JP4230723B2 - Subculture limit determination method, apparatus and computer program thereof - Google Patents
Subculture limit determination method, apparatus and computer program thereof Download PDFInfo
- Publication number
- JP4230723B2 JP4230723B2 JP2002186134A JP2002186134A JP4230723B2 JP 4230723 B2 JP4230723 B2 JP 4230723B2 JP 2002186134 A JP2002186134 A JP 2002186134A JP 2002186134 A JP2002186134 A JP 2002186134A JP 4230723 B2 JP4230723 B2 JP 4230723B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- subculture
- cell
- adhesion area
- cells
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Complex Calculations (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、継代培養限界判定方法、その装置及びそのコンピュータプログラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒト組織をインビトロ(in vitro)で培養し、培養した組織を患者に適用する技術が数多く報告されている。特にヒト皮膚組織については、欧米において商品化レベルにまで達している。ここで、ヒト皮膚組織、例えばヒト表皮角化細胞（Keratinocyte）による培養細胞シートの製品化のフローを図１０に基づいて説明する。まず、患者の健康な部位から少量の組織片を採取し、酵素処理によって細胞分散させた後、角化細胞を分離・回収する（ステップＳ１）。次に、その角化細胞を用いて初代培養を行う（ステップＳ２）。その後、初代培養で増殖させた細胞を別の複数の培養容器に分けて接種（播種）し（ステップＳ３）、培地交換等の操作を必要に応じて行うと、細胞が増殖して培養面での細胞の占める面積が徐々に増加し、所定面積に達する（ステップＳ４）。このとき、製品として総合的に必要となる十分な面積（細胞数）が確保されたか否かをチェックし（ステップＳ５）、確保されていなければ細胞をトリプシンなどのプロテアーゼによって培養容器から剥離・回収し（ステップＳ６）、必要な面積が確保できるまで継代培養を繰返し行うことで面積を増やす。一方、必要な面積が確保されたならば組織構築のために三次元培養（重層化）を施し（ステップＳ７）、これを移植用の培養細胞シートとして病院へ輸送し、移植を行う（ステップＳ８）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、細胞は寿命を持っていて無制限に***できるわけではないため、必要な面積を確保する前に寿命が訪れて増殖しなくなるケースがある。このように増殖しなくなると、三次元培養に進めないこともあるため、生産効率が低下するという問題があった。このため、細胞の寿命つまり継代培養の限界を予測する方法の確立が望まれていたが、細胞の寿命は細胞を採取した部位や患者の年齢などにより変動することから、これまでそのような予測をすることは困難であった。
【０００４】
本発明は上記問題点を解決することを課題とするものであり、細胞の継代培養限界を判定できる継代培養限界判定方法を提供すること、並びにその装置及びコンピュータプログラムを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段、発明の実施の形態及び発明の効果】
本発明者は、培養容器に接着した細胞の接着面積とその細胞の残り細胞***回数（つまりあと何回細胞***を行えるか）との関係を調べたところ、両者の間には細胞を採取した患者や採取部位等に依存せず細胞の培養条件に依存する相関関係があることがわかった。また、同じく細胞の倍加時間とその細胞の残りの細胞***回数との関係を調べたところ、両者の間にも細胞を採取した患者や採取部位等に依存せず細胞の培養条件に依存する相関関係があることがわかった。このような新たな知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明の継代培養限界判定方法は、特定の培養条件で培養した細胞が培養容器の底面に接着したときの接着面積を求め、その接着面積に基づいて継代培養を続けるか否かを判定するものである。細胞の接着面積とその細胞の残りの細胞***回数との相関関係は培養条件に依存して決まるため、細胞の培養条件と接着面積がわかればその細胞の寿命を予測することができる。このため、細胞の接着面積は継代培養を続けるべきか否かの指標となり得、細胞の接着面積を追跡すれば継代培養限界を判定できる。これにより、必要な面積を確保する前に細胞に寿命が訪れて増殖しなくなるケースであっても、細胞***能力が残っている状態のうちに三次元培養工程に移行すれば、継代培養中に細胞増殖が停滞することを未然に回避し、製品化することが可能となる。
【０００７】
なお、三次元培養は、細胞が重層化していけばどのような操作を行ってもよい。例えば、無血清培地による培養の場合にはＣａ（カルシウム）のリッチな培地に交換することにより重層化していき、フィーダーレイヤー(Feeder Layer)培養法の場合には所定時に継代操作をせずコンフルエント状態にし、そのコンフルエント状態に至った後さらに培養を続けることで重層化していく。
【０００８】
この方法を実現するための継代培養限界判定装置の一例としては、特定の培養条件で培養した細胞が培養容器の底面に接着したときの接着面積を求める接着面積算出手段と、前記接着面積算出手段によって算出された接着面積に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する判定手段とを備えたものが挙げられる。
【０００９】
ここで、「細胞」とは、まず培養容器の底面に直接接着するか又は細胞外マトリックスを介して間接的に接着し、次いでその接着面積が広がっていき、その後細胞***する接着依存性細胞のことをいう。例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の細胞が挙げられる。この温血動物の細胞としては、例えば、角化細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれら細胞の前駆細胞、幹細胞若しくは接着依存性のガン細胞が挙げられる。また、胚性肝細胞を使用することもできる。或いは、エリスロポエチン、成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インスリン、インターフェロン、血液凝固第VIII因子等の血液凝固因子、グルカゴン、組織プラスミノーゲンアクチゲーター、ドーパミン、ガン遺伝子、ガン抑制遺伝子等をコードする外来遺伝子を前記細胞に導入し、それらの遺伝子を種々のプロモータを用いて強制的に又は特定の条件下で発現させるように構成した形質転換細胞を使用してもよい。また、細胞外マトリックスとしては、例えば、インテグリン、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質等が挙げられる。
【００１０】
また、「特定の培養条件」とは、例えば、ガス雰囲気、培地、培地交換サイクル、継代タイミング（培養容器の底面がどの程度細胞に覆われたら継代を行うかのタイミング）、細胞分散剤（底面に接着している細胞を剥がすもの）などによって特定された条件をいう。
【００１１】
また、「培養容器」としては、細胞が培養できるものであれば特に限定されないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン等の合成樹脂、ヒドロキシアパタイトセラミックス、アルミナセラミックス、ガラス等から構成されたものが好適に使用される。
【００１２】
本発明の継代培養限界判定方法において、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの接着面積と残り細胞***回数との相関関係を求めておき、今回求めた接着面積をこの相関関係に照らすことにより継代培養を続けるか否かを判定してもよい。こうすれば、細胞の接着面積から残り細胞***回数を予測することができるため、継代培養を続けるか否かを判定しやすい。具体的には、残り細胞***回数が所定値（例えば１回とか２回）になったときを継代培養の限界点と定めたとすると、予め残り細胞***回数がその所定値になるときの接着面積を閾値として求めておき、今回算出された接着面積とその閾値とを比較することにより継代培養を続けるか否かを判定してもよい。より具体的には、本発明の継代培養限界判定方法において、継代培養を続けるか否かを判定するにあたっては、前記接着面積が所定の閾値より小さいときに継代培養を続けると判定してもよい。
【００１３】
この方法を実現する継代培養限界装置の一例としては、先ほど例示した装置構成において、前記判定手段は、前記接着面積算出手段によって算出された接着面積を、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの接着面積と残り細胞***回数との相関関係に照らすことにより、継代培養を続けるか否かを判定する構成が挙げられる。
【００１４】
本発明の継代培養限界判定方法において、前記接着面積を求めるにあたっては、前記細胞による前記底面の被覆割合を示す表面被覆率と前記底面の単位面積あたりいくつの細胞が接着しているかを表す接着細胞濃度とから前記細胞１個あたりの接着面積を求めてもよい。こうすれば、細胞１個あたりの接着面積を比較的容易に求めることができる。
【００１５】
この方法を実現する継代培養限界装置の一例としては、先ほど例示したいずれかの装置構成において、前記接着面積算出手段は、前記細胞による前記底面の被覆割合を示す表面被覆率と前記底面の単位面積あたりいくつの細胞が接着しているかを表す接着細胞濃度とから前記細胞１個あたりの接着面積を算出する構成が挙げられる。
【００１６】
本発明の継代培養限界判定方法において、前記接着面積を求めるにあたっては、前記培養容器の底面を撮像した画像に基づいて前記表面被覆率及び前記接着細胞濃度を算出し、前記表面被覆率と前記接着細胞濃度とから前記細胞１個あたりの接着面積を算出してもよい。こうすれば、培養容器の底面の撮像画像から細胞１個あたりの接着面積を容易に求めることができ、自動化にも適している。
【００１７】
この方法を実現する継代培養限界装置の一例としては、先ほど例示した装置構成において、前記培養容器の底面を撮像する撮像手段を備え、前記接着面積算出手段は、前記撮像手段によって撮像された画像に基づいて前記表面被覆率及び前記接着細胞濃度を算出し、前記表面被覆率と前記接着細胞濃度とから前記細胞１個あたりの接着面積を算出する構成が挙げられる。
【００１８】
ここで、表面被覆率と接着細胞濃度とから細胞１個あたりの接着面積を算出する一例を示す。測定時における細胞１個当たりのみかけの接着面積（みかけの細胞接着面積）をＡｃ、培養容器底面に占める細胞の表面被覆率をＣｄ、接着細胞濃度をＸａとすると、Ａｃは下記数１式で表される。なお、本明細書では、ある特定の細胞のパラメータ値ではなく複数の細胞の平均のパラメータ値であることを表す場合には、パラメータの先頭に「みかけの」を付すものとする。
【００１９】
【数１】
Ａｃ＝Ｃｄ／Ｘａ
【００２０】
なお、Ｘａは単位面積当たりの接着細胞数を表すパラメータであるが、撮像手段によって撮像された培養容器底面の画像全体の面積をＳ、画像全体に占める接着細胞数をｎａとすると、Ｘａは下記数２式で表される。このＸａは培養容器底面の複数箇所で撮像した画像を用いて算出し、その平均値を採用することが好ましい。
【００２１】
【数２】
Ｘａ＝ｎａ／Ｓ
【００２２】
また、表面被覆率Ｃｄは、単位面積当たりの細胞接着面積の割合を表すパラメータであり、下記数３式で示されるように、撮像手段によって撮像された培養容器底面の画像において、画像全体の面積Ｓに対する個々の細胞の接着面積Ｓａの総和（ΣＳａ）が占める割合で示される。
