JP4223548B2 - 補足または非補足組織シーラント、それらの製法および使用 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、フィブリングルー（接着剤）（fibrin glue）（ＦＧ）のごとき非補足（unsupplemented）または補足（supplemented）組織シーラント（tissue sealant）（ＴＳ）、ならびにそれらの製法および使用に指向される。１つの態様において、本発明は、全厚さに渡る（full-thickness）皮膚の創傷治癒を阻害しないＴＳに指向される。もう１つの態様において、本発明は、成長因子（類）および／または薬物（類）を補足したＴＳ、ならびにそれらの製法および使用に指向される。選択された特別の成長因子（類）または薬物（類）はその使用の関数である。
発明の背景
Ａ．創傷治癒および成長因子
創傷治癒、病巣の修復は、損傷後ほとんど直ちに開始する。それは、種々の細胞の連続的共働的機能ならびに分解的および再生的過程の綿密な調節を要する。細胞の増殖、分化および移動は、創傷治癒を基礎付け、また、フィブリン血餅形成、血餅の吸収、線維増多のごとき組織の再構築、内皮形成および上皮形成を含む重要な生物学的過程である。創傷治癒は、多数の毛細血管を含有する高度血管化組織、多くの活性な線維芽細胞、および豊富なコラーゲンフィブリルの形成を含むが、特殊化された皮膚構造の形成を含まない。
創傷治癒の過程は、負傷細胞から流出するトロンボプラスチンによって開始され得る。トロナボプラスチンは血漿第ＶＩＩ因子と接触して第Ｘ因子アクチベーターが形成され、次いで、これは第Ｖ因子と一緒に、リン脂質およびカルシウムとの複合体において、プロトロンビンをトロンビンに変換する。トロンビンはフィブリノーゲンからのフィブリノペプチドＡおよびＢの放出を触媒してフィブリンモノマーを生じ、これは凝集してフィブリンフィラメントを形成する。また、トロンビンはトランスグルタミナーゼ、第ＸＩＩＩａ因子を活性化し、これは、フィブリンフィラメントを共有結合的に架橋させるイソペプチド結合の形成を触媒する。次いで、アルファ２−抗プラスミンが第ＸＩＩＩ因子によってフィブリンフィラメントへ結合され、それにより、フィラメントがプラスミンによる分解から保護する（例えば、Doolittleら，Ann. Rev. Biochem. 53:195-229（1984）参照）。
組織が負傷すると、一連の生物学的活性を呈するポリペプチド成長因子が創傷に放出され、それは治癒で非常に重要な役割を演じる（例えば、Hormanal Proteins and Peptides（Li, C.H.編），第７巻，Academic Press, Inc., New York, N.Y.231-177頁（1979）およびBruntら，Biotechnology 6:25-30（1988）参照）。これらの活性は、白血球および線維芽細胞のごとき細胞を損傷領域に補給し、細胞の増殖および分化を誘導する。創傷治癒に参画する成長因子は、限定されるものではないが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；インスリン結合性成長因子−１（ＩＧＦ−１）；インスリン結合性成長因子−２（ＩＧＦ−２）；表皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換（transforming）成長因子−α（ＴＧＦ−α）：形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）；血小板第４因子（ＰＦ−４）；およびヘパリン結合成長因子１および２（各々、ＨＢＧＦ−１およびＨＢＧＦ−２）を含む。
ＰＤＧＦ類は循環血小板のアルファ顆粒に貯蔵され、血液凝固の間に創傷部位で放出される（例えば、Lynchら，J. Clin. Invest. 84:640-646（1989）参照）。ＰＤＧＦ類はＰＤＧＦ；血小板由来血管形成因子（ＰＤＡＦ）；ＴＧＦ−β；および好中球に対する化学誘因物質であるＰＦ−４を含む（Knightonら，Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing；Biological and Clinical Implications, Alan R. Liss, Inc., New York, New York, 319-329頁（1988））。ＰＤＧＦは、***促進因子、化学誘因物質、および線維芽細胞および平滑筋細胞を含めた間葉起源の細胞における蛋白質合成め刺激物質である。また、ＰＤＧＦは内皮細胞に対する非***促進化学誘因物質である（例えば、Adelmann-Grillら，Eur. J. Cell Biol. 51:322-326（1990））。
ＩＧＦ−１はＰＤＧＦとの組合せで作用して、培養中の間葉細胞における有糸***誘発および蛋白質合成を促進する。ＰＤＧＦまたはＩＧＦ−１単独の皮膚創傷への適用は治癒を促進せず、両因子を一緒に適用すると、結合組織および上皮組織増殖を促進するようである（Lynchら，Proc. Natl. Acad. Sci. 76:1279-1283（1987））。
ＴＧＦ−βはマクロファージおよび単球に対する化学誘因物質である。他の成長因子の存在または不存在に応じて、ＴＧＦ−βは多くの細胞型の成長を刺激または阻害し得る。例えば、イン・ビボで適用すると、ＴＧＦ−βは治癒しつつある皮膚創傷の引張強度を増加させる。また、ＴＧＦ−βは内皮細胞有糸***を阻害し、線維芽細胞によるコラーゲンおよびグリコサミノグリカン合成を刺激する。。
ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＨＢＧＦ類およびオステオゲニンのごとき他の成長因子も創傷治癒で重要である。胃分泌物および唾液に見い出されたＥＧＦ、および正常および形質転換細胞双方によって作られるＴＧＦ−αは構造的に関連し、同一のレセプターを認識し得る。これらのレセプターは上皮細胞の増殖を媒介する。両因子は皮膚創傷の再上皮形成を加速する。外因性ＥＧＦは、ケラチノサイトおよび皮膚線維芽細胞の増殖を刺激することによって創傷治癒を促進する（Nanneyら，J. Invest. Dermatol. 83:385-393（1984）およびCoffeyら，Nature 328:817-820（1987））。ＥＧＦの局所適用は、ヒトにおける部分的厚みの創傷の治癒速度を加速する（Schultzら，Science 235:350-352（1987））。無機質脱落骨から精製されたオステオゲニンは骨成長を促進するようである（例えば、Luytenら，J. Biol. Chem. 264:13377（1989）。加えて、局所適用のための軟膏の形態である血小板由来創傷治癒処方、血小板抽出物が記載されている（例えば、Knightonら，Ann. Surg. 204:322-330（1986））。
酸性ＨＢＧＦ（ＨＢＦＧ−１またはＦＧＦ−１としても知られているａＨＢＧＦ）および塩基性ＨＢＧＦ（ＨＢＧＦ−２またはＦＧＦ−２としても知られているｂＨＢＧＦ）を含めた、線維芽細胞成長因子としても知られているヘパリン結合性成長因子（ＨＢＧＦ）は、内皮細胞を含めた中胚葉および神経外胚葉系の細胞に対する効力のある***促進因子である（Burgessら，Ann. Rev. Biochem. 58:575-606（1989））。加えて、ＨＢＧＦ−１は内皮細胞および大膠細胞を走化させる。ＨＢＧＦ−１およびＨＢＧＦ−２はヘパリンに結合し、ヘパリンはそれらを蛋白分解から保護する。ＨＢＧＦによって呈される一連の生物学的活性は、それらが創傷治癒で重要な役割を演じることを示唆する。
塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）は、血管形成ならびに線維芽細胞の移動および増殖の優れた刺激物質である（例えば、Gospodaroviczら，Mol. Cell. Endocinol. 46:187-204（1986）およびGospodaroviczら，Endo. Rev. 8:95-114（1985））。酸性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−１）は内皮細胞に対する優れた血管形成因子であることが示されている（Burgessら，前掲，1989）。しかしながら、ＦＧＦ成長因子が成長因子を走化させるか否かは確立されていない。
従って、成長因子は、創傷治癒および組織修復を特異的に促進するのにかなり有用である。しかしながら、創傷治癒を促進するそれらの使用は矛盾する結果を生じている（例えば、Carterら，Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing: Biological and Clinical Implications, Alan R. Liss, Inc., New York, New York, 303-317頁（1988））。例えば、ブタにおいて標準化された皮膚創傷に別々に適用されたＰＤＧＦ、ＩＧＦ−１、ＥＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＦＧＦ（ＨＢＧＦとしても知られている）は、創傷における結合組織または上皮細胞の再生に対してほとんど効果を有しなかった（Lynchら，J. Clin. Invest. 84:640-646（1989））。テストした因子のうち、ＴＧＦ−βは単独で最大の応答を刺激した。しかしながら、ＰＤＧＦ−ｂｂホモダイマーおよびＩＧＦ−１またはＴＧＦ−αのごとき因子の組合せは、結合組織の再生および上皮形成の劇的増加を生じた（同上）。ツボイらは、開いた創傷へのｂＦＧＦの毎日の適用は治癒しつつある障害において創傷治癒を刺激したが正常マウスでは刺激しなかったことを報告している（J. Exp. Med. 172:245-251（1990））。他方、恐らくは成長因子を含有した、ブタおよびウシ血小板溶解物の粗調製物のヒト皮膚創傷への適用は、創傷が閉じる速度、治癒領域における細胞数、血管の成長、コラーゲン沈積および傷組織の強度を増大させた（Carterら，前掲）。
かかる矛盾する結果の理由は知られていないが、通常の一連の生物学的活性を呈することができるように成長因子を哺乳動物における創傷に適用する困難性の結果であろう。例えば、いくつかの成長因子レセプターは、最大生物学的効果を生じるには少なくとも１２時間占有されていなければならないようである（Prestaら，Cell Regul. 2:719-726（1991）およびRusnatiら，J. Cell Physiol.154:152-161（1993））。かかる矛盾する結果のため、創傷治癒を刺激するにおいて、外因的に適用された成長因子によって演じられる役割は明瞭でない。さらに、成長因子を創傷に適用して創傷および成長因子（類）の間の接触の延長を生じる手段は現在知られていない。
Ｂ．ＴＳ類
血漿蛋白質を含有する外科接着剤およびＴＳは骨および皮膚におけるごとき外部および内部創傷をシールして、血液損失を減少させ、ホメオスタシスを維持するために使用される。かかるＴＳ類は血液凝固因子および他の血液蛋白質を含有する。フィブリンシーラントとも呼ばれるＦＧは、血漿から調製される天然血餅と同様のゲルである。各ＦＧの正確な成分は、出発物質として使用される個々の血漿画分の関数である。血漿成分の分画は、エタノール、ポリエチレングリコールおよび硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーのごとき標準的な蛋白質精製方法によって行うことができる。典型的には、ＦＧは、痕跡量のアルブミン、フィブロネクチンおよびプラスミノーゲンを含めた蛋白質の混合物を含有する。カナダ国、欧州および恐らくは他の地域において、商業的に入手可能なＦＧは、典型的には、安定化剤としてのアプロチニンも含有する。
ＦＧ類は、一般に、（１）フィブロネクチン、第ＸＩＩＩ因子およびフォンビルブランド因子を含有するフィブリノーゲン濃縮物；（２）乾燥したヒトおよびウシトロンビン；および（３）カルシウムイオンから調製される。商業的に入手可能なＦＧは、一般に、ウシ成分を含有する。フィブリノーゲン濃縮物は、低温沈殿、続いての分画によって血漿から調製して、トロンビンおよびカルシウムイオンのごときトロンビンのアクチベーターと混合するとシーラントまたは血餅を形成する組成物を得ることができる。フィブリノーゲンおよびトロンビン濃縮物は凍結乾燥形態で調製され、使用直前に塩化カルシウムの溶液と混合される。混合して、該成分は組織に適用され、そこで、該成分は該組織表面に凝固し、架橋されたフィブリンを含む血餅を形成する。フィブリノーゲン濃縮物に存在する第ＸＩＩＩ因子は架橋を触媒する。
オーストラリア特許第６５０９７／８７号は、フィブリノーゲン、第ＸＩＩＩ因子、抗トロンビンＩＩＩのごときトロンビン阻害剤、プロトロンビン因子、カルシウムイオン、および要すればプラスミン阻害剤の水性溶液を含有する一成分接着剤を記載している。ストレートマン（Stroetmann）の米国特許第４，４２７，６５０号および第４，４２７，６５１号は、フィブリノーゲン、トロンビンおよび／またはプロトロンビン、ならびにフィブリン溶解阻害剤を含有し、また血小板抽出物のごとき他の成分をも含有し得る創傷の閉鎖および治癒の増強のための粉末または噴霧可能な調製物の形態である富血漿誘導体の調製を記載している。ローズ（Rose）の米国特許第４，６２７，８７９号および第４，９２８，６０３号は、フィブリノーゲンおよび第ＸＩＩＩ因子を含有する低温沈殿させた懸濁液を調製する方法、およびＦＧを調製するためのそれらの使用を開示している。ＪＰ １−９９５６５は、創傷治癒のためのフィブリン接着剤を調製するためのキットを開示している。アルターバウム（Alterbaum）（米国特許第４，７１４，４５７号）およびモース（Morse）ら（米国特許第５，０３０，２１５号）はオートロガスＦＧを生産するための方法を開示している。加えて、改良されたＦＧ送達系がほかのところで開示されている（Millerらの米国特許第４，９３２，９４２号およびMorseらのＰＣＴ出願ＷＯ９１／０９６４１）。
イムノ社（ＩＭＭＵＮＯ ＡＧ）（ウイーン，オーストリア）およびベーリングウェルケ社（ＢＥＨＲＩＮＧＷＥＲＫＥ ＡＧ）（ドイツ国）（Gibbleら，Trasnfusion 30:741-747（1990））は、現在、欧州および他の地域の市場でＦＧ類を有している（例えば、イムノ社によって所有されている米国特許第４，３７７，５７２号および第４，２９８，５９８号参照）。ＴＳ類は米国では商業的に入手できない。しかしながら、米国国立赤十字（American National Red Cross）およびバクスター／ハイランド（ＢＡＸＴＥＲ／ＨＹＬＡＮＤ）（ロスアンゼルス、カリフォルニア州）は、最近、今や臨床実験に付されているＦＧ（ＡＲＣ／ＢＨ ＦＧ）を共同開発した。
米国外で臨床的に使用されているＴＳ類は、ある臨床的リスクの問題が持ち上がり、米国での使用ではアメリカ食品医薬品庁によって認可されていない。例えば、欧州で入手可能なＴＳ類は、アプロチニンおよびウシトロンビンのごとき非ヒト起源の蛋白質を含有する。これらの蛋白質は非ヒト起源であるので、人々はそれらに対するアレルギー反応を発症するかも知れない。欧州では、Ｆｇの成分に存在し得るウイルスを不活化するために加熱不活化が使用されている。しかしながら、この加熱不活化方法は、やはりアレルギー性であり得るＦＧ中の変性蛋白質を生じかねない。加えて、この不活化方法は、そこでのウシ蛋白質の使用のためＴＳな存在し得る、ウシ海綿状脳障害、「狂牛病（mad cow disease）」を引き起こすプリオンを不活化しないであろうという懸念がある。この病気はヒツジからすでに運ばれているようであり、そこではそれは雌牛に対して「スクラピー」と呼ばれ、それがヒトを感染し得るということは、些細な関心事ではない。
ＡＲＣ／ＢＨ ＦＧはウシ蛋白質を含有しないので、欧州で利用できるＴＳ類以上の利点を有する。例えば、ＡＲＣ／ＢＨ ＴＳはウシトロンビンの代わりにヒトトロンビンを含有し、アプロチニンを含有しない。ＡＲＣ／ＢＨ ＦＧはウシ蛋白質を含有しないので、欧州で入手可能なＴＳ類よりもヒトにおいてアレルギー性が低いはずである。加えて、ＡＲＣ／ＢＨ ＦＧはより少ない変性蛋白質を生じる溶媒界面活性剤方法によってウイルス不活化されており、かくして、欧州で入手できるものよりもアレルギー性が低い。従って、ＡＲＣ／ＢＨ ＦＧは今日他の国で商業的に入手可能であるＴＳ類以上の利点を有する。
ＦＧは、主として、には臨床局所適用のために処方され、出血を制御し、ホメオスタシスを維持し、創傷治癒を促進するのに使用される。ＦＧの臨床使用は最近総括されている（Gibbleら，Transfusion 30:741-747（1990）；Lernerら，J. Surg. Res. 48:165-181（1990））。シーリングによって組織ＦＧは空気または流体漏出を防ぎ、ホメオスタシスを誘導し、出血、血腫、感染等のごとき創傷治癒に干渉し得る事象を減少または防止することによって創傷治癒に間接的に寄与し得る。ＦＧはホメオスタシスを維持し、血液喪失を減少させるものの、真実の創傷治癒特性を有することは未だ示されていない。ＦＧは骨および皮膚損傷のごとき内部および外部損傷双方に適し、ホメオスタシスを維持するのに適するので、その創傷治癒特性を増強するのが望ましい。
ほぼ３９ｇ／ｌのフィブリノーゲン濃度および２００−６００Ｕ／ｍｌのトロンビン濃度を持つＦＧは有意に増加した張力、エネルギー吸収および弾性値を持つ血餅を生じている（Byrneら，Br. J. Surg. 78:841-843（1991））。フィブリン血餅（５ｍｇ／ｍｌ）を充填し、皮下移植された穿孔テフロンシリンダーは、空のシリンダーと比較して、コラーゲンの増大した沈殿を含めた、顆粒化組織の形成を刺激した（Hedelinら，Eur. Surg. Res. 15:312（1983））。
Ｃ．骨創傷およびその修復
骨誘導の順序はまず無機質脱落骨皮質マトリックスを用いイリスト（Irist）によって記載された（Clin. Orthop. Rel. Res. 71:271（1970）およびProc. Natl. Acad. Sci. USA 70:3511（1973））。局所***促進因子として使用して間葉細胞の増殖を刺激する無機質脱落骨皮質マトリックスが同種異系受容者に皮下移植された（Rathら，Nature（Lond.）278:855（1979））。新しい骨形成は移植後１２日および１８日の間に起こる。骨髄造血系が豊富な小骨発生が２１日までに起こった（Reddt, A., Extracellular Matrix Biochemistry（Plezら編）Elsevler, New York, N.Y., 575-412頁（1984））。
無機質脱落骨マトリックス（ＤＢＭ）は骨形態発生蛋白質（ＢＭＰ）として知られている骨誘導性蛋白質および先祖骨細胞の増殖を変調する成長因子の源である（例えば、Hauschkaら，J. Biol. Chem. 261:12665-12674（1986）およびCanalisら，J. Clin, Invest.81:277-281（1988）参照）。８つのＢＭＰが現在同定され、ＢＭＰ−１ないしＢＭＰ−８と略されている。ＢＭＰ−３およびＢＭＰ−７は、各々、オステオゲニンおよび骨原性蛋白質−１（ＯＰ−１）としても知られている。
不運なことに、ＤＢＭ物質は、粒状骨髄自己移植と組み合わせるのでなければ臨床的用途をほとんど有しない。外科的に受容者の骨に組み入れて治療効果を生じることができるＤＢＭ量には限界がある。加えて、吸収は少なくとも４９％であると報告されている（Toriumiら，Arch. Otolatyngo. Head Neck Surg. 116:676-680（1990））。
ＤＢＭ粉末およびオステオゲニンは、それらの骨誘導性可能性が発現される前に組織流体によって洗浄除去される可能性がある。加えて、組織流体のＤＢＭ充填骨腔への浸潤および軟組織の創傷床への崩壊は、ＤＢＭおよびオステオゲニンの骨誘導性特性に有意に影響し得る２つの因子である。軟組織の創傷床への崩壊は、同様に、骨成分幹細胞の創傷床への適切な移動を阻害する。
粉末形態のヒトＤＢＭは、口腔手術の問に生じた顎骨腔を充填するために米国歯科医によって現在使用されている。しかしながら、粉末形態のＤＢＭは使用するのが困難である。
精製されたＢＭＰは、ＦＧ（Hattori, T.,日本整形外科学会雑誌64:874-834（1990）；Kawamuraら、Clin. Orthop. Rel.Res. 235:302-310（1988）；Schlagら，Clin. Orthop. Rel. Res. 227:269-285（1988）およびSchwarzら，Clin. Orthop. Rel. Res. 238:282-287（1987））および全血血餅（Wangら，J. Cell. biochem. 15F:Q20 Abstract（1990））を含めた種々の手段によって送達した場合、動物で骨誘導効果を有する。しかしながら、シュワルツ（Schwarz）ら（前掲）は、異所性骨誘導またはＢＭＰ−依存性骨再生に対するＦＧの明瞭な正または負の効果をいずれも証明していない。従って、これらの結果は矛盾し混乱している。
ＴＳはその細胞を用いて創傷領域に移動させて新しい組織を生じることができる「足場物質」としても働き得る。しかしながら、商業的に入手可能なＦＧおよび他のＴＳ類は、それらへのおよびそれらを通じての細胞移動を可能とするにはあまりにも濃過ぎる。これはいくつかのイン・ビボ使用におけるそれらの有効性を限定する。
骨偽関節欠陥と呼ばれる骨創傷の１のタイプにおいて、新しい骨形成が自然には起こらない最小ギャップがある。臨床的には、これらの状況のための治療は骨移植である。しかしながら、骨移植の源は通常限定され、同種異系骨の使用はウイルス汚染の高度の危険を伴う。この状況のため、無機質が脱落しウイルス不活化された骨粉末は魅力的な解決である。
Ｄ．血管補綴
人工的血管補綴は頻繁にポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）から作成され、ヒトおよび他の動物において所望の血管を置き換えるのに使用されている。開通率を最大化し、血管補綴のトロンボゲン形成性を最小化するために、非オートロガス内皮細胞の補綴への着床を含めた種々の技術が使用されている。血管移植片および内皮細胞双方に接着する種々の基材が、内皮細胞着床を増加させるための中間的基材として調べられている。これらの基材は予備凝集した（preclotted）血液（Herringら，Surgery 84:498-504（1978），ＦＧ（Rosenmanら，J. Vasc. Surg. 2:778-784（1985）；Schrenkら，Thorac. Cardiovasc. Surg. 33:6-10（1986）；Kovekerら，Thorac. Cardiovasc. Surgeon 34:49-51（1986）およびZillaら，Surgery 105:515-522（1989））、フィブロネクチン（例えば、Keslerら，J. Vasc. Surg. 3:58-64（1986）；Macarakら，J. Cell Physiol. 116:76-86（1983）およびＲａｍａｌｎｊｅｏｎａら，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．３：２６４−２７２（１９８６））、またはコラーゲン（Williamsら，J. Surg. res. 38:618-629（1985））を含む。しかしながら、これらの技術に伴う１つの一般的問題は、非オートロガス細胞を着床のために使用し、かくして、組織拒絶の可能性を生起するということである。加えて、密集した内皮細胞は通常確立されず、確立されるとすれば数カ月を要する。この遅延の結果、血管補綴の高閉塞率がある（例えば、Zillaら，前掲参照）。
