JP4244788B2 - Substrate on which a selective binding substance is immobilized - Google Patents
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Description
本発明は、被検物質と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性
物質」）を固定化した基材に関する。
The present invention relates to a substrate on which a substance that selectively binds to a test substance (“selective binding substance” in the present specification) is immobilized.
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能については、各種の方法で調べることができる。主なものとしては、核酸についてはノーザンハイブリダイゼーション、あるいはサザンハイブリダイゼーションのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質については、ウエスタンハイブリダイゼーションに代表されるような、蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。 Research on genetic information analysis of various organisms has been started, and information on many genes and their base sequences including human genes, proteins encoded by the gene sequences, and sugar chains that are secondarily produced from these proteins Is being revealed rapidly. The functions of macromolecules such as genes, proteins, and sugar chains whose sequences have been clarified can be examined by various methods. Mainly, with respect to nucleic acids, the relationship between various genes and their expression of biological functions can be examined by utilizing complementarity between various nucleic acids / nucleic acids such as Northern hybridization or Southern hybridization. With respect to proteins, the function and expression of proteins can be examined using protein / protein reactions, as typified by Western hybridization.
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法としてＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開発され、注目を集めている。これらの方法は、いずれも核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じであり、蛋白質／蛋白質間あるいは糖鎖／糖鎖間や糖鎖／蛋白質間のハイブリダイゼーションに基づく蛋白質や糖鎖検出・定量にも応用が可能ではある。これらの技術は、マイクロアレイ又はチップと呼ばれる平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。マイクロアレイ法の具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度解析装置で高速に読みとる方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。こうして、サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。 In recent years, a new analysis method or methodology called a DNA microarray method (DNA chip method) has been developed and attracted attention as a method for analyzing many gene expressions at once. In principle, these methods are the same as conventional methods in that they are nucleic acid detection and quantification methods based on nucleic acid / nucleic acid hybridization reactions, and are performed between proteins / proteins or between sugar chains / sugar chains and sugars. It can also be applied to the detection and quantification of proteins and sugar chains based on hybridization between chains / proteins. These techniques have a great feature in that a large number of DNA fragments, proteins, and sugar chains are aligned and fixed at high density on a flat substrate piece called a microarray or chip. As a specific method of using the microarray method, for example, a sample obtained by labeling an expression gene of a cell to be studied with a fluorescent dye or the like is hybridized on a flat substrate piece, and complementary nucleic acids (DNA or RNA) are bound to each other. There are a method of reading the part at high speed with a high resolution analyzer and a method of detecting a response such as a current value based on an electrochemical reaction. Thus, the amount of each gene in the sample can be quickly estimated.
核酸を基板上に固定化するための技術としては、上記ノーザン法同様、ナイロンシート等の上に高密度に固定化する方法の他、更に密度を高めるため、スライドガラス等の平坦な基板の上にポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン等をコーティングして、スポッターと呼ばれる点着装置を用いて、各核酸を固定化する方法などが開発されている（例えば、特許文献１参照。）。 As a technique for immobilizing nucleic acid on a substrate, as in the Northern method, in addition to a method of immobilizing on a nylon sheet or the like at a high density, on a flat substrate such as a glass slide to further increase the density. A method has been developed in which poly-L-lysine, aminosilane and the like are coated on each of the nucleic acids and a nucleic acid is immobilized using a spotting device called a spotter (see, for example, Patent Document 1).
しかし、従来のＤＮＡチップでは、ハイブリダイゼーションを行った時、どうしてもスポット以外の部分に非特異的に検体試料が吸着してしまう。そしてスキャナーと呼ばれる装置で蛍光検出を行う際、この非特異的に吸着した検体をも検出し、ノイズが大きくなり、結果的にＳ／Ｎが悪くなるといった問題があった。 However, in the conventional DNA chip, when hybridization is performed, the specimen sample is inevitably adsorbed nonspecifically on a portion other than the spot. When fluorescence detection is performed with an apparatus called a scanner, this non-specifically adsorbed specimen is also detected, resulting in a problem that noise increases and consequently S / N deteriorates.
また、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン処理を行ったスライドガラス等の平坦な固体表面にスポッターを用いて核酸をスポットする場合、各スポットの大きさがばらつき、後の解析に支障をきたす問題点がある。 In addition, when spotting nucleic acids on a flat solid surface such as a slide glass treated with poly-L-lysine or aminosilane using a spotter, the size of each spot varies, which hinders subsequent analysis. There is.
このような問題を解決するため、例えば二本鎖核酸に特異的にインターカレートする試薬を用い、ハイブリダイゼーション後に、この酸化電流を測定してハイブリダイゼーションした核酸の定量を行う方法などが提案されている（例えば特許文献２参照）。しかし、この方法では、蛍光スキャナーを用いることが不可能であり、特殊な装置が必要であると行った問題点があった。 In order to solve such problems, for example, a method for measuring the oxidation current after hybridization using a reagent that specifically intercalates with a double-stranded nucleic acid and quantifying the hybridized nucleic acid has been proposed. (For example, refer to Patent Document 2). However, this method has a problem that it is impossible to use a fluorescent scanner and a special device is required.
また、基材の凸部にＤＮＡを固定化した例もあるが、この方法では、後述する理由のため蛍光スキャナーで読みとることが困難である（例えば、特許文献３参照）。 In addition, there is an example in which DNA is immobilized on the convex portion of the base material, but with this method, it is difficult to read with a fluorescent scanner for the reason described later (see, for example, Patent Document 3).
蛋白質や糖鎖を用いたマイクロアレイについても、これら核酸を用いたマイクロアレイ同様の問題点がある。
本発明が解決しようとする課題は、上記のようなＳ／Ｎの悪化を防ぎ、検出感度の高い選択結合性物質が固定化された基材を提供することである。また、このような利点を備えつつも、新たな特殊な装置を用いることなく検出可能な選択結合性物質が固定化された基板を提供することである。 The problem to be solved by the present invention is to provide a base material on which a selective binding substance with high detection sensitivity is immobilized while preventing the deterioration of S / N as described above. It is another object of the present invention to provide a substrate on which a selective binding substance that can be detected without using a new special apparatus is fixed while having such advantages.
また、各スポットのばらつきが小さい選択結合性物質が固定化された基材を提供することである。 Another object of the present invention is to provide a base material on which a selective binding substance with small variation in each spot is immobilized.
すなわち、本発明は、選択結合性物質が固定化された基材であって、該基材には凹凸部が設けられており、選択結合性物質が凹凸部の複数の凸部に固定化され、少なくとも該凸部の側面に導電性材料が設けられている、選択結合性物質が固定化された基材である。
That is, the present invention is a substrate on which a selective binding substance is immobilized, the substrate is provided with uneven portions, and the selective binding substance is immobilized on a plurality of convex portions of the uneven portions. In addition, the substrate is provided with a conductive material provided at least on the side surface of the convex portion, on which the selective binding substance is immobilized.
本発明により、Ｓ／Ｎが良好な選択結合性物質が固定化された基材を提供することができる。また、ハイブリダイゼーションの高速化も可能である。 According to the present invention, it is possible to provide a substrate on which a selective binding substance having a good S / N is immobilized. In addition, hybridization can be accelerated.
本発明の選択結合性物質が固定化される基材は、選択結合性物質が固定化される凹凸部があり、凸部上面に選択性適合物質が固定化されている必要がある。このような構造を取ることにより、検出の際、後述のように非特異的に吸着した検体を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的にＳ／Ｎが良好な選択結合性物質が固定化された基材を提供することができる。そして、凹凸部の複数の凸部の高さに関しては、凸部の上面の高さが略同一であるであることが好ましい。ここで、高さが略同一とは、多少高さの違う凸部の表面に選択結合性物質を固定化し、これと蛍光標識した被検体とを反応させ、そして、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。具体的に高さが略同一とは、高さの差が１００μｍより小さいことをいう。さらに本発明の基材には、平坦部が設けられていることが好ましい。具体例を図１、図２に示す。１が平坦部であり、かつ、２で示される凹凸部の凸部上面に選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。そして、該凹凸部の凸部分の上面が実質的に平坦であることが好ましい。ここで凸部上面の実質的に平坦とは、５０μｍ以上の凹凸がないことを意味する。さらに、凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さが略同一である。ここで、平坦部と凹凸部との高さが略同一とは、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの低下具合が問題とならない高さをいう。具体的に高さの差が略同一とは、凹凸部凸部上面の高さと、平坦部の高さとの差が１００μｍより小さいことをいう。
The base material on which the selective binding substance of the present invention is immobilized has an uneven portion on which the selective binding substance is immobilized, and the selectivity compatible substance needs to be immobilized on the upper surface of the convex portion. By taking such a structure, upon detection, since there is no possible to detect an analyte non-specifically adsorbed as described below, the noise is small, resulting in S / N good selective binding substance There can be provided an immobilized substrate. And about the height of the some convex part of an uneven | corrugated | grooved part, it is preferable that the height of the upper surface of a convex part is substantially the same. Here, when the height is substantially the same, a selective binding substance is immobilized on the surface of a convex part having a slightly different height, and this is reacted with a fluorescently labeled analyte, and then scanned with a scanner. The height at which the difference in signal level strength does not matter. Specifically, “the heights are substantially the same” means that the difference in height is less than 100 μm. Furthermore, it is preferable that the base material of this invention is provided with the flat part. Specific examples are shown in FIGS. 1 is a flat portion, and a selective binding substance (for example, nucleic acid) is immobilized on the upper surface of the convex portion of the concavo-convex portion indicated by 2. And it is preferable that the upper surface of the convex part of this uneven | corrugated | grooved part is substantially flat. Here, “substantially flat on the upper surface of the convex portion” means that there is no irregularity of 50 μm or more. Furthermore, the height of the upper surface of the convex portion of the concavo-convex portion and the height of the flat portion are substantially the same. Here, the heights of the flat portion and the uneven portion are substantially the same height when the signal level is not lowered when scanned by the scanner. Specifically, the difference in height is substantially the same, which means that the difference between the height of the upper surface of the concavo-convex portion convex portion and the height of the flat portion is smaller than 100 μm.
