JP4255891B2 - タンパク質の結晶化方法 - Google Patents

Description

本発明は微量液体秤取構造を用いるタンパク質の結晶化方法に関する。さらに詳細には、本発明は各種サンプルを用いた分析や化学反応を行う際などに用いるのに好適な微量液体秤取構造及び該構造を基板内に有するマイクロチップを用いるタンパク質の結晶化方法に関する。

従来、電気泳動やクロマトグラフィーなどにより分析を行うための各種装置が知られており、こうした装置においては、使用するサンプルなどの液体を定量的に秤取することにより、正確な分析結果を得ることができるものである。

このため、こうした電気泳動やクロマトグラフィーなどに用いられる各種装置において、サンプルなどの液体を定量的に秤取するための手法が各種提案されている。例えば、特許文献１には、マイクロチップ電気泳動装置が記載されており、また、特許文献２には流体物質混合物の電気泳動分離のための装置及び方法が記載されている。しかし、これら従来技術のいずれの方法においても実際に分析に必要な量以上のサンプルが必要になってしまい、サンプルのデッドボリュームを減らすことができないという問題があった。

さらに、微量なサンプルなどの液体を用いた化学反応や分析においては、微小なチップにより構成されるマイクロチップが用いられることがある。こうしたマイクロチップを用いる場合にも、使用するサンプルなどの液体を定量的に秤取することにより、正確な結果が得られるものであるが、マイクロチップを用いた分析においては、取り扱うサンプルなどの液体の体積が極めて小さいために、液体を定量的に秤取することが難しく、そのための各種複雑な構成が必要となり、その構成を扱うための操作が煩雑になるという問題点があった。

一方，従来，タンパク質の結晶化の方法として，バッチ法，透析法，蒸気拡散法，ゲル法などが知られていた。しかし，これらの方法は，いずれも大量のタンパク質を必要とするという問題を有し，特に結晶化条件が未知のタンパク質の結晶化条件を探索する際には，膨大なタンパク質を必要とするという問題を有していた。

また，使用するタンパク質の量を減らすために，インクジェット（例えば、非特許文献１参照）あるいはエレクトロスプレー（例えば、特許文献３参照）などでタンパク質溶液を分注し，タンパク質の結晶化条件を探索する試みが知られていた。しかし，この方法では，液滴が空気中に露出しているため，液滴が蒸発し，乾固あるいは濃縮が起こるという問題を有していた。

さらに，マイクロチャネルデバイスを用いて，層流中で結晶を生成させる試み(例えば、特許文献４参照）あるいは温度制御を厳密に行って結晶を得る試み（例えば、非特許文献２参照）が知られていた。しかし，この方法では，反応場は微小で反応制御にも優れているが，タンパク質溶液の結晶化部位までの導入方法が，従来の手段と同様であり，デッドボリュームの割合が極めて大きいという問題を有していた。

特開平１０−１４８６２８号公報（図１及び図２参照） 特開平７−１９８６８０号公報（図１及び図２参照） 国際公開第ＷＯ０１／９２２９３号パンフレット 米国特許第６４０９８３２号明細書 「ジャーナル・オブ・アップライド・クリスタログラフィー」(Journal of Applied Crystallography )（２００２），３５，ｐ．２７８−２８１ 「アナリティカル・ケミストリー(Analytical Chemistry)」（２００２），７４，ｐ．３５０５−３５１０

従って、本発明の目的は、単純な構成により、簡単な操作のみで微量な液体を定量的に秤取することができるようにした微量液体秤取構造を用いるタンパク質の結晶化方法を提供することである。

また、本発明の別の目的は、定量的な液体の扱いが必要とされる各種装置において、サンプルのデッドボリュームを減らすことができるとともに、装置全体の省スペース化と低コスト化とを実現することができるようにした微量液体秤取構造を用いるタンパク質の結晶化方法を提供することである。

前記課題は本発明で用いる微量液体秤取構造により解決される。本発明で用いる微量液体秤取構造は、液体の表面張力に着目し、液体が流路に対して起こす毛細管現象（毛管斥力）を利用してなされたものである。

本発明で用いる微量液体秤取構造の第１の実施態様によれば、それぞれ所定の方向に延長される第１の流路ならびに第２の流路と、前記第１の流路の流路壁に開口する第３の流路と、前記第２の流路の流路壁に開口して前記第３の流路の一端と前記第２の流路を連結し、濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）性質を有し他の３本の流路より細い第４の流路を有し、前記第１の流路に導入された液体が、前記第１の流路の流路壁において開口する前記第３の流路の開口部を介して前記第３の流路内に引き込まれた後、前記第１の流路に残存する前記液体を取り除き、前記第３の流路の容積に応じた体積の液体を秤取することを特徴とする。

本発明で用いる微量液体秤取構造の第２の実施態様によれば、それぞれ所定の方向に延長される第１の流路ならびに第２の流路と、前記第１の流路の流路壁に開口する第３の流路と、前記第２の流路の流路壁に開口して前記第３の流路の一端と前記第２の流路を連結し、濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）性質を有し他の３本の流路より細い第４の流路とを有し、前記第１の流路に導入された液体が、前記第１の流路の流路壁において開口する前記第３の流路の開口部を介して前記第３の流路内に引き込まれた後、前記第１の流路に残存する前記液体を取り除き、前記第３の流路の容積に応じた体積の液体を秤取する系を少なくとも２つ有し、前記第１の流路または前記第２の流路を共有することを特徴とする。

本発明で用いる微量液体秤取構造の第３の実施態様によれば、前記第３の流路に前記第４の流路が２つ以上接続している、あるいは、前記第４の流路が２つ以上に分岐していることを特徴とする。

本発明で用いる微量液体秤取構造の第４の実施態様によれば、前記第３およびこれに接続する第４の流路が複数組形成されていることを特徴とする。

本発明で用いる微量液体秤取構造の第５の実施態様によれば、前記第４の流路の流路壁に開口し、前記第４の流路より細いか同じ太さで、濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）性質を有する流路壁からなる第５の流路を更に有することを特徴とする。

本発明で用いる微量液体秤取構造の第６の実施態様によれば、前記第２の流路は、該流路の一部に、該流路の通常の流路幅よりも狭い流路幅を有する狭隘流路部分を有し、該狭隘流路部分は通常の流路幅部分よりも濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）性質を有することを特徴とする。

本発明で用いる微量液体秤取構造の第７の実施態様によれば、前記第３の流路の容積に応じた体積で秤取された液体を、前記第４の流路を介して前記第２の流路に流出させる流出手段を更に有することを特徴とする。

本発明で用いる微量液体秤取構造の第８の実施態様によれば、前記第４の流路の開口部近傍の前記第２の流路が液体で満たされている場合に、前記第３の流路の容積に応じた体積で秤取された液体を、前記第４の流路を介して前記第２の流路に流出させる流出手段を更に有することを特徴とする。

本発明で用いる微量液体秤取構造の第９の実施態様によれば、前記第１の流路、前記第２の流路、前記第３の流路、前記第４の流路及び前記第５の流路はそれぞれ、基板上に形成されたチャネルであることを特徴とする。
本発明は、上記特徴を有する微量液体秤取構造又は該構造が形成されているチップを用いるタンパク質の結晶化方法である。

以上説明したように、本発明で用いる微量液体秤取構造は、単純な構成により、簡単な操作のみで微量な液体を定量的に秤取することができるようにした微量液体秤取構造である。更に、本発明で用いる微量液体秤取構造は、定量的な液体の扱いが必要とされる各種装置において、サンプルのデッドボリュームを減らすことができるとともに、装置全体の省スペース化と低コスト化とを実現することができるようにした微量液体秤取構造である。

即ち、本発明で用いる微量液体秤取構造は、マイクロチャネル内で、液体を微量かつ定量的に秤取できるため、観察や測定、混合、相変化、反応などを微量化できる。また、サンプルのデッドボリュームが小さく、特に第１の流路に第３の流路が複数接続している場合に、デッドボリュームが飛躍的に小さくできる。また、秤取された液体が外気と接触している面積が小さく、蒸発による乾固あるいは濃縮などが起こりにくいという利点もある。さらに、単純な構成により簡単な操作のみで液体を秤取し、かつその後も容易に液体操作が可能であるため、装置全体の省スペース化と低コストとを実現することができる。
上記した特長を有する微量液体秤取構造及びそれを備えたマイクロチップは、タンパク質の結晶化に特に好適に用いることができる。

以下、添付の図面を参照しながら、本発明で用いる微量液体秤取構造の実施の形態を詳細に説明する。

図１（ａ）、図１（ｂ）及び図１（ｃ）には、本発明で用いる微量液体秤取構造の原理を説明するための概念説明図が示されている。４本の流路Ａ（第１の流路）、流路Ｂ（第２の流路）、流路Ｃ（第３の流路）及び流路Ｄ（第４の流路）は、流路Ａ、流路Ｂの間に流路Ａの側から流路Ｂに向かって流路Ｃ、続いて流路Ｄが直列に橋渡しをするような構造を有する。流路Ａを介して流路Ｃに液体を導入する。濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）流路壁を有する流路Ｄは他の流路より細いために、導入するためにより大きな力を必要とするため、適当な圧力を液体に付与すれば、流路Ｃと流路Ｄの境界面ｃ２において、液体を停止させることができる（図１（ａ）および図１（ｂ）参照）。
本明細書において、「濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）性質」とは、液体が流路Ｃに引き込まれた時に、そのままの圧力では流路Ｄを通過する事が出来ず、液体が停止する流路の性質を意味する。