【００２３】
【数３】
Ｃｄ＝（ΣＳａ）／Ｓ
【００２４】
例えば、紀ノ岡らの論文（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６７，ｐ２３４−２３９（２０００））の画像解析手法を撮像画像に施すことにより得られる。この場合、原画像に対して背景分離処理、ルックアップテーブル変換処理、平滑化処理、二値化抽出処理、孤立点除去処理、クロージング処理、穴埋め処理、エリア抽出処理、画素数計測処理の順に画像解析を行い、画像全体の画素数（面積Ｓ）に対する細胞接着部分の画素数（接着面積の総和ΣＳａ）の割合を表面被覆率Ｃｄとして算出する。なお、原画像に対する接着部分の抽出処理としては、これらの画像処理方法に限定されず、種々の画像解析処理を行うことが可能である。このＣｄは継代タイミングの指標として用いることができ、例えばＣｄが所定値以上になった時点又は所定値を越えた時点を継代タイミングとし、培養容器から細胞を剥離して次の継代培養を行うようにしてもよい。
【００２５】
次に、細胞***回数を算出する一例を示す。継代回数Ｎｐにおけるみかけの細胞***回数をＮd,Np、初期の細胞接種濃度をＸ０とすると、Ｎd,Npは下記数４式で表される。そして、一連の継代培養（継代培養１回目から最終回まで）における累積細胞***回数Ｎｄは、各継代培養における総和として表される。
【００２６】
【数４】
Ｎd,Np＝ｌｏｇ2（Ｘａ／Ｘ０）
【００２７】
本発明の継代培養限界判定方法において、前記特定の培養条件で培養した細胞の倍加時間を求め、前記接着面積及び前記倍加時間の両方に基づいて継代培養を続けるか否かを判定してもよい。この継代培養限界判定方法では、特定の培養条件で培養した細胞が培養容器の底面に接着したときの接着面積及びその細胞の倍加時間を求め、その接着面積及び倍加時間に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する。ここで、細胞の接着面積が継代培養を続けるべきか否かの指標となり得ることは前述したが、細胞の倍加時間とその細胞の残りの細胞***回数との相関関係も培養条件に依存して決まるため、細胞の培養条件と倍加時間とがわかればその細胞の寿命を予測することができる。このため、細胞の倍加時間は継代培養を続けるべきか否かの判定の指標となり得る。つまり、細胞の倍加時間を追跡すれば継代培養限界を判定できる。これにより、必要な面積を確保する前に細胞に寿命が訪れて増殖しなくなるケースであっても、細胞***能力が残っている状態のうちに三次元培養工程に移行すれば、継代培養中に細胞増殖が停滞することを未然に回避し、製品化することが可能となる。
【００２８】
この方法を実現する継代培養限界装置の一例としては、先ほど例示したいずれかの装置構成において、前記特定の培養条件で培養した細胞の倍加時間を求める倍加時間算出手段を備え、前記判定手段は、前記細胞接着面積算出手段によって算出された接着面積及び前記倍加時間算出手段によって算出された倍加時間の両方に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する構成が挙げられる。
【００２９】
ここで、倍加時間を算出する一例を示す。みかけの倍加時間をｔｄとすると、ｔｄは下記数５式で表される。ここで、ｔは測定時、△ｔは微小時間（例えば２４時間）を表す。
【００３０】
【数５】
本発明の継代培養限界判定方法において、特定の培養条件で培養した細胞の倍加時間を求め、その倍加時間に基づいて継代培養を続けるか否かを判定してもよい。前述の通り、細胞の倍加時間を追跡しても継代培養限界を判定できる。
【００３２】
この方法を実現する継代培養限界判定装置の一例としては、特定の培養条件で培養した細胞の倍加時間を求める倍加時間算出手段と、前記倍加時間算出手段によって算出された倍加時間に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する判定手段とを備えたものが挙げられる。
【００３３】
本発明の継代培養限界判定方法において、倍加時間を利用する場合には、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの倍加時間と残り細胞***回数との相関関係を求めておき、今回求めた倍加時間をこの相関関係に照らすことにより継代培養を続けるか否かを判定してもよい。こうすれば、細胞の倍加時間から残り細胞***回数が予測できるため、継代培養を続けるか否かを判定しやすい。具体的には、残り細胞***回数が所定値（例えば１回とか２回）になったときを継代培養の限界点と定めたとすると、予め残り細胞***回数がその所定値になるときの倍加時間を閾値として求めておき、今回算出された倍加時間とその閾値とを比較することにより継代培養を続けるか否かを判定してもよい。
【００３４】
この方法を実現するための継代培養限界判定装置の一例としては、先ほどの継代培養限界判定装置において、細胞の倍加時間を継代培養を続けるべきか否かの判定の指標とする際、前記判定手段は、前記倍加時間算出手段によって算出された倍加時間を、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの倍加時間と残り細胞***回数との相関関係に照らすことにより、継代培養を続けるか否かを判定する構成が挙げられる。
【００３５】
本発明の継代培養限界判定方法において、前記特定の培養条件で培養した細胞の比増殖速度を求め、前記比増殖速度を指標の一つとして継代培養を続けるか否かを判定してもよい。この継代培養限界判定方法では、特定の培養条件で培養した細胞の比増殖速度を求め、その比増殖速度を指標の一つとして継代培養を続けるか否かを判定する。例えば、前記比増殖速度のみに基づいて判定してもよいし、前記接着面積及び前記比増殖速度に基づいて判定してもよいし、前記倍加時間及び前記比増殖速度に基づいて判定してもよいし、前記接着面積、前記倍加時間及び前記比増殖速度に基づいて判定してもよい。ここで、細胞の接着面積や倍加時間が継代培養を続けるべきか否かの指標となり得ることは前述したが、細胞の比増殖速度とその細胞の残りの細胞***回数との相関関係も培養条件に依存して決まるため、細胞の培養条件と比増殖速度とがわかればその細胞の寿命を予測することができる。このため、細胞の比増殖速度は継代培養を続けるべきか否かの判定の指標となり得る。つまり、細胞の比増殖速度を追跡すれば継代培養限界を判定できる。これにより、必要な面積を確保する前に細胞に寿命が訪れて増殖しなくなるケースであっても、細胞***能力が残っている状態のうちに三次元培養工程に移行すれば、継代培養中に細胞増殖が停滞することを未然に回避し、製品化することが可能となる。
【００３６】
この方法を実現する継代培養限界装置の一例としては、先ほど例示したいずれかの装置構成において、前記特定の培養条件で培養した細胞の比増殖速度を求める比増殖速度算出手段を備え、前記判定手段は、前記比増殖速度算出手段によって算出された比増殖速度を指標の一つとして継代培養を続けるか否かを判定する構成が挙げられる。
【００３７】
ここで、比増殖速度を算出する一例を示す。みかけの比増殖速度をμとすると、μは下記数６式で表される。ここで、ｔは測定時、△ｔは微小時間（例えば２４時間）を表す。
【００３８】
【数６】
本発明の継代培養限界判定方法において、特定の培養条件で培養した細胞の比増殖速度を求め、その比増殖速度に基づいて継代培養を続けるか否かを判定してもよい。前述の通り、細胞の比増殖速度を追跡しても継代培養限界を判定できる。
【００４０】
この方法を実現する継代培養限界判定装置の一例としては、特定の培養条件で培養した細胞の比増殖速度を求める比増殖速度算出手段と、前記比増殖速度算出手段によって算出された比増殖速度に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する判定手段とを備えたものが挙げられる。
【００４１】
本発明の継代培養限界判定方法において、比増殖速度を利用する場合には、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの比増殖速度と残り細胞***回数との相関関係を求めておき、今回求めた比増殖速度をこの相関関係に照らすことにより継代培養を続けるか否かを判定してもよい。こうすれば、細胞の比増殖速度から残り細胞***回数が予測できるため、継代培養を続けるか否かを判定しやすい。具体的には、残り細胞***回数が所定値（例えば１回とか２回）になったときを継代培養の限界点と定めたとすると、予め残り細胞***回数がその所定値になるときの比増殖速度を閾値として求めておき、今回算出された比増殖速度とその閾値とを比較することにより継代培養を続けるか否かを判定してもよい。
【００４２】
この方法を実現するための継代培養限界判定装置の一例としては、先ほどの継代培養限界判定装置において、細胞の比増殖速度を継代培養を続けるべきか否かの判定の指標とする際、前記判定手段は、前記比増殖速度算出手段によって算出された比増殖速度を、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの比増殖速度と残り細胞***回数との相関関係に照らすことにより、継代培養を続けるか否かを判定する構成が挙げられる。
【００４３】
コンピュータを上述の継代培養限界判定装置として機能させるためのプログラムや、コンピュータに上述の継代培養限界判定方法を実現させるためのプログラムは、通常、コンピュータのＣＰＵによって読み出すことが可能なＣＤ−ＲＯＭやＨＤＤ等の記録媒体に記録され、そこからＣＰＵによって読み出されて実行される。このため、このようなプログラムは上述した継代培養限界方法の作用効果を発揮するために用いられ、有用性が高い。また、このプログラムは、コンピュータが読み取り可能な記憶媒体（例えばハードディスク、ＲＯＭ、ＦＤ、ＣＤ、ＤＶＤなど）に記録されていてもよいし、伝送媒体（インターネットやＬＡＮなどの通信網）を介して配信されてもよいし、その他どのような形で授受されてもよい。
【００４４】
なお、本実施形態では、継代培養の限界判定のための指標として細胞の接着面積による説明を行ったが、接着面積の代わりに細胞を培養容器の一面（例えば底面）に投影させたときの投影面積を利用しても、同様の効果を得ることができる。この場合、走査型共焦点レーザ顕微鏡等の焦点能力の高い撮影装置を利用しなくとも、ＣＣＤカメラ等の焦点能力の低い撮影装置を利用することができ、簡易な構成とすることができる。
【００４５】
【実施例】
［実施例１］
１．使用した角化細胞
本実施例では０才***由来の角化細胞、２２才***由来の角化細胞、７０才***由来の角化細胞（いずれも（株）クラボウ製）を凍結バイアルとして購入し使用した。いずれも初代培養を経た後、凍結された細胞群であった。
【００４６】
２．継代培養の手順
図１は培養操作の概略説明図である。図１に示すように、凍結バイアルを速やかに融解した後、培養容器であるポリスチレン製７５ｃｍ2Ｔ型フラスコ（ヌンク社製）に接種した。この培養操作を継代１回目（Ｎｐ＝１）と定義した。培養は無血清培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２、（株）クラボウ製）中、３７℃、ＣＯ2５％雰囲気下で行った。培養中、培地交換は７２時間ごとに行った。そして、Ｔ型フラスコの底面を細胞が被覆する表面被覆率Ｃｄが０．８を越えた時点、つまり培養容器底面の８０％が細胞で覆われた時点で次回の継代培養に移行した。継代培養は、まず、０．１％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ溶液を培養面１ｃｍ2あたり０．０２ｍｌとなるように滴下して３７℃にて３分間静置することで細胞群を剥離し、次に、トリプシンインヒビターによって剥離を停止させた後、細胞群を回収して１０００ｒｐｍ、８分間の遠心分離によって各酵素を除去し、続いて、新鮮な培地によって細胞を再懸濁し、生存細胞の接種濃度が１．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2となるように新しいＴ型フラスコに接種した。培養は前出の無血清培地中で３７℃、ＣＯ2５％雰囲気下で行い、培地交換は７２時間ごとに行った。そして、表面被覆率Ｃｄが０．８を越えた時点で次回の継代培養に移行した。本実施例では継代５回（Ｎｐ＝５）まで行った。
【００４７】
３．各継代培養におけるパラメータの算出
