JP4228072B2 - Artificial synthetic gene encoding avidin - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、害虫抵抗性を付与するアビジンをコードする人工合成遺伝子、及び該遺伝子を導入した形質転換イネに関する。
【０００２】
【従来の技術】
米は小麦、トウモロコシと並ぶ世界の三大穀物の一つであり、日本においては国民の主食として最も重要な位置を占めている。イネの栽培に関しては、様々な害虫による被害を防ぐために農薬の使用が欠かせない。また収穫した米を貯穀害虫の被害から免れるためにも薫蒸剤が使用されている。しかしながら、近年における消費者側の安全性志向の流れ、また環境調和型の農業が求められている中で農薬および薫蒸剤の使用は大きな問題である。農薬の使用は、害虫のみならず益虫も殺傷することにより生態系のバランスを崩し、流出した農薬は環境を汚染し、農薬の散布自体が農業作業者の健康に悪影響を及ぼす可能性が考えられる。また、近年残留農薬の問題が消費者の不安を呼び起こし、安全な農産物が求められている。
【０００３】
これを解決する一つの手段として遺伝子組み換え手法により害虫に対する抵抗性を持たせることが考えられている。代表的な例としてBacillus thuringiensisが産生する毒素であるBt毒素遺伝子をイネに組み込むことによって害虫抵抗性を獲得することが報告されている（Biotechnology (NY),1993; 11(10): 1151-1155）。しかし、Bt毒素は効果を示す害虫に選択性があり、対象となる害虫が限られていることが問題となっている。例えば、あるBt毒素は鱗翅目の害虫に対して効果が認められるが、甲虫類に対しては効果がないなど、作用適性が限られていることが知られている（Microbiological Review 1989; 53(2): 242-255）。また、こうした組み換え体による害虫防除に関しても長期間に渡って同じ種類の遺伝子を導入した作物を栽培し続ければ、害虫の側に耐性が生じる危険性がある。
【０００４】
一方、アビジンは、ビオチンと強固に結合する性質を持つ卵白中の塩基性タンパク質である。アビジンは双翅目であるイエバエの幼虫（非特許文献１）、鱗翅目および鞘翅目の昆虫（非特許文献２）など、広範囲の種類の昆虫に対して殺虫活性があることが報告されている。これらの知見をもとに、アビジン遺伝子が導入されたトウモロコシ（非特許文献３）やタバコ(非特許文献４）が作製され、これらの植物が害虫抵抗性を持つことが報告されている。しかしながら、イネに関してはアビジンを導入した形質転換植物が作製された例は報告されていない。
【０００５】
【非特許文献１】
Journal of Insect Physiology 1959; 3: 293-305
【非特許文献２】
Entomologia Experimentalis Applicata 1993; 69: 97-108
【非特許文献３】
Nature Biotechnology 2000; 18: 670-674
【非特許文献４】
Transgenic Research 2002; 11(2): 185-198
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
イネに関する害虫防除手法として、従来技術である化学農薬の使用は、手間やコストがかかる、薬効が長続きしない、人体や環境への悪影響も懸念される等の問題がある。また、遺伝子組換え手法によっても、対象となる害虫の範囲が限定される、害虫側に耐性ができる、植物種によって発現効率が悪い、などといった問題がある。
従って、本発明の課題は、イネにおいて効率よく発現し、長期間にわたって優れた害虫抵抗性を付与することのできる人工合成遺伝子、及び該遺伝子を導入した形質転換イネを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、殺虫活性のあるアビジンタンパク質をコードする遺伝子をイネにおいて使用頻度の高いコドンを選択することによってイネの中で高い発現効率を有するように改変させた人工合成遺伝子をイネに導入すると、そのイネが優れた害虫抵抗性を発揮することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) 以下の(a)又は(b)に示すタンパク質をコードし、かつイネにおける使用頻度が高いコドンを選択することによってイネの中で高い発現効率を有するように改変された人工合成遺伝子。
(a) 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ害虫抵抗性を付与する活性を有するタンパク質
(2) 以下の(c)又は(d)に示すＤＮＡからなる(1)に記載の人工合成遺伝子。
(c) 配列表の配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡ
(d) 配列表の配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ害虫抵抗性を付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
(3) (1)又は(2)に記載の遺伝子に、シグナルペプチドをコードする遺伝子を付加した人工合成遺伝子。
(4) 配列表の配列番号３に示す塩基配列を有する(3)に記載の人工合成遺伝子。
(5) イネにおいて機能しうるプロモーターの下流に、(1)から(4)のいずれかに記載の人工合成遺伝子及びターミネーターを導入したことを特徴とする組換えベクター。
(6) (1)から(4)のいずれかに記載の遺伝子、又は(5)に記載の組換えベクターを導入した形質転換イネ。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
１．人工合成遺伝子の設計と合成
本発明の人工合成遺伝子（以下、本発明の遺伝子という）は、天然のアビジンタンパク質をコードする遺伝子を、イネにおける使用頻度が高いコドンを選択することによってイネの中で高い発現効率を有するように改変した遺伝子である。本発明の遺伝子をイネに導入し、形質転換することにより、害虫抵抗性に優れたイネを作出することができる。
【００１０】
本明細書において、天然のアビジンタンパク質とは、ニワトリ由来アビジンタンパク質をいい、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。また、このアミノ酸配列からなるタンパク質が害虫抵抗性を付与する活性を有する限り、そのアミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号１で表わされるアミノ酸配列に１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。ここで、「害虫抵抗性を付与する活性」とは、イネ等の作物に対して食害などによりその生育に悪影響を及ぼす、またはその収穫物である穀類に対して被害を及ぼしその商品価値を低下させる害虫を防除・殺虫する活性をいう。上記の「害虫抵抗性を付与する活性を有する」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が有する上記活性と実質的に同等であることをいう。
【００１１】
上記アミノ酸の欠失、付加、及び置換は、上記タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異が導入される。
【００１２】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子としては、具体的には、配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。また、配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ害虫抵抗性を付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も本発明に含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち60％以上、好ましくは80％以上の相同性を有するDNAの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましくは65℃での条件をいう。
【００１３】
本発明の遺伝子の設計と合成は、細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ７「植物のPCR実験プロトコール」、95〜100頁、島本巧・佐々木卓治監修秀潤社、1997年7月1日刊行に記載の方法を参考に行うことができる。
【００１４】
具体的には、配列番号１のアミノ酸配列を作成し、そのアミノ酸に対応するコドンとしてイネにおける使用頻度の高いコドンを選択することによって本発明の遺伝子の塩基配列を設計する。イネにおけるコドン使用頻度の情報（下記表１参照）は、例えば、当業者に公知のDNAデータベース（GenBank、EMBL、DDBJなど）を利用して得ることができる。また、細胞外に運搬させるために上記のアミノ酸配列にシグナル配列を付加する場合には、これを含めたタンパク質全体のアミノ酸配列を作成する。シグナル配列を付与するのは、発現されたアビジンが植物に対しても毒性を示す可能性があるのでそれを回避するためである。シグナル配列としては、イネ又はイネに近縁の植物由来のものであることが好ましく、例えば、細胞外へ移行するシグナルであるオオムギ由来のα−アミラーゼのシグナル配列等が挙げられるが、これに限定はされない。また、細胞外へ移行させる以外に液胞移行シグナル配列を用いて液胞に移行させてもよい。
