JP4246161B2 - Protein detection device and protein quantitative analysis method - Google Patents
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Description
本発明は、タンパク質の定量分析技術に関するものである。 The present invention relates to a protein quantitative analysis technique.
1990年代に入って進められてきたヒトゲノム計画は、各国が分担してヒトの遺伝暗号をすべて解読しようとする試みであり、2000年夏にドラフト版が完成したことが公表された。今後、機能ゲノム科学や構造ゲノム科学の進展によって、解読されたヒトゲノム配列情報の各々の箇所がどのような機能に係わっているかが明らかにされていくものと予想される。 The Human Genome Project, which has been underway in the 1990s, was an attempt to share all the human genetic codes with each country sharing, and it was announced that a draft version was completed in the summer of 2000. In the future, it is expected that the functions of each part of the decoded human genome sequence information will be clarified by the progress of functional genomic science and structural genomic science.
このヒトゲノム計画は、ライフサイエンスに関わりを持つ科学技術並びに産業に対して、大きなパラダイムの変化をもたらした。たとえば糖尿病は、血糖値が高くなるという病状に基づいて分類が行われ、発症の原因としては患者の体内でインシュリン産生能がどの程度あるかに基づいてI型(体内でインシュリンを産生できない)、II型(体内でインシュリン量の調整ができない)のような分類が行われてきた。 The Human Genome Project has brought about a major paradigm change for science and technology and industry that are involved in life sciences. For example, diabetes is classified based on the condition that the blood sugar level is high, and the cause of the onset is type I (inability to produce insulin in the body) based on the ability of the patient to produce insulin, Classification such as type II (in which the amount of insulin cannot be adjusted in the body) has been performed.
ヒトゲノム計画は、血糖とインシュリンの検出、合成、分解などの調整に係わっている酵素やレセプターなどのタンパク質のアミノ酸配列構造、ならびにそのようなタンパク質の存在量の制御に係わっている遺伝子のDNA配列の情報をすべて我々に提示している。 The Human Genome Project is designed to determine the amino acid sequence structure of proteins such as enzymes and receptors involved in the regulation of blood glucose and insulin detection, synthesis, and degradation, as well as the DNA sequences of genes involved in the control of the abundance of such proteins. All information is presented to us.
このような情報を使うと、血糖値の調整が正常に行われないという現象としての糖尿病は、血糖とインシュリンの検出、合成、分解などの一連の処理に係わるそれぞれのタンパク質のどれが不調なのかによって、サブタイプに分類でき、それによって適切な診断と治療を行うことが可能になるはずである。 Using this information, diabetes, which is a phenomenon in which blood sugar levels are not adjusted normally, is a malfunction of each protein involved in a series of processes such as detection, synthesis, and degradation of blood sugar and insulin. Should be able to classify into subtypes, thereby enabling appropriate diagnosis and treatment.
特に、ヒトゲノム配列に基づいて特定のタンパク質に対する薬剤を開発するゲノム創薬が精力的に進められており、このような一連の機能的にかかわりのあるタンパク質の状態を把握してゲノム創薬薬剤を投与し、症状の緩和や治癒を行う時代がくると予想される。 In particular, genome drug discovery that develops drugs for specific proteins based on the human genome sequence has been vigorously promoted. It is expected that the time will come when treatment will be given to alleviate and cure symptoms.
しかし、このような一連の機能的に関わりのあるタンパク質の存在量を簡便に測定できる技術は、プロテオーム解析技術として発展途上にある。現在確立されている方法として、二次元電気泳動と質量分析機の組み合わせで測定が行われているが、これには比較的大がかりな装置が必要になる。従って、臨床の現場、たとえば病院の検査室やベッドサイドで患者の症状を把握するためにはあらたな技術の開発が必要とされている。 However, a technique that can easily measure the abundance of such a series of functionally related proteins is under development as a proteome analysis technique. As a currently established method, measurement is performed by a combination of two-dimensional electrophoresis and a mass spectrometer, but this requires a relatively large apparatus. Therefore, new techniques need to be developed in order to grasp patient symptoms in clinical settings such as hospital laboratories and bedsides.
いわゆるDNAチップにおいては、測定対象であるDNAをあらかじめPCR反応(polymerase chain reaction)によって増幅(増量)する際に蛍光色素を導入し、アレイ状に配した相補DNA鎖と結合した試料中のDNA量を蛍光強度によって定量することが可能である。しかしながら、タンパク質はPCR反応に相当する増幅を行うことができない。 In a so-called DNA chip, the amount of DNA in a sample bound to complementary DNA strands arranged in an array by introducing a fluorescent dye when the DNA to be measured is amplified (increase) by PCR reaction (polymerase chain reaction) in advance. Can be quantified by fluorescence intensity. However, the protein cannot perform amplification corresponding to the PCR reaction.
微量タンパク質を捕らえるために用いられている手法としてはELISA(Enzyme−Linked Immunosorbent Assay)法などがある。ELISA法では、1次抗体を使い標的タンパク質を捕捉し、標的タンパク質の別部位を認識できる2次抗体を使用する。 As a technique used for capturing a trace amount of protein, there is an ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method. In the ELISA method, a primary antibody is used to capture a target protein, and a secondary antibody that can recognize another site of the target protein is used.
この際の認識手段としては、従来、2次抗体と蛍光標識抗体とを使い、蛍光標識抗体の蛍光発色により標的タンパク質の有無を確認していたが、その定量性の信頼性が低いという問題があった。 As a recognition means in this case, conventionally, a secondary antibody and a fluorescently labeled antibody were used, and the presence or absence of the target protein was confirmed by fluorescent color development of the fluorescently labeled antibody. However, there is a problem that the reliability of the quantitative property is low. there were.
その後改良が加えられ、2次抗体として酸化還元酵素連結抗体が使われるようになり、化学発光もしくは電気化学測定により標的タンパク質を確認することにより、定量性はかなり改善され、電気化学測定においてさらに改善されたという報告がある。 After that, improvements were made and oxidoreductase-linked antibodies were used as secondary antibodies. By confirming the target protein by chemiluminescence or electrochemical measurement, the quantitative properties were considerably improved, and further improvements were made in electrochemical measurements. There is a report that it was done.
このようなELISA法の標的になっているものは、生体内で微量に存在する物質である。そのため試料を検査項目毎に分割すれば、分割した数に比例して感度が低下することは避けられず、しかも、微量サンプルの厳密な分割は困難である。 What is the target of such an ELISA method is a substance that exists in a minute amount in a living body. Therefore, if the sample is divided for each inspection item, it is inevitable that the sensitivity decreases in proportion to the number of divided items, and it is difficult to strictly divide a small amount of sample.
また、サンプル中の標的タンパク質を固定する部位をアレイ化することにより定量する方法も考えられるが、サンプル溶液が各アレイに均等に行き渡る必要があり、その制御は非常に困難である。さらに、タンパク質をアレイ化する際にはタンパク質の変性を避けることが困難である。
従ってタンパク質の定量分析には、DNAの配列情報を介する方法が現実的であると考えられる。しかしながら、種々のタンパク質の定量分析を可能とするにはDNAのアレイ化が必須であり、アレイ化を行う微細加工に必要な高コスト問題を避けることができない(例えば特許文献1参照。)
本発明は、上記問題を解決し、DNAのアレイ化を不要としたタンパク質の定量分析技術を提供することを目的としている。本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになるであろう。
Therefore, it is considered that a method using DNA sequence information is practical for quantitative analysis of proteins. However, in order to enable quantitative analysis of various proteins, it is essential to form an array of DNA, and the high cost problem necessary for microfabrication for arraying cannot be avoided (see, for example, Patent Document 1).
