロール−PEGを含む。ウエル4は、30nmol/μgDNA+15%コレステロール−PEGを示し、ウエル5は、20nmol/μgDNA+20%コレステロール−PEGを示す。ウエル1と他のウエルとの比較は、検討した種々のDT−3TU製剤がゲル上のDNA移動を遅延させることを示唆しており、複合体からDNAを遊離させることなく、従って複合体を不安定にすることなく、これらの製剤中にポリエチレングリコールのポリマーが組み込まれている可能性を示している。
この実施例は、それ故、安定化粒子の形態のDT−3TU脂質が核酸を緊密化する能力を示している。
The gel shows the electrophoretic migration of DNA when DNA is not bound to lipid (well 1) and the difference in retention when DNA is bound to lipid. Wells 2-5 contain increasing amounts of DNA (0.01 g / l) combined with DT-3TU / DPPC nanoemulsion with or without cholesterol-PEG (20 units ethylene glycol) as a particle stabilizer. Show. Well 2 shows 20 nmol / μg DNA + 15% cholesterol-PEG. Well 3 contains 20 nmol / μg DNA + 20% cholesterol-PEG. Well 4 represents 30 nmol / μg DNA + 15% cholesterol-PEG, and well 5 represents 20 nmol / μg DNA + 20% cholesterol-PEG. Comparison of well 1 with the other wells suggests that the various DT-3TU formulations studied retarded DNA movement on the gel, thus freeing the DNA from the complex and thus making the complex uninhibited. It shows the possibility of incorporating polyethylene glycol polymers into these formulations without stabilization.
This example therefore demonstrates the ability of DT-3TU lipids in the form of stabilized particles to consolidate nucleic acids.
DT−4TU(15)の存在下での核酸の緊密化
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が核酸に結合する能力を示すことである。
Nucleic acid compaction in the presence of DT-4TU (15) The purpose of this example is to show the ability of the transfection compounds according to the invention to bind to nucleic acids.
これは臭化エチジウムによる蛍光試験によって容易に明らかにすることができる:蛍光が存在しないことは遊離核酸が存在しないことを示唆し、それは核酸がトランスフェクション化合物によって緊密化されたことを意味する。 This can be readily revealed by fluorescence studies with ethidium bromide: the absence of fluorescence suggests that no free nucleic acid is present, which means that the nucleic acid has been intimated by the transfection compound.
該核酸を、核酸の溶液中での様々な力価の脂質溶液の等容量混合によって、漸増量のDT−4TUと接触させた。0.01μg/mlの濃度の核酸複合体800μlの試料を、漸増量のDT−4TU(15)を含む150mM塩化ナトリウム溶液中で調製した。 The nucleic acid was contacted with increasing amounts of DT-4TU by mixing equal volumes of lipid solutions of various titers in the nucleic acid solution. A sample of 800 μl of nucleic acid complex at a concentration of 0.01 μg / ml was prepared in a 150 mM sodium chloride solution containing increasing amounts of DT-4TU (15).
同様に、3チオ尿素を含む脂質(図2参照)と4チオ尿素を含む脂質の複合体形成の効率を比較するために、該核酸を、核酸の溶液中での様々な力価の脂質溶液の等容量混合により漸増量のDT−3TU(12)と接触させることによって対照を調製した。このようにして、0.01μg/mlの濃度の核酸複合体800μlの試料を、漸増量のDPPCを含む5%グルコース溶液中で調製した。 Similarly, to compare the efficiency of complex formation of lipids containing 3 thiourea (see FIG. 2) and lipids containing 4 thiourea, the nucleic acid was added to various titers of lipid solutions in nucleic acid solutions. A control was prepared by contacting with increasing amounts of DT-3TU (12) by equal volume mixing. Thus, a sample of 800 μl of nucleic acid complex at a concentration of 0.01 μg / ml was prepared in a 5% glucose solution containing increasing amounts of DPPC.