各継代培養において、Ｔ型フラスコ１個あたり底面３箇所をＣＣＤカメラによって毎日培養容器底面の画像を取り込み、撮影された画像の面積Ｓにおける接着細胞数ｎａをカウントし、下記数７式に示すように各箇所での接着細胞濃度Ｘａ’を算出し、それらの平均値をそのときの接着細胞濃度Ｘａとした。
【００４８】
【数７】
Ｘ’ａ＝ｎａ／Ｓ
Ｘａ ＝（底面３箇所でのＸ’ａの平均値）
【００４９】
また、紀ノ岡らの論文（前出）の画像解析手法を撮影画像に施すことにより、撮影された画像（面積Ｓ）における細胞接着部分の総和面積ΣＳａを画素数に基づいて、下記数８式に示すように各箇所での細胞の表面被覆率Ｃ’ｄを算出し、それらの平均値をそのときの表面被覆率Ｃｄとした。更に、下記数９式により、みかけの細胞接着面積Ａｃを算出した。
【００５０】
【数８】
Ｃ’ｄ＝（ΣＳａ）／Ｓ
Ｃｄ ＝（底面３箇所でのＣ’ｄの平均値）
【００５１】
【数９】
Ａｃ＝Ｃｄ／Ｘａ
【００５２】
ここで、図２は、ある継代培養での培養時間ｔに対する接着細胞濃度Ｘａの変化を表したグラフである。細胞の培養過程は、一般に細胞接着期、誘導期及び対数増殖期を含んでなり、細胞接着期は、培養容器内に接種してからその容器底面に接着するまでの期間であり、誘導期は、細胞接着期の終了後から培養容器底面に接着した細胞が細胞***を開始するまでの期間であり、対数増殖期は、前記誘導期の終了後から培養容器の底面にほぼコンフルエントな状態（本実施例ではＣｄ＝０．８）になるまでの期間である。
【００５３】
各継代培養でのみかけの細胞***回数Ｎd,Npは、下記数１０式から算出した。そして、このＮd,Npを累積することにより累積細胞***回数Ｎｄを算出した。また、みかけの倍加時間ｔｄは下記数１１式より算出し、みかけの比増殖速度μは下記数１２式より算出した。なお、これ以降、各パラメータにつき接頭語の「みかけの」を省略して説明することもある。
【００５４】
【数１０】
Ｎd,Np＝ｌｏｇ2（Ｘａ／Ｘ０）
但し、Ｘ０＝１．０×１０4cells/cm2
Ｎｄ＝（累積細胞***回数）
【００５５】
【数１１】
【数１２】
４．倍加時間と寿命満了時について
一連の継代培養の増殖過程を示すために、０才ドナー由来の角化細胞の累積培養時間に対する、累積細胞***回数Ｎｄ及びみかけの倍加時間ｔｄの変化を表すグラフを図３に示す。
【００５８】
各継代培養において次の継代培養に移る直前の表面被覆率Ｃｄは、それぞれ０．８３，０．８９，０．８８，０．８１であった。図３から明らかなように、継代２回目及び３回目（Ｎｐ＝２及び３）の培養後期には、みかけの倍加時間ｔｄが急激に上昇したが、次の継代培養の初期ではこの影響を受けることなく倍加時間は低い値に戻り、細胞群の増殖は良好であった。このみかけの倍加時間ｔｄの一時的な上昇は、接触阻害（Contact Inhibition）の発現によるものと考えられる。接触阻害は、隣合う細胞同士が接触し、細胞***できる空間が少なくなることによって細胞増殖が抑制される現象をいう。しかし、継代４回目（Ｎｐ＝４）において、累積培養時間が４００時間を越えた頃から細胞群の***は継代３回目まで続いた上昇が見られなくなり、接触阻害の影響を受けているとは考えられない時期からみかけの倍加時間ｔｄが増大し続け、次の継代５回目（Ｎｐ＝５）の初期にもみかけの倍加時間ｔｄが低い値に戻ることはなかった。
【００５９】
本実施例では、角化細胞の寿命満了時は、継代１回目における平均倍加時間を基準としてその１０倍の倍加時間に達したときと定義した。具体的には、継代１回目における平均倍加時間は２０．６時間であったため、倍加時間が２０６時間に達した時を寿命満了時と定義した。そして、図３に基づいて倍加時間が２０６時間になったときの累積培養時間を求め、それに対応する累積細胞***回数Ｎｄを求め、それを寿命満了時の限界細胞***回数ＮｄＦとした。寿命満了時以降の累積細胞***回数ＮｄはほぼＮｄＦのままであり、更なる細胞***はほとんど起こっていないことがわかる。このことは、寿命満了時の定義が妥当であることを示している。
【００６０】
このように倍加時間によって寿命満了時を定義することは以下の事実によってもその妥当性が支持される。即ち、継代培養を繰り返した細胞群は、別途調べた分化度合いの指標であるインボルクリン含有量が顕著に増大したことから明らかなように成熟した細胞（分化した細胞）の割合が高くなっているが、このような細胞は***能力が低下していることから結果として細胞群全体の倍加時間が著しく増大することになる。逆にいえば、当初に比べて倍加時間が著しく増大したということは細胞***能力をほとんど持たない細胞で占められているということであり、細胞群全体としてみたときに寿命満了とみて差し支えないといえる。
【００６１】
５．残り細胞***回数と細胞接着面積又は倍加時間との関係
残り細胞***回数をＮｄＲとすると、このＮｄＲは下記数１３式のように、限界細胞***回数ＮｄＦから現在の累積細胞***回数Ｎｄを差し引いた値として表される。
【００６２】
【数１３】
ＮｄＲ＝ＮｄＦ−Ｎｄ
【００６３】
この残り細胞***回数ＮｄＲに対するみかけの倍加時間ｔｄの変化と、同じくみかけの細胞接着面積Ａｃの変化を図４に示した。図４では、０才由来、２２才由来、７０才由来の各角化細胞を用いて培養したときの結果をまとめて表記した。この図４から明らかなように、残り細胞***回数ＮｄＲに対するみかけの倍加時間ｔｄの変化及びみかけの細胞接着面積Ａｃの変化は、ドナーによらずどの角化細胞もほぼ同一曲線上に沿って推移することがわかった。また、残り細胞***回数ＮｄＲに対するみかけの倍加時間ｔｄの変化及びみかけの細胞接着面積Ａｃの変化は、本実施例の培養条件と異なる条件を採用した場合には異なる曲線に沿って推移したが、その培養条件を採用する限りドナーによらずどの細胞もほぼ同一曲線上に沿って推移することもわかった（実施例２参照）。
【００６４】
残り細胞***回数ＮｄＲが僅かになった細胞は、みかけの倍加時間ｔｄ及びみかけの細胞接着面積Ａｃが急激に増大しているが、これは寿命満了のために細胞***することなくただ培養面に接着している状態の細胞が多数を占めていることによると考えられる。このように、寿命満了間近になるとみかけの倍加時間ｔｄ及びみかけの細胞接着面積Ａｃが急激に増大するということは、逆にいえば、みかけの倍加時間ｔｄ及びみかけの細胞接着面積Ａｃが急激に増大したときには寿命満了間近になり、更なる継代培養を行うのに相応しくないといえる。
【００６５】
具体的には、残り細胞***回数ＮｄＲの下限回数を予め定めておき（例えば１回）、その下限回数に対応したみかけの倍加時間ｔｄ及びみかけの細胞接着面積Ａｃを図４から求め、そのようにして求めたみかけの倍加時間ｔｄ及びみかけの細胞接着面積Ａｃを予め閾値として定めておく。その後、同じ培養条件で同じ又は異なるドナー由来の角化細胞を培養したとき、時間の経過に伴ってみかけの倍加時間ｔｄ及びみかけの細胞接着面積Ａｃを算出し、それらを先ほどの閾値と比較し、閾値を越えた時点で残り細胞***回数ＮｄＲが予め定めた下限回数を下回ったと判断し、次回の継代培養処理を中止すればよい。したがって、図１０のステップＳ５において必要な面積を確保する前に細胞に寿命が訪れて増殖しなくなるケースであっても、細胞***能力が残っている状態のうちに三次元培養工程（図１０のステップＳ７）に移行すれば、継代培養中に細胞増殖が停滞することを未然に回避し、製品化することが可能となる。なお、上述のようにみかけの倍加時間ｔｄとみかけの細胞接着面積Ａｃの両方に基づいて継代培養を続けるか否かを判定してもよいが、いずれか一方に基づいて継代培養を続けるか否かを判定してもよい。
【００６６】
６．残り細胞***回数と比増殖速度との関係
上述した５．では細胞接着面積Ａｃと倍加時間ｔｄのいずれか一方又は両方を判定指標として残り細胞***回数を予測し、継代培養限界の判定を行ったが、これらに代えて又は加えて、みかけの比増殖速度μを判定指標としてもよい。比増殖速度μは、下記数１４式のように、みかけの倍加時間ｔｄから求めることができるが、接着細胞濃度Ｘａの時間変化から求めることもできる。なお、Ｘａ（ｔ）は時刻ｔにおける接着細胞濃度を表し、△ｔは微小時間（例えば２４時間）を表す。
【００６７】
【数１４】
図５に、０才、２２才、７０才ドナー由来の各角化細胞の培養時間に対する累積細胞***回数Ｎｄ、みかけの比増殖速度μ及びみかけの接着細胞面積Ａｃの変化を表すグラフを示した。但し、プロットした実験結果は、上述した５．の実験と同一条件下で行った別の実験の結果である。図５に示される各角化細胞の比増殖速度μの変化において、μの値が顕著に減少する直前点を臨界点（図中の矢印）として求めた。μが顕著に減少するということは、倍加時間ｔｄが著しく増大したことを示すので、細胞の増殖能が低下し、継代培養の限界が近いことを意味する。
【００６９】
表１には、各臨界点における比増殖速度μ、細胞接着面積Ａｃ、残り細胞***回数ＮｄＲを示した。この表１に示されるように、臨界点においては細胞株によることなく比増殖速度μ、細胞接着面積Ａｃがほぼ同じ値を示した。また、臨界点以降の残り細胞***回数ＮｄＲ（＝ＮｄＦ−Ｎｄ）も２〜３回であった。このため、これらの臨界点に基づいて比増殖速度μの閾値を定めておき、その後同じ培養条件で同じ又は異なるドナー由来の角化細胞を培養したとき、時間の経過に伴って比増殖速度μを算出し、それらを先ほどの閾値と比較すれば、継代培養限界（残り細胞***回数ＮｄＲが例えば２〜３回となる時期）を予測することができる。このように継代培養限界を予測することにより、細胞が増殖不可能になる前に三次元培養工程に移行して製品化（シート化）することが可能となる。例えば、比増殖速度μ［ｈ-1］の閾値を０．０２とすることで、継代限界となる前すなわち残り細胞***回数ＮｄＲが２〜３回の状態で三次元培養工程に進んで製品化することが可能となる。なお、限界細胞***回数ＮｄＦついては、上述した４．と同様にして求めた。
【００７０】
【表１】
図６に、残り細胞***回数ＮｄＲとみかけの比増殖速度μとの関係を表すグラフを示す。比増殖速度μも倍加時間ｔｄと同様、細胞株によらず一様のフィッティングラインで示される。これは、μとｔｄが反比例の関係にあることを考慮すれば予想され得ることである。図６に示されるように、各臨界点（黒塗）を境にＮｄＲがゼロに近づくにつれて比増殖速度μが急激に減少し、再び臨界点の値よりも大きくなることはなかった。この臨界点の前後において近似直線（図中の点線）の傾きが異なるため、両直線の交点におけるμの値に基づいて閾値を設定することで、容易且つ明確に継代培養限界を判定、評価することができる。あるいは、倍加時間ｔｄの場合とは異なり、各年齢のプロットのいずれについてもプロットの存在しない領域（図６の斜線領域）が現れるため、この領域に閾値を設定することで、倍加時間ｔｄの閾値を設定する場合に比べて容易且つ明確に継代培養限界を判定、評価することができる。
【００７２】
［実施例２］
実施例１では無血清培地による培養について説明したが、本実施例では実施例１とは異なる培養法であるフィーダーレイヤー(Feeder Layer)培養法について説明する。
【００７３】
１．使用した表皮細胞
本実施例では２０才（２個体）、４７才、５５才（２個体）、６８才の患者から皮膚組織を採取し、ディスパーゼやトリプシン等のプロテアーゼにより表皮細胞(keratinocyte)として単離した。この表皮細胞を用いて細胞懸濁液を調製した。
【００７４】
２．継代培養の手順
マイトマイシンＣにより増殖能を抑制したマウス線維芽細胞をフィーダ細胞として、培養フラスコの底面に敷設した後、１．で調製した細胞懸濁液を播種した。この培養操作を継代１回目（Ｎｐ＝１）と定義した。細胞播種後、５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）−ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）を培養用培地として注入し、フィーダ細胞の存在下で表皮細胞を培養した。表皮細胞のコロニー形成が確認された後、適時にトリプシンにより細胞群を剥離し、次に、トリプシンインヒビターによって剥離を停止させた後、細胞群を回収して１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって各酵素を除去した。続いて、新鮮な培地によって細胞を再懸濁し、新しい培養フラスコに播種した。
【００７５】
本実施例では、所定時間が経過しても継代操作に必要となる十分な細胞が得られなくなったとき、例えば、観察的にはコロニー（細胞集団）が十分に形成されなかったときを細胞増殖の限界とし、一つ前の継代培養を限界継代回数ＮｐＦとした。したがって、本実施例においては、各個体によって限界継代回数ＮｐＦが５〜１４と大きく異なる。
