JP4257513B2 - バイオセンシング方法 - Google Patents
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(1)ターゲット分子とキャプチャー分子との生体分子間相互作用を検出するバイオセンシング方法であって、
基板上に、ターゲット分子及びキャプチャー分子に対して反応性を有さない単分子膜が被覆されたテンプレート領域と基板面が露出した生体分子固定領域とを、上記テンプレート領域が上記生体分子固定領域を取り囲むように形成し、
上記生体分子固定領域の基板面に、ターゲット分子を、上記基板面と上記ターゲット分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに結合させて固定化し、次いで、上記生体分子固定領域に固定化されたターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を、表面に該表面と上記キャプチャー分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに固定化した磁性微粒子を、上記ターゲット分子とキャプチャー分子とを結合させることによって上記基板上に固定化し、上記磁性微粒子に、更に蛍光物質を固定化して、或いは
上記生体分子固定領域の基板面に、ターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を、上記基板面と上記キャプチャー分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに結合させて固定化し、次いで、上記生体分子固定領域に固定化されたキャプチャー分子と結合させるターゲット分子を、表面に該表面と上記ターゲット分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに固定化した磁性微粒子を、上記ターゲット分子とキャプチャー分子とを結合させることによって上記基板上に固定化し、上記磁性微粒子に、更に蛍光物質を固定化して
上記固定化された磁性微粒子の磁気をシグナルとすると共に、上記固定化された蛍光物質が発する蛍光をシグナルとして上記基板上に固定化されたターゲット分子を検出することを特徴とするバイオセンシング方法、
(2)ターゲット分子とキャプチャー分子との生体分子間相互作用を検出するバイオセンシング方法であって、
シリコン酸化膜が形成された基板の該シリコン酸化膜上に、ターゲット分子及びキャプチャー分子に対して反応性を有さないアルコキシシランの有機単分子膜が被覆されたテンプレート領域と、上記シリコン酸化膜が露出した生体分子固定領域とを、上記テンプレート領域が上記生体分子固定領域を取り囲むように形成し、
上記生体分子固定領域のシリコン酸化膜に、ターゲット分子を、上記有機単分子膜とは反応せず、上記シリコン酸化膜と反応して該シリコン酸化膜と上記ターゲット分子とを連結する連結分子を介して上記シリコン酸化膜に結合させて固定化し、次いで、上記生体分子固定領域に固定化されたターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を、表面に該表面と上記キャプチャー分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに固定化した磁性微粒子を、上記ターゲット分子とキャプチャー分子とを結合させることによって上記シリコン酸化膜上に固定化し、上記磁性微粒子に、更に蛍光物質を固定化して、或いは
上記生体分子固定領域のシリコン酸化膜に、ターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を、上記有機単分子膜とは反応せず、上記シリコン酸化膜と反応して該シリコン酸化膜と上記キャプチャー分子とを連結する連結分子を介して上記シリコン酸化膜に結合させて固定化し、次いで、上記生体分子固定領域に固定化されたキャプチャー分子と結合させるターゲット分子を、表面に該表面と上記ターゲット分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに固定化した磁性微粒子を、上記ターゲット分子とキャプチャー分子とを結合させることによって上記シリコン酸化膜上に固定化し、上記磁性微粒子に、更に蛍光物質を固定化して
上記固定化された磁性微粒子の磁気をシグナルとすると共に、上記固定化された蛍光物質が発する蛍光をシグナルとして上記基板上に固定化されたターゲット分子を検出することを特徴とするバイオセンシング方法、及び
(3)上記シリコン酸化膜と上記ターゲット分子とを連結する連結分子、及び上記シリコン酸化膜と上記キャプチャー分子とを連結する連結分子が、アミノ系又はカルボキシル系の官能基を少なくとも1個含有する炭素数3〜20の直鎖状炭化水素基を有するアルコキシシランであることを特徴とする(2)記載のバイオセンシング方法
を提供する。
本発明においては、基板上にバイオセンシングにより検出する生体分子であるターゲット分子又はターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を固定化する。そのために、まず、基板上にバイオセンシングにより検出する生体分子であるターゲット分子及びターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子に対して反応性を有さない単分子膜が被覆されたテンプレート領域と基板面が露出した生体分子固定領域とを、上記テンプレート領域が上記生体分子固定領域を取り囲むように形成する。