An object of the present invention is to provide a protein quantitative analysis technique that solves the above problems and eliminates the need for DNA arraying. Still other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following description.
本発明の一態様によれば、流路中に、
基体と、
標的タンパク質を特異的に捕捉するための、基体に結合した第一の結合部と、
第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、
標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と、
標的タンパク質に特異的に会合し、情報伝達部が結合した第二の結合部と
を有する2本鎖DNA生成セクションと、
生成した2本鎖DNAを増幅するための2本鎖DNA増幅セクションと、
増幅した2本鎖DNAを検出するための2本鎖DNA検出セクションと
を有するタンパク質検出デバイスが提供される。
According to one aspect of the invention, in the flow path,
A substrate;
A first binding moiety bound to a substrate for specifically capturing a target protein;
A target protein captured in the first binding site;
An information transmission unit that has a one-to-one correspondence with a target protein and that can recognize a sequence by a primer;
A double-stranded DNA generating section having a second binding part specifically associated with the target protein and bound with the information transmission part;
A double-stranded DNA amplification section for amplifying the generated double-stranded DNA;
A protein detection device is provided having a double-stranded DNA detection section for detecting amplified double-stranded DNA.
本発明態様により、DNAのアレイ化をしなくてもタンパク質の定量分析が可能となるデバイスを提供できる。 According to the embodiment of the present invention, it is possible to provide a device that enables quantitative analysis of proteins without arraying DNA.
外部から、流路中に、情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとdNTPとDNA複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、情報伝達部との相補作用により2本鎖DNAを生成し、かつ2本鎖DNAを増幅することのできること、2本鎖DNA増幅セクションが加熱可能であること、2本鎖DNA検出セクションが、タンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間により、標的タンパク質を定量分析できること、第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が抗体を含んでなること、第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が、基体、標的タンパク質および情報伝達部からなる群から選ばれた少なくとも一つと、アビジン−ビオチン結合、オリゴヒスチジン−金属錯体結合またはhAGTとアルキルグアニン誘導体によって生じる結合で結合していること、情報伝達部が核酸であること、タンパク質信号増幅体が、2本鎖DNAに対する特異的蛍光発光インタカレータを含むこと、2本鎖DNA検出セクションが蛍光を検出する能力を有することおよび、2本鎖DNA生成セクションを並列に複数有することが好ましい。 By supplying a protein signal amplifying body comprising a primer capable of recognizing the sequence of the information transfer unit, dNTP, and DNA replication enzyme from the outside into the flow path, a double strand is obtained by a complementary action with the information transfer unit. The ability to generate DNA and amplify double-stranded DNA, the double-stranded DNA amplification section can be heated, and the double-stranded DNA detection section starts to put the protein signal amplifier into the flow path. The target protein can be quantitatively analyzed according to the time from the start of detection to the start of detection, that at least one of the first binding portion and the second binding portion comprises an antibody, the first binding portion and the second binding portion At least one selected from the group consisting of a substrate, a target protein, and an information transmitter, an avidin-biotin bond, It is bound by a thiidine-metal complex bond or a bond generated by hAGT and an alkylguanine derivative, the information transmission part is a nucleic acid, and the protein signal amplifier contains a specific fluorescence intercalator for double-stranded DNA. It is preferred that the double-stranded DNA detection section has the ability to detect fluorescence and has a plurality of double-stranded DNA production sections in parallel.
本発明の他の一態様によれば、
流路中の基体に、
標的タンパク質を特異的に捕捉するための、基体に結合した第一の結合部と、
第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、
標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と
標的タンパク質に特異的に会合し、情報伝達部が結合した第二の結合部と
を有する構造体を結合し、
外部から、流路中に、情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとdNTPとDNA複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、情報伝達部との相補作用による2本鎖DNAを生成し、
その2本鎖DNAを増幅し、検出する
タンパク質の定量分析方法が提供される。
According to another aspect of the invention,
On the substrate in the channel,
A first binding moiety bound to a substrate for specifically capturing a target protein;
A target protein captured in the first binding site;
A structure having an information transmission part that has a one-to-one correspondence with a target protein and that can recognize a sequence by a primer and a second binding part that specifically associates with the target protein and is bound to the information transmission part,
By supplying a protein signal amplifier comprising a primer capable of recognizing the sequence of the information transmission unit, dNTP, and DNA replication enzyme into the channel from the outside, a double strand is produced by a complementary action with the information transmission unit. Producing DNA,
A method for quantitative analysis of a protein that amplifies and detects the double-stranded DNA is provided.
本発明態様により、DNAのアレイ化をしなくてもタンパク質を定量分析することができる。 According to the embodiment of the present invention, a protein can be quantitatively analyzed without arraying DNA.
2本鎖DNA生成後の増幅段階で加熱すること、検出段階で、タンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間により、標的タンパク質を定量分析すること、第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が抗体を含んでなること、第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が、基体、標的タンパク質および情報伝達部からなる群から選ばれた少なくとも一つと、アビジン−ビオチン結合、オリゴヒスチジン−金属錯体結合またはhAGTとアルキルグアニン誘導体によって生じる結合で結合していること、情報伝達部が核酸であること、タンパク質信号増幅体が、2本鎖DNAに対する特異的蛍光発光インタカレータを含むこと検出段階で蛍光を検出することが好ましい形態である。 Heating in the amplification stage after the generation of double-stranded DNA, quantitative analysis of the target protein according to the time from the start of the introduction of the protein signal amplification body into the flow path until the start of detection in the detection stage, At least one of the binding part and the second binding part comprises an antibody, and at least one of the first binding part and the second binding part is a substrate, a target protein, and an information transmission part And at least one selected from the group consisting of avidin-biotin bond, oligohistidine-metal complex bond or bond generated by hAGT and alkylguanine derivative, information transmission part is nucleic acid, protein signal amplification It is a preferred form that the body contains a specific fluorescent intercalator for double-stranded DNA, detecting fluorescence at the detection stage.
本発明により、DNAのアレイ化をしなくてもタンパク質の定量分析が可能となる。デバイスの製造コストの低減を図ることもできる。 According to the present invention, it is possible to quantitatively analyze proteins without arraying DNA. The manufacturing cost of the device can also be reduced.
以下に、本発明の実施の形態を図、実施例等を使用して説明する。なお、これらの図、実施例等及び説明は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の趣旨に合致する限り他の実施の形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。図中、同一の符号は同一の要素を表す。 Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings, examples and the like. In addition, these figures, Examples, etc. and description illustrate the present invention and do not limit the scope of the present invention. It goes without saying that other embodiments may belong to the category of the present invention as long as they match the gist of the present invention. In the drawings, the same reference numeral represents the same element.