より詳細には、流路Ａに液体１００（図１における網掛け領域参照）を導入した場合、流路Ａの流路壁ａａにおいて開口する細い流路Ｃの開口部ｃ１を介して、液体１００を流路Ｃに導入することができる。流路Ａおよび流路Ｃが濡れやすい（又は毛管引力の働きやすい）性質の流路壁を有する場合は、流路Ａより流路Ｃを細くしておけば、液体１００はより強い毛管引力により流路Ａの流路壁ａａに開口する流路Ｃの開口部ｃ１を介して流路Ｃに自発的に引き込まれる。流路Ａおよび流路Ｃが濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）性質の流路壁を有する場合は、流路Ａの端面より液体１００に適当な圧力を付与することにより流路Ｃに液体１００を導入することができる（図１（ｂ）参照）。

この際、流路Ｄ（ｃ２とｄ１の間の流路区間）の流路Ｃ側の端面ｃ２まで到達した液体１００は、濡れにくい流路壁を有する流路Ｄの毛管斥力によってせき止められ、流路Ｄに入り込むことはない。流路Ｃが濡れにくい流路壁の場合にも、流路Ｃの毛管斥力よりも流路Ｄの毛管斥力の方が強いため、流路Ｄに液体１００が入り込むことはない（図１（ｂ）参照）。

続いて、流路Ａ内に残留する液体１００を、例えば、流路Ａの両端部に適当な圧力差を生起させてより低圧側に移動させるなどし、流路Ａ内の流路Ｃの開口部ｃ１と接触しない位置に移動させるか又は流路Ａ内から取り除く（図１（ｃ）参照）。この際、流路Ｃ内の液体１００は、通常、流路Ａ内に戻って入り込むようなことはない（図１（ｃ）参照）。その結果、流路Ｃ内の液体１００の両端面たる端面１００ａと端面１００ｂとが、流路Ｃの開口部ｃ１ならびに流路Ａに繋がる側の端面ｃ２に位置するようになり、流路Ｃのｃ１とｃ２の区間の容積に応じた体積の液体の秤取が可能となる（図１（ｃ）参照）。但し、液体の端面は、表面張力や接触角等の影響により開口部ｃ１又はｃ２の端面にほぼ一致する程度で形成され、開口部ｃ１又はｃ２の端面と正確に一致しないこともある。従って、流路Ｃのｃ１とｃ２の区間の容積に応じて秤取された液体の体積は、流路Ｃのｃ１とｃ２の区間の体積と正確に一致しないこともあり得る。

さらに、流路Ｃ内に秤取された液体は、流路Ａの圧力が流路Ｂの圧力より僅かに大きくなるように、両流路間に適当な圧力差を生起させるなどして、流路Ｄおよびその開口部ｄ１を介して、流路Ｂ内に導入することは容易である。その結果、この液体を空気圧によって移送するなどして、反応あるいは分析の目的で利用することも可能である。

本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第１の実施態様は、それぞれ所定の方向に延長される第１の流路（流路Ａ）ならびに第２の流路（流路Ｂ）と、上記第１の流路（流路Ａ）の流路壁に開口する第３の流路（流路Ｃ）と、上記第２の流路（流路Ｂ）の流路壁に開口して上記第３の流路（流路Ｃ）の一端と上記第２の流路（流路Ｂ）を連結し、濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）性質を有し、他の３本の流路より細い第４の流路（流路Ｄ）とを有し、上記第１の流路に導入された液体が、上記第１の流路の流路壁において開口する上記第３の流路の開口部を介して上記第３の流路内に引き込まれた後、上記第１の流路に残存する上記液体を取り除き、上記第３の流路の容積に応じた体積の液体を秤取するようにしたものである。

従って、本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第１の実施態様によれば、第１の流路から第３の流路内に液体を導入することにより、第３の流路の容積に応じた体積の液体を秤取することができるので、単純な構成により、簡単な操作のみで液体を定量的に秤取することができるとともに、サンプルのデッドボリュームの低減と装置全体の省スペース化と低コストとを実現することができる。

また、本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第２の実施態様は、それぞれ所定の方向に延長される第１の流路（流路Ａ）ならびに第２の流路（流路Ｂ）と、前記第１の流路（流路Ａ）の流路壁に開口する第３の流路（流路Ｃ）と、前記第２の流路（流路Ｂ）の流路壁に開口して前記第３の流路（流路Ｃ）の一端と前記第２の流路（流路Ｂ）を連結し濡れにくい（毛管引力が働かない）性質を有し他の３本の流路より細い第４の流路（流路Ｄ）とを有し、前記第１の流路に導入された液体が、前記第１の流路の流路壁において開口する前記第３の流路の開口部を介して前記第３の流路内に引き込まれた後、前記第１の流路に残存する前記液体を取り除き、前記第３の流路の容積に応じた体積の液体を秤取する系を少なくとも２つ有し、上記の少なくとも２つの系は互いに、上記第１の流路または上記第２の流路を共有するようにしたものである（図２（ａ）および図２（ｂ）参照）。

従って、本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第２の実施態様によれば、２つの系が互いに第１の流路または第２の流路を共有するので、例えば、第１の流路を共有する２つの系のそれぞれにおいて同一の種類の液体を複数定量的に秤取すると、当該２つの系でそれぞれ秤取した異なる種類の液体とそれぞれの系の第２流路で合一、合一による希釈、合一による反応、合一後の反応による分析等を行うことができる（図２（ａ）参照）。また、反対に、例えば、第２の流路を共有する２つの系のそれぞれにおいて異なる種類の液体を定量的に秤取すると、当該２つの系で共有する第２の流路において、作成した複数の種類の液体の合一、合一による希釈、合一による反応、合一後の反応による分析等を行うことができる（図２（ｂ）参照）。

また、本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第３の実施態様のように、第１の実施態様または第２の実施態様のいずれか１つの微量液体秤取構造において、上記第４の流路（流路Ｄ）が２つ以上の流路に別れている、あるいは、２つ以上に分岐していても良い（図３（ａ）参照）。こうすると、上記流路Ｄ内の流体の流速を、毛管斥力とは独立に調節することが可能になる。

また、本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第４の実施態様は、第１の実施態様、第２の実施態様または第３の実施態様のいずれか１つの微量液体秤取構造において、上記第３の流路（流路Ｃ）および上記第４の流路（流路Ｄ）が２組以上形成されているようにしたものである（図３（ｂ）参照）。こうすると、本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第４の実施態様によれば、複数組の上記第３の流路および第４の流路（例えば、図３（ｂ）の流路Ｃと流路Ｄ、流路Ｃ’と流路Ｄ’および流路Ｃ”と流路Ｄ”）によって、複数の異なる体積の液体を定量的かつ並列的に秤取することができる。

また、本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第５の実施態様は、第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様または第４の実施態様のいずれか１つの微量液体秤取構造において、上記第４の流路（流路Ｄ）の流路壁に開口し上記第４の流路より細いか同じ太さで濡れにくい（毛管引力が働かない）性質を有する流路壁からなる第５の流路（流路Ｅ）を更に有するようにしたものである（図４参照）。

図４に第５の実施態様の微量液体秤取構造の原理を説明するための概念説明図が示されている。図４（ａ）に示したように、５本の流路Ａ、流路Ｂ、流路Ｃ、流路Ｄおよび流路Ｅが、流路Ａ、流路Ｂの間に流路Ｃと流路Ｄが直列に連結して橋渡しをするような構造を有している。流路Ａから流路Ｃに液体を導入すると流路Ｄは濡れにくい（又は毛管引力の働かない）性質の流路壁を有するので、流路Ｃと流路Ｄの界面ｃ２で液体は停止し、流路Ｄに液体を導入するには、さらに大きな力が必要となる。

太い流路Ａに液体１００（図４における網掛け領域参照）を導入した場合、流路Ａの流路壁ａａにおいて開口する細い流路Ｃの開口部ｃ１を介して、液体１００は流路Ｃ内に引き込まれる（図４（ｂ）参照）。この現象は、上記流路Ｂ内の流路Ｄの開口部ｄ１近傍に液体が充填されていない場合には、第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様および第４の実施態様のいずれか１つの微量液体秤取構造と同様の構造であるが、予め、流路Ｂに液体２００（図４における灰色の領域）が導入されていた場合には、第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様および第４の実施態様のいずれか１つの微量液体秤取構造では、上記の液体１００の流路Ｃへの導入は不完全な形で生起し完結しない。これは、流路Ｃ内に残存する気体の逃げ道がないためである。