臭化エチジウム蛍光を、それぞれ260nmと590nmの励起及び発光波長でFluoroMax−2(Jobin Yvon−Spex)を使用して測定した。励起と発光のためのスリット幅は5nmに設定した。DNA/脂質溶液(0.01g/l DNA)1mlにつき臭化エチジウム(1g/l)3μlを加えた後、蛍光値を記録した。その結果を図10に要約する。 Ethidium bromide fluorescence was measured using FluoroMax-2 (Jobin Yvon-Spex) at excitation and emission wavelengths of 260 nm and 590 nm, respectively. The slit width for excitation and emission was set to 5 nm. After adding 3 μl of ethidium bromide (1 g / l) per ml of DNA / lipid solution (0.01 g / l DNA), the fluorescence value was recorded. The results are summarized in FIG.
四角記号の曲線は、固定量の核酸(8μg)に対する漸増量のDT−3TU/DPPC脂質混合物(0.75nmolから30nmolのDT−3TU)の添加が、DNAの塩基対の間への臭化エチジウムの挿入の低下に結びつく蛍光の低下を誘導することを示している。これは、DT−3TU/DPPCリポソームとDNAの間の結びつきが、その複合体から臭化エチジウムを排除するのに十分なほど強かったことを示唆する。我々はそれ故、30nmolのDT−3TU/DPPC脂質/μgDNAを使用して70%のDNA緊密化を得ることができた。この脂質/DNA結合におけるDT−3TUの積極的な役割は図1及び2に示されている。同様に、漸増量のDT−4TU/DPPC脂質混合物(0.75nmolから30nmolのDT−3TU)を固定量の核酸(8μg)に加えた。この組合せは、DNAの塩基対の間への臭化エチジウムの挿入の低下に結びつく蛍光の低下を誘導する。これは、DT−4TU/DPPCリポソームとDNAの間の結びつきが、その複合体から臭化エチジウムを排除するのに十分なほど強かったことを示唆する。我々はそれ故、30nmolの脂質/μgDNAに関して60%のDNA緊密化を得ることができ(図10、丸印記号の曲線)、これは同じ条件を使用したDT−3TU複合体形成の効率と同様であった。 The squared curve shows that the addition of increasing amounts of DT-3TU / DPPC lipid mixture (0.75 nmol to 30 nmol DT-3TU) to a fixed amount of nucleic acid (8 μg) results in ethidium bromide between DNA base pairs. It has been shown to induce a decrease in fluorescence that leads to a decrease in insertion. This suggests that the association between DT-3TU / DPPC liposomes and DNA was strong enough to eliminate ethidium bromide from the complex. We were therefore able to obtain 70% DNA constriction using 30 nmol DT-3TU / DPPC lipid / μg DNA. The active role of DT-3TU in this lipid / DNA binding is illustrated in FIGS. Similarly, increasing amounts of DT-4TU / DPPC lipid mixture (0.75 nmol to 30 nmol DT-3TU) were added to a fixed amount of nucleic acid (8 μg). This combination induces a decrease in fluorescence that leads to a decrease in ethidium bromide insertion between DNA base pairs. This suggests that the association between DT-4TU / DPPC liposomes and DNA was strong enough to eliminate ethidium bromide from the complex. We can therefore obtain 60% DNA constriction for 30 nmol lipid / μg DNA (FIG. 10, circled curve), which is similar to the efficiency of DT-3TU complex formation using the same conditions Met.
この実施例は、それ故、DT−4TU脂質が核酸に結合する能力を示している。 This example therefore demonstrates the ability of DT-4TU lipids to bind nucleic acids.
DT−3TU/DPPC複合体によるデオキシリボヌクレアーゼからのDNAの保護
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が酵素加水分解、すなわちデオキシリボヌクレアーゼから核酸を保護する能力を示すことである。
Protection of DNA from deoxyribonuclease by DT-3TU / DPPC complex The purpose of this example is to show the ability of the transfection compounds according to the present invention to enzymatic hydrolysis, ie to protect nucleic acids from deoxyribonuclease.