本発明は、上記の課題を解決するため、アレイ化を行う代わりに、種々のタンパク質を分離せずに保持し、かつ、これらタンパク質のそれぞれの存否または量情報を読み出せる機能を有するドメインを設け、そこから随時量情報を読み出せるようにしたタンパク質検出デバイスを提供するものである。本発明に係るデバイスは、上記説明のように、タンパク質に関する存否または量情報を随時読み出せるため、タンパク質検出ライブラリと呼称することもできる。なお、本発明においては、DNAのアレイ化のようにタンパク質を整理して保持することが必要なく、種々雑多のまま上記ドメインに保持でき、しかも種々のタンパク質の存否または量情報を随時呼び出すことができるという特徴も有している。 In order to solve the above problems, the present invention provides a domain having a function of holding various proteins without separation and reading out the presence / absence or quantity information of each of these proteins instead of arraying. The present invention provides a protein detection device that can read out information from time to time. As described above, the device according to the present invention can be called a protein detection library because it can read presence / absence or quantity information about a protein at any time. In the present invention, it is not necessary to organize and retain proteins as in the case of DNA arraying, and can be retained in the above domains with various kinds of miscellaneous information, and the presence or amount information of various proteins can be called up as needed. It also has the feature of being able to do.
本発明に係るタンパク質検出デバイスは、流路中に、基体と、標的タンパク質を特異的に捕捉するための、基体に結合した第一の結合部と、第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と、標的タンパク質に特異的に会合し、情報伝達部が結合した第二の結合部とを有する2本鎖DNA生成セクションと、生成した2本鎖DNAを増幅するための2本鎖DNA増幅セクションと、増幅した2本鎖DNAを検出するための2本鎖DNA検出セクションとを有する。 The protein detection device according to the present invention includes a substrate, a first binding portion bound to the substrate for specifically capturing the target protein, and a target protein captured by the first binding portion in the flow path. A double-stranded chain having an information transmission part that has a one-to-one correspondence with the target protein and that can recognize the sequence with a primer, and a second binding part that specifically associates with the target protein and is bound to the information transmission part A DNA production section, a double-stranded DNA amplification section for amplifying the produced double-stranded DNA, and a double-stranded DNA detection section for detecting the amplified double-stranded DNA.
次に本発明を図を使用して説明する。図1は本発明に係る2本鎖DNA生成セクション1と2本鎖DNA増幅セクション2と2本鎖DNA検出セクション3と流路5とを有するタンパク質検出デバイス4の概念図であり、図2は2本鎖DNA生成セクション1を拡大した様子を示す概念図である。
Next, the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a conceptual diagram of a
2本鎖DNA生成セクション1は、図2に示すように、基体21および、標的タンパク質を特異的に捕捉するための第一の結合部22と、標的タンパク質23と、第二の結合部24と、標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部25とを有する構造体26を含んでいる。第二の結合部24は標的タンパク質23に特異的に会合し、情報伝達部25に結合している。図1の2本鎖DNA生成セクション1には構造体26と結合させた基体21も示されている(構造体26自体は示されていない)。
As shown in FIG. 2, the double-stranded
このような構造体を完成させるには公知のどのような方法を採用してもよい。たとえば、基体上に結合した第一の結合部により標的タンパク質を特異的に捕捉し、ついで第二の結合部が標的タンパク質23に特異的に会合し、その第二の結合部に情報伝達部を結合させることでこの構造体を得ることができる。
Any known method may be employed to complete such a structure. For example, the target protein is specifically captured by the first binding part bound on the substrate, and then the second binding part specifically associates with the
また、標的タンパク質を特異的に捕捉した第一の結合部を基体に結合させてもよい。さらに、標的タンパク質に第一の結合部と第二の結合部と情報伝達部とを予め結合させた後基体に結合させてもよい。 Alternatively, the first binding part that specifically captures the target protein may be bound to the substrate. Further, the first binding portion, the second binding portion, and the information transmission portion may be bound in advance to the target protein and then bound to the substrate.
基体に第一の結合部を結合させる方法、第一の結合部により標的タンパク質を特異的に捕捉する方法、第二の結合部を標的タンパク質に特異的に会合させる方法および情報伝達部を第二の結合部に結合させる方法については、本発明の趣旨に反しない限りどのような方法を採用してもよい。 A method for binding the first binding portion to the substrate, a method for specifically capturing the target protein by the first binding portion, a method for specifically associating the second binding portion with the target protein, and a second information transmission portion. Any method may be adopted as a method of coupling to the coupling part as long as it is not contrary to the gist of the present invention.
典型的な例では第一の結合部や第二の結合部として抗体を使用し、情報伝達部として核酸を使用するが、そのような場合には、基体に第一の結合部を結合させる方法として、抗体を基体に結合させる公知の方法を採用することができる。第一の結合部により標的タンパク質を特異的に捕捉する方法、第二の結合部を標的タンパク質に特異的に会合させる方法および情報伝達部を第二の結合部に結合させる方法についても同様である。 In a typical example, an antibody is used as the first binding portion or the second binding portion, and a nucleic acid is used as the information transmission portion. In such a case, a method of binding the first binding portion to the substrate. As a method, a known method for binding an antibody to a substrate can be employed. The same applies to the method for specifically capturing the target protein by the first binding portion, the method for specifically associating the second binding portion with the target protein, and the method for binding the information transmission portion to the second binding portion. .
具体的には、これらの結合または捕捉には、アビジン−ビオチン結合、オリゴヒスチジン−金属錯体結合またはhAGTとアルキルグアニン誘導体によって生じる結合を利用することができる。ただし、一般に、結合の解離定数が大きいと、基体上の上記構造体の量が急速に減少したり、上記構造体の構造が不完全になりやすいので、できるだけ結合の解離定数が小さいものが好ましい。例えば解離定数が10-5以下のものが好ましい。 Specifically, for such binding or capturing, an avidin-biotin bond, an oligohistidine-metal complex bond, or a bond generated by hAGT and an alkylguanine derivative can be used. However, generally, when the bond dissociation constant is large, the amount of the structure on the substrate is rapidly reduced or the structure of the structure is likely to be incomplete. . For example, a dissociation constant of 10 −5 or less is preferable.
本発明に係る基体としては、本発明の趣旨に反しない限りどのような材質のものも使用することができる。具体的には、ガラス、シリコン、セラミック、プラスチック等を例示することができる。また、本発明に係る流路についても同様に、本発明の趣旨に反しない限りどのような材質のものも使用することができる。 As the substrate according to the present invention, any material can be used as long as it is not contrary to the gist of the present invention. Specifically, glass, silicon, ceramic, plastic and the like can be exemplified. Similarly, any flow channel according to the present invention can be used as long as it is not contrary to the spirit of the present invention.
本発明に係る第一の結合部または第二の結合部としては、本発明の趣旨に反しない限りどのようなものも使用することができるが、例えば、DNA、RNA、抗体、天然または人工の1本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の2本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られる産物、蛋白質に対して親和性を有する有機化合物、蛋白質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれた少なくとも一つの物質よりなるものを挙げることができる。 As the first binding portion or the second binding portion according to the present invention, any one can be used as long as it is not contrary to the spirit of the present invention. For example, DNA, RNA, antibody, natural or artificial Single-stranded nucleotide bodies, natural or artificial double-stranded nucleotide bodies, aptamers, products obtained by limited degradation of antibodies with proteolytic enzymes, organic compounds having affinity for proteins, affinity for proteins A biopolymer having a property, a complex thereof, and at least one substance selected from the group consisting of any combination thereof.
本発明に係る情報伝達部は、標的タンパク質に一対一対応する。ここで、「一対一対応する」とは、情報伝達部と標的タンパク質とが1:1対応しており、情報伝達部の有する情報を読みとることにより、標的タンパク質の情報が読みとれることを意味する。具体的には、標的タンパク質と特異的に会合できる第二の結合部毎に、互いに区別できる特定の情報伝達部を結合させることにより、このような機能を発揮させることができる。 The information transmission unit according to the present invention has a one-to-one correspondence with the target protein. Here, “corresponding one-to-one” means that the information transmission unit and the target protein have a 1: 1 correspondence, and the information on the target protein can be read by reading the information held by the information transmission unit. . Specifically, such a function can be exhibited by binding specific information transfer units that can be distinguished from each other for each second binding unit that can specifically associate with the target protein.