Ｅ．血管形成
血管形成は新しい血管の誘導である。ＨＢＧＦ−１およびＨＢＧＦ−２のごとき増殖因子は血管形成性である。しかしながら、それらのコラーゲン海綿（Thompsonら，Science 241:1349-1352（1988））；ビーズ（Hayekら，Biochem. Biophys. Res. Commun. 147:876-880(1987））；海綿様構造中に配置されたコラーゲンで被覆された固体ＰＴＦＥ繊維（Thompsonら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:7928-7932（1989））に付着させた；あるいは注入による（Puumalaら，Brain Res. 534:283-286（1990））イン・ビボ投与の結果、ランダムな非組織化血管が生じる。これらの成長因子はイン・ビボで所与の部位において新しい血管の成長を指示するために首尾よく使用されたことがない。加えて、プレキシガラスチャンバーに入れて皮下移植させたフィブリンゲル（０．５−１０ｍｇ／ｍｌ）は、空のチャンバーまたは滅菌培地を充填したチャンバーと比較して、移植４日以内に血管形成を誘導する（Dvorakら，Lab. Invest. 57:673（1987））。
Ｆ．部位特異的局所化薬物送達
医学のいくつかの領域では効果的な部位特異的薬物送達系が大いに必要とされる。例えば、局所化薬物送達は、抗微生物剤の全身投与が効果的でない歯周炎のごとき局所感染の治療で必要である。全身投与後の問題は、通常、標的部位で達成できる抗微生物剤の低濃度に存する。局所濃度を上昇させるためには、全身投与量の増加は効果的であり得るが、毒性、微生物耐性および薬物不適合成をも生じかねない。これらの問題のいくつかを迂回するために、いくつかの別法が考案されるいるがいずれも理想的ではない。例えば、無定形の流動性塊としての水性媒質に分散されたコラーゲンおよび／またはフィブリノーゲン、および安定な定置が可能な蛋白質性マトリックス組成物も薬物を局所的に送達することが示されている（Luckらの米国再発行特許第３３，３７５号；Luckらの米国特許第４，９７８，３２２号）。
種々の抗体（ＡＢ）がＦＧから放出されるが、比較的低濃度で、かつ数時間ないし数日の範囲の短時間であることが報告されている（Kramら，J. Surg. Res. 50:175-178（1991））。ＡＢのほとんどは自由に水に溶解する形態であって、それが調製される間にＴＳに添加されている。しかしながら、テトラサイクリン塩酸塩（ＴＥＴ ＨＣｌ）およびＡＢ類の他の自由に水に溶解する形態のＦＧへの取り込みは、ＡＢ補足ＦＧの形成の間のフィブリン重合に干渉している（Schlagら，Biomaterials 4:29-32（1983））。この干渉は、ＡＢ−ＦＧ混合物で達成できるＴＥＴ ＨＣｌの量および濃度を限定し、ＡＢ濃度依存性のようであった。ＦＧからＡＢへの比較的短い放出時間はＡＢ補足ＴＳの比較的短い寿命またはＡＢ−ＴＳにおけるＡＢの形態および／または量を反映し得る。
Ｇ．ＴＳ類からの制御された薬物放出
いくつかの臨床的適用では、制御され局所化された薬物放出が望ましい。前記したごとく、いくつかの薬物、特にＡＢ類は、ＦＧのごときＴＳ類に一体化されそれから放出されている。しかしながら、明らかに、少なくとも部分的には薬物補足ＦＧの比較的短い寿命の反映である薬物放出の持続に対する制御はほとんどまたは全くない。従って、ＴＳからの他の補足物の延長された一体化および延長された放出に対する新しい技術である、延長された薬物放出を可能とするＦＧおよび他のＴＳ類を安定化する手段が望ましくかつ必要とされる。
Ｈ．開示されたＴＳ調製物は外傷創傷に対する救命非常事態治療を提供する。
外傷医療における継続的進歩に拘わらず、軍人および市民双方の集団の有意なパーセントが、毎年、致死的または重症の出血にかかる。驚くほどの数の事故死は防止可能である。というのは、生命救助を達成できるものの存在の発生は、適当なツールおよび訓練があれば、それらの創傷を制御するからである。本明細書で開示するＴＳの利用可能性は、進歩した使用が容易で実践的止血調製物に対する長年の要求を満足し、訓練された医療人のみならず訓練されていない個人が迅速に外傷犠牲者で出血を減じることができるようにする。開示されたＴＳの利用性の結果、２重の利点；外傷死亡の減少、および入手可能な血液供給に対する要求の減少が生じる。
開示された技術は、災害状況における犠牲者集団の治療にも利用できる。ひどい天然または人為災害が起こると、地方の病院および診療所は外傷医療を必要とする多数の個人で一杯となる。かかる災害の孤立する結果と併せると、血液および血液製品に対するその結果の要求はしばしば地方で入手できる供給を超過する。多くの場合、地方の医療人に対する要求も訓練された個人の利用可能な数を超過する。その結果、ひどくない負傷者が顧みられず、あるいは最適には至らない医療しか与えられない。以下に開示する使用が容易で自己含有されたＴＳ調製物の利用性は、地方の医療人および災害救助者が負傷者に完全な医療が利用できるまで一時的な治療を供するのを可能とする。さらに、開示されたＴＳ調製物は、医療救援が供されるまで、災害犠牲者の自己治療を可能とする。
しばしば、血液喪失による死亡を防ぐためにかかる状況下で適用できる医療的処置の唯一の形態は圧迫包帯、止血帯および圧点である。しかしながら、不運なことに、これらの各処置は連続的監視および注意が必要である。かかる注意は緊急または災害状況では通常可能ではないので、過剰の血液喪失を首尾よく制御できる簡便で即効性の応急処置に対して当該分野で明確な要求がある。
軍人への開示したＴＳ調製物の適用は、特に孤立した戦場状況においては容易に明らかとなる。戦場における死亡の単一最大の原因は放血であり、これは現在まですべての戦闘犠牲者の５０％までを占めていた。
発明の概要
１の態様において、本発明は、ＴＳを包含し、該シーラントは全厚さに渡る皮膚創傷治癒を阻害しない組成物を提供する。
もう１つの態様において、本発明はＴＳを包含し、該シーラントの全蛋白質濃度は３０ｍｇ／ｍｌ未満である組成物を提供する。
もう１つの態様において、補足ＴＳを包含し、全蛋白質濃度は３０ｍｇ／ｍｌ未満であって、該補足物は成長因子（類）および／または薬物（類）である組成物を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、補足ＴＳを包含し、全蛋白質濃度は３０ｍｇ／ｍｌ未満であって、該補足物は成長因子（類）および／または薬物（類）である組成物を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、ＴＳ、および有効濃度の少なくとも１種の成長因子を包含し、該成長因子の濃度は動物細胞の指向された移動を促進するのに効果的である、動物細胞の指向された移動（migration）を促進する組成物を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、ＴＳ、および有効濃度の少なくとも１種の成長因子を包含し、該濃度は創傷治癒を促進するのに効果的である創傷治癒を促進する組成物を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、ＴＳ、および有効濃度の少なくとも１種の成長因子を包含し、該濃度は血管補綴の内皮形成を促進するのに効果的である、血管補綴の内皮形成を促進する組成物を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、ＴＳ、および有効濃度の少なくとも１種の成長因子を包含し、該濃度は動物細胞の増殖および／または分化を促進するのに効果的である、動物細胞の増殖および／または分化を促進する組成物を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、ＴＳ、および少なくとも１種の薬物を包含し、少なくとも１種の薬物の局所化送達を促進する組成物を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、ＴＳ、および少なくとも１種の成長因子を包含し、少なくとも１種の成長因子の局所化送達を促進する組成物を提供する。
もう１つの態様において、ＴＳおよび有効濃度の少なくとも１種の成長因子を含有し、該濃度が創傷治癒を促進するのに効果的である組成物を創傷に適用することよりなる創傷治癒を促進する方法を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、ＴＳおよび有効濃度の少なくとも１種の成長因子を含有し、該濃度が血管補綴の内皮形成を促進するのに効果的である組成物を血管補綴に適用することよりなる、血管補綴の内皮形成を促進する方法を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、有効濃度の少なくとも１種の成長因子を含有し、該濃度が細胞の増殖および／または分化を促進するのに効果的であるＴＳに十分に近接させて動物細胞を置くことよりなる、動物細胞の増殖および／または分化を促進する方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、少なくとも１種の薬物を含有するＴＳを組織に適用することよりなる、組織に少なくとも１種の薬物を局所化送達する方法を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、少なくとも１種の成長因子を含有するＴＳを組織に適用することよりなる、組織に少なくとも１種の成長因子を局所化送達する方法を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、有効濃度の少なくとも１種の成長因子を含有し、該濃度が動物細胞の所望の指向された移動を生じるのに効果的であるＴＳを該細胞に十分近接させて置くことよりなる、動物細胞の指向された移動を生じさせる方法を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、（ａ）乾燥したウイルス不活化（virally-inactivated）精製フィブリノーゲン、（ｂ）乾燥したウイルス不活化精製トロンビンの有効量の組合せ、および要すれば、（ｃ）水和に際して組織シール性フィブリン血餅を生じるのに有効な量のカルシウムおよび／または第ＸＩＩＩ因子を包含する乾燥物質の層が付着された閉塞性（occlusive）裏打ちを備える、患者において創傷組織に組織シール性組成物を適用するための使用が簡便で即効性で実践的なフィブリン包帯を提供する。
さらなる態様において、本発明は、（ａ）乾燥したウイルス不活化精製フィブリノーゲン、（ｂ）乾燥したウイルス不活化精製トロンビンの有効量の組合せ、および要すれば、（ｃ）水和に際して組織シール性フィブリン血餅を生じるのに有効な量のカルシウムおよび／または第ＸＩＩＩ因子を包含する乾燥物質の層に付着された（１）閉塞性裏打ちよりなるフィブリン包帯を創傷に適用することによって患者において創傷組織を治療する方法を提供する。
さらにもう１つの態様において、本発明は、（１）ウイルス不活化精製フィブリノーゲン、（２）ウイルス不活化精製トロンビンの有効量の組合せ、および要すれば、（３）カルシウムおよび／または第ＸＩＩＩ因子を包含する発泡性フォームとして処方され、該組成物は十分な厚みの皮膚創傷治癒を有意には阻害しない、患者において創傷組織を治療するための使用が簡便で即効性の実践的なフィブリン包帯剤を提供する。
さらなる態様において、本発明は、（１）ウイルス不活化精製フィブリノーゲン、（２）ウイルス不活化精製トロンビンの有効量の組合せ、および要すれば、（３）カルシウムおよび／または第ＸＩＩＩ因子を包含し、該組成物は全厚さに渡る皮膚の創傷治癒を有意には阻害しない、組織シーラント発泡性フォーム包帯剤を創傷に適用することによって患者において創傷組織を治療する方法を提供する。
本発明の態様において、ＴＳはＦＧであってよい。
本発明の種々の態様において、ＦＧは、局所フィブリノーゲン複合体（ＴＦＣ）、ヒトトロンビンおよび塩化カルシウムを混合することから作製できる。ＴＦＣの濃度の変更は、最終ＦＧマトリックスの密度に対して最も重要な効果を有する。トロンビンの濃度の変更は、最終ＦＧの全蛋白質濃度に対して些細な効果を有するが、フィブリンへのＴＦＣのフィブリノーゲン成分の重合に要する時間に対しては大きな効果を有する。この効果はよく知られているが、それを単独でまたは補足して使用する場合、ＦＧの有効性を最大化するのに使用できることは一般に認識されていない。この効果のため、ＦＧ成分の混合とＦＧの硬化の間の時間を変更できる。かくして、創傷における深い間隙にＦＧをより自由に流動させることができ、ＦＧが硬化する前に創傷を完全に満たすことができる。別法として、ＦＧを十分迅速に硬化させて、特にもし創傷が加圧下で漏出する流体であれば（例えば、血液、リンパ、細胞間流体等）、創傷部位から出ることを防ぐことができる。また、この特性は、外科手術によってのみ接近可能であった身体中の部位へのＦＧまたは補足ＦＧの適用を可能とするのに重要な、長い通路を持つ送達デバイス、すなわち、カテーテル、内視鏡等をＦＧが動かなくするのを避けるのに重要である。この効果は、懸濁液中に不溶性補足物を保持し、それらがアプリケーター中または組織部位中で沈降するのを妨ぐという点でも重要である。
本明細書で使用するＴＦＣとは精製されウイルス不活化されたヒト血漿蛋白質の凍結乾燥混合物である。再構築（再構成）された場合、ＴＦＣは以下のものを含有する。
合計蛋白質：１００〜１３０ｍｇ／ｍｌ
フィブリノーゲン：（凝集可能蛋白質として）合計蛋白質の８０％（最小）
アルブミン（ヒト）：５〜２５ｍｇ／ｍｌ
プラスミノーゲン：５ｍｇ／ｍｌ
第ＸＩＩＩ因子：１０〜４０単位／ｍｌ
ポリソルベート−８０：０．３％（最大）
ｐＨ：７．１〜７．５
再構築したＴＦＣは痕跡量のフィブリノーゲンも含有し得る。
本明細書で使用するヒトトロンビンとは、精製されウイルス不活化されたヒト血漿蛋白質の凍結乾燥混合物である。再構築した場合、それは以下のものを含有する。
トロンビン効力：３００±５０国際単位／ｍｌ
アルブミン（ヒト）：５ｍｇ／ｍｌ
グリシン：０．３Ｍ±０．０５Ｍ
ｐＨ：６．５〜７．１
塩化カルシウムは、トロンビンを活性化するのに十分な濃度で添加する。十分なカルシウムがある限り、その濃度は重要ではない。
成長因子を含有する本発明の組成物において、該組成物は阻害性化合物（類）および／または促進性化合物（類）を含有することができ、ここに、該阻害性化合物（類）は成長因子のいずれかの生物学的活性と干渉するシーラントの活性を阻害し、該促進性化合物（類）は、成長因子のいずれかの生物学的活性を増強し、媒介しまたは増大し、ここに、阻害性または促進性化合物の濃度は阻害、促進、媒介または増強を達成するのに効果的なものである。
本発明の成長因子補足ＴＳ類は、創傷、特に糖尿病個人における皮膚潰瘍のごとき容易に治癒しないものの治癒を促進するのに、および限定されるものではないがＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＰＤＧＦ類、ＥＧＦ類、ＩＧＦ類、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＯＰ−１、ＴＧＦ−β、軟骨−誘導因子−Ａ（ＣＩＦ−Ａ）、軟骨−誘導因子−Ｂ（ＣＩＦ−Ｂ）、類骨−誘導因子（ＯＩＦ）、アンジオゲニン（類）、エンドセリン（類）、肝細胞成長因子およびケラチノサイト成長因子を含む成長因子を送達するのに、および創傷部位および成長因子（類）の間の延長された接触のための媒体を供するのに有用である。成長因子補足ＴＳは火傷および他の皮膚創傷を治療するのに使用でき、それは成長因子（類）に加えて、ＴＳ、抗生物質（類）および／または鎮痛剤（類）等を含むことができる。成長因子補足ＴＳは、皮膚創傷に対する皮膚のごとき天然または人工移植片の移植を助けるのに使用できる。また、それらは、ＴＳがＦＧＦ、ＥＧＦ、抗生物質およびミノキシジル、ならびに他の成分を含有し得る、例えば毛髪移植において美容的に使用できる。本発明の組成物についてのさらなる美容的使用は、シリコーンまたは他の成分を使用する代わりに皺および傷を治療することである。本態様において、例えば、ＴＳはＦＧＦ−１、ＦＧＦ−４および／またはＰＤＧＦ類および脂肪細胞を含有することができる。成長因子補足ＴＳ類は、その治癒を促進するために、外科創傷、骨折した骨または胃潰瘍および他のかかる内部創傷に適用することができる。本発明のＴＳ類は、例えば、移植片が天然組織よりなる場合のように、人工または天然を問わず、移植片を動物体内に一体化するのを助けるために使用できる。本発明のＴＳ類は、歯周炎のごときある種の疾患、すなわち執拗な感染、骨吸収、靭帯の喪失および歯周ポケットの未成熟内皮形成に関連する主要な問題のいくつかと戦うために使用できる。
もう１つの態様において、本発明は、ＦＧ、ＤＢＭおよび／または精製ＢＭＰ類の混合物を提供する。この混合物は、身体の細胞成分がそれに移動し、かくして、必要な場合に骨誘導を生じるのを可能とするマトリックスを提供する。（フィブリノーゲンおよび第ＸＩＩＩ因子のごとき）蛋白質類、（トロンビンおよびプラスミンのごとき）酵素類、ＢＭＰ類、成長因子類およびＤＢＭならびにそれらの濃度に関するマトリックス組成物は適当に処方して、この一時的足場物質構造の寿命および起こることが必要な骨誘導を最適化する。全てのＦＧ成分は骨成形の間を除いて生分解性であり、該混合物は、新しく形成された骨の形状および位置を決定できる非崩壊性足場物質を提供する。骨再構成外科手術で問題である、軟組織の骨偽関節欠陥への崩壊はかくして回避されるであろう。軟骨の発生を促進するＣＩＦ−ＡおよびＣＩＦ−Ｂ（後記参照）のごとき成長因子を補足したＴＳの使用は、喪失したまたは損傷した軟骨および／または損傷した骨の再構成で有用であろう。
好ましい態様において、創傷治癒を促進する能力を有する成長因子補足ＴＳを提供するために、ＨＢＧＦ−１の有効濃度をＦＧに添加する。もう１つの好ましい態様において、有効量の血小板由来抽出物をＦＧに添加する。他の好ましい態様において、有効濃度の少なくとも２種の成長因子の混合物をＦＧに添加し、有効量の成長因子（類）−補足ＦＧを創傷組織に適用する。
成長因子類に加え、薬物類、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体および限定されるものではないがＤＢＭおよびＢＭＰ類を含めた他の成分類をＴＳに添加することができる。それらは創傷治癒を加速し、感染、新形成および／または他の疾患過程と戦い、ＴＳにおける成長因子の活性を媒介しまたは促進し、および／またはＴＳにおける成長因子の活性を阻害するＴＳ成分に干渉する。これらの薬物は限定されるものではないが、テトラサイクリンおよびシプロフロキサシンのごとき抗生物質：５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、タキソールおよび／またはタキソテーレのごとき抗増殖／細胞毒薬物：ガングシクロビル、ジドブジン、アマンチジン、ビダラビン、リバラビン、トリフルリジン、アシクロビル、ジデオキシウリジンおよびウイルス成分または遺伝子産物に対する抗体のごとき抗ウイルス剤：α−またはβ−またはγ−インターフェロン、α−またはβ−腫瘍壊死因子およびインターメイキン類のごときサイトカイン類：コロニー刺激因子：エリスロポエチン：ジフルカン、ケタコニゾールおよびニスタチンのごとき抗真菌剤：ペンタミジンのごとき抗寄生虫剤：α−１−抗トリプシンおよびα−１−抗キモトリプシンのごとき抗炎症剤：ステロイド類：麻酔剤：およびホルモン類を含む。ＴＳに添加することができる他の成分は、限定されるものではないが、ビタミン類および他の栄養補給剤：ホルモン類：糖蛋白質類：フイブロネクチン：ペプチド類および蛋白質類：炭水化物類（単純および／または複合体）：プロテオグリカン類：抗アンジオテンシン類：抗原類：オリゴヌクレオチド類（センスおよび／またはアンチセンスＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）：ＢＭＰ類ＤＢＭ：抗生物質（例えば、感染剤、腫瘍、薬物類またはホルモン類に対するもの）：および遺伝子療法剤を含む。遺伝的に改変した細胞および／または他の細胞を本発明のＴＳに含むこともできる。本発明を実施するのに使用できる骨誘導性成分は、限定されるものではないが、オステオゲニン（ＢＭＰ３）：ＢＭＰ−２：ＯＰ−１：ＢＭＰ−２Ａ、−２Ｂおよび−７：ＴＧＦ−β、ＨＢＧＦ−１および−２：およびＦＧＦ−１および−４を含む。加えて、ＴＳを破壊しないいずれのものも本発明のＴＳに添加することができる。
本明細書に報告する研究は、予期せぬことに、遊離塩基ＴＥＴまたはシプロフロキサシン（ＣＩＰ）ＨＣｌのごとき成分をＦＧまたはそれでのＦＧの処置に含ませると、補足ＦＧに延長された寿命を賦与することを示す。この現象はＴＳからの薬物放出の持続を増加させるのに活用できる。別法として、この現象は、やはりＴＥＴ−ＦＧに一体化させる、ＦＧを安定化させるのに使用される化合物以外のもう１つの薬物（類）の放出を変調し、および／またはＦＧをイン・ビボまたはイン・ビトロで長時間存在させるのに活用できる。
一般に、ＴＥＴの遊離塩基のごとき薬物の貧水溶性形態は、その自由に水に溶解する形態よりもＴＳからの薬物の送達を増加させる。従って、薬物を、ＴＳ内のフィブリノーゲンまたは活性炭のごとき不溶性担体に結合させて、補足ＴＳからの薬物の送達を延長させることができる。
もう１つの態様において、補足ＴＳは、小器官で使用することができ、例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４およびＯＰ−１のごとき成長因子を含有させることができよう。
もう１つの態様において、本発明は、ＴＳおよび有効濃度の抗生物質の少なくとも１種の貧水溶性形態よりなる、ＴＥＴの遊離塩基形態のごとき抗生物質の貧水溶性形態、および他の薬物（類）の局所化送達を促進する組成物を提供する。
本発明は、従前に使用されたＴＳ組成物および方法よりも優れたいくつかの利点を有する。第１の利点は、本発明の成長因子−および／または薬物−補足ＴＳ類は理想的な生分解性担体の多くの特徴を有することである。すなわち、それらはヒト蛋白質のみを含有するように処方でき、かくして、免疫原性問題および外来物−身体反応を排除または最小化し；それらの投与は有用であり；それらは宿主自体の天然フィブリン溶解系によって分解されるので、それらの宿主組織からの除去は必要ではない。