これは、臭化エチジウム(EtBr)を使用して視覚化したDNAのアガロースゲル上での電気泳動遅延試験によって容易に明らかにしうる。遊離DNA又は脂質と複合したDNAを適切な量のデオキシリボヌクレアーゼで処理した。そのDNAを酵素消化混合物から抽出し、アガロースゲル上に置いた。その移動を処理しなかった核酸の移動と比較することによってDNAの完全性を確認した。 This can be readily revealed by an electrophoretic delay test on DNA agarose gel visualized using ethidium bromide (EtBr). Free DNA or DNA complexed with lipids was treated with an appropriate amount of deoxyribonuclease. The DNA was extracted from the enzyme digestion mixture and placed on an agarose gel. The integrity of the DNA was confirmed by comparing the movement with that of untreated nucleic acid.
あらかじめ2×10−4Mのデオキシリボヌクレアーゼ(Sigma)で処理した様々なDNA試料をアガロースゲル(1N TBE中0.8%アガロース)上に置いた。遊離DNA及びDNAと比較して漸増量のDT−3TU脂質と複合したDNAに関して、デオキシリボヌクレアーゼによる処理を実施した。電気泳動によってDNAを移動させるため、ゲルを1時間半70V及び40mAの電流に供した。バンドを臭化エチジウム及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。その結果を図11に示す。 Various DNA samples previously treated with 2 × 10 −4 M deoxyribonuclease (Sigma) were placed on an agarose gel (0.8% agarose in 1N TBE). Treatment with deoxyribonuclease was performed on free DNA and DNA complexed with increasing amounts of DT-3TU lipids compared to DNA. In order to move the DNA by electrophoresis, the gel was subjected to a current of 70 V and 40 mA for 1.5 hours. Bands were revealed by absorption under ethidium bromide and ultraviolet light. The result is shown in FIG.
ゲルは、デオキシリボヌクレアーゼで処理しなかったときのDNAの電気泳動移動(ウエル1)、及び処理後の保持率の差を示す。ウエル2は、2×10−4Mのデオキシリボヌクレアーゼで処理したときの同じ量のDNA(3μg)を示す。この処理(2×10−4Mのデオキシリボヌクレアーゼ、30分間、37℃)後、対応するバンドは認められず、DNAの分解を示唆している。30及び40nmolのDT−3TU脂質/μgDNA及び40nmolのDT−3TU脂質+Chol−PEGと複合した核酸を2×10−4Mのデオキシリボヌクレアーゼで処理した。フェノール/クロロホルムの混合物を使用してDNAを抽出し、沈殿させたあと、それぞれウエル3、4及び5のアガロースゲル上に置いた。それらのDNAの移動は、あらかじめデオキシリボヌクレアーゼで処理しなかったDNAの移動と同様であった。これは、前記DNAが無傷であり、デオキシリボヌクレアーゼでの処理によって損なわれていなかったこと、従ってDT−3TU脂質がDNAを保護したことを示唆している。DT−3TU脂質複合体中のDNAは、従って、酵素加水分解の影響を受けず、核酸はデオキシリボヌクレアーゼの加水分解から保護された。
The gel shows the difference in electrophoretic migration of DNA (well 1) and retention after treatment when not treated with deoxyribonuclease. Well 2 shows the same amount of DNA (3 μg) when treated with 2 × 10 −4 M deoxyribonuclease. After this treatment (2 × 10 −4 M deoxyribonuclease, 30 minutes, 37 ° C.), no corresponding band was observed, suggesting DNA degradation. Nucleic acids conjugated with 30 and 40 nmol DT-3TU lipid / μg DNA and 40 nmol DT-3TU lipid + Chol-PEG were treated with 2 × 10 −4 M deoxyribonuclease. DNA was extracted using a mixture of phenol / chloroform and precipitated, then placed on agarose gels in
この実施例は、それ故、DT−3TU脂質が核酸を酵素加水分解から保護する能力を示している。 This example therefore demonstrates the ability of DT-3TU lipids to protect nucleic acids from enzymatic hydrolysis.
DT−3TU/DPPC複合体による血清からのDNAの保護
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が、血清中での分解から核酸を保護する能力を示すことである。
Protection of DNA from serum by DT-3TU / DPPC complex The purpose of this example is to show the ability of the transfection compounds according to the invention to protect nucleic acids from degradation in serum.