【００７６】
３．各継代培養におけるパラメータの算出
各継代培養において、みかけの細胞***回数Ｎd,Npを下記数１５式より、みかけの倍加時間ｔｄを下記数１６式より算出した。但し、本実施例においては、Ｘ０は播種細胞密度、Ｘａは次の継代操作時（細胞回収時）における細胞密度、Δｔは１回の継代培養に要した培養時間を示す。
【００７７】
【数１５】
Ｎd,NP＝ｌｏｇ2（Ｘａ／Ｘ０）
【００７８】
【数１６】
４．残り細胞***回数と倍加時間との関係
本実施例における残り細胞***回数ＮｄＲと倍加時間ｔｄとの関係を図７に示す。ここでは、継代１回ごとにその継代の初期の細胞数と終期の細胞数とをカウントし、フラスコ底面の大きさで除することによりそれぞれの細胞密度Ｘ０，Ｘａを求め、それらの細胞密度に基づいて倍加時間ｔｄを求めたため、１回の継代につき１つの倍加時間ｔｄが対応することになる。したがって、各細胞において図７にプロットされた数だけ継代培養が行われたことになる。なお、残り細胞***回数ＮｄＲは下記数１７式で表される。累積細胞***回数ＮｄはＮd,Npを累積することにより算出した。
【００８０】
【数１７】
ＮｄＲ＝ＮｄＦ−Ｎｄ
【００８１】
図７では、２０才由来（２個体）、４７才、５５才（２個体）、６８才由来の各表皮細胞を用いて培養したときの結果をまとめて表記した。この図７から明らかなように、残り細胞***回数ＮｄＲに対するみかけの倍加時間ｔｄの変化は、継代回数や患者（個体差）によらず、どの表皮細胞もほぼ同一曲線上に沿って推移することがわかった。また、残り細胞***回数ＮｄＲが僅かになった細胞は、みかけの倍加時間ｔｄが急激に増加することがわかった。即ち、みかけの倍加時間ｔｄの急激な増大は寿命満了が間近であることを示しており、更なる継代培養を行うのに相応しくないといえる。
【００８２】
具体的には、残り細胞***回数ＮｄＲの下限回数を予め定めておき（例えば２〜３回）、その下限回数に対応したみかけの倍加時間ｔｄを図７から求め、そのようにして求めたみかけの倍加時間ｔｄを予め閾値として定めておく。一方、新たに培養を開始し、時間の経過に伴ってみかけの倍加時間ｔｄを算出し、それらを先ほどの閾値と比較し、閾値を超えた時点で残り細胞***回数ＮｄＲが予め定めた下限回数を下回ったと判断し、次回の継代培養処理を中止すればよい。
【００８３】
このように、培養条件を変えたフィーダーレイヤー培養法によっても、個体間の差は見られず、倍加時間ｔｄと残り細胞***回数ＮｄＲとの関係は一様なフィッティングラインで示された。したがって、本発明は培養条件が異なる種々の培養方法に広く応用できる。また、同一培養条件においては、細胞の個体特性によることなく閾値を設定することができるので、容易に細胞***限界又は継代限界を判定することができ、そのような限界に至る前に三次元培養工程に移して製品化（シート化、重層化）することができる。なお、本実施例においては、倍加時間ｔｄを用いて継代培養限界の判定を行ったが、実施例１の６．で述べたように比増殖速度μを用いて判定してもよい。
【００８４】
［実施例３］
以上の知見に基づいて製作される継代培養限界判定装置１０は、図８に示すように、培養中のＴ型フラスコ底面を撮影する撮像手段としてのＣＣＤカメラ１１と、各種指令やデータを入力する入力装置としてのキーボード１２と、各種情報を出力する出力装置としてのディスプレイ１３と、各種演算を実行する処理装置としてのコンピュータ１４とを備えて構成されている。
【００８５】
コンピュータ１４は、オペレータによって継代培養判定処理の開始が入力されたあと、予め定められた測定タイミングになるごとに内部メモリから継代培養判定処理のプログラムを読み出し、これを実行する。図９は継代培養判定処理のフローチャートである。まず、ＣＣＤカメラ１１は継代培養中のＴ型フラスコ底面を撮影してその画像をコンピュータ１４へ送信するが、そのＣＣＤカメラ１１から送信されてきた画像を読み込み（ステップＳ１００）、その画像に基づいて接着細胞濃度Ｘａ及び表面被覆率Ｃｄを前出の数７式及び数８式に基づいて算出する（ステップＳ１１０）。接着細胞濃度Ｘａを算出する際には細胞数が必要になるが、この細胞数はコールタカウンタなどの自動測定器から読み込む構成としてもよいし、オペレータが別途測定した値をキーボード等から入力する構成としてもよい。続いて、表面被覆率Ｃｄと接着細胞濃度Ｘａから前出の数９式に基づいてみかけの細胞接着面積Ａｃを算出し（ステップＳ１２０）、今回のみかけの細胞接着面積Ａｃと細胞接着面積閾値とを比較し（ステップＳ１３０）、前者が後者以下ならば残り細胞***回数は十分であり増殖能力があるとみなしてディスプレイ１３に継代培養の継続を許容する旨の表示を出力し（ステップＳ１４０）、このプログラムを終了する。一方、ステップＳ１３０で前者が後者を上回ったならば残り細胞***回数は僅かであり増殖能力が低いとみなしてディスプレイ１３に次回の継代培養処理の中止を促す表示を出力し（ステップＳ１５０）、このプログラムを終了する。
【００８６】
この継代培養限界判定装置１０によれば、継代培養を継続すべきか否かの判断を的確に行うことができるため、必要な面積を確保する前に細胞に寿命が訪れて増殖しなくなるケースであっても、細胞***能力が残っている状態のうちに三次元培養工程に移行すれば、継代培養中に細胞増殖が停滞することを未然に回避し、製品化することが可能となる。
【００８７】
この継代培養限界判定装置１０はみかけの細胞接着面積Ａｃに基づいて継代培養を続けるべきか否かを判定したが、これとは別に、みかけの倍加時間ｔｄを算出し、これとみかけの倍加時間閾値とを比較し、前者が後者以下ならば増殖能力があるとみなして継代培養の継続を許容する旨をディスプレイ１３に表示し、前者が後者を上回ったならば増殖能力が低いとみなして次回の継代培養処理を中止する旨をディスプレイ１３に表示してもよい。あるいは、みかけの比増殖速度μを算出し、これとみかけの比増殖速度閾値とを比較し、前者が後者以下ならば増殖能力があるとみなして継代培養の継続を許容する旨をディスプレイ１３に表示し、前者が後者を上回ったならば増殖能力が低いとみなして次回の継代培養処理を中止する旨をディスプレイ１３に表示してもよい。また、みかけの細胞接着面積Ａｃ、みかけの倍加時間ｔｄ、みかけの比増殖速度μの一つが閾値を上回ったときに増殖能力が低いとみなしてもよいし、いずれか二つが閾値を上回ったときに増殖能力が低いとみなしてもよいし、三つとも閾値を上回ったときに増殖能力が低いとみなしてもよい。
【００８８】
なお、上述した継代培養限界判定装置１０では、コンピュータ１４が本発明の接着面積算出手段及び判定手段に相当し、ＣＣＤカメラ１１が撮像手段に相当するが、コンピュータ１４がみかけの倍加時間ｔｄを求める場合にはは倍加時間算出手段にも相当し、コンピュータ１４がみかけの比増殖速度μを求める場合には比増殖速度算出手段にも相当する。
【図面の簡単な説明】
【図１】培養操作の概略説明図である。
【図２】ある継代培養での培養時間ｔに対する接着細胞濃度Ｘａ（ｔ）の変化を表したグラフである。
【図３】０才ドナー由来の角化細胞の累積培養時間に対する、累積細胞***回数Ｎｄ及びみかけの倍加時間ｔｄの変化を表すグラフである。
【図４】残り細胞***回数ＮｄＲに対するみかけの倍加時間ｔｄ及びみかけの細胞接着面積Ａｃの変化を表すグラフである。
【図５】各角化細胞の培養時間に対する累積細胞***回数Ｎｄ、みかけの比増殖速度μ及びみかけの接着細胞面積Ａｃの変化を表すグラフである。
【図６】残り細胞***回数ＮｄＲとみかけの比増殖速度μとの関係を表すグラフである。
【図７】残り細胞***回数ＮｄＲと倍加時間ｔｄとの関係を表すグラフである。
【図８】継代培養限界判定装置の概略構成図である。
【図９】継代培養限界判定処理のフローチャートである。
【図１０】ヒト皮膚組織の製品化のフローである。
【符号の説明】
１０・・・継代培養限界判定装置、１１・・・ＣＣＤカメラ、１２・・・キーボード、１３・・・ディスプレイ、１４・・・コンピュータ、Ａｃ・・・みかけの細胞接着面積、Ｃｄ・・・表面被覆率、Ｎｄ・・・累積細胞***回数、ＮｄＦ・・・限界細胞***回数、ＮｄＲ・・・残り細胞***回数、Ｎｐ・・・継代回数、ｔｄ・・・倍加時間、Ｘａ・・・接着細胞濃度、ｎａ・・・接着細胞数、Ｓ・・・画像全体の面積、Ｓａ・・・細胞面積。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a subculturing limit determination method, an apparatus thereof, and a computer program thereof.
[0002]
[Prior art]
In recent years, many techniques for culturing human tissue in vitro and applying the cultured tissue to a patient have been reported. In particular, human skin tissue has reached the level of commercialization in the West. Here, the flow of commercialization of a cultured cell sheet using human skin tissue, for example, human keratinocytes, will be described with reference to FIG. First, after collecting a small amount of tissue pieces from a healthy part of a patient and dispersing the cells by enzyme treatment, keratinocytes are separated and collected (step S1). Next, primary culture is performed using the keratinocytes (step S2). Thereafter, the cells grown in the primary culture are inoculated (seeded) separately in a plurality of other culture containers (step S3), and if the operation such as medium change is performed as necessary, the cells grow and grow on the culture surface. The area occupied by the cells gradually increases and reaches a predetermined area (step S4). At this time, it is checked whether or not a sufficient area (number of cells) necessary for the product as a whole has been secured (step S5). If not secured, the cells are detached from the culture vessel by a protease such as trypsin and collected. (Step S6), the area is increased by repeatedly performing subculture until the necessary area can be secured. On the other hand, if the necessary area is secured, three-dimensional culture (stratification) is performed for tissue construction (step S7), and this is transported to the hospital as a cultured cell sheet for transplantation, and transplantation is performed (step S8). ).