第２の利点は、本発明は、成長因子および／または薬物を長期間、内部または外部創傷に効果的に送達する良好な方法を提供することである。いくつかの成長因子レセプターは少なくとも１２時間占有されて、最大生物学的効果を生じなければならない。従前には、そうする方法がなかった。本発明は、成長因子およびそのレセプターの間の延長された接触が起こることを可能とし、かくして、強力な生物学的効果が生じるのを可能とする。
本発明の第３の利点は、動物細胞が本発明のＴＳ類へおよびそれを通って移動でき、その中で増殖できることである。これは隣接する組織および補綴への細胞の移植を助力する。欧州で入手可能なＴＳ類の組成物に基づき、これはこれらの処方では不可能であると予測される。代わりに、動物細胞は商業的に入手可能なＴＳの回りを移動し、あるいはそれを消化しなければならない。商業的に入手可能なＴＳの欧州から米国への輸入は不法である（それらの米国での使用は米国ＦＤＡによって認可されていない）。
第４の利点は、その最初の液体性質のため、本発明のＴＳは多くの従前に利用可能であった送達系よりもより徹底的にかっ完全に表面を被覆することができる。これは生体物質を被覆するにおいて、および血管補綴の内皮形成において、本発明の使用で特に重要である。何故ならば、成長因子補足ＦＧは血管補綴の内部、外部および孔を被覆するだろうからである。この結果、ＴＳへおよびそれを通って移動する内皮細胞の能力がプラスされると、オートロガス内皮細胞の移植は血管補綴の全長に沿って起こり、それにより、そのトロンボゲン形成性および抗原性を減少させる。従前に使用されたＴＳ類では、移植は血管補綴の末端で開始し、ともかくその内部まで進行し、かくして、長期間のトロンボゲン形成性および抗原性を発生させる。血管補綴で従前に使用されたＴＳ類は、まず、身体によって拒絶され、補綴を通る血液の剪断力によって容易に洗い流され得る非オートロガス細胞を着床させた。
第５の利点は、本発明の補足および非補足ＴＳは成形でき、かくして、ほとんどいずれの形状にも通常作製できることである。例えば、ＦＧのごときＴＳはＢＭＰ類および／またはＤＢＭを補足でき、最も適切に骨創傷を治療するのに必要な形状に通常作製できる。これは、ＤＢＭ粉末がその形状を維持しないでうあろうからＤＢＭ粉末ではなすことができない。
第６の利点は、ＴＥＴ−ＦＧのごとき本発明のＡＢ補足ＦＧは、非補足ＦＧのそれと比較してＦＧの寿命および安定性を予期せぬことに増大させたことである。この増大された安定性は、認識可能な量のＡＢがもはやＦＧに存在しない後であっても継続する。例えば、新しく形成されたＦＧ血餅を、遊離塩基ＴＥＴから生成したＴＥＴの飽和溶液またはＣＩＰ ＨＣｌの溶液に浸漬させるとＦＧ血餅を生じ、これは実質的に全てのＴＥＴまたはＣＩＰがＦＧ血餅を去った後でも安定で保存される。この効果がいかに生じるかについていずれかの理論に束縛されるつもりはないが、ＴＥＴまたはＣＩＰのごときＡＢはＴＦＣに存在するプラスミノーゲンを阻害し、ＦＧを破壊すると考えられる。一旦プラスミノーゲンが阻害されると、その継続する阻害はＦＧに残存するＴＥＴまたはＣＩＰの認められる量に依存しないようである。この安定化効果の結果、ＴＳの増大した貯蔵寿命、および恐らくはイン・ビボでの増大した持続を予期することができる。
本発明の第７の利点は、ＴＳの延長された寿命および安定性の直接的結果である。ＴＳの安定性におけるこの予期せぬ増大の結果、ＡＢ補足ＦＧを用いて、薬物（類）および／または成長因子（類）の局所化された長期間送達を生じさせることができる。この送達は、ＴＥＴまたはＣＩＰのごとき安定化薬物が実質的にＴＳを去った後でも継続するであろう。遊離塩基のごとき薬物の固体形態、好ましくは貧水溶性形態を、例えば、ＴＥＴまたはＣＩＰによって安定化されたＴＳに含ませると、安定化されたＴＳが長期間、その薬物（または成長因子）を局所的に送達するのを可能とする。遊離塩基ＴＥＴのごとき薬物のいくつかの形態は、ＴＳの安定化および延長された送達の双方を可能とする。他の薬物は一方または他方を可能とするが双方を可能とはしない。延長された局所化薬物送達を生じるためのＴＳの安定化で用いる化合物は従前には当該分野で知られていない。
本発明の第８の利点はそれが部位特異的血管形成をイン・ビボで起こるのを可能とすることである。他の者は局所化された非特異的血管形成を示しているが（前掲）、いずれの者も部位特異的血管形成を促進するＴＳを使用していなかった。
本発明の第９の利点は、ＴＳの成分は使用が簡便で即効性の実践的包帯剤のいくつかの形態に処方できるので、今や、出血する外傷創傷からの出血を制御し、それにより、従前に失われた多数の命を救うことができることである。かかる創傷を治療する生命救助方法は、訓練された医療人または十分に設備の整った病院で可能であるが、本発明は、緊急または災害状況において、訓練されていない個人が医療助力が得られるまで外傷負傷者を処置して出血を制御するのを可能とする使用が容易な応急（自己適用性でさえある）処置に対する社会の長い間の要望を満足する。
【図面の簡単な説明】
図１は、増大させていく濃度のヘパリンの存在下における２５０Ｕ／ｍｌトロンビンと共にインキュベートしたＨＢＧＦ−１βを含有する試料についてのゲルのウェスタンブロットを示す。ＨＢＧＦ−１β（１０μｇ／ｍｌ）、トロンビン（２５０μｇ／ｍｌ）および増大させていく濃度のヘパリン（０、０．５、５、１０、２０および５０単位／ｍｌ）を含有する溶液を３７℃で７２時間インキュベートした。インキュベートする混合物の各々から周期的にアリコットを取り出し、レムリ（Laemmli）（Nature 227:680（1970））によって記載されているごとくに調製し泳動させる８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに負荷した。次いで、該ゲルをニトロセルロースに電気ブロットし、ＨＢＧＦ−１βに対応するバンドを、アフィニティー精製したＨＢＧＦ−１βに対するポリクローナルウサギ抗血清を用いて同定した。インキュベートする混合物中のヘパリンの濃度は：パネルＡ）０単位／ｍｌ：パネルＢ）０．５Ｕ／ｍｌ；パネルＣ）５Ｕ／ｍｌ：パネルＤ）１０Ｕ／ｍｌ：パネルＥ）２０Ｕ／ｍｌ：およびパネルＦ）５０Ｕ／ｍｌであった。パネルＡ−Ｆの各々に描いたゲルにおいて、各レーンは以下のものを含有する：レーン１はＳＤＳ−ＰＡＧＥ低分子量標準を含有する；レーン２はビオチン化標準を含有する；レーン３は１０μｇ／ｍｌＨＢＧＦ−Ｉβを含有する；レーン４は２５０Ｕ／ｍｌトロンビンを含有する；およびレーン５−１３は、時点０、１、２、４、６、８、２４、４８および７２時間でインキュベートする混合物から取り出した試料を含有する。
図２は、相対的ＨＢＧＦ−１β濃度の関数としての³Ｈ−チミジンの取込を示す。２５０Ｕ／ｍｌのトロンビンおよび５Ｕ／ｍｌのヘパリンの存在下、図１および実施例２に記載したごとくに、１ＨＢＧＦ−１βの試料を０、２４または７２時間インキュベートした。次いで、これらの試料の希釈物をＮＩＨ ３Ｔ３細胞に添加し、これを実施例３に記載したごとくに平板培養した。ＣＰＭをＨＢＧＦ−１濃度に対してプロットする。
図３。１００ｎｇ／ｍｌの活性な野生型ＦＧＦ−１を補足したＦＧ上での７日間の増殖後におけるヒト臍帯静脈内皮細胞の典型的パターン。非常に多数の細胞およびそれらの細長い形状に注意されたい。非補足ＦＧ上で増殖させた細胞（図３）の少数と比較されたし。
図４。１０ｎｇ／ｍｌの活性な野生型ＦＧＦ−１を補足したＦＧ上での７日間の増殖後におけるヒト臍帯静脈内皮細胞の典型的パターン。非常に多数の細胞およびそれらの細長い形状に注意されたい。非補足ＦＧ上で増殖させた細胞（図５）の少数と比較されたし。
図５。非補足ＦＧ上で７日間増殖させた後における臍帯静脈内皮細胞の典型的パターン。図３および４における細胞数と比較して、より遅い増殖速度を示す、少数の細胞に注意されたし。
図６。１００ｎｇ／ｍｌの不活性な突然変異体ＦＧＦ−１を補足したＦＧ上での７日間の増殖後におけるヒト臍帯静脈内皮細胞の典型的パターン。図３および４における細胞数と比較して、より遅い増殖速度を示す、少数の細胞に注意されたし。
図７。ＰＧ１ｍｌ当たり１０⁵細胞の濃度でＦＧに埋め込んだ２４時間後におけるヒト臍帯内皮細胞の典型的パターン。ＦＧの蛋白質およびトロンビン濃度は、各々、４ｍｇ／ｍｌおよび０．６ＮＩＨ単位／ｍｌであった。それらの細長い多足状形態およびそれらは相互に接触する細胞ネットワークを形成することに注意されたい。フィブロネクチン中で増殖させた同様の細胞の丸石形態（図９）と比較されたい。
図８。ＦＧ１ml当たり１０⁵細胞の濃度でＦＧ中に埋め込んだ４８時間後におけるヒト臍帯内皮細胞の典型的パターン。培養条件は図７に記載したものである。さらに際立った細長して多足状形態および細胞ネットワークの増大する発生に注意されたい。フィブロネクチン中で増殖させた丸石形状細胞（図１０）と比較し、後者における細胞ネットワークの欠如に注意されたい。
図９。フィブロネクチンを被覆した表面で培養した２４時間後におけるヒト臍帯内皮細胞の典型的パターン。細胞の丸石形状および細胞ネットワークの欠如に注意されたい。図７と比較されたい。
図１０。フィブロネクチンの通常の使用されるフィルム中で培養した４８時間後におけるヒト臍帯内皮細胞の典型的パターン。細胞の丸石形状および細胞ネットワークの欠如に注意されたい。図８と比較されたい。
図１１。７日後（パネルＡ、Ｃ、Ｅ）または２８日後（パネルＢ、Ｄ、Ｆ）におけるイヌから外植したＰＴＦＥ血管移植片の断面の顕微鏡写真。移植に先立ち、移植片は処理しないか（ＡおよびＧ）、ＦＧ単独で被覆するか（ＣおよびＤ）、またはヘパリンおよびＨＢＧＦ−１を補足したＦＧで被覆した（ＥおよびＦ）。
未処理対照（ＡおよびＢ）は、最小の間葉組織内部成長を示し、両者の間隙はフィブリン凝塊が充填され、それらの管腔表面はフィブリン凝塊で被覆されていた。ＦＧ−処理移植片は移植片間隙の外方半分においてのみ間葉組織内部成長を示し、残りはフィブリン凝塊が充填されていた。非常に少数の間隙毛細血管が存在した。対照的に、ＦＧＦ−１を含有するＦＧで処理した移植片はより豊富な間隙内部成長を示し、２８日までには、多数の毛細血管、筋芽細胞およびマクロファージを示し、内部のカプセルは密集した内皮細胞層の直下のいくつかの層の筋芽細胞よりなっていた。移植１２８日後における同様の移植片結果は同様であり、より多数の毛細血管がＦＧ＋ＦＧＦ−１群にあった（データは示さず）。
図１２。移植２８日後における図１１に記載した血管移植片の内部ライニングの走査型顕微鏡写真。移植片は処理しないか（Ｇ）、ＦＧ単独で被覆するか（Ｈ）、あるいはヘパリンおよびＨＢＧＦ−１を補足したＦＧで被覆した（Ｉ）。未処理対照移植片（Ｇ）は、赤血球、血小板を含有する血栓の領域、および暴露したＰＴＦＥ移植片物質の領域（写真の中央および頂部に見える）の真中に内皮細胞被覆のまばらな領域を示した。ＦＧ単独で被覆した移植片（Ｈ）は、フィブリン凝塊の領域の真中に内皮細胞の島を示した。対照的に、ＦＧ＋ＨＢＧＦ−１で処理した移植片（Ｉ）は、血流の方向に沿って配向した密集内皮細胞を示した。
図１３。アルミニウムモールドを用いて調製した厚さ１ｍｍおよび直径８ｍｍのディスク形状移植片の調製。
図１４。ＤＢＭ単独による、ＦＧ移植片による、あるいはＤＢＭ−ＦＧによるラットにおける骨形成の誘導のための筋肉内バイオアッセイのダイアグラム。
図１５。ＤＢＭ−ＦＧによる頭蓋冠移植片における骨吸収の誘導を説明するダイアグラム。
図１６。ＤＢＭ−ＦＧまたはＦＧの筋肉内移植片からの手術２８日後における放射線−不透明性データ。
図１７。手術後２８日、３カ月および４カ月におけるＤＢＭ−ＦＧ（３０ｍｇ／ｍｌ）頭蓋冠移植片からの放射線−不透明性データ。
図１８。図１８Ａは処理動物における外科手術後２８日における開頭部位の写真である。
図１８Ｂは手術後２８日における未処理対照からの頭蓋冠創傷の写真である。繊維状結合組織のみが開頭創傷を横切って発育したことに注意されたい。
図１９。ＤＢＭ粒子のみで処理した動物の開頭創傷からの写真。
図２０。ＤＢＭ−ＦＧ（１５ｍｇ／ｍｌ）に応答して開頭部位で形成された新しい骨の写真。
図２１。ＤＢＭ−Ｆｇ（１５ｍｇ／ｍｌ）に応答して開頭部位で形成された新しい骨の写真。典型的には、ＤＢＭ移植片単独と比較して、ＤＢＭ−ＦＧディスクを移植した開頭創傷でより多く骨髄が形成されたことに注意されたい。
図２２。３７℃におけるＦＧの３×６ｍｍ直径ディスクからのＴＥＴの放出。放出されたＴＥＴの濃度は、毎日取り替えた２ｍｌのＰＢＳ上清中、分光光度法により測定した。これらの「静的」イン・ビトロ実験のうちの２つは実施して同一結果が得られた。それらのうちの１つの結果をここに示す。
図２３。３７℃におけるＦＧの３×６ｍｍ直径ディスクからのＴＥＴの放出。該ディスクは１００ｍｇ／ｍｌのＴＥＴよりなり、２ｍｌのＰＢＳを満たした密閉容器に入れた。ＴＥＴ濃度は３ｍｌ／日の率で連続的に交換したＰＢＳ流出物において分光光度法により測定した。ＰＢＳ上清の容量はほぼ２ｍｌにて一定に保持した。データは２の実験の平均である。
図２４。３７℃における、５０または１００ＴＥＴｍｇ／ｍｌＦＧを含有する３×６ｍｍ直径データからのＴＥＴの唾液への放出。ＴＥＴ濃度は、毎日取り替えた０．７５ｍｌの唾液上清において分光光度法により測定した。これらの実験で使用した唾液を１０のドナーからプールし、遠心し、濾過し、４℃に維持した。
図２５。ＴＥＴ補足ＦＧの安定性は対照ＦＧのそれと比較して増大した。１５日間にわたるＴＥＴを含まないおよび５０および１００ｍｇ／ｍｌＴＥＴを含む３×６ｍｍ直径ＦＧマトリックスの写真。ディスクは毎日交換する０．７５ｍｌの唾液中に維持した。唾液を１０のドナーからプールした。次いで、それを遠心し、濾過し、本実験で使用する前に４℃で貯蔵した。第９日において、ＴＥＴを含有しないＦＧマトリックスは、５０または１００ｍｇ／ｍｌのＴＥＴいずれかを含有するマトリックスよりも崩壊したことに注意されたい。また、第１５日には、ＴＥＴを含有しないＦＧマトリックスはほとんど全部崩壊したのに対し、５０または１００ｍｇ／ｍｌのＴＥＴを含有するＦＧマトリックスはほとんど変化しなかったことにも注意されたい。従って、５０または１００ｍｇ／ｍｌのＴＥＴを含有させると、イン・ビトロにて唾液中のＦＧマトリックスの寿命を劇的に延長した。
図２６。ＴＥＴ補足ＦＧから放出されたＴＥＴの抗菌活性。３×６ｍｍのＴＥＴ補足ＦＧディスクを囲む２ｍｌＰＢＳを毎日取り替えた。放出されたＴＥＴの抗微生物活性をテストするために、収集した溶出物を含浸させた６ｍｍペーパーディスクを、イー・コリ（E. coli）を含有する寒天プレート上で３７℃で１８時間インキュベートした。次いで、阻止ゾーンの直径を測定した。
図２７。ＦＧマトリックスからのシプロフロキサシン、アモキシシリンおよびメトロニダゾールの放出。各抗生物質の１００ｍｇ／ｍｌを含有する個々の３×６ｍｍ直径ディスクを３７℃にてリン緩衝化生理食塩水２ｍｌに浸漬した。上清を毎日取り替え、抗生物質濃度を、各々、２７５、２７４および３２０ｎｍにおいて分光光度法により測定した。
図２８。ＴＥＴ補足ＦＧディスクからのＴＥＴ放出は、ＴＥＴ−ＦＧディスクを浴するＰＢＳの温度に比例していた。
図２９。ＴＥＴ−ＦＧからのＴＥＴの放出に対するＦＧ蛋白質濃度の効果。より高いＦＧ蛋白質濃度の結果、ＴＥＴ−ＦＧからのより遅いＴＥＴ放出速度となる。
図３０。５−ＦＵ補足ＦＧからの５−ＦＵの放出は５−ＦＵの固体形態の使用によって延長された。
図３１。フィブロネクチンに対するＮＩＨ ３Ｔ３の走化性応答の用量−応答関係。濃度を段階的に増加させるグラジエントのフィブロネクチンを修飾されたボイデン（Boyden）チャンバーの低方ウェルに添加した。データは、高出力場当たりの移動細胞の平均±Ｓ．Ｅ．として表し、これはフィブロネクチンが、用量の関数として、それに向かうＮＩＨ ３Ｔ３細胞の走化性を誘導したことを示した。
図３２。ＦＧＦ−１に対するＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞の走化性応答の用量−応答関係。ヘパリンの存在下、濃度を段階的に増加させるグラジエントのＦＧＦ−１を修飾されたボイデン（Boyden）チャンバーの低方ウェルに添加した。データは、高出力場当たりの移動細胞の平均±Ｓ．Ｅ．として表し、これはＦＧＦ−１が、用量の関数として、それに向かうＮＩＨ ３Ｔ３細胞の走化性を誘導したことを示した。
図３３。ＦＧＦ−２に対するＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞の走化性応答の用量−応答関係。濃度を段階的に増加させるグラジエントのＦＧＦ−２を修飾されたボイデン（Boyden）チャンバーの低方ウェルに添加した。データは、高出力場当たりの移動細胞の平均±Ｓ．Ｅ．として表し、これはＦＧＦ−２が、用量の関数として、それに向かうＮＩＨ ３Ｔ３細胞の走化性を誘導したことを示した。
図３４。ＦＧＦ−４に対するＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞の走化性応答の用量−応答関係。ヘパリンの存在下、濃度を段階的に増加させるグラジエントのＦＧＦ−４を修飾されたボイデンチャンバーの低方ウェルに添加した。データは、高出力場当たりの移動細胞の平均±Ｓ．Ｅ．として表し、これはＦＧＦ−４が、用量の関数として、それに向かうＮＩＨ ３Ｔ３細胞の走化性を誘導したことを示した。
図３５。ＦＧＦ−１に対するヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）の走化性応答の用量−応答関係。ヘパリンの存在下、濃度を段階的に増加させるグラジエントのＦＧＦ−１を修飾されたボイデンチャンバーの低方ウェルに添加した。データは、高出力場当たりの移動細胞の平均±Ｓ．Ｅ．として表し、これはＦＧＦ−１が、用量の関数として、それに向かうＨＤＦの走化性を誘導したことを示した。
図３６。ＦＧＦ−２に対するＨＤＦの走化性応答の用量−応答関係。濃度を段階的に増加させるグラジエントのＦＧＦ−２を修飾されたボイデン（Boyden）チャンバーの低方ウェルに添加した。データは、高出力場当たりの移動細胞の平均±Ｓ．Ｅ．として表し、これはＦＧＦ−２が、用量の関数として、それに向かうＨＤＦの走化性を誘導したことを示した。
図３７。ＦＧＦ−４に対するＨＤＦの走化性応答の用量−応答関係。濃度を段階的に増加させるグラジエントのＦＧＦ−４を修飾されたボイデンチャンバーの低方ウェルに添加した。データは、高出力場当たりの移動細胞の平均±Ｓ．Ｅ．として表し、これはＦＧＦ−４が、用量の関数として、それに向かうＨＤＦの走化性を誘導したことを示した。
図３８。溶液中およびＦＧ中におけるＦＧＦ−４に対するＨＤＦの走化性応答の用量−応答関係。ＦＧＦ−４をＦＧに取り込み、走化性チャンバーの底部ウェルに入れた。ＦＧ中のＦＧＦの量は、低方チャンバー中のＦＧおよび媒体全体に均一に分配された場合に示した濃度となるのに十分なものであった。陰性対照は媒体単独およびＦＧを含み、ＦＧＦは含まなかった。低方チャンバー中の１０ｎｇ／ｍｌの濃度でＦＧＦ−４を含有する媒体は陽性対照として用いた。データは、高出力場当たりの移動細胞の平均±Ｓ．Ｅ．として表し、これはＦＧから放出されたＦＧＦ−４が、用量の関数として、それに向かうＨＤＦの走化性を誘導したことを示した。
図３９。自己含有された（self-contained）ＴＳ創傷包帯剤のダイアグラム。
好ましい態様の記載
定義
特に断りのない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書で挙げる全ての特許および刊行物は引用して本明細書の一部とする。
本明細書で使用する創傷とは、生きた生物体におけるいずれの組織に対する損傷をも含む。該組織は胃ライニングまたは骨のごとき内部組織、あるいは皮膚のごとき外部組織であり得る。それ自体、創傷は、限定されるものではないが、胃腸管海洋、骨折、新形成、および切ったまたは擦過された皮膚を含み得る。創傷は脾臓のごとき軟組織、または骨のごとき硬組織におけるものであってよい。創傷は、外傷負傷、感染または外科的介入を含めたいずれの剤によって引き起こされたものであってもよい。
本明細書で用いるＴＳとは、創傷への適用に際し、創傷をシールし、それにより、血液喪失を低下させ、止血を維持する物質または組成物である。本明細書で使用するＦＧとは、創傷への適用に際して、血餅を形成し、それにより創傷をシールし、血液喪失を低下させ、止血を維持する組換えまたは血漿蛋白質から調製された組成物である。ＦＧ（前掲）はＴＳの一形態である。
本明細書で使用する補足ＴＳは、実質的修飾なしに、成長因子、薬物または他の化合物、またはその混合物の送達用の担体ビヒクルとして働き、その接着性または吸着性特性によって、補足ＴＳに、その所望の効果、例えば、創傷治癒を促進するのに十分な時間、該部位との接触を維持できるいずれのＴＳをも含む。
本明細書で使用する成長因子補足ＴＳとは、少なくとも１種の成長因子が、その述べた目的に十分な濃度で添加されたＴＳである。成長因子は、例えば、創傷治癒または組織の（再）生を加速、促進または改良できる。また、成長因子補足ＴＳ類は、１）ＴＳにおける成長因子（類）の生物学的活性を促進し、刺激し、または媒介し；２）生物学的活性またはシーラント中の成長因子（類）を阻害しまたは破壊する成長因子補足ＴＳの成分の活性を低下させ；あるいは３）ＴＳからの補足物の延長された送達を可能とし；４）他の所望の特性を保有する、薬物、抗生物質、抗凝固剤および他の成分を含めたさらなる成分を含有させることができる。
本明細書で用いる促進性化合物とは、ＴＳ中の成長因子の生物学的活性を媒介しまたは増加させる化合物である。ヘパリンは、ＨＢＧＦ−１の生物学的活性を促進する化合物の例である。
本明細書で用いる阻害性化合物とは、ＴＳ中の成長因子または成長因子類の生物学的活性に干渉しまたはそれを阻害するＴＳの成分の有害活性を阻害、それに干渉し、またはそれを破壊する化合物である。阻害性化合物は成長因子を分解から保護することによってその効果を発揮し得る。しかしながら、阻害性化合物は、例えば、成長因子補足ＴＳの創傷治癒のごとき所望の特性に必須であるいずれの活性も阻害しない。阻害性化合物の例はヘパリンである。
本明細書で用いる成長因子とは、細胞増殖、細胞分化、組織再生、細胞誘因、創傷修復および／またはいずれかの発生もしくは増殖プロセスを調節するいずれの可溶性因子をも含む。成長因子は、当業者に知られている、天然源からの抽出、合成化学による生産、組換えＤＮＡ技術およびウイルス不活化成長因子（類）−富血小板放出物を含めたいずれかの他の技術の使用による生産を含むいずれかの適当な手段によって生産することができる。成長因子なる語は、いずれの前駆体、突然変異体、またはそれが由来しまたは関連する成長因子のものと同様の生物学的活性を保有するその他の形態、またはそのサブセットも含むことを意図する。
本明細書で用いる、内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）およびＦＧＦ−１のごとき当業者に別の名称でも知られているＨＢＧＦ−１とは、ＨＢＧＦ−１αの前駆体であるＨＢＧＦ−１βを含めたＨＢＧＦ−１のいずれの生物学的活性形およびＦＧＦのごとき他の切形形態をもいう。ここに引用して本明細書の一部とみなすJayeらに対する米国特許第４，８６８，１１３号は、ＨＢＧＦの各形態のアミノ酸配列を記載している。かくして、ＨＢＧＦ−１は、ＨＢＧＦ−１の生物学的活性を呈する前駆体、切形もしくは他の修飾形態、またはその突然変異体、またはそのサブセットを含めたいずれの生物学的活性ペプチドも含む。
他の成長因子も別の命名法によって当業者によって知られているかも知れない。従って、１の名称による特定の成長因子への本明細書での言及は、該因子が当業者に取られているいずれかの他の名称も含み、また、その生物学的誘導体または前駆体、切形突然変異体、または他の修飾形態も含む。
本明細書で用いる生物学的活性とは、イン・ビボおよび／またはイン・ビトロで特定の成長因子に関連する１または全ての活性をいう。一般に、成長因子は、***促進活性（細胞増殖を誘導または維持する能力）および分化および／または発生を誘導しまたは維持する能力を含めた非***促進活性を含む、いくつかの活性を呈する。加えて、成長因子は、増殖および発生過程がそれから進行する特定の細胞を補給または誘因できる。例えば、適当な条件下で、ＨＢＧＦ−１は内皮細胞を補給し、それから血管の形成を指示する。この活性により、成長因子補足ＴＳは、それにより、特異的部位への血流および栄養物を増強する手段を提供し得る。
本明細書で用いる延長された寿命とは、目視的に観察できる有用なＴＳのイン・ビトロの寿命の少なくとも２倍増加を意味する。
本明細書で用いる無機質脱落骨マトリックス（ＤＢＭ）とは、骨が塩酸または他の酸で脱カルシウム化された後に残る骨の有機性マトリックスを意味する。
本明細書で用いる骨形態発生蛋白質（ＢＭＰ）とは、元々、ＤＢＭの骨−誘導体抽出物におけるその存在によって同定された一群の関連蛋白質を意味する。少なくとも８種の関連メンバーが同定されており、ＢＭＰ−１ないしＢＭＰ−８と命名されている。ＢＭＰ類は他の名称よっても知られている。ＢＭＰ−２はＢＭＰ−２Ａとしても知られている。ＢＭＰ−４はＢＭＰ−２Ｂとしても知られている。ＢＭＰ−３はオステオゲニンとしても知られている。ＢＭＰ−６はＶｇｒ−１としても知られている。ＢＭＰ−７はＯＰ−１としても知られている。骨形態発生蛋白質はＢＭＰ−１ないしＢＭＰ−８を含むが、それらに限定されるものではない。
本明細書で用いる増加とは、補足または非補足ＴＳを用いて動物身体の成分の内部または外部表面の外形を変化させることを意味する。
本明細書で用いる損傷骨とは、骨折し、破砕し、その一部を失った骨、または健康でない正常な骨である。
本明細書で用いる欠陥骨とは、その機能を果たすのに不適当な形状または容量を有する骨である。
本明細書で用いる骨またはＴＳを補足するのに使用されるＤＢＭは、粉末、懸濁液、ストリップまたはブロックあるいは必要に応じてその所望の機能を発揮する他の形態であり得る。
本明細書で用いる小器官とは、全体的にまたは部分的に、天然器官の機能を置き換える天然要素または人工的要素、あるいは天然および人工的要素の組合せよりなるものであってよい。その例は、インスリンの遺伝子を含有する発現ベクターでトランスフェクトした細胞によって囲まれた毛細血管のネットワークからなる人工膵臓であろう。かかる小器官は、Ｉ型糖尿病を持つ患者の血流にインスリンを放出するように機能するであろう。
補足ＴＳの調製
本明細書で開示する本発明のいずれもの態様を実施する場合の第１工程として、補足物およびＴＳを選択しなければならない。補足物およびＴＳは、当業者に知られた方法によって調製でき、本出願の方法に従って調製できる。好ましい態様において、成長因子、薬物またはＤＢＭ補足ＦＧを調製する。
本発明の態様のいずれにおいても、混合してＴＳを形成する前に、補足物をフィブリノーゲン、トロンビン、カルシウムおよび／または水成分に添加することができる。別法として、補足物（類）は、それらを混合してＴＳを形成しつつ成分類に添加することができる。
本発明の態様において、カルシウムおよび／またはトロンビンは、例えば、創傷におけるもののごとき体液から外因的に供給することができる。
ＴＳ類の調製
限定されるものではないが、血管補綴のごとき本発明のある態様において、および骨および軟骨増加において、細胞をそれに移動させおよび／またはそれを通って移動させるＴＳが好ましくは使用できる。
商業的に入手可能なＦＧのごときいずれのＴＳも本発明のいくつかの態様で使用できる。例えば、当業者によく知られているＦＧ類（例えば、引用して本明細書の一部とみなす米国特許第４，６７２．８７９号；第４，３７７，５７２号；および第４，２９８，５９８号）は、イムノ社（ＩＭＭＵＮＯ ＡＧ）（ウィーン、オーストリア）およびベーリングウェルケ社（ＢＥＨＲＩＮＧＷＥＲＫＥ ＡＧ）（ドイツ国）のごときその供給業者または製造業者から購入できる。局所化薬物送達のごときこれらの使用では、選択したＴＳの特定の組成物はそれが望まれるごとく機能する限り臨界的ではない。商業的に入手可能なＦＧ類には、限定されるものではないが、イン・ビトロ細胞増殖および／または分化；薬物送達；成長因子送達等を含めた、本発明の態様における使用のための成長因子、抗生物質および／または他の薬物を補足することができる。
本明細書に例示する実験では、ＦＧは、新鮮な凍結した血漿からの低温沈殿から調製した。使用したＦＧの成分は：フィブリノーゲン濃縮物；トロンビン；およびカルシウムイオンを含む。
本発明の好ましい態様において、調製したＦＧにおける合成蛋白質濃度は約０．０１ないし５００ｍｇ／ｍｌＦＧである。より好ましい態様において、調製したＦＧにおける合成蛋白質濃度は約１ないし１２０ｍｇ／ＦＧｍｌである。最も好ましい態様において、調製したＦＧにおける合成蛋白質濃度は約４ないし３０ｍｇ／ＦＧｍｌである。
本発明の好ましい態様において、ＦＧを調製するのに使用したフィブリノーゲン濃度は約０．００９ないし４５０ｍｇ／ｍｌ溶液である。より好ましい態様において、この調製溶液におけるフィブリノーゲン濃度は約０．９ないし１１０ｍｇ／ｍｌである。最も好ましい態様において、調製溶液におけるフィブリノーゲン濃度は約３ないし３０ｍｇ／ｍｌである。
好ましい態様において、ＦＧを調製するのに使用したトロンビン濃度は０．０１〜３５０単位（Ｕ）／ｍｌである。より好ましい態様において、トロンビン濃度は１〜１７５Ｕ／ｍｌである。最も好ましい態様において、トロンビン濃度は２〜４Ｕ／ｍｌである。
カルシウムイオン濃度はトロンビンの活性化を可能とするのに十分であることが重要である。好ましい態様において、ＵＳＰ塩化カルシウム濃度は０〜１００ｍＭである。より好ましい態様において、ＵＳＰ塩化カルシウム濃度は１〜４０ｍＭである。最も好ましい態様において、ＵＳＰ塩化カルシウム濃度は２〜４ｍＭである。本発明のいくつかの態様において、カルシウムは、例えば、創傷包帯剤態様におけるごとく、組織または体液によって供給され得る。
ＴＳを調製するにおいて、注射用の滅菌水を使用すべきである。
成長因子（類）、薬物類および他の化合物類の濃度は所望の目的に応じて変更し得るが、濃度はそれらがそれらの述べた目的を達成するのを可能とするのに十分大きくなければならない。本発明の好ましい態様において、成長因子濃度は約１ｎｇ／ｍｌないし１ｍｇ／ｍｌＦＧである。より好ましい態様において、成長因子濃度は約１μｇ／ｍｌないし１００μｇ／ｍｌＦＧである。最も好ましい態様において、成長因子濃度は約５μｇ／ｍｌないし２０μｇ／ｍｌＦＧである。本発明の好ましい態様において、ＴＥＴまたはＣＩＰ濃度は０．０１ないし３００ｍｇ／ｍｌＦＧである。本発明のより好ましい態様において、ＴＥＴまたはＣＩＰ濃度は０．０１〜３００ｍｇ／ｍｌである。本発明の最も好ましい態様において、ＴＥＴまたはＣＩＰ濃度は１〜１５０ｍｇ／ｍｌである。添加すべき補足物の濃度は、種々の濃度をテストし、意図する目的および適用部位に効果的なものを選択することによって当業者が実験的に決定できる。
成長因子の調製
成長因子（類）、またはその混合物は当業者に知られた方法によって調製できるか、あるいは商業的に購入できる。限定されるものではないが、内皮細胞、線維芽細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、肝細胞およびケラチノサイトのごときある種の細胞型の増殖および／または誘因を刺激する成長因子、および／または同細胞型および平滑筋細胞の増殖を阻害する成長因子を含めたいずれの成長因子も選択できる。かかる選択は、成長因子補足ＴＳが適用される特定の組織部位および／または所望の効果の型に依存し得る。例えば、ＥＧＦ補足ＴＳは、眼における創傷への適用に、および胃潰瘍を治療するのに好ましく、他方、オステオゲニン補足ＴＳは、その治癒を促進するために、骨折および骨破損への適用に好ましいであろう。
もう１つの好ましい態様において、ＨＢＧＦ−１βを調製し、ＦＧに添加する。ＨＢＧＦ−１βまたはＨＢＧＦ−１α、あるいはＨＢＧＦ−１のいずれかの他の活性形を、天然源から、ＨＢＧＦ−１を発現する遺伝子工学で作製した細胞もしくはその誘導体から、または当業者に知られたいずれかの方法によって精製できる。
ＨＢＧＦ−１βは、組換えＤＮＡ法を用いて調製されている（Jayeらの米国特許第４，８６８，１１３号；Jayeら．J. Biol. Chem. 262:16612-16617（1987））。略言すれば、ＨＢＧＦ−１βをコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターｐＵＣ９誘導体にクローン化し、イー・コリ（E. coli）において細胞内で発現させた。発現されたペプチドを、次いで、高圧縮−脱圧縮サイクルで作動させる細胞破壊機を用い、圧力によって細胞から放出させた。破壊後、細胞夾雑物を濾過によって除去し、ＨＢＧＦ−１βを、ヘパリンセファロース（セファロース）^TM上のアフィニティークロマトグラフィー、続いてのＣＭ−セファロース^TM上でのイオン交換クロマトグラフィーを含めた蛋白質精製の標準的方法を用いて上清から精製した。
前記したＨＢＧＦ−１に加えて、ＦＧに添加することができる他の成長因子は、限定されるものではないが、ＨＢＧＦ−２、ＩＧＦ−１、ＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α、いずれかの血小板由来成長因子または抽出物、ＭＢＰ類、およびいずれかの成長因子の混合物を含む。例えば、成長因子の豊富な源として供される血小板由来抽出物を、ＨＢＧＦ−１のごとき他の成長因子の外に、またはそれに代えてＴＳに添加することができる。
好ましい態様において、当業者に公知の方法によって調製した血小板由来抽出物をＴＳに添加する。かかる抽出物はＦＧでの使用のために血漿由来血小板から調製されている。
血小板由来創傷治癒因子（ＰＤＷＨＦ）を調製し、ＦＧに添加することもできる（Knightonら，Ann. Surg. 204:322-330（1986））。略言すると、ＰＤＷＨＦを調製するには、血液を吸って抗凝固剤溶液に入れ、冷蔵遠心によって富血小板血漿を調製する。血小板を単離し、アルファ顆粒の内容物を放出させるトロンビンで刺激する。血小板を除去し、有効濃度の残存する抽出物をＴＳに添加する。
成長因子補足ＴＳのさらなる成分
それらは実質的に血漿画分であるので、成長因子での使用に考えられるＴＳ類は多数の成分を含有し、そのうちいくつかは選択した成長因子（類）の生物学的活性に干渉し得る。例えば、ＦＧの必須成分であるトロンビンは蛋白分解酵素として作用し、ＨＢＧＦ−１βを特異的に切断できる。従って、選択した成長因子（類）を、成長因子（類）の生物学的活性に干渉しまたはそれを破壊するＴＳ中の他の成分の作用から保護する、プロテアーゼまたは他の阻害剤のごときさらなる化合物類を含ませることが必要であろう。
個々の阻害性化合物（類）の選択は、ＴＳ中の成長因子（類）の生物学的活性を評価する後記の方法を用いて経験的に決定できる。生物学的活性を評価する方法は当業者に公知である。
加えて、ある種の成長因子がそれらの生物学的活性を呈するためには、所望の活性を促進しまたは媒介する化合物を含ませることが必要であろう。例えば、ヘパリンはイン・ビボでＨＢＧＦ−１の生物学的活性を促進する（例えば、Burgessら，Annu. Rev. Biochem. 58:575-606（1989））。
本発明の補足ＴＳは薬物類、他の化学物質類および蛋白質類のごとき化合物を含有することができる。これらは限定されるものではないが、ＴＥｔ、シプロフロキサシン、アモキシリン、またはメトロニダゾールのごとき抗生物質、活性化プロテインＣ、ヘパリン、プロスタサイクリン（ＰＧＩ₂）、プロスタグランジン類、ロイコトリエン類、抗トロンビンＩＩＩのごとき抗凝固剤、ＡＤＰアーゼ、およびプラスミノーゲンアクチベーター；デキサメタゾンのごときステロイド類、プロスタサイクリン、プロスタグランジン類、ロイコトリエン類の阻害剤および／または炎症を阻害するキニン類；カルシウムチャンネルブロッカーのごとき心血管薬物類；化学誘因物質：ブピバカインのごとき局所麻酔剤；および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、タキソールおよび／またはタキソテーレのごとき抗増殖性／抗腫瘍薬物類を含み得る。また、これらの補足化合物類はポリクローナル、モノクローナルまたはキメラ抗体、またはその機能的誘導体または断片を含み得る。それらは、例えば、ＰＤＧＦ、および／またはＴＧＦ−βに対する抗体のごとき平滑筋増殖を阻害する、あるいはＴＳで処理した領域内またはその回りの他の望まない細胞型の増殖を阻害する抗生物質であり得る。また、これらの抗体は、抗癌、抗−血小板または抗炎症活性が必要とされる状況において有用であり得る。一般に、その効果が部位特異的送達によって改良され得るいずれの抗体もそのＴＳ送達系で使用する利点を有する。
成長因子補足ＴＳの創傷治癒特性を評価するアッセイ
特定の成長因子補足ＴＳが創傷治癒を促進するか否かを確認するために、およびそうするための成長因子（類）の最適濃度を選択するために、当業者に知られたいずれかの手段によってテストすることができる（例えば、Tsuboiら，J. Exp. Med. 172:245-251（1990）；Ksanderら，J. Am. Acad. Dermatol. 22:781-791（1990）；およびGreenhalghら，Ann. J. Biol. 136:1230（1000）参照）。それによってＴＳ組成物における選択した成長因子（類）の活性を評価できるイン・ビボおよびイン・ビトロの両アッセイを含めたいずれかの方法を使用することができる。例えば、ＨＢＧＦ−１βの活性は２つの独立したイン・ビトロアッセイを用いて評価されている。第１のものにおいて、成長因子補足ＦＧを含浸させたプラスチック表面を覆う狭い流体層に懸濁した内皮細胞の増殖を測定した。第２のものにおいて、ＨＢＧＦ−１の存在下における培養線維芽細胞への³Ｈ−チミジンの取込を測定した。
イン・ビボアッセイにおいて、ＨＢＧＦ−１βを補足したＦＧを、マウスをモデル系として使用するイン・ビボでの治癒を促進するその能力についてテストした。この方法では、同一のパンチバイオプシーをマウスの背面領域で作製し、次いで、これをテスト群、処理対照群および未処理対照群に分離した。テスト群におけるマウスの創傷を成長因子補足ＴＳで処理した。処理対照群におけるマウスの創傷を非補足ＴＳで処理した。未処理群における創傷はＴＳで処理しなかった。検出可能な創傷治癒が進行するのに十分な時間、一般に１週間ないし１０日後に、マウスを犠牲とし、創傷組織を鏡検して、各群における創傷修復の程度を組織学的に評価した。
また、成長因子補足ＴＳが細胞増殖を誘導し、細胞を補給する能力も当業者に知られたイン・ビトロ方法によって評価できる。例えば、成長因子の生物学的活性を測定するにつき前記した、および実施例にい詳細に記載したイン・ビトロアッセイを用いて、ＴＳ組成物中の成長因子の活性をテストすることができる。加えて、阻害性および／または促進性化合物類を添加する効果も評価できる。
一般に、阻害性および／または促進性化合物類を添加する必要性は経験的に決定できる。例えば、後記する実験では、ＨＢＧＦ−１補足ＦＧにおけるＨＢＧＦ−１βは、確立論的方法にて特異的に切断され、これは、ＦＧ調製物の成分、最もありそうなのはトロンビンに帰すことができることを示唆する。ＨＢＧＦ−１に結合し、それをある種の蛋白分解活性から保護するヘパリンをＨＢＧＦ−１−補足ＦＧに添加した。比較的低濃度のヘパリンの添加は、ＨＢＧＦ−１βを、ＦＧにおけるその生物学的活性を破壊するであろう切断から保護した。従って、ＨＢＧＦ−１を含むＴＳ組成物はヘパリンまたは、トロンビンまたはＦＧの他の蛋白分解成分によるＨＢＧＦ−１の切断を阻害するいくつかの他の物質を含むことができる。
同様に、ＴＳ成分による分解から成長因子を保護する選択した阻害剤の能力は、当業者に公知のいずれかの方法によって評価できる。例えば、ヘパリンは、ＦＧの必須成分であるトロンビンによるＨＢＧＦ−１の切断を阻害するその能力につきテストした。そうするために、種々の濃度のヘパリンおよびＨＢＧＦ−１補足ＦＧの混合物を調製し、種々の時間インキュベートした。混合物中のＨＢＧＦ−１の生物学的活性をテストし、ＳＤＳゲルのウェスタンブロットを用いてＨＢＧＦ−１の総体（integrity）を確認した。相対的低濃度、約１：１のモル比のヘパリン：ＨＢＧＦ−１がＨＢＧＦ−１をＦＧにおける分解から保護するのに十分である。
また、特定の化合物を、ＴＳにおける成長因子（類）の生物学的活性を促進、媒介または増強するのに使用できるか否かを実験的に決定できる。
内部または外部創傷への成長因子補足ＴＳの局所または内部適用
臨床的使用に先立ち、成長因子およびＴＳ、または成長因子補足ＴＳを殺菌し、あるいは処理してウイルスのごときその中のいずれの病原体汚染も不活化した。汚染を不活化する方法は当業者によく知られており、限定されるものではないが、溶媒−界面活性剤処理および加熱処理を含む（例えば、Taborら，Thrombosis Res. 22:233-238（1981）およびPiszkiewiczら，Treanfusion 28:198-199（1988））。
補足ＴＳは創傷、他の組織または他の所望の場所に直接適用される。典型的には、外部創傷では、創傷の頂部へのスプレイを含むいずれかの手段によって直接適用することができる。また、それは、外科手術法の間のごとく内部適用できる。骨のごとき内部適用する場合、血餅は徐々に時間と共に溶解する。
内部または外部創傷のための補足または非補足ＴＳの自己含有適用
ＴＳ類は、ＦＧの必要なトロンビンおよびフィブリノーゲンを含有する自己含有創傷包帯剤、またはフィブリンシーラント包帯として処方できる。自己含有包帯剤または包帯は使用が容易で、使用するために進んだ技術や技量を要しない。それは、医療助力が利用できるようになるまで生命を維持する緊急の応急手段として自己投与さえできる。
自己含有ＴＳ創傷包帯剤またはフィブリンシーラント包帯は、実践的調製物を長期間保存でき、かつ成分の可溶化および混合に関連した時間的遅れなくして出血する創傷の迅速なＴＳ処置を供するのに使用できる点で現行技術よりも進んでいる。これらの特性は、兵士用の外傷パック、救助労働者、救急車／救急医療士チーム、消防士のごとき野外適用における、および特に災害状況における病院および診療所の緊急室個人による初期外傷および応急治療における使用にそれを理想的とする。また、小バージョンは一般公衆によるまたは医療実践者による使用のための応急キットで有用性を有し得る。
自己含有ＴＳ創傷包帯剤またはフィブリンシーラント包帯は、組織シーラントまたは前記したタイプのフィブリン複合体からなる組織シール性組成物を含む。例えば、組成物は、フィブリン血餅を生じるのに十分に第ＸＩＩＩ因子と共に、精製されたフィブリノーゲン、トロンビンおよび塩化カルシウムよりなるものとできる。１の態様において、フィブリノーゲンおよび第ＸＩＩＩ因子成分は局所フィブリノーゲン複合体（ＴＦＣ）の形態で供給される。
ヒト患者に使用する場合、成分類は、最も好ましくは、ヒト源由来の病原体不活化精製成分類である。特に、それへの添加剤を含めた本発明の成分類は界面活性剤／溶媒で処理し、および／または例えば殺菌または限外濾過によって処理してウイルスのごときその中のいずれの病原体汚染も不活化する。汚染を不活化する方法は当業者によく知られており、限定されるものではないが、溶媒−界面活性剤処理および加熱処理を含む。溶媒−界面活性剤処理は、蛋白質性成分が不可逆的熱変性に暴露されない点で特に有利である。
カルシウムおよび／または第ＸＩＩＩ因子成分はトロンビンおよび／またはフィブリノーゲン成分類に含有させることができ、および／または創傷から出てくる流体に存在する患者の内因性カルシウムを吸収することができる。また、トロンビンは内因的に供給することもできる。トロンビンまたはフィブリノーゲン成分のいずれかまたは双方には、以下の態様の各々において、（成長因子または薬物の生物学的活性いずれかに干渉し得るシーラントの活性を阻害するための）阻害性化合物類、および（成長因子または薬物の生物学的活性のいずれかを促進し、媒介しまたは増強するための）促進性化合物、フィブリン血餅の破壊を阻害する化合物類、または色素を補足することができるが必ずしもそうする必要はない。
成長因子は、例えば、線維芽細胞成長因子−１、線維芽細胞成長因子−２および線維芽細胞成長因子−４；血小板由来成長因子；インスリン−結合成長因子−１；インスリン−結合成長因子−２；表皮成長因子；形質転換成長因子−α；形質転換成長因子−β；軟骨−誘導因子−Ａおよび−Ｂ；類骨−誘導因子；オステオゲニンおよび他の骨成長因子；コラーゲン成長因子；ヘパリン−結合成長因子−１；ヘパリン−結合成長因子−２；および／またはそれらの生物学的に活性な誘導体を含み得る。
薬物は鎮痛剤；防腐剤、抗生物質、または感染を阻害し、創傷治癒を促進しおよび／または瘢痕形成を阻害できるする抗増殖剤のごとき他の薬物（類）であり得る。同時に放出させるために１を超える薬物を組成物に添加することができ、あるいは所定の時間−放出方法にて放出させることができる。かかる薬物は、例えば、タキソール、テトラサイクリン遊離塩基、テトラサイクリン塩酸塩、シプロフルキサシン塩酸塩または５−ＦＵを含み得る。タキソールのフィブリンシーラント複合体への添加は特に有利であり得る。さらに、薬物は血管収縮剤、例えば、エピネフリンであってよく；あるいは他の薬物、例えばアプロチニンを添加して組織シーラントまたはフィブリン血餅を安定化させることもできる。補足物（類）はその意図する目的が効果的となるようなＴＳ中の濃度とし、例えば抗生物質は微生物の増殖を阻害し、鎮痛剤は苦痛等を緩和するであろう。
色素、マーカーまたはトレーサーを、例えば、フィブリン血餅が創傷に侵入する程度を示すために、あるいはフィブリン血餅の引き続いての吸収を測定するために添加することができるか、あるいは色素を診断目的で所定の時間−方法様式にて組織シーラントから放出させることができる。色素、マーカーまたはトレーサーは生理学的に適合するものでなければならず、トルイジンブルーのごとき水溶性色素を含めた着色色素、および当該分野で知られている放射性または蛍光マーカーまたはトレーサーから選択することができる。また、色素、マーカーまたはトレーサーは、組織シーラントの１以上の成分に化学的にカップリングできる化合物であり得る。加えて、マーカーは、創傷組織から出てくるプロテアーゼへの暴露に際して起こるごとき蛋白分解への暴露に際して、色を変化させあるいは色を発色し、その強度を定量できる、当該分野で知られている蛋白質性物質の中から選択できる。
さらに、ＴＳを使用して創傷または損傷骨または骨化組織を置き換えまたはそれを修復する場合、組成物に有効量の無機質脱落骨マトリックスおよび／または骨形態発生蛋白質、および／またはそれらの生物学的に適合する誘導体を補足することもできる。
自己含有ＴＳ創傷包帯剤またはフィブリンシーラント包帯のフィブリノーゲンおよび／またはトロンビン成分の濃度は、最終フィブリンマトリックスの密度および凝固速度に対して有意な効果を有し得る。この原理を用いて、特殊な状況において、自己含有ＴＳ創傷包帯剤またはフィブリンシーラント包帯の特異的使用を満足させることができる。例えば、動脈創傷の治療は、フィブリン血餅が非常に迅速に凝固し、加圧血流に耐えるのに十分な一体性を必要とするであろう。他方、創傷における深い間隙を充填する場合には、治療は、フィブリン血餅が凝固する前に成分が創傷を完全に満たすことが必要となろう。
ゲルパック態様
自己含有包帯剤のゲルパック態様において、トロンビンおよびフィブリノーゲン成分を独立した素早く蒸発するゲル層（例えば、メチルセルロース／アルコール／水）個々に含有させ、ここに、２のゲル層は不浸透性膜によって相互に分離され、該対は外方の保護のための第２の不浸透性膜で被覆されている。該包帯は、ゲルパッドが使用の間に所定の箇所に止まることを保証するためにゲルと接触する表面に被覆することができる（図３９参照）。
使用において、２のゲル層を分離する膜を除去し、２成分を混合させる。次いで、外方膜を除去し、包帯を創傷部位に適用する。トロンビンおよびフィブリノーゲン調製物の他の成分の作用は、他のＦＳ適用につき従前に開示されているように、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を引き起こす。この結果、血液および流体の創傷からの喪失が自然に阻害され、感染に対して自然のバリアーが確立される。
同様のゲルパック態様において、トロンビン成分、およびトロンビンゲルおよびフィブリノーゲンゲルを分離するプラスチック膜双方を省くことができる。操作において、外方不浸透プラスチックフィルムを除去し、前記したごとくに、創傷部位に包帯を直接適用する。トロンビンおよびカルシウムは創傷部位に天然に存在し、従って、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を誘導し、前記したごとく血液および流体の創傷からの喪失を阻害する。
ゲルパックのこの別の態様は、簡便で、安価で、生産するのが容易であるという利点を有する。しかしながら、患者の創傷がフィブリノーゲンゲルをフィブリン組織シーラントに効果的に変換するのに不十分なトロンビンを有する状況があり得る。その場合には、前記した本発明のゲルパック態様におけるごとく、トロンビン成分を外因的に適用しなければならない。
フィブリンシーラント包帯態様
フィブリンシーラント包帯態様は、患者において創傷組織に組織シーラント組成物を適用するために処方され、ここに該包帯は、順番に（１）閉塞性裏打ち；（２）該裏打ちの創傷に面する表面上の生理学的に許容される接着剤層；および（３）（ａ）乾燥したウイルス不活化精製フィブリノーゲン複合体、（ｂ）乾燥したウイルス不活化精製トロンビンの有効量の組合せ、および必要に応じて（ｃ）水和に際して組織シール性フィブリン血餅を生じるのに有効な量のカルシウムおよび／または第ＸＩＩＩ因子からなる乾燥物質の層からなり、ここに、乾燥物質の該層は接着層の創傷に面する表面に付着されている。１の態様において、閉塞性裏打ちおよび生理学的に許容される接着剤層は、もし裏打ち層が乾燥物質の層を効果的に結合させるのに十分な位接着性であれば、１つであって同一である。
もう１つの態様において、長期間の安定な貯蔵のために、除去可能な耐水性の保護フィルムを乾燥物質の層および包帯の露出した接着剤表面上に置く。操作において、耐水性の保護フィルムを、創傷組織上の包帯の適用に先立って除去する。
１の態様の組織シーラント成分は包帯を創傷組織に適用する時に活性化させて、出血する創傷から出てくる患者の内因性流体によって組織シール性フィブリン血餅を形成させる。好ましくは、組織シーラントを水和させ、創傷からの流体喪失は創傷組織への包帯の適用の数分内に有意に排除される。フィブリン血餅が形成され凝固するスピードは適用によって幾分指示されるが（例えば、動脈創傷および出血する組織損傷にための迅速な凝固、骨組織に対する創傷の処理のための遅い凝固）、好ましくは、フィブリン血餅は適用後２０分以内に形成されるであろう。より好ましくは、この効果は、包帯の適用後１０分以内に明らかとなるであろう。最も好ましくは、フィブリン血餅は適用後２ないし５分内に形成されるであろう。フィブリン血餅を最も迅速に形成することからなる態様において、組織シールは適用後１−２分内、より好ましくは１分以内、最も好ましくは３０秒以内に実質的に形成される。
組織シール性フィブリン血餅が創傷部位上に形成されるまでフィブリンシーラント包帯を適用するにおいては圧力を使用する必要があろう。
別法において、創傷からの流体喪失が乾燥した組織シーラント物質の適当な水和を供するのに不十分である状況、あるいは生命の危険な状況におけるごとく時間が重要な状況において、組織シーラント組成物を、創傷組織への包帯の適用に先立って、適当な生理学的に許容される液体によって水和させる。
包帯を構成するためには、例えば、凍結乾燥によって乾燥物質を得ることができ、あるいは適当な商業的に入手可能な物質を利用できる。また無水ＣａＣｌ₂を乾燥ＴＳ組成物に添加して、フィブリンシーラント包帯の水和に際してフィブリン形成速度を加速することもできる。乾燥物質の接着剤または裏打ち層への結合は、結合剤、好ましくは水溶性結合剤を乾燥成分に添加することによって促進することができる。
フィブリンシーラント包帯の裏打ちは通常の再吸収可能な材料、例えば、シリコーンパッチまたはプラスチック材料とすることができ、あるいは生分解性の再吸収可能な材料とすることもできる。裏打ち材料は送達デバイス以上として作用し得る。その好ましい組成物はフィブリンシーラント包帯の所望の適用によって決定される。例えば、非再吸収性裏打ちは、それがフィブリン血餅に強度および保護を供する場合には、多くの外部使用に適する。別の態様において、非再吸収性裏打ちは、例えば、繊維で補強して、フィブリン血餅上を被覆する保護のために過剰の強度および持続性を供する。
裏打ちでの血餅の引き続いての除去は、フィブリンシーラント包帯を、医療助力が利用できるようになるまでのか応急手段として使用される場合のごとき、多くの状況では許容される。かかる状況において、血餅はその目的を達して、生命を脅かす流体の喪失を防ぎ、創傷の適当な処置または外科的修復を可能とするためにさらなる組織損傷を引き起こすことなく血餅を除去するのが望ましいであろう。
別法において、非再吸収性裏打ちを用いて、例えば、動脈創傷におけるごとく出血する流体が加圧下で出てくる場合には、その形成の間に組織シール性フィブリン血餅に強度を与えることができる。しかし、かかる創傷が内部のものであれば、組織シールを乱すことなくフィブリン血餅から裏打ちを除去するのが有利である。従って、フィブリンシーラント包帯は、接着剤層がフィブリン血餅のそれよりも低い勢断強度を有する材料であり、創傷を囲むフィブリン血餅または組織に対する損傷なくして裏打ちを除去するのが可能となる場合に供される。
比較により、ある種の内部適用は、包帯剤のひき続いての除去の必要性をなくするために、再吸収性裏打ちの使用を要求する。再吸収性材料は、いずれの他の代謝の乱れも引き起こすことなく、有意には治癒および／または組織の再生または機能と干渉しないように消費されまたは排出される化合物に自然に、または身体によって分解されるものである。ホメオスタシスは維持される。生分解性裏打ちを調製するのに適した材料は、蛋白質性物質、例えば、フィブリン、コラーゲン、ケラチンおよびゼラチン、または炭水化物由来物質、例えば、キチン、キトサン、カルボキシメチルセルロースまたはセルロース、および／またはそれらの生物学的適合誘導体を含む。
接着剤層は、もし閉塞性裏打ち層から分離していると、フィブリンシーラント包帯の意図した適用に基づいて選択され、通常の接着剤材料よりなるものとできる。防腐剤を接着剤層に添加することができる。
外科手術に先立ってのごとく、組織シール性フィブリン血餅を閉塞性裏打ちにて創傷から除去すべきであれば、接着剤は、乾燥物質層を閉塞性裏打ちに付着させ、フィブリンの剪断強度よりも大きい接着剤の水和後能力を維持するのに十分でなければならない。
もし組織シール性フィブリン血餅を創傷上の所定の箇所に残すべきであるが、閉塞性裏打ちを適用後に除去しなければならないならば、接着剤は、乾燥物質層を閉塞性裏打ちに付着させるのに十分に暗い粘着性でなければならないが、フィブリン血餅の剪断強度よりも小さい接着剤の水和後強度を有しなければならない。別法において、接着剤層は、乾燥物質の水和の間に可溶化され、あるいは粘着性が低くなり、フィブリン血餅からの裏打ちの除去を可能とするものでよい。かかる目的での別法において、乾燥物質層は閉塞性包帯に直接付着させることができる。
もう１つの態様において、接着剤層は組織シール性フィブリン血餅を乱すことなく閉塞性層の水和後の除去を可能とする２つの異なる接着剤よりなる。典型的には、かかる状況においては、乾燥した組織シーラント成分材料は裏打ちの特別の領域、「内方領域」、例えば、中央に付着させ、接着剤の塞がれない領域は乾燥物質の領域、「外方領域」を超えて伸びる。
接着剤の外方領域は、包帯の乾燥物質領域が創傷上に直接フィブリン血餅を形成するように、創傷を囲むまたはそれに隣接する皮膚または組織に直接付着させる。包帯の乾燥物質層によって覆われない裏打ちの領域上の接着剤は、その物理的除去まで、フィブリンシーラント包帯を創傷を囲むフィブリンシーラント包帯を付着させるのに十分なものとする。外方領域上の接着剤は、加圧下の創傷、例えば動脈創傷からもし流体が出てきても、包帯を所定の箇所に保持するのに十分なものでなければならない。
接着剤の内方領域は、乾燥物質層を裏打ちに付着させるのに十分な位粘着性であるが、フィブリン血餅の剪断強度よりも小さい接着剤の水和後能力を有するものである。別法において、接着剤の内方領域は、乾燥物質の水和の間に可溶化されまたは粘着性がより低くなり、裏打ちのフィブリン血餅からの除去を可能とする材料である。かかる目的の別法において、乾燥物質層は、直接閉塞性包帯に内方領域にて付着させることができ、接着剤層は外方層のみに適用される。
かくして、２つの接着剤態様において、フィブリンシーラント包帯の裏打ちは、包帯を物理的に除去するまで創傷を囲む組織に所定の箇所にて付着させたままとする。しかし、除去に際しては、組織シールを乱すことなく、裏打ちを組織シール性フィブリン血餅から分離する。
フィブリンシーラント包帯の二重カプセル化態様
フィブリンシーラント包帯のなおさらなるもう１つの態様において、有効量の炭酸化水またはＰＢＳのごとき生理学的に許容される緩衝化水和剤、または匹敵するゲルからなる独立した水和層を、破壊可能な液体不浸透性容器内に含有させる。水和層をカプセル化する破壊可能な液体不浸透性容器は、前記閉塞性包帯にまたは閉塞性包帯に隣接する前記接着剤層に直接付着させる。水和層をカプセル化する破壊可能な液体不浸透性容器の露出側（裏打ちまたは接着剤層に付着させない側）に付着して、前記したごとく、微細に粉砕した粉末化フィブリン成分の乾燥層がある。乾燥成分の層は、粉末化フィブリノーゲン、またはフィブリノーゲン複合体、トロンビン、および要すれば、水和に際してフィブリン血餅を形成するのに十分なカルシウムおよび／または第ＸＩＩＩ因子を含む。
二重層（乾燥層および水和層）は、外方の保護のための第２不浸透性膜と共に、閉塞性裏打ちに当該層を付着させる閉塞性裏打ちまたは接着剤物質と接触せずに全ての表面を一緒に覆う。かくして、この二重層態様において、内容物は不浸透性容器内に完全にカプセル化され、ここに、一方側は閉塞性裏打ち材料であって、他方側および全てのエッジは外方の保護のための第２不浸透性膜によって形成される。
操作において、水和層をカプセル化する内方液体不浸透性容器は物理的に破壊されて、そこに含有される水和物質を乾燥フィブリン成分層に放出させ、その結果、十分に水和した組織シール性フィブリン血餅が生じて、創傷からの血液および流体喪失を阻害し、感染に対する天然のバリアーを供する。外方の第２不浸透性膜は、放出された水和物質、順応性フィブリン複合体が形成されるまで乾燥成分と接触させておき、その時点で、外方膜は物理的に除去され、包帯は創傷上に置かれて組織シーラントを形成する。
別法において、外方膜を物理的に除去し、組織シール性フィブリン血餅が創傷組織上に直接形成されるように、内方液体不浸透性容器を破壊し、水和剤が乾燥フィブリン成分類に放出される方法で、二重層に力をかけて創傷領域に適用する。
フィブリンシーラント包帯の他の態様におけるごとく、選択した接着剤および裏打ち材料は、包帯の意図した適用によって決定できる。裏打ちは除去可能であるか、あるいは再吸収性であり、接着剤は包帯の除去に際して組織シーラントを創傷を除去する、または組織シール性フィブリン血餅を乱さないようにしておくという意図した目的を有する。接着剤は別々に結合した層であるか、あるいは裏打ちがそれ自体乾燥フィブリン成分を付着させる接着剤として作用する。
フィブリン複合体を形成するのに必要であるトロンビン、カルシウムおよび第ＸＩＩＩ因子は、乾燥物質層中に乾燥物質（類）として添加しておくか、あるいはそれらは水和層中に液体またはゲル形態で含ませて置くことができる。さらに、それらは、必要なフィブリン形成性成分が存在し、乾燥層が包帯が使用されるまで水和されずにいる限り、２の層の間に分割することができる。加えて、従前に開示したごとき成長因子、抗生物質、防腐剤、抗増殖薬物等のごとき添加剤もフィブリンシーラント包帯の本態様に含ませることができる。
もし水和層が気体で過飽和した液体を含有するならば、乾燥物質層は発泡性で発泡体を形成するフィブリン組織シーラントとして水和されるであろう。別法において、乾燥物質層に、気体を生じる、かくして水和剤と接触して発泡する物質を補足することができる。
もし水和層が速蒸発性ゲル層（例えば、メチルセルロース／アルコール／水）のごときゲルの形態であれば、回りの不浸透性バリアーの破壊は、前記したごとく乾燥物質フィブリン成分を直接水和層に接触させて、組織シール性フィブリン血餅を生じさせる。液体水和層につき記載したのと同様に、ゲル層はフィブリン複合体のトロンビン、カルシウムまたは第ＸＩＩＩ因子のうちのいずれか１種または全て、および／または前記添加剤のうちのいずれか１種を含むことができる。
別の二重層において、組織シーラントを、裏打ちに付着させる必要のない創傷シーリング包帯剤として送達する。成分はカプセル内の実質的にカプセルとして組織され、ここにカプセルなる語は材料というよりもむしろ広い概念を定義するのに用いる。前記カプセル化水和層は、それ自体、乾燥フィブリン成分物質およびカプセル化水和層を共に含有する、第２のカプセル化ユニット内に含有される。
操作において、水和層をカプセル化する内方液体不浸透性容器を物理的に破壊して、そこに含まれる水和物質を乾燥フィブリン層に放出させ、その両者は外方第２カプセル化ユニット内に完全に含有されたままである。水和層をカプセル化する内方容器を物理的に破壊する場合、外方第２カプセル化ユニットの全体が破壊されるのではない。
外方カプセル化ユニット内の水和層と乾燥フィブリン成分との混合の結果、十分に水和されたシーリングフィブリン血餅が得られ、次いで、これは創傷組織へと放出または排出されて組織シールを形成する。フィブリン塊を放出させるには、外方カプセル化ユニットを、ランダムにあるいは表面上の特定の位置にて物理的に切断しまたは引き裂いて、流動噴流を形成させ、順応性フィブリン塊の流れを創傷部位に向ける。
もし水和層が気体で過飽和した剤であれば、水和剤と乾燥フィブリン成分との混合の結果、発泡性混合物が得られ、次いで、これを創傷組織に適用する。別法において、発泡は乾燥成分層の水和によって達成することができる。
自己発泡性フィブリンシーラント態様
患者なおいて創傷組織を治療するための自己発泡性フィブリンシーラント包帯剤態様は、（１）ウイルス不活化精製フィブリノーゲン、（２）ウイルス不活化精製トロンビンのフィブリン形成有効量の組合せ、および必要に応じて（３）カルシウムおよび／または第ＸＩＩＩ因子からなる発泡性フォームとして処方され、ここに、該組成物は十分な厚みの皮膚創傷治癒を有意に阻害しない。従前に記載されているＴＳ成分は、該成分が発泡性フォームとして創傷部位に送達させ、それが数分内にフィブリンシールを形成するように、圧縮プロペラントを有する容器またはタンク中に貯蔵される。
発泡性フォーム態様の許容される処方は、フィブリン血餅の水和成分を提供し、これは操作において２０倍まで発泡する。しかしながら、組織シール性フィブリン血餅の発泡の程度はその意図した適用によって決定される。
例えば、腹部内での発泡性フォームシーラント包帯剤の使用は、感染に対するバリアーも供しつつ、損傷した内部組織器官または血管からの血液または流体喪失を有意に減少または防止するフィブリン組織シーラントを提供する。しかしながら、同時に、フォームの発泡は組織、器官または血管に対する有害な圧力を防止するように制御されなければならない。かかる状況は、発泡が１または２倍で５〜１０倍以下に限定される発泡性フォーム包帯剤の使用を保証できる。
比較すると、骨内の間隙を満たすための発泡性フォームフィブリンシーラント包帯剤の使用は、かなり大きい速度で発泡して密で強固なシールを創傷領域上に生じる物質の使用を保証する。また、動脈創傷は高圧縮フォーム組織シーラント包帯剤にもよく応答する。かかる物質の発泡の程度は、好ましくは１０〜２０倍、より好ましくは５〜１０倍であるが、２０倍を超える範囲であってもよい。１ないし２倍を含めた５倍未満の発泡も、例えば、内部耳のごとき小さな領域において血管または損傷骨の修復に適用することができる。
発泡速度と同様に、発泡性フォームフィブリン包帯剤を用いるフィブリンシールの形成のための硬化時間もその意図した適用に関係する。ある状況では、動脈創傷または損傷した心臓組織を患う患者におけるごとく、生命が失われるのが切迫し得る。かかる状況では、フィブリン包帯剤を非常に迅速に発泡させ、できるだけ素早くフィブリン組織シールを形成させなければならない。好ましくは、該シールは硬化させ、２分以内、より好ましくは１〜２分内に、最も好ましくは１分以内に患者の流体喪失を有意に減少させる。
他方、全ての創傷が直ちに生命を脅かすものではない。例えば、骨組織の組織シーラント修復の強度は迅速な硬化時間よりも重要である。かかる状況では、組織シール性フィブリン血餅の組成物を修飾して、フィブリンフィブリルのより大きな架橋または粘稠化を可能とし、あるいは長期間発泡し続けるより希薄な組成物の送達を可能とする。かかる処方は、組織シール性フィブリン血餅を硬化させるのにわずかに長い時間を可能としまたはそれを要する。１分以下の硬化時間はかかる適用に適し、１〜２分または５分までの硬化時間が許容されるであろう。当業者に認識可能な状況において、５〜１０分の、あるいは２０分までもの長い硬化時間は生命を脅かさない状況で許容されるであろう。
送達デバイス、例えば、小型容器、タンク等は特に本適用のために開発することができ、それらは商業的に入手可能である。小型容器は単一または多数の貯蔵器いずれかであってよい。別々の貯蔵器は、より高価ではあるが、有利には、水和した成分がそれらが適用に際して混合されるまで別々であってかつ安定であるようにする。
プロペラントは生理学的に許容され、薬理学的適用に適するものでなければならず、また、便宜には、加圧下の知られたプロペラント、例えば、ＣＯ₂、Ｎ₂、空気またはフレオンのごとき不活性ガスを含み得る。別法において、乾燥フィブリン成分には、気体を生成し、それにより、水和剤との接触に際して発泡する物質（類）を補足することができる。
送達デバイスからの発泡性フォームフィブリン包帯剤の送達圧は、フィブリン血餅自体の組成およびその硬化時間を組み合わせると、包帯剤の発泡の程度を決定するので、送達圧は処置すべき創傷の性質によって決定される。前記したごとく、ある種の創傷は生命の喪失を防止するために組織シール性フィブリン血餅が直ちに形成されるのを必要とし、他方、他の創傷はゆっくりとした送達または組織シール性組成物を強化するために強い架橋を形成する時間を必要とする。従って、送達圧は理想的には状況特異的である。
１気圧またはそれ未満（１４．７ｌｂｓ／インチ²）の圧力は、低レベルの発泡および遅い速度の送達を提供する。しかしながら、ある種の生命を脅かす状況は１〜５気圧またはそれを超える送達圧を是認し得る。ほとんどの場合、選択した送達圧は、商業的に入手可能な小型容器デバイスのそれに対応する。添加因子として、送達圧は組織シーラント物質が送達系またはデバイス詰まらせないようにするのに重要であろう。
自己含有創傷包帯剤およびフィブリンシーラント包帯の組合せ態様
最後に、ある種の外傷損傷は、自己含有フィブリンシーラント包帯剤のいくつかの態様を組み合わせることによって最良に処置されるであろう。例えば、ひどい自動車事故あるいは対人地雷または爆発によって引き起こされたひどい負傷においては、創傷は生命を脅かすのみならず広範なものであり、組織または骨に大きなギザギザの開口を含み、かなりの内部損傷を伴い、しばしば重症の火傷を伴う。かかる創傷は、広い面積の創傷組織に加えて、多数の切断された動脈および血管を示す。かかる創傷では、まず、迅速に凝固する発泡性フィブリンフォーム包帯剤を惜し気もなく適用して、出血を素早く制御し、次いで、犠牲者を医療機関まで輸送できるまで、あるいは専門家の医療救助が受けられるまで、創傷領域を支持し保護し、例えば、火傷を受けた組織からのゆっくりとした流体喪失をシールするために、フィブリンシーラント包帯の態様にて全領域を包むのが有利である。ほとんどの場合に、次いで、損傷組織の長期間の修復、治療および保護のために、フィブリンシーラント包帯剤のさらなる処方を訓練された者が適用する。
以下の実施例は説明目的で含ませたものであって、本発明の範囲を限定する意図のものではない。
実施例１
ＦＧの補足のためのＨＢＧＦ−１の調製
ＨＢＧＦ−１βをコードするＤＮＡを含んだプラスミドを含有する組換えイー・コリ（E. coli）の培養物８００ｍｌを調製した。３７℃における２４時間のインキュベーションおよび培養の後、細胞を遠心し、上清を捨てた。細胞ペレットを、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．３を含有する２０ｍＭリン酸緩衝液２５ｍｌに再懸濁した。懸濁した細胞を細胞破壊機で破壊し、５０００ｇにおける２０分間の遠心によって細胞夾雑物を得られた溶液から分離した。
ペレットを捨て、可溶化されたＨＢＧＦ−１βおよび他の細菌蛋白質を含有する上清を直径２．６ｃｍ、高さ１０ｃｍのヘパリン−セファロース^TMカラム（Pharmacia Fine Chemicals, Upsala, スウェーデン）に負荷した。２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．３中の０．１５Ｍ ＮａＣｌの５カラム容量でカラムを洗浄し、次いで、２０ｍＭリン酸緩衝液中の０．１５Ｍ ＮａＣｌないし２．０Ｍ ＮａＣｌグラジエントで溶出させた。
溶出物を２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収によってモニターした。ＵＶ吸収性物質の３つのピークが溶出し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。ピーク番号３のものは約１７，４００ダルトンにおける単一のバンドとして電気泳動され、実質的に純粋なＨＢＧＦ−１βを含有するものであった。
ＨＢＧＦ−１βが汚染細菌蛋白質を含まないことをさらに保証するために、成長因子活性を含有するピーク番号３のものを２０ｍＭヒスチジン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に対して一晩透析した。２ｍｇの蛋白質を１ｍｌのＣＭ−セファロース^TM（Pharmacia, Upsala, スウェーデン）イオン交換カラムに負荷した。カラムを１０ベッド容量（０．５ｍｌ／分）の２０ｍＭヒスチジン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７，５で洗浄し、２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ７．５中の０．１５Ｍ ＮａＣｌないし１．０Ｍ ＮａＣｌのグラジエントで溶出させた。溶出物を２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収によってモニターし、ＨＢＧＦ−１βをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって同定した。
この精製したＨＢＧＦ−１を用いて引き続いての実施例でＦＧを補足した。
実施例２
ＨＢＧＦ−１の安定性
ＦＧの成分である、トロンビンによるＨＢＧＦ−１βの消化を阻害または防止するＦＧに成分を添加することが必要であった（Lobb, Biochem. 27:2572-2578（1988））。ＨＢＧＦ−１に吸収されるヘパリンを選択し、トロンビンおよびＦＧのいずれかの他の蛋白分解成分による消化からＨＢＧＦ−１を保護できるか否かを判断するためにテストした。増大させる濃度のヘパリンの存在下におけるＨＢＧＦ−１の安定性を評価した。ＨＢＧＦ−１β（１０μｇ／ｍｌ）、トロンビン（２５０Ｕ／ｍｌ）および増大させる濃度のヘパリン（０、０．５、１０、２０および５０Ｕ／ｍｌ）を含有する溶液を３７℃でインキュベートした。インキュベートする溶液からアリコットを周期的に取り出し、凍結し、さらなるテストのために−７０℃で保存した。
インキュベーションが完了した後、試料を解凍し、レムリ（Nature, 227:680（1970））の方法に従って、還元条件下で１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離した。次いで、該ゲルをニトロセルロースに電気ブロットし、ＨＢＧＦ−１に対応するバンドを、ＨＢＧＦ−１に対するアフィニティー精製したウキギポリクローナル抗体を用いて同定した。ウェスタンブロットを図１に示し、そこでは、１７，４００ｍｗにおけるＨＢＧＦ−１βが観察できる。結果は、５Ｕ／ｍｌもと低い濃度のヘパリンの存在下で、ＨＢＧＦ−１βがトロンビンによる消化から保護されたことを示した。加えて、実施例３に示すごとく、その生物学的活性は変化されなかった。
実施例３
ヘパリンおよびトロンビンの存在下におけるインキュベーション後のＨＢＧＦ−１βの生物学的活性
５Ｕ／ｍｌのヘパリンを含有し、実施例２に記載したインキュベーション混合物中のＨＢＧＦ−１の生物学的活性を、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞での³Ｈ−チミジン取込アッセイを用いて測定した。
ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を９６ウェルプレートに導入し、細胞が３０ないし５０％密集に達するまで、０．５％胎児ウシ血清（ＢＣＳ：ＧＩＢＣＯ,Grand Island, New York）を含むダルベッコウの修飾培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ,Grand Island, New York）中、飢餓条件下で、３７℃でインキュベートした。２日後に、実施例２で調製した試料からの希釈度を変えたＨＢＧＦ−１を、培地を変化させることなく各ウェルに添加した。希釈剤（インキュベーション緩衝液）を、陰性対照のために成長因子に代えて添加し、増殖のための成長因子を含有する、１０％ＢＣＳを含むＤＭＥＭを、陽性対照のためにＨＢＧＦ−１試料に代えて添加した。
３７℃における１８時間のインキュベーションの後、０．２５μＣｉの³Ｈ−チミジン、特異的活性６．７μＣｉ／モルを各ウェルに添加し、インキュベーションを３７℃でさらに４時間継続した。プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、４℃にて１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）０．５ｍｌで１５分間固定した。ＴＣＡを除去し、プレートをＰＢＳですすぎ、酸沈殿物質を室温にて０．５ｍｌ／ウェルの０．１Ｎ水酸化ナトリウムで１時間可溶化させた。試料をシンチレーションバイアルに移し、１０ｍｌのシンチレーション流体（New England Nyclear, AquasureTM）をバイアル当たりに添加した。
図２に示す結果は、トロンビンおよびヘパリンの存在下でインキュベートしたＨＢＧＦ−１がその生物学的活性を保持したことを示した。チミジン取込の観察された濃度依存性は、インキュベーション時間とは無関係で、成長因子濃度の関数としての細胞の増殖の依存性につき予測されたものに典型的なものであった。成長因子は、典型的には、細胞増殖が最大となる最適濃度を示す。
内皮細胞増殖を観察することによって、トロンビンおよびヘパリンの存在下におけるＨＢＧＦ−１の生物学的活性も測定した。ペトリ皿の表面にＨＢＧＦ−１補足ＦＧを含浸させた。内皮細胞の狭い層を添加し、細胞の数を測定した。時間が経つと、細胞数は増加した。加えて、細胞は血管へと組織されるようであった。
従って、ＨＢＧＦ−１は、トロンビンの分解活性からＨＢＧＦ−１を保護し、成長因子補足ＦＧ中でＨＢＧＦ−１の生物学的活性を促進もし得るヘパリンを含むＦＧにおいてその生物学的活性を保持する。
実施例４
ＦＧ血餅からのＨＢＧＦ−１の拡散
１０Ｕ／ｍｌヘパリンおよびトロンビンを含有するフィブリノーゲン複合体０．３ｍｌおよび４０ｍＭ ＣａＣｌ・を混合することによってＦＧ血餅を５ｍｌプラスチック試験管中に形成させた。４本の試験管を以下のごとくに設定した。
（Ａ）０．５Ｕ／ｍｌトロンビンおよび１０μｇ／ｍｌ ＨＢＧＦ−１；
（Ｂ）０．５Ｕ／ｍｌトロンビンおよび５０μｇ／ｍｌ ＨＢＧＦ−１；
（Ｃ）５Ｕ／ｍｌトロンビンおよび１０μｇ／ｍｌ ＨＢＧＦ−１；および
（Ｄ）５Ｕ／ｍｌトロンビンおよび５０μｇ／ｍｌ ＨＢＧＦ−１
各血餅を０．２Ｍヒスチジン緩衝液、ｐＨ７．３で覆った。重層する緩衝液の３０μｌ試料を各試験管から２時間毎に取り出し、ウェスタンブロットで泳動させた。
実験結果は、血餅からのＨＢＧＦ−１拡散は、時間および血餅中のその濃度の関数であって、血餅中のトロンビンの濃度はＨＢＧＦ−１が血餅から放出される速度に影響しないことを示した。
実施例５
成長因子補足ＦＧにおけるヒト臍帯静脈内皮細胞の挙動：野生型および突然変異型ＦＧＦ−１の効果
ヒト内皮細胞に対する酸性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−１）補足ＦＧのイン・ビトロ効果を調べるために、これらの細胞の懸濁液を、ｍｌ当たりほぼ９ｍｇのフィブリノーゲンおよびｍｌ当たり０．２５ＮＩＨ単位のトロンビンを含有するＦＧの２．５ｍｌの均一に塗布した層を含有する１０ｃｍ直径ペトリ皿に添加した。該ＦＧを以下にように補足した。
（Ａ）成長因子無添加；
（Ｂ）１００ｎｇ／ｍｌの活性な野生型ＦＧＦ−１を補足；
（Ｃ）１００ｎｇ／ｍｌの不活性な突然変異体ＦＧＦ−１を補足；または
（Ｄ）１０ｎｇ／ｍｌの活性な野生型ＦＧＦ−１を補足
ＦＧ層に撒いた細胞を、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ中で７日間維持した。
細胞は細長くなり、生物学的に活性なＦＧＦ−１を補足したＦＧと接触された場合に効果的に増殖した（図３および４）。非補足ＦＧと接触させた場合（図５）、生物学的に不活性な突然変異体ＦＧＦ−１を補足したＦＧと接触させた場合（図６）、細胞は細長くなったが比較的ゆっくりと増殖した。
実施例６
ＦＧＦ−１補足ＦＧ中のヒト臍帯静脈内皮細胞の挙動
それらの増殖を比べるために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ｍｌ当たり１０⁵またはそれ以上）を、その蛋白質濃度が４ｍｇ／ｍｌであるＦＧに埋め込んだ。ＦＧ中のトロンビンの濃度は０．６ＮＩＨ Ｕ／ｍｌに調整した。全ての実験で使用した培地は、１０％胎児ウシ血清、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１ｎｇ／ｍｌＦＧＦ−１および１０Ｕ／ｍｌヘパリンを補足したＭ１９９（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）であった。
ＦＧ中での２４時間内に、細胞は細長く、多足状態になり、相互に接触するようになると細胞ネットワークを形成した（図７）。この増殖は少なくとも５日間継続した。図８は、４８時間におけるこの状況を示す。
対照として、同一の細胞懸濁液を１０μｇ／ｃｍ³のフィブロネクチンで被覆した表面で培養した。対照細胞は丸石形状を獲得し、この形態を少なくとも５日間維持した。図９および１０は、各々、２４時間および４９時間におけるこの状況を示す。
実施例７
ＦＧ中のＰＭＥＸＮＥＯ−３Ｔ３−２．２細胞の挙動
ＰＭＥＸＮＥＯ−３Ｔ３−２．２細胞は、遺伝工学により作製した蛋白質を発現する能力を有する修飾ゲノムを含む線維芽細胞である（Foroughら，J. Biol. Chem. 268:2960-2968（1993））。ＦＧにおけるこれらの細胞の挙動を測定するために、ウェル当たり１０⁵細胞を３つの条件下（１）ＦＧに埋め込む；（２）ＦＧの表面上；および（３）ＦＧの不存在下（対照）で培養した。実験は、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ培地（Sigma Chemical Co., StるLouis,MO）中、２４−ウェルにて二連で行った。ＦＧ蛋白質濃度は４ｍｇ／ｍｌであった。同一の実験において、培地を１．５ＦＢＳで補足し、陰性対照として使用した。
１０％ＦＢＳを補足した培地の存在下において、全ての３群の細胞は増殖し、密集した。培地に１．５ＦＢＳを補足した陰性対照実験において、細胞は増殖し、ＦＧの存在下では少なくとも５日間生存したが、それなしでは生存しなかった。しかしながら、それらの増殖は、１．５％ＦＢＳを補足したそれにおけるよりも、１０％ＦＢＳを補足したＦＧでより速かった。ＦＧの不存在下では、１．５％ＦＢＳを補足した培地では、細胞は３８時間内に死滅した。生存の基準は、１０％ＦＢＳを補足した新鮮な培地への移行に際して、増殖するテスト細胞の能力である。
実施例８
ＨＢＧＦ−１予備処理による発泡ＰＴＦＥ血管移植体の内皮形成
２の実験は、内皮細胞（ＥＣ）での、血液含有生体材料の予備処理は内皮形成を増強したことを示した。最初の実験では、ウサギ大動脈に移植した発泡ＰＴＦＥ移植体に適用されたＨＢＧＦ−１補足ＦＧのイン・ビボでの流出特性を調べた。第２の実験では、同様の移植体をイヌの回腸大動脈位置に移植した。ＨＢＧＦ−１（血管形成因子）を実験で用いた。ＦＧＦ、ＦＧＦ−４および／またはＯＰ−１のごとき他の成長因子も血管移植片のための補足物（類）として使用した。
Ａ．流出実験
一般に、修飾したＦＧは、ヒト組換え¹²⁵Ｉ−ＨＢＧＦ−１のほぼ１ｎｇ／ｃｍ²面積の内方および外方移植片表面、２０μｇ／ｃｍ²ブタ腸粘膜ヘパリン、および２．８６ｍｇ／ｃｍ²フィブリノーゲンを２．８６×１０^-2Ｕ／ｃｍ²の復元した商業的に入手可能なヒトトロンビン（１０００Ｕ／ｍｌ）に添加して重合を誘導することによって滅菌的に調製した。
該¹²⁵Ｉ−ＨＢＧＦは以下のごとくに特異的に調製した。フィブリノーゲンは、５００ｍｇのフィブリノーゲンを２５ｍｌのＰＢＳに添加して２０ｍｇ／ｍｌＰＢＳのフィブリノーゲン濃度を生じることによって復元した。６０ｍｇのフィブリノーゲンを含有する３ｍｌのこの溶液を１２のエッペンドルフプラスチック製試験管に入れ、−７０℃に維持した。これらのアリコットの各々を個々に使用した。
トロンビンは、１０００Ｕ／ｍｌの濃度の商業的に入手可能なその調製物（Armour Pharmaceutical Co., Kankakee, IL）を１：１０の率にて滅菌溶液中に希釈して１００Ｕ／ｍｌの濃度を生じることによって再構成した。このトロンビン溶液を再度１：１０希釈して１０Ｕ／ｍｌの溶液を得た。
ウシヘパリン（Upjohn, Kalamazoo, MI）は、１０００Ｕ／ｍｌの濃度の調製物を１：１０００の率で通常の食塩水を用いて希釈することによって再構成した。
１および４８／１００（１．４８）ｍｌの復元したフィブリノーゲン、６３μＬの復元したヘパリン＋１５．６６μＬの¹²⁵Ｉ−ＨＢＧＦ−１をガラス製シンチレーション試験管中で混合した。次いで、この混合物を３ｍｌプラスチック製シリンジに吸引した。５ｍｌの復元したトロンビンをガラス製シンチレーション試験管に入れた。
発泡ＰＴＦＥ移植片の一端をプラスチック製三方ストップコックノズル上に置き、２−０絹紐でそこに締め付けた。次いで、ＰＴＦＥを３×３ｃｍ平方のパラフィルム（Parafilm）^TMで巻き、次いで、真っすぐな止血材でそこに圧着して水密シールを確立した。第２の２−０絹紐をストップコックに隣接するパラフィルム上に位置させてもう１つのシールを形成させた。次いで、真っすぐな止血材を用いて、ＰＴＦＥ／パラフィルムの末端側２ｍｍを圧着させてこの端部をシールした。
等容量の前記したごとくに調製したフィブリノーゲンおよびトロンビン溶液を混合し、ほぼ３０秒間反応させ、その時反応が起こる。次いで、トロンビン重合したフィブリンは不透明である。（この時間因子は近似値であり、トロンビン間で変化する。重合に対するおよその時間は、混合物の不透明性を観察することによって決定できる。）フィブリン／トロンビン混合物を１ｃｃのシリンジに吸引した。（注意：この移植片の容量は０．４２ｍｌであった。より大きい容量の移植片については、より大きいシリンジを使用する必要がある。）該シリンジをストップコックに取り付け、ＰＴＦＥ間隙を通って液体が「発汗」するように見えるまで混合物を手で５秒間にわたって注入し、ＰＴＦＥとパラフィルム^TMの間の間隙を充填した。三方ストップコックをＰＴＦＥ移植片に対して３分間閉じ、メスを用いてストップコック上のＰＴＦＥの端部の紐を切断した。ＰＴＦＥ移植片／パラフィルムをストップコックから外し、止血剤を用いて、ＰＴＦＥをパラフィルム包みから取り出した。残存する成長因子補足ＦＧを移植片管腔から取り除くために、移植片管腔が完全に清掃されるまで、Ｎｏ．３の塞栓摘出用カテーテルを移植片に５回通した。成長因子補足ＦＧで処理したＰＴＦＥ移植片を層流フード下で一晩約１２時間乾燥させた。処理した移植片を次いで移植用に準備した。
別法として、このＨＢＧＦ−補足ＦＧを３４ｍｍ（２４ｍｍ＋５ｍｍ各端部）×４ｍｍ（内径）の薄壁発泡ＰＴＦＥ移植片に加圧灌流させ、それにより、移植片管腔表面をコートし、節を通って移植片の外方表面まで延ばした。移植片の管腔を前記したごとく清掃した。次いで、これらの移植片を２４匹の３〜５ｋｇニュージーランド白色ウサギの腎臓下腹部大動脈に挿入した。第１の実験において、動物を犠牲にし、検体を０時間（外科的操作による喪失を修正するためのもの）および５、３０および６０分、および７、１４および３０日に外植した。残存する放射能をガンマカウンティングによって測定した。自然崩壊につき修正した残存¹²⁵Ｉ−ＨＢＧＦ−１は、ゼロ時間値のパーセントとして表す。循環の再確立を伴う迅速な初期喪失（％／分＝−２４．１、５および６０分の間）、続いて１時間後のゆっくりとした喪失（％／分＝−０．０３）、１週間後の１３．４％±６．９％残存、および３０日後の３．８％±１．１％残存という古典的動態に続いて¹²⁵Ｉ−ＨＢＧＦ−１を流出させた。
Ｂ．イン・ビボ内皮形成実験
第２の実験では、適用されたＨＢＧＦ−１補足ＦＧ懸濁液が、イヌ大動脈−腸骨位置に移植したかなり発泡した６０μｍ節間距離の発泡ＰＴＦＥ移植片の内皮形成速度；時間の関数としてのこれらの内皮細胞の増殖活性；および観察された内皮細胞増殖の刺激におけるＨＢＧＦ−１およびＦＧの相対的寄与に対する効果を評価した。５０×４ｍｍ非補強発泡ＰＴＦＥ移植片の３群を１２匹のイヌの大動脈腸骨位置に移植した。群１（ｎ＝６）は２０μｇ／ｃｍ²ヘパリン、２．８６ｍｇ／ｃｍ²フィブリノーゲンおよび２．８６×１０^-2Ｕ／ｃｍ²のヒトトロンビン＋１ｎｇ／ｃｍ²のＨＢＧＦ−１を含有するものであった。群２（ｎ＝３）はＨＢＧＦ−１無しで同ＦＧを含有するものであった。トリチウム化チミジン（³Ｈ−ＴｄＲ；０．５μＣｉ／ｋｇ）を外植の１０時間前に注入した。光学顕微鏡および電子顕微鏡、第ＶＩＩＩ因子免疫組織化学、ランダム高出力場における内皮細胞増殖についてのen faceオートラジオグラフィー用に移植片を７および２８日に外植した。いずれの処理群から移植片が由来するかを知らない３人の観察者によって各移植片を観察した。内皮細胞増殖における差異を両側ＡＮＯＶＡおよび独立ｔ検定によって統計学的に解析した。
第７日において、ＦＧおよびＨＢＧＦ−１補足ＦＧ移植片は共に内皮細胞の非接触フォーカスを示した（図１１）。最小移植片の表面はフィブリン凝塊を残した。第２８日において、各ＨＢＧＦ−１補足ＦＧはかなりの毛細血管の内部増殖および密集内皮形成血液接触表面を示し、これは他の２群のいずれの検体にも観察されなかった（図１１および１２）。図１２は、第２８日における未処理移植片はそれらの表面に目視できる内皮細胞をほとんど有しなかったことを示す（パネルＧ）。ＦＧ単独で処理した移植片は内皮細胞で被覆された約３３％のその表面を有し、これは、ＦＧ処理単独がいくらかの再内皮形成を刺激したことを示す（パネルＨ）。しかしながら、ＨＢＧＦ−１を補足したＦＧで処理した移植片（パネルＩ）は、内皮細胞の特徴的な丸石形態を示す内皮細胞で完全に（＞９５％）覆われているように見えた。かくして、ＦＧによって送達された成長因子の組合せは、非トロンボゲン形成性内皮細胞ライニングでの血管移植片の実質的に完全な被覆を刺激できた。エンファス（en face）オートラジオグラフィーは、２８日でのＨＢＧＦ−１補足ＦＧ移植片における内皮細胞のＤＮＡの³Ｈ−ＴｄＲ取込の統計学的に有意な増加（ｐ＜０．０５）を明らかとした。他方、全ての他の群では、時間および移植片処理の関数であった。
これらのデータは、６０μ節間距離の発泡ＰＴＦＥ移植片へのＨＢＧＦ−１−補足ＦＧ懸濁液の加圧灌流は、毛細血管内部増殖および増大した内皮細胞増殖を介する内皮形成を促進することを示した。
これらの実験は、小径血管移植片の増強された自然発生再内皮形成、および移植された内皮細胞のより迅速な密集を刺激する方法を示す。
実施例９
ＦＧで使用するための血小板由来抽出物の調製
血漿由来血小板を調製し、ペレット化した。上清血漿を除去した。ペレット化血小板を洗浄し、ｐＨ６．５の５０ｍＭヒスチジンおよび０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液に懸濁させ、ウシトロンビンで処理した。処理後、上清を遠心によって収集し、アリコットを−８０℃で凍結した。抽出物を解凍し、ＦＧまたは他のＴＳ類と混合した。
このようにして得た血小板抽出物は、対照と比較して、増殖するＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞のＤＮＡへの放射性標識チミジンの取込を増加させるので生物学的に活性であった。
創傷治癒に対する血小板抽出物の効果を評価するために、ＨＢＧＦ−１βにて後記実施例１０で行ったものと同一の実験を糖尿病マウスにおける血小板抽出物で行った。これらの実験の結果から、血小板抽出物における成長因子が低濃度であれば、創傷当たり血小板抽出物蛋白質の１００μｇより大きい用量が創傷治癒を促進するのに必要であることが明らかである。
実施例１０
イン・ビボにおける皮膚創傷治癒に対するＦＧの効果
材料および方法
Ａ．非補足ＦＧＨ
動物
雌Ｃ５７ＢＬ／Ｋ_sＪ−ｄｂ／ｄｂマウスをジャクソン・ラバラトリーズ（Jackson Laboratories（Bar Harbor, ME））から入手し、それらは実験の開始時に８ないし１２週齢であった。それらを動物医療施設での外科的処置の後にケージに収容した。
これらのマウスで観察された代謝異常性はヒト糖尿病で見い出されるものに類似しているので、これらのマウスを糖尿病ヒトにおける損傷創傷治癒のモデルとして使用した。加えて、顕著に遅延した細胞浸潤、顆粒組織形成、および創傷癒合に要する時間によって特徴付けられる損傷の治癒は、これらのマウスモデルにおける治癒はヒト糖尿病で観察される損傷治癒に関連し得ることを示唆する。
フィブリングルー（接着剤）
この実験で用いた濃縮された局所フィブリノーゲン複合体（ＴＦＣ）は新鮮な凍結しプールしたヒト血漿から得た。ＴＦＣ産物（米国赤十字-Baxter Hyland Division, Los Angeles, CA）を凍結乾燥形態で供給した。３．３ｍｌの滅菌水での再構成後、本実験で用いたＴＦＣ溶液の蛋白質特性は以下のごとくであった：全蛋白質１２０ｍｇ／ｍｌ；フィブリノーゲン９０ｍｇ／ｍｌ；フィブロネクチン１３．５ｍｇ／ｍｌ；第ＸＩＩＩ因子１７Ｕ／ｍｌ；およびプラスミノーゲン２．２μｇ／ｍｌ。
局所用ウシトロンビン（５０００単位バイアル、Armour Pharmaceutical Co., Kankakee, IL）を５ｍｌの滅菌水で復元し、８０ｍＭ塩化カルシウム溶液（American Reagent Laboratories, Shirley, NY）中の滅菌的に希釈して１５Ｕ／ｍｌの濃度とした。
等容量のＴＦＣおよび復元したトロンビンを混合してＦＧを得た。丸い６ｍｍ直径の十分な厚さの創傷を満たすために、０．０１５ｍｌのＴＦＣを０．０１５ｍｌのトロンビンと混合した。生成されたＦＧはほぼ６０ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度を有していた。