これは、臭化エチジウム(EtBr)を使用して視覚化したDNAのアガロースゲル上での電気泳動遅延試験によって容易に明らかにしうる。遊離DNA又は脂質と複合したDNAを種々の量の血清と共に37℃でインキュベートした。血清から抽出した後、DNAをアガロースゲル上に置き、その移動をインキュベートしなかった核酸の移動と比較することによってDNAの完全性を確認した。 This can be readily revealed by an electrophoretic delay test on DNA agarose gel visualized using ethidium bromide (EtBr). Free DNA or DNA complexed with lipids was incubated with various amounts of serum at 37 ° C. After extraction from serum, DNA integrity was confirmed by placing the DNA on an agarose gel and comparing the transfer with the transfer of unincubated nucleic acids.
あらかじめ150mMのNaCl、20%及び100%血清中でインキュベートした様々なDNA試料をアガロースゲル(1N TBE中0.8%アガロース)上に置いた。遊離DNA及びDNAと比較して漸増量のDT−3TUと複合したDNAに関して、塩類溶液及び血清による処理を実施した。電気泳動によってDNAを移動させるため、ゲルを1時間半70V及び40mAの電流に供した。バンドを臭化エチジウム及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。その結果を図12に示す。 Various DNA samples previously incubated in 150 mM NaCl, 20% and 100% serum were placed on an agarose gel (0.8% agarose in 1N TBE). Treatment with saline and serum was performed on free DNA and DNA complexed with increasing amounts of DT-3TU compared to DNA. In order to move the DNA by electrophoresis, the gel was subjected to a current of 70 V and 40 mA for 1.5 hours. Bands were revealed by absorption under ethidium bromide and ultraviolet light. The result is shown in FIG.
ゲルは、処理しなかったDNA(ブランク)の電気泳動移動(ウエル1)、遊離DNAを塩類溶液(150mMのNaCl)中で処理したとき(ウエル2)、DNAを40nmolのDT−3TU脂質/μgDNAと複合したとき(ウエル3)の保持率の差を示す。塩類溶液から抽出したDNAの移動は2つのウエルにおいて同様であった。これは、DNAがこれらの条件下で無傷に保持されたことを示唆する。次のウエルは、同じ順序で、2つの異なる血清条件:ウエル4〜5については20%血清及びウエル6〜7については100%血清、でのDNA(ウエル4及び6)、DNA+40nmolのDT−3TU脂質(ウエル5及び7)を示す。DNAが遊離しているとき、上述した両方の血清条件下で、37℃で30分後に核酸は完全に分解された(ウエル4及び6)。他方で、DT−3TU/DPPCナノ乳剤とのDNA複合体形成は、DNAに対応する移動バンドが認められたことから、核酸の保護を誘導する(ウエル5及び7)。DT−3TU脂質複合体中のDNAは、それ故、遊離DNAと比較したとき、血清中で分解から保護された。
Gels were electrophoretic transfer of untreated DNA (blank) (well 1), when free DNA was treated in saline (150 mM NaCl) (well 2), the DNA was 40 nmol of DT-3TU lipid / μg DNA. The difference in retention rate when combined with (well 3) is shown. The migration of DNA extracted from the saline solution was similar in the two wells. This suggests that the DNA was kept intact under these conditions. The next well, in the same order, had two different serum conditions: 20% serum for wells 4-5 and 100% serum for wells 6-7, DNA (
この実施例は、それ故、血清中での分解から核酸を保護するDT−3TU脂質の能力を示している。 This example therefore demonstrates the ability of DT-3TU lipids to protect nucleic acids from degradation in serum.
DT−3TU/DNA組成物のインビボトランスフェクション
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物がインビボで生体組織をトランスフェクトする能力を示すことである。
In Vivo Transfection of DT-3TU / DNA Composition The purpose of this example is to show the ability of the transfection compounds according to the present invention to transfect biological tissues in vivo.