【００１５】
【表１】

【００１６】
以下、本発明の遺伝子作製の具体的手順を示す。
▲１▼ まず作成したアミノ酸配列に含まれる各アミノ酸の個数を求める。
▲２▼ イネのコドンの平均出現頻度に最も近くなるように、上記で求めた個数のアミノ酸について使用するコドンを割り当てる。
▲３▼ なるべく同一コドンが連続しないように、それぞれのコドンの使用順番をつける。
▲４▼ Ｎ末端側のアミノ酸から順番に、各アミノ酸について▲３▼で決定したコドンの順番通りに選び、そのアミノ酸残基のコドンと仮決定する。
▲５▼ ▲１▼〜▲３▼の手順を繰り返しＣ末端までの全アミノ酸のコドンを仮決定し、最後に終止コドンを配置する。
▲６▼ 決定されたコドンからなる人工遺伝子について、植物において遺伝子の転写を阻害する配列であるATTTA配列が存在しないことを確認する。この配列が存在した場合には、この配列にかかるコドンを別の部分で使用したコドンと交換する。
▲７▼ 以降の操作で使用する制限酵素の認識配列が存在しないことを確認する。存在した場合には、この配列にかかるコドンを別の部分で使用したコドンと交換する。
▲８▼ 再び▲６▼、▲７▼を確認する。
尚、遺伝子設計の際に、後の操作のために適当な制限酵素認識配列を５’および３’に付加しておくことが好ましい。
【００１７】
次に、上記で設計した塩基配列を有する遺伝子の合成は、PCRを用いた長鎖DNA合成法を用いて行うことができる(島本ら、「植物のPCR実験プロトコール」、同上参照）。この方法では、長い合成オリゴヌクレオチドプライマーのみを使用してDNAを合成する。プライマーの対は、プライマーの各々の3'末端に約10〜12bpの相補鎖またはオーバーラップをもつように合成され、お互いのプライマーを鋳型としてDNA合成を行う。プライマーの全長は、約60〜100mer、好ましくは約80〜100merである。
【００１８】
まず、設計された塩基配列をもとに例えば約90塩基ごとにプライマーとするDNAオリゴマーを設計し、合成する（図１参照）。DNAオリゴマーの合成は、β−シアノエチルホスホアミダイド法によりDNA合成機を用いて行うことができる。
まず、設計した塩基配列の中央部付近から5’側約90残基上流までの配列を用いて第１のDNAオリゴマー設計し、合成する。次にこの第１のDNAオリゴマーの3’側12残基の配列を含み、この部分より遺伝子の3’下流側に90残基程度の長さの相補鎖オリゴマーを合成し、これを第２のDNAオリゴマーとする。また、第１のDNAオリゴマーの5’側12残基を含み、この部分より遺伝子の5’上流側に90残基程度の長さの相補鎖オリゴマーを合成し、これを第３のDNAオリゴマーとする。さらに、第２のDNAオリゴマーの5’側（遺伝子側からみると3’側）の12残基の配列を含み、この部分より遺伝子の3’下流側に第２のDNAオリゴマーの相補鎖を合成し、これを第４のDNAオリゴマーとする。以下同様に第５、第６のDNAオリゴマーを合成する。合成遺伝子は550残基程度なのでこれで全部の領域をカバーできるが、カバーできていない場合はカバーできるまでさらにオリゴマーを合成する。
【００１９】
次に、これらオリゴマーを順番にPCR反応により結合する。まず第１と第２のDNAオリゴマーをプライマーとして用いてPCR反応を行う。次にこのPCR産物を鋳型として、第３、第４のDNAオリゴマーをプライマーとして用いてPCR反応を行う。PCR反応は、例えば、変性温度94℃１分、アニール温度51℃１分、伸長温度72℃２分を１セットとして５サイクル反応させた後、変性温度94℃１分、アニール温度60℃１分、伸長温度72℃２分を１セットして20サイクル反応を行う。反応に使用するDNAポリメラーゼは塩基の取り込みエラー率の低い酵素を使用することが好ましい。以下この操作を繰り返し、塩基配列を伸長し、目的の塩基配列を得る。目的の塩基配列の両端には、必要に応じて制限酵素部位を設け、常法に従いクローニングベクターに導入し、サブクローニングする。得られたクローンの塩基配列をDNAシークエンサーで確認し、目的の塩基配列が得られたことを確認する。
【００２０】
２．組換えベクターの構築
１．で合成した人工合成遺伝子は適当なベクターに挿入し、イネなどの植物細胞へ導入して発現される。本発明の遺伝子を導入するためのベクターとしては、pBI系のベクター、pUC系のベクター、pTRA系のベクターが好適に用いられる。pBI系及びpTRA系のベクターは、アグロバクテリウムを介してイネに目的遺伝子を導入することができる。本発明においてはpBI系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3等が挙げられる。バイナリーベクターとは大腸菌（Escherichia coli）およびアグロバクテリウムにおいて複製可能なベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物に感染させると、ベクター上にあるLB配列とRB配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のDNAを植物核DNAに組み込むことが可能である（EMBO Journal 1991；10(3)：697-704）。一方、pUC系のベクターは、パーティクルガン法などでイネに目的遺伝子を直接導入することができ、例えば、pUC18、pUC19、pUC9等が挙げられる。また、カルフラワーモザイクウイルス（CaMV)、インゲンマメモザイクウイルス（BGMV)、タバコモザイクウイルス（TMV）等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
【００２１】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法で行うことができる。
【００２２】
本発明の遺伝子は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこでベクターには、発現カセットとして、本発明の遺伝子の上流にプロモーター、下流にターミネーターを結合し、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）などを含めることができる。
【００２３】
「プロモーター」としては、植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。使用するプロモーターの種類を変更することによって、アビジンを発現させる部位を変えることが可能である。あるいは特定の生育段階で発現させることや特定の反応刺激によって誘導することもできる。使用することのできるプロモーターとしては、例えば、グルテリンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Pnos)、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来PRタンパク質プロモーター等が挙げられる。グルテリン由来のプロモーターは種子特異的発現を誘導する性質を持ち（Plant Journal 1998;14(6):673-683）、貯穀害虫に対する効果の点からより好ましい。
【００２４】
「ターミネーター」は、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を集結できる配列であればよい。具体例としては、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Tnos)、カリフラワーモザイクウイルスポリＡターミネーター等が挙げられる。
【００２５】
「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、例えばCaMV35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。
【００２６】
また、本発明の遺伝子の導入により形質転換した植物細胞を効率的に選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含めるか、もしくは選抜マーカー遺伝子 を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
【００２７】
３．形質転換イネの作製
形質転換イネは、本発明の遺伝子又は該遺伝子を含む組換えベクターを、該遺伝子が発現しうるようにイネ細胞に導入することにより得ることができる。
ここで、「イネ細胞」とは、例えば葉、根、茎、花および種子中の胚盤などの細胞、カルス、懸濁培養細胞等をいう。
【００２８】
本発明の遺伝子又は組換えベクターをイネに導入する方法としては、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。例えばアグロバクテリウム法による遺伝子導入は、前記の組換えベクター（バイナリーベクター）をアグロバクテリウムに導入し、得られたアグロバクテリウムをイネ細胞に感染させることによる行う。以下に、具体的手順を示す。
【００２９】