本発明に係る情報伝達部としては、上記の機能を有するものであればどのようなものを使用してもよい。具体的にはDNA、RNAを含む核酸であって標的タンパク質に一対一対応するものを挙げることができる。また、情報伝達部が核酸以外の構造を有していてもよい。情報伝達部に第二の結合部としての機能を持たせることも可能である。そのような場合には、情報伝達部と第二の結合部とが分離して区別できない場合もあり得る。本発明の範疇にはこのような場合も含まれる。 Any information transmission unit according to the present invention may be used as long as it has the above functions. Specific examples include nucleic acids including DNA and RNA that have a one-to-one correspondence with the target protein. Moreover, the information transmission part may have structures other than a nucleic acid. It is also possible for the information transmission unit to have a function as a second coupling unit. In such a case, the information transmission unit and the second coupling unit may be separated and cannot be distinguished. Such a case is also included in the category of the present invention.
本発明ではこのような2本鎖DNA生成セクションから情報を読み出す。すなわち二本鎖DNAを生成する。このためには、このような2本鎖DNA生成セクションを有する流路中に、外部から、核酸の断片であるプライマーであって上記情報伝達部の配列を認識し得るものと、dATP(デオキシアデノシン三リン酸)、dGTP(デオキシグアノシン三リン酸)、dCTP(デオキシシチジン三リン酸)およびTTP(チミジン三リン酸)を含むdNTP(デオキシヌクレオシド三リン酸)と、DNA複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、情報伝達部との相補作用により2本鎖DNAを生成させる。このように本発明におけるタンパク質信号増幅体は、標的タンパク質に一対一対応する核酸配列を生成または増幅する機能を有する。 In the present invention, information is read from such a double-stranded DNA generation section. That is, double-stranded DNA is produced. For this purpose, in the channel having such a double-stranded DNA generation section, a primer which is a fragment of a nucleic acid and capable of recognizing the sequence of the above-mentioned information transfer unit is used, and dATP (deoxyadenosine). DNTP (deoxynucleoside triphosphate), including dphosphate (triphosphate), dGTP (deoxyguanosine triphosphate), dCTP (deoxycytidine triphosphate) and TTP (thymidine triphosphate), and DNA replication enzyme By supplying the protein signal amplifier, double-stranded DNA is generated by a complementary action with the information transmission unit. Thus, the protein signal amplifier in the present invention has a function of generating or amplifying a nucleic acid sequence corresponding to a target protein on a one-to-one basis.
本発明に係るプライマーは情報伝達部と相補結合できるとして選択されているので、このプライマーが核酸と相補的に結合し、このプライマーの持つ情報に従い、DNA複製酵素が増幅部位を決定することにより、dNTPを原料にして、 情報伝達部の有する情報を含む2本鎖DNAが生成される。 Since the primer according to the present invention is selected as being capable of complementary binding to the information transmission part, this primer binds complementarily to the nucleic acid, and according to the information possessed by this primer, the DNA replication enzyme determines the amplification site, Using dNTP as a raw material, double-stranded DNA containing information possessed by the information transmission unit is generated.
本発明に係るDNA複製酵素としては、高熱耐性DNA複製酵素Taqポリメレースが好適として挙げられるが、流路内の温度で安定であれば、いかなるDNA複製酵素でもよい。 The DNA replication enzyme according to the present invention is preferably a high heat resistant DNA replication enzyme Taq polymerase, but any DNA replication enzyme may be used as long as it is stable at the temperature in the flow path.
このようにして生成した2本鎖DNAは通常その量が少ないので、本発明では、増幅(すなわち、複製によりその量を増大)してから検出する。この増幅は、2本鎖DNA増幅セクションにおいてdNTPとプライマーとDNA複製酵素とにより行うことができる。ただし、特に2本鎖DNA増幅セクションを明示的に設ける必要はなく、2本鎖DNA生成セクションと2本鎖DNA検出セクションとの間に一定の保持時間があれば十分である。2本鎖DNA生成セクションと2本鎖DNA検出セクションとの間にある流路部分を2本鎖DNA増幅セクションと考えてもよい。この保持時間は、定量分析したいタンパク質の量、上記流路を流れるタンパク質信号増幅体の流量等により、実状に応じて定めることができる。 Since the amount of the double-stranded DNA thus generated is usually small, in the present invention, detection is performed after amplification (that is, the amount is increased by replication). This amplification can be performed with dNTPs, primers, and DNA replication enzymes in the double-stranded DNA amplification section. However, it is not necessary to explicitly provide a double-stranded DNA amplification section, and a certain holding time is sufficient between the double-stranded DNA generation section and the double-stranded DNA detection section. The channel portion between the double-stranded DNA generation section and the double-stranded DNA detection section may be considered as a double-stranded DNA amplification section. This holding time can be determined according to the actual situation, depending on the amount of protein to be quantitatively analyzed, the flow rate of the protein signal amplification body flowing in the flow path, and the like.
なお、2本鎖DNAの増幅は一般に高温ほど有利であるが、タンパク質は熱に弱いので、2本鎖DNA増幅セクションを加熱し、2本鎖DNA生成セクションは加熱しないで室温程度に保つことが好ましい。2本鎖DNA増幅セクションの温度範囲としては30〜60℃の範囲が好ましい。 In general, amplification of double-stranded DNA is more advantageous at higher temperatures. However, since proteins are vulnerable to heat, the double-stranded DNA amplification section should be heated, and the double-stranded DNA production section should be kept at room temperature without heating. preferable. The temperature range of the double-stranded DNA amplification section is preferably in the range of 30 to 60 ° C.
2本鎖DNA検出セクションでは2本鎖DNAを検出するが、その方法としては、公知のどのような方法を使用してもよい。たとえば、後述するように、タンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間により、上記標的タンパク質を定量分析することができる。上記タンパク質信号増幅体は、プライマーとdNTPとDNA複製酵素とを含む水溶液であるが、これに、2本鎖DNAに対する特異的蛍光発光インタカレータを含ませておき、2本鎖DNA検出セクションでその蛍光を検出する方法が信頼性が高く、好ましい。 In the double-stranded DNA detection section, double-stranded DNA is detected, and any known method may be used. For example, as will be described later, the target protein can be quantitatively analyzed based on the time from the start of the introduction of the protein signal amplifier into the flow channel until the start of detection. The protein signal amplifying body is an aqueous solution containing a primer, dNTP, and a DNA replicating enzyme, which contains a specific fluorescence intercalator for double-stranded DNA, and in the double-stranded DNA detection section, A method for detecting fluorescence is preferable because of its high reliability.