これは、ルシフェラーゼについてのコードDNA複合体を筋肉内注入することによって明らかにしうる。注入の96時間後に筋肉試料を採取し、ルミノメーター(Wallace)を使用してルシフェラーゼの発現レベルを測定した。 This can be revealed by intramuscular injection of the coding DNA complex for luciferase. Muscle samples were taken 96 hours after injection and the expression level of luciferase was measured using a luminometer (Wallace).
漸増量のDT−3TU脂質/μgDNAを含む複合体をマウスの脛骨筋及び頭蓋筋に注入し、それに電気パルスを適用するか又は適用しなかった(Bureau,M.ら、BBA2000)。 A complex containing increasing amounts of DT-3TU lipid / μg DNA was injected into the tibialis and cranial muscles of mice with or without applying electrical pulses (Bureau, M. et al., BBA2000).
40nmol及び60nmolの漸増量のDT−3TU脂質/μgDNAを含む複合体を、3μgDNA/動物を含有する30μLの容量で脛骨筋及び頭蓋筋に注入した。マウスC57bl/6には、あらかじめケタミン/キシラジンの混合物で麻酔を施した。注入に続いて、筋の両方の末端に設置した電極を使用して経皮的に電気パルスを適用するか又は適用しなかった(Bureau,M.ら、BBA2000)。 Complexes containing 40 nmol and 60 nmol increasing amounts of DT-3TU lipid / μg DNA were injected into the tibial and cranial muscles in a volume of 30 μL containing 3 μg DNA / animal. Mouse C57bl / 6 was previously anesthetized with a mixture of ketamine / xylazine. Following injection, electrical pulses were or were not applied percutaneously using electrodes placed at both ends of the muscle (Bureau, M. et al., BBA2000).
注入の96時間後、マウスを安楽死させ、筋肉試料を採取して、緩衝溶解溶液1ml中で摩砕した。遠心分離(10分間、12000rpm、4℃)後、上清(10μl)を採取し、96穴プレートに入れて、ルシフェラーゼ基質50μlを加えた後ルシフェラーゼを読み取った。ルミノメーター(Wallace,Victor)を使用して上清中の発光のレベルを読み取った。 96 hours after injection, mice were euthanized and muscle samples were taken and triturated in 1 ml of buffered lysis solution. After centrifugation (10 minutes, 12000 rpm, 4 ° C.), the supernatant (10 μl) was collected, placed in a 96-well plate, 50 μl of luciferase substrate was added, and luciferase was read. The level of luminescence in the supernatant was read using a luminometer (Wallace, Victor).
得られた結果を図13に示す。それらの結果は、核酸と結合した脂質の量、20nmol及び40nmolのDT−3TU脂質/μgDNAに対する発現のレベルを表わしている。得られた種々の発現レベルは有意であり、筋を対照としたときに得られたバックラウンドノイズ(5.0×104)を上回っていた。種々の量のDT−3TU脂質と複合したDNAは、それ故、有意のトランスフェクションレベルで筋肉組織をトランスフェクトすることができた。 The obtained result is shown in FIG. The results represent the amount of lipid bound to the nucleic acid, the level of expression for 20 nmol and 40 nmol DT-3TU lipid / μg DNA. The various expression levels obtained were significant and exceeded the background noise (5.0 × 10 4 ) obtained when using muscle as a control. DNA complexed with various amounts of DT-3TU lipid could therefore transfect muscle tissue at significant transfection levels.
この実施例は、本発明によるトランスフェクション化合物がインビボで組織をトランスフェクトする能力を示している。 This example demonstrates the ability of the transfection compounds according to the present invention to transfect tissues in vivo.
DT−3TU/DPPC/DNA複合体のインビボでの生体分布
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が、それらの中性特性のゆえにインビボで血流中により長い時間とどまる能力を示すことである。
In vivo biodistribution of DT-3TU / DPPC / DNA complexes The purpose of this example is to demonstrate the ability of the transfection compounds according to the present invention to remain in the bloodstream in vivo longer due to their neutral properties It is.