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
However, since cells have a life span and cannot be divided indefinitely, there are cases in which the life span comes to an end and does not proliferate before a necessary area is secured. If the cells do not grow in this way, there is a problem that the production efficiency is lowered because the three-dimensional culture may not proceed. For this reason, it has been desired to establish a method for predicting the life span of cells, that is, the limit of subculture, but since the life span of cells varies depending on the site from which the cells were collected, the age of the patient, etc. It was difficult to make a prediction.
[0004]
An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems, and to provide a subculturing limit determination method capable of determining the subculturing limit of cells, and to provide an apparatus and a computer program therefor. And
[0005]
Means for Solving the Problems, Embodiments of the Invention, and Effects of the Invention
The present inventor examined the relationship between the adhesion area of the cells adhered to the culture vessel and the number of remaining cell divisions of the cells (that is, how many cell divisions can be performed), and cells were collected between the two. It was found that there is a correlation depending on the culture conditions of the cells without depending on the patient or the collection site. Similarly, when the relationship between the doubling time of a cell and the number of remaining cell divisions of the cell was examined, there was a correlation depending on the culture condition of the cell without depending on the patient from whom the cell was collected or the collection site. I found that there was a relationship. Based on such new knowledge, the present invention has been completed.
[0006]
That is, the subcultivation limit determination method of the present invention obtains the adhesion area when cells cultured under specific culture conditions adhere to the bottom surface of the culture vessel, and determines whether to continue subculture based on the adhesion area. Is determined. Since the correlation between the cell adhesion area and the number of remaining cell divisions of the cell is determined depending on the culture conditions, the lifetime of the cell can be predicted if the cell culture condition and the adhesion area are known. Therefore, the cell adhesion area can be an indicator of whether or not to continue the subculture, and the subculture limit can be determined by tracking the cell adhesion area. As a result, even if it is a case where the cells reach the end of their life before securing the necessary area, they will not proliferate if they move to the three-dimensional culture process while the cell division ability remains. In addition, it is possible to avoid the stagnation of cell growth and to produce a product.
[0007]
In the three-dimensional culture, any operation may be performed as long as cells are layered. For example, in the case of culturing in a serum-free medium, it is layered by exchanging with a Ca (calcium) rich medium, and in the case of a feeder layer culture method, it is confluent without performing subculture at a predetermined time. After reaching the confluent state, further culturing is continued for further stratification.
[0008]
As an example of the subculturing limit determination device for realizing this method, an adhesion area calculation means for obtaining an adhesion area when cells cultured under specific culture conditions adhere to the bottom surface of the culture vessel, and the adhesion area calculation And a determination means for determining whether or not to continue the subculture based on the adhesion area calculated by the means.
[0009]
Here, the “cell” refers to an adhesion-dependent cell that first adheres directly to the bottom surface of the culture vessel or indirectly adheres via the extracellular matrix, then expands its adhesion area, and then cell divides. That means. Examples thereof include various cells collected from warm-blooded animals such as humans, mice, rats, guinea pigs, hamsters, chickens, rabbits, pigs, sheep, cows, horses, dogs, cats, monkeys, and the like. Examples of the warm-blooded animal cells include keratinocytes, spleen cells, neurons, glial cells, pancreatic β cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, Muscle cells, adipocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem cells or adhesion-dependent cancer cells Can be mentioned. Embryonic hepatocytes can also be used. Or, erythropoietin, growth hormone, granulocyte colony-stimulating factor, insulin, interferon, blood coagulation factor such as blood coagulation factor VIII, glucagon, tissue plasminogen activator, dopamine, oncogene, cancer suppressor gene, etc. You may use the transformed cell which introduce | transduced the gene into the said cell, and was configured so that those genes may be forcedly expressed under various conditions using various promoters. Examples of the extracellular matrix include integrin, collagen, elastin, proteoglycan, glycosaminoglycan, glycoprotein and the like.
[0010]
“Specific culture conditions” include, for example, a gas atmosphere, a medium, a medium exchange cycle, passage timing (how much passage the bottom of the culture vessel is covered with cells), cell dispersing agent (Those that peel off the cells adhered to the bottom surface) and the like.
[0011]
The “culture vessel” is not particularly limited as long as cells can be cultured. For example, synthetic resins such as polyethylene, polypropylene, polystyrene, polycarbonate, polyvinyl chloride, polytetrafluoroethylene, hydroxyapatite ceramics, alumina What consists of ceramics, glass, etc. is used suitably.
[0012]
In the subculturing limit determination method of the present invention, the correlation between the adhesion area and the number of remaining cell divisions when a certain cell is repeatedly subcultured under the specific culture conditions is obtained, and the adhesion area obtained this time is determined. Whether or not to continue the subculture may be determined in light of this correlation. In this way, since the number of remaining cell divisions can be predicted from the cell adhesion area, it is easy to determine whether or not to continue the subculture. Specifically, assuming that the remaining cell division number reaches a predetermined value (for example, once or twice) as the limit point of subculture, adhesion when the remaining cell division number reaches the predetermined value in advance. It may be determined whether the subculture is continued by obtaining the area as a threshold and comparing the adhesion area calculated this time with the threshold.More specifically, in the subculture limit determination method of the present invention, when determining whether or not to continue subculture, it is determined that subculture is continued when the adhesion area is smaller than a predetermined threshold. May be.
[0013]
As an example of the subculturing limit device that realizes this method, in the device configuration exemplified above, the determination means uses the adhesion area calculated by the adhesion area calculation means as a predetermined cell under the specific culture condition. A configuration in which it is determined whether or not to continue subculture by considering the correlation between the adhesion area when repeatedly subcultured and the number of remaining cell divisions.
[0014]
In the subculturing limit determination method of the present invention, in determining the adhesion area, the surface coverage indicating the coverage ratio of the bottom surface by the cells and the adhesion indicating how many cells are adhered per unit area of the bottom surface The adhesion area per cell may be determined from the cell concentration. In this way, the adhesion area per cell can be determined relatively easily.
[0015]
As an example of the subculture limit apparatus for realizing this method, in any of the apparatus configurations exemplified above, the adhesion area calculation means includes a surface coverage ratio indicating a coverage ratio of the bottom surface by the cells and a unit of the bottom surface. The structure which calculates the adhesion area per said cell from the adhesion cell density | concentration showing how many cells have adhered per area is mentioned.
[0016]
In the subculturing limit determination method of the present invention, in determining the adhesion area, the surface coverage and the adherent cell concentration are calculated based on an image obtained by imaging the bottom surface of the culture vessel, and the surface coverage and the The adhesion area per cell may be calculated from the adherent cell concentration. If it carries out like this, the adhesion area per cell can be easily calculated | required from the captured image of the bottom face of a culture container, and it is suitable also for automation.
[0017]
As an example of the subculturing limit device that realizes this method, in the device configuration illustrated above, the imaging device includes an imaging unit that images the bottom surface of the culture vessel, and the adhesion area calculation unit is an image captured by the imaging unit. The surface coverage and the adherent cell concentration are calculated based on the above, and the adhesion area per cell is calculated from the surface coverage and the adherent cell concentration.
[0018]
Here, an example in which the adhesion area per cell is calculated from the surface coverage and the adhesion cell concentration is shown. Assuming that the apparent adhesion area (apparent cell adhesion area) per cell at the time of measurement is Ac, the surface coverage of cells occupying the bottom of the culture vessel is Cd, and the adherent cell concentration is Xa, Ac is expressed by the following equation (1). expressed. In the present specification, “apparent” is added to the head of a parameter when it represents an average parameter value of a plurality of cells rather than a parameter value of a specific cell.
[0019]
[Expression 1]
Ac = Cd / Xa
[0020]
Xa is a parameter representing the number of adherent cells per unit area. If the area of the entire image of the bottom surface of the culture vessel imaged by the imaging means is S and the number of adherent cells in the entire image is na, Xa is the following: It is expressed by
[0021]
[Expression 2]
Xa = na / S
[0022]
Further, the surface coverage Cd is a parameter representing the ratio of the cell adhesion area per unit area, and as shown by the following
[0023]
[Equation 3]
Cd = (ΣSa) / S
[0024]
For example, it can be obtained by applying the image analysis technique described in a paper by Kinooka et al. (Biotech. Bioeng., 67, p234-239 (2000)) to a captured image. In this case, the image is processed in the order of background separation processing, lookup table conversion processing, smoothing processing, binarization extraction processing, isolated point removal processing, closing processing, hole filling processing, area extraction processing, and pixel count measurement processing on the original image. Analysis is performed, and the ratio of the number of pixels of the cell adhesion portion (total adhesion area ΣSa) to the number of pixels (area S) of the entire image is calculated as the surface coverage Cd. It should be noted that the extraction process of the adhesion portion with respect to the original image is not limited to these image processing methods, and various image analysis processes can be performed. This Cd can be used as an index of passage timing. For example, when Cd becomes a predetermined value or higher or exceeds a predetermined value, passage time is used, and the cells are detached from the culture vessel to be used for the next passage culture. May be performed.
[0025]
Next, an example of calculating the number of cell divisions is shown. The number of apparent cell divisions at passage number Np is Nd, NpIf the initial cell inoculation concentration is X0, Nd, NpIs represented by the following equation (4). Then, the cumulative cell division number Nd in a series of subcultures (from the first subculture to the final subculture) is expressed as the sum total in each subculture.
[0026]
[Expression 4]
Nd, Np= Log2(Xa / X0)
[0027]
In the subculturing limit determination method of the present invention, the doubling time of cells cultured under the specific culture conditions is obtained, and it is determined whether or not to continue subculturing based on both the adhesion area and the doubling time. Also good. In this subcultivation limit determination method, the adhesion area and the doubling time of the cells when the cells cultured under specific culture conditions adhere to the bottom surface of the culture vessel are determined, and subculture is performed based on the adhesion area and the doubling time. It is determined whether or not to continue. Here, as described above, the adhesion area of a cell can be an indicator of whether or not to continue subculture, but the correlation between the doubling time of a cell and the number of remaining cell divisions of the cell also depends on the culture conditions. Therefore, if the cell culture conditions and doubling time are known, the lifetime of the cell can be predicted. For this reason, the doubling time of the cells can be an index for determining whether or not to continue subculture. That is, the subculture limit can be determined by tracking the doubling time of the cells. As a result, even if it is a case where the cells reach the end of their life before securing the necessary area, they will not proliferate if they move to the three-dimensional culture process while the cell division ability remains. In addition, it is possible to avoid the stagnation of cell growth and to produce a product.
[0028]
As an example of the subculture limit device that realizes this method, in any one of the apparatus configurations exemplified above, it includes a doubling time calculating means for obtaining a doubling time of the cells cultured under the specific culture conditions, and the determining means And a configuration for determining whether to continue subculture based on both the adhesion area calculated by the cell adhesion area calculation means and the doubling time calculated by the doubling time calculation means.
[0029]
Here, an example of calculating the doubling time is shown. Assuming that the apparent doubling time is td, td is expressed by the following equation (5). Here, t represents a measurement time, and Δt represents a minute time (for example, 24 hours).
[0030]
[Equation 5]
In the subculturing limit determination method of the present invention, the doubling time of cells cultured under specific culture conditions may be obtained, and it may be determined whether or not to continue subculturing based on the doubling time. As described above, the subculture limit can also be determined by following the cell doubling time.