ここで、2本鎖DNAに対する特異的蛍光発光インタカレータとは2本鎖DNAに特異的にインタカレーションし、その際、蛍光を発光する物質を意味する。特異的蛍光発光インタカレータとしては、サイバーグリーン1、YOYO1等を挙げることができる。なお、タンパク質信号増幅体には、この他、インタカレータの代わりに蛍光・消光一本短鎖DNA(taqman probe等)が含まれていてもよい。
Here, the specific fluorescence emitting intercalator for double-stranded DNA means a substance that specifically intercalates with double-stranded DNA and emits fluorescence. Examples of specific fluorescent light emitting intercalators include
このようにして、標的タンパク質の有する情報が情報伝達部とプライマーとを介して2本鎖DNAに伝えられるので、この2本鎖DNAを検出することで標的タンパク質を定量分析することが可能となる。従って、本発明により、DNAのアレイ化をしなくてもタンパク質の定量分析が可能となる。アレイ化のための加工費用が不要となるのでデバイスの製造コストの低減を図ることもできる。 In this way, since the information possessed by the target protein is transmitted to the double-stranded DNA via the information transmission part and the primer, the target protein can be quantitatively analyzed by detecting this double-stranded DNA. . Therefore, according to the present invention, it is possible to quantitatively analyze proteins without arraying DNA. Since the processing cost for arraying becomes unnecessary, the manufacturing cost of the device can be reduced.
なお、本発明において、「標的タンパク質の定量分析」とは、2本鎖DNA生成セクションに捕捉されている標的タンパク質の定量を意味するが、本発明を利用すれば、サンプル液中におけるタンパク質を2本鎖DNA生成セクションに捕捉させることにより、特定タンパク質の有無の確認および定量を行うことも可能である。 In the present invention, “quantitative analysis of target protein” means quantification of the target protein captured in the double-stranded DNA production section, but if the present invention is used, the protein in the sample solution is 2 It is also possible to confirm and quantify the presence or absence of a specific protein by capturing in the double-stranded DNA production section.
2本鎖DNA生成セクションには複数種類のタンパク質を同時に存在させてもよい。それぞれとの一対一対合を通じて、それぞれの標的タンパク質の情報を読み出し、それぞれの定量分析に供することができる。図2について説明すれば、図2の三つの標的タンパク質23がそれぞれ別種である場合には、三つの情報伝達部25も別種になり、従って、三種類の2本鎖DNAが生じ、それぞれの分析をすれば、それぞれの標的タンパク質の定量分析が可能となるのである。従って、本発明により、DNAのアレイ化をしなくても複数種のタンパク質の定量分析が可能となる。
Multiple types of proteins may be present simultaneously in the double-stranded DNA generation section. Information on each target protein can be read out through a pair-pair with each, and used for each quantitative analysis. Referring to FIG. 2, when the three
本発明に係るタンパク質検出デバイスは、2本鎖DNA生成セクションを並列に複数有するものであってもよい。タンパク質検出デバイスが複数あれば、複数のタンパク質の定量をより迅速に行うことができる。この場合、2本鎖DNA増幅セクションおよび/または2本鎖DNA検出セクションが複数あるものであってもよい。 The protein detection device according to the present invention may have a plurality of double-stranded DNA generation sections in parallel. If there are a plurality of protein detection devices, a plurality of proteins can be quantified more quickly. In this case, a plurality of double-stranded DNA amplification sections and / or double-stranded DNA detection sections may be provided.
次に、本発明に係るタンパク質の定量分析方法について説明する。本発明に係るタンパク質の定量分析方法は、流路中の基体に、標的タンパク質を特異的に捕捉するための、基体に結合した第一の結合部と、第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と標的タンパク質に特異的に会合し、情報伝達部が結合した第二の結合部とを有する構造体を結合し、外部から、流路中に、情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとdNTPとDNA複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、情報伝達部との相補作用による2本鎖DNAを生成し、その2本鎖DNAを増幅し、検出することで行うことができる。 Next, the protein quantitative analysis method according to the present invention will be described. The protein quantitative analysis method according to the present invention includes a first binding portion bound to a substrate and a target captured by the first binding portion for specifically capturing the target protein on the substrate in the flow path. A structure having a protein, a signal transmission part that corresponds to the target protein on a one-to-one basis and that can recognize a sequence by a primer, and a second binding part that specifically associates with the target protein and is bound to the information transmission part By supplying a protein signal amplifying body comprising a primer capable of recognizing the sequence of the information transmission unit, dNTP, and a DNA replication enzyme from the outside into the flow path, by a complementary action with the information transmission unit This can be done by generating double-stranded DNA, amplifying the double-stranded DNA, and detecting it.
本発明に係るタンパク質の定量分析方法は、上記のタンパク質検出デバイスを使用して実行することが好ましいが、他のデバイスを使用してもよいことはいうまでもない。たとえば、流路中に、基体と2本鎖DNA検出セクションとを有するデバイスについて、その基体に、標的タンパク質を特異的に捕捉するための第一の結合部と、第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と標的タンパク質に特異的に会合し、情報伝達部が結合した第二の結合部とを有する構造体を結合し、外部から、流路中に、情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとdNTPとDNA複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、上記と同様に2本鎖DNAを生成し、増幅し、検出することができる。 The protein quantitative analysis method according to the present invention is preferably performed using the protein detection device described above, but it goes without saying that other devices may be used. For example, for a device having a substrate and a double-stranded DNA detection section in the flow path, the substrate has a first binding part for specifically capturing the target protein, and is captured by the first binding part. Structure having a target protein, an information transmission part that has a one-to-one correspondence with the target protein and that can recognize the sequence by a primer, and a second binding part that specifically associates with the target protein and is bound to the information transmission part By binding a body and supplying a protein signal amplifying body comprising a primer capable of recognizing the sequence of the information transmitter, dNTP, and a DNA replication enzyme into the channel from the outside, two in the same manner as described above. Strand DNA can be generated, amplified and detected.
なお、本発明に係るタンパク質の定量分析方法における用語の意味および好ましい形態は上記の本発明に係るタンパク質検出デバイスにおける用語の意味および好ましい形態と同様に考えることができる。 The meaning and preferred form of the term in the protein quantitative analysis method according to the present invention can be considered in the same manner as the meaning and preferred form of the term in the protein detection device according to the present invention.
以下に、標的タンパク質の定量分析を具体的に例示すると次のようになる。 Specific examples of quantitative analysis of target proteins are as follows.
(1)あるサンプル中に特定のタンパク質Aが含まれているかどうかの確認
第一の結合体および第二の結合体として、タンパク質Aに特異的に結合または会合する抗体を選択し、情報伝達部として、タンパク質Aと一対一対応する核酸を選択し、このサンプルを使用して2本鎖DNA生成セクションを構成する作業を行う。このようにして得たタンパク質検出デバイスに、外部から、流路中に、上記情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとdNTPとDNA複製酵素と、特異的蛍光発光インタカレータとを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給して、2本鎖DNAを生成させる操作を行い、必要であれば2本鎖DNA増幅セクションを加熱し、2本鎖DNA検出セクションで、特異的蛍光発光インタカレータの発光の有無を検出する。この特異的蛍光発光インタカレータは、生成した2本鎖DNAとインタカレーションした場合にのみ蛍光を発するので、容易に生成した2本鎖DNAの有無を検出でき、従ってタンパク質Aの存否を判定できる。
(1) Confirmation of whether or not a specific protein A is contained in a certain sample An antibody that specifically binds or associates with protein A is selected as the first conjugate and the second conjugate, and the signal transmitter As described above, a nucleic acid corresponding one-to-one with protein A is selected, and the sample is used to construct a double-stranded DNA generation section. The protein detection device thus obtained comprises a protein comprising a primer capable of recognizing the sequence of the information transmission unit, dNTP, a DNA replicating enzyme, and a specific fluorescence emitting intercalator in the flow path from the outside. Supply signal amplifier to perform generation of double-stranded DNA, heat double-stranded DNA amplification section if necessary, and double-stranded DNA detection section emits light from specific fluorescence intercalator Detect the presence or absence. Since this specific fluorescence emitting intercalator emits fluorescence only when intercalated with the generated double-stranded DNA, the presence or absence of the generated double-stranded DNA can be easily detected, and therefore the presence or absence of protein A can be determined. .