これは、蛍光脂質を含むDNAをマウス血流中に注入することによって明らかにしうる。注入後種々の時点で血液試料を採取し、FluoroMax−2(Jobin Yvon−Spex)を用いて血流中の蛍光のレベルを測定した。 This can be revealed by injecting DNA containing fluorescent lipids into the mouse bloodstream. Blood samples were collected at various times after injection and the level of fluorescence in the bloodstream was measured using FluoroMax-2 (Jobin Yvon-Spex).
40nmolのDT−3TU脂質/μgDNAを含む複合体、1モル当量のDPPC/DT−3TU脂質及び(脂質総量の)0.7%の脂質−ローダミンを、11μgDNA/動物を含有する200μLの容量で尾静脈に注入した。マウスC57bl/6にはケタミン/キシラジンの混合物で麻酔を施した。 Complex containing 40 nmol DT-3TU lipid / μg DNA, 1 molar equivalent of DPPC / DT-3TU lipid and 0.7% lipid-rhodamine (total lipid) in a volume of 200 μL containing 11 μg DNA / animal Infused intravenously. Mouse C57bl / 6 was anesthetized with a mixture of ketamine / xylazine.
注入後、30分、1時間及び6時間目に、マウスを麻酔した状態で心臓穿刺によって血液試料を採取した。マウスを安楽死させたあと、直ちに肝臓、脾臓及び肺を摘出し、計量して、PBS(5μl/mg組織)中で均質化した。血液100μLから脂質を抽出し、クロロホルム/メタノール混合物(1/1)3mlを使用して、30分間強く攪拌し、その後遠心分離することによって器官を均質化した。FluoroMax−2(Jobin Yvon−Spex)を用いてそれぞれ550nmと590nmの励起及び発光波長で、上清中の蛍光を測定した。励起及び発光のためのスリット幅は5nmに設定した。 At 30 minutes, 1 hour and 6 hours after injection, blood samples were collected by cardiac puncture with the mice anesthetized. Immediately after euthanizing the mice, the liver, spleen and lungs were removed, weighed and homogenized in PBS (5 μl / mg tissue). Lipid was extracted from 100 μL of blood and the organ was homogenized by using 3 ml of chloroform / methanol mixture (1/1) and stirring vigorously for 30 minutes, followed by centrifugation. The fluorescence in the supernatant was measured using FluoroMax-2 (Jobin Yvon-Spex) at excitation and emission wavelengths of 550 nm and 590 nm, respectively. The slit width for excitation and emission was set to 5 nm.
結果を図14に要約する。それらは、注入後30分、1時間及び6時間眼に血液、肺及び細網内皮系(肝臓と脾臓を合わせて)から得た注入用量のパーセンテージを表わしている。30分後の血液中の蛍光の測定値は注入用量の50%であり、カチオン型のDNA界面活性剤に関して得られるものをはるかに上回っていた。1時間後には、注入用量の17%が検出でき、やはりカチオン型複合体と比較して著明な改善を示している。これらの脂質/DNA複合体の中性特性(ζ電位は非常に弱い正であった:図4)は、それ故、血清タンパク質に対して潜伏性の(furtive)粒子を得るための事実上の利点である。中性特性はまた、マクロファージ及び肝臓及び脾臓のクップファー細胞との相互作用も制限するはずであり、このことが、注入後30分及び1時間目に血液中で認められたリポソームの量を説明すると考えられる。
The results are summarized in FIG. They represent the percentage of infusion dose obtained from blood, lung and reticuloendothelial system (liver and spleen combined) at 30 minutes, 1 hour and 6 hours after injection. Measured fluorescence in the blood after 30 minutes was 50% of the injected dose, far exceeding what was obtained for cationic DNA surfactants. After 1 hour, 17% of the injected dose can be detected, again showing a marked improvement compared to the cationic complex. The neutral nature of these lipid / DNA complexes (ζ potential was very weak positive: FIG. 4), therefore, is the de facto factor to obtain a latent particle for serum proteins. Is an advantage. Neutral properties should also limit interactions with macrophages and liver and spleen Kupffer cells, which explains the amount of liposomes found in the
肺で検出されたリポプレックスの量は、カチオン性リポプレックスを使用したときに認められた量と比較して低かった。リポソームの中性特性は、肺の陰性内皮との非特異的相互作用も低下させるはずである。 The amount of lipoplex detected in the lung was lower compared to the amount observed when using cationic lipoplex. The neutral nature of liposomes should also reduce nonspecific interactions with the negative endothelium of the lung.
