JP4264748B2

JP4264748B2 - Unloading molecular motor system for loading molecular packages

Info

Publication number: JP4264748B2
Application number: JP2005099124A
Authority: JP
Inventors: 正人小高; 修平; 永忠杜
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2005-03-30
Filing date: 2005-03-30
Publication date: 2009-05-20
Anticipated expiration: 2025-03-30
Also published as: JP2006271323A

Description

本発明は、分子モータシステムとその応用に関し、より詳しくは、DNAコンジュゲート微小管及びこれを移動させる基板を用いて、目的分子荷物を選択性良く搭載、輸送、降荷することができる分子荷物の搭載降荷分子モータシステムに関する。 The present invention relates to a molecular motor system and its application, and more specifically, a molecular package capable of loading, transporting, and unloading a target molecular package with high selectivity using a DNA conjugate microtubule and a substrate on which the DNA conjugate microtubule is moved. The present invention relates to an unloading molecular motor system.

チューブリンタンパク質が線維状の会合体を形成している微小管は、分子の運動を誘導する経路として細胞内の輸送機構に携わっている。分子の輸送は、微小管系モータータンパク質であるキネシン及びダイニンによって行われる。これらのタンパク質は、ATP加水分解によるエネルギーを利用して、微小管に沿って一方向に運動して特定の目的地に分子を輸送する。
直径24 nmの細胞骨格線維である微小管は細胞内で様々な役割を果たしている。例えば、微小管は神経細胞軸索の中を通っており、細胞体と神経末端の間で物質や膜小胞の双方向の輸送を可能にしている。微小管はGTP結合チューブリンタンパク質サブユニットからなる会合体である。各々のサブユニットは、α−チューブリンおよびβ−チューブリンのヘテロ二量体である。チューブリンは2つのGTP分子に2つの異なる部位で結合し、3つのチューブリンは、不変のグリシンリッチ領域を共有し、その領域はヌクレオチド結合部位の1つへのアクセスの制御に関与していると考えられる。 Microtubules in which tubulin proteins form fibrous aggregates are involved in the intracellular transport mechanism as a pathway for inducing molecular movement. Molecular transport is performed by the microtubule motor proteins kinesin and dynein. These proteins use the energy from ATP hydrolysis to move in one direction along microtubules and transport molecules to specific destinations.
Microtubules, which are cytoskeletal fibers with a diameter of 24 nm, play various roles in cells. For example, microtubules pass through nerve cell axons, allowing bidirectional transport of substances and membrane vesicles between the cell body and nerve endings. Microtubules are aggregates composed of GTP-binding tubulin protein subunits. Each subunit is a heterodimer of α-tubulin and β-tubulin. Tubulin binds to two GTP molecules at two different sites, and three tubulins share an invariant glycine-rich region that is involved in controlling access to one of the nucleotide binding sites. it is conceivable that.

Bachandらは、ビオチン化微小管を用いて、アビジン化されたQ-dotを微小管上に固定化し、輸送することに成功した（非特許文献１）。 Bachand et al. Succeeded in immobilizing and transporting avidinized Q-dots on microtubules using biotinylated microtubules (Non-patent Document 1).

Muthukrishnanらは、ガラス基板上に固定化されたプローブDNAと、アビジン結合微小管にビオチン化DNAを修飾したDNA結合微小管とのハイブリッド形成を行い、微小管のパターニングを行い、キネシンモーターを移動させた（非特許文献２）。 Muthukrishnan et al. Hybridized probe DNA immobilized on a glass substrate with DNA-bound microtubules modified with biotinylated DNA on avidin-bound microtubules, patterned microtubules, and moved the kinesin motor. (Non-Patent Document 2).

上記のキネシン-微小管系を用いて、目的物質を輸送させる研究が盛んに行われている。近年は、微小管を基板上に固定化し、キネシンの運動を観察する方法もあるが、微小管を固定化するのが難しい。そのため多くは、キネシンをガラス基板上に物理的に固定化させ、微小管を運動させるmotility assay(非特許文献３)が一般的に使用されている。 Research on transporting target substances using the above kinesin-microtubule system has been actively conducted. In recent years, there is a method of fixing the microtubule on the substrate and observing the motion of kinesin, but it is difficult to fix the microtubule. Therefore, in many cases, a motility assay (Non-patent Document 3) in which kinesin is physically immobilized on a glass substrate and a microtubule is moved is generally used.

微細加工技術を用いて、単一方向に微小管を運動させる報告もなされており、人工的に離れた別の場所に目的物質を輸送することは可能である（非特許文献４）。 It has been reported that a microtubule is moved in a single direction using a microfabrication technique, and it is possible to transport a target substance to another place artificially separated (Non-Patent Document 4).