[0032]
As an example of a subculture limit determination apparatus that realizes this method, a doubling time calculating means for obtaining a doubling time of cells cultured under specific culture conditions, and a subculture based on the doubling time calculated by the doubling time calculating means. And a determination means for determining whether or not to continue subculture.
[0033]
In the subculture limit determination method of the present invention, when doubling time is used, the correlation between the doubling time and the number of remaining cell divisions when a certain cell is repeatedly subcultured under the specific culture conditions is obtained. In addition, it may be determined whether or not the subculture is continued by comparing the doubling time obtained this time with this correlation. In this way, since the remaining number of cell divisions can be predicted from the doubling time of the cells, it is easy to determine whether or not to continue the subculture. Specifically, assuming that the number of remaining cell divisions reaches a predetermined value (for example, once or twice) as the limit point of subculture, the doubling when the remaining number of cell divisions reaches the predetermined value in advance It may be determined whether or not to continue the subculture by determining the time as a threshold and comparing the doubling time calculated this time with the threshold.
[0034]
As an example of the subculture limit determination apparatus for realizing this method, in the previous subculture limit determination apparatus, when the cell doubling time is used as an index for determining whether or not to continue subculture, The determination means is based on the doubling time calculated by the doubling time calculating means in light of the correlation between the doubling time and the number of remaining cell divisions when a certain cell is repeatedly subcultured under the specific culture conditions. A configuration for determining whether or not to continue subculture is included.
[0035]
In the subculturing limit determination method of the present invention, the specific growth rate of the cells cultured under the specific culture conditions is obtained, and it is determined whether or not to continue the subculture using the specific growth rate as one of the indices. Good. In this subculture limit determination method, the specific growth rate of cells cultured under specific culture conditions is obtained, and it is determined whether or not to continue subculture using the specific growth rate as an index. For example, it may be determined based only on the specific growth rate, may be determined based on the adhesion area and the specific growth rate, or may be determined based on the doubling time and the specific growth rate. Alternatively, the determination may be made based on the adhesion area, the doubling time, and the specific growth rate. Here, as described above, the cell adhesion area and doubling time can be an indicator of whether or not to continue subculture, but the correlation between the specific growth rate of the cell and the number of remaining cell divisions of the cell is also cultured. Since it depends on the conditions, if the cell culture conditions and the specific growth rate are known, the lifetime of the cell can be predicted. For this reason, the specific growth rate of cells can be an index for determining whether or not to continue subculture. That is, the subculture limit can be determined by following the specific growth rate of the cells. As a result, even if it is a case where the cells reach the end of their life before securing the necessary area, they will not proliferate if they move to the three-dimensional culture process while the cell division ability remains. In addition, it is possible to avoid the stagnation of cell growth and to produce a product.
[0036]
As an example of the subculture limit device that realizes this method, in any one of the apparatus configurations exemplified above, the apparatus includes a specific growth rate calculating means for obtaining a specific growth rate of cells cultured under the specific culture condition, The means may be configured to determine whether or not to continue the subculture using the specific growth rate calculated by the specific growth rate calculation means as one of the indexes.
[0037]
Here, an example of calculating the specific growth rate is shown. When the apparent specific growth rate is μ, μ is expressed by the following equation (6). Here, t represents a measurement time, and Δt represents a minute time (for example, 24 hours).
[0038]
[Formula 6]
In the subculturing limit determination method of the present invention, a specific growth rate of cells cultured under a specific culture condition may be obtained, and it may be determined whether or not to continue subculture based on the specific growth rate. As described above, the subculture limit can also be determined by following the specific growth rate of the cells.
[0040]
As an example of a subculture limit determination apparatus that realizes this method, specific growth rate calculation means for obtaining the specific growth rate of cells cultured under specific culture conditions, and the specific growth rate calculated by the specific growth rate calculation means And a determination means for determining whether or not to continue the subculture based on the above.
[0041]
In the subculturing limit determination method of the present invention, when using a specific growth rate, the correlation between the specific growth rate and the number of remaining cell divisions when a certain cell is repeatedly subcultured under the specific culture conditions. It may be determined whether or not the subculture is continued by comparing the specific growth rate obtained this time with this correlation. In this way, since the number of remaining cell divisions can be predicted from the specific growth rate of the cells, it is easy to determine whether or not to continue the subculture. Specifically, assuming that the number of remaining cell divisions reaches a predetermined value (for example, once or twice) as the limit point of subculture, the ratio when the remaining number of cell divisions reaches the predetermined value in advance. The growth rate may be obtained as a threshold value, and it may be determined whether or not the subculture is continued by comparing the specific growth rate calculated this time with the threshold value.
[0042]
As an example of the subculture limit determination device for realizing this method, the specific growth rate of the cell is used as an index for determining whether or not to continue subculture in the subculture limit determination device. The determination means is the correlation between the specific growth rate calculated by the specific growth rate calculation means and the specific growth rate when a certain cell is repeatedly subcultured under the specific culture conditions and the number of remaining cell divisions. The structure which determines whether it continues by subculture by illuminating is mentioned.
[0043]
A program for causing a computer to function as the above-described passage culture limit determination device and a program for causing the computer to realize the above-described passage culture limit determination method are usually CD-ROMs that can be read by the CPU of the computer. And is recorded on a recording medium such as an HDD or the like, read from the CPU, and executed. For this reason, such a program is used in order to exhibit the effect of the subculture limit method mentioned above, and its usefulness is high. The program may be recorded on a computer-readable storage medium (eg, hard disk, ROM, FD, CD, DVD, etc.) or distributed via a transmission medium (communication network such as the Internet or LAN). It may be exchanged in any other form.
[0044]
In the present embodiment, the cell adhesion area is described as an index for determining the limit of subculture. However, instead of the adhesion area, cells are projected on one surface (for example, the bottom surface) of the culture vessel. Even if the projected area is used, the same effect can be obtained. In this case, it is possible to use a photographing apparatus with a low focal ability such as a CCD camera without using an imaging apparatus with a high focal ability such as a scanning confocal laser microscope, and a simple configuration can be achieved.
[0045]
【Example】
[Example 1]
1. Used keratinocytes
In this example, keratinocytes derived from 0-year-old foreskin, keratinocytes derived from 22-year-old breast, and keratinocytes derived from 70-year-old breast (all manufactured by Kurabo Industries, Ltd.) were purchased and used as frozen vials. All of these were frozen cell groups after primary culture.
[0046]
2. Subculture procedure
FIG. 1 is a schematic explanatory diagram of the culturing operation. As shown in FIG. 1, after rapidly thawing the frozen vial, the culture vessel is made of polystyrene (75 cm).2A T-shaped flask (manufactured by NUNK) was inoculated. This culture operation was defined as the first passage (Np = 1). The culture was performed in a serum-free medium (HuMedia-KG2, manufactured by Kurabo Industries, Ltd.) at 37 ° C., CO2Performed in a 5% atmosphere. During the culture, the medium was changed every 72 hours. Then, when the surface coverage Cd where the cell covers the bottom of the T-shaped flask exceeded 0.8, that is, when 80% of the bottom of the culture vessel was covered with cells, the next subculture was started. For subculture, first, 0.1% trypsin-0.02% EDTA solution was added to the
[0047]
3. Calculation of parameters for each subculture
In each subculture, images of the bottom surface of the culture vessel were taken every day with a CCD camera at three bottoms per T-shaped flask, and the number of adherent cells na in the area S of the photographed image was counted. Thus, the adherent cell concentration Xa ′ at each location was calculated, and the average value thereof was defined as the adherent cell concentration Xa at that time.
[0048]
[Expression 7]
X'a = na / S
Xa = (average value of X′a at three positions on the bottom surface)
[0049]
Further, by applying the image analysis technique of the paper of Kinooka et al. (Supra) to the photographed image, the total area ΣSa of the cell adhesion portion in the photographed image (area S) is expressed by the following
[0050]
[Equation 8]
C′d = (ΣSa) / S
Cd = (average value of C′d at three locations on the bottom surface)
[0051]
[Equation 9]
Ac = Cd / Xa
[0052]
Here, FIG. 2 is a graph showing the change of the adherent cell concentration Xa with respect to the culture time t in a certain subculture. The cell culturing process generally includes a cell adhesion phase, an induction phase, and a logarithmic growth phase. The cell adhesion phase is a period from inoculation into a culture container to adhesion to the bottom of the container, and the induction period is The period from the end of the cell adhesion period to the time when cells attached to the bottom of the culture vessel start to divide, and the logarithmic growth phase is almost confluent on the bottom of the culture container after the induction period (this In the embodiment, this is a period until Cd = 0.8).
[0053]
Apparent number of cell divisions in each subculture Nd, NpWas calculated from the following equation (10). And this Nd, NpThe cumulative number of cell divisions Nd was calculated. The apparent doubling time td was calculated from the following equation (11), and the apparent specific growth rate μ was calculated from the following equation (12). Hereinafter, the “apparent” prefix for each parameter may be omitted.
[0054]
[Expression 10]
Nd, Np= Log2(Xa / X0)
However, X0 = 1.0 × 10Fourcells / cm2
Nd = (cumulative number of cell divisions)
[0055]
## EQU11 ##
[Expression 12]
4). About doubling time and life expiration
In order to show the growth process of a series of subcultures, FIG. 3 shows a graph showing changes in the cumulative cell division number Nd and the apparent doubling time td with respect to the cumulative culture time of keratinocytes derived from a 0-year-old donor.
[0058]
The surface coverage Cd immediately before moving to the next subculture in each subculture was 0.83, 0.89, 0.88, and 0.81, respectively. As apparent from FIG. 3, the apparent doubling time td increased rapidly in the second and third passages (Np = 2 and 3) of the second culture, but this effect in the initial stage of the next subculture. The doubling time returned to a low value without receiving, and the growth of the cell population was good. This temporary increase in the apparent doubling time td is considered to be due to the occurrence of contact inhibition. Contact inhibition refers to a phenomenon in which cell proliferation is suppressed when adjacent cells come into contact with each other and the space for cell division decreases. However, at the 4th passage (Np = 4), the cell culture division is no longer elevated until the 3rd passage from the time when the cumulative culture time exceeds 400 hours, and is affected by contact inhibition. The apparent doubling time td continued to increase from the time when it was not considered, and the apparent doubling time td did not return to a low value even at the initial stage of the fifth passage (Np = 5).
[0059]
In the present example, the end of the life of keratinocytes was defined as the time when the doubling time of 10 times was reached with reference to the average doubling time at the first passage. Specifically, since the average doubling time at the first passage was 20.6 hours, the time when the doubling time reached 206 hours was defined as the end of life. Then, based on FIG. 3, the cumulative culture time when the doubling time reached 206 hours was determined, the corresponding cumulative cell division number Nd was determined, and this was taken as the limit cell division number NdF at the end of life. It can be seen that the cumulative number of cell divisions Nd after the end of lifespan remains almost NdF, and further cell division hardly occurs. This indicates that the definition at the end of the lifetime is valid.
[0060]
In this way, the validity of the definition of the end of life by doubling time is supported by the following facts. That is, in the cell group in which the subculture was repeated, the ratio of mature cells (differentiated cells) is high as apparent from the fact that the content of involucrin, which is an indicator of the degree of differentiation examined separately, increased significantly. However, such cells have a reduced ability to divide, resulting in a significant increase in the doubling time of the entire cell group. Conversely, the doubling time significantly increased compared to the beginning means that it is occupied by cells that have almost no cell division ability, and it can be regarded as the end of life when viewed as a whole cell group. I can say that.