この実施例は、本発明によるトランスフェクション化合物が血清タンパク質に対して潜伏性である能力を示している。 This example demonstrates the ability of the transfection compounds according to the present invention to be latent for serum proteins.
Claims (28)
nは、2、3、4、5、又は6であり、
mは、2、3、又は4であり、各々のm値は、各々の基−[NH−CS−NH−(CH)m]−について独立して選択され、
Xは、1個から8個の炭素原子を含む飽和又は不飽和直鎖又は環状脂肪族基、メルカプトメチル(−CH2SH)基、又は−(CH2)x−(CHOH)u−H[式中、xは1〜10から選択される整数であり、uは1、2、3、4、5又は6である]もしくは−(OCH2CH2O)v−H[式中、vは、1、2又は3である]で表される親水鎖であり、
Yは1個から6個の炭素原子を有するアルキル、ケトン、エステル、エーテル、アミド、アミジン、カルバメート又はチオカルバメート官能基、グリセロール、尿素、チオ尿素、又は芳香環から選択される少なくとも1個の化学官能基を含むスペーサーであって、
R1とR2は、互いに独立して、水素原子又は脂肪族鎖であり、該脂肪族鎖は10個から22個の炭素原子及び任意に少なくとも1つの不飽和を含むアルキル基から選択され、R1及びR2の少なくとも1個は水素原子ではない]
の化合物、又はその異性体、又はそれらの混合物。Formula (III):
n is 2, 3, 4, 5, or 6;
m is 2, 3, or 4 and each m value is independently selected for each group — [NH—CS—NH— (CH) m ] —
X is a saturated or unsaturated linear or cyclic aliphatic group containing 1 to 8 carbon atoms, a mercaptomethyl (—CH 2 SH) group, or — (CH 2 ) x — (CHOH) u —H [ Wherein x is an integer selected from 1 to 10 and u is 1, 2, 3, 4, 5 or 6] or — (OCH 2 CH 2 O) v —H [wherein v is a hydrophilic chain represented by 1, 2 or 3,
Y is at least one chemistry selected from alkyl, ketone, ester, ether, amide, amidine, carbamate or thiocarbamate functional group having 1 to 6 carbon atoms, glycerol, urea, thiourea, or aromatic ring A spacer containing a functional group,
R 1 and R 2 are independently of one another a hydrogen atom or an aliphatic chain, the aliphatic chain being selected from an alkyl group containing 10 to 22 carbon atoms and optionally at least one unsaturation; At least one of R 1 and R 2 is not a hydrogen atom]
Or an isomer thereof, or a mixture thereof.
を含む、請求項1に記載の化合物、又はその異性体、又はそれらの混合物。Formula (IV):
The compound of Claim 1 containing this, or its isomer, or mixtures thereof.
−NH−C(O)−CH2−CH2− (V)
又は−(CH2)i−W−(CH2)j− (VI)
[式中、i及びjは、1から6までの整数であり、及びWは、ケトン、エステル、エーテル、アミド、アミジン、カルバメート又はチオカルバメート官能基、グリセロール、尿素、チオ尿素、又は選択的に芳香環である]
の基である、請求項1又は2に記載の化合物。The spacer is represented by formula (V) or formula (VI):
—NH—C (O) —CH 2 —CH 2 — (V)
Or - (CH 2) i -W- ( CH 2) j - (VI)
Wherein i and j are integers from 1 to 6 and W is a ketone, ester, ether, amide, amidine, carbamate or thiocarbamate functional group, glycerol, urea, thiourea, or optionally It is an aromatic ring]
The compound of Claim 1 or 2 which is group of these.
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