ほぼ１ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度の希釈ＦＧも用いた。
外科的処置
７ｍｌケタミン塩酸塩（１００ｍｇ／ｍｌ；Ketaset, Aveco Co., Inc., Fort Dodge, IA）、３ｍｌキシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ；Rompun, Mobey Corp., Shawnee, KA）、および２０生理食塩水からなる混合物を、１００ｇ体重当たり０．１ｍｌの用量にて筋肉内投与してマウスを麻酔した。背面毛髪を刈り、皮膚をポビドン−ヨウ素溶液で洗浄し、７０％アルコール溶液で拭いた。２の十分な厚みの丸い外科的創傷（６ｍｍ直径）を、中央線から等距離にて各片側に１つ、マウスの低部背中に作成した。２の創傷の中央エッジを少なくとも１．５ｃｍの非創傷皮膚の縁によって分けた。
創傷を行った直後に、ＦＧおよび／または包帯剤を示した創傷上に置いた。包帯剤は透明な半浸透性接着剤ポリウレタン包帯剤（オプサイト（Opsite）^TM, Smith and Nephew, Massillon, OH）であった。ベンゾイン化合物のチンキ剤（Paddock Laboratories, Minneapolis, MN）を包帯剤の適用に先立って創傷領域の周辺に適用した。創傷エッジを囲む０．５ｃｍの皮膚の余白があり、その上にはベンゾインのチンキ剤は適用せず、生創傷に対するベンゾインの可能な炎症効果を回避した。実験の間に該創傷にはさらに処置を適用しなかった。
処理群
マウスを４の処理群に分け、各マウスをそれ自体の対照として供した。
群Ｉ：動物の一方側の創傷をＦＧ（６０ｍｇ／ｍｌ）で処理し、他方、対側性創傷には処理を施さなかった。両創傷をオプサイト^TMで覆った。
群ＩＩ：希釈したＦＧ（１．０ｍｇ／ｍｌ）を一方側の創傷に局所適用し、他方、対側性創傷には処理を施さなかった。両創傷をオプサイト^TMで覆った。
群ＩＩＩ：ＦＧ（６０ｍｇ／ｍｌ）を両創傷上に局所適用した。一方側の創傷を覆わなくて、他方、対側性創傷はオプサイトTMで覆った。
群ＶＩ：創傷には局所処理を適用しなかった。動物の一方側の創傷は覆わず、他方、対側性創傷はオプサイト^TMで覆った。
創傷分析
動物を実験の第９日に安楽死させた。創傷を、非創傷皮膚の０．５ｍｍ縁を含めて、筋肉層まで切除し、緩衝化した１０％ホルマリン溶液に入れた。検体を加工のために組織学研究所に提出した。検体をパラフィンに埋め込み、創傷の中央部分を５μｍ切片に切断した。組織学分析のためにスライドをヘマトキシリンおよびエオシン、またはマッソンの三色で染色した。
各スライドに、１ないし１５の範囲の組織学的スコアを与え、１は治癒無しに対応し、１５は組織化されたコラーゲンファイバーを持つ瘢痕に対応する（表１）。スコアリング尺度は、従前の研究者が使用した尺度に基づくものであった。従前に使用された基準を修飾し、再上皮形成の程度、細胞侵入の程度、顆粒組織形成、コラーゲン沈着、血管分布、および創傷収縮をより正確に反映するように定義した。少なくとも３種の分析によって組織学的スコアを別々に割り当てた。創傷処理を記載する規則は全ての観察者によってスコアリングが完全に完了した後に破棄した。

統計学的解析
分析者の組織学的スコアの値を平均し、平均値±平均標準誤差として表した。
異なる処理群における対平均の比較のために対ｔ−検定を用いた。解析は、ＲＳ／１ Release 3.0統計学ソウトウェアパッケージ（BBN Software Products Corporation）を用いて行った。
試料の平均的相違を、統計学的解析ソフトウエアシステム（Statistical Analysis Software（SAS）System）を用いる偏差解析につきテストした。
結果
創傷閉鎖に対するＦＧの効果（群Ｉ）
群Ｉにおいては、各マウスの両創傷をオプサイト^TMで覆った。これらの条件下で、６０ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度を持つＦＧを動物の一方側のみに局所適用した結果、未処理創傷（５．２６）と比較してＦＧ側につき統計学的に低い平均組織学的スコア（３．０６）が得られた（Ｐ＜０．００５）（表２）。

創傷閉鎖に対する希薄ＦＧの効果（群ＩＩ）
この群では、オプサイト^TMで覆った双方の対創傷に希薄ＦＧ（１ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度）を局所適用した結果、未処理創傷のそれ（４．３６）と統計学的に異ならない平均組織学的スコア（４．０）が得られた（Ｐ＝０．１７）（表３）。

ＦＧ−処理創傷に対するオプサイト^TMの効果（群ＩＩＩ）
６０ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度を持つＦＧで共に処理した対創傷のこの群において、オプサイト^TMを片側に適用した結果、覆わないままとした創傷のそれ（４．９３）と統計学的に異ならない平均組織学的スコア（４．２）が得られた（Ｐ＝０．１１）（表４）。

対の未処理創傷の閉鎖に対するオプサイト^TMの効果（群ＩＶ）
ＦＧの局所処理を受けなかった対創傷のこの群において、オプサイト^TMを片側に適用した結果、覆わなかったままとした創傷のそれ（６．３１）と比較して、統計学的に低い平均組織学的スコア（４．９２）が得られた（Ｐ＜０．０００５）（表５）。
試料平均の相違に対する処理効果のＡＮＯＶＡは＜０．０００１で有意であった。

考察
この実験の結果は、マウスにおいて、（１）開いた創傷に適用した場合、止血用に処方した濃度（６０ｍｇ／ｍｌ）のＦＧの結果、未処理創傷のそれと比較して創傷治癒の遅い速度を示すより低い組織学的スコアが第９日に得られ；（２）１ｍｇ／ｍｌへのＦＧ蛋白質濃度の希釈の結果、創傷治癒のより速い速度を示すより高い組織学的スコアが第９日に得られ；および（３）半浸透性包帯剤（オプサイト^TM）の適用はそれ自体で本動物モデル自体において創傷閉鎖を有意に遅らせたことを示した。
ＦＧの全蛋白質濃度は、ＦＧを用いる実験の結果を比較すると、重要な変数である。創傷治癒および組織修復の促進におけるフィブリンの有利な効果が報告されたが、市販の製剤で通常見い出されるものよりも低い濃度のフィブノーゲンを本実験で用いた。
６０ｍｇ／ｍｌの濃度のＦＧは創傷閉鎖を遅らせた（群Ｉ）。フィブリノーゲンおよびトロンビン成分の混合物の後の、欧州で商業的に入手可能なＦＧの全蛋白質濃度は３７．５ないし５７．５ｍｇ／ｍｌである。これらのデータは、止血および接着適応症用に現在処方されているＦＧは、開いた皮膚創傷に適用した場合に治癒を遅らせることを示す。この効果は、（１）創傷治癒過程に能動的に参加する細胞要素の移動または増殖に対する機械的妨害、（２）創傷縮小の機械的阻害または（３）創傷治癒に対する１以上ＦＧ成分の化学的阻害効果によるものであろう。創傷閉鎖の機械的妨害および阻害はありそうな説明である。というのは、第９日において、創傷表面に固形のフィブリノーゲンをベースとする血餅の持続があるからである。
これが原因であるかを判断するのを助けるために、ＦＧの全蛋白質濃度を１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。この希薄ＦＧの局所適用の結果、未処理創傷のそれと有意に異ならない組織学的スコアが得られ（群ＩＩ）、これは、低全蛋白質濃度は創傷治癒過程を有意に阻害しないことを示唆する。
同濃度のＦＧ（６０ｍｇ／ｍｌ）で処理したが異なる処理群（群ＩおよびＩＩＩ）に属する覆った創傷についての平均組織学的スコアは有意に異なる値を有した（群Ｉにつき３．０６に対し群ＩＩＩにつき４．２）ことも注目に値する。これらのデータは、動物間のバラツキが、同一処理変数に付した異なる動物から明確な結論を引き出すのを困難とすることを示す。何故ならば、いくつかの動物は同一処理を受けたにも拘わらず他の動物よりも速いまたは遅いかる知れないからである。これは平均スコアについての標準誤差の範囲に反映されている。この理由で、各動物はそれ自体の対照として供し、例えば、同一動物における創傷を相互に比較した。テスト創傷として同一動物において対照創傷を有することによって、動物間の変動の効果は最小化された。また、これらのデータは、オプサイト^TMのごとき接着性包帯剤は創傷閉鎖を有意に遅らせたことを示す。しかしながら、ブタでの部分的厚みの皮膚創傷において、ＦＧの蛋白質濃度は創傷治癒の速度に関係しないようであることに注意すべきである。
Ｂ．イン・ビトロにおける創傷治癒に対する成長因子補足ＦＧ
糖尿病マウスにおける創傷修復速度に対するＨＢＧＦ−１β成長因子補足ＦＧの効果を評価した。本実験で用いた方法は、前記したものと丁度同様である。６匹のテストマウスの背面部分の２の６ｍｍの十分な厚みの皮膚バイオプシーに、５μｇのＨＢＧＦ−１βを添加したＦＧを充填した。６匹のマウスにおける同一バイオプシーを未処理のままとし、６匹の対照マウスにおいて、非補足ＦＧを充填した。９日後、全てのマウスを犠牲にし、各創傷からの５ミクロン厚みのスライスおよび周囲の皮膚の組織学的調製物を調製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。それが由来する処理群に関して同一ではなかった各試料における創傷修復の程度を、コラーゲン沈着、再上皮形成、顆粒組織の厚みおよび炎症細胞、線維芽細胞および毛細血管の密度を評価した３人の訓練された各分析家が「盲検」により評価した。各動物に、修復無しない完全な修復の範囲の１ないし１５のスコアを与えた。非補足ＦＧで処理した創傷からの試料は矛盾なく最低のスコアを与え、未処理創傷または成長因子補足ＦＧで処理した創傷からのものは最高のスコアを与えた。
実施例１１
イン・ビボにおける骨誘導性物質の送達ビヒクルとしてのＦＧ
材料および方法
フィブリンシーラント
米国赤十字用に、スクリーニングした新鮮で凍結しプールしたヒト血漿から、濃縮されたヒトＴＦＣ（Baxter Hyland Division, San Pedro, CA）およびヒトトロンビン（Baxter Hyland Division, Glendale, CA）を製造した。両成分はその生産の間に溶媒界面活性剤方法（New York Blood Center）を用いてウイルス不活化を受けた。３．３ｍｌの滅菌水での復元の後、ＴＦＣ溶液の蛋白質特性は以下の通りであった：全蛋白質＝１２０ｍｇ／ｍｌ；フィブリノーゲン＝９０ｍｇ／ｍｌ；フィブロネクチン＝１３．５ｍｇ／ｍｌ；第ＸＩＩＩ因子＝１７Ｕ／ｍｌ；およびプラスミノーゲン＝２．２μｇ／ｍｌ。
ヒトトロンビン（１０００Ｕバイアル）は３．３ｍｌ滅菌水で復元し、４０ｍＭ塩化カルシウム溶液（American Laboratories, Shirley, NY）中に系列希釈して１５Ｕ／ｍｌの濃度とした。ヒトトロンビンは、頭蓋冠欠陥に移植されるディスクを調製するのに使用した。
局所用ウシトロンビン（５０００Ｕバイアル、Armour Pharmaceutical Co., Kamkakee, IL）は５ｍｌの滅菌水で復元し、４０ｍＭ塩化カルシウム溶液中に系列希釈して１５Ｕ／ｍｌの濃度とした。ウシトロンビンは筋肉内バイオアッセイ用のインプラントを調製するのに用いた。
本発明の本態様を実施するにおいて、フィブリノーゲンは１ないし１２０ｍｇ／ｍｌＦＧ、より好ましくは３ないし６０ｍｇ／ｍｌＦＧ、最も好ましくは１０ないし３０ｍｇ／ｍｌＦＧの濃度で存在させるべきである。ＤＢＭは約１ないし１０００ｍｇ／ｍｌＦＧ、より好ましくは５０ないし５００ｍｇ／ｍｌＦＧ、最も好ましくは３００−５００ｍｇ／ｍｌＦＧのおよその濃度で存在させるべきである。無機質脱落骨粉末の粒子サイズは０．０１ないし１０００ミクロン、好ましくは２０〜５００ミクロン、最も好ましくは７０〜２５０ミクロンとすべきである。骨誘導性成長因子（類）またはＢＭＰ類は約１ないし１００μｇ／ｍｌの濃度で存在させるべきであり、ここに、該濃度は所望の目的を達成するのに十分なものである。本態様で骨誘導性物質として使用できる成長因子は、限定されるものではないが、オステオゲニン（ＢＭＰ３）；ＢＭＰ−２；ＯＰ−１；ＨＢＧＦ−１；ＨＢＧＦ−２；ＢＭＰ ２Ａ、２Ｂおよび７；ＦＧＦ−１；ＦＧＦ−４；およびＴＧＦ−βを含む。加えて、抗生物質のごとき薬物類を用いて骨修復で使用するＴＳを補足することもできる。
移植体調製
ラットＤＢＭを以下のごとくに調製した。ラットの長骨の骨端を取り出し、骨幹のみを後に残した。要すれば、該骨幹を割り、次いで、骨髄を脱イオン水（Milli-Q Water Purification System^TM，ミリポア社（Millipore Corporation, Bedford, MA）で徹底的にフラッシュした。次いで、該骨幹を室温で洗浄した。４℃で、１０００ｍｌの脱イオン水を１００ｇの骨に添加した。混合物を３０分間撹拌し、水をデカントした。この工程を２時間反復した。
４℃にて、１リットルの冷無水エタノール（Quantum Chemical Coprporation, U.S.1. Division, Tuscola, IL）を１００ｇの骨毎に添加した。１５分間撹拌した後、エタノールをデカントした。これを１時間の全持続の間に４回反復した。
ヒュームフード下で、５００ｍｌのジエチルエーテル（Mallinckrodt Speciality Chemicals, Paris, KY）を骨に添加したそれを覆った。これを穏やかに１５分間撹拌し、次いで、エーテルをデカントした。さらに５００ｍｌのエーテルを骨に添加し、混合物を１５分間撹拌した。エーテルを再度デカントした。エーテルの蒸発が起こるように骨をヒュームフード上に放置した。脱脂骨は極低温フリーザー（−１３５℃）中に無期限で貯蔵できる。
次いで、該骨を粉砕して骨粉末を得た。該粉末を分級し、７４ないし２４０ミクロンのサイズの粒子を収集した。
該骨粉末の１０グラムのアリコットを２５０ｍｌ遠心ビンに入れた。８０ｍｌの０．５Ｎ ＨＣｌを各ビンにゆっくりと添加して、泡立ちを回避した。次いで、各ビンの内容物を穏やかに撹拌した。１５分後、さらに１００ｍｌの０．５Ｎ ＨＣｌを各ビンに１０分間にわたって添加した。次いで、該ビンをさらに３５分間穏やかに撹拌した。該粉末をＨＣｌに入れた合計時間は１時間を超えなかった。
次いで、各混合物を４℃にて、３０００ｒｐｍの遠心機で１５分間回転させた。次いで、上清のｐＨをチェックした。もしｐＨが２を超えると、ペレットを乱すことなく、上清を化学品の流しに注いだ。もし上清のｐＨが２未満であると、上清を有害廃棄物容器に注いだ。もしペレットがゆるくなると、遠心時間を３０分に増やした。これらの工程は上清のｐＨが０．５Ｎ ＨＣｌと等しくなるまで反復した。
次いで、撹拌することによってペレットを１８０ｍｌの脱イオン水で洗浄して、均一な懸濁液を得た。次いで、該懸濁液をさらに１５分間遠心した。次いで、上清を前記のような捨てた。洗浄は上清のｐＨが脱イオン水のｐＨと等しくなるまで反復した。
次いで、ペレットをフリーザー中、−１８０℃で凍結した。次いで、それらを標準的手法を用いて凍結乾燥した。
厚み１ｍｍで直径８ｍｍのディスク形状移植体を４−ピースアルミニウムモールド（図１３）を用いて作製した。２５ｍｇのラットＤＢＭ粉末をモールドチャンバーに添加した。次いで、３０μｌのＴＦＣをピペットでＤＢＭに加え、ＤＢＭが全ての溶液を吸収してしまうまで混合した。使用したＴＦＣの濃度は１０、２０、４０、８０または１２０ｍｇ／ｍｌであった。次いで、３０μｌのトロンビン溶液（４０ｍＭ塩化カルシウム溶液中１５Ｕ／ｍｌ）をＤＢＭ−ＴＦＣ複合体に添加し、混合し、ピストン形状の蓋を用いて圧縮してディスク形状とした。２５ｍｇのＤＢＭ粉末は２０μｌの容量を有すると判断された。ＤＢＭをＦＧに添加した後、最終蛋白質濃度は以下のようになった。

ＤＢＭ単独またはＦＧ単独（４、８、１５および４５ｍｇ／ｍｌ全蛋白質濃度）からなるディスク移植体を同様に同一モールドを用いて作製した。
５０ｍｇのＤＢＭをアルミニウムモールドに注ぎ、次いで、６０μｌのＴＦＣを該ＤＢＭに添加し、十分に吸収されるまで混合した。次いで、６０μｌのトロンビンをＤＢＭ−ＴＦＣ複合体に添加し、混合し、ピストン形状の蓋を用いて、１ｃｍ直径および２ｍｍ厚みのディスク形状に圧縮した。次いで、ディスクを手で切断して所望の形状（三角形、四角形またはドーナツ形）とした。
筋肉内バイオアッセイ実験のために、移植体を、７０ミクロンのメッシュサイズを有し、１ｃｍ×１ｃｍの寸法の滅菌ナイロンバッグに入れた。
動物
雄Long-Evansラットはチャールズ・リバー・ラバラトリーズ（Charles River Laboratories（Willington,MA））から得た。筋肉内バイオアッセイのために、２８ないし３５日齢のラットを用いた。３月齢のラットを開頭術実験で用いた。
外科的処置
１００ｇｍ体重当たり０．１ｍｌの用量にて、１０ｍｌのケタミン塩酸塩（Vetalar、１００ｍｇ／ｍｌ、Parke-Davis, Morris Plains, NJ）、５ｍｌのキシラジン（Rompun,２０ｍｇ／ｍｌ，Mobay Corporation, Shawnee,KN）、および１ｍｌの生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）よりなる混合物を筋肉内投与して動物を麻酔した。動物の手術部位を７０％アルコール溶液、続いてポビドン−ヨウ素溶液で準備した。次いで、無菌技術を用いて外科的手法を行った。
筋肉内バイオアッセイ。 正中腹側切開を施し、平滑切開で胸筋間にスペースをつくった。示した実験材料を含有するナイロン包みを筋肉内スペースに挿入し、３−０ デクソン（Dexon）縫合で締めた（図１４）。次いで、対側性側にて同一手法を反復した。次いで、皮膚をステープルで閉じた。移植体を４週間後に収穫し、Ｘ−線処理し、組織学のために調製した。
ディスク形状移植体をランダムに入れ、それは以下のものからなるものであった：ＤＢＭ単独（ｎ＝１２）；異なる濃度（４ｍｇ／ｍｌ、ｎ＝１４；８ｍｇ／ｍｌ、ｎ＝３；１５ｍｇ／ｍｌ、ｎ＝３；および４５ｍｇ／ｍｌ、ｎ＝１２）のＦＧ単独、およびＤＢＭ−ＦＧ複合体（４ｍｇ／ｍｌ、ｎ＝１２；８ｍｇ／ｍｌ、ｎ＝１２；１５ｍｇ／ｍｌ、ｎ＝１２；および４５ｍｇ／ｍｌ、ｎ＝１２）。各々四角形、三角形およびドーナツ形の形状の移植体の４種があった。
開頭術手法。 鼻骨から中央−矢状陵まで直線切開を施した。軟組織は穏やかに反射し、骨膜を開頭部位から切開した（後頭骨、前頭骨、頭頂骨）。要すれば多量のセーライン洗浄を用い、低速回転ハンドピース中のトレフィンで８ｍｍ開頭を調製した。二重穿孔および上矢状静脈洞侵入を避けつつ、頭蓋冠ディスクを自由に切開した。８ｍｍ頭蓋冠欠陥は対照として処理しないか、あるいは１×８ｍｍのＤＢＭまたはＤＢＭ−ＦＧディスクを充填した（図１５）。次いで、皮膚ステープルで皮膚を閉じた。
外科的処置に続き、各ラットを耳パンチによって確認し、そのケージに戻し、２−３時間内そこで歩行させた。
頭蓋冠移植体の第１セットは、ＤＢＭ単独（２５ｍｇ，ｎ＝３）またはＦＧマトリックス中のＤＢＭ（１５ｍｇ／ｍｌ、ｎ＝２；３０ｍｇ／ｍｌ、ｎ＝３；および４５ｍｇ／ｍｌ、ｎ＝３）よりなるものであって、２８日後に回収した。頭蓋冠移植体の第２セットは、３０ｍｇ／ｍｌＦｇ中の２５ｍｇＤＢＭよりなるものであって、異なる手術後時点で回収した（２８日、ｎ＝１０；３カ月、ｎ＝９；および４カ月、ｎ＝５）。
移植体の回収
示した時点で、ラットを二酸化炭素チャンバー中で安楽死させた。実験した受容体ベッド（すなわち、大胸筋または頭蓋冠）の回りに皮膚切開を施し、軟組織は受容体ベッドから反射した。正常位部位において、３−４ｍｍの隣接骨を持つ開頭を前頭骨−後頭骨−頭頂骨複合体から回収した。異所性部位において、鋭く平坦な切開を用いて、移植されたナイロン包みを回収した。
ラジオグラフィー
３０ｋｖｐ、３Ｍａおよび１０秒において、ミニショット・ベンクトン・キャビネット（Minishot Benchtop Cabinet）Ｘ線システム（TFI Corporation, West Haven, CT）にてＸ−ＯＭＡＴＬ^TM高コントラストコダックＸ−線フィルム（Eastman Kodak Company, Rochester, NY）を用いて移植体をラジオグラフィーに付した。ケンブリッジ920イメージ分析システム（Image Analysis System^TM（Cambridge Instruments Limited, Cambridge, England）を用いて筋肉内および開頭部位のラジオグラフの灰色レベル密度を分析した。
組織学的分析
すべての回収した検体（軟組織および硬組織）を、保存剤溶液を含有する適当に標識したバイアルに直ちに入れ、加工のために組織学研究所に提出した。組織学的検体は冠直径を通って４．５ミクロン厚みの切片であった。各受容体部位では、１の切片を（細胞および間質の詳細の顕微鏡写真および鏡検用に）ヘマトキシリンおよびエオシン染色で調製し、他の切片をフォンコッサ（von Lossa）染色で調製した。
結果
筋肉内プラントのラジオグラフィー
全てのＤＢＭディスクは放射線不透明のイメージを示した。４８の移植したＤＢＭ−ＦＧディスクのうち４５（９３．７５％）が放射線不透明であった。全てのＤＢＭ−ＦＧディスクは、蛋白質濃度に拘わらず（４−４５ｍｇ／ｍｌ）、放射線不透明性を誘導した（図１６）。いくつかのＤＢＭディスクの放射線不透明性測定値（図１６）は、ＤＢＭ−ＦＧディスクよりも高かったが、他の測定値は十分にＤＢＭ−ＦＧディスクの測定値の範囲内であった。ＤＢＭを補足しなかった３２のＦＧディスクのうち３０（９３．７５％）が放射線不透明性を示さなかった。
四角形、三角形またはドーナツ形の形態のＤＢＭ−ＦＧディスクも、ＤＢＭを補足しなかったＦＧディスクと比較して顕著に放射線不透明であった。移植体の元の形状は一般に保持されていた。
筋肉内移植体の組織学
筋肉内バイオアッセイは、骨髄が充填された中央腔を持つ小骨の形成および従前に移植したＤＢＭ粒子の吸収によって示されるごとく、ＤＢＭおよびＤＢＭ−ＦＧ移植体につき陽性であった。
頭蓋冠移植体のラジオグラフィー
Ｘ−線は、ＦＧマトリックス中のＤＢＭが、ＤＢＭ単独または未処理対照よりも一般により放射線不透明性であることを示した。ＤＢＭを送達するのに使用した異なる濃度のＦＧ間に顕著な識別できる差異はなかった。未処理の８−ｍｍ直径の頭蓋冠欠陥のラグオグラフィーは、無視できる量の放射線−不透明性を示した。
３０ｍｇ／ｍｌＦＧマトリックス中のＤＢＭを用いる頭蓋冠移植体の第２のセットは、２８日頭蓋冠よりも３または４カ月頭蓋冠の頭開創傷内で顕著に増大した放射線−不透明性を示した（図１７）。
頭蓋冠移植体の組織学
未処理８ｍｍ頭開創傷は、頭開創傷を横切って発達する繊維状結合組織のみを示した（図１８）。ＤＢＭ移植体の組織学は、視野全体に散らばったＤＢＭ粒子を示した。しかしながら、ほとんどのＤＢＭ粒子は頭開創傷の境界内にあり、よく血管が形成された緩い結合組織によって囲まれていた。破骨細胞によるＤＢＭの活性な吸収が認められた。また、多くのＤＢＭ粒子は生細胞に存在することが認められた。破骨細胞によって作られた新しい類骨および骨は非常に明らかであった。