第５の実施態様によれば、流路Ｂに液体２００（図４における灰色の領域）が導入されていた場合には、流路Ｃへの液体１００の導入に伴い、それまで流路内部にあった気体は、流路Ｄの流路壁に開口部ｅ１を有する流路Ｅにパージされる（流路Ｅのｅ１とは反対側の端面は大気に開放されている）。（図４（ｂ）参照）。この場合にも、流路Ｃと流路Ｄの間の端面ｃ２まで到達した液体１００は、濡れにくい（又は毛管引力の働かない）流路壁を有する流路Ｄ（ｃ２とｄ１の間の流路区間）の毛管斥力によってせき止められ、流路Ｄに入り込むことはない（図４（ｂ）参照）。

続いて、流路Ａ内に残留する液体１００を、例えば、流路Ａの両端部に適当な圧力差を生起させてより低圧側に移動させるなどし、流路Ａ内から取り除く。その結果、流路Ｃ（ｃ１とｃ２の区間）の容積に応じた体積の液体の秤取が可能となる（図４（ｃ）参照）。

さらに、流路Ｃ内に形成された液体は、流路Ａの圧力が流路Ｂの圧力より僅かに大きくなるように両流路間に適当な圧力差を生起させるなどして、流路Ｄを介して、流路Ｂ内の液体２００の中に導入することが可能となる。この際、流路Ｅの端面ｅ１とは反対側の端面は閉じておく必要がある（図４（ｄ）参照）。

従って、本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第５の実施態様を用いれば、タンパク質の結晶化装置において、微量のサンプルや試薬の導入を定量的に行うための実際的な手法を提供することができる。

図５（ａ）及び（ｂ）は、第６の実施態様の微量液体秤取構造を示す平面図であり、（ｃ）は（ｂ）におけるｃ−ｃ線に沿った断面図である。図５（ａ）に示されるように、第２の流路（流路Ｂ）は、該流路の一部に、該流路の通常の流路幅よりも狭い流路幅を有する狭隘流路部分（流路ｂ１及び流路ｂ２）を有する。該狭隘流路部分は通常の流路幅部分よりも濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）性質を有する。第２の流路（流路Ｂ）自体及び狭隘流路部分（流路ｂ）はその一端が大気中に開放されているか、又は適当な圧力に調整されている。従って、第２の流路の一部を２つの狭隘流路部分で挟むことにより、第２の流路の一部に容積限定区画を形成することができる。この第２の流路の容積限定区画に、第４の流路（流路Ｄ）を介して第３の流路（流路Ｃ）を連通させることができる。例えば、一方の第３の流路（流路Ｃ）で秤取された第１の液体を第４の流路（流路Ｄ）を介して第２の流路の容積限定区画内に押し出すと、容積限定区画内の空気は狭隘流路部分を介して大気中に放出され、押し出された第１の液体は容積限定区画内に留まる。更に、他方の第３の流路（流路Ｃ’）で秤取された第２の液体を他方の第４の流路（流路Ｄ’）を介して第２の流路の容積限定区画内に押し出すと、容積限定区画内の残りの空気も狭隘流路部分を介して大気中に放出され、第１の液体及び第２の液体を容積限定区画内に充満させることができる。従って、２つの狭隘流路部分で挟まれた容積限定区画を反応チャンバとして利用することができ、使用する反応液の量を最小にすることができる。このため、第２の流路の容積限定区画の容積は、この限定区画内に供給される液体の総量を考慮して決定することができる。例えば、この限定区画内に連結される一つ以上の第３の流路の容積の和と大体同一であるか又はこれよりも若干大きい値に設定することが好ましい。

図５（ｂ）は、第２の流路の容積限定区画に一つの第３の流路が接続されている実施態様を示すものであり、第２の流路はその一部に２つの狭隘流路部分（流路ｂ１及び流路ｂ２）を有しその他の部分は通常の流路幅である。例えば、通常の流路幅の第２の流路から第１の液体を第１の狭隘流路部分（流路ｂ１）を介して容積限定区画に供給し、次いで、第３の流路（流路Ｃ）で秤取された第２の液体を第４の流路（流路Ｄ）を介して容積限定区画内に供給する。

従って、第２の流路は、必ずしも液体が移動する（流れる）流路のみを意味するものでなく、空気を移動させるための流路としても利用される。特に、第３の流路で秤取された液体を流出させうる、２つの狭隘流路部分で挟まれた容積限定区画が形成されていればよく、第２の流路の形状、なかんずく、容積限定区画の平面形状は図示された矩形状に限定されず、円形、楕円形、三角形など様々な形状をとることができる。

図５（ｃ１）に示されるように、第２の流路の狭隘流路部分（流路ｂ１及び流路ｂ２）を下側の基板１に形成し、第２の流路の通常幅部分を上側の基板３に形成することもできるし、或いは図５（ｃ２）に示されるように、第２の流路の狭隘流路部分（流路ｂ１及び流路ｂ２）及び第２の流路の通常幅部分の全てを上側の基板３に形成することもできる。

また、本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第７の実施態様は、第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様、第４の実施態様、第５の実施態様又は第６の実施態様のいずれか１つの微量液体秤取構造において、さらに、上記第３の流路（流路Ｃ）内に定量的に秤取された液体を、上記第４の流路（流路Ｄ）を介して上記第２の流路（流路Ｂ）の流路壁において開口する上記第４の流路（流路Ｄ）の開口部から上記第２の流路（流路Ｂ）に流出させる流出手段を有するようにしたものである。

具体的には、定量的に形成された第３の流路内の液体を、第２の流路に流出させるには、第１の流路の圧力が第２の流路の圧力より僅かに大きくなるように、両流路間に適当な圧力差を生起させるあるいは流出方向に遠心力を付与するなどすれば良い。圧力差を生起させる手段としては例えば、公知慣用の加圧機構又は減圧機構などが好適に使用される。

従って、本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第７の実施態様によれば、定量的に秤取された第３の流路内の液体を、第２の流路に流出させることができるため、タンパク質の結晶化装置において、微量のサンプルや試薬の導入を定量的に行うことが可能である。

また、本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第８の実施態様は、第７の実施態様の微量液体秤取構造において、さらに、上記第２の流路（流路Ｂ）が液体で満たされている場合に、上記第３の流路（流路Ｃ）内に定量的に秤取された液体を、上記第４の流路（流路Ｄ）を介して前記第２の流路の流路壁において開口する上記第３の流路の開口部から上記第２の流路に流出させる流出手段を有するようにしたものである。

具体的には、本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第８の実施態様により、第５の実施態様の微量液体秤取構造を用いて定量的に形成された第３の流路内の液体は、図４の流路Ｅのｅ１とは反対側の端面を閉じた状態で、第１の流路の圧力が第２の流路の圧力より僅かに大きくなるように、両流路間に適当な圧力差を生起させるあるいは流出方向に遠心力を付与するなどの操作を行うことにより、第２の流路に流出させることが可能である。

従って、本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第５の実施態様によれば、定量的に秤取された第３の流路内の液体を、第２の流路に流出させることができるため、タンパク質の結晶化装置において、微量のサンプルや試薬の導入を定量的に行うことが可能である。

また、本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第９の実施態様は、第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様、第４の実施態様、第５の実施態様、第６の実施態様、第７の実施態様又は第８の実施態様のいずれか１つにおいて、上記第１の流路（流路Ａ）、上記第２の流路（流路Ｂ）、上記第３の流路（流路Ｃ）、上記第４の流路（流路Ｄ）及び上記第５の流路（流路Ｅ）はそれぞれ、基板内に形成されたチャネルであるようにしたものである。

従って、本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第９の実施態様によれば、単純な構成により、簡単な操作のみで、微小体積の液体を定量的に秤取することができるとともに、より一層のサンプルのデッドボリュームの低減と装置全体の省スペース化と低コスト化とを実現することができる。

また、本発明で用いる微量液体秤取構造のうち第１０の実施態様は、第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様、第４の実施態様、第５の実施態様、第６の実施態様、第７の実施態様、第８の実施態様又は第９の実施態様のいずれか１つにおいて、上記第３の流路の容積はピコリットルからマイクロリットルオーダーの大きさに形成されているものである。

従って、本発明で用いる微量液体秤取構造によれば、単純な構成により、簡単な操作のみで、ピコリットルからマイクロリットルオーダーの様々な大きさの微小体積の液体を定量的に秤取することができる。

本発明で用いる微量液体秤取構造はチップ内に形成することができる。本発明で用いる微量液体秤取構造は同一のチップに同じ構造もしくは異なる構造の組合せで複数組形成されていてもよい。本発明で用いるチップにおいて、形成される各流路はマイクロチャネルであるものが好ましい。ここでマイクロチャネルとは、チャネル（流路）に液体を導入した時に、マイクロ効果が現れる、即ち液体に何らかの挙動変化が現れる断面形状を持つチャネルを意味する。マイクロ効果の発現は，液体の物性によっても異なるが、断面形状，即ちチャネルの主流方向に垂直な面の形状のうち、最も短い間隔（長方形なら短辺，楕円なら短径に相当する）の長さが通常５ｍｍ以下、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは２００μｍ以下が適当である。この長さの下限は特に限定されず、マイクロチャネルとしての機能を有する長さであればよい。