(2)あるサンプル中に含まれる特定のタンパク質A量の測定
第一の結合体および第二の結合体として、タンパク質Aに特異的に結合または会合する抗体を選択し、情報伝達部として、タンパク質Aと一対一対応する核酸を選択し、それらの十分な量とこのサンプルを使用して2本鎖DNA生成セクションを構成する作業を行う。このようにして得たタンパク質検出デバイスに、外部から、流路中に、上記情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとdNTPとDNA複製酵素と、特異的蛍光発光インタカレータとを含んでなる、十分な量のタンパク質信号増幅体を供給し、必要であれば2本鎖DNA増幅セクションを加熱し、2本鎖DNA検出セクションで、特異的蛍光発光インタカレータの発光を検出する。
(2) Measurement of the amount of specific protein A contained in a sample As the first conjugate and the second conjugate, an antibody that specifically binds or associates with protein A is selected, and the protein is used as an information transmitter. Nucleic acids that correspond one-to-one with A are selected, and a sufficient amount of them and this sample are used to construct a double-stranded DNA production section. The protein detection device thus obtained comprises a primer capable of recognizing the sequence of the information transmission unit, dNTP, a DNA replication enzyme, and a specific fluorescence intercalator from the outside in the flow path. A sufficient amount of protein signal amplifier is supplied, the double stranded DNA amplification section is heated if necessary, and the luminescence of the specific fluorescence intercalator is detected in the double stranded DNA detection section.
発光は時間と共に指数関数的に増大するが、最初に2本鎖DNA生成セクションに捕捉された量が多いほど早く検出される。従って、2本鎖DNA検出セクションで、タンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間により、標的タンパク質を定量分析すれば、その量の多寡を測定することができる。この場合、タンパク質Aの濃度が既知のサンプルについてのタンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間と比較すれば、サンプル中の絶対量を知ることもできる。具体的には、通常、図3のような結果が得られるので、例えば蛍光強度が最大値の5%に達した時までの時間を採用して比較することができる。上記の十分な量は、使用量を変えて実験することにより容易に知ることができる。使用量が過剰であっても差し支えないので、大過剰量を使用することが実際的である。 Luminescence increases exponentially with time, but is detected earlier the higher the amount initially captured in the double-stranded DNA production section. Therefore, in the double-stranded DNA detection section, if the target protein is quantitatively analyzed according to the time from the start of loading the protein signal amplifier into the flow channel to the start of detection, the amount of the amount can be measured. . In this case, the absolute amount in the sample can also be known by comparing the time from the start of the introduction of the protein signal amplification body for the sample with a known protein A concentration into the flow channel to the start of detection. Specifically, since the result as shown in FIG. 3 is usually obtained, for example, the time until the fluorescence intensity reaches 5% of the maximum value can be adopted and compared. The above-mentioned sufficient amount can be easily known by experimenting by changing the amount used. It is practical to use a large excess, since it can be excessive.
本発明によって実現されるタンパク質検出デバイスおよびタンパク質の定量分析方法は、プロテオームチップ上へのタンパク質のライブラリ化への応用に最も期待できる。バイオメムスなどの検出器部分に、本発明に係るタンパク質検出デバイスを導入することにより、現在の微細加工の限界を超えた集積化が可能になり、低コスト化が可能になる。 The protein detection device and the protein quantitative analysis method realized by the present invention can be most expected for application to a protein library on a proteome chip. By introducing the protein detection device according to the present invention into a detector portion such as biomems, integration beyond the limits of current microfabrication becomes possible, and cost reduction is possible.
多種類のタンパク質を少量のサンプルから定量するという需要は様々な疾病において存在する。例えば糖尿病において肝細胞がインシュリンの受容状態に応じて細胞内グリコーゲン代謝を切り換えるなどの場合に、インシュリン受容体からグリコーゲン分解酵素に至る一連のタンパク質相互作用ネットワークの一部が低下ないし昂進していることを捉えようとするものがある。本件技術を使うことによって、リン酸化や糖鎖付加などのいわゆる翻訳後修飾も含めて、タンパク質のポピュレーションを捉えることが可能になるであろう。 The demand for quantifying many types of proteins from small samples exists in various diseases. For example, in diabetes, when hepatocytes switch intracellular glycogen metabolism according to the state of insulin reception, part of a series of protein interaction networks from the insulin receptor to glycogenolytic enzymes is reduced or promoted. There is something that tries to catch. By using this technology, it will be possible to capture the population of proteins, including so-called post-translational modifications such as phosphorylation and glycosylation.
これにより、従来のように症状として現れた現象を大括りにして糖尿病と捉えるのではなく、相互作用ネットワークに係わるある特定のタンパク質の機能低下が糖代謝の不全を起こしているなどを把握できるようになり、機能不全の原因に対応して適切な診断と治療、ならびに治療結果の検証が可能になる。 As a result, it is possible to grasp that the decline in the function of a specific protein related to the interaction network causes the failure of glucose metabolism, instead of comprehending the phenomenon that appears as a symptom as in the past as diabetes. Thus, it becomes possible to appropriately diagnose and treat the cause of the malfunction and to verify the treatment result.
もちろん同様の手法は、糖尿病に限らず、高血圧症、高脂血症やその他の多因子性疾患全般に対して適用が可能である。 Of course, the same technique is applicable not only to diabetes but also to hypertension, hyperlipidemia and other multifactorial diseases in general.
次に本発明の実施例及び比較例を詳述するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。 Next, although the Example and comparative example of this invention are explained in full detail, this invention is not limited by these.
[実施例1]
(cDNAの定量)
ラット肝臓組織からの末端チオール化オリゴ(dT)プライマーを用いてGubler and Hoffman法に基づいてcDNAを基体上に結合させた。
[Example 1]
(Quantification of cDNA)
CDNA was bound onto the substrate based on the Gubler and Hoffman method using terminal thiolated oligo (dT) primers from rat liver tissue.
アミノ末端磁気ビーズを2官能性(マレイイミド−スクシンイミド)試薬で処理してアミノ末端とスクシンイミド基とを反応させ、ビーズの表面にマレインイミド官能基を露出させた状態にした後、マレイミド基と上記チオール基とを反応させることによりcDNAライブラリーを基体上に固定した。 The amino-terminated magnetic beads are treated with a bifunctional (maleimide-succinimide) reagent to react the amino terminus with the succinimide group so that the maleimide functional group is exposed on the surface of the bead. The cDNA library was immobilized on the substrate by reacting with the group.
本操作の代わりに好熱細菌由来のアビジンがコートされた磁気ビーズと末端ビオチン化オリゴ(dT)プライマーを用いることでも同様のことが可能である。 The same can be done by using magnetic beads coated with avidin derived from thermophilic bacteria and terminal biotinylated oligo (dT) primers instead of this operation.
本基体を用いてcDNA濃度が各々2桁以上異なる3組のcDNAについてその定量を試みた。DNA逐次読み出しはICAN法を用いることにより行った。結果は、図3について説明した場合と同様に、3組の間にはっきりとした差が認められた。 Using this substrate, an attempt was made to quantify three sets of cDNAs each having a cDNA concentration that differs by 2 digits or more. DNA sequential reading was performed by using the ICAN method. The results showed a clear difference between the three sets, similar to the case described for FIG.
本例は、タンパク質を使用せず、情報伝達部としてのcDNAを直接基体に結合させた例であるが、本発明では、情報伝達部がタンパク質と一対一対応するので、本例から、タンパク質を使用した場合にも同様の効果が得られることが容易に理解される。 In this example, no protein is used and cDNA as an information transmission part is directly bound to a substrate. However, in the present invention, the information transmission part has a one-to-one correspondence with the protein. It is easily understood that the same effect can be obtained when used.
[実施例2]
(タンパク質の定量)
図4に模式的に示した流路を有するタンパク質検出デバイス4を使用した。基体21として、アマシャムバイオサイエンス社製のビーズを使用した。
[Example 2]
(Quantification of protein)
A
このような構成で、2本鎖DNA生成セクション1を挟んで、インレット41−アウトレット42間に、N末ビオチン修飾一本鎖GST抗体(ScFv)溶液を流した後に決まった濃度のGSTを流し、第一の結合部としてのGST抗体と標的タンパク質としてのGSTを結合させた複合体を基体に結合した。
In such a configuration, after a N-terminal biotin-modified single-strand GST antibody (ScFv) solution is flowed between the inlet 41 and the
ついで、インレット41−アウトレット42間に、RNA標識されており、GSTに特異的に会合する抗体の水溶液を流した後、インレット41−アウトレット42間およびインレット43−アウトレット42間をバッファー液で洗浄した。このRNAが本発明に係る情報伝達部、抗体が本発明に係る第二の結合部に該当する。この抗体-RNAコンジュゲートはN末6-alkylguanine-DNA alkyltransferase融合scFvと5’末端6-アルキルグアニン修飾RNAから合成した。その結果、標的タンパク質の配列情報に対応した配列情報を有することになる。このようにして、2本鎖DNA生成セクション1(図4上、2本鎖DNA生成セクション1は基体21と同一個所に見えている。)を完成した。
Next, an aqueous solution of an antibody that is labeled with RNA and specifically associates with GST was passed between the inlet 41 and the
ついで、インレット41−アウトレット44間に、RNA−DNAキメラプライマー,dNTP、RNAaseH、鎖置換型DNAポリメレース(ICAN法試薬)、AMV逆転写酵素およびSYBR green 1を含む水溶液を流し、生成する2本鎖DNAの量をSYBR greenを用いることにより、蛍光を検出できる2本鎖DNA検出セクション3を使用して定量した。上記水溶液が、本発明に係るタンパク質信号増幅体、SYBR green 1が、本発明に係る、2本鎖DNAに対する特異的蛍光発光インタカレータである。2本鎖DNA生成セクション1から2本鎖DNA検出セクション3までの流路45が、本発明に係る2本鎖DNA増幅セクション2に該当する。タンパク質検出デバイスは、2本鎖DNA生成セクション1は37℃に、それ以外は60℃に維持した。
全ての操作の間、室温に保った。
Subsequently, an aqueous solution containing an RNA-DNA chimera primer, dNTP, RNAaseH, strand displacement DNA polymerase (ICAN method reagent), AMV reverse transcriptase and SYBR green 1 is allowed to flow between the inlet 41 and the
It was kept at room temperature during all operations.
結果は、図3と同様に濃度と代謝時間に相関関係が認められた。 As in the results shown in FIG. 3, there was a correlation between concentration and metabolic time.
[実施例3]
(タンパク質の定量)
実施例2と同じ図4に模式的に示した構成で、2本鎖DNA生成セクション1を挟んで、インレット41−アウトレット42間に、N末ビオチン修飾一本鎖GST抗体(ScFv)とN末ビオチン修飾一本鎖GFP抗体(ScFv)混合溶液を流し、更にGSTとGFPの混合物を流した後についで、インレット41−アウトレット42間に、RNA標識されており、GSTに特異的に会合する抗体及びRNA標識されており、GFPに特異的に会合する抗体の水溶液を流した後、実施例2と同様の手法でGSTについて定量し、bufferで洗浄し、同様の手法でGFPについて定量した。
[Example 3]
(Quantification of protein)
4 having the same structure as that of Example 2, the N-terminal biotin-modified single-strand GST antibody (ScFv) and the N-terminal are interposed between the inlet 41 and the
なお、上記に開示した内容から、下記の付記に示した発明が導き出せる。 In addition, the invention shown to the following additional remarks can be derived from the content disclosed above.
(付記1)
流路中に、
基体と、
標的タンパク質を特異的に捕捉するための、当該基体に結合した第一の結合部と、
当該第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、
当該標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と、
当該標的タンパク質に特異的に会合し、当該情報伝達部と結合した第二の結合部と
を有する2本鎖DNA生成セクションと、
生成した2本鎖DNAを増幅するための2本鎖DNA増幅セクションと、
増幅した2本鎖DNAを検出するための2本鎖DNA検出セクションと
を有するタンパク質検出デバイス。
(Appendix 1)
In the flow path
A substrate;
A first binding moiety bound to the substrate for specifically capturing a target protein;
A target protein captured by the first binding site;
An information transmission unit that has a one-to-one correspondence with the target protein and that can recognize the sequence with a primer;
A double-stranded DNA generating section that specifically associates with the target protein and has a second binding portion bound to the signaling portion;
A double-stranded DNA amplification section for amplifying the generated double-stranded DNA;
A protein detection device having a double-stranded DNA detection section for detecting amplified double-stranded DNA.
(付記2)
外部から、前記流路中に、前記情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとdNTPとDNA複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、前記情報伝達部との相補作用により2本鎖DNAを生成し、かつ当該2本鎖DNAを増幅することのできる、付記1に記載のタンパク質検出デバイス。
(Appendix 2)
By supplying a protein signal amplifying body comprising a primer capable of recognizing the sequence of the information transmission unit, dNTP, and a DNA replication enzyme into the channel from the outside, by a complementary action with the information transmission unit The protein detection device according to
(付記3)
前記2本鎖DNA増幅セクションが加熱可能である、付記1または2に記載のタンパク質検出デバイス。
(Appendix 3)
The protein detection device according to
(付記4)
前記2本鎖DNA検出セクションが、前記タンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間により、前記標的タンパク質を定量分析できる、付記1〜3のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
(Appendix 4)
The double-stranded DNA detection section according to any one of
(付記5)
前記第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が抗体を含んでなる、付記1〜4のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
(Appendix 5)
The protein detection device according to any one of
(付記6)
前記第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が、前記基体、標的タンパク質および情報伝達部からなる群から選ばれた少なくとも一つと、アビジン−ビオチン結合、オリゴヒスチジン−金属錯体結合またはhAGTとアルキルグアニン誘導体によって生じる結合で結合している、付記1〜5のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
(Appendix 6)
At least one of the first binding part and the second binding part is at least one selected from the group consisting of the substrate, the target protein, and the information transmission part, an avidin-biotin bond, and an oligohistidine-metal complex. The protein detection device according to any one of
(付記7)
前記情報伝達部が核酸である、付記1〜6のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
(Appendix 7)
The protein detection device according to any one of
(付記8)
前記タンパク質信号増幅体が、2本鎖DNAに対する特異的蛍光発光インタカレータを含む、付記1〜7のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
(Appendix 8)
The protein detection device according to any one of
(付記9)
前記2本鎖DNA検出セクションが蛍光を検出する能力を有する、付記1〜8のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
(Appendix 9)
The protein detection device according to any one of
(付記10)
前記2本鎖DNA生成セクションを並列に複数有する、付記1〜9のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
(Appendix 10)
The protein detection device according to any one of
(付記11)
流路中の基体に、
標的タンパク質を特異的に捕捉するための、当該基体に結合した第一の結合部と、
当該第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、
当該標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と
当該標的タンパク質に特異的に会合し、当該情報伝達部と結合した第二の結合部と
を有する構造体を結合し、
外部から、当該流路中に、当該情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとdNTPとDNA複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、当該情報伝達部との相補作用による2本鎖DNAを生成し、
当該2本鎖DNAを増幅し、検出する
タンパク質の定量分析方法。)
(付記12)
前記2本鎖DNA生成後の増幅段階で加熱する、付記11に記載のタンパク質の定量分析方法。
(Appendix 11)
On the substrate in the channel,
A first binding moiety bound to the substrate for specifically capturing a target protein;
A target protein captured by the first binding site;
A structure having an information transmission part that has a one-to-one correspondence with the target protein and that can recognize a sequence with a primer, and a second binding part that specifically associates with the target protein and binds to the information transmission part Combine and
By supplying a protein signal amplifying body comprising a primer capable of recognizing the sequence of the information transmission unit, dNTP, and a DNA replication enzyme into the channel from the outside, by a complementary action with the information transmission unit Producing double stranded DNA,
A method for quantitative analysis of a protein in which the double-stranded DNA is amplified and detected. )
(Appendix 12)
12. The method for quantitative analysis of protein according to appendix 11, wherein heating is performed in an amplification step after the generation of the double-stranded DNA.
(付記13)
前記検出段階で、前記タンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間により、前記標的タンパク質を定量分析する、付記11または12に記載のタンパク質の定量分析方法。
(Appendix 13)
13. The protein quantitative analysis method according to appendix 11 or 12, wherein in the detection step, the target protein is quantitatively analyzed based on a time from when the protein signal amplification body is introduced into the flow channel to when detection is started.
(付記14)
前記第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が抗体を含んでなる、付記11〜13のいずれかに記載のタンパク質の定量分析方法。
(Appendix 14)
The protein quantitative analysis method according to any one of appendices 11 to 13, wherein at least one of the first binding portion and the second binding portion includes an antibody.
(付記15)
前記第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が、前記基体、標的タンパク質および情報伝達部からなる群から選ばれた少なくとも一つと、アビジン−ビオチン結合、オリゴヒスチジン−金属錯体結合またはhAGTとアルキルグアニン誘導体によって生じる結合で結合している、付記11〜14のいずれかに記載のタンパク質の定量分析方法。
(Appendix 15)
At least one of the first binding part and the second binding part is at least one selected from the group consisting of the substrate, the target protein, and the information transmission part, an avidin-biotin bond, and an oligohistidine-metal complex. The method for quantitative analysis of a protein according to any one of appendices 11 to 14, wherein the protein is bound by a bond or a bond generated by hAGT and an alkylguanine derivative.
(付記16)
前記情報伝達部が核酸である、付記11〜15のいずれかに記載のタンパク質の定量分析方法。
(Appendix 16)
The method for quantitative analysis of protein according to any one of appendices 11 to 15, wherein the information transmission unit is a nucleic acid.
(付記17)
前記タンパク質信号増幅体が、2本鎖DNAに対する特異的蛍光発光インタカレータを含む、付記11〜16のいずれかに記載のタンパク質の定量分析方法。
(Appendix 17)
The protein quantitative analysis method according to any one of appendices 11 to 16, wherein the protein signal amplifier includes a specific fluorescent intercalator for double-stranded DNA.
(付記18)
前記検出段階で蛍光を検出する、付記11〜17のいずれかに記載のタンパク質の定量分析方法。
(Appendix 18)
18. The method for quantitative analysis of protein according to any one of appendices 11 to 17, wherein fluorescence is detected in the detection step.
1 2本鎖DNA生成セクション
2 2本鎖DNA増幅セクション
3 2本鎖DNA検出セクション
4 タンパク質検出デバイス
5 流路
21 基体
22 第一の結合部
23 標的タンパク質
24 第二の結合部
25 情報伝達部
26 構造体
41 インレット
42 アウトレット
43 インレット
44 アウトレット
45 流路
DESCRIPTION OF
Claims (8)
基体と、
標的タンパク質を特異的に捕捉するための、当該基体に結合した第一の結合部と、
当該第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、
当該標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と、
当該標的タンパク質に特異的に会合し、当該情報伝達部と結合した第二の結合部と
を有する2本鎖DNA生成セクションと、
生成した2本鎖DNAを増幅するための2本鎖DNA増幅セクションと、
増幅した2本鎖DNAを検出するための2本鎖DNA検出セクションと
をこの順に有するタンパク質検出デバイスであって、
外部から、前記流路中に、前記情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとdNTPとDNA複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、前記情報伝達部との相補作用により2本鎖DNAを生成し、かつ当該2本鎖DNAを増幅することのでき、
前記2本鎖DNA検出セクションが、前記タンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間により、前記標的タンパク質を定量分析できる、
タンパク質検出デバイス。 In the flow path
A substrate;
A first binding moiety bound to the substrate for specifically capturing a target protein;
A target protein captured by the first binding site;
An information transmission unit that has a one-to-one correspondence with the target protein and that can recognize the sequence with a primer;
A double-stranded DNA generating section that specifically associates with the target protein and has a second binding portion bound to the signaling portion;
A double-stranded DNA amplification section for amplifying the generated double-stranded DNA;
A protein detection device having, in this order, a double-stranded DNA detection section for detecting amplified double-stranded DNA ,
By supplying a protein signal amplifying body comprising a primer capable of recognizing the sequence of the information transmission unit, dNTP, and a DNA replication enzyme into the channel from the outside, by a complementary action with the information transmission unit Producing double-stranded DNA and amplifying the double-stranded DNA;
The double-stranded DNA detection section can quantitatively analyze the target protein according to the time from the start of loading the protein signal amplifier into the flow channel until the start of detection.
Protein detection device .
標的タンパク質を特異的に捕捉するための、当該基体に結合した第一の結合部と、
当該第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、
当該標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と
当該標的タンパク質に特異的に会合し、当該情報伝達部と結合した第二の結合部と
を有する構造体を結合し、
外部から、当該流路中に、当該情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとdNTPとDNA複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を当該流路に沿って供給することにより、当該情報伝達部との相補作用による2本鎖DNAを生成し、
その後、当該2本鎖DNAを増幅し、検出する
タンパク質の定量分析方法。 On the substrate in the channel,
A first binding moiety bound to the substrate for specifically capturing a target protein;
A target protein captured by the first binding site;
A structure having an information transmission part that has a one-to-one correspondence with the target protein and that can recognize a sequence with a primer, and a second binding part that specifically associates with the target protein and binds to the information transmission part Combine and
By supplying a protein signal amplifier comprising a primer capable of recognizing the sequence of the information transmission unit, dNTP, and DNA replication enzyme from the outside along the channel, the information transmission is performed. To generate double-stranded DNA by complementary action with
Thereafter, a method for quantitative analysis of the protein in which the double-stranded DNA is amplified and detected.
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