まず、イネの完熟種子を次亜塩素酸で消毒後、2, 4-ジクロロ酢酸を含む 寒天固形培地に置床して培養する。約３週間後胚盤組織より生じたカルスを寒天固形培地に移植して約３日又はそれ以上培養すると、アグロバクテリウム法に供試できるカルスが得られる。使用するイネの品種としては、例えば、コシヒカリ等の日本型品種および IR36 等のインド型品種があるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
次に、得られたカルスに組換えベクターを導入したアグロバクテリウムを感染させる。アグロバクテリウムは、例えばアグロバクテリウム・ツメファンシス（Agrobacterium tumefaciens）EHA101、LBA4404 などを用いることができる。このアグロバクテリウムを選抜用薬剤を含む培地で培養することによって、本発明の遺伝子および選抜マーカー遺伝子が導入されたアグロバクテリウムのみを増殖することができる。最後に、遺伝子導入カルスから残存するアグロバクテリウムを除去し、ハイグロマイシンなどの選抜用薬剤を含んだ再分化誘導用培地にて培養し、形質転換されたカルスを選抜した後、シュートを誘導し、イネ植物体を形成させ、形質転換イネを得る。
【００３１】
なお、本発明において 形質転換イネとは、本発明の遺伝子を導入したカルスなどの植物培養細胞、植物体全体、植物器官（根、茎、葉、花、種子、実（種籾））を総称するものであり、種子の可食形態である玄米、精米、米粉および米飯を含む。植物培養細胞を対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させるためには既知の組織培養法により器官又は個体を再生させればよい。
【００３２】
本発明の遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、形質転換細胞および組織から常法に従って DNAを抽出し、公知の PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。
【００３３】
本発明の形質転換イネは、自家受粉によって後代植物を作出することが可能であり、本発明の遺伝子を後代に遺伝させることできる。また、本発明の形質転換イネは他のイネとの交配により新たな品種を作出するためにも用いることができる。本発明の形質転換イネは、導入されたアビジン人工合成遺伝子により阻害されることなく正常に生育し、かつ該遺伝子の発現によって高い害虫抵抗性を示し、これを食害した貯穀害虫は死亡あるいは生育が抑制される。
【００３４】
ここで、抵抗性を示すことができる害虫の種類としては、例えば、直翅目（イナゴ、クサキリ等）、半翅目（アブラムシ、イネカメムシ、イネクロカメムシ、ウンカ、カメムシ、クモヘリカメムシ、シラホシカメムシ、セジロウンカ、ツマグロヨコバイ、トビイロウンカ等）、鱗翅目（アワヨトウ、イチモンジセセリ、イネアオムシ、イネツトムシ、イネヨトウ、コブノメイガ、ニカメイガ、ニカメイチュウ、ノシメマダラメイガ、イッテンコクガ、ガイマイツヅリガ、バクガ等）、双翅目（イネカラバエ、イネキモグリバエ、イネハモグリバエ等）、甲虫目（ヒラタコクヌストモドキ、イネクビホソハムシ、イネゾウムシ、イネドロオイムシ、コクヌストモドキ、コクゾウムシ、ココクゾウムシ等）などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例により限定されるものではない。
【００３６】
（実施例１） アビジンタンパク質をコードする人工合成遺伝子の設計および合成
大麦のアルファアミラーゼ由来のシグナル配列（配列番号４）に続いてアビジンのアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列を作成した。このアミノ酸配列に含まれる各アミノ酸に前記手順に従ってイネにおいて使用頻度の高いコドンを割り当てることによって人工合成遺伝子のDNA配列を設計した（配列番号３）。遺伝子には５’側の末端にBamHIサイトを、３’側末端にHindIIIおよびBamHIサイトを（５’側からHindIII 、BamHIの順番で）挿入した。
【００３７】
設計したDNA配列をもとに約90塩基ごとに下記のDNAオリゴマー合成業者（タバイエスペックオリゴ）に依頼して合成した。
Avid3F（配列番号７）：
agagttcact gggacataca ttaccgcagt cacggcgact tcaaacgaaa tcaaagagtc gccattgcac ggcacccaga atacaatcaa ca
Avid4R（配列番号８）
aaagcattgg cccgtgaaga cggttgtact ctcggagaac ttccaattca cagtaaaccc
gaaggtcggc tgcgtacgct tgttgattgt at
Avid2F（配列番号６）
gccaggaagt gctccctcac cggcaagtgg acgaatgacc tgggtagcaa catgaccatt
ggcgctgtga actctcgcgg agagttcact gg
Avid5R（配列番号９）：
ttccagtcat cgcctatgtc gttcacggag ctgcgtagaa gccacatcgt cttgagaact
tctttaccat ttcgatcgat aaagcattgg cc
Avid1F(配列番号５）：
ggatccatgg ctaacaagca cctcagcctg tccttgttcc tcgtgcttct cggcctgtca
gcctcgctag cgtctggaca ggccaggaag tgc
Avid6R(配列番号１０)：
ggatccaagc tttcactcct tctgggtcct cagtcttgtg aagatgttga ttcctacccg
agtggctttc cagtcatcg
【００３８】
なお、上記Avid3F（配列番号７）、Avid4R（配列番号８）、Avid2F（配列番号６）、Avid5R（配列番号９）、Avid1F(配列番号５)、Avid6R(配列番号１０)は、それぞれ前記のオリゴマーDNA１，２，３，４，５，６に相当する。
【００３９】
最初に、上記DNAオリゴマーのうち、Avid3F（配列番号７）およびAvid4R（配列番号８）を用いてPCR反応を行った。PCR反応液の組成を表２に示す。反応に使用したDNAポリメラーゼはタカラバイオ社のExTaqであり、酵素に添付された反応緩衝液を使用した。PCRの条件は、変性温度94℃１分、アニール温度51℃１分、伸長温度72℃２分を１サイクルとして5サイクル、変性温度94℃1分、アニール温度60℃1分、伸長72℃2分を１サイクルとして20サイクルとした。
【００４０】
【表２】

【００４１】
次に、上記PCR反応の増幅産物の一部を取りこれをテンプレートとしてAvid2F（配列番号６）、Avid5R（配列番号９）を用いてPCR反応を行った。PCR条件は上記1回目の反応と同じでPCR反応液の組成は表３に示す通りである。
【００４２】
【表３】

【００４３】
次に、上記PCR反応の増幅産物の一部を取りこれをテンプレートとして増幅産物の一部を取り、最後にAvid1F(配列番号５)、Avid6R(配列番号１０)を用いてPCR反応を行い、目的とする人工合成遺伝子を作製した。PCR条件は上記1回目の反応と同じでPCR反応液の組成は表４に示す通りである。
PCR反応終了後の反応液をキアゲン社のPCR Purification Kitを用いて合成DNAを精製し、次のサブクローニングに使用した。
【００４４】
【表４】

【００４５】
（実施例２） 組換えベクターの構築及び形質転換イネの作製
(1) 組換えベクターの構築
実施例１で得られたDNA断片をTOPO-XLクローニングキット（インビトロジェン社製）用いて、キットに含まれるpCR-XL-TOPOベクターにサブクローニングした。サブクローニングしたDNA配列が正しいものであるかをDNAシークエンサー（パーキンエルマー社製ABIprism310）で確認した。このサブクローニングしたプラスミドよりBamHIで挿入断片を切り出した。農業生物資源研究所の高岩らが作成したGluB-1プロモーター（グルテリンプロモーター）がpUC18に挿入されたベクターをBamHIで切断し、上記の挿入断片を連結させた。GluB-1プロモーターの3’下流に正方向に挿入されたクローンを選び、このクローンをHindIIIで切断し、GluB-1プロモーターに連結されたアビジン人工合成遺伝子（アミラーゼシグナル配列を含む）を切り出した。
【００４６】
バイナリーベクターは農業生物資源研究所の川崎らが作成したベクターを改変したpBIG-Hを用いた。このベクターは２つのボーダー配列の間にカナマイシン耐性遺伝子（NPT II)、ハイグロマイシン耐性遺伝子(HPT)、β-グルクロニダーゼ遺伝子、SAR配列を有する。このベクターを、HindIIIで処理し、上記のGluB-1プロモーターに連結されたアビジン人工合成遺伝子を挿入した。図２に、アビジン人工合成遺伝子含有バイナリーベクター（Avi-pBIG-Hと称する）の構造を示す（図２中、GluB-1-pro:GluB-1プロモーター、amyl-avidin:アビジンの人工合成遺伝子にアミラーゼのシグナル配列部分を付加した遺伝子、HindIII:HindIII制限酵素部位、RB:ライトボーダー、Nos-pro:ノパリン合成酵素プロモーター、NPTII:カナマイシン耐性遺伝子、Nos-ter:ノパリン合成酵素ターミネーター、SAR:スキャフォールドアタッチメントリージョン、35S:カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、intron-GUS:イントロンを含むβ-グルクロニダーゼ遺伝子、HPT:ハイグロマイシン耐性遺伝子、LB:レフトボーダーを示す）。なおこのベクターにはHindIII挿入部位の3'下流にNosターミネーター配列が存在し、正方向に遺伝子を導入すると導入した遺伝子のターミネーターとして機能する。また、SAR配列とはMAR配列とも呼ばれ、核マトリックスと親和性のあるDNA配列でSAR配列の近傍にある遺伝子の転写効率を高めることが報告されている(Transgenic Research 1993；2(2)：93-100）。