[0061]
5). Relationship between number of remaining cell divisions and cell adhesion area or doubling time
Assuming that the number of remaining cell divisions is NdR, this NdR is expressed as a value obtained by subtracting the current cumulative cell division number Nd from the limit cell division number NdF as shown in the following equation (13).
[0062]
[Formula 13]
NdR = NdF-Nd
[0063]
FIG. 4 shows changes in the apparent doubling time td with respect to the remaining cell division number NdR and changes in the apparent cell adhesion area Ac. In FIG. 4, the result when it culture | cultivated using each keratinocyte derived from 0 years old, 22 years old, and 70 years old was described collectively. As is apparent from FIG. 4, the change in the apparent doubling time td and the change in the apparent cell adhesion area Ac with respect to the remaining cell division number NdR change along almost the same curve for all keratinocytes regardless of the donor. I found out that In addition, the change in the apparent doubling time td and the change in the apparent cell adhesion area Ac with respect to the remaining number of cell divisions NdR changed along different curves when conditions different from the culture conditions of this example were adopted. It was also found that as long as the culturing conditions were adopted, all cells changed along almost the same curve regardless of the donor (see Example 2).
[0064]
Cells with a small number of remaining cell divisions NdR have a sharp increase in the apparent doubling time td and the apparent cell adhesion area Ac. This is thought to be due to the large number of cells in the state of adhesion. As described above, the apparent doubling time td and the apparent cell adhesion area Ac increase rapidly when the lifetime is about to expire. Conversely, the apparent doubling time td and the apparent cell adhesion area Ac are rapidly increased. When it increases, it will be near the end of life, and it is not suitable for further subculture.
[0065]
Specifically, a lower limit number of remaining cell division times NdR is determined in advance (for example, once), an apparent doubling time td and an apparent cell adhesion area Ac corresponding to the lower limit number are obtained from FIG. The apparent doubling time td and the apparent cell adhesion area Ac determined in this manner are determined in advance as threshold values. Thereafter, when keratinocytes derived from the same or different donors are cultured under the same culture conditions, the apparent doubling time td and the apparent cell adhesion area Ac are calculated over time, and these are compared with the previous threshold values. When the threshold value is exceeded, it is determined that the remaining cell division number NdR has fallen below a predetermined lower limit number, and the next subculture process may be stopped. Therefore, even in the case where the cells reach their lifetime before the necessary area is secured in step S5 of FIG. 10, the three-dimensional culture process (FIG. If it transfers to step S7), it will become possible to avoid that cell growth will stagnate during subculture, and to commercialize. In addition, as described above, it may be determined whether to continue the subculture based on both the apparent doubling time td and the apparent cell adhesion area Ac, but the subculture is continued based on either one. It may be determined whether or not.
[0066]
6). Relationship between number of remaining cell divisions and specific growth rate
As described above 5. Then, the number of remaining cell divisions was predicted using either or both of the cell adhesion area Ac and the doubling time td as a determination index, and the subculture limit was determined, but instead of or in addition to this, apparent specific growth The speed μ may be used as a determination index. The specific growth rate μ can be obtained from the apparent doubling time td as shown in the following
[0067]
[Expression 14]
FIG. 5 shows a graph showing changes in the cumulative cell division number Nd, apparent specific growth rate μ, and apparent adherent cell area Ac with respect to the culture time of each keratinocyte derived from a 0-year-old, 22-year-old, and 70-year-old donor. . However, the plotted experimental results are as described in 5. above. It is the result of another experiment conducted under the same conditions as the experiment of. In the change in the specific growth rate μ of each keratinocyte shown in FIG. 5, the point immediately before the value of μ significantly decreased was determined as a critical point (arrow in the figure). A marked decrease in μ indicates that the doubling time td has increased significantly, which means that the cell growth ability is reduced and the limit of subculture is close.
[0069]
Table 1 shows the specific growth rate μ, the cell adhesion area Ac, and the remaining number of cell divisions NdR at each critical point. As shown in Table 1, at the critical point, the specific growth rate μ and the cell adhesion area Ac showed almost the same value regardless of the cell line. Further, the number of remaining cell divisions NdR (= NdF-Nd) after the critical point was 2 to 3 times. For this reason, when the threshold value of specific growth rate μ is determined based on these critical points, and then keratinocytes derived from the same or different donors are cultured under the same culture conditions, the specific growth rate μ Is calculated and compared with the previous threshold value, the subculture limit (the time when the remaining cell division number NdR is 2 to 3 times, for example) can be predicted. By predicting the subculture limit in this way, it becomes possible to shift to a three-dimensional culture process and make a product (sheet) before the cells cannot grow. For example, the specific growth rate μ [h-1] Is set to 0.02, it becomes possible to proceed to the three-dimensional culture process and commercialize before reaching the passage limit, that is, in a state where the remaining cell division number NdR is 2 to 3 times. The limit cell division number NdF is described in 4. It was obtained in the same manner.
[0070]
[Table 1]
FIG. 6 is a graph showing the relationship between the number of remaining cell divisions NdR and the apparent specific growth rate μ. Similar to the doubling time td, the specific growth rate μ is also shown by a uniform fitting line regardless of the cell line. This can be expected considering that μ and td are inversely related. As shown in FIG. 6, the specific growth rate μ rapidly decreased as NdR approached zero at each critical point (black paint) as a boundary, and did not become larger than the critical point value again. Since the slope of the approximate straight line (dotted line in the figure) is different before and after this critical point, the subculture limit can be easily and clearly determined and evaluated by setting a threshold based on the value of μ at the intersection of both straight lines. can do. Or, unlike the case of the doubling time td, an area where no plot exists (the hatched area in FIG. 6) appears for any of the plots for each age. By setting a threshold in this area, the threshold of the doubling time td The subculture limit can be determined and evaluated more easily and clearly than in the case of setting.
[0072]
[Example 2]
In Example 1, culture using a serum-free medium has been described, but in this Example, a feeder layer culture method, which is a culture method different from Example 1, will be described.
[0073]
1. Epidermal cells used
In this example, skin tissues were collected from 20-year-old (2 individuals), 47-year-old, 55-year-old (2 individuals), and 68-year-old patients and isolated as keratinocytes by proteases such as dispase and trypsin. A cell suspension was prepared using the epidermal cells.
[0074]
2. Subculture procedure
Mouse fibroblasts whose growth ability was suppressed by mitomycin C as feeder cells were laid on the bottom of the culture flask. The cell suspension prepared in (1) was seeded. This culture operation was defined as the first passage (Np = 1). After cell seeding, 5% FBS (fetal bovine serum) -DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) was injected as a culture medium, and epidermal cells were cultured in the presence of feeder cells. After the formation of epidermal cell colonies was confirmed, the cells were detached with trypsin in a timely manner, and then the detachment was stopped with a trypsin inhibitor. Then, the cells were collected and centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. Was removed. Subsequently, the cells were resuspended with fresh medium and seeded in a new culture flask.
[0075]
In this example, when sufficient cells necessary for the passage operation cannot be obtained even after a predetermined time has elapsed, for example, when the colony (cell population) is not sufficiently formed in observation, the cells As the limit of growth, the previous subculture was defined as the limit passage NpF. Therefore, in this example, the limit passage number NpF is greatly different from 5 to 14 depending on each individual.
[0076]
3. Calculation of parameters for each subculture
In each subculture, the number of apparent cell divisions Nd, NpFrom the following
[0077]
[Expression 15]
Nd, NP= Log2(Xa / X0)
[0078]
[Expression 16]
4). Relationship between number of remaining cell divisions and doubling time
FIG. 7 shows the relationship between the remaining cell division number NdR and the doubling time td in this example. Here, for each passage, the number of initial cells and the number of cells at the end of the passage are counted and divided by the size of the bottom of the flask to obtain the respective cell densities X0 and Xa. Since the doubling time td is obtained based on the density, one doubling time td corresponds to one passage. Therefore, the subculture was performed for each cell by the number plotted in FIG. The remaining cell division number NdR is expressed by the following equation (17). Cumulative number of cell divisions Nd is Nd, NpIt was calculated by accumulating.
[0080]
[Expression 17]
NdR = NdF-Nd
[0081]
In FIG. 7, the results when cultured using respective epidermal cells derived from 20 years old (2 individuals), 47 years old, 55 years old (2 individuals), and 68 years old are collectively shown. As is clear from FIG. 7, the change in the apparent doubling time td with respect to the remaining cell division number NdR changes along almost the same curve in all epidermal cells regardless of the number of passages and patients (individual differences). I understood it. In addition, it was found that the apparent doubling time td increased rapidly in cells where the number of remaining cell divisions NdR was small. That is, the rapid increase in the apparent doubling time td indicates that the lifetime is about to expire, and it can be said that it is not suitable for further subculture.
[0082]
Specifically, a lower limit number of remaining cell division times NdR is determined in advance (for example, 2 to 3 times), and an apparent doubling time td corresponding to the lower limit number is obtained from FIG. Is set in advance as a threshold value. On the other hand, the culture is newly started, the apparent doubling time td is calculated with the passage of time, compared with the previous threshold, and when the threshold is exceeded, the remaining number of cell divisions NdR is a predetermined lower limit. And the next subculture treatment may be stopped.
[0083]
Thus, the feeder layer culture method with different culture conditions did not show differences between individuals, and the relationship between the doubling time td and the remaining cell division number NdR was shown by a uniform fitting line. Therefore, the present invention can be widely applied to various culture methods having different culture conditions. In addition, since the threshold can be set without depending on the individual characteristics of the cells under the same culture conditions, the cell division limit or the passage limit can be easily determined, and three-dimensional before reaching such a limit. It can be transferred to a culturing process to make a product (sheet formation, layering). In this example, the subculture limit was determined using the doubling time td. As described above, it may be determined using the specific growth rate μ.
[0084]
[Example 3]
As shown in FIG. 8, the subculturing
[0085]
After the start of the subculture determination process is input by the operator, the
[0086]
According to this subculturing
[0087]
The subculturing
[0088]
In the subculture
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic explanatory diagram of a culture operation.
FIG. 2 is a graph showing changes in adherent cell concentration Xa (t) with respect to culture time t in a certain subculture.
FIG. 3 is a graph showing changes in the cumulative cell division number Nd and the apparent doubling time td with respect to the cumulative culture time of keratinocytes derived from a 0-year-old donor.
FIG. 4 is a graph showing changes in the apparent doubling time td and the apparent cell adhesion area Ac with respect to the remaining cell division number NdR.
FIG. 5 is a graph showing changes in cumulative cell division number Nd, apparent specific growth rate μ, and apparent adherent cell area Ac with respect to the culture time of each keratinocyte.
FIG. 6 is a graph showing the relationship between the number of remaining cell divisions NdR and the apparent specific growth rate μ.
FIG. 7 is a graph showing the relationship between the number of remaining cell divisions NdR and the doubling time td.
FIG. 8 is a schematic configuration diagram of a subculture limit determination apparatus.
FIG. 9 is a flowchart of subculture limit determination processing.
FIG. 10 is a flow of commercialization of human skin tissue.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF
Claims (20)
予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの接着面積と残り細胞***回数との相関関係を求めておき、今回求めた接着面積をこの相関関係に照らすことにより継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定方法。 Finding the adhesion area when cells cultured under specific culture conditions adhere to the bottom of the culture vessel, and determining whether or not to continue subculture based on the adhesion area ,
Find the correlation between the adhesion area and the number of remaining cell divisions when a certain cell is repeatedly subcultured under the specified culture conditions in advance, and subculture by comparing the adhesion area obtained this time with this correlation. Determine whether to continue
Subcultivation limit determination method.