本発明において、チップとは、微量液体秤取構造を含む部分の部材を意味する。またマイクロチップとは、上記マイクロチャネルよりなる微量液体秤取構造を備えるチップを意味する。チップの大きさ、形状は特に限定されず、用途に応じて任意に設定することができる。

本発明において、チップは、タンパク質結晶化に用いるものである。本発明におけるチップは、用途上、使い捨てあるいは制限された回数のみの使用で交換されることが望ましいが、恒久的に使用しても構わない。この場合、分注機あるいは測定器などの機器と一体の場合も考えられるが、その場合も流路構造を含む部分の部材をチップという。
本発明におけるチップの材料は、上記流路構造を実現できる限り、その種類を問わない。材料としては、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ガラス、シリコン、光反応性樹脂やその他の樹脂、金属、セラミックおよびそれらの組み合わせなどが挙げられる。

本発明で用いる微量液体秤取構造の作成法は、上記微量液体秤取構造を実現できる限り如何なる方法であってもよい。例えば機械加工、射出成型や圧縮成型に代表される転写技術、ドライエッチング（ＲＩＥ、ＩＥ、ＩＢＥ、プラズマエッチング、レーザーエッチング、レーザーアブレーション、ブラスト加工、放電加工、ＬＩＧＡ、電子ビームエッチング、ＦＡＢ）、ウエットエッチング（化学浸食）、光造形やセラミックス敷詰等の一体成型、各種物質を層状にコート、蒸着、スパッタリング、堆積し、部分的に除去することにより微細構造物を形成するSurface Micro-machining、１枚以上のシート状物質（フィルム、テープ等）により開口部分を形成して溝を形成する方法、インクジェットやディスペンサーにより流路構成材料を滴下、注入して形成させる方法を含む。

本発明で用いるチップを作成するために、上記方法においてマスクを利用してもよい。マスクは、本発明のチップを最終的に作成できる限りにおいてどのようなデザインでもよいし、複数でも構わない。マスクは、通常は流路を平面に射影した形状で設計されるが、貼り合わせる流路構成材の両側に加工を行う場合や、複数の部材を用いて流路を形成する場合などは、複数のマスクを用いたり、一部はマスクを用いずに直接加工することができるため、マスクは必ずしも最終的な流路の形状の射影であるとは限らない。光硬化性樹脂などに用いる電磁波遮蔽用のマスクとしては、水晶あるいはガラスにクロムをコートしたもの、あるいは樹脂のフィルムにレーザーの焼き付けを行ったものなどが挙げられる。

上記マスクは、例えば、コンピュータを用い、適当なソフトウエアにより、上記流路構造の少なくとも一部を描画し、透明な樹脂フィルムに印刷することにより作成することもできる。上記ソフトウエアにより描画された、上記流路構造の少なくとも一部の電子情報が格納された上記マスクまたはマスターチップを作成するために用いるコンピュータ読み取り可能な記録媒体も本発明に含まれる。ここで適当な記録媒体としては、例えば、フロッピーディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体；ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ等の光ディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。

本発明で用いるチップを作成するにあたり、上記方法によって直接チップを製作しても構わないし、これを型としてチップ整形しても構わない。当然、さらにこれを型にしてチップを整形することも可能である。本発明においては、初めに作成された型から、実際に操作に用いるチップの手前までの各段階の型を「マスターチップ」と呼ぶことがある。マスターチップは、通常は実際のチップと同じ凹凸パターンを持つもの（ポジ）を作成し、これを２回転写するか、実際のチップと逆の凹凸パターンを持つもの（ネガ）を作成し、１回転写して用いられるが、本発明におけるマスターチップは、必ずしもこれに限定されるものではない。

本発明で用いるチップは、２つ以上の材料の貼り合わせによって加工できる。貼り合わせ法としては、接着剤による接着、プライマーによる樹脂接合、拡散接合、陽極接合、共晶接合、熱融着、超音波接合、レーザー溶融、溶剤・溶解溶媒による貼り合わせ、粘着テープ、接着テープ、圧着、自己吸着剤による結合、物理的な保持、凹凸による組み合わせが挙げられる。
また、貼り合わせを必要とせず、上記流体分岐部分と独立流路を一体に形成させる方法も可能である。具体的には、光造形法などの一体成型により閉空間を含む構造を形成することが可能である。
かくして作成されるチップの一辺の長さ、形状、厚みに制限はなく、例えば一辺５ｍｍ〜１００ｍｍの任意の値に設定することができる。

なお、マスクおよびマスターチップを用い、基板を貼り合わせて、マイクロチップを作製する場合、チップ内のマイクロチャネルの深さは、例えば２枚の基板で作成する場合には、チャネルが上側の基板の下面と、下側の基板の上面のどちらに存在するかによって、部分的に任意の２種類の値のどちらかに設定することができ、その深さは特に限定されないが、好ましくは１〜２００μｍ程度の任意の値に設定することができる。ここで「チャネルの深さ」とは、チャネルの鋳型となる凸構造の流路を有するチップ、即ちマスターチップの凸部の高さに相当する。また、基板は２枚に限定されるものでなく、必要に応じて任意の複数枚を積層してチップを作成することもできる。

本発明のタンパク質の結晶化方法は、上記微量液体秤取構造又は該構造が形成されているチップを用いることを特徴とする方法である。
本発明のうち、請求項１に記載の発明は、
（ａ）上記流路構造の上記第１の流路にタンパク質溶液もしくは沈殿剤溶液を導入し、前記第１の流路に開口する第３の流路の開口部を介して前記第３の流路に前記タンパク質溶液もしくは沈殿剤溶液が引き込まれた後、前記第１の流路に残存する前記タンパク質溶液もしくは沈殿剤溶液を、前記第３の流路の開口部と接触しない位置まで移動させ、前記第３の流路の容積に応じた体積で作成されたタンパク質溶液もしくは沈殿剤溶液を第４の流路を介して前記第２の流路に流出させる工程と、
（ｂ）第１の流路に沈殿剤溶液もしくはタンパク質溶液を導入し、前記第１の流路に開口する第３の流路の開口部を介して前記第３の流路に前記沈殿剤溶液もしくはタンパク質溶液が引き込まれた後、前記第１の流路に残存する前記沈殿剤溶液もしくはタンパク質溶液を、前記第３の流路の開口部と接触しない位置まで移動させ、前記第３の流路の容積に応じた体積で作成された沈殿剤溶液もしくはタンパク質溶液を第４の流路を介して前記第２の流路に流出させ、タンパク質溶液と沈殿剤溶液とを第２の流路中で接触・合一させる工程と、
（ｃ）第２の流路中で合一させたタンパク質および沈殿剤溶液中からのタンパク質結晶を析出させる工程を含むことを特徴とするタンパク質の結晶化方法である。
また、本発明のうち請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の発明において、合一させたタンパク質および沈殿剤溶液中からのタンパク質結晶の析出が、該溶液と離れた流路構造中に沈殿剤溶液が配置されている状態で行われることを特徴とする方法である。この発明において、沈殿剤溶液の配置は、例えば、予め適当な流路、例えば第２の流路に導入して配置しておいてもよいし、タンパク質溶液と沈殿剤溶液とを接触・合一させた後に、沈殿剤溶液を第１の流路に導入し、第３の流路に引き込まれた状態で配置してもよい。

これらの発明において、タンパク質溶液と沈殿剤溶液の第２の流路への導入は、どちらを先に行ってもよいし、別に形成された２組の流路構造を用いて同時に第２の流路へ導入してもよい。

また、本発明のうち請求項３に記載の発明は、
（ａ）上記微量液体秤取構造の上記第１の流路にタンパク質溶液を導入し、前記第１の流路に開口する第３の流路の開口部を介して前記第３の流路に前記タンパク質溶液が引き込まれた後、前記第１の流路に残存する前記タンパク質溶液を、前記第３の流路の開口部と接触しない位置まで移動させ、前記第３の流路の容積に応じた体積でタンパク質溶液を作成する工程と、
（ｂ）第１の流路に沈殿剤溶液を導入し、タンパク質溶液と沈殿剤溶液とを第３の流路の開口部において接触させ、タンパク質溶液と沈殿剤溶液とを合一させる工程と、
（ｃ）合一させたタンパク質および沈殿剤溶液中からのタンパク質結晶を析出させる工程を含むことを特徴とするタンパク質の結晶化方法である。
この方法においては、第１および／または第３の流路内でタンパク質結晶の析出が起こるので、必要に応じて合一させた溶液を適当な時間静置後、結晶析出の有無を確認する。

結晶析出の確認手段は、それ自体既知の適当な検出手段、例えば目視、顕微鏡観察などにより行えばよい。また、析出したタンパク質結晶は、それ自体既知の適当な方法、例えば適当な液体を導入して流出させる等して、採取することもできる。

ここで、本発明のタンパク質結晶化方法に用いるタンパク質溶液の物性は、本発明の微量液体秤取構造で用いることができるものであれば特に限定されない。具体的には、例えば溶媒としては水、塩の溶液、バッファ溶液、アルコールあるいはグリセロールとその溶液、合成あるいは天然高分子溶液などが挙げられる。