【００４７】
(2) 発現用バイナリーベクターのイネへの導入
(1)で作製したAvi-pBIG-Hベクターをアグロバクテリウムに導入した。遺伝子導入は、エレクトロポレーション装置（Genetronics社製ECM395）を使用し、1.45keVで荷電することにより行った。形質転換したアグロバクテリウムは50％グリセロールを含むLB培地を用いて-80℃で保存した。また、これと同様にpBIG-H（対照）を同様にしてアグロバクテリウムに導入した。Avi-pBIG-H、pBIG-H導入アグロバクテリウムをそれぞれ用いてイネ（日本晴）を形質転換した。
【００４８】
(3) アビジン遺伝子の発現の確認
形質転換イネにおけるアビジンタンパク質の発現をウェスタンブロッティング法により検出した。方法は、タンパク質実験ノート、24-32頁、岡田雅人・宮崎香編集、羊土社、1996年10月15日刊行に記載の方法に準じた。形質転換イネ及び対照イネ（対照用のpBIG-Hで形質転換）の種子より可溶性タンパク質を抽出し、30μｇずつSDS-PAGEにかけた。電気泳動した後、ゲル内のタンパク質を平板型転写装置セミドライタイプ（日本エイドー社製）を用いて転写膜（Immobilon-Psq, Millipore社製）に転写した。検出のための１次抗体としてウサギ抗卵白アビジンポリクローナル抗体（Biogenesis社製）を用い、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識したヤギ抗IgG抗体（バイオ・ラッド社製）を用いた。検出にはAP発色キット（バイオ・ラッド社製）を用いた。図３に、形質転換イネ及び対照イネのそれぞれの種子から抽出した可溶性タンパク質をウェスタンブロッティング法によって解析した結果を示す（図３中、レーン１：対照イネ種子の抽出液（タンパク質量30μｇ）、レーン２：形質転換イネ種子の抽出液（タンパク質量30μｇ）、レーン３：標準アビジン（100ng）を示す）。形質転換イネ種子の可溶性タンパク質のレーンでは強いシグナルがみられ、アビジンタンパク質が発現していることが確認された。また、検出されたシグナルより推定される分子量は標準品のアビジンよりやや小さかった。一方、対照イネの可溶性タンパク質ではシグナルが検出されなかった。
【００４９】
（実施例３） 形質転換イネ米に含有されるアビジン量の測定
ELISA法により形質転換イネ米に含有されるアビジン量を測定した。実験方法は「タンパク質実験の進め方」、94〜96頁、岡田雅人・宮崎香編集、羊土社、1998年10月1日刊行に記載の方法に準じた。実施例２で得られた形質転換イネの玄米１粒に0.1モルリン酸緩衝液（pH7.0）を加えてホモジナイズし、10000×ｇ、10分間遠心分離して得られた上澄み可溶性液を試験に供した。ELISA試験用マイクロプレート（IWAKI3801-096）にこの可溶性液50μｌずつ分注した。室温で２時間放置し、サンプルを取り除いた後、PBS（NaCl 8g, Na₂HPO₄・12H₂O 2.9g, KCl 0.2g, KH₂PO₄ 0.2gを１Lの精製水に溶解して作製）を各ウェル当たり100μｌ分注して３回洗った。ブロッキング溶液（2.5%牛血清アルブミン、5%ショ糖を含む10mMリン酸緩衝液(pH8.0)）を100μｌずつ分注し室温で２時間放置した。ブロッキング溶液を取り除き、ブロッキング溶液で1000分の１に希釈した１次抗体（実施例２で使用）を60μｌずつ分注し37℃で１時間放置した。未結合の一次抗体を取り除くため、100μlのPBSで５回洗った。続いて、ブロッキング溶液で1000分の１に希釈した２次抗体（実施例２で使用）を60μｌずつ分注し37℃で１時間放置した。未結合の二次抗体を取り除くため、100μlのPBSで５回洗った。PBSを捨て、発色用反応液（バイオラド172-1063）を100μl加えて室温で１時間反応させた。マイクロプレートリーダー（東ソー MPR-A4）により410nmの吸光度を測定した。実施例２で作製した形質転換イネ１９系統のうち、ウェスタンブロット法による解析で強いシグナルが認められた３系統について８粒ずつ分析したところ、それぞれ平均値で54、114、76ppmのアビジンを含んでいた。白米ではタンパク質含量が約90％に減少するので（５訂日本食品成分表、科学技術庁資源調査会編（2000年））、白米における推定アビジン含量はそれぞれ49、103、68ppmとなる。
【００５０】
（実施例４） 形質転換イネ米を用いた害虫成育抑制試験
実施例２で得られた形質転換イネ(試験区）と対照イネ（対照区）の玄米を用意した。これら玄米を別々にミルサー（イワタニ社製）を用いて粉砕し、1.5mlマイクロチューブに50mgずつ分けて入れこれを試験区、対照区とも各20個用意した。マイクロチューブの蓋には呼吸用の穴を３カ所針先で開けた。このチューブにヒラタコクヌストモドキの孵化幼虫を１頭ずつ放ち、30℃下で飼育試験を行った。結果を表５に示す。形質転換イネ米を飼料とした場合、試験２週間後で生存個体は２頭となり、最終的に成虫になった個体は存在しなかった。一方、対照区では試験開始２週間後で18個体が生存し、最終的には16頭が成虫となった。従って、アビジンを含む形質転換イネの玄米は強力に害虫の成育を抑制することが判明した。
【００５１】
【表５】

【００５２】
（実施例５） プロモーターの発現効率の比較
イネ種子におけるプロモーターとしての誘導効率に関し、GluB-1プロモーターと植物の遺伝子導入の際に汎用されている35Sプロモーターとの比較を行った。ハトムギ由来のシスタチン遺伝子（Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 2002;66(10):2287-2291)を35SプロモーターおよびGluB-1プロモーターの下流に結合したコンストラクトをそれぞれ作製し、バイナリーベクターに導入した。これらのベクターを用いて実施例２に記載の通りアグロバクテリウム法により形質転換イネを作製した。それぞれの形質転換体イネから得た稔実種子（４粒）の可溶性タンパク質30μgをSDS-PAGEで分離した後、ウェスタンブロッティング法により解析し、発現量を比較した。図４にその結果を示す（図４中、レーン１：35Sプロモーター形質転換体、レーン２：GluB-1プロモーター形質転換体、レーン３：プロモーターおよびシスタチン遺伝子を含まない形質転換体、矢印：導入したシスタチンのシグナルを示す）。その結果、GluB-1プロモーターを用いた場合の方が35Sプロモーターより強いシグナルが検出された。NIH imageソフトウェアによりシグナルを定量化したところ、GluB-1プロモーターを使用した場合の方が約４倍のシグナル強度があり、GluB-1プロモーターの使用は従来から汎用されている35Sプロモーターより種子における転写効率が高いと考えられる。従って、種子におけるアビジンの発現に関しては35SプロモーターよりGluB-1プロモーターが有効であると考えられる。
【００５３】
（実施例６）ユビキチンプロモーターを使用した形質転換イネ
実施例２におけるGluB-1プロモーターの代わりにイネユビキチンプロモーター(PLANT SCIENCE 2000 Jul 28;156(2):201-211)を使用して形質転換イネを作製したところ、１系統の植物体が得られた。この植物体の葉にはアビジンが発現していることをウェスタンブロット法による解析で確認できたが、稔実しなかった。従って、ユビキチンプロモーターはアビジンを葉茎などに発現させる場合には有用であるが、種子における発現にはGluB-1プロモーターの方が適していると考えられる。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によれば、殺虫活性のあるアビジンタンパク質をコードする遺伝子をイネにおいて使用頻度の高いコドンを選択することによってイネの中で高い発現効率を有するように改変させた人工合成遺伝子が提供される。この人工合成遺伝子を導入した形質転換イネは優れた害虫抵抗性を有する。
【００５５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】 人工合成アビジン遺伝子の作製に用いたDNAオリゴマーの模式図を示す。
【図２】 アビジン人工合成遺伝子含有バイナリーベクター（Avi-pBIG-H）の構造を示す。
【図３】 形質転換イネ及び対照イネのそれぞれの種子から抽出した可溶性タンパク質をウェスタンブロッティング法によって解析した結果を示す。
【図４】 GluB-1プロモーターおよび35Sプロモーターにより誘導されるタンパク質発現量をウェスタンブロッティング法によって解析した結果を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an artificial synthetic gene encoding avidin that imparts pest resistance, and transformed rice into which the gene has been introduced.
