JP4275736B2 - 診断方法と装置 - Google Patents
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Description
本発明は、ビタミンＤレセプター遺伝子における多型に基づく診断方法および装置に関する。より詳細には、本発明は、この多型の存在についてスクリーニングすることによる、特定の疾患状態に対する素因または罹患し易さの診断のための方法に関する。本発明はまた、多型についてスクリーニングするための組成物に関する。
変形性関節症（または退行性の間接疾患としても知られる）は、関節炎の最も一般的な型の１つである。これは、間接の軟骨の故障、骨に対して骨を摩擦させることを引き起こし、そして疼痛および運動の損失を引き起こすことによって特徴付けられる。変形性関節症は、非常に穏やかなものから非常に重篤なものにわたり得、そして中年以上の人々にきわめて一般に発症し得る。これは、手および体重軸受け関節（例えば、膝、股関節部、足および背中）に発症する。
年齢が主な危険因子であるが、現在まで、この条件の病因および病原は、ほとんどわからないままである。多くの環境性の因子および他の独立した条件が、変形性関節症と関連しており、それらには、肥満、以前の外傷および/またはメニセクトミー（menisectomy）、膝を曲げる職業、喫煙、性ホルモン、婦人科の障害および他の代謝的因子が含まれる。肥満は、膝の変形性関節症を導き得る。さらに、スポーツ、繰り返しの運動、または事故のために関節に損傷を有する人々は、変形性関節症を発生する増大した危険にあり得る。
現在、変形性関節症の正確な診断は、一般に、その疾患が有意に進行したときにのみ可能である。臨床医は、身体検査および兆候の病歴に基づいて変形性関節症の診断を行うより多くはできない。Ｘ線は、代表的には、診断を確認するためのみに使用される。
最近の研究により、過体重である中年の人々における体重減少は、その危険性を有意に減少させるか、またはさらに膝の変形性関節症が発生することを妨げ得ることが結論付けられた。このような場合、変形性関節症に対する素因または罹患し易さの診断の正確性を改善する能力は、明確に有益である。
本発明の目的は、変形性関節症の診断を改善することである。本発明の詳細な目的は、変形性関節症に対する素因または罹患し易さの診断方法を提供することである。さらなる目的は、そのような診断の後に、疾患が有意に確立される前に変形性関節症の予防的処置または対症療法の方法を提供することである。別の目的は、変形性関節症に対する素因または罹患し易さを診断するための手段を提供する。
第１の局面において、本発明は、ビタミンＤレセプター遺伝子における遺伝的多型と関連する疾患を、その疾患に対して素因を有するかまたは罹患し易い動物において診断する方法を提供する。この方法は、動物においてビタミンＤレセプターの遺伝子型を決定する工程を含む。本発明の第１の局面は、さらに、ビタミンＤレセプター遺伝子における遺伝的多型と関連する疾患に対して素因を有するかまたは罹患し易い動物を同定する方法を提供する。この方法は、動物においてビタミンＤレセプター遺伝子の遺伝子型を決定する工程を含む。
本発明の第１の局面の実施態様によれば、変形性関節症に対する素因または罹患し易さの診断方法が提供され、これは個体のビタミンＤレセプター遺伝子の遺伝子型を決定する工程を含む。代表的には、この方法は、個体がビタミンＤレセプター遺伝子の別バージョンについてヘテロ接合性であるか、またはホモ接合性であるかどうかを決定する工程を含む。本発明の実施態様において、この診断方法は、ビタミンＤレセプター遺伝的多型に関連する変形性関節症のような状態または疾患の危険にある個体についてスクリーニングすることである。
ビタミンＤレセプター遺伝子の多型は公知であり、そして本発明は、ビタミンＤレセプター遺伝子（特に、この遺伝子のエキソン９およびエキソン７から3’UTRまでの領域）における多型と変形性関節症に対する素因または罹患し易さとの間の関係の観察に基づく。本発明は、多型の存在についてスクリーニングすることによって、疾患に対する遺伝的な素因または罹患し易さを有するようである個体を同定することが可能である点で有利である。代表的には、スクリーニングは、インビトロ技術を用いて達成される。
本発明の実施態様において、診断は、ビタミンＤレセプター遺伝子のフラグメントが制限酵素TaqIの切断部位を含むかどうかを決定することによって実行される。次いで、個体は、代表的には、そのフラグメントがTaqIの切断部位を含むかどうかによって分類される。ここで、その切断部位を含むフラグメントを保有することは、変形性関節症に対する素因または罹患し易さの危険性の減少と関連する。
従って、TaqI切断部位が存在しないビタミンＤレセプター遺伝子は、この遺伝子の危険多型、すなわち、変形性関節症に対する素因または罹患し易さの危険の増大と関連する、この遺伝子の多型性変種として分類され得る。ヒトゲノムは、染色体の組の各々に１つづつ、２つのビタミンＤレセプター遺伝子を含むので、従って、個体は、危険多型に対してホモ接合性もしくはヘテロ接合性であるか、または危険多型を欠失していることが見出され得る。
本発明のさらなる実施態様において、本方法は、ビタミンＤレセプター遺伝子のフラグメントが制限酵素BsmIの切断部位を含むかどうかを決定する工程を含む。個体は、切断部位を含むかまたは含まないかによって分類され、ここで、切断部位を含まないことについてホモ接合型であることは、変形性関節症に対する素因または罹患しやすさの危険性の減少と関連する。この実施態様において、BsmI切断部位を含む遺伝子の多形は、遺伝子の危険多形である。
本発明のなおさらなる実施態様において、本方法は、ビタミンＤレセプター遺伝子のフラグメントが制限酵素ApoIの切断部位を含むかどうかを決定する工程を含む。個体の、変形性関節症に対する素因または罹患し易さの危険性は、その遺伝子が、ApoIの切断部位を含む場合に増大していると分類され、そしてその切断部位の存在についてホモ接合性であることは、個体が増大した危険性にありそうであることを示す。
本方法は、ビタミンＤレセプターのフラグメントを増幅し、コピーを生成する工程およびそのフラグメントのコピーが制限酵素TaqI、BsmIまたはApoIの内の１つの切断部位を含むかどうかを決定する工程を都合よく含む。本方法は、必要に応じて、これらの制限酵素の１以上またはそれら全てを用いて、ビタミンＤレセプター遺伝子型を試験する工程を含む。
適切な技術は、少なくとも500塩基対の長さ、好ましくは少なくとも600塩基の長さであるフラグメントのコピーを生成する、PCR技術を用いてフラグメントを増幅することである。PCRプライマーは、約740塩基対の長さである遺伝子の領域を増大するように選択されることが好ましい。ビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９の適切なセクションを増幅するためのプライマーを同定するための、PCR技術は、当該分野で周知であり、そして当業者の範囲内にある。PCR技術は、例えば、EP-A-0200362およびEP-A-0201184に記載されている。本発明のさらなる実施態様において、本診断方法は、ビタミンＤレセプター遺伝子が危険形態であるか、または非危険形態であるかどうかを決定するための一本鎖コンホメーション多型（SSCP）マッピングを用いるビタミンＤレセプター遺伝子の分析を含む。
本発明の特定の実施態様において、下記の実施例に記載されるように、診断は、ビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９のフラグメント（詳細には、約740塩基の長さであるフラグメント）を増幅する工程を含んで、行われる。あるいは、本方法は、個体の遺伝子型の分析の他の方法を使用して、そのフラグメントがTaqIの切断部位を含むかどうかが決定される。
適切なPCRプライマーは：
１：CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG（3’）
２：GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC（3’）
ここで、増幅されるフラグメントは、約740塩基対の長さである。これらのプライマーを用いて、DNAフラグメントが増幅され、そしてTaqI切断部位が存在するかどうかについて試験される。この部位は、例えば、エキソン９のATTコドンがATCに変化した場合に存在する。
本発明のさらなる実施態様において、本方法は、BsmIまたはApoIのいずれかを用いて、エキソン７から3’UTRまでのビタミンＤレセプター遺伝子の領域の遺伝子型を決定する工程を含む。本方法は、この特定の領域を増幅する工程および制限酵素BsmIまたはApoIの切断部位の存在または非存在について試験する工程を含み、ここで、その多型の存在は危険遺伝子型である。
本発明の方法のさらなる実施態様は、個体における変形性関節症に対する素因または罹患し易さの診断のために、個体が危険関連多型バージョンのビタミンＤレセプター遺伝子を保有するかどうかを決定する工程を含み、この遺伝子の危険関連多型バージョンは、制限酵素TaqIの切断部位を欠失したものである。この方法は、
PCR技術を用いて、ビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９のフラグメントを増幅し、そのフラグメントのコピーを作製する工程、
そのコピーがTaqIの切断部位を含むかどうかを試験する工程、
それによって、個体がその遺伝子の多型バージョンについてホモ接合性またはヘテロ接合性であるかどうかを決定する工程、および
その個体がその遺伝子の多型バージョンについてホモ接合性である場合には最大として、そしてその患者が多型バージョンを欠失している場合には最小として、その個体の変形性関節症に対する素因または罹患し易さの危険性を診断する工程を含む。本発明の実施例において、PCRプライマー：
１：CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG
２：GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC
が、ビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９の740塩基対フラグメントを増幅するために用いられる。
上記のように、本発明の第一の局面の好ましい実施態様において、本方法は、ビタミンＤレセプター遺伝子をスクリーニングする工程を含み、そしてこのスクリーニングの工程は、当該分野で公知である多数の適切な技術のいずれか１つによって簡便に行われ、そしてビタミンＤレセプター遺伝子内に位置する核酸配列の増幅、この遺伝子の領域のサザンブロッティングおよびこの遺伝子内の領域の一本鎖コンホメーション多型マッピングから簡便に選択され得る。その領域の遺伝子型はまた、必要に応じて、疾患に対する素因または罹患し易さと関連するビタミンＤレセプター遺伝子の特定の多型とハイブリダイズするように選択的に適合されたハイブリダイゼーションプローブを用いて決定される。
ハイブリダイゼーション検出法に使用されるプローブは、上首尾なハイブリダイゼーション事象の検出が可能であるように、いくつかの方法で標識されなければならない。これは、必要に応じて、インビトロ法（例えばニックトランスレーション、放射性標識ヌクレオチドによるプローブ中のヌクレオチドの置換、またはランダムプライマーエクステンション）によって達成され、ここで、非標識分子は、標識コピーの合成のためのテンプレートとして作用する。ハイブリダイゼーションを検出するためのプローブを標識する他の標準的な方法は、当業者に公知である。
本発明の第２の局面によれば、診断および治療の方法が提供され、これは、本発明の第１の局面の方法に従って、変形性関節症に対する素因または罹患し易さを診断する工程およびこのような素因または罹患し易さを有する個体を処置して、変形性関節症を予防または軽減する工程を包含する。
変形性関節症の公知の治療は、疾患の進行を休止すること、または少なくとも進行を緩徐にすることにおいて、効果的であり得る。しかし、このような既存の治療は、一般に、疾患状態の劇的な逆転を引き起こし得ない、すなわち、罹患者に疼痛および不快感の有意な軽減を誘導し得ない。従って、本発明の利点は、変形性関節症の初期診断が改善され、その結果、予防的な治療が開始され得ることである。別の診断方法が改善および開発されるので、本発明は、個体の変形性関節症を発症する危険の総合的な知識に加わり得る。疾患の予測における、治療の開始をどのようにするか、そして開始するかどうかの臨床医の決定は、増大した信頼を伴って、行われ得る。
本発明における使用に適切な処置は、変形性関節症の予防的処置または対症療法（例えば、関節可動性を維持するための運動、筋肉強度を改善するための運動、関節における緊張または圧迫を防止するための関節保護物の使用、体重軸受け関節における圧迫を防止するための体重制御および関節圧迫を予防または制御するための手術）を処方することを含む。適切な薬学的処置は、兆候改善薬剤または疾患改変薬剤の使用を含む。
変形性関節症の種々の適切な処置は、当該分野に記載されており、これらの内容は、参考として本明細書中に取り込まれる。WO-A-97/00675は、変形性関節症の処置のためのアントラキオニン（anthraquonine）化合物の使用を記載しており、そしてUS-A-5591740は、3,4-アゼピニル（azepinyl）-ピロール誘導体を用いた変形性関節症の処置を記載している。変形性関節症の処置のための皮膚科調製物は、JP-A-08/169832に記載されている。WO-A-96/18403は、変形性関節症の処置のためのさらなる組成物を記載しており、これはジクロフェナクナトリウムおよびトレベノシド（trebenoside）を含む。変形性関節症の他の薬学的処置は、WO-A-96/09043およびJP-A-08/053403に記載されている。膝靱帯損傷および変形性関節症の医学的処置のための内側側副靱帯装具は、US-A-5562605に記載されている。他の処置は当業者に公知である。
本発明の第３の局面は、ビタミンＤレセプター遺伝子における遺伝的多型に関与する疾患を、その疾患に対して素因を有するかまたは罹患し易い動物における診断に使用するための組成物を提供する。この組成物は、（a）（i）エキソン９の一部および（ii）エキソン７と3’UTRとの間のその遺伝子の一部から選択されるビタミンＤレセプター遺伝子の一部を増幅するように適合された１以上のプライマー核酸分子、および（b）（i）エキソン９または（ii）エキソン７から3’UTRのその遺伝子の一部における多型を同定するための手段を含む。
本発明の第３の局面はまた、ビタミンＤレセプター遺伝子における遺伝的多型に関与する疾患に対して素因を有するか、または罹患し易い動物を同定することに使用するための組成物を提供する。この組成物は、（a）（i）エキソン９の一部および（ii）エキソン７と3’UTRとの間の一部から選択されるビタミンＤレセプター遺伝子の一部を増幅するように適合された１以上のプライマー核酸分子、および（b）（i）エキソン９または（ii）エキソン７から3’UTRのその遺伝子の一部における多型を同定するための手段を含む。
本発明の実施態様において、本発明の第３の局面の組成物は、ビタミンＤレセプター遺伝子における多型を同定し得る核酸分子を含む。この多型は、その動物における危険遺伝子型の指標である。
本発明の第３の局面のさらなる実施態様は、変形性関節症に対する素因または罹患し易さの診断のための組成物を提供する。この組成物は、個体のビタミンＤレセプター遺伝子の遺伝子型（例えば、個体がビタミンＤレセプター遺伝子の多型性変種についてホモ接合性であるか、またはヘテロ接合性であるか）を決定するための手段を含む。
本発明の実施態様において、診断用組成物は、ビタミンＤレセプターのエキソン９内のDNA配列を増幅するように適合されたPCRプライマーを含む。
本発明のさらなる実施態様による診断用組成物は、ビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９内のDNA配列を増幅するように適合されたPCRプライマーを含む。ここで、この遺伝子の変化バージョンは、その配列が、制限酵素TaqIによる切断のための部位を含むか、欠失しているかによって他のものと区別される。適切なPCRプライマーは、
１：CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG（3’）
２：GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC（3’）
さらに、本発明による診断用組成物は、制限酵素TaqIの供給を含み得る。
本発明の第４の局面において、上記のような診断用組成物および変形性関節症に対する素因または罹患し易さと関連するビタミンＤレセプター遺伝子の多型バージョンを保有するかどうかを示すための指示組成物を含む診断用キットが提供される。