本発明においては、生体分子固定領域に固定化されたターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を、表面に該表面とキャプチャー分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに固定化した磁性微粒子を用い、これを上述したように基板上の生体分子固定領域に固定化したターゲット分子と結合させる。或いは、生体分子固定領域に固定化されたキャプチャー分子と結合させるターゲット分子を表面に該表面とターゲット分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに固定化した磁性微粒子を用い、これを上述したように基板上の生体分子固定領域に固定化したキャプチャー分子と結合させる。
生体分子固定化
基板として、シリコンウェハーの表面にシリコン酸化膜を950℃のドライ酸化によって形成したものを用いた。これを、硫酸過水(硫酸:過酸化水素=4:1)で10分間、120℃、続いてアンモニア過水(アンモニア:過酸化水素:水=1:1:5)で10分間、80℃の条件で洗浄し、ドライ窒素で乾燥後、疎水性単分子膜(ODMS:n−オクタデシルトリメトキシシラン)をシリコン酸化膜上に成膜した。成膜は、0.2mlのODMSを含む20cm3のテフロン(登録商標)容器に基板を封入し、露点−80℃のドライルーム中で110℃にて3〜5時間以上気相化学反応させる方法で行った。ODMSの膜厚は、エリプソメーターによって測定され、1.7〜2.1nmであることが確認された。この結果は、ODMSが単分子膜であることを示している。
10%APTESを含むトルエン溶液中に粒径が約200nmの磁性微粒子(Fe3O4:マグネタイト)を加え、分散させながら、60℃にて30分間反応した。次に、メタノール及び水を用いて十分洗浄し、得られたAPTESを導入した磁性微粒子を、7.5mmol/lSulfo−NHS−LC−LC−ビオチンを含むTris buffer(10mmol/l,pH7.4)中で分散させながら1時間反応した。次に、ビオチン固定化磁性微粒子を50μmol/lアビジン溶液に分散させながら1時間反応してアビジン固定化磁性微粒子を得た。反応後、磁性微粒子は繰り返し洗浄することで精製した。
ビオチン固定化基板に対するアビジン固定化磁性微粒子の反応は、20μlのTris buffer(10mmol/l,pH7.4)中に分散した1〜100μg/mlの粒子を含む溶液を基板ドット上に滴下し、10〜30分間、室温にて静置することで行った。反応後、基板を洗浄することで非特異的に吸着した粒子を除去した。
アビジン固定化磁性微粒子のビオチン固定化基板に対する反応について、各種顕微鏡を用いた詳細な観察を行った。光学顕微鏡観察から、ビオチン−アビジン反応による磁性微粒子の基板上への固定化が確認された(図3(A))。また、基板ドット内に固定化された磁性微粒子の詳細を観察するため、透過型電子顕微鏡(SEM)による評価を行った(図3(B))。ドット内には粒径約200nmの磁性微粒子の存在が確認された。この結果から、生体分子間相互作用により粒子はドット内部にのみ、選択的に固定化されていることが確認された。
ビオチン固定化基板に対してアビジン固定化磁性微粒子を固定化した基板を、原子間力顕微鏡(AFM)及び磁気力間顕微鏡(MFM)により観察した。図4(A)に基板ドット内部のAFM写真、図4(B)にMFM写真を示す。AFM観察から得られた凹凸像に対応する明瞭な磁場像がMFMによって観察された。一方、蛍光顕微鏡により、ドットパターンに対応する粒子に標識されたCy2由来の蛍光像も観察された(図4(C))。
生体分子固定化
実施例1と同様の方法でAPTESを導入した基板を得、この基板に、10mmol/lのSulfo−LC−LC−SPDP溶液を基板表面に滴下し、1時間反応後、基板を洗浄し、続いて25μmol/lのターゲットDNA(オリゴヌクレオチド:5’SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’FITC)溶液25μlを滴下し、1時間静置することで固定化を行った。洗浄後、蛍光顕微鏡を用いて固定化したターゲットDNAを確認したところ、FITC由来の蛍光像が観察された(図5(A))。
10%APTESを含むトルエン溶液中に粒径が約200nmの磁性微粒子(Fe3O4:マグネタイト)を加え、分散させながら、60℃にて30分間反応した。次に、メタノール及び水を用いて十分洗浄し、得られたAPTESを導入した磁性微粒子を、7.5mmol/lSulfo−NHS−LC−LC−ビオチンを含むTris buffer(10mmol/l,pH7.4)中で分散させながら1時間反応した。次に、ビオチン固定化磁性微粒子を50μmol/lアビジン溶液に分散させながら1時間反応し、更に、これに25μmol/lのRhodamine標識検出プローブ(オリゴヌクレオチド:5’biotin-AAAAAAAAAAAAAAA-3’Rhodamine)を加え、1時間反応を行った後、洗浄してDNA検出プローブ固定化磁性微粒子を得た。
DNA固定化基板に対するDNA検出プローブ固定化磁性微粒子の反応は、20μlのTris buffer(10mmol/l,pH7.4)中に分散した1〜100μg/mlの粒子を含む溶液を基板ドット上に滴下し、10〜30分間、室温にて静置することで行った。反応後、基板を洗浄することで非特異的に吸着した粒子を除去した。
DNA検出プローブ固定化磁性微粒子のDNA固定化基板に対する反応について、各種顕微鏡を用いた詳細な観察を行った。光学顕微鏡観察から、DNA検出プローブとDNAとの反応による磁性微粒子の基板上への固定化が確認された。また、基板ドット内に固定化された磁性微粒子の詳細を観察するため、透過型電子顕微鏡(SEM)による評価を行った。ドット内には粒径約200nmの磁性微粒子の存在が確認された。この結果から、生体分子間相互作用により粒子はドット内部にのみ、選択的に固定化されていることが確認された。
DNA固定化基板に対してDNA検出プローブ固定化磁性微粒子を固定化した基板を、原子間力顕微鏡(AFM)及び磁気力間顕微鏡(MFM)により観察した。AFM観察から得られた凹凸像に対応する明瞭な磁場像がMFMによって観察された。一方、蛍光スキャナにより、ドットパターンに対応する粒子に標識されたRhodamine由来の蛍光像も観察された(図6)。
ディスク状基板を用いて実施例1と同様の方法で、ビオチン固定化基板に対してアビジン固定化磁性微粒子を固定化した基板を得た(図7)。次に、ドット部位の磁性微粒子について振動試料型磁力計(VSM)を用いて磁気の検出を行ったところ、図8に示すように良好なヒステリシスループが得られた。この時の保磁力、残留磁化は175Oe、0.062emu/dotであった。また、ドット以外の部位においては、図9に示すように磁気は全く検出されなかった。このように、ドット部位のみにおいて磁気信号が検出されることから、ドット部位以外には、磁性微粒子の付着がないことが確認され、また、ドット部位における磁力を磁力検出機器により検出することが可能であることも確認された。
2 シリコン酸化膜
3 有機単分子膜
4 レジスト
5 テンプレート領域
6 生体分子固定領域
Claims (3)
- ターゲット分子とキャプチャー分子との生体分子間相互作用を検出するバイオセンシング方法であって、
基板上に、ターゲット分子及びキャプチャー分子に対して反応性を有さない単分子膜が被覆されたテンプレート領域と基板面が露出した生体分子固定領域とを、上記テンプレート領域が上記生体分子固定領域を取り囲むように形成し、
上記生体分子固定領域の基板面に、ターゲット分子を、上記基板面と上記ターゲット分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに結合させて固定化し、次いで、上記生体分子固定領域に固定化されたターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を、表面に該表面と上記キャプチャー分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに固定化した磁性微粒子を、上記ターゲット分子とキャプチャー分子とを結合させることによって上記基板上に固定化し、上記磁性微粒子に、更に蛍光物質を固定化して、或いは
上記生体分子固定領域の基板面に、ターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を、上記基板面と上記キャプチャー分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに結合させて固定化し、次いで、上記生体分子固定領域に固定化されたキャプチャー分子と結合させるターゲット分子を、表面に該表面と上記ターゲット分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに固定化した磁性微粒子を、上記ターゲット分子とキャプチャー分子とを結合させることによって上記基板上に固定化し、上記磁性微粒子に、更に蛍光物質を固定化して
上記固定化された磁性微粒子の磁気をシグナルとすると共に、上記固定化された蛍光物質が発する蛍光をシグナルとして上記基板上に固定化されたターゲット分子を検出することを特徴とするバイオセンシング方法。 - ターゲット分子とキャプチャー分子との生体分子間相互作用を検出するバイオセンシング方法であって、
シリコン酸化膜が形成された基板の該シリコン酸化膜上に、ターゲット分子及びキャプチャー分子に対して反応性を有さないアルコキシシランの有機単分子膜が被覆されたテンプレート領域と、上記シリコン酸化膜が露出した生体分子固定領域とを、上記テンプレート領域が上記生体分子固定領域を取り囲むように形成し、
上記生体分子固定領域のシリコン酸化膜に、ターゲット分子を、上記有機単分子膜とは反応せず、上記シリコン酸化膜と反応して該シリコン酸化膜と上記ターゲット分子とを連結する連結分子を介して上記シリコン酸化膜に結合させて固定化し、次いで、上記生体分子固定領域に固定化されたターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を、表面に該表面と上記キャプチャー分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに固定化した磁性微粒子を、上記ターゲット分子とキャプチャー分子とを結合させることによって上記シリコン酸化膜上に固定化し、上記磁性微粒子に、更に蛍光物質を固定化して、或いは
上記生体分子固定領域のシリコン酸化膜に、ターゲット分子に選択的に結合するキャプチャー分子を、上記有機単分子膜とは反応せず、上記シリコン酸化膜と反応して該シリコン酸化膜と上記キャプチャー分子とを連結する連結分子を介して上記シリコン酸化膜に結合させて固定化し、次いで、上記生体分子固定領域に固定化されたキャプチャー分子と結合させるターゲット分子を、表面に該表面と上記ターゲット分子とを連結する連結分子を介して又は介さずに固定化した磁性微粒子を、上記ターゲット分子とキャプチャー分子とを結合させることによって上記シリコン酸化膜上に固定化し、上記磁性微粒子に、更に蛍光物質を固定化して
上記固定化された磁性微粒子の磁気をシグナルとすると共に、上記固定化された蛍光物質が発する蛍光をシグナルとして上記基板上に固定化されたターゲット分子を検出することを特徴とするバイオセンシング方法。 - 上記シリコン酸化膜と上記ターゲット分子とを連結する連結分子、及び上記シリコン酸化膜と上記キャプチャー分子とを連結する連結分子が、アミノ系又はカルボキシル系の官能基を少なくとも1個含有する炭素数3〜20の直鎖状炭化水素基を有するアルコキシシランであることを特徴とする請求項2記載のバイオセンシング方法。
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