[0002]
[Prior art]
Rice is one of the three largest grains in the world, along with wheat and corn, and occupies the most important position as a national staple food in Japan. In rice cultivation, the use of pesticides is indispensable to prevent damage from various pests. Fumigants are also used to save harvested rice from the damage caused by stored pests. However, the use of pesticides and fumigants is a major problem in recent years, with the trend toward consumer safety and the need for environmentally conscious agriculture. The use of pesticides destroys the balance of the ecosystem by killing not only pests but also beneficial insects, and the spilled pesticides can contaminate the environment, and the spraying of pesticides itself can adversely affect the health of farmers. . In recent years, the problem of residual agricultural chemicals has caused consumer insecurity, and safe agricultural products have been demanded.
[0003]
As one means for solving this, it is considered to provide resistance to pests by a genetic recombination technique. As a representative example, it has been reported that pest resistance is acquired by incorporating a Bt toxin gene, which is a toxin produced by Bacillus thuringiensis, into rice (Biotechnology (NY), 1993; 11 (10): 1151-1155 ). However, Bt toxin has a problem in that pests having an effect have selectivity, and the target pests are limited. For example, a certain Bt toxin is known to have an effect on lepidopterous pests, but has no effect on beetles (Microbiological Review 1989; 53 ( 2): 242-255). In addition, regarding pest control with such recombinants, if crops introduced with the same type of gene are continuously cultivated for a long period of time, there is a risk that resistance will occur on the pest side.
[0004]
On the other hand, avidin is a basic protein in egg white having the property of binding strongly to biotin. Avidin has been reported to have insecticidal activity against a wide variety of insects, including the dipterous larvae of the house fly (Non-patent Document 1) and lepidopterous and Coleoptera insects (Non-patent Document 2). . Based on these findings, maize (Non-patent Document 3) and tobacco (Non-patent Document 4) into which the avidin gene has been introduced were produced, and it has been reported that these plants have pest resistance. However, no example has been reported for rice in which transgenic plants into which avidin has been introduced have been produced.
[0005]
[Non-Patent Document 1]
Journal of Insect Physiology 1959; 3: 293-305
[Non-Patent Document 2]
Entomologia Experimentalis Applicata 1993; 69: 97-108
[Non-Patent Document 3]
Nature Biotechnology 2000; 18: 670-674
[Non-Patent Document 4]
Transgenic Research 2002; 11 (2): 185-198
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
As a pest control method for rice, the use of chemical pesticides, which are conventional techniques, has problems such as labor and cost, long-lasting medicinal effects, and concerns about adverse effects on the human body and the environment. In addition, the genetic recombination technique also has problems such as that the range of target pests is limited, the pest side can be tolerated, and the expression efficiency is poor depending on the plant species.
Accordingly, an object of the present invention is to provide an artificially synthesized gene that is efficiently expressed in rice and can impart excellent pest resistance over a long period of time, and a transformed rice plant into which the gene has been introduced.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have achieved high expression efficiency in rice by selecting a codon frequently used in rice for a gene encoding an avidin protein having insecticidal activity. It was found that when an artificially synthesized gene modified so as to have it was introduced into rice, the rice exhibited excellent pest resistance, and the present invention was completed.
[0008]
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) An artificial synthetic gene that has been modified to have high expression efficiency in rice by selecting a codon that encodes the protein shown in (a) or (b) below and is frequently used in rice.
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
(b) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and having an activity of imparting pest resistance
(2) The artificially synthesized gene according to (1), comprising the DNA shown in the following (c) or (d).
(c) DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
(d) a DNA encoding a protein that hybridizes with a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing under stringent conditions and has an activity of imparting pest resistance
(3) An artificially synthesized gene obtained by adding a gene encoding a signal peptide to the gene according to (1) or (2).
(4) The artificially synthesized gene according to (3) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
(5) A recombinant vector comprising the artificially synthesized gene and terminator according to any one of (1) to (4) introduced downstream of a promoter that can function in rice.
(6) A transgenic rice plant into which the gene according to any one of (1) to (4) or the recombinant vector according to (5) has been introduced.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
1. Design and synthesis of artificially synthesized genes
The artificial synthetic gene of the present invention (hereinafter referred to as the gene of the present invention) has a high expression efficiency in rice by selecting a gene encoding a natural avidin protein by selecting a codon frequently used in rice. It is a modified gene. By introducing the gene of the present invention into rice and transforming it, rice having excellent pest resistance can be produced.
[0010]
In the present specification, the natural avidin protein refers to a chicken-derived avidin protein, which is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Further, as long as the protein comprising this amino acid sequence has an activity of imparting pest resistance, a plurality of amino acid sequences, preferably one or several amino acids, may be mutated such as deletion, substitution, addition, etc. . For example, 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be deleted, and 1 to 10, preferably 1 is deleted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. ˜5 amino acids may be added, or 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be substituted with other amino acids. Here, “activity imparting pest resistance” refers to adverse effects on the growth of rice and other crops due to food damage, etc., or damage to the cereal crops, resulting in a reduction in commercial value. It refers to the activity to control and kill insect pests. The above “having an activity of imparting pest resistance” means substantially equivalent to the activity possessed by the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
[0011]
The amino acid deletion, addition, and substitution can be performed by modifying a gene encoding the protein by a technique known in the art. Mutation can be introduced into a gene by a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method or a method equivalent thereto, for example, a mutation introduction kit (for example, Mutant-K using site-directed mutagenesis). (TAKARA) or Mutant-G (TAKARA)) or the like, or the TAKARA LA PCR in vitro Mutagenesis series kit is used to introduce mutations.
[0012]
Specific examples of the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 include a gene consisting of DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. In addition, a gene comprising a DNA that hybridizes with a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 under a stringent condition and encodes a protein having an activity of imparting pest resistance is also included in the present invention. Here, “stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, a nucleic acid with high homology, that is, a condition where a complementary strand of DNA having a homology of 60% or more, preferably 80% or more hybridizes, and a complementary strand of a nucleic acid with lower homology does not hybridize. . More specifically, the sodium concentration is 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, and the temperature is 60 to 68 ° C, preferably 65 ° C.
[0013]
The design and synthesis of the gene of the present invention is described in Cell Engineering Supplement, Plant Cell Engineering Series 7 “Plant PCR Experiment Protocol”, pages 95-100, published by Shujunsha, supervised by Takuji Shimamoto and Takuji Sasaki, July 1, 1997. The method described can be used as a reference.
[0014]
Specifically, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is prepared, and the base sequence of the gene of the present invention is designed by selecting a codon frequently used in rice as a codon corresponding to the amino acid. Information on codon usage in rice (see Table 1 below) can be obtained using, for example, DNA databases (GenBank, EMBL, DDBJ, etc.) known to those skilled in the art. In addition, when a signal sequence is added to the above amino acid sequence for transporting it outside the cell, an amino acid sequence of the entire protein including the signal sequence is prepared. The signal sequence is added in order to avoid the expressed avidin since it may be toxic to plants. The signal sequence is preferably derived from rice or a plant closely related to rice, and examples thereof include, but are not limited to, the signal sequence of barley-derived α-amylase which is a signal that moves outside the cell. Not done. Moreover, you may make it transfer to a vacuole using a vacuole transfer signal arrangement | sequence other than transferring outside a cell.
[0015]
[Table 1]

[0016]
Hereinafter, a specific procedure for producing the gene of the present invention will be described.
(1) First, the number of each amino acid contained in the prepared amino acid sequence is determined.
(2) The codons to be used for the number of amino acids determined above are assigned so as to be closest to the average frequency of rice codons.
(3) The order of use of the respective codons is set so that the same codons do not continue as much as possible.
{Circle around (4)} In order from the amino acid at the N-terminal side, each amino acid is selected in the order of the codons determined in {circle around (3)}, and is temporarily determined as the codon of that amino acid residue.
(5) Repeat steps (1) to (3) to tentatively determine the codons of all amino acids up to the C-terminal, and finally place a stop codon.
{Circle around (6)} Regarding the artificial gene comprising the determined codon, it is confirmed that there is no ATTTA sequence that is a sequence that inhibits gene transcription in plants. If this sequence is present, the codon for this sequence is replaced with a codon used elsewhere.
(7) Confirm that there is no recognition sequence for the restriction enzyme used in the subsequent operations. If present, the codon for this sequence is replaced with a codon used elsewhere.
(8) Check (6) and (7) again.
In addition, at the time of gene design, it is preferable to add appropriate restriction enzyme recognition sequences to 5 ′ and 3 ′ for subsequent operations.