用いられる沈殿剤溶液とは、タンパク質の結晶形成を促す溶液を意味するこの溶液の物性は、上記と同様に本発明の微量液体秤取構造で用いることができるものであれば特に限定されない。具体的には、例えば水、塩の溶液、バッファ溶液、アルコールあるいはグリセロールとその溶液、合成あるいは天然高分子溶液などである。また、結晶形成を促す物質として、タンパク質や高分子のゲル、多孔質シリコン（Chayenら、Journal of Molecular Biology, (2001) 312, 591-595参照）などが知られているが、それらを含んでもよい。

また、本発明の方法において、封止や蒸気圧の調整が必要な時は、溶液と接する気相の体積が小さい方が好ましい。この場合、例えば第２の流路が２つの狭隘流路部分により挟まれることにより形成された容積限定区画を有する微量液体秤取構造（図５参照）を有するマイクロチップを用いることが好ましい。

タンパク質の結晶化を行うための方法として、例えば、バッチ法、蒸気拡散法、界面接触法、ゲル法などが知られている。ここで、本発明の流路構造を有するマイクロチップ内でバッチ法により結晶化を行うためには、例えば、上記請求項１〜３のいずれかに記載の方法の通り、タンパク質溶液と沈殿剤溶液とを接触・合一させ、必要に応じ上記方法で流路を封止すればよい。

蒸気拡散法を行うためには、例えば、上記請求項１または２に記載の方法の通り、タンパク質溶液と沈殿剤溶液とを第2の流路内で接触・合一させた後、上記の通り、必要に応じて蒸気圧を調整する液体を第１の流路に導入し、接触・合一させた液体と第３および／または第４の流路を隔てて蒸気拡散を調節すればよい。ただし、蒸気拡散法においては、接触・合一させた液体と蒸気圧を調整する液体（沈殿剤）が、気相を隔てて配置されていればよく、液体の配置は必ずしも前述の形である必要はない。第１の流路の途中まであるいは端部に蒸気圧を調整する液体を導入して、第１、第３および第４の流路を隔てて蒸気圧を調整してもよいし、第２の流路の途中まで、あるいは端部に蒸気圧を調整する液体を導入して、第２の流路を隔てて蒸気圧を調整してもよい。

以下、参考例及び実施例により本発明の微量液体秤取構造、該構造を有するマイクロチップを使用したタンパク質の結晶化について具体的に例証する。
参考例１ イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質の分離
図６（ａ）には、本発明で用いる微量液体秤取構造を備えたマイクロチップ１０が示されている。図６（ａ）に示したマイクロチップ１０は、タンパク質の分析に用いるキャピラリーイオン交換クロマトグラフィーのためのマイクロチップであり、サンプルのインジェクション部分に本発明で用いる微量液体秤取構造が備えられている。

図６（ａ）において、ポート１１とポート１２はタンパク質の溶離バッファーを導入するためのポートであり、イオン強度の異なるバッファーを導入し、流量をそれぞれ変化させ、ミキサー１３においてイオン強度の異なるバッファーを混合することにより、イオン強度の勾配を形成することができる。従って、ポート１１とポート１２の上面は大気に対して開口しており、下部はチャネルに連通している。

また、マイクロチャネル１４は、クロマトグラフィーのためのカラムであり、イオン交換ビーズ（イオン交換ビーズとしては、例えばファルマシア社製アニオン交換ビーズ：粒径３０μｍなどを用いることができる）の堰き止め部１５から、微量液体秤取構造部（ｂ）方向に向かって３ｍｍの区間に、イオン交換ビーズが充填されている。堰き止め部１５の反対方向にはポート１８が存在する。

微量液体秤取構造部（ｂ）を拡大したものが図６（ｂ）である。ここで示したマイクロチップ１０は、高分子（ポリマー）材料、例えばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）により形成された２枚の平板状の基板（上側：基板１６、下側：基板１７）を重ね、結合させることによって構成されており、一辺が２０ｍｍの正方形で、厚みは５ｍｍであるが、マイクロチップの一辺の長さ、形状、厚みに制限はなく、例えば一辺５ｍｍ〜１００ｍｍの任意の値に設定することができる。

また、上側の基板１６の下面と下側の基板１７の上面には、それぞれ深さの違うマイクロチャネルが形成されている。基板１６の下面に存在するマイクロチャネルは深さ１００μｍ、基板１７の上面に存在するマイクロチャネルは深さ１０μｍである。更に、ＰＤＭＳの特徴として、硬化した表面は疎水性を示す。また、この表面をＯ_２プラズマや、エキシマＵＶレーザなどで照射処理することにより、容易にＰＤＭＳとＰＤＭＳ、ＰＤＭＳとガラスなどを接着することが可能である。上記二点から、この微量液体秤取構造の製作にＰＤＭＳが適している。

なお、マイクロチップ１０内のマイクロチャネルの深さは、上側の基板１６の下面と、下側の基板１７の上面のどちらに存在するかによって、部分的に任意の２種類の値のどちらかに設定することができ、その深さは１〜２００μｍの任意の値に設定することができる。

図６（ｂ）及び図６（ｃ１）に示されるように、微量液体秤取構造部(ｂ）におけるマイクロチャネルの構造は、上側の基板１６の下面において、互いに並行して左右方向に延長される第１の流路１９および第２の流路２０と、第１の流路１９から第２の流路方向に垂直に向かう第３の流路２１、及びに下側の基板１７の上面において第２の流路２０と第３の流路２１を連結する第４の流路２２、第４の流路２２の途中から派生し第４の流路２２と直行する第５の流路２３によって形成されている。浅く、幅の狭い流路を下側の基板１７の上面に配設する場合、上側の基板１６の下面に配設される深く、幅の広い流路と部分的に重複させることにより、各流路を相互に連通させることができる。別法として、図６（ｃ２）に示されるように、全ての流路を上側の基板１６（又は下側の基板１７）に配設する場合、各流路に重複部を設ける必要は無い。基板として使用される合成樹脂材料を適宜選択することにより及び／又は基板内に配設される特定の流路の表面や必要な箇所の一部又は全部を濡れ易くしたりあるいは濡れ難くしたりすることにより、図６（ｃ２）のように、全ての流路を一方の基板にだけ設けることもできる。

第１の流路１９及び第２の流路２０の幅は２００μｍ、第３の流路２１の幅は１００μｍ、第４の流路２２の幅及び、第５の流路２３において第４の流路２２と接する部分の幅は２０μｍである。なお、第４の流路２２内に液体が入りにくくするために、第４の流路２２は第１の流路１９、第２の流路２０、第３の流路２１よりも細くなる必要があり、また第５の流路２３内にも液体が入りにくくするために、第５の流路２３の幅は第４の流路２２の幅と同等またはそれ以下になる必要がある。

次に、上記したマイクロチップ１０は以下に示す製造プロセスによって作製するものであるが、その製造プロセスに先だって、まずマイクロチップ１０における上側の基板１６と下側の基板１７が有するマイクロの流路のレイアウトのパターンをそれぞれ別々に、フォトリソグラフィーのマスクとして利用するために、高解像度（例えば４０６４ｄｐｉ）で透明フィルムに印刷しておくものである。

はじめに、シリコン（Ｓｉ）ウエハを、作製するマイクロチップの大きさに合わせてダイヤモンドカッターでカットし、超音波洗浄後、乾燥させ、プラズマリアクターを用いてＯ_２プラズマ処理を２００Ｗ、３０秒間行う。

次にネガティブフォトレジストＳＵ−８をスピン塗布し（１００μｍの流路を作製する場合にはＳＵ−８ ５０を用い２０００ｒｐｍで１０秒、１０μｍの流路を作製する場合にはＳＵ−８を用い２０００ｒｐｍで１０秒）、その後オーブンで９０℃で３０分間保持する。

次に、マスクアライナーを用いて、フィルム上に印刷したマイクロチップ１０における上側の基板１６と下側の基板１７でのマイクロチャネルのレイアウトのパターンを、ＳＵ−８を塗布した別々のシリコンウエハにフォトリソグラフィーの手法を用いて転写し、さらにオーブンで９０℃で３０分間保持した後、Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒとしては、例えば、１−メトキシ−２−プロピルアセテートなどを用いることができる。）の中に浸して現像し、イソプロピルアルコール、続いて蒸留水で洗浄し、乾燥させる。

こうして作製されたマスターは、上側の基板１６及び下側の基板１７のマイクロチャネルの鋳型となる凸型構造を有するものである。

次に、型取り後のＰＤＭＳレプリカの取り外しがスムーズになるように、ＰＤＭＳのプレポリマーを注ぎ入れる前に、３％ジメチルオクタデシルクロロシラン／トルエン溶液中で２時間保持し、表面処理を行う。

次に、ＰＤＭＳのプレポリマーとキュアリング試薬（キュアリング試薬としては、例えば「Ｓｙｌｇａｒｄ １８４：Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏ．、ＭＩ」を用いることができる。）を１０：１の割合で混合し、充分に撹拌した後、マスターを設置するためにアクリルを用いて作製した枠の中に注ぎ、９０℃で３０分間保持してキュアリングを行う。