本発明者らは、微小管に一本鎖のプローブとなるDNAを修飾したDNAコンジュゲート微小管を開発し、標的DNAと選択的なハイブリダイゼーションに成功し、一塩基多型の検出に成功している（特許文献１）。
Bachand, G. D.; Rivera, S. B.; Boal, A. K.;Gaudioso, J.; Liu, J.; Bunker, B. C.; Nano Lett. 2004, 4, 817-821. Muthukrishnan, G.; Roberts, C.A.; Chen, Y.C.;Zahn, J. D.; Hancock, W. O. Nano lett. 2004, 4, 2127-2132. Vale, R. D.; Reese, T. S.; Sheetz, M. P. Cell.1985, 42, 39-50. Hiratsuka, Y.; Tada, T.; Oiwa, K.; Kanayama,T.; Uyeda, T. Q. Biophys. J. 2001．81, 1555-1561. 特開２００６−２０４２４１号公報 The present inventors have developed a DNA-conjugated microtubule in which a DNA that becomes a single-stranded probe is modified in a microtubule, succeeded in selective hybridization with a target DNA, and succeeded in detecting a single nucleotide polymorphism. (Patent Document 1).
Bachand, GD; Rivera, SB; Boal, AK; Gaudioso, J .; Liu, J .; Bunker, BC; Nano Lett. 2004, 4, 817-821. Muthukrishnan, G .; Roberts, CA; Chen, YC; Zahn, JD; Hancock, WO Nano lett. 2004, 4, 2127-2132. Vale, RD; Reese, TS; Sheetz, MP Cell. 1985, 42, 39-50. Hiratsuka, Y .; Tada, T .; Oiwa, K .; Kanayama, T .; Uyeda, TQ Biophys. J. 2001. 81, 1555-1561. JP 2006-204241 A

微小管の物質輸送能力の高さは公知の事実であり様々な応用例がある。しかし、微小管に直接、輸送したい物質、特に高分子量の物質を修飾することは困難であり、修飾効率も低い。
また一度搭載した分子荷物は共有結合的に微小管に修飾しており、降荷できないシステムである。荷物を搭載して、目的地まで輸送し搭載した分子荷物を降荷するというシステムの構築は不可能であった。本発明者は、これまでにDNAコンジュゲート微小管の開発に成功しており（特許文献１）、新規のDNA解析法を提案している。このDNAコンジュゲート微小管を用いることで、高効率に分子荷物を微小管に搭載することが可能になる。また、この搭載した分子荷物はDNAハイブリダイゼーションを介して微小管に修飾されているため、制限酵素や脱ハイブリダイゼーション（脱相補結合）により切り離すことが可能である。このように、分子荷物を搭載、輸送、降荷した例は知られていない。
The high mass transport capacity of microtubules is a well-known fact and has various applications. However, it is difficult to modify a substance to be transported directly to a microtubule, particularly a high molecular weight substance, and the modification efficiency is low.
In addition, once loaded molecular packages are covalently modified to microtubules, so they cannot be unloaded. It was impossible to build a system to load the cargo, transport it to the destination, and unload the loaded molecular baggage. The present inventor has so far succeeded in developing a DNA-conjugated microtubule (Patent Document 1) and has proposed a novel DNA analysis method. By using this DNA-conjugated microtubule, it becomes possible to mount molecular luggage on the microtubule with high efficiency. In addition, since the loaded molecular luggage is modified into microtubules through DNA hybridization, it can be separated by restriction enzymes or dehybridization (decomplementary binding). Thus, there are no known examples of loading, transporting, or unloading molecular packages.

上記目的を達成するために本発明は、微小管表面上プローブとなる一本鎖DNAを導入したDNAコンジュゲート微小管を使用し、微小管の運動を妨げることなく選択的な分子荷物（Q-dot）の搭載、降荷を可能にした。このことより、搭載部位から微小管を輸送し目的地（降荷部位）での分子荷物の降荷が可能であることを見出した。
すなわち、本発明は、一本鎖のリンカーDNAが微小管上に結合しているリンカーDNAコンジュゲート微小管、キネシンが塗布された基板、リンカーDNA修飾分子荷物（Q-dot）、緩衝液からなり、サンプル分子荷物とリンカーDNAコンジュゲート微小管とを反応させ、サンプル分子荷物がハイブリダイゼーションを介してDNAコンジュゲート微小管に固定化され、キネシンを塗布された基板上を移動することにより、選択的に目的の分子荷物を移動させる分子モータシステムを見出し、本発明の分子モータシステムは、キネシンが塗布された基板上において、DNA標識されたサンプル分子荷物を一本鎖のリンカーDNAコンジュゲート微小管と反応させた後に制限酵素により搭載した微小管上の分子荷物を降荷することが可能であり、搭載と移動と降荷が緩衝液中で行われる。すなわち、本発明は、
一本鎖のリンカーDNAが微小管上に結合しているリンカーDNAコンジュゲート微小管、キネシンが塗布された基板、緩衝液からなり、標的DNAを含むサンプルDNAとリンカーDNAコンジュゲート微小管とを反応させ、微小管上のリンカーDNAと相補的なDNA配列が修飾された標的分子荷物がハイブリダイゼーションによりDNAコンジュゲート微小管に固定化され、キネシンを塗布された基板上を移動することにより、選択的に目的の標的分子荷物を移動させ、制限酵素によりリンカーDNAを切断することで分子荷物を降荷する分子荷物の搭載降荷分子モータシステムである。
また、本発明は、標的DNAを蛍光標識することができる。
さらに本発明は、微小管上のリンカーDNAと相補的なDNA配列が修飾された標的分子荷物において、さらに修飾するDNA配列を変更して一つの微小管上に数種類の分子荷物を積むことができる。
また、本発明は、標的分子荷物が、一本鎖のDNAが修飾された量子ドット（Q-dot）を含み、さらに、量子ドット（Q-dot）を修飾するDNAの配列には制限酵素により切断される配列を設計することができる。
さらに本発明は、キネシンが塗布された基板上において、一本鎖DNA標識された標的DNAを含むサンプルDNAを、一本鎖のプローブDNAコンジュゲート微小管と反応させる反応部位、移動したプローブDNAと相補結合した標的DNAを検出する検出部位が、通路で結ばれ、反応と移動と検出が緩衝液中で行うことができる。
また、本発明は、一本鎖のリンカーDNAと微小管の結合が、アビジン化DNAとビオチン化微小管若しくは、ビオチン化DNAとアビジン化微小管により行うことができる。
またさらに、本発明は、移動した標的DNA又はサンプル分子荷物を、制限酵素により切断することに代えて、脱ハイブリダイゼーション（脱相補結合）により、微小管から分離することができる。 In order to achieve the above object, the present invention uses a DNA-conjugated microtubule into which a single-stranded DNA serving as a probe on the surface of a microtubule is introduced, and does not interfere with the movement of the microtubule (Q- dot) can be loaded and unloaded. From this, we found that it is possible to unload molecular packages at the destination (unloading site) by transporting microtubules from the mounting site.
That is, the present invention comprises a linker DNA-conjugated microtubule in which a single-stranded linker DNA is bound on a microtubule, a substrate coated with kinesin, a linker DNA-modified molecular package (Q-dot), and a buffer solution. Selective by reacting sample molecular baggage with linker DNA-conjugated microtubules and immobilizing the sample molecular baggage on DNA-conjugated microtubules via hybridization and moving on a kinesin-coated substrate The molecular motor system of the present invention moves a molecular package of interest to a single-stranded linker DNA conjugate microtubule on a substrate coated with kinesin. After reacting, it is possible to unload molecular packages on microtubules loaded by restriction enzymes. It is carried out at. That is, the present invention
A linker DNA-conjugated microtubule in which single-stranded linker DNA is bound on a microtubule, a substrate coated with kinesin, and a buffer solution, which reacts sample DNA containing the target DNA with the linker DNA-conjugated microtubule The target molecule package modified with a DNA sequence complementary to the linker DNA on the microtubule is selectively immobilized by hybridization on the DNA-conjugated microtubule and moved on a kinesin-coated substrate. This is a loaded molecular motor system for molecular packages that unloads molecular packages by moving the target molecular packages to the target and cleaving the linker DNA with restriction enzymes.
In the present invention, the target DNA can be fluorescently labeled.
Furthermore, in the present invention, in the target molecular package in which the DNA sequence complementary to the linker DNA on the microtubule is modified, the DNA sequence to be further modified can be changed to load several kinds of molecular packages on one microtubule. .
In the present invention, the target molecular package includes a quantum dot (Q-dot) in which a single-stranded DNA is modified, and the DNA sequence that modifies the quantum dot (Q-dot) is restricted by a restriction enzyme. The sequence to be cleaved can be designed.
Furthermore, the present invention provides a reaction site for reacting a sample DNA containing a target DNA labeled with a single-stranded DNA with a single-stranded probe DNA conjugate microtubule on a substrate coated with kinesin; Detection sites for detecting the complementary bound target DNA are connected by a passage, and reaction, migration and detection can be performed in a buffer solution.
Furthermore, in the present invention, single-stranded linker DNA and microtubules can be bound by avidinized DNA and biotinylated microtubules or biotinylated DNA and avidinized microtubules.
Still further, in the present invention, the transferred target DNA or sample molecular baggage can be separated from the microtubule by dehybridization (decomplementary binding) instead of being cleaved by a restriction enzyme.

本発明は、荷物を搭載して、目的地まで輸送し搭載した分子荷物を降荷するというシステムを構築し、それが現実に実現できることを立証した。さらに、リンカーとなるDNA配列を種々の制限酵素認識サイトにすることで、複数種の分子荷物を搭載後、選択的に任意の分子荷物だけを降荷することもできる。 The present invention has established a system for loading a cargo, transporting it to a destination, and unloading the loaded molecular cargo, and has proved that it can be realized in practice. Furthermore, by using a DNA sequence serving as a linker as various restriction enzyme recognition sites, it is possible to selectively unload any molecular package after mounting multiple types of molecular packages.

本発明の分子モータシステムの概略を、図１を用いて説明する。
本発明においては、微小管上にリンカーとなる一本鎖リンカーDNAを導入した形のDNAコンジュゲート微小管を用いて、リンカーDNAと相補的なDNAを修飾した分子荷物(Q-dot)とハイブリダイゼーション（相補結合）させることができ、分子荷物を搭載、移動させることができる(図 1A)。
また、本発明においては、DNA配列に制限酵素で切断される配列を設計することで、ハイブリダイゼーション後リンカーDNAを切断することで搭載した分子荷物の降荷が可能になる(図 1B)。
また、本発明においては、リンカーとなるDNA配列を種々の制限酵素認識サイトにすることで、複数種の分子荷物を搭載後、選択的に任意の分子荷物だけを降荷することも可能である(図 1C)。
本発明で用いるDNAコンジュゲート微小管を製造するに際して、用いられる微小管は、何でも良いが、とくに、蛍光物質であるローダミン、もしくはビオチン修飾チューブリンからなるものを好ましく用いることができる。
また、本発明において一本鎖のプローブDNAと微小管の結合は、どのような結合でも良いが、アビジン化DNAとビオチン化微小管若しくは、ビオチン化DNAとアビジン化微小管により行うことができる。好ましくは、アビジン化DNAとビオチン化微小管が良い。
さらに、本発明の分子モータシステムでは、キネシンが塗布された基板上において、蛍光標識された標的DNAを含むサンプルDNAを一本鎖のプローブDNAコンジュゲート微小管と反応させる反応部位、移動したプローブDNAと相補結合した標的DNAを検出する検出部位が、通路で結ばれ、反応と移動と検出が緩衝液中で行われるが、代表的には図１Dに示される装置が簡便である。すなわち、基板ガラスに一定間隔で２本の両面接着テープを張り付け、上からカバーグラスを載せる。ガラス基板面のカバーグラスに、微細加工により、反応部位と通路と検出部位を刻っておくと良い。
緩衝液としては、一本鎖のプローブDNA、サンプルDNA、キネシン等が活発に動けるものあればどのようなものでも良いが、代表的のものは、アッセイバッファー (10 mM Tris-acetate (pH 7.5), 50 mM potassium acetate, 2.5 mM EGTA, 4 mM magnesium sulfate)を挙げることができる。
蛍光物質としては、何でも良いが、身近にあるものとしては、ローダミン、FITC、BODIPY、Oregon Green 514、Cy dyeシリーズを挙げることができる。とくにローダミンが好ましく用いられる。
微小管を構成するチューブリンモノマーのビオチン化に際して、リンカーの長さは特に限定されるものではないが、身近にあるものとしては、Pierce社製の、Biotin-(Long Arm)-NHS、EZ-link NHS-LC-LC-Biotinを挙げることができる。とくにBiotin-(Long Arm)-NHSが好ましく用いられる。
用いる分子荷物は、特に限定されるものではない。身近にあるものとしては、Quantum dot社製のQ-dot（Qd）シリーズを挙げることができる。とくにQd-525、Qd-655が好ましく用いられる。また、DNA結合タンパク質なども分子荷物として挙げられる。
またさらに、本発明において、制限酵素により切断することに代えて、脱ハイブリダイゼーション（脱相補結合）により、微小管から分離することができるが、脱ハイブリダイゼーション（脱相補結合）は、温度をDNA２重鎖の脱ハイブリダイゼーション温度（Tm.）以上にするか、溶液をアルカリ雰囲気にする等の従来から知られている方法を用いることが出来る。
An outline of the molecular motor system of the present invention will be described with reference to FIG.
In the present invention, a DNA conjugate microtubule in which a single-stranded linker DNA serving as a linker is introduced on a microtubule, and a molecular package (Q-dot) modified with a DNA complementary to the linker DNA and a high molecular weight are used. Hybridization (complementary binding) can be performed, and molecular packages can be loaded and moved (Fig. 1A).
Further, in the present invention, by designing a sequence that can be cleaved with a restriction enzyme into the DNA sequence, it is possible to unload the loaded molecular package by cleaving the linker DNA after hybridization (FIG. 1B).
In the present invention, it is also possible to selectively unload arbitrary molecular packages after mounting a plurality of types of molecular packages by using a DNA sequence serving as a linker as various restriction enzyme recognition sites. (Figure 1C).
In producing the DNA-conjugated microtubule used in the present invention, any microtubule may be used, and in particular, a fluorescent substance composed of rhodamine or biotin-modified tubulin can be preferably used.
In the present invention, the binding between the single-stranded probe DNA and the microtubule may be any type of binding, but can be carried out by using avidinized DNA and biotinylated microtubules or biotinylated DNA and avidinized microtubules. Avidinized DNA and biotinylated microtubules are preferable.
Further, in the molecular motor system of the present invention, on the substrate coated with kinesin, the reaction site for reacting the sample DNA containing the fluorescently labeled target DNA with the single-stranded probe DNA conjugate microtubule, the moved probe DNA A detection site for detecting a target DNA that is complementarily bound to is linked by a passage, and the reaction, movement, and detection are performed in a buffer solution. Typically, the apparatus shown in FIG. 1D is simple. That is, two double-sided adhesive tapes are attached to the substrate glass at regular intervals, and a cover glass is placed from above. A reaction site, a passage, and a detection site are preferably carved into the cover glass on the glass substrate surface by fine processing.
Any buffer can be used as long as single-stranded probe DNA, sample DNA, kinesin, etc. can move actively, but typical ones are assay buffer (10 mM Tris-acetate (pH 7.5)). , 50 mM potassium acetate, 2.5 mM EGTA, 4 mM magnesium sulfate).
Any fluorescent material may be used, but examples of familiar materials include rhodamine, FITC, BODIPY, Oregon Green 514, and Cy dye series. In particular, rhodamine is preferably used.
The length of the linker is not particularly limited when biotinylating the tubulin monomer constituting the microtubule, but the familiar ones include Biotin- (Long Arm) -NHS, EZ- link NHS-LC-LC-Biotin. In particular, Biotin- (Long Arm) -NHS is preferably used.
The molecular baggage used is not particularly limited. A familiar example is the Q-dot (Qd) series manufactured by Quantum dot. In particular, Qd-525 and Qd-655 are preferably used. In addition, DNA-binding proteins can be listed as molecular luggage.
Furthermore, in the present invention, instead of cleaving with a restriction enzyme, it can be separated from microtubules by dehybridization (decomplementary binding). Conventionally known methods such as raising the dehybridization temperature (Tm.) Of the heavy chain or bringing the solution to an alkaline atmosphere can be used.

（DNA修飾ストレプトアビジン（SA）の調製）
SAに共有結合的にDNAを修飾する方法を用いた(非特許文献 C.M. Niemeyer, T. Sano, C.L. Smith and C.R. Cantor, Nucleic Acid Reserch, 1994, 22, 5530-5539)。
([N-e-maleimidocaproyloxy]sulfosuccinimide ester) (sulfo-EMCS)によってSAにマレイミド基を付与した。得られたマレイミド化SAに末端チオール化DNAを加えて反応させた。未反応のマレイミド基をつぶすために、メルカプトエタノールを添加した。
（Q-dot修飾DNA (Q-DNA)の調製）
市販のQ-dot（抗体標識キット）の表面を4-(maleimidomethyl)-1-cyclohexanecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester (SMCC)によりマレイミド化し、末端チオール化DNAを共有結合的に修飾した。未反応のマレイミド基をつぶすために、メルカプトエタノールを添加した。
（微小管の調製）
用いた微小管は、ローダミン修飾／ビオチン化チューブリン (仕込み比 1:1)を BRP80 (80 mM PIPES, pH 6.8, 1 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 10 % glycerol, 5 mM GTP) 緩衝液に懸濁し 37 °C で40分間インキュベートさせ、最後にタキソールで微小管を安定させることでローダミン修飾／ビオチン化-微小管(以下微小管)を調製した。
微小管の運動性を評価するために、キネシンをガラス基板上に固定化して微小管の観察を行う方法(motility assay)を採用した。微小管には蛍光物質であるローダミンが修飾してあるため顕微鏡でその運動を可視化できる。
スライドガラス、カバーガラスを用いて作製した図１Dのようなフローチャンバーを用いてDNAコンジュゲート微小管の特性評価を行った。フローチャンバー内にアッセイバッファー (10 mM Tris-acetate (pH 7.5), 50 mM potassium acetate, 2.5 mM EGTA, 4 mM magnesium sulfate) 中に溶解したキネシン溶液を挿入し物理的に基板にキネシンを固定化した。その後、微小管溶液を同様にフローチャンバー内に挿入し微小管を基板上に固定化した。
(DNAコンジュゲート微小管の調製と運動確認)
SA-DNAを上記の微小管固定化基板に加えて微小管上に一本鎖のリンカーDNAを固定化した。
（Qd-DNAのハイブリダイゼーション（搭載）と制限酵素による切断（降荷））
DNAコンジュゲート微小管と、Qd-DNAとのハイブリダイゼーションを行った。キネシン固定化基板に前述と同様にDNAコンジュゲート微小管を調製し、続けてQd-655または、Qd-525修飾DNA［完全相補鎖、非相補鎖I（ポリチミン配列）、］の２種類（10 ng mL^-1）の混合溶液を加えて、30分間、室温でインキュベートした。洗浄後、蛍光顕微鏡を用いて、微小管の運動、DNAのハイブリダイゼーションを観察した。ハイブリダイゼーションによる分子荷物の搭載を確認後、制限酵素（Eco RIまたは、Eco RV）を基板に導入し、１０分間３７°Cでインキュベーションした。その後、蛍光顕微鏡にて微小管上のQ-dotの存在を確認した。
(Preparation of DNA-modified streptavidin (SA))
A method of covalently modifying DNA to SA was used (Non-patent literature CM Niemeyer, T. Sano, CL Smith and CR Cantor, Nucleic Acid Reserch, 1994, 22, 5530-5539).
A maleimide group was imparted to SA by ([Ne-maleimidocaproyloxy] sulfosuccinimide ester) (sulfo-EMCS). The resulting maleimidated SA was reacted with terminal thiolated DNA. Mercaptoethanol was added to crush unreacted maleimide groups.
(Preparation of Q-dot modified DNA (Q-DNA))
The surface of a commercially available Q-dot (antibody labeling kit) was maleimidized with 4- (maleimidomethyl) -1-cyclohexanecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester (SMCC), and the terminal thiolated DNA was covalently modified. Mercaptoethanol was added to crush unreacted maleimide groups.
(Preparation of microtubules)
The microtubules used were rhodamine modified / biotinylated tubulin (1: 1 feed ratio) in BRP80 (80 mM PIPES, pH 6.8, 1 mM MgCl ₂ , 1 mM EGTA, 10% glycerol, 5 mM GTP) buffer. Rhodamine-modified / biotinylated-microtubules (hereinafter referred to as microtubules) were prepared by suspending and incubating at 37 ° C. for 40 minutes, and finally stabilizing the microtubules with taxol.
In order to evaluate the motility of microtubules, a method (motility assay) was adopted in which kinesin was immobilized on a glass substrate and the microtubules were observed. Since the microtubules are modified with rhodamine, a fluorescent substance, the movement can be visualized with a microscope.
The characteristics of the DNA-conjugated microtubules were evaluated using a flow chamber as shown in FIG. 1D prepared using a slide glass and a cover glass. A kinesin solution dissolved in assay buffer (10 mM Tris-acetate (pH 7.5), 50 mM potassium acetate, 2.5 mM EGTA, 4 mM magnesium sulfate) was inserted into the flow chamber to physically immobilize kinesin on the substrate. . Thereafter, the microtubule solution was similarly inserted into the flow chamber, and the microtubules were immobilized on the substrate.
(Preparation of DNA-conjugated microtubules and confirmation of movement)
SA-DNA was added to the microtubule-immobilized substrate, and single-stranded linker DNA was immobilized on the microtubule.
(Qd-DNA hybridization (loaded) and restriction enzyme cleavage (unloading))
Hybridization of DNA-conjugated microtubules with Qd-DNA was performed. Prepare DNA-conjugated microtubules on a kinesin-immobilized substrate in the same way as described above, then continue with Qd-655 or Qd-525 modified DNA [fully complementary strand, non-complementary strand I (polythymine sequence)] (10 ng mL- ¹ ) was added and incubated at room temperature for 30 minutes. After washing, microtubule movement and DNA hybridization were observed using a fluorescence microscope. After confirming the loading of the molecular package by hybridization, a restriction enzyme (Eco RI or Eco RV) was introduced into the substrate and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the presence of Q-dots on the microtubules was confirmed with a fluorescence microscope.

微小管（図２A-I）上からQd-655（完全相補鎖DNAが修飾）の蛍光が観察された（図２A-II）。しかし、Qd-525（非相補鎖DNAが修飾）（図２A-III）の蛍光は観察されなかった。これらより、DNAコンジュゲート微小管が、選択性よく完全相補鎖のみとハイブリダイゼーションして、分子荷物であるQdを搭載していることが確認できる。
Qdの種類によって搭載、降荷に影響がないことを証明するために、Qd-525（完全相補鎖DNAが修飾）、Qd-655（非相補鎖DNAが修飾）の組み合わせでも同等の実験を行った。結果、Qd-525（完全相補鎖DNAが修飾）の蛍光は観察されたがQd-655（非相補鎖DNAが修飾）の蛍光は観察されなかった。このことより、分子荷物の種類に応じてDNAコンジュゲート微小管が、選択性よく完全相補鎖のみとハイブリダイゼーションして、分子荷物であるQdを搭載していることが確認できる。
次に、この分子荷物搭載後のDNAコンジュゲート微小管の運動性能について評価した。実験は、ATP存在下で行った。結果より、DNAコンジュゲート微小管はハイブリダイゼーション後もキネシン固定化基板上を移動することができた（図３）。その際の速度は、0.43±0.057 mm s^-1であった。これは、微小管のみの速度（0.5 mm s^-1）とほぼ同等であることから、分子荷物を搭載したことで微小管の輸送能力には影響がないことがわかる。 The fluorescence of Qd-655 (completely complementary DNA was modified) was observed from above the microtubule (FIG. 2A-I) (FIG. 2A-II). However, the fluorescence of Qd-525 (modified with non-complementary strand DNA) (FIGS. 2A-III) was not observed. From these, it can be confirmed that the DNA-conjugated microtubules are hybridized with only the completely complementary strand with high selectivity and have Qd which is a molecular package.
In order to prove that there is no effect on loading and unloading depending on the type of Qd, the same experiment was conducted with a combination of Qd-525 (modified with fully complementary DNA) and Qd-655 (modified with non-complementary DNA) It was. As a result, fluorescence of Qd-525 (modified with completely complementary strand DNA) was observed, but fluorescence of Qd-655 (modified with non-complementary strand DNA) was not observed. From this, it can be confirmed that the DNA-conjugated microtubule hybridizes with only the completely complementary strand with high selectivity according to the type of the molecular baggage and carries Qd as the molecular baggage.
Next, we evaluated the movement performance of the DNA-conjugated microtubules after loading these molecular packages. The experiment was performed in the presence of ATP. From the results, DNA-conjugated microtubules were able to move on the kinesin-immobilized substrate even after hybridization (FIG. 3). The speed at that time was 0.43 ± 0.057 mm s ⁻¹ . This is almost the same as the speed of microtubules only (0.5 mm s ^-1 ), so it can be seen that the loading capacity of microtubules has no effect on the transport capacity of microtubules.

（制限酵素によるQ-dot DNAの微小管上からの切り離し）
本発明の分子モータシステムで用いるDNAコンジュゲート微小管が、分子荷物を搭載するだけでなく、制限酵素により、リンカーDNAを切断することで分子荷物を降荷できること確認した。Eco RVをQd-655搭載微小管固定化基板にインジェクションし、洗浄後基板を観察すると、Qd-655の蛍光は観察されなかった（図２B-I, II）。このことより、制限酵素による分子荷物の降荷に成功した。 (Removal of Q-dot DNA from microtubules by restriction enzymes)
It was confirmed that the DNA conjugate microtubules used in the molecular motor system of the present invention can not only carry molecular packages but also unload molecular packages by cleaving linker DNA with restriction enzymes. When Eco RV was injected into a Qd-655-equipped microtubule-immobilized substrate and the substrate was observed after cleaning, no fluorescence of Qd-655 was observed (FIGS. 2B-I and II). As a result, we succeeded in unloading molecular packages using restriction enzymes.

（複数種の分子荷物の搭載と、選択的降荷）
Qd-DNA 655はEco RIで、Qd-DNA 525はEco RVで切断されるように配列を設計し、双方のQdを微小管上に搭載させた、表１に代表的なものを示す。
上記のDNA配列は、次のような意味を持つものである。DNA配列 (A) Qd側修飾DNA（含Eco RV切断配列）、DNA配列（B）SA側修飾DNA（含Eco RV切断配列）、DNA配列（C）Qd側修飾DNA（コントロール配列）、DNA配列（D）Qd側修飾DNA（含Eco RI切断配列）、DNA配列（E）SA側修飾DNA（含Eco RI切断配列）。５末端はすべてチオール化されたものを使用している。

結果より、双方のQdの蛍光が微小管上から観察された（図４A）。続いて、Eco RVをインジェクションし洗浄後、基板を観察すると、微小管上からQd-525の蛍光が観察されなくなった。しかし、Qd-655の蛍光は観察された（図４B）。この基板にEco RIをインジェクションし洗浄後、微小管上からQd-655の蛍光が観察されなくなった。以上のことより、複数種の分子荷物(Qd)をDNA配列と制限酵素の種類によって、選択的に微小管上から降ろすことに成功した。 (Multiple types of molecular baggage and selective unloading)
Table 1 shows representative examples of sequences designed so that Qd-DNA 655 is cleaved with Eco RI and Qd-DNA 525 is cleaved with Eco RV, and both Qd are mounted on a microtubule.
The above DNA sequence has the following meaning. DNA sequence (A) Qd modified DNA (including Eco RV cleavage sequence), DNA sequence (B) SA modified DNA (including Eco RV cleavage sequence), DNA sequence (C) Qd modified DNA (control sequence), DNA sequence (D) Qd modified DNA (including Eco RI cleavage sequence), DNA sequence (E) SA modified DNA (including Eco RI cleavage sequence). All 5 terminals are thiolated.

From the results, both Qd fluorescences were observed from above the microtubules (FIG. 4A). Subsequently, when Eco RV was injected and washed, and the substrate was observed, the fluorescence of Qd-525 was not observed from above the microtubules. However, Qd-655 fluorescence was observed (FIG. 4B). After injecting Eco RI into this substrate and washing, the fluorescence of Qd-655 was not observed from above the microtubule. Based on the above, we succeeded in selectively removing multiple types of molecular packages (Qd) from the microtubules depending on the DNA sequence and the type of restriction enzyme.

本発明の分子モータシステムは、標的分子荷物をDNAハイブリダイゼーションを利用して簡便に微小管上に搭載することができ、また、制限酵素により搭載した分子荷物を降ろすこともできる。また、複数種の分子荷物を同時に搭載することも可能であり、選択性よく任意の分子荷物を降ろすことも可能である。基板に制限酵素を固定化する技術を併せて用いれば、分子荷物を輸送するばかりか、任意の場所に、任意の分子荷物だけを降ろすことも可能になり、バイオマシンとして有用なばかりか、この分野に広く応用できる可能性を秘めたものであり、産業上の利用可能性は極めて高いものである。 In the molecular motor system of the present invention, a target molecular package can be easily mounted on a microtubule using DNA hybridization, and a molecular package mounted by a restriction enzyme can be lowered. It is also possible to load a plurality of types of molecular packages at the same time, and it is possible to unload any molecular packages with high selectivity. If the technology for immobilizing restriction enzymes on the substrate is also used, it is possible not only to transport molecular packages but also to unload only arbitrary molecular packages to any location, which is useful as a biomachine. It has the potential to be widely applied in the field, and its industrial applicability is extremely high.

本発明のDNAコンジュゲート微小管の分子荷物搭載概念図Conceptual diagram of loading DNA molecular microtubules of the present invention 本発明のDNAコンジュゲート微小管の分子荷物降荷概念図Conceptual diagram of molecular package unloading of DNA conjugate microtubules of the present invention 本発明のDNAコンジュゲート微小管の複数種の分子荷物搭載と選択的降荷概念図Conceptual diagram of loading and selective loading of multiple types of molecular packages of the DNA conjugate microtubules of the present invention 検出システムの概念図Conceptual diagram of detection system 分子荷物の搭載：DNAコンジュゲート微小管の蛍光像 (I)微小管に修飾されているローダミンの蛍光、(II)Qd-655(完全相補鎖)の蛍光、(III)Qd-525(コントロール配列)の蛍光。Loading of molecular baggage: Fluorescence image of DNA conjugate microtubule (I) Fluorescence of rhodamine modified in microtubule, (II) Fluorescence of Qd-655 (fully complementary strand), (III) Qd-525 (control sequence) ) Fluorescence. 分子荷物の降荷（制限酵素をインジェクション後）：DNAコンジュゲート微小管の蛍光像 (I)微小管に修飾されているローダミンの蛍光、(II)Qd-655(完全相補鎖)の蛍光。Unloading of molecular packages (after restriction enzyme injection): DNA conjugate microtubule fluorescence image (I) Fluorescence of rhodamine modified in microtubule, (II) Fluorescence of Qd-655 (fully complementary strand). Q-dot搭載DNAコンジュゲート微小管のキネシン固定化基板上での輸送の様子。（＊写真は微小管に修飾されているローダミンの蛍光を観察）（A）０秒後、（B）６０秒後。Transport of Q-dot-loaded DNA conjugate microtubules on a kinesin-immobilized substrate. (* Photo shows the fluorescence of rhodamine modified in microtubules) (A) 0 seconds later, (B) 60 seconds later. 複数種の分子荷物の搭載：DNAコンジュゲート微小管の蛍光像 (I)微小管に修飾されているローダミンの蛍光。(II)Qd-655(含EcoRIで切断配列)の蛍光、(III)Qd-525(含EcoRVで切断配列)の蛍光。Loading of multiple types of molecular luggage: Fluorescence image of DNA-conjugated microtubules (I) Fluorescence of rhodamine modified in microtubules. (II) Fluorescence of Qd-655 (cleaved sequence containing EcoRI), (III) Fluorescence of Qd-525 (cleaved sequence containing EcoRV). 選択的分子荷物の降荷（制限酵素Eco RVをインジェクション後）：DNAコンジュゲート微小管の蛍光像 (I)微小管に修飾されているローダミンの蛍光。(II)Qd-655の蛍光、(III)Qd-525の蛍光。Selective molecular unloading (after injection of restriction enzyme Eco RV): fluorescence image of DNA conjugate microtubule (I) Fluorescence of rhodamine modified in microtubule. (II) Qd-655 fluorescence, (III) Qd-525 fluorescence. 選択的分子荷物の降荷（制限酵素Eco RIをインジェクション後）：DNAコンジュゲート微小管の蛍光像 (I)微小管に修飾されているローダミンの蛍光。(II)Qd-655の蛍光。Selective molecular unloading (after injection of restriction enzyme Eco RI): fluorescence image of DNA-conjugated microtubule (I) Fluorescence of rhodamine modified in microtubule. (II) Qd-655 fluorescence.

Claims

一本鎖のリンカーDNAが微小管上に結合しているリンカーDNAコンジュゲート微小管、キネシンが塗布された基板、緩衝液からなり、標的DNAを含むサンプルDNAとリンカーDNAコンジュゲート微小管とを反応させ、微小管上のリンカーDNAと相補的なDNA配列が修飾された標的分子荷物がハイブリダイゼーションによりDNAコンジュゲート微小管に固定化され、キネシンを塗布された基板上を移動することにより、選択的に目的の標的分子荷物を移動させ、制限酵素によりリンカーDNAを切断することで分子荷物を降荷する分子荷物の搭載降荷分子モータシステム。 A linker DNA-conjugated microtubule in which single-stranded linker DNA is bound on the microtubule, a substrate coated with kinesin, and a buffer solution, which reacts sample DNA containing the target DNA with the linker DNA-conjugated microtubule The target molecule package modified with a DNA sequence complementary to the linker DNA on the microtubule is selectively immobilized by hybridization on the DNA-conjugated microtubule and moved on a kinesin-coated substrate. A molecular loading system for unloading molecular packages that unloads molecular packages by moving the target molecular packages to the target and cleaving the linker DNA with restriction enzymes.

標的DNAが蛍光標識されたものである請求項１に記載した分子荷物の搭載降荷分子モータシステム。 2. The molecular cargo loading / unloading molecular motor system according to claim 1, wherein the target DNA is fluorescently labeled.

微小管上のリンカーDNAと相補的なDNA配列が修飾された標的分子荷物において、さらに修飾するDNA配列を変更して一つの微小管上に数種類の分子荷物を積む請求項１又は請求項２に記載した分子荷物の搭載降荷分子モータシステム。 The target molecular package modified with a DNA sequence complementary to the linker DNA on the microtubule, wherein the DNA sequence to be modified is further changed to load several types of molecular packages on one microtubule. Loaded molecular unloading molecular motor system with molecular package described.

標的分子荷物が、一本鎖のDNAが修飾された量子ドット（Q-dot）を含み、さらに、量子ドット（Q-dot）を修飾するDNAの配列には制限酵素により切断される配列を設計した請求項１ないし請求項３のいずれかに記載した分子荷物の搭載降荷分子モータシステム。 The target molecular package contains a quantum dot (Q-dot) modified with single-stranded DNA, and the sequence of DNA that modifies the quantum dot (Q-dot) is designed to be cleaved by a restriction enzyme. 4. A molecular load mounting / unloading molecular motor system according to any one of claims 1 to 3.

キネシンが塗布された基板上において、一本鎖DNA標識された標的DNAを含むサンプルDNAを、一本鎖のプローブDNAコンジュゲート微小管と反応させる反応部位、移動したプローブDNAと相補結合した標的DNAを検出する検出部位が、通路で結ばれ、反応と移動と検出が緩衝液中で行われることを特徴とする請求項１に記載した分子モータシステム。 A reaction site where sample DNA containing target DNA labeled with single-stranded DNA is reacted with a single-stranded probe DNA conjugate microtubule on a substrate coated with kinesin, and target DNA complementarily bound to the transferred probe DNA 2. The molecular motor system according to claim 1, wherein the detection sites for detecting the reaction are connected by a passage, and the reaction, movement and detection are performed in a buffer solution.

一本鎖のリンカーDNAと微小管の結合が、アビジン化DNAとビオチン化微小管若しくは、ビオチン化DNAとアビジン化微小管により行われる請求項１ないし請求項５のいずれかに記載した分子荷物の搭載降荷分子モータシステム。 The molecular package according to any one of claims 1 to 5, wherein the binding between the single-stranded linker DNA and the microtubule is performed by avidinized DNA and biotinylated microtubules, or biotinylated DNA and avidinized microtubules. Onboard unloading molecular motor system.

移動した標的DNA又はサンプル分子荷物を、制限酵素により切断することに代えて、脱ハイブリダイゼーション（脱相補結合）により、微小管から分離する請求項１ないし請求項６のいずれかに記載した分子荷物の搭載降荷分子モータシステム。

The molecular package according to any one of claims 1 to 6, wherein the transferred target DNA or sample molecular package is separated from the microtubule by dehybridization (decomplementary binding) instead of being cleaved by a restriction enzyme. The unloading molecular motor system.