[0017]
Next, synthesis of a gene having a base sequence designed as described above can be performed using a long-chain DNA synthesis method using PCR (see Shimamoto et al., “Plant PCR Experiment Protocol”, ibid). In this method, DNA is synthesized using only long synthetic oligonucleotide primers. The primer pair is synthesized so that each 3 ′ end of the primer has a complementary strand or overlap of about 10 to 12 bp, and DNA synthesis is performed using each primer as a template. The total length of the primer is about 60-100mer, preferably about 80-100mer.
[0018]
First, based on the designed base sequence, for example, a DNA oligomer is designed and synthesized using primers every about 90 bases (see FIG. 1). The synthesis of the DNA oligomer can be performed using a DNA synthesizer by the β-cyanoethyl phosphoramidide method.
First, a first DNA oligomer is designed and synthesized using a sequence from about the center of the designed base sequence to about 90 residues upstream of the 5 ′ side. Next, a sequence of 12 residues at the 3 ′ side of the first DNA oligomer was synthesized, and a complementary strand oligomer having a length of about 90 residues was synthesized from this portion 3 ′ downstream of the gene. A DNA oligomer is used. In addition, it contains 12 residues on the 5 ′ side of the first DNA oligomer, and a complementary strand oligomer having a length of about 90 residues is synthesized 5 ′ upstream of the gene from this portion. To do. Furthermore, it contains a 12-residue sequence on the 5 'side (3' side when viewed from the gene side) of the second DNA oligomer, and the complementary strand of the second DNA oligomer is synthesized 3 'downstream of the gene from this part. This is the fourth DNA oligomer. Thereafter, the fifth and sixth DNA oligomers are synthesized in the same manner. Since the synthetic gene is about 550 residues, this can cover the entire region, but if it is not covered, further oligomers are synthesized until it can be covered.
[0019]
Next, these oligomers are sequentially bound by a PCR reaction. First, a PCR reaction is performed using the first and second DNA oligomers as primers. Next, a PCR reaction is performed using the PCR product as a template and the third and fourth DNA oligomers as primers. For example, the PCR reaction is performed by 5 cycles of a denaturation temperature of 94 ° C. for 1 minute, an annealing temperature of 51 ° C. for 1 minute, and an extension temperature of 72 ° C. for 2 minutes, followed by a denaturation temperature of 94 ° C. for 1 minute and an annealing temperature of 60 ° C. for 1 minute. Then, 20 cycles of reaction are performed with one set of extension temperature 72 ° C. for 2 minutes. The DNA polymerase used in the reaction is preferably an enzyme having a low base incorporation error rate. Thereafter, this operation is repeated to extend the base sequence to obtain the target base sequence. Restriction enzyme sites are provided at both ends of the target base sequence, if necessary, and introduced into a cloning vector according to a conventional method for subcloning. The base sequence of the obtained clone is confirmed with a DNA sequencer to confirm that the target base sequence has been obtained.
[0020]
2. Construction of recombinant vector
1. The artificially synthesized gene synthesized in (1) is inserted into an appropriate vector and introduced into plant cells such as rice to be expressed. As a vector for introducing the gene of the present invention, a pBI vector, a pUC vector, and a pTRA vector are preferably used. The pBI and pTRA vectors can introduce a target gene into rice via Agrobacterium. In the present invention, a pBI binary vector or an intermediate vector is preferably used, and examples thereof include pBI121, pBI101, pBI101.2, pBI101.3 and the like. A binary vector is a vector that can replicate in Escherichia coli and Agrobacterium. When Agrobacterium holding the binary vector is infected with a plant, it is surrounded by a border sequence consisting of LB and RB sequences on the vector. It is possible to incorporate the portion of DNA into plant nuclear DNA (EMBO Journal 1991; 10 (3): 697-704). On the other hand, a pUC vector can directly introduce a target gene into rice by a particle gun method or the like, and examples thereof include pUC18, pUC19, and pUC9. Plant virus vectors such as calflower mosaic virus (CaMV), kidney bean mosaic virus (BGMV), and tobacco mosaic virus (TMV) can also be used.
[0021]
In order to insert the gene of the present invention into a vector, first, the purified DNA is cleaved with a suitable restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of a suitable vector DNA, and ligated to the vector. be able to.
[0022]
The gene of the present invention needs to be incorporated into a vector so that its function is exhibited. Therefore, the vector contains an expression cassette, a promoter upstream of the gene of the present invention, a terminator downstream, and an enhancer, splicing signal, poly A addition signal, selection marker, ribosome binding sequence (SD sequence), etc. be able to.
[0023]
The “promoter” does not have to be derived from a plant as long as it functions in plant cells and can induce expression in a specific tissue of a plant or in a specific developmental stage. It is possible to change the site where avidin is expressed by changing the type of promoter used. Alternatively, it can be expressed at a specific growth stage or induced by a specific reaction stimulus. Examples of promoters that can be used include glutelin promoter, cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, nopaline synthase gene promoter (Pnos), corn-derived ubiquitin promoter, rice-derived actin promoter, tobacco-derived PR protein promoter, etc. Is mentioned. A promoter derived from glutelin has a property of inducing seed-specific expression (Plant Journal 1998; 14 (6): 673-683), and is more preferable from the viewpoint of effects on stored pests.
[0024]
The “terminator” may be any sequence that can collect transcription of a gene transcribed by the promoter. Specific examples include nopaline synthase gene terminator (Tnos) and cauliflower mosaic virus poly A terminator.
[0025]
The “enhancer” is used to increase the expression efficiency of the target gene. For example, an enhancer region containing an upstream sequence in the CaMV35S promoter is preferable.
[0026]
In order to efficiently select plant cells transformed by introduction of the gene of the present invention, the above recombinant vector contains an appropriate selection marker gene or is introduced into a plant cell together with a plasmid vector containing the selection marker gene. It is preferable to do this. Selectable marker genes used for this purpose include, for example, the hygromycin phosphotransferase gene that is resistant to the antibiotic hygromycin, the neomycin phosphotransferase that is resistant to kanamycin or gentamicin, and the acetyltransferase that is resistant to the herbicide phosphinothricin. Genes and the like.
[0027]
3. Production of transformed rice
Transformed rice can be obtained by introducing the gene of the present invention or a recombinant vector containing the gene into rice cells so that the gene can be expressed.
Here, “rice cells” refers to cells such as leaves, roots, stems, flowers and scutellum in seeds, callus, suspension culture cells and the like.
[0028]
Examples of methods for introducing the gene or recombinant vector of the present invention into rice include the Agrobacterium method, PEG-calcium phosphate method, electroporation method, liposome method, particle gun method, and microinjection method. For example, gene introduction by the Agrobacterium method is performed by introducing the above-described recombinant vector (binary vector) into Agrobacterium and infecting the resulting Agrobacterium into rice cells. The specific procedure is shown below.
[0029]
First, ripened rice seeds are sterilized with hypochlorous acid, then placed on an agar solid medium containing 2,4-dichloroacetic acid and cultured. After approximately 3 weeks, callus generated from scutellum tissue is transplanted to an agar solid medium and cultured for about 3 days or more to obtain callus that can be used for the Agrobacterium method. Examples of rice varieties to be used include, but are not limited to, Japanese varieties such as Koshihikari and Indian varieties such as IR36.
[0030]
Next, the obtained callus is infected with Agrobacterium introduced with a recombinant vector. As Agrobacterium, for example, Agrobacterium tumefaciens EHA101, LBA4404 and the like can be used. By culturing this Agrobacterium in a medium containing a selection drug, only Agrobacterium into which the gene of the present invention and the selection marker gene have been introduced can be grown. Finally, the remaining Agrobacterium is removed from the transgenic callus, cultured in a redifferentiation induction medium containing a selection agent such as hygromycin, the transformed callus is selected, and then a shoot is induced. Then, rice plants are formed to obtain transformed rice.
[0031]
In the present invention, “transformed rice” is a general term for cultured plant cells such as callus into which the gene of the present invention has been introduced, the entire plant body, and plant organs (root, stem, leaf, flower, seed, fruit (seed seed)). And includes brown rice, polished rice, rice flour and cooked rice which are edible forms of seeds. When plant cultured cells are targeted, in order to regenerate a transformant from the obtained transformed cells, an organ or an individual may be regenerated by a known tissue culture method.