上記キュアリングの後に、ＰＤＭＳレプリカをマスターから引き剥がすことにより、マイクロチップ１０の上側の基板１６と下側の基板１７がそれぞれ得られる。さらに、上側の基板１６の下面と下側の基板１７の上面をＯ_２プラズマで処理し、結合させることにより、マイクロチップ１０を得る。

上記の方法を用いて得られたマイクロチップ１０を用いて、以下に実際に行うサンプルインジェクションの為の微量液体秤取操作について説明する。

まず、第１の流路１９の片側から圧力流によってサンプルを流すことにより、サンプルを第１の流路１９及び第３の流路２１に満たす。この時、第４の流路２２は、濡れ難い又は相対的に毛管引力が働きにくい性質を有し、かつ第１の流路１９、第２の流路２０、第３の流路２１よりも細いため親水性の液体では濡れにくいので、サンプルは第４の流路２２には入らない。

第２の流路２０に液体が充填されている状態では、第５の流路２３が存在しないと、第３の流路２１内へのサンプルの導入の際に第３の流路２１内の空気が第２の流路２０内へリークしてしまう。

しかしながら、第５の流路２３が存在することにより、第２の流路２０に液体が充填されている場合でも、第３の流路２１内の空気が第５の流路２３へと抜けて行くため、第２の流路２０に空気がリークすることなく、第３の流路２１にサンプルを導入することができる。

次に、引き続いて第１の流路１９に空気を圧力流によって導入することにより、第１の流路内のサンプルは押し出され、第３の流路２１内にのみサンプルが残り、第３の流路２１内に残ったサンプルは再び第１の流路１９内に逆流することはない。ここに示したチップの例では、第３の流路２１内に残るサンプル量は５ｎｌになるよう設計されている。

引き続いて第１の流路１９内の圧力を増大させることにより、第３の流路２１内のサンプルは第４の流路２２にリークし、サンプルが第２の流路２０に到達することにより第２の流路２０へサンプルが導入される。この時、第５の流路２３の出口側は閉じられているため、サンプルが第５の流路２３にリークすることはない。

サンプルが第５の流路２３にリークする可能性を低くするためには、第５の流路２３の流路幅は第４の流路２２の流路幅以下であることが望ましく、ここでは両者とも２０μｍに設定してある。

なお、クロマトグラフィーで分離するためのサンプル（タンパク質など）のＰＤＭＳへの吸着を防ぐために、ＨＣｌを用いて、第１の流路１９、第２の流路２０、第３の流路２１のみを親水化する処理を行っている。ただし、親水化処理はＨＣｌに限らず、Ｏ_２プラズマを用いる方法や、アルブミンを用いる方法などでも可能である。ＰＤＭＳ自体は疎水性の物質である。

実際に、上記の微量液体制御操作によるサンプルインジェクションを用いたクロマトグラフィーにおいて、ＦＩＴＣラベルしたアルブミンとＩｇＧの混合液を導入し、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ８．０）を流速１．０μｌ／ｍｉｎで流し、陰イオン交換ビーズ（ファルマシア製：粒子径３０μｍ）を用い、吸着後、塩化ナトリウムによる０〜１Ｍのグラジエントバッファーを使用して、両者を１分以内で分離することに成功した。

上記参考例１では、この微量液体秤取構造をシリコンポリマーのＰＤＭＳで作製したが、流路内表面及び／又は端面の一部又は全部を濡れ易くしたりあるいは濡れ難くしたりすることにより、流路内の濡れ具合が調節でき、構造が製作できれば、あらゆる材質（例えば、シリコン、ポリマー、ガラス、セラミックス、金属など）に適応できる構造である。また、これらの異なる材質同士の複合的な使用や、温度、ｐＨ応答性物質ＰＩＰＡＡｍ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）などを混合させた材料によってもこの微量液体秤取構造は利用可能である。

参考例２ 酵素反応によるグルコースの定量
図７（ａ）は、本発明で用いる微量液体秤取構造の別の参考例によるマイクロチップ２４の平面図である。図７（ａ）に示されるマイクロチップ２４は、定量的に秤取した２液の混合により最大５０種類の反応又は分析を個別的に行うことのできるマイクロチップであり、液体の秤取部分には本発明で用いる微量液体秤取構造が採用されている。図７（ａ）に示されたマイクロチップ２４は最大５０種類の反応又は分析を処理するが、これよりも多数の反応又は分析を処理するマイクロチップも当然作製することができる。

図７（ａ）に示されるようなマイクロチップ２４を用いることにより、極めて簡便な操作により、例えば、５０種類のサンプルに対して、１種類の試薬の混合による反応又は分析を個別的に、かつ、同時に行うことができる。あるいは、１種類のサンプルに対して、例えば、５０種類の試薬の混合による反応又は分析を個別的に、かつ、同時に行うことも出来る。

図７（ａ）に示されるようなマイクロチップ２４は、図５に示されるマイクロチップ１０と同様に、高分子（ポリマー）材料、例えば、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）により形成された２枚の平板状の基板を重ね合わせ、結合させることにより構成されており、直径が９０ｍｍの円盤状であり、厚さは３ｍｍである。これ以外の直径及び厚みも当然使用できる。マイクロチップ２４の形状は図示された円盤状に限定されない。矩形又は多角形状の基板を用いて形成することもできる。

図７（ａ）に示されるマイクロチップ２４において、上側の基板２５の下面と、下側の基板２６の上面には、それぞれ深さの異なるマイクロチャネルが形成されており、基板２５の下面に存在するマイクロチャネルの深さは例えば、１００μｍであり、基板２６の上面に存在するマイクロチャネルの深さは例えば、１０μｍである。これら以外の深さも当然使用できる。

図７（ａ）におけるマイクロチップ２４の部分（ｂ）を拡大したものが図７（ｂ）であり、図７（ｂ）の部分（ｃ）を拡大したものが図７（ｃ）である。

図７（ｂ）において、中央の略環状をした第１液体供給チャネル３３はその途中の一箇所で切断されており、一方の切断端は半径方向外方に向かって延びるチャネル２７を介してポート２８に接続かつ連通されており、他方の切断端は半径方向外方に向かって延びるチャネル２９介してポート３０に接続かつ連通されている。ポート２８は混合する第１の液体の入口であり、ポート３０はその液体の出口である。ポート２８から導入された液体はチャネル２７を介して第１液体供給チャネル３３に入り、この第１液体供給チャネル３３内を流れ、チャネル２９を介してポート３０から流出する。別法として、ポート２８を出口とし、ポート３０を入口とすることもできる。

また、図７（ｂ）におけるポート３１ａは混合する第２の液体の入口であり、第２液体供給チャネル３５を介して出口ポート３１ｂに連通している。入口ポート３１ａと出口ポート３１ｂが第２液体供給チャネル３５を介して連通していることにより、入口ポート３１ａから注入された液体を空気圧などの適宜の手段により第２液体供給チャネル３５内に容易に満たすことができる。ポート３１ａ及びポート３１ｂに隣接して、混合チャネル３４を介してポート３２ａ及びポート３２ｂがそれぞれ配設されている。混合チャネル３４は混合された両液体の反応チャンバとしての機能も果たす。ポート３２ａ及びポート３２ｂは混合チャネル３４を介して相互に連通しているので、ポート３２ａ及び／又はポート３２ｂを介して混合チャネル３４に空気圧を印加してチャネル内の液体の混合を促進させたり、あるいは混合チャネル３４内の反応生成物を外部に取り出すために使用したりすることができる。

第１液体供給チャネル３３を挟んで、半径方向外側にはポート３１ａ、３１ｂと第２液体供給チャネル３５及びポート３２ａ、３２ｂと混合チャネル３４からなる微量液体秤取及び混合のための構造が３０個配置されている。一方、半径方向内側には同様な微量液体秤取及び混合のための構造が２０個配置されている。配置個数は図示された実施態様に限定されない。

図７（ｃ）に示された構造は、図２（ｂ）に示された構造と類似の目的で形成されたものであり、微量の液体を秤取するためのマイクロチャネル構造と、２種類の液体を混合するためのチャネルから構成されている。反応チャンバとして機能する混合チャネル３４（図２（ｂ）における流路Ｂに相当する）を間に挟んで、一方の液体を供給する第１液体供給チャネル３３（図２（ｂ）における流路Ａに相当する）と他方の液体を供給する第２液体供給チャネル３５（図２（ｂ）における流路Ａ’に相当する）が設けられている。第１液体供給チャネル３３から供給される一方の液体は、第１秤取チャネル３６（図２（ｂ）における流路Ｃに相当する）により一定量だけ秤取される。同様に、第２液体供給チャネル３５から供給される他方の液体は第２秤取チャネル３７（図２（ｂ）における流路Ｃ’に相当する）により一定量だけ秤取される。第１秤取チャネル３６及び第２秤取チャネル３７内の液体は、これらのチャネルよりも細い第１狭隘チャネル３８及び第２狭隘チャネル３９をそれぞれ介して、圧力差などの常用の手段を用いて混合チャネル３４内に取り入れ、該チャネル内で混合することができる。

図７において、一方の液体を供給する第１液体供給チャネル３３、他方の液体を供給する第２液体供給チャネル３５及び混合チャネル３４のチャネル幅は例えば、２００μｍであり、第１秤取チャネル３６及び第２秤取チャネル３７のチャネル幅はそれぞれ例えば、１００μｍで、長さは例えば、６００μｍであり、第１狭隘チャネル３８及び第２狭隘チャネル３９のチャネル幅はそれぞれ例えば、２０μｍである。これら以外のチャネル幅及びチャネル長さも当然使用できる。例えば、図７（ｃ）において、混合する２液の体積はそれぞれ６ｎｌであるが、この体積は第１秤取チャネル３６及び第２秤取チャネル３７の体積と等しい。従って、これら各秤取チャネルの体積を変更することにより、１ｐｌから１μｌの範囲内で任意に調節可能である。

図７のマイクロチップ２４は、図６に示されたマイクロチップ１０と同様な製造プロセスにより作製することができる。

図７に示されたマイクロチップ２４は例えば、グルコースオキシダーゼ・ペルオキシダーゼ法によるグルコースの定量分析のための微量液体秤取及び混合操作に使用できる。

このグルコースオキシダーゼ・ペルオキシダーゼ法によるグルコースの定量分析のための微量液体秤取及び混合操作について以下説明する。グルコースオキシダーゼ・ペルオキシダーゼ法では、試薬として、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ムタロターゼ、４−アミノアンチピリン及びフェノールを適量混合したリン酸緩衝液を用い、サンプルとしてはグルコース水溶液を使用する。

先ず、図７（ａ）におけるポート２８からポート３０に向けて、試薬約１μｌを圧力流によって導入し、続いて余分な試薬を流すために、空気を導入する。導入された試薬及び空気は第１液体供給チャネル３３内を時計方向に流れていく。図７（ｃ）において、試薬を第１秤取チャネル３６に導入する際、第１狭隘チャネル３８は疎水性であり、液体に対して濡れ難くなっており、かつ、第１液体供給チャネル３３及び第１秤取チャネル３６よりもチャネル幅が細いため、試薬は第１秤取チャネル３６内に留まり、第１狭隘チャネル３８内には進入しない。

この操作により第１秤取チャネル３６内に、第１秤取チャネル３６の体積と等しい体積の試薬液体を秤取することができる。また、ポート２８からポート３０に向けた試薬導入と、これに引き続く空気導入という操作を１回行うだけで、５０個の第１秤取チャネル３６内に所定量の試薬液体を一度に秤取することが可能である。このような極めて簡便な操作により、微量の液体を更に細かく分配し、極めて微量の多数の液体を同時に形成することが可能になる。また、このような操作においては、操作後に分配されない残液の量も極めて微量になることが期待される。

続いて、試薬の導入と同様に、ポート３１ａからポート３１ｂに向けてサンプルを導入し、第２液体供給チャネル３５を介して第２秤取チャネル３７内に所定量のサンプル液体を秤取することができる。

次に、引き続いて、第１液体供給チャネル３３及び第２液体供給チャネル３５内の空気の圧力を高めることにより、第１秤取チャネル３６内の試薬及び第２秤取チャネル３７内のサンプルはそれぞれ混合チャネル３４内に押し出され、該チャネル内で混合される。混合された二つの溶液は化学反応により赤色を呈するため、この赤色値を評価することによりグルコースの定量的な分析を行うことができる。言うまでもなく、図７に示されたマイクロチップ２４は前記以外の定性及び／又は定量分析に使用することもできる。

実施例１ グルコースイソメラーゼの結晶化（液体同士の合一）
図８（ａ）に示されたマイクロチップ４１を用いてタンパク質（グルコースイソメラーゼ）の結晶化を行った。用いたマイクロチップ４１の微量液体秤取構造構造部分（ｂ）を拡大したものが図８（ｂ）である。このマイクロチップ４１は図７（ａ）に示されたマイクロチップ２４と、形状及び微量液体秤取構造の配設個数を除けば、基本的に概ね同一である。

図８（ａ）に示したマイクロチップ４１は、タンパク質の結晶化のためのマイクロチップであり、溶液（タンパク質溶液および沈殿剤溶液）のインジェクション部分に本発明で用いる微量液体秤取構造が備えられている。材料としてＰＤＭＳを用い、参考例１に準じた方法で作成した。チップの大きさは２４ｘ４６ｍｍ、厚みは６０μｍである。第１液体供給チャネル３３及び第２液体供給チャネル３５の幅はそれぞれ２００μｍであり、混合チャネル３４の幅は３００μｍである。第１秤取チャネル３６及び第２秤取チャネル３７の幅はそれぞれ１００μｍであり、長さは各１０００μｍである。第１狭隘チャネル３８及び第２狭隘チャネル３９の幅はそれぞれ２０μｍであり、長さは各４００μｍである。

図８（ａ）において、ポート２８及び３０はタンパク質溶液を導入するためのポートであり、ポート３１ａ及び３１ｂは沈殿剤溶液を導入するためのポートである。
このマイクロチップに形成されている微量液体秤取構造において、第１液体供給チャネル（第１の流路）３３には第１の液体（タンパク質溶液）を秤取するための第１秤取チャネル（第３の流路）３６が7つ接続され、その7箇所それぞれに、第１狭隘チャネル（第４の流路）３８が接続され、該第１狭隘チャネル３８は混合チャネル（第２の流路）３４に開口している。７箇所それぞれに形成されている混合チャネル（第２の流路）３４には、第２の液体（沈殿剤溶液）を秤取するための、第２液体供給チャネル３５、第２秤取チャネル３７及び第２狭隘チャネル３９よりなる流路構造が接続されている。

まず、第１の液体（タンパク質溶液）を秤取するため、ポート２８から第１液体供給チャネル３３に、陽圧を用いて、水中に２０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調整したグルコースイソメラーゼ（Hampton Research社 HR7-102）の溶液を充填した。さらに空気を陽圧下で流通させることにより、ポート３０を介して第１液体供給チャネル３３より過剰のグルコースイソメラーゼ溶液を除去し、第１の液体（タンパク質溶液）を秤取するための第１秤取チャネル３６の全7箇所にグルコースイソメラーゼ溶液を秤取した。
次に、上記した過剰のグルコースイソメラーゼ溶液を除去する際の圧力よりもさらに高い陽圧を用いて空気をポート２８より第１液体供給チャネル３３内に流通させ、秤取されたグルコースイソメラーゼ溶液を混合チャネル３４に流出させた。

次に、１００ｍＭのＭＥＳ（Hampton Research社 HR2-587） のバッファ（ｐＨ６．５）中に、ＰＥＧ８０００ (Hampton Research社 HR2-535) が１０％、ＭｇＣｌ_２(Hampton Research社 HR2-559) が２００ｍＭになるように調整した沈殿剤溶液を第２の液体を秤取するための第２液体供給チャネル３５及び第２秤取チャネル３７に、ポート３１ａより陽圧を用いて充填し、さらに空気を陽圧下で流通させることにより、ポート３１ｂを介して第２液体供給チャネル３５内の過剰の沈殿剤溶液を除去し、第２の液体を秤取するための第２秤取チャネル３７に沈殿剤溶液を秤取した。次に、過剰の沈殿剤溶液を除去する際の圧力よりもさらに高い陽圧を用いて、ポート３１ａより空気を第２液体供給チャネル３５に流通させ、秤取された沈殿剤溶液を混合チャネル３４に流出させた。この結果、グルコースイソメラーゼ溶液と沈殿剤溶液は混合チャネル３４内で接触・合一した。この操作を5箇所で行い、グルコースイソメラーゼ溶液と沈殿剤溶液の合一した液体を5個作成した。

このチップを、実体顕微鏡で観察したところ、グルコースイソメラーゼ溶液と沈殿剤溶液の合一した液体5個すべてにおいて、液体内に結晶が観察された。

実施例２ グルコースイソメラーゼの結晶化（液体と連続液体との接触）
実施例１と同様のチップを用い、また試薬はすべて実施例１と同一のものを用いて実験を行った。
まず、第１の液体（タンパク質溶液）を秤取するため、ポート２８から第１液体供給チャネル３３に、陽圧を用いて、水中に２０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調整したグルコースイソメラーゼ（Hampton Research社 HR7-102）の溶液を充填した。さらに空気を陽圧下で流通させることにより、ポート３０を介して第１液体供給チャネル３３より過剰のグルコースイソメラーゼ溶液を除去し、第１の液体（タンパク質溶液）を秤取するための第１秤取チャネル３６の全７箇所にグルコースイソメラーゼ溶液を秤取した。
次に、１００ｍＭの濃度のＭＥＳバッファ（ＰＨ６．５）中に、ＰＥＧ８０００が１０％、ＭｇＣｌ_２が２００ｍＭになるように調整した沈殿剤溶液を、ポート２８から第１液体供給チャネル３３に陽圧を用いて充填した。この結果、第１液体供給チャネル３３の第１秤取チャネル３６の開口部において、グルコースイソメラーゼ溶液と沈殿剤溶液は接触した。
このチップを、実体顕微鏡で観察したところ、グルコースイソメラーゼ溶液と沈殿剤溶液の界面が存在したところ（第１液体供給チャネル３３と第１秤取チャネル３６との開口部）のグルコースイソメラーゼ溶液側（第１秤取チャネル３６）および沈殿剤溶液側（第１液体供給チャネル３３側）の液体中に結晶が観察された。特に、沈殿剤側の液体中に結晶が多く観察された。

以上、本発明の微量液体秤取構造又は該構造を有するマイクロチップを用いたタンパク質の結晶化について具体的に説明してきたが、本発明は具体的に例示された実施態様及び実施例に限定されるものではない。例えば、第３の流路（流路Ｃ）の第２の流路（流路Ｂ）寄り部分だけを選択的に濡れにくい（又は相対的に毛管引力が働きにくい）性質を有するように改質できれば、幅の狭い第４の流路（流路Ｄ）を配設することなく、広い幅の第３の流路を同じ幅の第２の流路（流路Ｂ）に直接接続させることもできる。また、液体を秤取するための第３の流路の形状は矩形状の他、円形、楕円形、三角形など任意の形状をとることもできる。

本発明で用いる微量液体秤取構造の原理を説明するための概念説明図であり、（ａ）はその構造を示し、（ｂ）及び（ｃ）は液体の秤取方法を説明している。 第２の実施態様の２つの液体作成系を有する微量液体秤取構造の説明図であり、（ａ）は、流路Ａを共有する場合、（ｂ）は流路Ｂを共有する場合である。 第３の実施態様および第４の実施態様の微量液体秤取構造の説明図であり、（ａ）は、流路Ｄが３本の流路に別れている場合、（ｂ）は、太さの異なる流路Ｃおよび流路Ｄが３組ある場合の説明図である。 第５の実施態様の微量液体秤取構造の説明図であり、（ａ）はその構造を示し、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、流路Ｂに液体が充填されている場合の液体導入方法の説明図である。 （ａ）及び（ｂ）は、第６の実施態様の微量液体秤取構造を示す平面図であり、（ｃ）は（ｂ）におけるｃ−ｃ線に沿った断面図である。 参考例１のイオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質の分離に使用される、本発明で用いる微量液体秤取構造を備えたマイクロチップ１０の説明図であり、（ａ）はチップ全体のレイアウト、（ｂ）は微量サンプルの定量と導入部の拡大説明図であり、（ｃ１）及び（ｃ２）は図（ｂ）におけるｃ−ｃ線に沿った断面図である。 （ａ）は参考例２の酵素反応によるグルコースの定量に使用される、本発明で用いる微量液体秤取構造の別の実施態様によるマイクロチップ２４の平面図であり、（ｂ）は（ａ）図におけるｂ部の部分拡大平面図であり、（ｃ）は（ｂ）図におけるｃ部の部分拡大平面図である。 実施例１及び２のグルコースイソメラーゼの結晶化で使用されるマイクロチップ４１の平面図であり、（ｂ）は（ａ）図におけるｂ部の部分拡大平面図である。

符号の説明

１０ キャピラリークロマトグラフィー用マイクロチップ
１１ 溶離バッファー導入用ポート
１２ 溶離バッファー導入用ポート
１３ ミキサー
１４ マイクロチャネル
１５ 堰き止め部
１６ PDMS 平板（上部）
１７ PDMS 平板（下部）
１８ ポート
１９ 第１の流路
２０ 第２の流路
２１ 第３の流路
２２ 第４の流路
２３ 第５の流路
２４ ５０種類の微量２液混合反応用のマイクロチップ
２５ 上部基板
２６ 下部基板
２７ チャネル
２８ 第１の液体の入口ポート
２９ チャネル
３０ 第１の液体の出口ポート
３１ａ 第２の液体の入口ポート
３１ｂ 第２の液体の出口ポート
３２ａ ポート
３２ｂ ポート
３３ 第１液体供給チャネル
３４ 混合チャネル
３５ 第２液体供給チャネル
３６ 第１秤取チャネル
３７ 第２秤取チャネル
３８ 第１狭隘チャネル
３９ 第２狭隘チャネル
４１ タンパク質の結晶化用マイクロチップ
１００ 液体（サンプル等）
１００ａ 流路Ｃ内の液体の下端（流路Ａの側）
１００ｂ 流路Ｃ内の液体の上端（流路Ｄの側）
２００ 液体（液クロの移動相等）
ａａ、ａａ’ 流路Ａの流路壁
ｂｂ、ｂｂ’ 流路Ｂの流路壁
ｃ１ 流路Ｃの開口部（流路Ａの側）
ｃ２ 流路Ｃの開口部（流路Ｄの側）
ｄ１ 流路Ｄの開口部（流路Ｂの側）
ｅ１ 流路Ｅの開口部（流路Ｄの側）

Claims (3)

1. 微量液体秤取構造を用いるタンパク質の結晶化方法であって、
   該微量液体秤取構造は、それぞれ所定の方向に延長される第１の流路（流路Ａ）ならびに第２の流路（流路Ｂ）と、前記第１の流路（流路Ａ）の流路壁に開口する第３の流路（流路Ｃ）と、前記第２の流路（流路Ｂ）の流路壁に開口して前記第３の流路（流路Ｃ）の一端と前記第２の流路を連結し、前記第３の流路（流路Ｃ）よりも相対的に毛管引力が働きにくい性質を有し他の３本の流路より細い第４の流路（流路Ｄ）を有し、前記第１の流路に導入された液体が、前記第１の流路の流路壁において開口する前記第３の流路の開口部を介して前記第３の流路内に引き込まれた後、前記第１の流路に残存する前記液体を取り除き、前記第３の流路の容積に応じた体積の液体を秤取することを特徴とし、且つ、
   該方法は、
   （ａ）第１の流路にタンパク質溶液もしくは沈殿剤溶液を導入し、前記第１の流路に開口する第３の流路の開口部を介して前記第３の流路に前記タンパク質溶液もしくは沈殿剤溶液が引き込まれた後、前記第１の流路に残存する前記タンパク質溶液もしくは沈殿剤溶液を、前記第３の流路の開口部と接触しない位置まで移動させ、前記第３の流路の容積に応じた体積で作成されたタンパク質溶液もしくは沈殿剤溶液を第４の流路を介して前記第２の流路に流出させる工程と、
   （ｂ）第１の流路に沈殿剤溶液もしくはタンパク質溶液を導入し、前記第１の流路に開口する第３の流路の開口部を介して前記第３の流路に前記沈殿剤溶液もしくはタンパク質溶液が引き込まれた後、前記第１の流路に残存する前記沈殿剤溶液もしくはタンパク質溶液を、前記第３の流路の開口部と接触しない位置まで移動させ、前記
   第３の流路の容積に応じた体積で作成された沈殿剤溶液もしくはタンパク質溶液を第４の流路を介して前記第２の流路に流出させ、タンパク質溶液と沈殿剤溶液とを第２の流路中で接触・合一させる工程と、
   （ｃ）第２の流路中で合一させたタンパク質および沈殿剤溶液中からのタンパク質結晶を析出させる工程を含むことを特徴とする。
2. 合一させたタンパク質および沈殿剤溶液中からのタンパク質結晶の析出が、該溶液と離れた流路構造中に沈殿剤溶液が配置されている状態で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 微量液体秤取構造を用いるタンパク質の結晶化方法であって、
   該微量液体秤取構造は、それぞれ所定の方向に延長される第１の流路（流路Ａ）ならびに第２の流路（流路Ｂ）と、前記第１の流路（流路Ａ）の流路壁に開口する第３の流路（流路Ｃ）と、前記第２の流路（流路Ｂ）の流路壁に開口して前記第３の流路（流路Ｃ）の一端と前記第２の流路を連結し、前記第３の流路（流路Ｃ）よりも相対的に毛管引力が働きにくい性質を有し他の３本の流路より細い第４の流路（流路Ｄ）を有し、前記第１の流路に導入された液体が、前記第１の流路の流路壁において開口する前記第３の流路の開口部を介して前記第３の流路内に引き込まれた後、前記第１の流路に残存する前記液体を取り除き、前記第３の流路の容積に応じた体積の液体を秤取することを特徴とし、且つ、
   該方法は、
   （ａ）第１の流路にタンパク質溶液を導入し、前記第１の流路に開口する第３の流路の開口部を介して前記第３の流路に前記タンパク質溶液が引き込まれた後、前記第１の流路に残存する前記タンパク質溶液を、前記第３の流路の開口部と接触しない位置まで移動させ、前記第３の流路の容積に応じた体積でタンパク質溶液を作成する工程と、
   （ｂ）第１の流路に沈殿剤溶液を導入し、タンパク質溶液と沈殿剤溶液とを第３の流路の開口部において接触させ、タンパク質溶液と沈殿剤溶液とを合一させる工程と、
   （ｃ）合一させたタンパク質および沈殿剤溶液中からのタンパク質結晶を析出させる工程を含むことを特徴とする。

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