一般に、マイクロアレイは、蛍光標識化された検体と基材に固定化された選択結合性物質とを反応させ、スキャナーと呼ばれる装置で蛍光を読みとることが一般的である。スキャナーは励起光であるレーザー光を対物レンズで絞り込み、レーザー光を集光する。そして、何らかの方法でマイクロアレイ表面でレーザービームをフォーカスして集光させ、このフォーカス条件を保持して、対物レンズもしくは、マイクロアレイ自体を走査することによりマイクロアレイから発生する蛍光を読み込むような仕組みとなっていることが多い。従って、少なくとも、本発明の選択性結合物質を固定化した凸部の上面の高さは、略同一であることが好ましい。もしも、選択結合性を固定化した凸部上面の高さが大きく違えば、それぞれの凸部上面にて集光されたレーザー光の大きさにばらつきが生じ（ぼやけてしまい）、最悪の場合、ある凸部上面では全くシグナルを検出できなくなることがある。 In general, a microarray generally reacts a fluorescently labeled specimen with a selective binding substance immobilized on a substrate and reads fluorescence with a device called a scanner. The scanner condenses the laser light by narrowing down the laser light as excitation light with an objective lens. Then, the laser beam is focused and condensed on the surface of the microarray by some method, and this focusing condition is maintained, and the fluorescence generated from the microarray is read by scanning the objective lens or the microarray itself. There are many. Therefore, it is preferable that at least the height of the upper surface of the convex portion on which the selective binding substance of the present invention is immobilized is substantially the same. If the height of the upper surface of the convex portion with fixed selective connectivity is greatly different, the size of the laser beam collected on the upper surface of each convex portion will vary (blur), and in the worst case, A signal may not be detected at all on the upper surface of a certain convex portion.
なお、マイクロアレイの表面に励起光の焦点を合わせる際には、マイクロアレイの隅で励起光の焦点を合わせるか、図３に示すように、治具にマイクロアレイを突き当て、レーザー光の焦点をマイクロアレイ表面にあわせる。そして、その条件のまま、マイクロアレイ全体をスキャンすることが多い。 When the excitation light is focused on the surface of the microarray, the excitation light is focused at the corner of the microarray, or as shown in FIG. 3, the microarray is abutted against a jig and the laser beam is focused on the surface of the microarray. To suit. In many cases, the entire microarray is scanned with this condition.
本発明の選択結合性物質を固定化する基材をスキャンする場合は、いったん平坦部の上面で励起光の焦点を合わせたり、平坦部を治具に突き当てることが可能である。このようにして、平坦部で励起光の焦点を合わせるので、選択結合性物質が固定化された凸部の上面は、平坦であり、かつ、凸部上面の高さと平坦部の高さが略同一であることが好ましい。 When scanning the base material on which the selective binding substance of the present invention is immobilized, it is possible to focus the excitation light once on the upper surface of the flat part or to hit the flat part against a jig. In this way, since the excitation light is focused on the flat portion, the upper surface of the convex portion on which the selective binding substance is immobilized is flat, and the height of the upper surface of the convex portion and the height of the flat portion are substantially the same. It is preferable that they are the same.
凸部の上面の高さと平坦部の高さの差が大きく違えば、以下のような問題点が生じることが多い。すなわち、励起光の焦点は平坦部の上面で調整されているので、凸部の上面の高さが異なると、凸部上面での励起光の焦点がぼやけてしまい、最悪の場合、選択結合性物質と検体が反応したことによる蛍光が全く検出されないことが起こりうる。 If the difference between the height of the upper surface of the convex part and the height of the flat part is greatly different, the following problems often occur. That is, since the focal point of the excitation light is adjusted on the upper surface of the flat part, if the height of the upper surface of the convex part is different, the focal point of the excitation light on the upper surface of the convex part is blurred. It may happen that no fluorescence due to the reaction between the substance and the analyte is detected.
また、凸部の上面が平坦でない場合、凸部上面での励起光の焦点の大きさにばらつきが起き、結果的に１つの凸部上面内で検出された蛍光の強さにむらが発生する。こうなると、後の解析が困難となる。従って、凸部上面は平坦であることが好ましく、この場合は、上記のような問題は起きず、良好なシグナル（蛍光）を得ることが可能である。 In addition, when the upper surface of the convex portion is not flat, the focal spot size of the excitation light on the upper surface of the convex portion varies, and as a result, the intensity of fluorescence detected in one upper surface of the convex portion varies. . If this happens, later analysis becomes difficult. Therefore, the upper surface of the convex portion is preferably flat. In this case, the above-described problem does not occur and a good signal (fluorescence) can be obtained.
また、複数の凸部の高さのばらつきに関して、詳しく述べれば、選択結合性物質が固定化された凸部の上面の高さが、略同一であれば、本発明の効果は得られるが、好ましくは、選択結合性物質が固定化された複数の凸部の内、最も高い凸部の高さと、最も低い凸部の高さの差が５０μｍ以下であることが好ましい。より好ましくは、３０μｍ以下であることがより好ましく、凸部の上面の高さと平坦部分の高さが同一であればなお好ましい。なお、本願でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。
Further, regarding the variation in the height of the plurality of convex portions, the effect of the present invention can be obtained if the height of the upper surface of the convex portion to which the selective binding substance is immobilized is substantially the same, Preferably, the difference between the height of the highest convex portion and the height of the lowest convex portion among the plurality of convex portions to which the selective binding substance is immobilized is preferably 50 μm or less. More preferably, it is more preferably 30 μm or less, and still more preferably if the height of the upper surface of the convex portion is the same as the height of the flat portion. In addition, the same height as used in this application shall also include the error by the dispersion | variation which generate | occur | produces by production etc.
なお、選択結合性物質が固定化された複数の凸部とは、データとして必要な選択結合性物質（例えば核酸）が固定化された凸部をいうのであって、何も固定化していない凸部や、ただ単にダミーの選択結合性物質を固定化した凸部は除く。 The plurality of convex portions on which the selective binding substance is immobilized refers to convex portions on which a selective binding substance (for example, nucleic acid) required as data is immobilized, and nothing is immobilized. And convex portions where only a dummy selective binding substance is immobilized are excluded.
また、本発明の選択結合性物質固定化された基材の凸部の上面の高さと平坦部分の高さの差は、略同一であれば良いが、好ましくは５０μｍ以下であり、３０μｍ以下であることがより好ましく、凸部の上面の高さと平坦部分の高さが同一であればなお好ましい。なお、本願でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。
Further, the difference between the height of the upper surface of the convex portion and the height of the flat portion of the base material on which the selective binding substance of the present invention is fixed may be substantially the same, but is preferably 50 μm or less, preferably 30 μm or less. more preferably in still preferable if high Saga same height as the flat portion of the upper surface of the convex portion. In addition, the same height as used in this application shall also include the error by the dispersion | variation which generate | occur | produces by production etc.
また本発明では、平面上の基材に選択結合性物質を点着するのではなく、凹凸部分の凸部上面にのみ選択結合性物質を固定化している。したがって、凸部上面以外の部分に非特異的に検体試料が吸着しても、凸部上面以外の部分では、励起光の焦点がぼやけてるため、望まざる非特異的な吸着をした検体試料からの蛍光を検出することがない。このため、ノイズが小さくなり、結果的にＳ／Ｎが良くなるという効果を発揮する。 Further, in the present invention, the selective binding substance is immobilized only on the upper surface of the convex part of the concavo-convex part, instead of spotting the selective binding substance on the substrate on the plane. Therefore, even if the specimen sample is non-specifically adsorbed on a portion other than the top surface of the convex portion, the focus of the excitation light is blurred on the portion other than the top surface of the convex portion. No fluorescence is detected. For this reason, the noise is reduced, and as a result, the S / N ratio is improved.
このような構造を取ることにより、検出の際、前記の非特異的に吸着した検体を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的にＳ／Ｎが良好な選択結合性物質が固定化された基材を提供することができる。
By taking such a structure, upon detection, since there is no possible to detect the non-specifically adsorbed analyte of the noise is small, resulting in S / N good selective binding substance is fixed A structured substrate can be provided.
また、凸部の上面の面積は略同一であることが好ましい。このようにすることにより、多種の選択結合性物質が固定化される部分の面積を同一にできるので、後の解析に有利である。ここで、凸部の上部の面積が略同一とは、凸部の中で最も大きい上面面積を、最も小さい上面面積で割った値が１．２以下であることを言う。 Moreover, it is preferable that the area of the upper surface of a convex part is substantially the same. By doing in this way, the area of the part by which various selective binding substances are immobilized can be made the same, which is advantageous for later analysis. Here, the area of the upper part of the convex part is substantially the same means that the value obtained by dividing the largest upper surface area in the convex part by the smallest upper surface area is 1.2 or less.
基材の材質としては、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを拳げることができる。本願のような形状を持つ基材の製造方法としては、プラスチックの場合、射出成形法や、ホットエンボス法、ガラスやセラミックの場合、サンドブラスト法、シリコンの場合は公知の半導体プロセスなどで作製できる。この中でも、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマー、ガラス、シリコンを特に好ましく用いることができる。 Examples of the material of the base material include glass, ceramics, inorganic materials such as silicon, polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate, polystyrene, polymethyl methacrylate, silicone rubber, and other polymers. As a manufacturing method of the substrate having the shape as in the present application, it can be manufactured by an injection molding method or hot embossing method in the case of plastic, a sand blasting method in the case of glass or ceramic, or a known semiconductor process in the case of silicon. Among these, polymethyl methacrylate, polystyrene, polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer, glass, and silicon can be particularly preferably used.
上記の材料を本願の基材の形状に形成するには、ガラスや無機物の場合は、サンドブラスト法、フォトリゾグラフィー法など、ポリマーの場合は射出成型法、ホットエンボス法、鋳型内で重合させる方法などの公知の方法により達成しうる。 In order to form the above materials into the shape of the base material of the present application, in the case of glass or inorganic materials, sand blasting method, photolithography method, etc., in the case of polymers, injection molding method, hot embossing method, polymerization method in the mold It can be achieved by a known method such as
本発明に用いる基材は、無処理の状態でそのまま用いてもよいが、必要に応じて、反応性官能基を凸部の表面に導入した基材であってもよく、また、プラズマ処理、紫外線処理やγ線、電子線などの放射線処理を施した基材であってもよい。これら基材に選択結合性物質を固定化する場合には、基材と選択結合性物質との間における各種化学的又は物理的な相互作用、すなわち基材が有している官能基と、選択結合性物質との間の化学的又は物理的な相互作用を利用し公知の方法によって達成しうる。 The substrate used in the present invention may be used as it is in an untreated state, but if necessary, it may be a substrate having a reactive functional group introduced on the surface of the convex portion, and plasma treatment, It may be a base material that has been subjected to radiation treatment such as ultraviolet ray treatment, γ-ray, electron beam or the like. When a selective binding substance is immobilized on these base materials, various chemical or physical interactions between the base material and the selective binding substance, that is, functional groups possessed by the base material, and selection This can be achieved by a known method using a chemical or physical interaction with the binding substance.
例えば、基材に選択性結合物質を固定化するため、ポリカチオンで被覆処理することや、官能基を表面に設けるような化学修飾をすることが好ましい。ガラスの基材に核酸を固定化する場合であると、基材（ガラス）表面にポリ−Ｌ−リシン、シランカップリング剤などでコーティングすることで官能基（アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基など）を表面に導入でき、核酸を固定化することが可能である。このようなシランカップリング剤としては、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ジメトキシ−３−メルカプトプロピルメチルシランなどが挙げられる。シリコンの場合も同様な処理を施すことにより、核酸を固定化できる。 For example, in order to immobilize the selective binding substance on the base material, it is preferable to perform a coating treatment with a polycation or to perform chemical modification such that a functional group is provided on the surface. When nucleic acid is immobilized on a glass substrate, the surface of the substrate (glass) is coated with poly-L-lysine, a silane coupling agent, etc., so that functional groups (amino group, aldehyde group, epoxy group, etc.) ) Can be introduced on the surface, and the nucleic acid can be immobilized. Examples of such silane coupling agents include 3-aminopropyltriethoxysilane, 3-aminopropyltrimethoxysilane, 3-aminopropyldiethoxymethylsilane, 3- (2-aminoethylaminopropyl) trimethoxysilane, 3 -(2-aminoethylaminopropyl) dimethoxymethylsilane, 3-mercaptopropyltrimethoxysilane, dimethoxy-3-mercaptopropylmethylsilane and the like. In the case of silicon, nucleic acid can be immobilized by performing the same treatment.
また、ポリマーの場合の表面修飾方法としては、アルゴンなどの希ガス、窒素、酸素雰囲気下でのプラズマ処理やオゾン処理などで、基材の表面にラジカルを発生させ、グラフト重合を行うなどの公知の方法で化学修飾することが可能である。 In addition, as a surface modification method in the case of a polymer, a known method such as performing radical polymerization on the surface of the substrate by plasma treatment or ozone treatment under a rare gas such as argon, nitrogen or oxygen atmosphere, and graft polymerization is performed. It is possible to chemically modify by this method.
また、本発明の基材は、少なくとも凸部の側面が導電性材料でコートされている。こうすると、例えば、対抗電極を設け、対抗電極とこの導電性材料の間に電流、電圧を印加することにより核酸の場合であるとハイブリダイゼーションの高速化が可能となる。導電性材料がコートされる好ましい領域としては、凹部の全部、凸部の側面全部である。その例を図４に示す。
Further, the substrate of the present invention, that is coated at least the side surfaces of the convex portion is a conductive material. In this case, for example, in the case of nucleic acid, hybridization can be accelerated by providing a counter electrode and applying a current and voltage between the counter electrode and the conductive material. Preferred regions to be coated with the conductive material are all the concave portions and all the side surfaces of the convex portions. An example is shown in FIG.
印加する電圧の範囲としては、電流が流れる場合は、０．０１Ｖ以上、２Ｖ以下の範囲が好ましい。特に好ましい範囲は、０．１Ｖ以上、１．５Ｖ以下である。これより、大きい電圧を印加すると水が電気分解をおこし、表面の選択結合性物質に悪影響を及ぼす場合がある。導電性材料の材質としては特に限定されないが、炭素、マグネシウム、アルミ、シリコン、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、錫、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、銀、ハフニウム、タンタル、タングステン、白金、金、ステンレスやこれらの混合物や導電性ポリマーが挙げられる。この中でも、白金、金、チタンが特に好ましく用いられる。これらの導電性材料の膜の作製方法としては、蒸着、スパッタ、ＣＶＤ、メッキなどが挙げられる。 As a range of the voltage to be applied, a range of 0.01 V or more and 2 V or less is preferable when a current flows. A particularly preferable range is 0.1 V or more and 1.5 V or less. From this, when a large voltage is applied, water causes electrolysis, which may adversely affect the surface selective binding substance. The material of the conductive material is not particularly limited, but carbon, magnesium, aluminum, silicon, titanium, vanadium, chromium, manganese, iron, cobalt, nickel, copper, tin, zirconium, niobium, molybdenum, palladium, silver, hafnium, Examples include tantalum, tungsten, platinum, gold, stainless steel, mixtures thereof, and conductive polymers. Among these, platinum, gold, and titanium are particularly preferably used. Examples of a method for forming these conductive material films include vapor deposition, sputtering, CVD, and plating.
凸部の上面以外はさらに絶縁材料の層を設けることが好ましい。絶縁材料の層があると、電流を流した場合凸部の上面にのみ被検体を引き寄せることが可能である。絶縁材料の材料としては、金属の酸化物（例えば、Ａｌ−Ｏ、ＳｉＯ2、ＴｉＯ2、ＶＯ、ＳｎＯ、Ｃｒ−Ｏ、Ｚｎ−Ｏ、ＧｅＯ2、Ｔａ2Ｏ5、ＺｒＯ2、Ｎｂ−Ｏ、Ｙ2Ｏ3など）、窒化物（Ａｌ−Ｎ、Ｓｉ3Ｎ4、ＴｉＮ、Ｔａ−Ｎ、Ｇｅ−Ｎ、Ｚｒ−Ｎ、ＮｂＮなど）、硫化物（ＺｎＳ、ＰｂＳ、ＳｎＳ、ＣｕＳ）、絶縁性のポリマーが挙げられる。後述の理由から、撥水性を持つポリマーが特に好ましく用いることができる。このポリマーの中でもシリコーンゴムが特に好ましく用いることができる。シリコーンゴムとしては、付加重合型のもの、縮合重合型のものいずれも用いられる。この中でも、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマーが特に好ましく用いることができる。
It is preferable to further provide a layer of an insulating material other than the upper surface of the convex portion. When there is a layer of insulating material, it is possible to draw the subject only on the upper surface of the convex portion when a current is passed. Examples of the insulating material include metal oxides (for example, Al—O, SiO 2 , TiO 2 , VO, SnO, Cr—O, Zn—O, GeO 2 , Ta 2 O 5 , ZrO 2 , Nb—O). , Y etc. 2 O 3), nitride (Al-N, Si 3 N 4, TiN, Ta-N, Ge-N, Zr-N, NbN , etc.), sulfides (ZnS, PbS, SnS, CuS), An insulating polymer may be mentioned. For the reasons described later, a polymer having water repellency can be particularly preferably used. Among these polymers, silicone rubber can be particularly preferably used. As the silicone rubber, either an addition polymerization type or a condensation polymerization type is used. Among these, a polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer can be particularly preferably used.
基材の凹凸部分において、凸部の側面および凹部が、凸部の上面より疎水的な材料が設けられていることが好ましい。このようにすることにより、選択結合性物質を含む溶液を凸部に点着しても、この溶液が凹部や凸部の側面に流れてしまうことを防止することができる。ここでいう疎水的な材料とは、該材料と水との接触角の方が、基材凸部上面と水との接触角よりも大きい材料のことをいう。水との接触角は、一般の接触角計により容易に測定できる。この疎水的な材料としては、好ましくは、前述のシリコーンゴムが挙げられる。 In the concavo-convex portion of the substrate, it is preferable that the side surface and the concave portion of the convex portion be provided with a hydrophobic material than the upper surface of the convex portion. By doing in this way, even if the solution containing the selective binding substance is spotted on the convex portion, it is possible to prevent the solution from flowing to the side surface of the concave portion or the convex portion. The hydrophobic material as used herein refers to a material having a contact angle between the material and water that is greater than the contact angle between the upper surface of the substrate convex portion and water. The contact angle with water can be easily measured with a general contact angle meter. As this hydrophobic material, preferably, the aforementioned silicone rubber is used.
本発明の凸部の表面の面積は、特に限定される物ではないが、選択結合性物質の量を少なくすることができる点とハンドリングの容易さの点から、４ｍｍ2以下、１０μｍ2以上が好ましい。 Although the area of the surface of the convex part of the present invention is not particularly limited, it is 4 mm 2 or less and 10 μm 2 or more from the viewpoint that the amount of the selective binding substance can be reduced and handling is easy. preferable.
凹凸部における凸部の高さとしては、０．０５ｍｍ以上、１ｍｍ以下が好ましい。凸部の高さがこれより低いと、スポット以外の部分の非特異的に吸着した検体試料を検出してしまうことがあり、結果的にＳ／Ｎが悪くなることがある。また、凸部の高さが１ｍｍ以上であると、凸部が折れて破損しやすいなどの問題が生じる場合がある。 The height of the convex portion in the concave and convex portion is preferably 0.05 mm or more and 1 mm or less. If the height of the convex portion is lower than this, a non-specifically adsorbed specimen sample other than the spot may be detected, resulting in a poor S / N. Further, when the height of the convex portion is 1 mm or more, there may be a problem that the convex portion is easily broken and damaged.
さらに、Ｓ／Ｎを向上させるという観点から、基材の少なくとも一部を黒色にすることが好ましい。こうすることにより、基材からの自家蛍光を低減することができる。基材の黒色にする部分としては、凹凸部が設けられた基材の本体でも良いし、凸部の側面、凹部に設けられた疎水的な材料や絶縁層でも良いし、これらの全部でも良い。 Further, from the viewpoint of improving S / N, it is preferable to make at least a part of the base material black. By doing so, autofluorescence from the substrate can be reduced. The blackened portion of the base material may be the main body of the base material provided with the concavo-convex part, or may be a hydrophobic material or insulating layer provided on the side surface of the convex part, the concave part, or all of these. .
ここで、基材が黒色とは、可視光（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）範囲において、基材の黒色部分の分光反射率が特定のスペクトルパターン（特定のピークなど）を持たず、一様に低い値であり、かつ、基材の黒色部分の分光透過率も、特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値であることをいう。 Here, the black color of the base material means that the spectral reflectance of the black portion of the base material does not have a specific spectral pattern (specific peak, etc.) and is uniformly low in the visible light (wavelength range of 400 nm to 800 nm). It is a value, and the spectral transmittance of the black part of the substrate also has a specific spectral pattern and is uniformly low.
この分光反射率、分光透過率の値としては、可視光（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）の範囲の分光反射率が７％以下であり、同波長範囲での分光透過率が２％以下であることが好ましい。なお、ここでいう分光反射率は、ＪＩＳ Ｚ ８７２２ 条件Ｃに適合した、照明・受光光学系で、基材からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率をいう。 As the values of the spectral reflectance and the spectral transmittance, the spectral reflectance in the range of visible light (wavelength is 400 nm to 800 nm) is 7% or less, and the spectral transmittance in the same wavelength range is 2% or less. Is preferred. Note that the spectral reflectance here refers to the spectral reflectance when regular reflected light from the substrate is captured in an illumination / light-receiving optical system conforming to JIS Z 8722 Condition C.
黒色にする手段としては、基材、絶縁材料に黒色物質を含有させることにより達成しうる。この黒色物質は、光を反射したり透過し難いものであれば特に制限はないが、好ましいものを挙げると、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、ＣｏおよびＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、ＺｒおよびＣｒの炭化物などの黒色物質が使用できる。 The means for blackening can be achieved by adding a black substance to the base material or insulating material. The black material is not particularly limited as long as it is difficult to reflect or transmit light, but preferred examples include carbon black, graphite, titanium black, aniline black, Ru, Mn, Ni, Cr, Fe, Black materials such as Co and Cu oxides, Si, Ti, Ta, Zr and Cr carbides can be used.
これらの黒色物質は単独で含有させる他、２種類以上を混合して含有させることもできる。例えば、基材、絶縁材料がポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーン樹脂などのポリマーの場合は、この中の黒色物質の中でも、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラックを好ましく含有させることができ、特にカーボンブラックを好ましく用いることができる。ガラス、セラミックの無機材料の場合は、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、ＣｏおよびＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、ＺｒおよびＣｒの炭化物を好ましく含有させることができる。 These black materials can be contained alone or in combination of two or more. For example, if the base material or insulating material is a polymer such as polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate, polystyrene, polymethyl methacrylate, or silicone resin, among these black substances, carbon black, graphite, titanium black, aniline black are used. Carbon black can be preferably used. In the case of inorganic materials such as glass and ceramic, oxides of Ru, Mn, Ni, Cr, Fe, Co and Cu, and carbides of Si, Ti, Ta, Zr and Cr can be preferably contained.
ここで、「選択結合性物質」とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。核酸は、ＤＮＡやＲＮＡでもＰＮＡでもよい。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。また、タンパク質としては、抗体及びFabフラグメントやF(ab')2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。「選択結合性物質」として、特に好ましいものは、核酸、抗体及び抗原である。本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。 Here, the “selective binding substance” means a substance that can selectively bind to a test substance directly or indirectly, and representative examples thereof include nucleic acids, proteins, saccharides and other antigenic properties. A compound can be mentioned. The nucleic acid may be DNA, RNA or PNA. A single-stranded nucleic acid having a specific base sequence selectively hybridizes and binds to a single-stranded nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence or a part thereof. Falls under the category of Examples of the protein include an antibody and an antigen-binding fragment of an antibody such as a Fab fragment or F (ab ′) 2 fragment, and various antigens. Since an antibody or an antigen-binding fragment thereof selectively binds with a corresponding antigen, and the antigen selectively binds with a corresponding antibody, it corresponds to a “selective binding substance”. As the saccharide, a polysaccharide is preferable, and various antigens can be exemplified. In addition, substances having antigenicity other than proteins and saccharides can be immobilized. Particularly preferred as “selective binding substances” are nucleic acids, antibodies and antigens. The selective binding substance used in the present invention may be a commercially available substance or may be obtained from a living cell or the like.
生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎらの方法（ Ｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３： ２３０３ （１９７６））等により、また、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（ Favaloro etal., Methods Enzymol.65: 718 (1980)）等により行うことができる。固定化する核酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。 Preparation of DNA or RNA from living cells can be carried out by known methods, for example, DNA extraction by the method of Blin et al. (Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (1976)), etc. Extraction can be performed by the method of Favaloro et al. (Favaloro et al., Methods Enzymol. 65: 718 (1980)). Examples of the nucleic acid to be immobilized include linear or circular plasmid DNA and chromosomal DNA, DNA fragments obtained by digesting these with restriction enzymes or chemically, DNA synthesized with enzymes in a test tube, or chemically synthesized oligos. Nucleotides and the like can also be used.
本発明の基材を用いた測定方法に供せられる被検物質としては、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの被検物質を含む検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオシド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、基材を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、基材に結合した標識を測定することもできる。 Examples of the test substance used in the measurement method using the substrate of the present invention include nucleic acids to be measured, for example, genes such as pathogenic bacteria and viruses, causative genes of genetic diseases, etc., and parts thereof, various antigenic properties Examples include, but are not limited to, biological components, antibodies against pathogenic bacteria, viruses, and the like. Examples of specimens containing these test substances include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, feces, spinal fluid, saliva, various tissue fluids, various foods and beverages, and dilutions thereof. It is not limited to these. Moreover, the nucleic acid to be the test substance may be labeled with a nucleic acid extracted from blood or cells by a conventional method, or may be amplified by a nucleic acid amplification method such as PCR using the nucleic acid as a template. In the latter case, the measurement sensitivity can be greatly improved. When a nucleic acid amplification product is used as a test substance, the amplified nucleic acid can be labeled by performing amplification in the presence of a nucleoside triphosphate labeled with a fluorescent substance or the like. When the test substance is an antigen or antibody, the test substance antigen or antibody may be directly labeled by a conventional method, or the test substance antigen or antibody may be bound to a selective binding substance. Thereafter, the substrate is washed, and a labeled antibody or antigen that reacts with the antigen or antibody for antigen-antibody reaction is reacted, and the label bound to the substrate can be measured.
固定化物質と被検物質を相互作用させる工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、５０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。 The step of causing the immobilized substance and the test substance to interact can be performed in the same manner as in the past. The reaction temperature and time are appropriately selected according to the chain length of the nucleic acid to be hybridized, the type of antigen and / or antibody involved in the immune reaction, and in the case of nucleic acid hybridization, usually 50 ° C. to 70 ° C. In the case of an immune reaction, it is usually from room temperature to about 40 ° C. for about 1 minute to several hours.
上記方法により、固定化された選択結合性物質と選択的に結合する核酸や抗体、抗原等の被検物質を測定することができる。すなわち、選択結合性物質として核酸を固定化した場合には、この核酸又はその一部と相補的な配列を有する核酸を測定することができる。また、選択結合性物質として抗体又は抗原を固定化した場合には、この抗体又は抗原と免疫反応する抗原又は抗体を測定することができる。なお、本明細書でいう「測定」には検出と定量の両者を示すものである。 By the above method, test substances such as nucleic acids, antibodies and antigens that selectively bind to the immobilized selective binding substance can be measured. That is, when a nucleic acid is immobilized as a selective binding substance, a nucleic acid having a sequence complementary to this nucleic acid or a part thereof can be measured. When an antibody or antigen is immobilized as a selective binding substance, the antigen or antibody that immunoreacts with this antibody or antigen can be measured. Note that “measurement” in this specification indicates both detection and quantification.
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 The invention is illustrated in more detail by the following examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
実施例１
（基材の処理）
顕微鏡用のスライドガラス（松浪ガラス製）にサンドブラスト法により、一辺の長さが８ｍｍの正方形の領域の部分うち、核酸を固定化する部分以外のガラスを削り、凹凸部と平坦部を備える基材をえた。具体的には、凹凸部における、凹部から凸部表面までの高さ０．５ｍｍ、直径０．５ｍｍ、ピッチが２ｍｍである９本の凸部を設けた。なお、サンドブラスト処理していない部分は平坦である（この部分が本発明における平坦部に相当する）。
Example 1
(Substrate treatment)
A base material provided with an uneven part and a flat part by cutting glass other than a part for immobilizing nucleic acid out of a part of a square area with a side length of 8 mm by a sandblast method on a microscope slide glass (made by Matsunami Glass) I gave Specifically, nine convex portions having a height from the concave portion to the convex portion surface of 0.5 mm, a diameter of 0.5 mm, and a pitch of 2 mm in the concave and convex portions were provided. In addition, the part which is not sandblasted is flat (this part corresponds to the flat part in this invention).
実際に測定顕微鏡にて、各凸部上面部分の形状を観察して凸部上部がほぼ真円であることを確認した。ついで、この測定顕微鏡にて各凸部上面の直径を測定して面積を計算したところ、いずれの凸部上面部分の面積は、ほぼ０．２ｍｍ2であり、同一であった。すなわち、９個の凸部の内、（最も大きい上面の面積）を（最も小さい上面の面積）で割った値は１．２未満であった。 Actually, the shape of the upper surface portion of each convex portion was observed with a measuring microscope, and it was confirmed that the upper portion of the convex portion was almost a perfect circle. Then, when the area was calculated by measuring the diameter of the upper surface of each convex portion with this measuring microscope, the area of the upper surface portion of any convex portion was approximately 0.2 mm 2 and was the same. That is, the value obtained by dividing (the area of the largest upper surface) by (the area of the smallest upper surface) among the nine convex portions was less than 1.2.
次いで、スライド全面に真空蒸着法によりＣｒを２ｎｍ蒸着し、次いで金を１００ｎｍ蒸着した。そして、凸部上面と平坦部上面が電気的に導通していることを確認した。このとき、凸部の側面には、導電性材料（金）が均一に作製されていることを確認した。 Next, 2 nm of Cr was deposited on the entire slide surface by vacuum deposition, and then 100 nm of gold was deposited. And it confirmed that the convex part upper surface and the flat part upper surface were electrically connected. At this time, it was confirmed that the conductive material (gold) was uniformly formed on the side surface of the convex portion.
さらに、ラッピングペーパーにより凸部上面のみの金とＣｒを除去した。次いで、この加工したスライドを３ｍｏｌ／ｌ、ＮａＯＨ水溶液に３０分浸し、次いで、超純水で十分に洗浄して乾燥した。そして、１０体積％ ３-アミノプロピルトリエトキシシランのアセトン溶液に５時間浸した。その後、スライドガラスを引き上げ、アセトンで洗浄して乾燥した。このようにして、凸部上面のガラス面にアミノ基を導入した。 Furthermore, the gold | metal | money and Cr of only the convex part upper surface were removed with the wrapping paper. Next, the processed slide was immersed in a 3 mol / l NaOH aqueous solution for 30 minutes, and then thoroughly washed with ultrapure water and dried. Then, it was immersed in an acetone solution of 10% by volume 3-aminopropyltriethoxysilane for 5 hours. Thereafter, the slide glass was pulled up, washed with acetone and dried. In this way, amino groups were introduced into the glass surface on the upper surface of the convex portion.
次に、シリコーン樹脂であるシルガード１８４（Sylgard 184（登録商標））（Sylgardはダウ・コーニング（Dow Corning）社の登録商標）のキットに含まれるシリコーンエラストマー液とキュアリングエージェント液をメーカー推奨の割合で混ぜた後、さらに、トルエンを加え粘度を調整した。この溶液を、凹部の端からスポイドで注意深くゆっくりと注入し、凹部全体と、凸部の側面をこの溶液（シリコーン樹脂）で覆うことができた。これを、８０℃に保持してシリコーン樹脂を硬化した。硬化後、凸部の表面部分には、シリコーン樹脂が付着していないことを顕微鏡で確認した。作製した基材の模式図を図５に示す。 Next, the silicone elastomer liquid and the curing agent liquid included in the kit of the silicone resin Sylgard 184 (Sylgard 184 (registered trademark)) (Sylgard is a registered trademark of Dow Corning) are recommended by the manufacturer. Then, toluene was added to adjust the viscosity. This solution was carefully and slowly poured from the end of the concave portion with a dropoid, and the entire concave portion and the side surface of the convex portion could be covered with this solution (silicone resin). This was kept at 80 ° C. to cure the silicone resin. After curing, it was confirmed with a microscope that the silicone resin did not adhere to the surface portion of the convex portion. A schematic diagram of the produced substrate is shown in FIG.
そして、１体積％グルタルアルデヒド水溶液にこの基材を１時間浸した。こうして、ガラス表面に、アルデヒド基を導入した。 And this base material was immersed in 1 volume% glutaraldehyde aqueous solution for 1 hour. Thus, aldehyde groups were introduced on the glass surface.
また、同様な基材を作製して、任意の１つの凸部上面の平坦性をＡＦＭ（原子間力顕微鏡；デジタルインスツルメント社製 ＮａｎｏｓｃｏｐｅIII）で測定したところ、この部分の凹凸の自乗平均平方根（ＲＭＳ）は３０ｎｍ以下であり、また、全ての凸部上面部分に５０μｍ以上の凹凸は認められず十分平滑であった。また、それぞれの凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）、さらには、凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さの差を測定したところそれぞれ０．５μｍ以下であった。 Further, a similar base material was prepared, and the flatness of the upper surface of any one convex portion was measured with an AFM (atomic force microscope; Nanoscope III manufactured by Digital Instruments). (RMS) was 30 nm or less, and unevenness of 50 μm or more was not observed on the upper surface portions of all the convex portions, and the surface was sufficiently smooth. Further, the height variation of the top surface of each convex portion (the difference between the height of the top surface of the highest convex portion and the height of the top surface of the lowest convex portion), and the average value of the height of the top surface of the convex portion and the top surface of the flat portion The difference in height was measured and found to be 0.5 μm or less.
このようにして、凹凸部と平坦部が設けられており、該凹凸部の凸部上面は実質的に平坦であり、凸部の上面の高さと平坦部分の上面の高さが、同一であることを特徴とする選択結合性物質が固定化された基材を得た。 Thus, the uneven portion and the flat portion are provided, and the upper surface of the convex portion of the uneven portion is substantially flat, and the height of the upper surface of the convex portion and the height of the upper surface of the flat portion are the same. A base material on which the selective binding substance characterized by the above was immobilized was obtained.
なお、別に本実施例で用いたシリコーン樹脂と、３-アミノプロピルトリエトキシシランで処理したスライドガラスについて、それぞれ、水の接触角を測定したところ、シリコーン樹脂の接触角の方が明らかに大きかった。３-アミノプロピルトリエトキシシランで処理したスライドガラスの対水接触角が４０度、シリコーン樹脂の対水接触角が１００度であった。なお、接触角は、純水を２０μｌ程度、サンプルの上に静かに置いて、接触角計（協和界面（株）製、ＣＡ−Ｄ）を用いて測定した。 In addition, when the contact angle of water was measured for each of the slide glass treated with the silicone resin and 3-aminopropyltriethoxysilane separately used in this example, the contact angle of the silicone resin was clearly larger. . The slide glass treated with 3-aminopropyltriethoxysilane had a water contact angle of 40 degrees, and the silicone resin had a water contact angle of 100 degrees. The contact angle was measured using a contact angle meter (Kyowa Interface Co., Ltd., CA-D) with pure water about 20 μl gently placed on the sample.
（核酸の処理および基材への核酸の固定）
以下の配列の核酸を合成した。
5'-TTTACGTATACACGCGTGTA-3'（配列番号１；５’末端アミノ化）
配列番号（ＤＮＡ）１の５’末端はアミノ化されている。これを、これをＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたもの）に、１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度で溶かした。
(Nucleic acid treatment and immobilization of nucleic acid on substrate)
Nucleic acids having the following sequences were synthesized.
5'-TTTACGTATACACGCGTGTA-3 '(SEQ ID NO: 1; 5' terminal amination)
The 5 ′ end of SEQ ID NO: DNA is aminated. This is made into PBS (8 g NaCl, 2.9 g Na 2 HPO 4 · 12H 2 O, 0.2 g KCl, 0.2 g KH 2 PO 4 dissolved in pure water and made up to 1 l) , Dissolved at a concentration of 100 pmol / μl.
上記で調整した基材の凸部に、この調整した核酸溶液をマイクロピペットで点着した。この時、凸部の上面以外の部分は、シリコーン樹脂にて撥水処理を施しているので、凸部の上面から核酸溶液が流れてしまうようなことはなかった。計９個の凸部に溶解した核酸溶液を点着して、湿度１００％のプラスチック溶液にいれ３０℃で２４時間放置した。このようにして、ＤＮＡ１の５’末端のアミノ基と基材のアルデヒド基をシッフ塩基結合させることにより、ＤＮＡを固定化した。 The adjusted nucleic acid solution was spotted with a micropipette on the convex portion of the base material adjusted as described above. At this time, the portion other than the upper surface of the convex portion was subjected to a water repellent treatment with a silicone resin, so that the nucleic acid solution did not flow from the upper surface of the convex portion. The nucleic acid solution dissolved in a total of 9 protrusions was spotted, placed in a plastic solution with a humidity of 100%, and allowed to stand at 30 ° C. for 24 hours. In this way, DNA was immobilized by making a Schiff base bond between the amino group at the 5 'end of DNA1 and the aldehyde group of the base material.
次いで、この基材を０．２重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液の中にスライドを入れ、２分間振とうし、さらに、純水中で２分間振とうして洗浄した。さらに、１．５ｇのＮａＢＨ4に４５０ｍｌのＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたもの）、１００％エターノールを１３３ｍｌ加えた溶液を準備した。溶液の準備後、素早く前記スライドグラスをこの溶液に浸し、５分後、スライドガラスを取りだした。このようにして、ＤＮＡと結合していない、スライドガラス上の余分なアルデヒド基をブロッキングした。次いで、０．２重量％ＳＤＳ水溶液、純水の順に洗浄し、乾燥した。 Next, the substrate was placed in a 0.2 wt% SDS (sodium dodecyl sulfate) aqueous solution, shaken for 2 minutes, and further washed by shaking in pure water for 2 minutes. Furthermore, 450 ml of PBS (NaCl 8 g, Na 2 HPO 4 .12H 2 O 2.9 g, KCl 0.2 g, KH 2 PO 4 0.2 g in pure water to 1 l in 1.5 g NaBH 4 A solution prepared by adding 133 ml of 100% ethanol was prepared. After preparing the solution, the slide glass was immediately immersed in this solution, and after 5 minutes, the slide glass was taken out. In this way, excess aldehyde groups on the slide glass that were not bound to DNA were blocked. Subsequently, it was washed in order of 0.2 wt% SDS aqueous solution and pure water and dried.
（ハイブリダイゼーション用核酸の調整）
以下の配列の核酸を合成した。
5'-TAGCATGCTAATGCATGCATTGGAGAACTGATCGACACAGTACACGCGTGTATACGTAAAGTGGCCATC
CATAGTCTTCTAGGCTGCTCCCCGCGTGGCC-3'（配列番号２）
5'-GGCCACGCGGGGAGCAGCCTACAAGACTATGGATGGCCACTTTACGTATACACGCGTGTACTGTGTCGA
TCAGTTCTCCAATGCATGCATTAGCATGCTA-3'（配列番号３）
配列番号（ＤＮＡ）２の５’末端から４１番目の塩基から６０番目の塩基までは、配列番号（ＤＮＡ）１と相補的な配列を有している。また、配列番号（ＤＮＡ）３と配列番号（ＤＮＡ）２とは、相補的な塩基配列を有している。
(Preparation of nucleic acid for hybridization)
Nucleic acids having the following sequences were synthesized.
5'-TAGCATGCTAATGCATGCATTGGAGAACTGATCGACACAGTACACGCGTGTATACGTAAAGTGGCCATC
CATAGTCTTCTAGGCTGCTCCCCGCGTGGCC-3 '(SEQ ID NO: 2)
5'-GGCCACGCGGGGAGCAGCCTACAAGACTATGGATGGCCACTTTACGTATACACGCGTGTACTGTGTCGA
TCAGTTCTCCAATGCATGCATTAGCATGCTA-3 '(SEQ ID NO: 3)
The 41st base to the 60th base from the 5 'end of SEQ ID NO: (DNA) 2 have a sequence complementary to SEQ ID NO: (DNA) 1. Further, SEQ ID NO: (DNA) 3 and SEQ ID NO: (DNA) 2 have complementary base sequences.
１００ｎｍｏｌのＤＮＡ２と１００ｎｍｏｌのＤＮＡ３をそれぞれ１９．７ｍｌの純水にとかし、これらを混合し二本鎖のＤＮＡとした。さらに、９ｍｅｒのランダムプライマー（宝酒造（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かしたものを２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（宝酒造（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（dATP、dTTP、dGTPの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、dCTPの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５５０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ５で標識されたＤＮＡを得た。ついでこれを精製、乾燥した後、ヒスチジン溶液（５０ｍＭ）１００μｌに溶かし、ハイブリダイゼーション用の溶液を得た。 100 nmol of DNA2 and 100 nmol of DNA3 were each dissolved in 19.7 ml of pure water, and these were mixed to obtain double-stranded DNA. Further, 2 μl of 9-mer random primer (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd .; product number 3802) dissolved in a concentration of 6 mg / ml was added. This solution was heated to 100 ° C. and then rapidly cooled on ice. To this, 5 μl of a buffer attached to Klenow Fragment (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd .; product number 2140AK) and 2.5 μl of a dNTP mixture (concentrations of dATP, dTTP, and dGTP were 2.5 mM and dCTP were 400 μM, respectively) were added. Furthermore, 2 μl of Cy5-dCTP (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech; product number PA55021) was added. 10 U of Klenow Fragment was added to this solution and incubated at 37 ° C. for 20 hours to obtain DNA labeled with Cy5. Subsequently, this was purified and dried, and then dissolved in 100 μl of a histidine solution (50 mM) to obtain a solution for hybridization.
（ハイブリダイゼーション）
カバーガラスにクロムを５ｎｍ、金を１００ｎｍ蒸着した。これに金線をはんだで付けた。
(Hybridization)
一方、先に用意した核酸が固定化されている基材の凹凸部分に、ハイブリダイゼーション用の溶液を５０μｌ加え、カバーガラスの金の面が基材の凹凸部分に向くようにして、上記のカバーガラスをかぶせた。この時、基材の金とカバーガラスの金が電気的にショートしないように、高さ０．２ｍｍのスペーサーを間に入れた。カバーガラスの周りをペーパーボンドでシールし、ハイブリダイゼーションの溶液が乾燥しないようにした。 On the other hand, 50 μl of the hybridization solution is added to the uneven portion of the base material on which the nucleic acid prepared previously is immobilized, so that the gold surface of the cover glass faces the uneven portion of the base member. Covered with glass. At this time, a spacer having a height of 0.2 mm was interposed so that the gold of the base material and the gold of the cover glass were not electrically short-circuited. The cover glass was sealed with a paper bond to prevent the hybridization solution from drying.
ついで、基材の金を電源の陽極、カバーガラスの金（金線）を電源の陰極につないだ。これを６５℃のオーブンに入れ１５分間インキュベートした。そして、電源から１Ｖの電圧を３分間印加した後、オーブンから取りだし、カバーガラスを剥離後に洗浄、乾燥した。 Next, the gold of the base material was connected to the anode of the power source, and the gold (gold wire) of the cover glass was connected to the cathode of the power source. This was placed in a 65 ° C. oven and incubated for 15 minutes. And after applying the voltage of 1V from a power supply for 3 minutes, it took out from oven and wash | cleaned and dried after peeling off the cover glass.
（測定）
スキャナー（Axon Instruments社のGenePix 4000A）に上記処理後の基材をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧を５００に設定した状態で測定を行った。その結果を表１に示す。
(Measurement)
The substrate after the above treatment was set on a scanner (GenePix 4000A manufactured by Axon Instruments), and measurement was performed with the laser output set to 33% and the photomultiplier voltage set to 500. The results are shown in Table 1.
なお、ここでいうノイズとは、凸部上面のまわりの蛍光強度のメジアンであり、蛍光強度とは、スポット内の蛍光強度のメジアンである。 Here, the noise is the median of the fluorescence intensity around the upper surface of the convex portion, and the fluorescence intensity is the median of the fluorescence intensity in the spot.
また、各スポットの大きさは、凸部上面の面積と等しく、スポットの大きさのばらつきもなかった。また、本実施例では、ハイブリダイゼーションの時間も２０分以内で完了した。 Moreover, the size of each spot was equal to the area of the upper surface of the convex portion, and there was no variation in spot size. In this example, the hybridization time was also completed within 20 minutes.
比較例１
顕微鏡用のスライドガラス（松浪ガラス製）を３ｍｏｌ／ｌ、ＮａＯＨ水溶液に３０分浸し、次いで、超純水で十分に洗浄して乾燥した。そして、１０体積％ ３-アミノプロピルトリエトキシシランのアセトン溶液に５時間浸した。その後、スライドガラスを引き上げ、アセトンで洗浄して乾燥した。そして、１体積％グルタルアルデヒド水溶液にこの基材を１時間浸した。このような処理を施すことにより、ガラス表面に、アルデヒド基を導入した。
Comparative Example 1
A microscope slide glass (manufactured by Matsunami Glass) was immersed in a 3 mol / l NaOH aqueous solution for 30 minutes, and then thoroughly washed with ultrapure water and dried. Then, it was immersed in an acetone solution of 10% by volume 3-aminopropyltriethoxysilane for 5 hours. Thereafter, the slide glass was pulled up, washed with acetone and dried. And this base material was immersed in 1 volume% glutaraldehyde aqueous solution for 1 hour. By performing such treatment, an aldehyde group was introduced on the glass surface.
実施例１と同じ核酸を用い、また、核酸の処理も実施例１と同様に行った。調整した基材固定用の核酸（ＤＮＡ１）溶液をマイクロピペットで９箇所に点着し、この後の処理（洗浄、ハイブリダイゼーション溶液などの処理）も実施例１と同様に行った。 The same nucleic acid as in Example 1 was used, and the nucleic acid treatment was performed in the same manner as in Example 1. The prepared nucleic acid (DNA1) solution for immobilizing the substrate was spotted at nine locations with a micropipette, and the subsequent treatment (treatment of washing, hybridization solution, etc.) was performed in the same manner as in Example 1.
ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション用の溶液を調整したスライドグラスに２０μｌ加えカバーガラスをかぶせた。この時、高さ０．１ｍｍのスペーサーを入れた。カバーガラスの周りをペーパーボンドでシールし、ハイブリダイゼーションの溶液が乾燥しないようにした。 For hybridization, 20 μl of a slide glass prepared with the hybridization solution was added and a cover glass was put on. At this time, a spacer having a height of 0.1 mm was inserted. The cover glass was sealed with a paper bond to prevent the hybridization solution from drying.
ついで、６５℃のオーブンに入れ１０時間インキュベートした。そして、オーブンから取りだし、カバーガラスを剥離後に洗浄、乾燥した。実施例１と同様に測定を行った結果を表２に示す。 Then, it was placed in an oven at 65 ° C. and incubated for 10 hours. And it took out from oven and wash | cleaned and dried after peeling the cover glass. Table 2 shows the results of measurement as in Example 1.
なお、ここでいうノイズとは、スポットのまわりの蛍光強度のメジアンであり、蛍光強度とは、スポット内の蛍光強度のメジアンである。このように、実施例１と比較し、明らかにノイズの大きいことがわかった。また、スポットの大きさのばらつきも大きかった。 Here, the noise is the median of the fluorescence intensity around the spot, and the fluorescence intensity is the median of the fluorescence intensity within the spot. Thus, compared with Example 1, it turned out that noise is clearly large. Also, the spot size variation was large.
また、本比較例の場合、事前の予備検討により、ハイブリダイゼーションを完了させるためには、６５℃でおおむね３時間以上必要であることがわかった。すなわち、実施例１では、ハイブリダイゼーションの時間も大幅に短縮できることがわかった。 In addition, in the case of this comparative example, it was found from the preliminary examination in advance that it takes about 3 hours or more at 65 ° C. to complete the hybridization. That is, in Example 1, it was found that the hybridization time can be greatly shortened.
参考例１
ホットエンボス法により、基材の材料がポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）の基材を作製した。全体の大きさは、顕微鏡用のスライドガラスと同じ大きさであり、厚さを１ｍｍとした。また、一辺の長さが８ｍｍの正方形の領域の部分をへこませ、この中に、凸部を設け凹凸部を作製した。具体的には、凹凸部における、凹部から凸部表面までの高さ０．５ｍｍ、直径５００μｍ、ピッチが２ｍｍである９本の凸部を設けた。
Reference example 1
A base material made of polymethyl methacrylate (PMMA) was prepared by a hot embossing method. The overall size was the same as that of a microscope slide glass, and the thickness was 1 mm. Moreover, the part of the square area | region whose length of one side is 8 mm was dented, the convex part was provided in this, and the uneven part was produced. Specifically, nine convex portions having a height from the concave portion to the convex portion surface of 0.5 mm, a diameter of 500 μm, and a pitch of 2 mm in the concave and convex portions were provided.
ついで、凸部をラッピングペーパーで削り、平坦部上面と、凸部上面の高さの差が５０μｍ、３０μｍ、０μｍの３種類の基材を作製した。凸部の上面（８箇所）にＣｙ５−ｄＣＴＰを５００ｐｌ点着、乾燥し、それぞれの基材について測定を行った。その結果（Ｃｙ５の蛍光強度とノイズの平均値）を表３に示す。 Next, the convex portion was shaved with wrapping paper, and three types of base materials having height differences of 50 μm, 30 μm, and 0 μm between the upper surface of the flat portion and the upper surface of the convex portion were produced. Cy5-dCTP was spotted at 500 pl on the upper surface (eight locations) of the convex portion, dried, and each substrate was measured. The results (Cy5 fluorescence intensity and noise average value) are shown in Table 3.
参考例２
平坦部上面と、凸部上面の高さの差を１００μｍにした他は、参考例１と同様に基材を作成し、評価を行った。結果を表３に示す。
Reference example 2
A substrate was prepared and evaluated in the same manner as in Reference Example 1 except that the difference in height between the upper surface of the flat part and the upper surface of the convex part was 100 μm. The results are shown in Table 3.
この結果から、平坦部上面と、凸部上面の高さの差が５０μｍ以下であると、実用上ほぼ問題のないことがわかった。 From this result, it was found that there is almost no problem in practical use when the difference in height between the flat part upper surface and the convex part upper surface is 50 μm or less.
参考例３
ホットエンボス法により、基材の材料がポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の透明な基材を作製した。全体の大きさは、顕微鏡用のスライドガラスと同じ大きさであり、厚さを１ｍｍとした。また、一辺の長さが８ｍｍの正方形の領域の部分をへこませ、この中に、凸部を設け凹凸部を作製した。具体的には、凹凸部における、凹部から凸部表面までの高さ０．５ｍｍ、直径５００μｍ、ピッチが２ｍｍである９本の凸部を設けた。ついで、凸部をラッピングペーパーで削り、平坦部上面と、凸部上面の高さの差が０μｍの基材を作製した。
Reference example 3
A transparent base material made of polymethyl methacrylate (PMMA) was produced by a hot embossing method. The overall size was the same as that of a microscope slide glass, and the thickness was 1 mm. Moreover, the part of the square area | region whose length of one side is 8 mm was dented, the convex part was provided in this, and the uneven part was produced. Specifically, nine convex portions having a height from the concave portion to the convex portion surface of 0.5 mm, a diameter of 500 μm, and a pitch of 2 mm in the concave and convex portions were provided. Next, the convex portion was shaved with wrapping paper to prepare a base material having a height difference of 0 μm between the upper surface of the flat portion and the upper surface of the convex portion.
別途、エチレンジアミン５ｍｌを密閉容器の中に入れ、窒素でパージした後、ｎ−ブチルリチウムを５ｍｌ少しずつ加えた。これを２時間程度十分に攪拌し、紫色の反応物（ｎ−リチウムエチレンジアミン）を得た。これを、作製した基材に滴下し１分後に水で洗浄して、基材の表面にアミノ基を導入した。 Separately, 5 ml of ethylenediamine was put in a sealed container and purged with nitrogen, and then 5 ml of n-butyllithium was added little by little. This was sufficiently stirred for about 2 hours to obtain a purple reaction product (n-lithium ethylenediamine). This was dropped onto the prepared substrate and washed with water after 1 minute to introduce an amino group on the surface of the substrate.
次いで、シリコーン樹脂であるシルガード１８４（Sylgard 184（登録商標））（Sylgardはダウ・コーニング（Dow Corning）社の登録商標）のキットに含まれるシリコーンエラストマー液とキュアリングエージェント液をメーカー推奨の割合で混ぜた後、さらに、トルエンを加え粘度を調整した。この溶液を、基材の凹部の端からスポイドで注意深くゆっくりと注入し、凹部全体と、凸部の側面をこの溶液（シリコーン樹脂）で覆うことができた。６０℃に保持してシリコーン樹脂を硬化した。 Next, the silicone elastomer liquid and the curing agent liquid contained in the kit of the silicone resin Sylgard 184 (Sylgard 184 (registered trademark)) (Sylgard is a registered trademark of Dow Corning) are used at the manufacturer's recommended ratio. After mixing, toluene was further added to adjust the viscosity. This solution was carefully and slowly poured from the edge of the concave portion of the base material with a spoid, and the entire concave portion and the side surface of the convex portion could be covered with this solution (silicone resin). The silicone resin was cured by maintaining at 60 ° C.
なお、別に本参考例で用いたシリコーン樹脂と、本参考例の方法でアミノ基を導入した透明なＰＭＭＡ板について、それぞれ、水の接触角を測定したところ、シリコーン樹脂の接触角の方が明らかに大きかった。実施例１と同様に接触角を測定したところ、アミノ基を導入したＰＭＭＡ板の対水接触角が６０度、本参考例で用いたシリコーン樹脂の対水接触角が１００度であった。
Incidentally, the silicone resin used separately in the present reference example, a method of amino group introduction was transparent PMMA plate in the present embodiment, respectively, when the contact angle of water was measured, it revealed towards the contact angle of the silicone resin It was big. When the contact angle was measured in the same manner as in Example 1, the contact angle with water of the PMMA plate introduced with amino groups was 60 degrees, and the contact angle with water of the silicone resin used in this reference example was 100 degrees.
次いで、実施例１と同様に調整したＤＮＡ１の溶液を、基材の９箇所の凸部に点着して、乾燥した。こうして、基材表面のアミノ基とＤＮＡを静電的な結合により固定化した。そしてこの基材をさらに純水で洗浄した。 Subsequently, the DNA1 solution prepared in the same manner as in Example 1 was spotted on nine convex portions of the substrate and dried. Thus, the amino group on the substrate surface and DNA were immobilized by electrostatic bonding. The substrate was further washed with pure water.
ハイブリダイゼーション用のＤＮＡは実施例１と同様に調整した。ただし、ハイブリダイゼーション用のＤＮＡは、終濃度が、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとはＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇの純水にとかし、２００ｍｌにメスアップしたもの）、０．０１重量％サケ***ＤＮＡ、１．０重量％ウシ血清アブルミン、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）である溶液１００μｌに溶解した。 DNA for hybridization was prepared in the same manner as in Example 1. However, the final concentration of the DNA for hybridization was 5 × SSC (5 × SSC was dissolved in 43.8 g of NaCl and 22.1 g of trisodium citrate hydrate in pure water and made up to 200 ml. 1), 0.01 wt% salmon sperm DNA, 1.0 wt% bovine serum abulmin, 0.1 wt% SDS (sodium dodecyl sulfate).
そして、このハイブリダイゼーション用の溶液を基材上に５０μｌたらして、カバーガラスをかぶせた。この時、高さ０．２ｍｍのスペーサーをカバーガラスと基材の間に入れた。カバーガラスの周りをペーパーボンドでシールし、ハイブリダイゼーションの溶液が乾燥しないようにした。これを６５℃の条件で、１０時間インキュベートした後、オーブンから取りだし、カバーガラスを剥離後に洗浄、乾燥した。 Then, 50 μl of this hybridization solution was put on a substrate and covered with a cover glass. At this time, a spacer having a height of 0.2 mm was placed between the cover glass and the substrate. The cover glass was sealed with a paper bond to prevent the hybridization solution from drying. This was incubated at 65 ° C. for 10 hours, then removed from the oven, and the cover glass was peeled off, washed and dried.
スキャナー（Axon Instruments社のGenePix 4000A）に上記処理後の基材をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧を５００に設定した状態で測定を行った。その結果（Ｃｙ５の蛍光強度とノイズの凸部９箇所における平均値）を表４に示す。 The substrate after the above treatment was set on a scanner (GenePix 4000A manufactured by Axon Instruments), and measurement was performed with the laser output set to 33% and the photomultiplier voltage set to 500. Table 4 shows the result (the fluorescence intensity of Cy5 and the average value of 9 noise protrusions).
参考例４
ＰＭＭＡ中に１重量％の割合でカーボンブラックを混合した黒色平面板から、ホットエンボス法により基材を作製した。全体の大きさ、凹凸部の形状は、実施例３と同様にした。また、平坦部上面と凸部上面の高さの差は、参考例３と同様に０μｍとした。また、基材表面のアミノ基導入は参考例３と同様に行った。
Reference example 4
A base material was prepared by a hot embossing method from a black flat plate in which carbon black was mixed at a ratio of 1% by weight in PMMA. The overall size and the shape of the concavo-convex part were the same as in Example 3. Further, the difference in height between the upper surface of the flat portion and the upper surface of the convex portion was set to 0 μm as in Reference Example 3 . The introduction of amino groups on the substrate surface was carried out in the same manner as in Reference Example 3 .
次いで、シリコーン樹脂である、シルガード１８４（Sylgard 184（商標））（Sylgardはダウ・コーニング（Dow Corning）社の商標）のキットに含まれるシリコーンエラストマー液とキュアリングエージェント液をメーカー推奨の割合で混ぜた後、さらに、トルエンを加え粘度を調整した。これに、カーボンブラックを１重量％の割合で混ぜて黒色にした。この溶液を、基材の凹部の端からスポイドで注意深くゆっくりと注入し、凹部全体と、凸部の側面をこの溶液（シリコーン樹脂）で覆うことができた。６０℃に保持してシリコーン樹脂を硬化した。 Next, the silicone elastomer liquid and the curing agent liquid contained in the kit of the silicone resin Sylgard 184 (Sylgard 184 (trademark)) (Sylgard is a trademark of Dow Corning) are mixed at the manufacturer's recommended ratio. Thereafter, toluene was further added to adjust the viscosity. Carbon black was mixed at a ratio of 1% by weight to make it black. This solution was carefully and slowly poured from the edge of the concave portion of the base material with a spoid, and the entire concave portion and the side surface of the convex portion could be covered with this solution (silicone resin). The silicone resin was cured by maintaining at 60 ° C.
別途、本参考例で用いたカーボンブラック入りのシリコーン樹脂と、本参考例の方法でアミノ基を導入した黒色ＰＭＭＡ板について、それぞれ、水の接触角を測定したところ、シリコーン樹脂の接触角の方が明らかに大きかった。実施例１と同様に接触角を測定したところ、アミノ基を導入したＰＭＭＡ板の対水接触角が６０度、本参考例で用いたシリコーン樹脂の対水接触角が１００度であった。
Separately, a silicone resin of the carbon black-containing used in this Example, the black PMMA plate obtained by introducing an amino group in the method of the present embodiment, respectively, was measured the contact angle of water, towards the contact angle of the silicone resin Was obviously big. When the contact angle was measured in the same manner as in Example 1, the contact angle with water of the PMMA plate introduced with amino groups was 60 degrees, and the contact angle with water of the silicone resin used in this reference example was 100 degrees.
さらに、別途同様な基材を作製して、この凹部における基材の分光反射率と分光透過率を測定したところ、可視光領域（４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも４．７％以下であり。また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなかった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ Ｚ ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、基材からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。 Furthermore, a similar base material was separately prepared, and when the spectral reflectance and spectral transmittance of the base material in this recess were measured, it was 4.7% or less at any wavelength in the visible light region (400 nm to 800 nm). . Further, the transmittance was 0.5% or less at the same wavelength range. Neither spectral reflectance nor spectral transmittance had a specific spectral pattern (such as a peak) in the visible light region. The spectral reflectance is the value when specularly reflected light from the base material is captured using an apparatus (manufactured by Minolta Camera, CM-2002) equipped with an illumination / light receiving optical system conforming to the condition C of JIS Z 8722. Spectral reflectance was measured.
参考例３と同様に、点着するＤＮＡの調整、凸部へのＤＮＡ溶液の点着、ハイブリダイゼーション用のＤＮＡの調整、ハイブリダイゼーションの操作を行い、参考例３と同様に、測定を行った。その結果（Ｃｙ５の蛍光強度とノイズの凸部９箇所における平均値）を表４に示す。
As in Reference Example 3 , adjustment of spotted DNA, spotting of a DNA solution on a convex portion, adjustment of DNA for hybridization, and hybridization were performed, and measurement was performed in the same manner as in Reference Example 3 . . Table 4 shows the result (the fluorescence intensity of Cy5 and the average value of 9 noise protrusions).
参考例５
ホットエンボス法により、材料がポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の透明な基材を作製した。全体の大きさ、凹凸部の形状は、参考例３と同様にした。また、平坦部上面と凸部上面の高さの差は、参考例３と同様に０μｍとした。また、基材表面のアミノ基導入は参考例３と同様に行った。
Reference Example 5
A transparent base material made of polymethyl methacrylate (PMMA) was produced by a hot embossing method. The overall size and the shape of the concavo-convex portion were the same as in Reference Example 3 . Further, the difference in height between the upper surface of the flat portion and the upper surface of the convex portion was set to 0 μm as in Reference Example 3 . The introduction of amino groups on the substrate surface was carried out in the same manner as in Reference Example 3 .
次いで、シリコーン樹脂である、シルガード１８４（Sylgard 184（登録商標））（Sylgardはダウ・コーニング（Dow Corning）社の登録商標）のキットに含まれるシリコーンエラストマー液とキュアリングエージェント液をメーカー推奨の割合で混ぜた後、さらに、トルエンを加え粘度を調整した。これに、カーボンブラックを１重量％の割合で混ぜて黒色にした。この溶液を、基材の凹部の端からスポイドで注意深くゆっくりと注入し、凹部全体と、凸部の側面をこの溶液（シリコーン樹脂）で覆うことができた。６０℃に保持してシリコーン樹脂を硬化した。 Next, the silicone elastomer liquid and the curing agent liquid included in the kit of the silicone resin Sylgard 184 (Sylgard 184 (registered trademark)) (Sylgard is a registered trademark of Dow Corning) are recommended by the manufacturer. Then, toluene was added to adjust the viscosity. Carbon black was mixed at a ratio of 1% by weight to make it black. This solution was carefully and slowly poured from the edge of the concave portion of the base material with a spoid, and the entire concave portion and the side surface of the convex portion could be covered with this solution (silicone resin). The silicone resin was cured by maintaining at 60 ° C.
別途、本実施例で用いたカーボンブラック入りのシリコーン樹脂と、本参考例の方法でアミノ基を導入した透明なＰＭＭＡ板について、それぞれ、水の接触角を測定したところ、シリコーン樹脂の接触角の方が明らかに大きかった。実施例１と同様に接触角を測定したところ、アミノ基を導入したＰＭＭＡ板の対水接触角が６０度、本参考例で用いたシリコーン樹脂の対水接触角が１００度であった。
Separately, when the contact angle of water was measured for the silicone resin containing carbon black used in this example and the transparent PMMA plate introduced with amino groups by the method of this reference example, the contact angle of the silicone resin was measured. Was obviously bigger. When the contact angle was measured in the same manner as in Example 1, the contact angle with water of the PMMA plate introduced with amino groups was 60 degrees, and the contact angle with water of the silicone resin used in this reference example was 100 degrees.
さらに、別途同様な基材を作製して、この凹部における基材の分光反射率と分光透過率を参考例４と同様に測定したところ、可視光領域（４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも分光反射率は、５％以下であり、また、同範囲の波長で、分光透過率は１％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、ブロードであった。
Further, a similar base material was prepared separately, and the spectral reflectance and spectral transmittance of the base material in this recess were measured in the same manner as in Reference Example 4. As a result, spectroscopy was performed at any wavelength in the visible light region (400 nm to 800 nm). The reflectance was 5% or less, and the spectral transmittance was 1% or less at the same wavelength range. Both the spectral reflectance and the spectral transmittance were broad with no specific spectral pattern (such as a peak) in the visible light region.
参考例３と同様に、点着するＤＮＡの調整、凸部へのＤＮＡ溶液の点着、ハイブリダイゼーション用のＤＮＡの調整、ハイブリダイゼーションの操作を行い、参考例３と同様に測定を行った。その結果（Ｃｙ５の蛍光強度とノイズの凸部９箇所における平均値）を表４に示す。
In the same manner as in Reference Example 3 , adjustment of spotted DNA, spotting of a DNA solution on a convex portion, adjustment of DNA for hybridization, and hybridization were performed, and measurement was performed in the same manner as in Reference Example 3 . Table 4 shows the result (the fluorescence intensity of Cy5 and the average value of 9 noise protrusions).
参考例６
厚さ１ｍｍの透明なＰＭＭＡ板をスライドガラスと同じ大きさに切りだした。別途、エチレンジアミン５ｍｌを密閉容器の中に入れ、窒素でパージした後、ｎ−ブチルリチウムを５ｍｌ少しずつ加えた。これを２時間程度十分に攪拌し、紫色の反応物（ｎ−リチウムエチレンジアミン）を得た。これを、作製したＰＭＭＡ板に滴下し１分後に水で洗浄して、表面にアミノ基を導入した。
Reference Example 6
A transparent PMMA plate having a thickness of 1 mm was cut into the same size as the slide glass. Separately, 5 ml of ethylenediamine was put in a sealed container and purged with nitrogen, and then 5 ml of n-butyllithium was added little by little. This was sufficiently stirred for about 2 hours to obtain a purple reaction product (n-lithium ethylenediamine). This was dropped onto the produced PMMA plate and washed with water after 1 minute to introduce amino groups on the surface.
次いで、実施例１と同様に調整したＤＮＡ１の溶液を、ＰＭＭＡ板の９箇所に点着して、乾燥した。こうして、表面のアミノ基とＤＮＡを静電的な結合により固定化した。そして、これを純水で洗浄した。 Subsequently, the DNA1 solution prepared in the same manner as in Example 1 was spotted on nine places of the PMMA plate and dried. Thus, the amino group on the surface and DNA were immobilized by electrostatic bonding. And this was wash | cleaned with the pure water.
ハイブリダイゼーション用のＤＮＡは参考例３と同様に調整した。そして、このハイブリダイゼーション用の溶液をＰＭＭＡ板の上に２０μｌたらして、カバーガラスをかぶせた。この時、高さ０．２ｍｍのスペーサーをカバーガラスと基材の間に入れた。カバーガラスの周りをペーパーボンドでシールし、ハイブリダイゼーションの溶液が乾燥しないようにした。これを６５℃の条件で、１０時間インキュベートした後、オーブンから取りだし、カバーガラスを剥離後に洗浄、乾燥した。そして、参考例３と同様に測定を行った。その結果を表４に合わせて示す。
DNA for hybridization was prepared in the same manner as in Reference Example 3 . Then, 20 μl of this hybridization solution was put on a PMMA plate and covered with a cover glass. At this time, a spacer having a height of 0.2 mm was placed between the cover glass and the substrate. The cover glass was sealed with a paper bond to prevent the hybridization solution from drying. This was incubated at 65 ° C. for 10 hours, then removed from the oven, and the cover glass was peeled off, washed and dried. And it measured similarly to the reference example 3 . The results are also shown in Table 4.
このように、平面板と比較し、Ｓ／Ｎが良好であることがわかる。また、基材を黒色にすることにより、さらにＳ／Ｎが向上することがわかった。
Thus, compared to the flat surface plate, it can be seen that S / N is good. Moreover, it turned out that S / N improves further by making a base material black.
参考例７
次いで、凸部の高さがばらついた場合について実験を行った。ホットエンボス法により、基材の材料がポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の透明な基材を作製した。全体の大きさは、顕微鏡用のスライドガラスと同じ大きさであり、厚さを１ｍｍとした。また、一辺の長さが８ｍｍの正方形の領域の部分をへこませ、この中に、凸部を設け凹凸部を作製した。具体的には、凹凸部における、凹部から凸部表面までの高さ０．２ｍｍ、直径５００μｍ、ピッチが２ｍｍである９本の凸部を設けた。ついで、凸部をラッピングペーパーで削り、凸部上面の高さに差を設けた。すなわち、他の凸部上面（基準となる凸部）よりも、３０μｍ低い凸部（３箇所）がある基材（基材ア）、他の凸部上面よりも、５０μｍ低い凸部（３箇所）がある基材（基材イ）をそれぞれ作製した。なお、これら基材の低い部分以外の凸部上面の高さと、平坦部分の高さの差は０μｍであった。参考例３と同様に、点着するＤＮＡの調整、凸部上面へのＤＮＡ溶液の点着、ハイブリダイゼーション用のＤＮＡの調整、ハイブリダイゼーションの操作を行い、参考例３と同様に測定を行った。その結果（蛍光強度とノイズの平均値）を表５に示す。
Reference Example 7
Next, an experiment was performed for the case where the height of the convex portion varied. A transparent base material made of polymethyl methacrylate (PMMA) was produced by a hot embossing method. The overall size was the same as that of a microscope slide glass, and the thickness was 1 mm. Moreover, the part of the square area | region whose length of one side is 8 mm was dented, the convex part was provided in this, and the uneven part was produced. Specifically, nine convex portions having a height from the concave portion to the convex portion surface of 0.2 mm, a diameter of 500 μm, and a pitch of 2 mm in the concave and convex portions were provided. Next, the convex portion was shaved with wrapping paper, and a difference was made in the height of the upper surface of the convex portion. That is, a base material (base material a) having 30 μm lower convex portions (three locations) than the other convex portion upper surfaces (reference convex portions), and a 50 μm lower convex portion (three locations) than the other convex upper surfaces. ) Were prepared, respectively. In addition, the difference of the height of the convex part upper surface other than the low part of these base materials and the height of a flat part was 0 micrometer. As in Reference Example 3 , adjustment of spotted DNA, spotting of a DNA solution on the upper surface of the convex portion, adjustment of DNA for hybridization, and hybridization were performed, and measurement was performed in the same manner as in Reference Example 3 . . The results (average values of fluorescence intensity and noise) are shown in Table 5.
参考例８
参考例７と同様に、同様に基材を調整し他の凸部上面よりも、１００μｍ低い凸部（３箇所）がある基材（基材ウ）をそれぞれ作製した。参考例３と同様に測定を行った。その結果（蛍光強度とノイズの平均値）を表５に示す。
Reference Example 8
In the same manner as in Reference Example 7 , the base material (base material c) having convex portions (three places) lower by 100 μm than the upper surfaces of the other convex portions was prepared in the same manner. Measurements were performed in the same manner as in Reference Example 3 . The results (average values of fluorescence intensity and noise) are shown in Table 5.
このように、凸部の高さが大きく違うと、スキャナーの焦点深度の関係で、凸部の高さによってシグナル強度が大きく違ってしまい、評価する基材としては不適である。 Thus, if the height of the convex portion is greatly different, the signal intensity varies greatly depending on the height of the convex portion due to the depth of focus of the scanner, which is not suitable as a base material to be evaluated.
１ 平坦部
２ 凹凸部
３ マイクロアレイ
４ 対物レンズ
５ 励起光
６ マイクロアレイを治具に突き当てるためのバネ
１０ 導電性膜
１１ 凸部上面
１２ 導電性膜
１３ 絶縁膜
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Claims (10)
The substrate on which the selective binding substance according to any one of claims 1 to 9 is immobilized, wherein at least a part of the substrate is black.
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