[0032]
Whether or not the gene of the present invention has been introduced into a plant can be confirmed by extracting DNA from transformed cells and tissues according to a conventional method, and using a known PCR method, Southern hybridization method, Northern hybridization method, or the like. . For example, DNA is prepared from a transformed plant, PCR is performed by designing DNA-specific primers. After PCR, the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc., stained with ethidium bromide, SYBR Green solution, etc., and the amplified product is detected as a single band. By doing so, it can confirm that it transformed. Moreover, PCR can be performed using a primer previously labeled with a fluorescent dye or the like to detect an amplification product. Furthermore, the amplification product may be bound to a solid phase such as a microplate, and the amplification product may be confirmed by fluorescence or enzymatic reaction.
[0033]
The transformed rice of the present invention can produce progeny plants by self-pollination, and the gene of the present invention can be inherited to progeny. The transformed rice of the present invention can also be used to produce a new variety by crossing with other rice. The transformed rice of the present invention grows normally without being inhibited by the introduced avidin artificially synthesized gene, and exhibits high insect pest resistance by the expression of the gene. It is suppressed.
[0034]
Here, the types of pests that can exhibit resistance include, for example, straight-eyed eyes (locust, weevil, etc.), hemiptera (aphids, rice stink bugs, rice black stink bugs, planthoppers, stink bugs, spider-headed bugs, white-headed stink bugs) , White-tailed planthopper, leafhopper, leafhopper, etc., lepidoptera (Ayoyoto, Ichimonse-seeri, rice-worm, rice-worm, rice-plant, yellow-tailed moth, moth-winged moth, moth-winged moth, moth-winged moth, moth-bird Etc.), Coleoptera (Pinus terrestris, Pterophyllum beetle, B. weevil, B. weevil, B. weevil, B. weevil, B. weevil, etc.), but are not limited to these. No.
[0035]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, this invention is not limited by the following Example.
[0036]
(Example 1) Design and synthesis of artificial synthetic gene encoding avidin protein
An amino acid sequence was prepared by combining the signal sequence derived from barley alpha amylase (SEQ ID NO: 4) with the amino acid sequence of avidin. A DNA sequence of an artificially synthesized gene was designed by assigning a codon frequently used in rice according to the above procedure to each amino acid contained in this amino acid sequence (SEQ ID NO: 3). A BamHI site was inserted into the gene at the 5 ′ end, and HindIII and BamHI sites were inserted into the 3 ′ end (in the order of HindIII and BamHI from the 5 ′ side).
[0037]
Based on the designed DNA sequence, about 90 bases were synthesized by the following DNA oligomer synthesizer (Tabaie spec oligo).
Avid3F (SEQ ID NO: 7):
agagttcact gggacataca ttaccgcagt cacggcgact tcaaacgaaa tcaaagagtc gccattgcac ggcacccaga atacaatcaa ca
Avid4R (SEQ ID NO: 8)
aaagcattgg cccgtgaaga cggttgtact ctcggagaac ttccaattca cagtaaaccc
gaaggtcggc tgcgtacgct tgttgattgt at
Avid2F (SEQ ID NO: 6)
gccaggaagt gctccctcac cggcaagtgg acgaatgacc tgggtagcaa catgaccatt
ggcgctgtga actctcgcgg agagttcact gg
Avid5R (SEQ ID NO: 9):
ttccagtcat cgcctatgtc gttcacggag ctgcgtagaa gccacatcgt cttgagaact
tctttaccat ttcgatcgat aaagcattgg cc
Avid1F (SEQ ID NO: 5):
ggatccatgg ctaacaagca cctcagcctg tccttgttcc tcgtgcttct cggcctgtca
gcctcgctag cgtctggaca ggccaggaag tgc
Avid6R (SEQ ID NO: 10):
ggatccaagc tttcactcct tctgggtcct cagtcttgtg aagatgttga ttcctacccg
agtggctttc cagtcatcg
[0038]
The above Avid3F (SEQ ID NO: 7), Avid4R (SEQ ID NO: 8), Avid2F (SEQ ID NO: 6), Avid5R (SEQ ID NO: 9), Avid1F (SEQ ID NO: 5), and Avid6R (SEQ ID NO: 10) are the oligomers described above. It corresponds to DNA1,2,3,4,5,6.
[0039]
First, PCR reaction was performed using Avid3F (SEQ ID NO: 7) and Avid4R (SEQ ID NO: 8) among the above DNA oligomers. The composition of the PCR reaction solution is shown in Table 2. The DNA polymerase used for the reaction was ExTaq manufactured by Takara Bio Inc., and a reaction buffer attached to the enzyme was used. PCR conditions are: denaturation temperature 94 ° C 1 minute, annealing temperature 51 ° C 1 minute, extension temperature 72 ° C 2 minutes as one cycle, 5 cycles, denaturation temperature 94 ° C 1 minute, annealing temperature 60 ° C 1 minute, extension 72 ° C 2 One cycle was 20 cycles.
[0040]
[Table 2]

[0041]
Next, a part of the amplification product of the PCR reaction was taken, and this was used as a template to perform a PCR reaction using Avid2F (SEQ ID NO: 6) and Avid5R (SEQ ID NO: 9). The PCR conditions are the same as in the first reaction, and the composition of the PCR reaction solution is as shown in Table 3.
[0042]
[Table 3]

[0043]
Next, a part of the amplified product of the above PCR reaction is taken and a part of the amplified product is taken as a template. Finally, a PCR reaction is performed using Avid1F (SEQ ID NO: 5) and Avid6R (SEQ ID NO: 10). An artificially synthesized gene was prepared. PCR conditions are the same as in the first reaction, and the composition of the PCR reaction solution is as shown in Table 4.
After completion of the PCR reaction, synthetic DNA was purified using Qiagen PCR Purification Kit and used for the next subcloning.
[0044]
[Table 4]

[0045]
(Example 2) Construction of recombinant vector and production of transformed rice
(1) Construction of recombinant vector
The DNA fragment obtained in Example 1 was subcloned into the pCR-XL-TOPO vector included in the kit using the TOPO-XL cloning kit (Invitrogen). Whether the subcloned DNA sequence was correct was confirmed with a DNA sequencer (ABIprism310 manufactured by PerkinElmer). The insert fragment was excised from this subcloned plasmid with BamHI. A vector in which the GluB-1 promoter (gluterin promoter) inserted by Takaiwa et al. Of the National Institute of Agrobiological Sciences was inserted into pUC18 was cleaved with BamHI, and the above insert fragment was ligated. A clone inserted in the forward direction 3 ′ downstream of the GluB-1 promoter was selected, and this clone was cut with HindIII to cut out an avidin artificially synthesized gene (including an amylase signal sequence) linked to the GluB-1 promoter.
[0046]
The binary vector used was pBIG-H modified from a vector created by Kawasaki et al. This vector has a kanamycin resistance gene (NPT II), a hygromycin resistance gene (HPT), a β-glucuronidase gene, and a SAR sequence between two border sequences. This vector was treated with HindIII, and the avidin artificially synthesized gene linked to the GluB-1 promoter was inserted. Fig. 2 shows the structure of an avidin artificially synthesized gene-containing binary vector (referred to as Avi-pBIG-H) (in Fig. 2, GluB-1-pro: GluB-1 promoter, amyl-avidin: avidin artificially synthesized gene) Gene with amylase signal sequence added, HindIII: HindIII restriction enzyme site, RB: Light border, Nos-pro: Nopaline synthase promoter, NPTII: Kanamycin resistance gene, Nos-ter: Nopaline synthase terminator, SAR: Scaffold Attachment region, 35S: cauliflower mosaic virus 35S promoter, intron-GUS: β-glucuronidase gene containing intron, HPT: hygromycin resistance gene, LB: left border). This vector has a Nos terminator sequence 3 ′ downstream of the HindIII insertion site, and functions as a terminator for the introduced gene when the gene is introduced in the forward direction. The SAR sequence is also called a MAR sequence, and is reported to increase the transcription efficiency of a gene in the vicinity of the SAR sequence with a DNA sequence having affinity with the nuclear matrix (Transgenic Research 1993; 2 (2): 93-100).
[0047]
(2) Introduction of binary vector for expression into rice
The Avi-pBIG-H vector prepared in (1) was introduced into Agrobacterium. Gene introduction was performed by charging with 1.45 keV using an electroporation apparatus (ECM395 manufactured by Genetronics). The transformed Agrobacterium was stored at −80 ° C. using LB medium containing 50% glycerol. Similarly, pBIG-H (control) was similarly introduced into Agrobacterium. Rice (Nipponbare) was transformed with Avi-pBIG-H and pBIG-H-introduced Agrobacterium, respectively.
[0048]
(3) Confirmation of avidin gene expression
The expression of avidin protein in the transformed rice was detected by Western blotting. The method was in accordance with the method described in Protein Experiment Note, pages 24-32, Masato Okada and Kaori Miyazaki, Yochisha, published October 15, 1996. Soluble protein was extracted from the seeds of transformed rice and control rice (transformed with pBIG-H for control) and subjected to SDS-PAGE by 30 μg. After electrophoresis, the protein in the gel was transferred to a transfer membrane (Immobilon-Psq, manufactured by Millipore) using a flat plate transfer device semi-dry type (manufactured by Nippon Aido). Rabbit anti-egg white avidin polyclonal antibody (Biogenesis) was used as the primary antibody for detection, and alkaline phosphatase-labeled goat anti-IgG antibody (Bio-Rad) was used as the secondary antibody. AP color development kit (manufactured by Bio-Rad) was used for detection. FIG. 3 shows the results of analyzing the soluble protein extracted from the seeds of transformed rice and control rice by Western blotting (in FIG. 3, lane 1: extract of control rice seed (protein amount 30 μg), lane). 2: Extract of transformed rice seed (protein amount 30 μg), lane 3: standard avidin (100 ng). A strong signal was observed in the soluble protein lane of transformed rice seeds, confirming the expression of avidin protein. The molecular weight estimated from the detected signal was slightly smaller than that of the standard avidin. On the other hand, no signal was detected in the soluble protein of the control rice.
[0049]
(Example 3) Measurement of the amount of avidin contained in transformed rice rice
The amount of avidin contained in the transformed rice rice was measured by ELISA. The experimental method was in accordance with the method described in “Proceeding with Protein Experiments”, pages 94 to 96, edited by Masato Okada and Kaori Miyazaki, Yodosha, published October 1, 1998. To one grain of brown rice of transformed rice obtained in Example 2, 0.1 mol phosphate buffer (pH 7.0) was added and homogenized, and the supernatant soluble liquid obtained by centrifugation at 10000 × g for 10 minutes was used for the test. Provided. 50 μl of this soluble solution was dispensed into an ELISA test microplate (IWAKI3801-096). After leaving at room temperature for 2 hours and removing the sample, PBS (NaCl 8g, Na ₂ HPO _Four ・ 12H ₂ O 2.9g, KCl 0.2g, KH ₂ PO _Four 100 g of each well was dispensed and washed 3 times. A blocking solution (10 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 2.5% bovine serum albumin and 5% sucrose) was dispensed in an amount of 100 μl each and allowed to stand at room temperature for 2 hours. The blocking solution was removed, 60 μl of the primary antibody diluted in 1/1000 with the blocking solution (used in Example 2) was dispensed and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. To remove unbound primary antibody, it was washed 5 times with 100 μl PBS. Subsequently, 60 μl of a secondary antibody (used in Example 2) diluted 1/1000 with a blocking solution was dispensed and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. To remove unbound secondary antibody, it was washed 5 times with 100 μl PBS. The PBS was discarded, 100 μl of a coloring reaction solution (BioRad 172-1063) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. Absorbance at 410 nm was measured with a microplate reader (Tosoh MPR-A4). Of the 19 transformed rice lines produced in Example 2, 8 grains were analyzed for 3 lines that showed a strong signal by Western blot analysis, and each contained 54, 114, and 76 ppm of avidin on average. It was. In white rice, the protein content is reduced to about 90% (5th edition Japanese Food Composition Table, Science and Technology Agency Resource Research Committee (2000)), so the estimated avidin content in white rice is 49, 103 and 68 ppm, respectively.
[0050]
Example 4 Pest Growth Inhibition Test Using Transformed Rice Rice
Brown rice of transformed rice (test group) and control rice (control group) obtained in Example 2 was prepared. These brown rices were separately pulverized using a miller (manufactured by Iwatani Co., Ltd.), and 50 mg each was placed in a 1.5 ml microtube, and 20 samples were prepared for each of the test group and the control group. The microtube lid was opened with three holes for breathing. One single hatched larvae of the larvae was released into this tube one by one, and a breeding test was conducted at 30 ° C. The results are shown in Table 5. When transformed rice rice was used as a feed, there were 2 surviving individuals 2 weeks after the test, and there were no individuals that eventually became adults. On the other hand, in the control group, 18 individuals survived 2 weeks after the start of the test, and finally 16 became adults. Therefore, it was found that brown rice of transformed rice containing avidin strongly suppresses the growth of pests.
[0051]
[Table 5]

[0052]
(Example 5) Comparison of promoter expression efficiency
Regarding the induction efficiency as a promoter in rice seeds, a comparison was made between the GluB-1 promoter and the 35S promoter, which is widely used for gene introduction in plants. Constructs in which cystatin genes derived from pearl barley (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 2002; 66 (10): 2287-2291) were respectively produced downstream of the 35S promoter and the GluB-1 promoter were prepared and introduced into binary vectors. Using these vectors, transformed rice was prepared by the Agrobacterium method as described in Example 2. Soluble proteins (4 grains) obtained from each transformant rice were separated by 30 μg of soluble protein, analyzed by Western blotting, and the expression levels were compared. The results are shown in FIG. 4 (in FIG. 4, lane 1: 35S promoter transformant, lane 2: GluB-1 promoter transformant, lane 3: promoter and cystatin gene-free transformant, arrow: introduced. Cystatin signal is shown). As a result, a signal stronger than the 35S promoter was detected when the GluB-1 promoter was used. When the signal was quantified using NIH image software, the signal intensity was about 4 times higher when using the GluB-1 promoter, and the use of the GluB-1 promoter was more transcribed in the seed than the 35S promoter that has been widely used in the past. The efficiency is considered high. Therefore, it is considered that the GluB-1 promoter is more effective than the 35S promoter for the expression of avidin in seeds.
[0053]
(Example 6) Transformation rice using ubiquitin promoter
When transformed rice was produced using the rice ubiquitin promoter (PLANT SCIENCE 2000 Jul 28; 156 (2): 201-211) instead of the GluB-1 promoter in Example 2, one line of plant body was obtained. It was. Western blot analysis confirmed that avidin was expressed in the leaves of this plant, but did not produce fruit. Therefore, the ubiquitin promoter is useful when avidin is expressed in leaf stems and the like, but the GluB-1 promoter is considered more suitable for expression in seeds.
[0054]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided an artificial synthetic gene obtained by modifying a gene encoding an avidin protein having an insecticidal activity so as to have high expression efficiency in rice by selecting a codon frequently used in rice. . Transformed rice introduced with this artificially synthesized gene has excellent pest resistance.
[0055]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a schematic diagram of a DNA oligomer used to produce an artificially synthesized avidin gene.
FIG. 2 shows the structure of an avidin artificially synthesized gene-containing binary vector (Avi-pBIG-H).
FIG. 3 shows the results of analysis of soluble proteins extracted from the seeds of transformed rice and control rice by Western blotting.
FIG. 4 shows the results of analyzing the protein expression level induced by the GluB-1 promoter and 35S promoter by Western blotting.

Claims (3)

グルテリンプロモーターの下流に、配列表の配列番号３に示す塩基配列を有する人工合成遺伝子及びターミネーターを導入したことを特徴とする組換えベクター。A recombinant vector , wherein an artificially synthesized gene having a base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and a terminator are introduced downstream of the glutelin promoter. 請求項１に記載の組換えベクターを導入した形質転換イネ。A transformed rice introduced with the recombinant vector according to claim 1 . 請求項１に記載の組換えベクターを導入した形質転換イネの種子。A seed of transformed rice into which the recombinant vector according to claim 1 has been introduced.

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