診断キットは、代表的には、キットを用いて得られた結果の解釈を補助するためのチャートまたは他の視覚補助物により達成されるか、または含む。本発明の診断用キットに使用するために適切な指示組成物は、ビタミンＤレセプター遺伝子の危険多型バージョンを保有することが変形性関節症に対する素因または罹患し易さの増大した危険と関連することを示す印刷物または他の視覚的な注意書きを含む。
本発明のなおさらなる局面において、個体が変形性関節症に対する素因または罹患し易さを有するかどうかを診断するための手段の製造における、ビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９の領域を増幅するように適合されたPCRプライマーの使用が提供される。この遺伝子の変化バージョンは、代表的には、その領域がTaqIによる切断の部位を含むかどうかによって他のものと区別される。適切なPCRプライマーは、
１：CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG（3’）
２：GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC（3’）
本発明によれば、危険多型についてホモ接合性である、すなわち、エキソン９においてTaqI切断部位を含まないこの遺伝子のバージョンについてホモ接合性である個体は、最も高い危険性にあると分類される。ヘテロ接合性である個体は、中程度の危険性を有すると分類される。
必要に応じて、本発明の任意の局面による個体の危険因子の評価は、ビタミンＤレセプター遺伝的多型の遺伝子型を決定し、そして他の公知の遺伝的または生理学的または食事性または他の指標の分析による結果と組み合わせることによって計算される。この方法において、本発明は、個体の危険の測定が基づき得るさらなる情報を提供する。
本発明の特定の実施態様の実施において、以下に詳細に記載されるように、ビタミンＤレセプター遺伝的多型と一般市民の女性における初期の膝の変形性関節症との間の関連性を実証した。本発明の特定の実施態様において、危険多型は、Ｔとして示され、そして危険多型の非存在はtとして示されている。TT遺伝子型は、膝の変形性関節症を有する女性において、tt遺伝子型と比較して過剰に示され、そして代替的なホモ接合性遺伝子型ttと比較した場合、この疾患状態の発生について４倍の危険を供するようである。この関係は、年齢に基づいては説明され得ない。なぜなら、年齢による層別化後の全体群の期待される遺伝子型頻度からは有意な偏差が観察されなかったからである。それゆえ、1930年代から40年代における移入または移住のいずれかに起因する集団構造における長寿化への変化、または遺伝子型頻度を変化させ得る若年死は、ありそうにない。
膝の変形性関節症は、遺伝的影響の下にありそうであるが、候補遺伝子はこれまで報告されていない。ビタミンＤレセプターの遺伝子座は、体細胞ハイブリダイゼーションによって染色体12q12〜14にマッピングされる。TaqI多型は、同義コドン変化がビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９であり、それゆえレセプターのタンパク質構造を変化させないことを示す。ビタミンＤレセプター多型が疾患原因遺伝子ではなく、かわりに第12染色体上のすぐ近くの新規な疾患感受性遺伝子との連鎖不均衡にある可能性がある。それにも関わらず、観察された関係は、変形性関節症に対する素因または罹患し易さの危険の診断に有用である。
以下は、本発明の特定の実施態様の記載である。
患者および方法
研究設定は、54.2±6.0歳の平均年齢（±SD）を有する1003人の女性の集団コホート中でのネストされた症例−コントロール研究であった。45〜64の範囲の年齢の女性を、Chingford、North-East Londonのリウマチ疾患の長期的な流行病学的研究に関与する大きな単一の総合開業医院（全部で11,000人の登録患者）から選択した。1,353人の女性が、特定された年齢の範囲に入ることが見出され、そしてこれらの78％（1,003）が参加に同意した。この地域は、主として中流階級であり、98％が白人であり、そして身長、体重、喫煙状態、子宮摘出率、およびホルモン代償療法（HRT）の使用に関してUKの標準に類似する集団である（Hart DJ，Spector TD: The relationship of obesity，fat distribution and osteoarthritis in the general population: the Chingford Study．J Rheumatol 20:331-335、1993）。女性を、12ヶ月間月経がないことによって定義され、そして性ホルモン（血清エストラジオール、黄体形成ホルモン、および卵胞刺激ホルモン）の測定によって確認される閉経後の状態に基づいて選択した。全ての女性が、骨粗鬆症およびOAの両方の危険因子を詳述する詳細にわたる質問票を完成させた。この研究は、Local Ethics Committeeによって認可され、そして全ての女性が実施についてインフォームドコンセントされた。
体軸方向の体重軸受け膝のＸ線写真を、標準的な手順を使用して行い、続いて、KellgrenおよびLawrenceの方法に従って一人の観察者（DJH）によって盲目的に悪性度分類した。ここで、０〜４の階級を使用した（０は疾患なしを示し、４は重度の疾患を示す）（Kellgren JH，Lawrence JS: The Epidemiology of Chronic Rheumatism．Oxford: Blackwell Scientific，1963）。OAの放射線医学的定義は、集団におけるOAの免疫遺伝学的研究のために標準化されて現在採用されている（Spector TD，Hart DJ，Byrne J，Harris PA，Dacre JE，Doyle DV: Definition of osteoarthritis of the Knee for epidemiological studies．Ann Rheum Dis 52:790-794，1993）。膝のOAは、２以上のグレードが与えられる場合に存在すると定義し、そしてコントロールは、１のグレードを有するOAを有さない場合に分類した。この技術について、内部観察者の再現性は良好であり、0.8以上のκスコアを有する。ヘーバーデン結節の存在を、臨床的な触診によって決定した（Egger P，Cooper C，Hart DJ，Doyle DV，Coggon D，Spector TD: Patterns of joint involvement in osteoarthritis of the hand．J Rheumatol 22:1509-1513，1995）。BMDを、Hologic QDR-1000（Hologic Inc．，Waltham，MA）を用いて二重エネルギーＸ線吸光光度分析を使用して大腿頚部で測定した。再現性（CV％）を健常なボランティアにおいて二連で評価し、大腿頚部では1.4％であった。
DNAを、末梢血白血球から標準的な技術を使用して抽出した。PCRを使用して、一般的なプライマーおよび反応条件を用いてVDR遺伝子の740bpのフラグメントを増幅した（Spector TD，Keen RW，Arden NK，Morrison NA，Major PJ，Nguyen TV，Baker JR，JR Baker，Sambrook PN，Lanchbury JS，Eisman JA:．Vitamin D receptor gene（VDR）Alleles and bone density in postmenopausal women: a UK twin study．BMJ 310: 1657-1360，1995; Morrison NA，Qi JC，Tokita A，Kelly PJ，Crofts L，Nguyen TV，Sambrook PN，Eisman JA:．Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles．Nature 367: 284-287，1994）。VDR遺伝子型を、PCR産物の制限酵素TaqI（Promega Corps）での消化によって得、そして対立遺伝子は「Ｔ」（TaqI制限部位が存在しない）および「ｔ」（制限部位が存在する）として示した。OAの症例とコントロールとの間、およびVDR遺伝子型間の人口統計学的変数における差異を、分散-カイ二乗試験の分析を使用して最初に比較した。VDR遺伝子型の頻度を、フィッシャーの検定試験を使用してOAとコントロール群との間で比較した。条件的ロジスティック回帰解析を用いて、個体のVDR遺伝子型に対するOAの放射線医学的特徴を発生させることに関するオッズ比および95％試験ベース信頼区間を推定した。ここでホモ接合型VDR遺伝子型「tt」をベースライン設定した。他の潜在的な混乱変数についての調整を、PCソフトウェア統計学的プログラムSTATAでの条件的ロジスティック回帰を使用して行った。
結果
全コホートに由来する、全部で501人の女性は閉経後であり、そして悪性度分類された膝のＸ線写真を撮影した。全遺伝子型の結果は、351人（70％）の女性について入手可能であった：82人の被験体が膝のOAを有し、そして269人が正常なＸ線写真を有した。351人の女性の全ての群の平均年齢±SDは、55.3±5.0歳であった。OAに関するＸ線写真の悪性度分類による、遺伝子型の結果を有する女性の細分は、63の症例（76.8％）がグレード２であり、15の症例（18.3％）がグレード３であり、そして４の症例（4.9％）がグレード４であるという症例を示した。コントロールについては、201の症例（74.7％）がグレード０であり、そして68の症例（25.3％）がグレード１であった。膝のOAの非存在または存在による女性の特徴を、表１に示す。そしてこれは、年齢、閉経状態、および持続期間を除いて、全コホートの特徴と類似である。遺伝子型の結果を有する被験体とDNAが入手可能でなかった被験体との間では、有意な差異は観察されなかった。全結果を有する351人の女性の中には、年齢、肥満度指数（BMI）、HRTの使用、および股関節部のBMDのような潜在的な混乱因子について、症例とコントロールとの間に有意な差異が存在した。
351人の女性の全群におけるVDR遺伝子型の頻度は、他の白人種集団において報告された頻度、およびハーディー-ワインベルグの式において報告された頻度に類似していた（Spector TD，Keen RW，Arden NK，Morrison NA，Major PJ，Nguyen TV，Baker JR，JR Baker，Sambrook PN，Lanchbury JS，Eisman JA;．Vitamin D receptor gene（VDR）alleles and bone density in postmenopausal woman: a UK twin study．BMJ 310: 1357-1360，1995; Morrison NA，Qi JC，Tokita A，Kelly PJ，Crofts L，Nguyen TV，Sambrook PN，Eisman JA:．Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles．Nature 367: 284-287，1994）。表１において測定されるようなVDR遺伝子型間のベースライン特性における有意な差異は、全群またはKellgrenおよびLawrenceのOAグレードによる層別化後には、存在しなかった。TaqI遺伝子型の頻度は、OAの症例とコントロールとの間で有意に異なることが、フィッシャーの検定試験（Ｐ＝0.03）を使用して見出された。重篤なOA（グレード３）を有する被験体の数は、正式な分析のためには少なすぎたが、tt遺伝子型の頻度は、OA状態の悪化にともなって減少した（表２）。Ｔ対立遺伝子の頻度は、コントロールと比較してOA群において５％だけ増大したが、この差異は有意ではなかった。別のホモ接合遺伝子型「tt」と比較して、「TT」VDR遺伝子型群における膝のOAのオッズ比（95％CI）は、2.42（0.94−6.21、ｐ＝0.07）であり、そしてヘテロ接合遺伝子型Ttにおいては、3.15（1.26−7.83、ｐ＝0.01）であった（表３）。潜在的な混乱因子であると判断される変数（年齢、BMI、HRTの使用、および股関節部BMD）の調整後、TT遺伝子型における膝のOAのオッズ比（95％CI）（TT対tt）は、2.82（0.98−8.10、ｐ＜0.05）でわずかに増大しただけであった。同様の調整後の「Tt」遺伝子型（Tt対tt）は、2.98（1.09−8.12、ｐ＝0.03）でわずかに減少した。膝のOAの危険性は、優性な遺伝のパターンを有するＴ対立遺伝子の存在に関連するようであったので、続いて、分析を、ベースラインに設定したttホモ接合群に対して組み合わせた、遺伝子型TTおよびTtについて行った。粗分析は、Ｔ対立遺伝子と関連する膝のOAの危険性について2.82（1.16−6.85、ｐ＝0.02）のオッズ比を示した。危険性におけるこの増大は、調節した後も以前に記載したように、2.60（1.01−6.71、ｐ＜0.05）のオッズ比を維持した。
VDR遺伝子型と結節性関節炎との間には、ヘーバーデン結節の存在によって決定されるような有意な関係は観察されなかった。さらに、膝のOAのみと比較して臨床学的な結節の存在をも有する膝のOAの症例のサブセットにおいて、遺伝子型の頻度における差異は存在しなかった（データは示さない）。351人の女性の全群において、本発明者らはまた、ホモ接合型遺伝子型TTとttとの間には股関節部でのBMDにおいて4.6％の差異が存在したが、BMDとVDR遺伝子型の間には総合的な有意な関係を全く示すことができなかった。年齢、BMI、HRTの使用、およびOAグレードのような潜在的な混乱因子についての調整は、これらの知見を大きく変えることはなかった。
考察
本発明者らのデータは、一般的な集団に由来する女性における、VDR遺伝子座のTaqI多型と初期の膝のOAとの間の相関を示す。「Ｔ」対立遺伝子は、別の対立遺伝子と比較した場合に、ほぼ３倍に増大した膝のOAの発症の危険性に関連する。危険性のパターンは、共優性であることが観察され、ホモ接合遺伝子型TTおよびヘテロ接合遺伝子型Ttは両方とも同等に増大した膝のOAの危険性を有した。この関係は年齢に基づいて説明され得ない。なぜなら、本発明者らは、年齢による層別化後の全群において予想される遺伝子型頻度から有意な偏差を観察しなかったからである。この関係はまた、OAの危険性に影響を及ぼすことが示されており、そしてこの症例とコントロールとの間で異なることが見出された、BMI、HRTの使用、および骨塩量のような他の因子から独立していた。VDR遺伝子座と結節性関節炎との間に相関関係が存在しないという本発明者らの知見は、異なる遺伝的機構がヘーバーデン結節および関連する一般化された変形性関節症の発症の基礎となり得ることを示唆する。
従って、本発明は、ビタミンＤレセプター遺伝子に関して個体の遺伝子型を決定することによる、変形性関節症の素因または罹患しやすさを有する個体の診断および処置のための方法および装置を提供する。早期の診断方法または改善された診断方法は、この処置が有効であり得る時点で予防的処置または対症療法を個体に受容させることを可能にする。
変形性関節症（または退行性の間接疾患としても知られる）は、関節炎の最も一般的な型の１つである。これは、間接の軟骨の故障、骨に対して骨を摩擦させることを引き起こし、そして疼痛および運動の損失を引き起こすことによって特徴付けられる。変形性関節症は、非常に穏やかなものから非常に重篤なものにわたり得、そして中年以上の人々にきわめて一般に発症し得る。これは、手および体重軸受け関節（例えば、膝、股関節部、足および背中）に発症する。
年齢が主な危険因子であるが、現在まで、この条件の病因および病原は、ほとんどわからないままである。多くの環境性の因子および他の独立した条件が、変形性関節症と関連しており、それらには、肥満、以前の外傷および/またはメニセクトミー（menisectomy）、膝を曲げる職業、喫煙、性ホルモン、婦人科の障害および他の代謝的因子が含まれる。肥満は、膝の変形性関節症を導き得る。さらに、スポーツ、繰り返しの運動、または事故のために関節に損傷を有する人々は、変形性関節症を発生する増大した危険にあり得る。
現在、変形性関節症の正確な診断は、一般に、その疾患が有意に進行したときにのみ可能である。臨床医は、身体検査および兆候の病歴に基づいて変形性関節症の診断を行うより多くはできない。Ｘ線は、代表的には、診断を確認するためのみに使用される。
最近の研究により、過体重である中年の人々における体重減少は、その危険性を有意に減少させるか、またはさらに膝の変形性関節症が発生することを妨げ得ることが結論付けられた。このような場合、変形性関節症に対する素因または罹患し易さの診断の正確性を改善する能力は、明確に有益である。