請求項１記載の継代培養限界判定方法。When determines whether continued subculturing Subculture limit determination method of determining according to claim 1, wherein continuing subculture when the bonding area is less than a predetermined threshold value.
請求項２記載の継代培養限界判定方法。The subculture limit determination according to claim 2 , wherein the predetermined threshold is determined based on a correlation between an adhesion area when a predetermined cell is repeatedly subcultured under the specific culture condition and the number of remaining cell divisions. Method.
請求項１〜３のいずれか記載の継代培養限界判定方法。In determining the adhesion area, the adhesion per cell is determined from the surface coverage indicating the coverage ratio of the bottom surface by the cells and the adherent cell concentration indicating how many cells are adhered per unit area of the bottom surface. The method for determining the subculture limit according to any one of claims 1 to 3 .
請求項４記載の継代培養限界判定方法。In determining the adhesion area, the surface coverage and the adherent cell concentration are calculated based on an image obtained by imaging the bottom surface of the culture vessel, and the per cell is calculated from the surface coverage and the adherent cell concentration. The method for determining a subculture limit according to claim 4, wherein the adhesion area is calculated.
前記特定の培養条件で培養した細胞の倍加時間を求め、前記接着面積及び前記倍加時間の両方に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定方法。A method for determining a subculture limit according to any one of claims 1 to 5 ,
A subculturing limit determination method for determining a doubling time of a cell cultured under the specific culture condition and determining whether or not to continue subculturing based on both the adhesion area and the doubling time.
予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの倍加時間と残り細胞***回数との相関関係を求めておき、今回求めた倍加時間をこの相関関係に照らすことにより継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定方法。The subculturing limit determination method according to claim 6 ,
Obtain a correlation between the doubling time when the cells are repeatedly subcultured under the specific culture conditions and the number of remaining cell divisions in advance, and subculture is performed by comparing the doubling time obtained this time with this correlation. A subculturing limit determination method for determining whether or not to continue.
前記特定の培養条件で培養した細胞の比増殖速度を求め、前記比増殖速度を指標の一つとして継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定方法。A subculture limit determination method according to any one of claims 1 to 7
A subculturing limit determination method for determining a specific growth rate of cells cultured under the specific culture conditions and determining whether or not to continue subculture using the specific growth rate as an index.
予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの比増殖速度と残り細胞***回数との相関関係を求めておき、今回求めた比増殖速度をこの相関関係に照らすことにより継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定方法。It is a subculture limit determination method according to claim 8 ,
The correlation between the specific growth rate and the number of remaining cell divisions when a certain cell is repeatedly subcultured under the above-mentioned specific culture conditions is obtained in advance, and the subculture is performed by comparing the specific growth rate obtained this time with this correlation. A subculturing limit determination method for determining whether or not to continue culturing.
前記接着面積算出手段によって算出された接着面積に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する判定手段と
を備え、
前記判定手段は、前記接着面積算出手段によって算出された接着面積を、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの接着面積と残り細胞***回数との相関関係に照らすことにより、継代培養を続けるか否かを判定する、
継代培養限界判定装置。An adhesion area calculation means for obtaining an adhesion area when cells cultured under specific culture conditions adhere to the bottom surface of the culture container;
Determination means for determining whether or not to continue subculture based on the adhesion area calculated by the adhesion area calculation means ,
The determination means is based on the correlation between the adhesion area calculated by the adhesion area calculation means and the number of remaining cell divisions when a certain cell is repeatedly subcultured under the specific culture conditions. Determine whether to continue subculture,
Subculture limit determination device.
請求項１０記載の継代培養限界判定装置。The determination means determines that the subculture is continued when the adhesion area is smaller than a predetermined threshold,
The subculture culture limit determination apparatus according to claim 10 .
請求項１１記載の継代培養限界判定装置。The subculturing limit determination according to claim 11 , wherein the predetermined threshold is determined based on a correlation between an adhesion area when a predetermined cell is repeatedly subcultured under the specific culture condition and the number of remaining cell divisions. apparatus.
前記細胞による前記底面の被覆割合を示す表面被覆率と前記底面の単位面積あたりいくつの細胞が接着しているかを表す接着細胞濃度とから前記細胞１個あたりの接着面積を算出する
請求項１０〜１２のいずれか記載の継代培養限界判定装置。The adhesion area calculation means includes
Claim 10 in which a number of cells per unit area of said bottom surface and surface coverage showing the covering ratio of the bottom surface by the cell to calculate the adhesion area per the cells from the adherent cells concentration indicating whether the bonded 12. The subculture culture limit determination apparatus according to any one of 12 above.
前記接着面積算出手段は、前記撮像手段によって撮像された画像に基づいて前記表面被覆率及び前記接着細胞濃度を算出し、前記表面被覆率と前記接着細胞濃度とから前記細胞１個あたりの接着面積を算出する
請求項１３に記載の継代培養限界判定装置。Comprising imaging means for imaging the bottom surface of the culture vessel;
The adhesion area calculation means calculates the surface coverage and the adherent cell concentration based on the image captured by the imaging means, and the adhesion area per cell from the surface coverage and the adherent cell concentration The subculturing limit determination device according to claim 13.
前記特定の培養条件で培養した細胞の倍加時間を求める倍加時間算出手段を備え、
前記判定手段は、前記細胞接着面積算出手段によって算出された接着面積及び前記倍加時間算出手段によって算出された倍加時間の両方に基づいて継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定装置。The subculture culture limit determination apparatus according to any one of claims 10 to 14 ,
A doubling time calculating means for determining a doubling time of the cells cultured under the specific culture conditions;
The determination means determines whether or not to continue the subculture based on both the adhesion area calculated by the cell adhesion area calculation means and the doubling time calculated by the doubling time calculation means. apparatus.
前記判定手段は、前記倍加時間算出手段によって算出された倍加時間を、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの倍加時間と残り細胞***回数との相関関係に照らすことにより、継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定装置。It is a subculture culture limit judging device according to claim 15 ,
The determination means is based on the doubling time calculated by the doubling time calculating means in light of the correlation between the doubling time and the number of remaining cell divisions when a certain cell is repeatedly subcultured under the specific culture conditions. A subculturing limit determination device that determines whether or not to continue subculture.
前記特定の培養条件で培養した細胞の比増殖速度を求める比増殖速度算出手段を備え、
前記判定手段は、前記比増殖速度算出手段によって算出された比増殖速度を指標の一つとして継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定装置。The subculture culture limit determination apparatus according to any one of claims 10 to 16 ,
A specific growth rate calculating means for obtaining a specific growth rate of cells cultured under the specific culture conditions,
The determination means determines whether or not to continue subculture using the specific growth rate calculated by the specific growth rate calculation means as an index.
前記判定手段は、前記比増殖速度算出手段によって算出された比増殖速度を、予めある細胞を前記特定の培養条件で繰り返し継代培養したときの比増殖速度と残り細胞***回数との相関関係に照らすことにより、継代培養を続けるか否かを判定する
継代培養限界判定装置。It is a subculture culture limit judging device according to claim 17 ,
The determination means is a correlation between the specific growth rate calculated by the specific growth rate calculation means and the specific growth rate when a certain cell is repeatedly subcultured under the specific culture conditions and the number of remaining cell divisions. A subculturing limit determination device that determines whether or not to continue subculture by illuminating.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002186134A JP4230723B2 (en) | 2001-06-29 | 2002-06-26 | Subculture limit determination method, apparatus and computer program thereof |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001198704 | 2001-06-29 | ||
| JP2001-198704 | 2001-06-29 | ||
| JP2002186134A JP4230723B2 (en) | 2001-06-29 | 2002-06-26 | Subculture limit determination method, apparatus and computer program thereof |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003116530A JP2003116530A (en) | 2003-04-22 |
| JP2003116530A5 JP2003116530A5 (en) | 2005-10-06 |
| JP4230723B2 true JP4230723B2 (en) | 2009-02-25 |
Family
ID=26617872
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002186134A Expired - Fee Related JP4230723B2 (en) | 2001-06-29 | 2002-06-26 | Subculture limit determination method, apparatus and computer program thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4230723B2 (en) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006238802A (en) * | 2005-03-03 | 2006-09-14 | Olympus Corp | Cell observation apparatus, cell observation method, microscope system, and cell observation program |
| JP6284862B2 (en) * | 2014-09-17 | 2018-02-28 | 富士フイルム株式会社 | Cell arrangement determination apparatus and method, and program |
| US20170204359A1 (en) | 2014-12-19 | 2017-07-20 | Panasonic Corporation | Cell culture apparatus |
| JP5935963B1 (en) * | 2014-12-19 | 2016-06-15 | パナソニック株式会社 | Cell culture equipment |
-
2002
- 2002-06-26 JP JP2002186134A patent/JP4230723B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2003116530A (en) | 2003-04-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2003021628A (en) | Adhered cell selecting device, cell proliferation potency evaluating device, and its program and method | |
| Kang et al. | In vitro 3D model for human vascularized adipose tissue | |
| EP2682134A1 (en) | Cytokine-producing cell sheet and method for using same | |
| JP2016059329A (en) | Cell culture apparatus and method | |
| JP5912255B2 (en) | Sheet formation judgment system | |
| JP7428353B2 (en) | Growth prediction method, growth prediction device and program | |
| JP4230723B2 (en) | Subculture limit determination method, apparatus and computer program thereof | |
| CN105854085A (en) | Method for constructing tissue engineered cartilages in vivo | |
| CN111235101B (en) | Culture medium and culture method for human umbilical cord mesenchymal stem cells | |
| Kuhlmann et al. | Experimental approach to nasal septal cartilage regeneration with adipose tissue‐derived stem cells and decellularized porcine septal cartilage | |
| JP4095811B2 (en) | Exfoliated cell sorting apparatus, exfoliated cell sorting method and program thereof | |
| Qi et al. | Experimental study on repairing of nude mice skin defects with composite skin consisting of xenogeneic dermis and epidermal stem cells and hair follicle dermal papilla cells | |
| Sandulache et al. | Fetal dermal fibroblasts retain a hyperactive migratory and contractile phenotype under 2-and 3-dimensional constraints compared to normal adult fibroblasts | |
| Otsuki et al. | Tissue neogenesis and STRO‐1 expression in immature and mature articular cartilage | |
| JP2004344049A (en) | Apparatus for evaluating cell growth ability and method therefor | |
| CN103893831B (en) | A kind of organotypic artificial skin, its preparation method and application | |
| Przytulska et al. | The evaluation of 3D morphological structure of porous membranes based on a computer-aided analysis of their 2D images | |
| JP4436518B2 (en) | Cultured cell evaluation method, cultured cell growth prediction method, and cultured cell growth control method | |
| JP4227339B2 (en) | Exfoliated cell recovery device, exfoliated cell recovery method and program thereof | |
| JP4252319B2 (en) | Layering determination method and layering determination apparatus | |
| JP2007124914A (en) | Method for judging passage of cultured cell | |
| JP5917000B2 (en) | Sheet formation evaluation method | |
| JP2005168398A (en) | Method for culturing epithelial cell and method for preparing three-dimensional structure of epithelial cell | |
| JP2004141064A (en) | Method for preserving cell and apparatus therefor | |
| Raktoe et al. | Mimicking fat grafting of fibrotic scars using 3D‐organotypic skin cultures |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050527 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050527 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080805 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081003 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20081111 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20081204 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4230723 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111212 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141212 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |