JP4256802B2 - 感作ラテックス及び免疫学的測定法 - Google Patents
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Description
本発明は、活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中等に存在するニトロスピラ属に属する細菌を、迅速・簡便に測定する当該抗体感作ラテックス、免疫学的手法、および好気性生物処理施設の運転管理法に関するものである。
更に詳しくは、徒来、長期間を要し、また技術的にも熟練が必要とされていたニトロスピラ属の細菌の検出を、簡便な操作で、正確に実施することを可能にすると共に、新規な抗体感作ラテックス、ニトロスピラ属細菌の測定方法、および活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセスを的確に運転管理する方法を確立するものである。
我々の生活環境から排出される廃水、ゴミ等は多くの窒素化合物を含み、それらは地下水、河川、湖沼などの周辺環境へ排出され、重大な環境問題を引き起こすことがある。その対策として活性汚泥を使った生物学的硝化・脱窒法が開発され、様々な下水処理場で利用されている。その処理法の内、硝化行程においては、活性汚泥中に存在する硝化細菌が重要な役割を担っている。
生物学的脱窒処理プロセスでは硝化反応が律速段階となっているため、処理プロセスの安定化や更なる高度効率化を図るためには、硝化反応にかかわる微生物群（硝化細菌、アンモニア酸化細菌と亜硝酸酸化細菌で構成される）の解析が必要不可欠であると考えられている。
一般に硝化反応にかかわる細菌は独立栄養細菌であり、有機物を除去する従属栄養細菌に比較して比増殖速度が小さく、ｐＨ、水温などの環境条件の影響を受けやすいため、硝化反応槽（反応タンク）に硝化細菌を高密度に保持することは非常に重要である。
しかしながら、これら処理槽の評価及び維持管理はシステムのインプット及びアウトプットの解析により判定されているが、肝心の菌叢の判定等は全く行われていないのが現状である。
具体的には、従来、下水処理施設の活性汚泥処理槽等の生物学的窒素処理プロセス中や土壌中の亜硝酸酸化細菌の定量方法としては、一般に、試料を採取し、１ヶ月から２ヶ月位の培養期間を経た後、当該試料における亜硝酸の消費の有無から、それらを間接的に測定する方法が知られていた（非特許文献１参照）。
また、従来、かかる方法を利用することによって、活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセスや土壌中の硝化細菌の動向を管理するを行おうとの試みがあったが、当該方法では、硝化細菌数の測定に熟練性が要求され、また、かなりの日数が必要となることから、測定結果から硝化細菌の動向を日常的に管理するための迅速な対応が取れないのが現状であった。
そこで、発明者らは、代表的な硝化細菌であるニトロソモナス属の細菌（アンモニア酸化細菌）とニトロバクター属の細菌（亜硝酸酸化細菌）についてこれらの菌を特異的に認識する抗体を用いる検出方法を開発し、該方法によりアンモニア酸化細菌または亜硝酸酸化細菌を、迅速・簡便に検出する方法を提供している（特許文献１参照）。更に、当該抗体をラテックス粒子に吸着させた抗体感作ラテックスを使用することで、さらに容易にアンモニア酸化細菌、亜硝酸酸化細菌の検出を行う方法についても提供してきた（特許文献２参照）。
一方、１９９０年以降、水環境分野に分子生物学的手法を使った解析技術が導入されたことにより、硝化細菌の分布やポピュレーションに関する知見は徐々に更新されつつある。特に亜硝酸酸化細菌については、新たにニトロスピラ属の細菌が見出され、優占種として検出される窒素処理プロセスが頻繁に報告されるようになった。このことから、当該生物学的窒素処理プロセスでの窒素の除去効率を正しく把握するためには、ニトロソモナス属及びニトロバクター属の細菌に加えて、ニトロスピラ属の細菌数をいかに正確に測定するかという点が重要な課題となっている。
しかしながら、上述した測定方法では、生物学的窒素処理プロセスより入手した活性汚泥等の検体を用い培養する過程で、ニトロソモナス属細菌やニトロバクター属細菌等、ニトロスピラ属細菌以外の菌体が優勢となってしまい、正確な結果が得られないといった問題があった。また、ニトロスピラ属細菌自体が従来の方法では単離できないため、ニトロスピラ属細菌を特異的に認識する抗体を得ることができず、当該菌を検出・定量することはできないという問題があった。
木村龍介ら、土壌微生物実験法、207-214頁(1992) 特開平０５−３２２８９６号公報
特開平０８−０２９４２６号公報
木村龍介ら、土壌微生物実験法、207-214頁(1992)
この様な状況を踏まえ、本発明者等は、更に、活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中等などに存在するニトロスピラ属の細菌を簡便かつ迅速に測定する方法を開発することを目的として鋭意検討を行った。その結果、本発明者らは、ニトロスピラ属の細菌に特異的な抗体を作製し、当該抗体をラテックス粒子に吸着させた抗体感作ラテックスを用いることにより、簡単な操作で目的とするニトロスピラ属の細菌を迅速に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の目的は、活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中等のニトロスピラ属の細菌を迅速・簡便に検出することを可能にする新規なニトロスピラ属の細菌測定用抗体感作ラテックスを提供することにある。また、別の目的は、上記測定用抗体感作ラテックスを利用することによって、活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中等のニトロスピラ属の細菌を、迅速・簡便に測定する免疫学的測定法を提供することにある。更に別の目的は、好気性生物処理施設の日々の管理について、ニトロスピラ属をはじめとする硝化細菌数を指標とした好気性生物処理槽の運転管理法を提供することにある。
請求項１に記載された発明に係るニトロスピラ属細菌測定用抗体感作ラテックスは、亜硝酸酸化活性を有するニトロスピラ属細菌に特異的な抗体を比重が略１．５ｇ／ｍｌで平均粒径が１．０〜１．５μｍのラテックス粒子に吸着させたことを特徴とするものである。
請求項２に記載された発明に係るニトロスピラ属細菌測定用抗体感作ラテックスを用いた免疫学的測定法は、請求項１に記載の抗体感作ラテックスと被検試料とを混合し、予め定められた時間静置した後、個々のラテックス粒子同士が凝集したことを示す凝集像の発生の有無を確認することを特徴とするものである。
本発明は以上説明した通り、ニトロスピラ属の細菌に特異的な抗体をラテックス粒子に吸着させた測定用抗体感作ラテックスに係るものであり、当該抗体感作ラテックスを用いることにより、従来、長期間を要し、技術的にも熟練が必要とされていた、ニトロスピラ属の細菌の検出・測定を容易にかつ簡便に行うことを可能とするものである。また、別の本発明は、ニトロスピラ属の細菌に対する特異的な抗体を作製し、活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中のニトロスピラ属の細菌を同定し、その菌数を迅速かつ適正に測定することを可能にするものである。更に別の発明では、ニトロスピラ属をはじめとする硝化細菌数を指標とし、好気性生物処理槽の運転条件を制御することにより、好気性生物処理施設の運転管理が容易となる。
本発明のニトロスピラ属細菌測定用抗体感作ラテックスは、亜硝酸酸化活性を有するニトロスピラ属細菌に特異的な抗体を比重が略１．５ｇ／ｍｌで平均粒径が１．０〜１．５μｍのラテックス粒子に吸着させたものであり、これにより、従来、長期間を要し、技術的にも熟練が必要とされていた、ニトロスピラ属の細菌の検出・測定を容易にかつ簡便に行うことができる。
本発明の方法は、ニトロスピラ属の細菌に対する抗体と、抗体とを反応させる免疫学的測定法であればよく、検体としては、例えば、活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中から採取した試料等をそのままあるいは希釈して用いることができる。より具体的には、検体中に存在するニトロスピラ属の細菌を、これらに特異的な抗体により検出・定量する免疫測定法等が挙げられる。
免疫測定法としては、例えばラテックス凝集法や逆受身ラテックス（赤血球）凝集法等の免疫凝集法、免疫クロマト法、蛍光抗体法、酵素抗体法及び放射免疫測定法などが挙げられるが、簡便性、及び迅速性の点から免疫凝集法及び免疫クロマト法が好ましい。また、当該免疫凝集法のうち、抗原または抗体を結合した赤血球またはラテックス粒子を用いる間接凝集反応である逆受身ラテックス（赤血球）凝集法が特に好ましい。
本発明の免疫凝集法に使用する不溶性担体としては、赤血球、金コロイド粒子等の無機化合物粒子およびラテックス粒子等の有機高分子粒子等の何れを用いてもよいが、ラテックス粒子を用いることが抗原または抗体感作後の試薬の安定性の点から好ましい。
本発明で云うニトロスピラ属の細菌とは、亜硝酸酸化活性、すなわち亜硝酸の酸化により硝酸を生成する作用を有する微生物、所謂、亜硝酸酸化菌の一属である。現在、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）にはニトロスピラ様細菌の１６Ｓ−ｒＲＮＡ塩基配列が４３本登録されており、その配列を用いた系統解析結果から、４つの系統（種）が提案されている。
しかし、純粋培養に成功した菌株は淡水性のニトロスピラ モスコビエンシス(Nitrospira moscoviensis)、および深海から単離されたニトロスピラ マリナ(Nitrospira marina ATCC43039株)の２株しかなく、活性汚泥、土壌、その他下水処理リアクターなどの通常の生物学的窒素処理プロセスからは単離されていない。本発明では、抗体を調製するためのニトロスピラ属の細菌として、ニトロスピラ モスコビエンシスを用いたが、他にニトロスピラ属の純粋培養株が確立された場合には、当該菌株を用いても同様に抗体を調製し得ることは言うまでもない。
これらの菌に特異的な抗体は、上記の菌体を抗原としてウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、羊、馬などの動物を免疫し、得られた抗体を細菌の検出用抗体とし用いればよい。さらには、公知の方法（特許文献１に記載の方法等）により製造した抗血清を、更に、プロテインＧを結合したアフィニティークロマト等の適宣の精製手段で精製して使用される。
以下、免疫凝集法の場合を例にとり、より詳細に説明する。用いるラテックス粒子としては、比重が１．０ｇ以上／ｍｌであり、好ましくは１．５ｍｇ／ｍｌ前後、特に１．２〜１．８ｍｇ／ｍｌの高比重ラテックス粒子が好適なものとして用いられ、さらに平均粒子径は約０．１〜４．０μｍ、好ましくは平均１．０〜１．５μｍ前後、更に好ましくは平均１．３μｍ前後のラテックス粒子が好適なものとして用いられ、更にはラテックス粒子に着色したものが好適なものとして用いられる。このようなラテックス粒子としては、例えば、バクトラテックス０．８１（ディフコ（DIFCO）社製、平均粒径０．８１μｍ、比重１．０ｇ／ｍｌ）や、IMMUTEX Hシリーズ（ＪＳＲ社製、比重は１．５ｇ／ｍｌ、平均粒径は０．９４μｍ〜４．９μｍ、着色したラテックスを含む）およびポリビーズ#15706、#15709（ポリサイエンス社製）等の市販製品が例示できるが、これに限らず、これらと同じ効果を有するものであればその種類を問わず使用することが可能である。
ニトロスピラ属の細菌に特異的な抗体を調製するには、まず、菌を亜硝酸を増殖基質とする無機塩液体培地を用いて培養し、必要に応じて殺菌し、集菌し、抗原とする。次いで、この抗原を、ウサギの耳静脈から注射により投与し、抗体価の上昇を確認した上で、全採血し、遠心分離などの適宣な処理を施した後、５６℃で不活化を行い、抗血清とする。更に、プロテインＧを結合したアフィニティークロマト等の適宣の精製手段で精製して使用される。
次いで、上記特異的な抗体を吸着させる担体のラテックス粒子や、また、感作ラテックスの製造方法等は、特に限定されるものではなく、例えば本発明者らが報告した方法（特許文献２に記載の方法）に従い調製することができる。
これら抗体を担体粒子に担持させて免疫学的凝集反応粒子とする方法は、物理吸着法と化学結合法があるが、どちらも本発明の免疫学的凝集反応に好適に使用することができる。凝集反応粒子としてラテックス粒子を用いる場合は、物理的吸着法で充分に抗原または抗体を感作させることが可能である。
上記のラテックス粒子に抗体を感作させる場合は、緩衝液中において行うことが好ましい。すなわち、適当な濃度に希釈したラテックス粒子の懸濁液と抗体または抗原の溶液とを混合し、しばらく放置した後に洗浄して感作ラテックス粒子を製造する。希釈に用いる緩衝液としては、一般に担持された抗原または抗体の測定対象物質である抗体または抗原との反応を阻害しないイオン強度、ｐＨを有するものが選択される。例えば、ＴＢＳ、ＰＢＳ、ＧＢＳ、リン酸緩衝液およびホウ酸緩衝液が利用できる。中でも、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液およびＧＢＳは感作ラテックス粒子の凝集性、自己凝集の起こりにくさから好適なものとして用いられる。ｐＨ５〜１０の範囲で選択されることが一般的であり、特にｐＨ６〜９の範囲が好適なものとして選択される。
感作時のラテックス粒子の濃度は０．０１〜０．５（ｗ／ｖ）％が適当であり、特に０．０５〜０．２５（ｗ／ｖ）％程度で良好な結果が得られる。また、抗体を感作させる場合における抗体溶液の抗体タンパク質濃度は、１．０〜１０００μｇが適当であり、それ以外では感度の低下や感作ラテックス粒子の自己凝集により陽性・陰性の判断がつきにくくなる。更に、感作反応時の温度については、０〜６０℃の範囲内で行うが、室温または室温よりやや高めの温度（〜４０℃）で反応を行うと、感度のよいラテックス粒子が得られる。
これらの感作ラテックスを用いて、ニトロスピラ属の細菌の検出、菌数の測定を行うには、逆受身ラテックス凝集法が好ましい。逆受身ラテックス凝集法とは、被検物質と特異的に結合する性質をもつ物質（抗体など）を高比重の標識物質（ラテックス粒子など）に結合させた免疫学的凝集反応粒子を含む液状の試薬と、被検物質を含む試料を混合し、対象物質の検出あるいは定量を行う方法である。より詳細には、適当な段階に希釈した試料と、抗体感作ラテックスを含む試薬とを混合し、凝集像が観察される希釈度を確認し、一方で、既知菌数の菌液を含む標準試料を用いた混合試験を行い、その結果との比較から、菌数を算出すればよい。
さらに詳細には、Ｕ型のマイクロタイタープレートに、緩衝液で段階的に希釈した抗原または標準試料を添加し、各穴に等量の試薬を分注した後、室温で４〜１５時間静置した後、肉眼または１０倍程度のルーペを用い、観察・判定するものである。具体的には、緩衝液のみの場合の凝集像を陰性とし、各穴の凝集像を判定し、陽性の凝集像を示した被検穴の希釈倍率と標準抗原を用いた凝集試験の結果から、菌数を計算する。
本発明においては、このほかにも本発明に係るラテックス粒子と被検試料とをスライドガラス上で混合し、光学顕微鏡的に凝集像の成否を判断する方法（顕微鏡ラテックス法）や、免疫クロマト法等、免疫学的凝集反応粒子を用いる様々な定性・定量方法に利用できることは言うまでもない。
なお、従来から、一般的に、抗体を吸着させる担体としてラテックス粒子が存在することは知られていたが、これを実際にニトロスピラ属の細菌の検出・同定に使用した例はこれまで報告されておらず、その有効性は本発明者らによって初めて検討されたものである。また、ニトロスピラ属の細菌に特異的な抗体を用いて、特に活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中の活性（亜硝酸の酸化）のある目的微生物を同定し、その菌数を迅速かつ適正に管理する方法を確立することを可能にし得るとの知見は、本発明者らによって初めて得られたものである。
更に、本発明では、好気性生物処理槽内のニトロスピラ属細菌数を測定し、目標の硝化率を維持するために必要なニトロスピラ属細菌数となるように、槽内の固形物滞留時間、槽内の溶存酸素量、槽内への流入負荷から選ばれる少なくとも１つの運転条件を制御する。更に好ましくは、ニトロスピラ属細菌に加えて、ニトロソモナス属細菌数およびニトロバクター属細菌数を測定し、目標の硝化率を維持するために必要なニトロソモナス属細菌数、ニトロバクター属細菌数およびニトロスピラ属細菌数となるように、槽内の固形物滞留時間、槽内の溶存酸素量、槽内への流入負荷から選ばれる少なくとも１つの運転条件を制御する。これにより、好気性生物処理施設日々の運転管理について、ニトロスピラ属をはじめとする硝化細菌数を指標とした管理が容易となる。
ここでいう好気性生物処理とは溶存酸素の存在のもとに、さまざまな好気性微生物が関与して、有機性物質、アンモニア性窒素、臭気、鉄などを酸化分解し、除去する処理方法である。好気性処理を大別すると、曝気によって生物フロックを浮遊させた状態で有機物質を酸化分解する方法と、担体に微生物を付着増殖させて生物膜を形成させ、これを廃水に接触させて酸化分解する方式に分かれる。前者の代表が活性汚泥法であり、下水処理で広く用いられている。後者は一般に生物膜法と呼ばれている。
ここでいう活性汚泥法とは、標準活性汚泥法、酸素活性汚泥法、長時間エアレーション法、オキシデーションディッチ法、回分式活性汚泥法等が含まれ、さらには循環式硝化脱窒法、硝化内生脱窒法、嫌気−無酸素−好気法、嫌気−好気活性汚泥法が含まれる。またここでいう生物膜法とは、微生物を担体（支持体あるいは接触材ともいう）に固定化させることから、最近は生物固定法と呼ぶことが多い。担体の状態から分類すると、担体を処理槽に浸漬させておく場合（固定床）と処理槽内で動かす場合（流動床）に分けられる。
また主に窒素化合物やリンの除去を目的として生物膜を用いて高濃度廃水を嫌気性処理した後に好気性処理する方法などの好気性処理と嫌気性処理の併用技術が活用されているが、このような好気性生物処理を含む生物処理方法に広く応用できることは言うまでもない。
以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は当該実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１．抗原に用いる菌体の調製
ニトロスピラ モスコビエンシスを表１の培地で培養した。この株はドイツ・ハンブルグ大学 エバ スピーク博士(Universitat Hamburg、 Dr. Eva Spieck)から分与された(非特許文献２参照)。培養は３段階(100mLスケールの種培養、1Lスケールの中間培養、4Lスケールの最終培養)に分けて行い、いずれの段階も培養温度は３７℃、培養期間は７〜１０日間とした。
Ehrich S., D.Behrens,E.Lebedeva, W.Ludwig, and E.Bock. (1995) A new obligately chemolitoautotrophic, nitrite-oxidizing bacterium, Nitrospira moscoviensis sp. nov. and its phylogenetic relationship. Arch. microbiol. 164: pp 16-23.
ニトロスピラ モスコビエンシスを表１の培地で培養した。この株はドイツ・ハンブルグ大学 エバ スピーク博士(Universitat Hamburg、 Dr. Eva Spieck)から分与された(非特許文献２参照)。培養は３段階(100mLスケールの種培養、1Lスケールの中間培養、4Lスケールの最終培養)に分けて行い、いずれの段階も培養温度は３７℃、培養期間は７〜１０日間とした。
Ehrich S., D.Behrens,E.Lebedeva, W.Ludwig, and E.Bock. (1995) A new obligately chemolitoautotrophic, nitrite-oxidizing bacterium, Nitrospira moscoviensis sp. nov. and its phylogenetic relationship. Arch. microbiol. 164: pp 16-23.
菌の増殖が最大になったと考えられる時点で最終培養を停止し、当該培養液を４．０℃で24,000×ｇ １０分間遠心分離し、菌を回収した。ＰＢＳ ３０ｍＬを加えピペッティングにより菌を分散させた後、等量の０．６％ホルマリンを添加し十分に攪拌した。この溶液を３７℃で１時間静置した後、さらに菌が死滅するまで４．０℃で固定した。固定菌体を24,000×ｇ １０分間遠心分離して回収しＰＢＳで洗浄した後、再度24,000×ｇ １０分間遠心分離した菌体を抗原に用いた。さらに、６６０ｎｍの吸光度が０．５となるようにＰＢＳで調整し、供試抗原とした。
抗原の純度は、ニトロスピラに特異的なＤＮＡプローブ NSR1156およびNtspa0662を用いて確認した。すなわち、当該プローブを用いてハイブリダイゼーション試験を行い、菌懸濁液中にDSM10035以外の菌が混入していないかどうかを確認した。
実施例２．ポリクローナル抗体の作製方法
ＫＢＬ：Ｊｗ（日本白色種）ウサギを２羽使用した。抗原の投与量は１回あたり０．５ｍＬとし、７〜１０日毎に耳静脈から注射した。免疫中のウサギから試験的に血清を採取し、ニトロスピラ モスコヴィエンシスDSM10035株に対する抗体価の上昇度を酵素結合免疫測定法（enzyme linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ法）ＥＬＩＳＡ法により調べた。具体的には、炭酸・重炭酸緩衝液で吸光度（Ａ660nm）＝０．０５に調整した抗原を９６穴プレートに１ウェルあたり１００μＬ分注し、４．０℃で１６時間吸着させた。洗浄液（０．０５％Triton-X100を含むＰＢＳ（−））で各ウェルを洗浄後、ブロッキング液（１．０％ＢＳＡを含む炭酸・重炭酸緩衝液）を１２０μＬ／ウェル添加し、３７℃で１時間反応させた。ウェルを洗浄した後、０．０５％Triton-X100、１．０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で段階希釈した血清を１ウェルあたり９０μＬ加え、３７℃で１．５時間反応させた。ウェルの洗浄後、ペルオキシターゼ標識２次抗体（抗ウサギ免疫グロブリンＧ（IgG）−ヒツジIgG）を１００μＬ／ウェル添加し、遮光してさらに３７℃、１．５時間反応させた。反応終了後、洗浄したウェルに過酸化水素をふくむＯ−フェニレンジアミンの加クエン酸緩衝液を１００μＬ／ウェル添加し、遮光して３７℃で１０分放置し、発色させた。２．５Ｍ硫酸を５０μＬ／ウェル添加し反応を停止させた後、４９２ｎｍの吸光度（Ａ660nm）を測定した。なお抗体価は、Ａ492nmの発色強度が０．５を示す血清の希釈倍率の逆数で示した。抗体価の上昇が認められない場合に、心臓から全採血を行った。５６℃で不活化し、ニトロスピラ属の細菌に対応する抗血清とした。
ＫＢＬ：Ｊｗ（日本白色種）ウサギを２羽使用した。抗原の投与量は１回あたり０．５ｍＬとし、７〜１０日毎に耳静脈から注射した。免疫中のウサギから試験的に血清を採取し、ニトロスピラ モスコヴィエンシスDSM10035株に対する抗体価の上昇度を酵素結合免疫測定法（enzyme linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ法）ＥＬＩＳＡ法により調べた。具体的には、炭酸・重炭酸緩衝液で吸光度（Ａ660nm）＝０．０５に調整した抗原を９６穴プレートに１ウェルあたり１００μＬ分注し、４．０℃で１６時間吸着させた。洗浄液（０．０５％Triton-X100を含むＰＢＳ（−））で各ウェルを洗浄後、ブロッキング液（１．０％ＢＳＡを含む炭酸・重炭酸緩衝液）を１２０μＬ／ウェル添加し、３７℃で１時間反応させた。ウェルを洗浄した後、０．０５％Triton-X100、１．０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で段階希釈した血清を１ウェルあたり９０μＬ加え、３７℃で１．５時間反応させた。ウェルの洗浄後、ペルオキシターゼ標識２次抗体（抗ウサギ免疫グロブリンＧ（IgG）−ヒツジIgG）を１００μＬ／ウェル添加し、遮光してさらに３７℃、１．５時間反応させた。反応終了後、洗浄したウェルに過酸化水素をふくむＯ−フェニレンジアミンの加クエン酸緩衝液を１００μＬ／ウェル添加し、遮光して３７℃で１０分放置し、発色させた。２．５Ｍ硫酸を５０μＬ／ウェル添加し反応を停止させた後、４９２ｎｍの吸光度（Ａ660nm）を測定した。なお抗体価は、Ａ492nmの発色強度が０．５を示す血清の希釈倍率の逆数で示した。抗体価の上昇が認められない場合に、心臓から全採血を行った。５６℃で不活化し、ニトロスピラ属の細菌に対応する抗血清とした。
実施例３．免疫グロブリンＧ（Immunoglobulin Ｇ：IgG）の精製
プロテインＧを結合したアフィニティークロマト（Mab TrapGキット アマシャム・ファルマシア製）により抗血清からＩｇＧを分画した。この精製ＩｇＧを抗ニトロスピラ抗体とし、以下の実験に用いた。
プロテインＧを結合したアフィニティークロマト（Mab TrapGキット アマシャム・ファルマシア製）により抗血清からＩｇＧを分画した。この精製ＩｇＧを抗ニトロスピラ抗体とし、以下の実験に用いた。
実施例４．交差反応性試験
抗ニトロスピラ抗体と表２に示す各細菌との交差反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた。交差反応性は、抗ニトロスピラ抗体のニトロスピラ モスコヴィエンシス （DSM10035株）に対する抗体価（ＥＬＩＳＡ法を応用した呈色反応による吸光度（ＯＤ４９２＝0.5）を示す希釈倍率の逆数）を１００％とした場合の、当該抗体と各菌体との交差反応性を％で示した。
抗ニトロスピラ抗体と表２に示す各細菌との交差反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた。交差反応性は、抗ニトロスピラ抗体のニトロスピラ モスコヴィエンシス （DSM10035株）に対する抗体価（ＥＬＩＳＡ法を応用した呈色反応による吸光度（ＯＤ４９２＝0.5）を示す希釈倍率の逆数）を１００％とした場合の、当該抗体と各菌体との交差反応性を％で示した。
一般に活性汚泥等の水質浄化プロセスからは、シュードモナス、アルカリゲネス、フラボバクテリウムなどのグラム陰性桿菌が優占種として報告される例が多い。しかし表３に示す通り、今回作製した抗ニトロスピラ抗体には、これらの菌に対する交差反応性が認められず高い特異性を有することが明らかとなった。そして、これらの高い特異性を有する抗血清は、当該抗体の各細菌に対する凝集反応等の反応特性を直接指標として、あるいは当該反応特性に相関する発色反応を指標として、また、検出用抗体感作ラテックスを用いて、活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中のニトロスピラ属の細菌を簡便に検出するのに有用であることが判明した。
実施例５．ニトロスピラ用ラテックス試薬の調製
ニトロスピラ用ラテックス試薬の検出感度を高めるため、ラテックス粒子に感作させるタンパク質量およびラテックス粒子の粒径を最適化した。抗体感作ラテックス試薬の調製は、公知の特許文献２に記載した方法に準じて行った。
ニトロスピラ用ラテックス試薬の検出感度を高めるため、ラテックス粒子に感作させるタンパク質量およびラテックス粒子の粒径を最適化した。抗体感作ラテックス試薬の調製は、公知の特許文献２に記載した方法に準じて行った。
具体的には、抗ニトロスピラ抗体を、５０〜５００μｇ／ｍＬとなるようにＧＢＳで希釈した。当該抗体希釈液１容にＧＢＳで０．２５％ｗ／ｖに希釈したポリスチレン製高比重ラテックス溶液（ＪＳＲ製、比重１．５ｇ／ｍｌ）１容を混和し、３７℃で１．０時間反応させた。反応終了後、ブロッキング溶液（１．０％ＢＳＡを含む０．１ＭＧＢＳ）を加えラテックス粒子上の抗体未吸着部分をＢＳＡでブロッキングした。３０分間ブロッキング反応した後、2,700×ｇ １０分間 室温で遠心分離し未結合の抗体を取り除いた。この抗体結合ラテックス粒子は保存溶液（１．０％ＢＳＡ、０．０８％ＮａＮ３を含む０．１Ｍ ＧＢＳ ｐＨ８．２）で２度遠心洗浄を繰り返した後、最終的に粒子濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）になるように保存溶液に懸濁し、ニトロスピラ用ラテックス試薬とした。この操作を、表４に記載した各粒径のラテックス粒子について行った。
実施例６．逆受身ラテックス凝集法によるニトロスピラの検出
既知菌数のホルマリン固定済みニトロスピラ モスコヴィエンシス（DSM10035株）を保存溶液を用いて２の階乗希釈した。各希釈液５０μＬを９６ウェルＵＶプレート（SJ103-20 三光純薬株式会社）に分注した後、種々の濃度の抗体を感作させた高比重ラテックス試薬を等量添加した。混合液が飛び散らない程度の強さで十分攪拌した後、室温で４．０時間反応させ、検出可能な最少菌量を求めた。この試験を、表４に示す各粒径について実施し、検出感度の最も高い粒径と抗体タンパク質感作濃度を調べた。
既知菌数のホルマリン固定済みニトロスピラ モスコヴィエンシス（DSM10035株）を保存溶液を用いて２の階乗希釈した。各希釈液５０μＬを９６ウェルＵＶプレート（SJ103-20 三光純薬株式会社）に分注した後、種々の濃度の抗体を感作させた高比重ラテックス試薬を等量添加した。混合液が飛び散らない程度の強さで十分攪拌した後、室温で４．０時間反応させ、検出可能な最少菌量を求めた。この試験を、表４に示す各粒径について実施し、検出感度の最も高い粒径と抗体タンパク質感作濃度を調べた。
その結果、図１に示す通り直径が０．９〜１．４μｍまでの間では粒径に比例して試薬の測定感度が高まることが明らかとなった。反対に、直径が１．４μｍを超えると、感度の低下が認められた。また、同一粒子でも感作させる抗体量により検出感度は変化することから、抗体を感作させるラテックス粒子の粒径、および感作抗体タンパク質量を適宜調節することにより、任意の検出感度を持つニトロスピラ用ラテックス試薬を作製することが可能であった。また、製品Ｎｏ．Ｈ１００９の高比重ラテックス粒子を用いることにより、ラテックス試薬の検出感度を最高で７．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬまで高められることを明らかにした。過去に我々は、日本各地の廃水処理施設から活性汚泥を採取し、当該汚泥中に棲息する硝化細菌群を蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（以下ＦＩＳＨ法と略す）により解析してきた。その結果、ニトロスピラ属細菌の菌数は１０６〜１０８cells/ｍＬの間で推移していることを明らかにしている。よって今回得られたニトロスピラ用ラテックス試薬の検出感度は、活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中に棲息するニトロスピラを検出・定量する手法として十分実用可能なレベルであると考えられた。
実施例７．実試料中のニトロスピラ属細菌数の測定
本発明に係る免疫学的測定法の有効性を確認するために、逆受身ラテックス凝集法により、活性汚泥中のニトロスピラ属の細菌を検出・定量した。
本発明に係る免疫学的測定法の有効性を確認するために、逆受身ラテックス凝集法により、活性汚泥中のニトロスピラ属の細菌を検出・定量した。
被検試料には、標準活性汚泥法４施設、オキシデーションディッチ法６施設、Ａ２Ｏ法１施設および膜分離法１施設の計１２施設の反応タンクから採取した活性汚泥を用いた。また比較対照試験として、ニトロスピラ属の細菌に特異的なＤＮＡプローブＮｔｓｐａ０６６２を用いてＡｍａｎｎらの方法に従い（非特許文献３参照）ＦＩＳＨ法によりニトロスピラ属の細菌数を求めた。さらに、培養法である最確数法（ＭＰＮ法）により亜硝酸酸化細菌数を求めた。
Amann R. (1995) In situ identification of micro-organisms by whole cell hybridization with rRNA-targeted nucleic acid probes ; Molecular Microbial Ecology Manual 3.3.6 : pp 1-15.
Amann R. (1995) In situ identification of micro-organisms by whole cell hybridization with rRNA-targeted nucleic acid probes ; Molecular Microbial Ecology Manual 3.3.6 : pp 1-15.
ＲＰＬＡ法により実処理施設の活性汚泥中の亜硝酸酸化細菌を測定した結果（図２）、ニトロスピラ属の細菌は全ての試料から検出され、菌数は１０６〜１０８オーダーであった。またＦＩＳＨ法でも１４試料から菌が検出され、その測定値は６試料でＲＰＬＡ法の値とほぼ一致した。なお、他の試料についてはＦＩＳＨ法の測定値がＲＰＬＡ法よりも１オーダー程度低くなる傾向が認められた。また、処理方法の違いによる影響も認められなかった。
一方、ＭＰＮ法では逆受身ラテックス凝集法よりも１〜５オーダー以上低い値を示した。ＭＰＮ法による測定値については、混合培養系試料の硝化細菌数をＭＰＮ法で測定した場合、抗原抗体法に比較して２〜５オーダー小さい計測効率であることが知られている（非特許文献４参照）。今回行った実験においても、同様の結果が得られており、硝化細菌の測定法としてＭＰＮ法よりも逆受身ラテックス凝集法の方が適していることが示された。
荒木 信夫， 大橋 晶良， 原田 秀樹， Izarul Machdar (1999) ＦＩＳＨ法を適用した生物膜内硝化細菌の菌数計測と空間分布の観察 ; 水環境学会誌 22 : (2) pp152-159.
荒木 信夫， 大橋 晶良， 原田 秀樹， Izarul Machdar (1999) ＦＩＳＨ法を適用した生物膜内硝化細菌の菌数計測と空間分布の観察 ; 水環境学会誌 22 : (2) pp152-159.
一方、一般的にＦＩＳＨ法は１６Ｓ−リボソーマルＤＮＡおよびＲＮＡの塩基配列情報が細菌間で異なること利用した検出方法であり、分子生物学的な環境微生物の解析手法として非常に有用な方法であると考えられている。しかしこの方法では、細胞内に多数のターゲット（リボゾーマルＲＮＡ）が存在していることが必須であるために、当該リボソーマルＲＮＡ分子を十分に含まない細胞（飢餓状態にある細胞など）では検出することができないことが問題として挙げられている。一方、活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセスに棲息する微生物は、流入水質の多様性等の原因で、常に何らかの環境ストレスを受けながら棲息しているため、菌体内に十分なリボソームＲＮＡが合成されていない場合が多い。よって、今回も亜硝酸酸化活性があってもＦＩＳＨ法では十分に検出されないニトロスピラ属の細菌が存在すると推測された。
また、逆受身ラテックス凝集法では、抗体を利用しているため、既に活性をなくしているが抗原性は残存しているような死菌体も測定している可能性が考えられた。これらのことが原因で、逆受身ラテックス凝集法によるニトロスピラ属細菌の測定値とＦＩＳＨ法による測定値は一致せず、逆受身ラテックス凝集法の方がＦＩＳＨ法の測定値よりも高い値になったと考えられた。
しかしながら、活性汚泥等の水質浄化工程中、水中、土壌中等のニトロスピラ属の細菌を同定し、その菌数を迅速かつ適正に管理する方法を確立することを目的とする今回の開発目標に関しては、本発明のニトロスピラ属の細菌測定用抗体感作ラテックス粒子による逆受身ラテックス凝集法は、迅速性、簡便性の面で優れた方法であることが確認できた。
実施例８．下水処理施設の運転管理への応用
下水処理施設（１０施設）の硝化反応タンクについてニトロスピラ属細菌数と処理水中のケルダール態窒素量の関係を求めた。試料数は、春、夏、秋および冬について各施設１試料ずつ採取し、計４０試料を解析した。その結果、図３に示す通り、ニトロスピラ属細菌数が１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上保持されている反応タンクでは、９０％以上のケルダール態窒素が除去されていることが明らかとなった。また、１０６〜１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの菌数が保持されているタンクでは、約９割のタンクで８０％以上のケルダール態窒素が除去されていた。
下水処理施設（１０施設）の硝化反応タンクについてニトロスピラ属細菌数と処理水中のケルダール態窒素量の関係を求めた。試料数は、春、夏、秋および冬について各施設１試料ずつ採取し、計４０試料を解析した。その結果、図３に示す通り、ニトロスピラ属細菌数が１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上保持されている反応タンクでは、９０％以上のケルダール態窒素が除去されていることが明らかとなった。また、１０６〜１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの菌数が保持されているタンクでは、約９割のタンクで８０％以上のケルダール態窒素が除去されていた。
硝化率は次の式で表される。
硝化率(%) ＝（流入水のケルダール態窒素濃度 − 処理水のケルダール態窒素濃度）／（流入水のケルダール態窒素濃度）×100
よって、以上の結果から、ニトロスピラ属の細菌数が１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、更に好ましくは１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上となるよう、硝化反応タンクの運転条件を調整すれば、８０％以上の硝化率を維持できると考えられた。
硝化率(%) ＝（流入水のケルダール態窒素濃度 − 処理水のケルダール態窒素濃度）／（流入水のケルダール態窒素濃度）×100
よって、以上の結果から、ニトロスピラ属の細菌数が１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、更に好ましくは１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上となるよう、硝化反応タンクの運転条件を調整すれば、８０％以上の硝化率を維持できると考えられた。
硝化細菌の増殖速度は、有機物を分解する細菌の増殖速度と比較してかなり小さいため、生物学的な硝化・脱窒プロセスのようにＣ−ＢＯＤの酸化分解と硝化を同一の反応タンク内で行う場合には、硝化細菌を系内に保持できる条件（式１）が必要となる。
ＳＲＴＮ≧１／μＮ −（式１）
ＳＲＴＮ：硝化細菌を反応タンク系内に維持するために必要な固形物滞留時間(SRT)(d)
μＮ ：硝化細菌の比増殖速度
ＳＲＴＮ≧１／μＮ −（式１）
ＳＲＴＮ：硝化細菌を反応タンク系内に維持するために必要な固形物滞留時間(SRT)(d)
μＮ ：硝化細菌の比増殖速度
活性汚泥プロセスでは、硝化細菌のＳＲＴと活性汚泥プロセスのＳＲＴが同じであることから、当該プロセスに硝化細菌を維持し硝化を促進させるためには、式１を満たすＳＲＴの設定が必要であった。
硝化細菌の増殖速度は水温の影響を受けるので、低水温期では、硝化細菌を反応タンク内に保持するために必要な固形物滞留時間（ＳＲＴ）は長くなる。現在では、標準活性汚泥法として設計されている下水処理施設における硝化反応に対する水温と固形物滞留時間の関係から、完全に硝化を生じさせることができる水温ごとのＳＲＴの値を経験的に定量化し、その値による運転条件の管理が行われてきた。しかし、この方法はあくまでも経験式に基づくため、この式から導かれるＳＲＴの値によって全ての反応タンクで最良の硝化率が得られるわけではなかった。
しかしながら、本発明では迅速かつ簡便に反応タンク内の硝化細菌を測定し、測定データをもとに、良好な硝化率が維持できる量の硝化細菌が保持できるようにＳＲＴを調整することができ、個々の反応タンクごとに適した運転管理を行うことが可能となる。
また、硝化細菌数の測定には、既存の硝化細菌測定法である最確数法や蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、定量的ＰＣＲ法なども使用することができる。しかし、これらの方法は、測定期間が長かったり、熟練性や高価な機器、試薬が必要であったりすることから、施設内で容易に測定することはできなかった。
したがって、菌数を指標とする活性汚泥プロセスの運転管理方法は、本発明によりはじめて実現するものであり、既存の方法と比較してより効率的な方法であるといえる。
以上詳述したように、本発明は、ニトロスピラ属の細菌に特異的な抗体をラテックス粒子に吸着させた測定用抗体感作ラテックスに係るものであり、当該抗体感作ラテックスを用いることにより、従来、長期間を要し、技術的にも熟練が必要とされていた、ニトロスピラ属の細菌の検出・測定を容易にかつ簡便に行うことを可能とするものである。
また、本発明は、ニトロスピラ属の細菌に対する特異的な抗体を作製し、活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中のニトロスピラ属の細菌を同定し、その菌数を迅速かつ適正に測定することを可能にするものである。
また本発明は、下水処理施設の反応タンク中の硝化細菌数を迅速かつ簡便に測定し、これを指標として、活性汚泥プロセスの固形物滞留時間等の運転条件を制御することにより、活性汚泥プロセスの運転管理が容易となる。
Claims (2)
- 亜硝酸酸化活性を有するニトロスピラ属細菌に特異的な抗体を比重が略１．５ｇ／ｍｌで平均粒径が１．０〜１．５μｍのラテックス粒子に吸着させたことを特徴とするニトロスピラ属に属する細菌の測定用抗体感作ラテックス。
- 請求項１に記載の抗体感作ラテックスと被検試料とを混合し、予め定められた時間静置した後、個々のラテックス粒子同士が凝集したことを示す凝集像の発生の有無を確認することを特徴とする免疫学的測定法。
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