本発明の目的は、変形性関節症の診断を改善することである。本発明の詳細な目的は、変形性関節症に対する素因または罹患し易さの診断方法を提供することである。さらなる目的は、そのような診断の後に、疾患が有意に確立される前に変形性関節症の予防的処置または対症療法の方法を提供することである。別の目的は、変形性関節症に対する素因または罹患し易さを診断するための手段を提供する。
第１の局面において、本発明は、ビタミンＤレセプター遺伝子における遺伝的多型と関連する疾患を、その疾患に対して素因を有するかまたは罹患し易い動物において診断する方法を提供する。この方法は、動物においてビタミンＤレセプターの遺伝子型を決定する工程を含む。本発明の第１の局面は、さらに、ビタミンＤレセプター遺伝子における遺伝的多型と関連する疾患に対して素因を有するかまたは罹患し易い動物を同定する方法を提供する。この方法は、動物においてビタミンＤレセプター遺伝子の遺伝子型を決定する工程を含む。
本発明の第１の局面の実施態様によれば、変形性関節症に対する素因または罹患し易さの診断方法が提供され、これは個体のビタミンＤレセプター遺伝子の遺伝子型を決定する工程を含む。代表的には、この方法は、個体がビタミンＤレセプター遺伝子の別バージョンについてヘテロ接合性であるか、またはホモ接合性であるかどうかを決定する工程を含む。本発明の実施態様において、この診断方法は、ビタミンＤレセプター遺伝的多型に関連する変形性関節症のような状態または疾患の危険にある個体についてスクリーニングすることである。
ビタミンＤレセプター遺伝子の多型は公知であり、そして本発明は、ビタミンＤレセプター遺伝子（特に、この遺伝子のエキソン９およびエキソン７から3’UTRまでの領域）における多型と変形性関節症に対する素因または罹患し易さとの間の関係の観察に基づく。本発明は、多型の存在についてスクリーニングすることによって、疾患に対する遺伝的な素因または罹患し易さを有するようである個体を同定することが可能である点で有利である。代表的には、スクリーニングは、インビトロ技術を用いて達成される。
本発明の実施態様において、診断は、ビタミンＤレセプター遺伝子のフラグメントが制限酵素TaqIの切断部位を含むかどうかを決定することによって実行される。次いで、個体は、代表的には、そのフラグメントがTaqIの切断部位を含むかどうかによって分類される。ここで、その切断部位を含むフラグメントを保有することは、変形性関節症に対する素因または罹患し易さの危険性の減少と関連する。
従って、TaqI切断部位が存在しないビタミンＤレセプター遺伝子は、この遺伝子の危険多型、すなわち、変形性関節症に対する素因または罹患し易さの危険の増大と関連する、この遺伝子の多型性変種として分類され得る。ヒトゲノムは、染色体の組の各々に１つづつ、２つのビタミンＤレセプター遺伝子を含むので、従って、個体は、危険多型に対してホモ接合性もしくはヘテロ接合性であるか、または危険多型を欠失していることが見出され得る。
本発明のさらなる実施態様において、本方法は、ビタミンＤレセプター遺伝子のフラグメントが制限酵素BsmIの切断部位を含むかどうかを決定する工程を含む。個体は、切断部位を含むかまたは含まないかによって分類され、ここで、切断部位を含まないことについてホモ接合型であることは、変形性関節症に対する素因または罹患しやすさの危険性の減少と関連する。この実施態様において、BsmI切断部位を含む遺伝子の多形は、遺伝子の危険多形である。
本発明のなおさらなる実施態様において、本方法は、ビタミンＤレセプター遺伝子のフラグメントが制限酵素ApoIの切断部位を含むかどうかを決定する工程を含む。個体の、変形性関節症に対する素因または罹患し易さの危険性は、その遺伝子が、ApoIの切断部位を含む場合に増大していると分類され、そしてその切断部位の存在についてホモ接合性であることは、個体が増大した危険性にありそうであることを示す。
本方法は、ビタミンＤレセプターのフラグメントを増幅し、コピーを生成する工程およびそのフラグメントのコピーが制限酵素TaqI、BsmIまたはApoIの内の１つの切断部位を含むかどうかを決定する工程を都合よく含む。本方法は、必要に応じて、これらの制限酵素の１以上またはそれら全てを用いて、ビタミンＤレセプター遺伝子型を試験する工程を含む。
適切な技術は、少なくとも500塩基対の長さ、好ましくは少なくとも600塩基の長さであるフラグメントのコピーを生成する、PCR技術を用いてフラグメントを増幅することである。PCRプライマーは、約740塩基対の長さである遺伝子の領域を増大するように選択されることが好ましい。ビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９の適切なセクションを増幅するためのプライマーを同定するための、PCR技術は、当該分野で周知であり、そして当業者の範囲内にある。PCR技術は、例えば、EP-A-0200362およびEP-A-0201184に記載されている。本発明のさらなる実施態様において、本診断方法は、ビタミンＤレセプター遺伝子が危険形態であるか、または非危険形態であるかどうかを決定するための一本鎖コンホメーション多型（SSCP）マッピングを用いるビタミンＤレセプター遺伝子の分析を含む。
本発明の特定の実施態様において、下記の実施例に記載されるように、診断は、ビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９のフラグメント（詳細には、約740塩基の長さであるフラグメント）を増幅する工程を含んで、行われる。あるいは、本方法は、個体の遺伝子型の分析の他の方法を使用して、そのフラグメントがTaqIの切断部位を含むかどうかが決定される。
適切なPCRプライマーは：
１：CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG（3’）
２：GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC（3’）
ここで、増幅されるフラグメントは、約740塩基対の長さである。これらのプライマーを用いて、DNAフラグメントが増幅され、そしてTaqI切断部位が存在するかどうかについて試験される。この部位は、例えば、エキソン９のATTコドンがATCに変化した場合に存在する。
本発明のさらなる実施態様において、本方法は、BsmIまたはApoIのいずれかを用いて、エキソン７から3’UTRまでのビタミンＤレセプター遺伝子の領域の遺伝子型を決定する工程を含む。本方法は、この特定の領域を増幅する工程および制限酵素BsmIまたはApoIの切断部位の存在または非存在について試験する工程を含み、ここで、その多型の存在は危険遺伝子型である。
本発明の方法のさらなる実施態様は、個体における変形性関節症に対する素因または罹患し易さの診断のために、個体が危険関連多型バージョンのビタミンＤレセプター遺伝子を保有するかどうかを決定する工程を含み、この遺伝子の危険関連多型バージョンは、制限酵素TaqIの切断部位を欠失したものである。この方法は、
PCR技術を用いて、ビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９のフラグメントを増幅し、そのフラグメントのコピーを作製する工程、
そのコピーがTaqIの切断部位を含むかどうかを試験する工程、
それによって、個体がその遺伝子の多型バージョンについてホモ接合性またはヘテロ接合性であるかどうかを決定する工程、および
その個体がその遺伝子の多型バージョンについてホモ接合性である場合には最大として、そしてその患者が多型バージョンを欠失している場合には最小として、その個体の変形性関節症に対する素因または罹患し易さの危険性を診断する工程を含む。本発明の実施例において、PCRプライマー：
１：CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG
２：GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC
が、ビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９の740塩基対フラグメントを増幅するために用いられる。
上記のように、本発明の第一の局面の好ましい実施態様において、本方法は、ビタミンＤレセプター遺伝子をスクリーニングする工程を含み、そしてこのスクリーニングの工程は、当該分野で公知である多数の適切な技術のいずれか１つによって簡便に行われ、そしてビタミンＤレセプター遺伝子内に位置する核酸配列の増幅、この遺伝子の領域のサザンブロッティングおよびこの遺伝子内の領域の一本鎖コンホメーション多型マッピングから簡便に選択され得る。その領域の遺伝子型はまた、必要に応じて、疾患に対する素因または罹患し易さと関連するビタミンＤレセプター遺伝子の特定の多型とハイブリダイズするように選択的に適合されたハイブリダイゼーションプローブを用いて決定される。
ハイブリダイゼーション検出法に使用されるプローブは、上首尾なハイブリダイゼーション事象の検出が可能であるように、いくつかの方法で標識されなければならない。これは、必要に応じて、インビトロ法（例えばニックトランスレーション、放射性標識ヌクレオチドによるプローブ中のヌクレオチドの置換、またはランダムプライマーエクステンション）によって達成され、ここで、非標識分子は、標識コピーの合成のためのテンプレートとして作用する。ハイブリダイゼーションを検出するためのプローブを標識する他の標準的な方法は、当業者に公知である。
本発明の第２の局面によれば、診断および治療の方法が提供され、これは、本発明の第１の局面の方法に従って、変形性関節症に対する素因または罹患し易さを診断する工程およびこのような素因または罹患し易さを有する個体を処置して、変形性関節症を予防または軽減する工程を包含する。
変形性関節症の公知の治療は、疾患の進行を休止すること、または少なくとも進行を緩徐にすることにおいて、効果的であり得る。しかし、このような既存の治療は、一般に、疾患状態の劇的な逆転を引き起こし得ない、すなわち、罹患者に疼痛および不快感の有意な軽減を誘導し得ない。従って、本発明の利点は、変形性関節症の初期診断が改善され、その結果、予防的な治療が開始され得ることである。別の診断方法が改善および開発されるので、本発明は、個体の変形性関節症を発症する危険の総合的な知識に加わり得る。疾患の予測における、治療の開始をどのようにするか、そして開始するかどうかの臨床医の決定は、増大した信頼を伴って、行われ得る。
本発明における使用に適切な処置は、変形性関節症の予防的処置または対症療法（例えば、関節可動性を維持するための運動、筋肉強度を改善するための運動、関節における緊張または圧迫を防止するための関節保護物の使用、体重軸受け関節における圧迫を防止するための体重制御および関節圧迫を予防または制御するための手術）を処方することを含む。適切な薬学的処置は、兆候改善薬剤または疾患改変薬剤の使用を含む。
変形性関節症の種々の適切な処置は、当該分野に記載されており、これらの内容は、参考として本明細書中に取り込まれる。WO-A-97/00675は、変形性関節症の処置のためのアントラキオニン（anthraquonine）化合物の使用を記載しており、そしてUS-A-5591740は、3,4-アゼピニル（azepinyl）-ピロール誘導体を用いた変形性関節症の処置を記載している。変形性関節症の処置のための皮膚科調製物は、JP-A-08/169832に記載されている。WO-A-96/18403は、変形性関節症の処置のためのさらなる組成物を記載しており、これはジクロフェナクナトリウムおよびトレベノシド（trebenoside）を含む。変形性関節症の他の薬学的処置は、WO-A-96/09043およびJP-A-08/053403に記載されている。膝靱帯損傷および変形性関節症の医学的処置のための内側側副靱帯装具は、US-A-5562605に記載されている。他の処置は当業者に公知である。
本発明の第３の局面は、ビタミンＤレセプター遺伝子における遺伝的多型に関与する疾患を、その疾患に対して素因を有するかまたは罹患し易い動物における診断に使用するための組成物を提供する。この組成物は、（a）（i）エキソン９の一部および（ii）エキソン７と3’UTRとの間のその遺伝子の一部から選択されるビタミンＤレセプター遺伝子の一部を増幅するように適合された１以上のプライマー核酸分子、および（b）（i）エキソン９または（ii）エキソン７から3’UTRのその遺伝子の一部における多型を同定するための手段を含む。
本発明の第３の局面はまた、ビタミンＤレセプター遺伝子における遺伝的多型に関与する疾患に対して素因を有するか、または罹患し易い動物を同定することに使用するための組成物を提供する。この組成物は、（a）（i）エキソン９の一部および（ii）エキソン７と3’UTRとの間の一部から選択されるビタミンＤレセプター遺伝子の一部を増幅するように適合された１以上のプライマー核酸分子、および（b）（i）エキソン９または（ii）エキソン７から3’UTRのその遺伝子の一部における多型を同定するための手段を含む。
本発明の実施態様において、本発明の第３の局面の組成物は、ビタミンＤレセプター遺伝子における多型を同定し得る核酸分子を含む。この多型は、その動物における危険遺伝子型の指標である。
本発明の第３の局面のさらなる実施態様は、変形性関節症に対する素因または罹患し易さの診断のための組成物を提供する。この組成物は、個体のビタミンＤレセプター遺伝子の遺伝子型（例えば、個体がビタミンＤレセプター遺伝子の多型性変種についてホモ接合性であるか、またはヘテロ接合性であるか）を決定するための手段を含む。
本発明の実施態様において、診断用組成物は、ビタミンＤレセプターのエキソン９内のDNA配列を増幅するように適合されたPCRプライマーを含む。
本発明のさらなる実施態様による診断用組成物は、ビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９内のDNA配列を増幅するように適合されたPCRプライマーを含む。ここで、この遺伝子の変化バージョンは、その配列が、制限酵素TaqIによる切断のための部位を含むか、欠失しているかによって他のものと区別される。適切なPCRプライマーは、
１：CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG（3’）
２：GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC（3’）
さらに、本発明による診断用組成物は、制限酵素TaqIの供給を含み得る。
本発明の第４の局面において、上記のような診断用組成物および変形性関節症に対する素因または罹患し易さと関連するビタミンＤレセプター遺伝子の多型バージョンを保有するかどうかを示すための指示組成物を含む診断用キットが提供される。
診断キットは、代表的には、キットを用いて得られた結果の解釈を補助するためのチャートまたは他の視覚補助物により達成されるか、または含む。本発明の診断用キットに使用するために適切な指示組成物は、ビタミンＤレセプター遺伝子の危険多型バージョンを保有することが変形性関節症に対する素因または罹患し易さの増大した危険と関連することを示す印刷物または他の視覚的な注意書きを含む。
本発明のなおさらなる局面において、個体が変形性関節症に対する素因または罹患し易さを有するかどうかを診断するための手段の製造における、ビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９の領域を増幅するように適合されたPCRプライマーの使用が提供される。この遺伝子の変化バージョンは、代表的には、その領域がTaqIによる切断の部位を含むかどうかによって他のものと区別される。適切なPCRプライマーは、
１：CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG（3’）
２：GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC（3’）
本発明によれば、危険多型についてホモ接合性である、すなわち、エキソン９においてTaqI切断部位を含まないこの遺伝子のバージョンについてホモ接合性である個体は、最も高い危険性にあると分類される。ヘテロ接合性である個体は、中程度の危険性を有すると分類される。
必要に応じて、本発明の任意の局面による個体の危険因子の評価は、ビタミンＤレセプター遺伝的多型の遺伝子型を決定し、そして他の公知の遺伝的または生理学的または食事性または他の指標の分析による結果と組み合わせることによって計算される。この方法において、本発明は、個体の危険の測定が基づき得るさらなる情報を提供する。
本発明の特定の実施態様の実施において、以下に詳細に記載されるように、ビタミンＤレセプター遺伝的多型と一般市民の女性における初期の膝の変形性関節症との間の関連性を実証した。本発明の特定の実施態様において、危険多型は、Ｔとして示され、そして危険多型の非存在はtとして示されている。TT遺伝子型は、膝の変形性関節症を有する女性において、tt遺伝子型と比較して過剰に示され、そして代替的なホモ接合性遺伝子型ttと比較した場合、この疾患状態の発生について４倍の危険を供するようである。この関係は、年齢に基づいては説明され得ない。なぜなら、年齢による層別化後の全体群の期待される遺伝子型頻度からは有意な偏差が観察されなかったからである。それゆえ、1930年代から40年代における移入または移住のいずれかに起因する集団構造における長寿化への変化、または遺伝子型頻度を変化させ得る若年死は、ありそうにない。
膝の変形性関節症は、遺伝的影響の下にありそうであるが、候補遺伝子はこれまで報告されていない。ビタミンＤレセプターの遺伝子座は、体細胞ハイブリダイゼーションによって染色体12q12〜14にマッピングされる。TaqI多型は、同義コドン変化がビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９であり、それゆえレセプターのタンパク質構造を変化させないことを示す。ビタミンＤレセプター多型が疾患原因遺伝子ではなく、かわりに第12染色体上のすぐ近くの新規な疾患感受性遺伝子との連鎖不均衡にある可能性がある。それにも関わらず、観察された関係は、変形性関節症に対する素因または罹患し易さの危険の診断に有用である。
以下は、本発明の特定の実施態様の記載である。
患者および方法
研究設定は、54.2±6.0歳の平均年齢（±SD）を有する1003人の女性の集団コホート中でのネストされた症例−コントロール研究であった。45〜64の範囲の年齢の女性を、Chingford、North-East Londonのリウマチ疾患の長期的な流行病学的研究に関与する大きな単一の総合開業医院（全部で11,000人の登録患者）から選択した。1,353人の女性が、特定された年齢の範囲に入ることが見出され、そしてこれらの78％（1,003）が参加に同意した。この地域は、主として中流階級であり、98％が白人であり、そして身長、体重、喫煙状態、子宮摘出率、およびホルモン代償療法（HRT）の使用に関してUKの標準に類似する集団である（Hart DJ，Spector TD: The relationship of obesity，fat distribution and osteoarthritis in the general population: the Chingford Study．J Rheumatol 20:331-335、1993）。女性を、12ヶ月間月経がないことによって定義され、そして性ホルモン（血清エストラジオール、黄体形成ホルモン、および卵胞刺激ホルモン）の測定によって確認される閉経後の状態に基づいて選択した。全ての女性が、骨粗鬆症およびOAの両方の危険因子を詳述する詳細にわたる質問票を完成させた。この研究は、Local Ethics Committeeによって認可され、そして全ての女性が実施についてインフォームドコンセントされた。
体軸方向の体重軸受け膝のＸ線写真を、標準的な手順を使用して行い、続いて、KellgrenおよびLawrenceの方法に従って一人の観察者（DJH）によって盲目的に悪性度分類した。ここで、０〜４の階級を使用した（０は疾患なしを示し、４は重度の疾患を示す）（Kellgren JH，Lawrence JS: The Epidemiology of Chronic Rheumatism．Oxford: Blackwell Scientific，1963）。OAの放射線医学的定義は、集団におけるOAの免疫遺伝学的研究のために標準化されて現在採用されている（Spector TD，Hart DJ，Byrne J，Harris PA，Dacre JE，Doyle DV: Definition of osteoarthritis of the Knee for epidemiological studies．Ann Rheum Dis 52:790-794，1993）。膝のOAは、２以上のグレードが与えられる場合に存在すると定義し、そしてコントロールは、１のグレードを有するOAを有さない場合に分類した。この技術について、内部観察者の再現性は良好であり、0.8以上のκスコアを有する。ヘーバーデン結節の存在を、臨床的な触診によって決定した（Egger P，Cooper C，Hart DJ，Doyle DV，Coggon D，Spector TD: Patterns of joint involvement in osteoarthritis of the hand．J Rheumatol 22:1509-1513，1995）。BMDを、Hologic QDR-1000（Hologic Inc．，Waltham，MA）を用いて二重エネルギーＸ線吸光光度分析を使用して大腿頚部で測定した。再現性（CV％）を健常なボランティアにおいて二連で評価し、大腿頚部では1.4％であった。
DNAを、末梢血白血球から標準的な技術を使用して抽出した。PCRを使用して、一般的なプライマーおよび反応条件を用いてVDR遺伝子の740bpのフラグメントを増幅した（Spector TD，Keen RW，Arden NK，Morrison NA，Major PJ，Nguyen TV，Baker JR，JR Baker，Sambrook PN，Lanchbury JS，Eisman JA:．Vitamin D receptor gene（VDR）Alleles and bone density in postmenopausal women: a UK twin study．BMJ 310: 1657-1360，1995; Morrison NA，Qi JC，Tokita A，Kelly PJ，Crofts L，Nguyen TV，Sambrook PN，Eisman JA:．Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles．Nature 367: 284-287，1994）。VDR遺伝子型を、PCR産物の制限酵素TaqI（Promega Corps）での消化によって得、そして対立遺伝子は「Ｔ」（TaqI制限部位が存在しない）および「ｔ」（制限部位が存在する）として示した。OAの症例とコントロールとの間、およびVDR遺伝子型間の人口統計学的変数における差異を、分散-カイ二乗試験の分析を使用して最初に比較した。VDR遺伝子型の頻度を、フィッシャーの検定試験を使用してOAとコントロール群との間で比較した。条件的ロジスティック回帰解析を用いて、個体のVDR遺伝子型に対するOAの放射線医学的特徴を発生させることに関するオッズ比および95％試験ベース信頼区間を推定した。ここでホモ接合型VDR遺伝子型「tt」をベースライン設定した。他の潜在的な混乱変数についての調整を、PCソフトウェア統計学的プログラムSTATAでの条件的ロジスティック回帰を使用して行った。
結果
全コホートに由来する、全部で501人の女性は閉経後であり、そして悪性度分類された膝のＸ線写真を撮影した。全遺伝子型の結果は、351人（70％）の女性について入手可能であった：82人の被験体が膝のOAを有し、そして269人が正常なＸ線写真を有した。351人の女性の全ての群の平均年齢±SDは、55.3±5.0歳であった。OAに関するＸ線写真の悪性度分類による、遺伝子型の結果を有する女性の細分は、63の症例（76.8％）がグレード２であり、15の症例（18.3％）がグレード３であり、そして４の症例（4.9％）がグレード４であるという症例を示した。コントロールについては、201の症例（74.7％）がグレード０であり、そして68の症例（25.3％）がグレード１であった。膝のOAの非存在または存在による女性の特徴を、表１に示す。そしてこれは、年齢、閉経状態、および持続期間を除いて、全コホートの特徴と類似である。遺伝子型の結果を有する被験体とDNAが入手可能でなかった被験体との間では、有意な差異は観察されなかった。全結果を有する351人の女性の中には、年齢、肥満度指数（BMI）、HRTの使用、および股関節部のBMDのような潜在的な混乱因子について、症例とコントロールとの間に有意な差異が存在した。
351人の女性の全群におけるVDR遺伝子型の頻度は、他の白人種集団において報告された頻度、およびハーディー-ワインベルグの式において報告された頻度に類似していた（Spector TD，Keen RW，Arden NK，Morrison NA，Major PJ，Nguyen TV，Baker JR，JR Baker，Sambrook PN，Lanchbury JS，Eisman JA;．Vitamin D receptor gene（VDR）alleles and bone density in postmenopausal woman: a UK twin study．BMJ 310: 1357-1360，1995; Morrison NA，Qi JC，Tokita A，Kelly PJ，Crofts L，Nguyen TV，Sambrook PN，Eisman JA:．Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles．Nature 367: 284-287，1994）。表１において測定されるようなVDR遺伝子型間のベースライン特性における有意な差異は、全群またはKellgrenおよびLawrenceのOAグレードによる層別化後には、存在しなかった。TaqI遺伝子型の頻度は、OAの症例とコントロールとの間で有意に異なることが、フィッシャーの検定試験（Ｐ＝0.03）を使用して見出された。重篤なOA（グレード３）を有する被験体の数は、正式な分析のためには少なすぎたが、tt遺伝子型の頻度は、OA状態の悪化にともなって減少した（表２）。Ｔ対立遺伝子の頻度は、コントロールと比較してOA群において５％だけ増大したが、この差異は有意ではなかった。別のホモ接合遺伝子型「tt」と比較して、「TT」VDR遺伝子型群における膝のOAのオッズ比（95％CI）は、2.42（0.94−6.21、ｐ＝0.07）であり、そしてヘテロ接合遺伝子型Ttにおいては、3.15（1.26−7.83、ｐ＝0.01）であった（表３）。潜在的な混乱因子であると判断される変数（年齢、BMI、HRTの使用、および股関節部BMD）の調整後、TT遺伝子型における膝のOAのオッズ比（95％CI）（TT対tt）は、2.82（0.98−8.10、ｐ＜0.05）でわずかに増大しただけであった。同様の調整後の「Tt」遺伝子型（Tt対tt）は、2.98（1.09−8.12、ｐ＝0.03）でわずかに減少した。膝のOAの危険性は、優性な遺伝のパターンを有するＴ対立遺伝子の存在に関連するようであったので、続いて、分析を、ベースラインに設定したttホモ接合群に対して組み合わせた、遺伝子型TTおよびTtについて行った。粗分析は、Ｔ対立遺伝子と関連する膝のOAの危険性について2.82（1.16−6.85、ｐ＝0.02）のオッズ比を示した。危険性におけるこの増大は、調節した後も以前に記載したように、2.60（1.01−6.71、ｐ＜0.05）のオッズ比を維持した。
VDR遺伝子型と結節性関節炎との間には、ヘーバーデン結節の存在によって決定されるような有意な関係は観察されなかった。さらに、膝のOAのみと比較して臨床学的な結節の存在をも有する膝のOAの症例のサブセットにおいて、遺伝子型の頻度における差異は存在しなかった（データは示さない）。351人の女性の全群において、本発明者らはまた、ホモ接合型遺伝子型TTとttとの間には股関節部でのBMDにおいて4.6％の差異が存在したが、BMDとVDR遺伝子型の間には総合的な有意な関係を全く示すことができなかった。年齢、BMI、HRTの使用、およびOAグレードのような潜在的な混乱因子についての調整は、これらの知見を大きく変えることはなかった。
考察
本発明者らのデータは、一般的な集団に由来する女性における、VDR遺伝子座のTaqI多型と初期の膝のOAとの間の相関を示す。「Ｔ」対立遺伝子は、別の対立遺伝子と比較した場合に、ほぼ３倍に増大した膝のOAの発症の危険性に関連する。危険性のパターンは、共優性であることが観察され、ホモ接合遺伝子型TTおよびヘテロ接合遺伝子型Ttは両方とも同等に増大した膝のOAの危険性を有した。この関係は年齢に基づいて説明され得ない。なぜなら、本発明者らは、年齢による層別化後の全群において予想される遺伝子型頻度から有意な偏差を観察しなかったからである。この関係はまた、OAの危険性に影響を及ぼすことが示されており、そしてこの症例とコントロールとの間で異なることが見出された、BMI、HRTの使用、および骨塩量のような他の因子から独立していた。VDR遺伝子座と結節性関節炎との間に相関関係が存在しないという本発明者らの知見は、異なる遺伝的機構がヘーバーデン結節および関連する一般化された変形性関節症の発症の基礎となり得ることを示唆する。
従って、本発明は、ビタミンＤレセプター遺伝子に関して個体の遺伝子型を決定することによる、変形性関節症の素因または罹患しやすさを有する個体の診断および処置のための方法および装置を提供する。早期の診断方法または改善された診断方法は、この処置が有効であり得る時点で予防的処置または対症療法を個体に受容させることを可能にする。
Claims (13)
- 変形性関節症の素因を有するかまたは罹患しやすい動物を同定する方法であって、ビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９のフラグメント、または該遺伝子のエキソン７から3’UTRまでの領域を増幅することによって、該動物中のビタミンＤレセプター遺伝子の遺伝子型を決定する工程を包含する、方法。
- 変形性関節症の素因を有するかまたは罹患しやすい動物において変形性関節症を診断するための、請求項１に記載の方法であって、該動物中のビタミンＤレセプター遺伝子の遺伝子型を決定する工程を包含する、方法。
- 個体がビタミンＤレセプター遺伝子の多型についてホモ接合型またはヘテロ接合型であるかどうかを決定する工程を包含する、請求項１または請求項２に記載の方法。
- 前記ビタミンＤレセプター遺伝子のフラグメントが、TaqI、BsmI、およびApoIから選択される制限酵素の切断部位を含むかどうかを決定する工程を包含する、請求項３に記載の方法。
- 以下に従って個体を分類する工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法：
前記フラグメントがTaqIの切断部位を含むかどうか、ここで、該切断部位を欠いているフラグメントを有することは、変形性関節症の素因または罹患しやすさの増大した危険性に関連する；あるいは、
前記領域がBsmIまたはApoIの切断部位を含むかどうか、ここで、該切断部位を含む領域を有することは、増大した危険性に関連する。 - 前記フラグメントが、以下のPCRプライマーを使用して増幅される、請求項５に記載の方法：
１：CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG（3’）
２：GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC（3’）。 - 変形性関節症の素因を有するかまたは罹患しやすい動物における変形性関節症の診断に使用するための組成物であって、
（ａ）該動物中のビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９の一部、またはエキソン７から3’UTRまでの領域を増幅するように適応された１つ以上のプライマー核酸分子、および
（ｂ）該増幅された部分の多形性間を区別するための手段、
を含む、組成物。 - ビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９内のDNA配列を増幅するために適応されたPCRプライマーを含む、請求項７に記載の組成物であって、該遺伝子の代替バージョンは、該配列が制限酵素TaqIによる切断部位を含むかまたは欠いているかによって他のものと区別される、組成物。
- 以下のPCRプライマーを含む、請求項７または８に記載の組成物：
１：CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG（3’）
２：GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC（3’）。 - 制限酵素TaqIの供給をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
- 制限酵素BsmIまたはApoIの供給をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
- 変形性関節症の素因または罹患しやすさの診断のための組成物の製造における、ビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン９のフラグメントを増幅するように適応されたPCRプライマーの使用。
- 変形性関節症の素因または罹患しやすさの診断のための組成物の製造における、ビタミンＤレセプター遺伝子のエキソン７と3’UTRとの間の領域を増幅するように適応されたPCRプライマーの使用。
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