ＦＧマトリックス中のＤＢＭ移植体の組織学は、かなり密でより多くの細胞結合組織によって囲まれた頭開創傷内に局在するＤＢＭ粒子を示した（図２０および２１）。類骨マトリックスおよび骨小柱の形成は明らかであった。ほとんどの骨髄は、ＤＢＭ移植体単独よりもＤＢＭ−ＦＧディスクを移植した頭開創傷において形成されることが認められた。また、ＤＢＭ移植体単独または未処理対照よりもＤＢＭ−ＦＧディスクでより大きい新生血管形成があった。骨再生はＤＢＭを送達するのに用いた全ての濃度のＦＧで明らかであった。
考察
ＦＧの天然の生体適合性および生分解性は、それをＤＢＭおよびＢＭＰ類用の理想的にビヒクルとする特徴である。ＦＧはＤＢＭの所望の形態へ形状変化して骨欠陥を満たすことを容易とし、該欠陥内にＤＢＭを維持し、ＤＢＭと相乗的であるらしい。さらに、軟組織脱出症は起こらず、骨外形は維持された。ＤＢＭ−補足ＦＧは、骨芽細胞補給および骨再生を支持する適当な微細構造、生分解性プロフィールおよび放出動態を保有していた。
総じて、データは、テストしたいずれのＦＧ蛋白質濃度においてＦＧに送達されたＤＢＭもＤＢＭ単独と同程度の骨形成を誘導したことを示した。さらに、ＤＢＭはＦＧと共に特定の手術前形態とした場合、誘導された骨は手術後に元の形状をかなり保持した。
ＤＢＭ−ＦＧマトリックスは新しく形成された骨の形態を決定するので、可能ならば、ＤＢＭ−ＦＧマトリックスは所定の形状から作成すべきである。しかしながら、液体形態におけるＤＢＭ−ＦＧマトリックスは不規則な形状の欠陥に送達または注入でき、そこで、重合し、ＤＢＭ−ＦＧ−充填領域における骨形成を刺激するであろう。
実施例１２
ＦＧからの抗生物質（ＡＢ）の放出およびＡＢ補足ＦＧの増大した寿命
方法
Ａ．ＡＢ−ＦＧの調製
１．ＴＥＴ遊離塩基
３・１／２ｍｌの注射用水を、米国赤十字から供給された凍結乾燥ヒト局所用フィブリノーゲン濃縮物（ＴＦＣ）のバイアルに注入した。得られた溶液の蛋白質濃縮物はほぼ１２０ｍｇ／ｍｌであった。
米国赤十字／バクスター−ハイランド社（Glendale, CA）によって供給された凍結乾燥トロンビン濃縮物を、注射用水中に調製した塩化ナトリウムの４０ｍＭ溶液３．５ｍｌで復元した。得られた溶液はほぼ２５０Ｕ／ｍｌであった。
ＴＥＴ−ＦＧは、注射品質の塩化カルシウム（American Reagent, Shirley, NYから購入）の存在下で、所望の重量のＴＥＴと１ｍｌの復元したＴＦＣ溶液および１ｍｌの復元したトロンビン溶液とを混合することによって処方した。該ＴＥＴは遊離塩基形態であって、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company（St. Louise, MO））から購入した。該ＴＥＴ−ＦＧは、ＴＦＣおよびトロンビンをデュオフロ（Duoflo）^TM分注器（Hamaedics, CA）を通して１２ｍｍ直径のミリポア培養プレート（ミリポア社，Bedford, MA）中のミリポア膜上に混合することによって形成された。混合物を２２℃で１時間凝固させた。ＴＥＴ−ＦＧを含有する６ｍｍディスクおよびミリポア膜を、６ｍｍパンチバイオプシーを用いて後者から切り取った。ＴＥＴ−ＦＧ含有ディスクをＴＥＴ放出実験で用いた。
ＴＥＴ−ＦＧからのＴＥＴのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または唾液への放出は、２つの異なるセットの条件下で、２４−ウェル細胞培養プレート（Corning Glass Works, Corning, NY）を用いて測定した。１の条件（静的様式）において、２ｍｌのＰＢＳまたは０．７５ｍｌの唾液を２４−ウェル細胞培養プレート中で毎日取り替えた。他の条件（連続的交換様式）において、ＴＥＴ−ＦＧからのＴＥＴ放出は、１日当たりほぼ３ｍｌの率で交換されたＰＢＳで測定した。試料は分析されるまで−２０℃で保存した。唾液は１０人の異なる人から収集し、プールし、５０００ｇにおける遠心によって清澄化した。次いで、それを０．４５μｍのポアサイズの膜を通して濾過し、毎日の使用のために４℃で保存した。
ＴＥＴ−ＦＧディスクから放出されたＴＥＴの濃度および生物学的活性を測定するために、抜き取ったＴＥＴを解凍し、３２０ｎｍにおいて分光光度法によりおよび／または寒天プレート上のイー・コリ（E. coli）増殖の阻害によって生物学的に分析した。これらのアッセイを較正するために、各々、０ないし５０および０ないし５００μｇ／ｍｌのＴＥＴ濃度をカバーする標準曲線を使用した。
２．シプロフロキサシンＨＣｌ（ＣＩＰ）−、アモキシシリン（ＡＭＯ）−およびメトロニダゾール（ＭＥＴ）補足ＦＧ
ＴＥＴにつき前記したごとく、ＣＩＰ ＨＣｌ、ＡＭＯまたはＭＥＴを含有するＦＧを調製した。対応するＡＢ−ＦＧからのこれらのＡＢの中間環境への放出をモニターするために、ＡＢ−ＦＧディスクを２４−ウェル細胞培養プレート中の個々のウェルに入れ、収集したＰＢＳ２ｍｌで覆い、毎日取り替え、分析されるまで前記したごとく−２０℃で保存した。溶出物中のＣＩＰ、ＡＭＯおよびＭＥＴの濃度は各々２７５、２７４および３２０ｎｍにて分光光度法により測定し、対応するＡＢの０ないし５０μｇ／ｍｌを含有する標準曲線と比較した。
Ｂ．ＡＢ−ＦＧの構造一体性
ＦＧおよびＴＥＴ−ＦＧディスクの構造一体性の維持は、微小スパチュラでディスクを「つつく」ことによる目視観察および物理的検査によって評価した。ディスクをＴＥＴ−ＦＧに付着ままにしつつ切断した多孔性膜を用いて、それらの構造一体性の評価の間ディスクを位置付けるのを助けた。ディスクの頂面図および側面図の写真も取り、それを評価で用いた。
ＦＧおよびＴＥＴ−ＦＧの構造一体性は滅菌および非滅菌の両条件下で測定した。非滅菌条件では、ＰＢＳおよび唾液を分析するまで凍結保存した。滅菌条件では、全プロセスを滅菌条件下で行った以外は同一手法を使用した。系の一体性は、０．２ｍｌの試料および２ｍｌのブロセスを３７℃でインキュベートすることによってテストし、該ブロスの濁度は４８時間モニターした。濁度の欠如は系の滅菌性を示した。ＣＩＰ−、ＡＭＯ−、およびＭＥＴ−ＦＧの安定性は非滅菌条件下のみであること以外は前記したごとくに実験した。
Ｃ．ＡＢ−ＦＧから放出されたＡＢのイン・ビトロ抗微生物活性
ＡＢ−ＦＧから放出された抗微生物活性は、ＡＢ−ＦＧを囲む毎日収集したＰＳＢまたは唾液からの６ｍｍ直径ディスクからの溶出物によって生じた阻止ゾーンの直径を測定することによって評価した。非補足ＦＧからの溶出物は対照として供した。既知濃度のＡＢ溶液は標準として使用した。寒天プレート上で培養したイー・コリ（E. coli）を用いて、放出されたＴＥＴ、ＣＩＰおよびＭＥＴのＡＢ活性を測定した。培養プレートを作成するために、ほぼ１０⁸細胞／ｍｌを含有する１００μｌの細菌懸濁液を５０℃で３ｍｌの頂部寒天混合し、直ちにプレートの硬い底部寒天上に注いで均一な細胞層を形成させた。該プレートを３７℃で１８時間インキュベートした。
結果
Ａ．ＴＥＴ
１．ＴＥＴ放出データ
「静的」実験における、ＴＥＴ−ＦＧからのＴＥＴの回りのＰＢＳへの放出は、毎日取り替えた２ｍｌのＰＢＳで達成されたＴＥＴ濃度を測定することによって分光光度法によって測定した。ＴＥＴ−ＦＧに取り込まれたＴＥＴの異なる量について得られたＴＥＴ濃度を図２２に示す。５０ｍｇ／ｍｌ未満のＴＥＴ−ＦＧ中のＴＥＴ濃度において、ＴＥＴの放出は５日以内に完了した。しかしながら、１００および２００ｍｇ／ｍｌのＴＥＴ濃度を含有したＴＥＴ−ＦＧディスクからのＴＥＴの放出は、各々、ほぼ２週間、および３週間を超えて起こった。ＴＥＴ−ＦＧディスクの構造的一体性は３ないし５週間保持された。これらの結果は、ＴＥＴ放出がＦＧ分解とは独立していること、およびＴＥＴ放出の速度はＴＥＴ−ＦＧディスクに残ったＴＥＴ量に依存することを示した。
連続的交換実験で収集した分光光度法データを図２３に示す。これらのデータは、元々１００ｍｇ／ｍｌＦＧのＴＥＴ濃度を含有したＴＥＴ−ＦＧディスクからの連続的ＴＥＴ放出は２週間にわたって起こったことを示す。ＦＧディスクはこの２週間の間にその構造的一体性を保持した（後述）。また、連続様式実験で得られたＴＥＴ放出データは、ＴＥＴ放出機会の率はＴＥＴ−ＦＧディスクに残ったＴＥＴの濃度に依存することを示した。
理論によって拘束されるつもりはないが、これらの実験で観察された初期の高ＴＥＴ濃度は、恐らくは、ディスク表面またはその近くからのＴＥＴの拡散の結果であったであろう。すなわち、これらの位置に「捕らえられた」ＴＥＴが消費されると、可溶化および／または拡散の速度が、最もありそうには、ＴＥＴ濃度勾配によるように、およびＦＧの形状の配置によるように減少した。
温度およびＦＧ蛋白質濃度もＴＥＴ−ＦＧディスクからのＴＥＴ拡散速度を決定する役割を演じる（実施例１３および１４参照）が、これらの２つのパラメーターはこれらの実験では一定に保持した。
５０および１００ｍｇ／ｍｌのＴＥＴを含有するＴＥＴ−ＦＧからのＴＥＴの唾液への放出は、毎日取り替えた０．７５ｍｌの唾液中のＴＥＴ濃度を測定することによって静的実験で測定した。これらの結果（図２４）は、ＴＥＴの濃度がより高く、最もありそうには、放出されたＴＥＴを収集するのに用いた唾液の小容量を反映する以外は、ＰＢＳで得られたものと同様である。加えて、ＦＧマトリックス中のＴＥＴの存在は、再度、予期せぬことに、９日までに崩壊を開始し、１５日までにはほとんど完全に崩壊した対照ＦＧディスクについてのものと比較して、少なくとも１５日間はＴＥｔ−ＦＧマトリックスの構造的一体性を延長した（図２５）。
２．ＴＥＴ抗微生物データ
ＰＢＳ中のいくつかのＴＥＴ濃度におけるイー・コリ（E. coli）増殖に対する抗微生物効果を図２６に示す。この方法によって検出可能な最低ＴＥＴ濃度はほぼ５μｇ／ｍｌであった。これらの結果は、放出されたＴＥＴが抗微生物活性を有することを明らかに示す。これらのデータは、分光光度法によってえられたものを確証し、ＦＧに取り込まれたＴＥＴの量はＴＥＴ−ＦＧを囲む溶液中のＴＥＴ濃度を決定することを示す。また、これらのデータは、ＦＧ中のＴＥＴの量を調整して、ＴＥＴ−ＦＧを囲む媒体中の所望のＴＥＴ濃度を最小の所望のＴＥＴ濃度をまたはそれを超える濃度に維持することを示す。
３．ＴＥＴ−ＦＧマトリックス寿命
対照ＦＧおよびＡＢ−ＦＧディスクの寿命は、ディスクの目視評価によって見積もった。ディスク作成の間に切断した多孔性膜はＦＧに付着させたままとし、これは、それらの一体性評価の間にディスクを位置付けるのに助けとなった。ＴＥＴを含有しない（対照）、およびＦＧ１ｍｌ当たり５０または１００ｍｇのＴＥＴを含有するディスクの頂面図を、０、９および１５日におけるものを図２５に示す。この図は典型的結果を示す、すなわち、ＦＧ対照ディスクは２週間内で分解し、他方、ＴＥＴ−ＦＧディスクは１５日間完全名間々、あるいはほとんど完全なままであった。さらなる実験において、ＴＥＴ−ＦＧディスクは、少なくとも５週間は完全なまま、あるいはそれまではほとんど完全なままであった（データは示さず）。ＦＧ寿命における有意な変化が、滅菌および非滅菌ＴＥＴ放出実験の間で観察された。
Ｂ．ＣＩＰ、ＡＭＯおよびＭＥＴデータ
１．ＣＩＰ、ＡＭＯおよびＭＥＴ放出データ
ＣＩＰ−、ＡＭＯ−およびＭＥＴ−ＦＧから放出された抗生物質は図２７に示す。ＣＩＰはほぼ４週間、見掛け上一定速度で放出され、次いで、速度はほぼさらに１週間で徐々に低下した。ＡＭＯおよびＭＥＴの放出は３日以内に完了した。
２．ＣＩＰおよびＭＥＴ抗微生物活性
放出されたＣＩＰおよびＭＥＴの抗微生物活性（データは示さず）は、同一のＡＢ−ＦＧディスクにつき分光光度法で測定したプロフィールが類似する。
３．補足−ＦＧマトリックスの寿命
ＣＩＰ−ＦＧについての結果はＴＥＴ−ＦＧのものと同様であった。ＡＭＯ−およびＭＥＴ−ＦＧについての結果は、ＦＧ対照で得られたものと同様であった。ＦＧ寿命において有意な変化は滅菌および非滅菌実験間で観察されなかった。
考察
結果は、ＣＩＰおよびＴＥＴの貧水溶性形態は、最大ＡＢ負荷、放出期間およびそれらを混入したＦＧマトリックスの寿命を有意に増加させる因子の組合せを提供することを示した。別法として、ＦＧディスクは、それらをＴＥＴまたはＣＩＰのごときＡＢの溶液に浸漬することによって安定化させることができる。
また、結果は、ＡＢ−ＦＧによって送達されたＡＢは、イー・コリ（E. coli）増殖の阻害によって示されるごとく、その抗微生物活性を維持したことを明瞭に示した。これらの結果は、ＦＧおよび他のＴＳのＴＥＴおよびＣＩＰ補足が、それからの薬物送達における限定因子としてのＦＧの分解を克服できることを示す。すなわち、これらのＡＢ類は、それらの放出期間および放出されたＡＢ濃度がＦＧ中のＡＢ濃度を用いて制御できるようにＦＧを安定化した。これらの手法を用い、ＴＥＴおよびＣＩＰをＦＧに負荷でき、それらの放出は、効果的抗微生物濃度にて、数日または数週間制御できる。
ＴＥＴ−およびＣＩＰ−誘導ＦＧ安定化は、その放出速度および／または全放出持続がＦＧマトリックスの一体性に依存するＦＧに添加されたこれらのＡＢ類のみならず他の薬物類または「補足物」につき全放出時間を制御するのに利用できる。
これらの結果は、ＦＧが局所化薬物送達系として働き得る歯周疾患および他の疾患で臨床的応用を有する。ＴＥＴ−またはＣＩＰ−誘導ＦＧ安定化は、ＴＥＴ−ＦＧまたはＣＩＰ−ＦＧマトリックスに添加されたＴＥＴ、ＣＩＰおよび他の薬物類または補足物類の全放出時間を制御するのに利用できる。
実施例１３
ＴＥＴ補足ＦＧからのＴＥＴ放出速度に対する温度の効果
本実験のために、ＦＧに５０ｍｇ／ｍｌのＴＥＴ遊離塩基を補足し、６×２．５ｍｍディスクの形状とした。ＦＧの蛋白質濃度は６０ｍｇ／ｍｌに調整した。該ディスクを２ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．３に入れ、４、２３および３７℃で放置した。ディスクを洗浄するために、ＰＢＳを１０分毎に６回、２ｍｌの新鮮なＰＢＳと取り替えた。しかる後、ＰＢＳを４時間の間、１時間毎に取り替えた。収集した試料中のＴＥＴ濃度は、前記したごとく、標準曲線に対して分光光度法によって測定した。
結果および結論
結果は、ＴＥＴ放出の速度が温度に比例したことを示した（図２８）。
実施例１４
ＴＥＴ補足ＦＧからのＴＥＴ放出速度に対するＦＧ蛋白質濃度の効果
本実験では、１ｍｇ／ｍｌのＴＥＴ ＨＣｌを補足したＦＧを調製し、６×２．５ｍｍディスクとしての形状とした。ＦＧの蛋白質濃度を６０、３０および１５ｍｇ／ｍｌに調整した。各ディスクを３ｍｌの蒸留水に入れた。該水を同一容量の水と、１０分毎に、合計１時間取り替えた。収集した試料中のＴＥＴ濃度は、前記したごとく、標準曲線に対して分光光度法により測定した。
データ（図２９）は、ＴＥＴ放出が最低の全蛋白質濃度を持つＦＧから最高であり、またその逆が成立することを示す。すなわち、ＴＥＴ放出はＦＧ蛋白質濃度に反比例する。
実施例１５
ＡＢ補足ＦＧから放出されたＡＢのイン・ビボ抗微生物活性
ＴＥＴ−およびＣＩＰ−ＦＧから放出されたＴＥＴおよびＣＩＰの抗微生物活性をテストするために、誘導歯周炎からマウスを保護するこれらのＡＢ補足ＦＧ類の能力を評価した。実験としては、第１日に、群当たり５匹の動物の各々に０．５ｍｌＰＢＳ（群−Ｉ）、ＦＧ（群−ＩＩ）、ＴＥＴ−ＦＧ（群−ＩＩＩ）またはＣＩＰ−ＦＧ（群−ＩＶ）を腹腔内注射した。ＦＧおよびＡＢ−ＦＧは、１２０ｍｇ／ｍｌのＴＦＣ０．２５ｍｌおよび２５０Ｕ／ｍｌのヒトトロンビン０．２５ｍｌを含有するハメディクス（Hamaedics）分注器を用いて投与した。ＴＥＴ−およびＣＩＰ−ＦＧの場合、トロンビン溶液は各ＡＢの５０ｍｇを含有するものであった。第２日に、全ての動物に、エス・アウレウス（S, aureus）２０２Ａの２×１０⁸（実験１）または４×１０⁸（実験２）コロニー形成単位（ｃｆｕ）を腹腔内注射した。結果：（実験１、実験２；動物は注射４８時間後に生存）：群Ｉ、０および１匹の生存；群ＩＩ、３および１匹；群ＩＩＩ、３および５匹；および群ＩＶ、５および４匹の生存。ほとんどの生存動物は実験期間（２週間）生存したが、いくつかの動物は死亡するか、あるいはそれらが病気となったので意図的に殺した。
これらのデータは、ＴＥＴ−ＦＧおよびＣＩＰ−ＦＧが、少なくともＡＢ補足ＦＧの投与後４８時間、エス・アウレウス２０２Ａによって引き起こされる死亡からマウスを保護したことを示した。
実施例１６
ＦＧからの細胞毒性／抗増殖薬物の長期間部位特異的送達
フィブリノーゲンを滅菌水で、あるいは１の群については１７ｍｇ／ｍｌの濃度の５−ＦＵで飽和した水で可溶化させた。トロンビン溶液は滅菌水で作成し、次いで、４０ｍＭ ＣａＣｌ₂中に希釈して１５Ｕ／ｍｌの濃度とした。あるいは、トロンビンを１７ｍｇ／ｍｌの濃度で５−ＦＵを飽和した４０ｍＭ ＣａＣｌ₂に溶解させた。
対照ＦＧ血餅は５−ＦＵを含有せず、これは、２００μｌのＴＦＣ溶液（６０ｍｇ／ｍｌ）を２００μｌのトロンビン溶液（１５Ｕ／ｍｌ）と混合し、２０分間乗号させることによって製造した。これらの血餅は、１２×７５ｍｍのテストチューブ中で作成し、次いで、０．０５Ｍヒスチジン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３（緩衝液）の１０ｍｌに入れた。
飽和レベルの液体５−ＦＵを含有するＦＧ血餅は、２００μｌのＴＦＣ（６０ｍｇ／ｍｌ＋１７ｍｇ／ｍｌ ５−ＦＵ）を２００μｌのトロンビン溶液（１５Ｕ／ｍｌ＋１７ｍｇ／ｍｌ ５−ＦＵ）と混合し、血餅を２０分間十分重合させることによって製造した。ＴＦＣおよびトロンビン溶液における飽和レベルの５−ＦＵの添加は、かなり不透明であった対照ＦＧ血餅と比較して、透明の血餅を生じる血餅形成を幾分改変した。形成された血餅は、色彩を除き、ＦＧ単独で作成されたものと物理的に同一であった。血餅は１２×７５ｍｍのテストチューブ中で形成させ、次いで、１０ｍｌの緩衝液に入れた。
５−ＦＵの飽和溶液で形成させた血餅に含まれる量と同一の量の固体状無水５−ＦＵを含有する第２群のＦＧ血餅を作成した。これらの血餅は、７ｍｇの固体状無水５−ＦＵを２００μｌのＴＦＣ（６０ｍｇ／ｍｌ）および２００μｌのトロンビン（１５Ｕ／ｍｌ）に添加することによって形成させた。７ｍｇの５−ＦＵを１２×７５ｍｍのテストチューブに入れた。次いで、２００μｌのＴＦＣ、続いて２００μｌのトロンビンを添加した。次いで、均一な混合物が観察されるまでピペットで吸上、放出を行うことによって３成分を混合し、さらなる混合は凝集反応のため阻害された。次いで、血餅を１０ｍｌのヒスチジン緩衝液に入れた。
最後の群は、血餅当たり５０ｍｇの固体状無水５−ＦＵを含有するものであった。増大した塊の５−ＦＵ（７ｍｇの代わりに５０ｍｇ）のため、従前に使用した方法は役に立たなかった。均一な血餅が生じる代わりに、テストチューブの底に沈降した５−ＦＵの大部分で血餅が形成された。この問題を回避するために、テストチューブの底をまず１００μｌのＴＦＣ（６０ｍｇ／ｍｌ）および１００μｌのトロンビン（１５Ｕ／ｍｌ）で覆った。これにより、テストチューブの凹部を覆った血餅が形成された。次に、５０ｍｇの固体状無水５−ＦＵを２００μｌ血餅の表面に添加した。これに続き、１００μｌのＴＦＣを１００μｌのトロンビンと共に添加した。蛋白質がゲル化し始めるまで、自動ピペッターを用いて２の溶液を混合した。これが起こると、ピペッティングを終え、血餅を２０分間重合させた。最終生成物は、ほぼ５０ｍｇの５−ＦＵを含有する密なコアを含有する血餅であった。他の血餅については、次いで、これらを１０ｍｌの緩衝液に入れた。全ての群におけるＦＧの最終全蛋白質濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。
各群は１０連を含有した。各連を１０ｍｌの緩衝液中、３７℃でインキュベートした。緩衝液を５、１０、２２、３３、５２、７５および１１４時間において新鮮に溶液１０ｍｌと交換した。次いで、溶出物緩衝液のアリコットを２６０に設定した波長で分校光度法により調べた。従前の実験は、５−ＦＵがこの波長強力に吸収し、他方、対照ＦＧからの溶出物はそうではないことを示した。
結果を図３０に示す。５−ＦＵを含有しない対照血餅は有意な読みを与えなかった。５−ＦＵの飽和溶液の形態または等量の固体状無水５−ＦＵの形態いずれかで５−ＦＵの７ｍｇで作成した血餅は、５ないし１０時間の間に５−ＦＵの送達を完了し、他方、５０ｍｇの固体状無水５−ＦＵを含有する血餅は少なくとも７５時間５−ＦＵを送達し続けた。全ての場合におけるピークレベルは５時間の時点で起こった。
理論に拘束されるつもりはないが、５−ＦＵ送達の持続は、ゲルに負荷された５−ＦＵの量の関数であるように考えられる。その結果、５−ＦＵを溶液中の含有する血餅から送達可能な５−ＦＵの量は薬物の溶解度によって制限された。かくして、５−ＦＵで飽和された液体から形成された血餅に存在する量と等しい量の固体状無水形態を含ませた結果、ほとんど同一の送達動態が得られ、他方、液体形態を用いて可能なものよりも大きい量の固体状形態の５−ＦＵを含ませた結果、送達の合計持続が３倍となり、それにより、所与の濃度の薬物の送達の持続は１０倍増加する。さらに多量の固体状無水５−ＦＵを含ませると、さらに長い送達持続が得られると予測される。他の実験において、血餅に含まれる５−ＦＵの量は少なくとも５倍、恐らくはそれ以上増加させることができ、また、５−ＦＵ−ＦＧ混合物は注射形態に処方できることが判明した（データは示さず）。さらに、無水形態よりも周囲の水性媒体に溶解性が低く、および／またはより遅い溶解速度を有する５−ＦＵの類似体または他の形態の使用の結果、送達時間はさらに増加することが予測された。
このプロセスの結果は、水性形態の薬物を使用して可能であったものよりも少なくとも１０倍長いフィブリン血餅からの抗増殖性／細胞毒性薬物５−ＦＵの持続性送達となる。この技術（すなわち、薬物の固体形態、好ましくは、低溶解度および／または溶解速度を持つものの使用）は、一般に、薬物粒子が懸濁されたマトリックスまたは薬物それ自体に拘わらず、適用可能なはずである。
実施例１７
線維芽細胞成長因子補足ＦＧおよびフィブロネクチンに対する応答における成長因子走化性
材料および方法
材料
ダルベッコウの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）はシグマ・ケミカル（St. Luoise, MO）から購入した。抗生物質−抗真菌剤溶液はギブコ（GIBCO）（Grand Island, N.Y.）から購入した。組換え線維芽細胞増殖因子−１（ＦＧＦ−１）および−４（ＦＧＦ−４）は、各々、米国赤十字，ロックビルMDのレジナルド・キッド，プラズマ・デリバティブズ・ラバラトリーズ（Reginald Kidd, Plasma Derivatives Laboratory）およびジェネティクス・インスチチュート（Genetics Institute（Cambridge, MA））から親切にも贈られた。組換え線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２、塩基性ＦＧＦまたはｂＦＧＦとしても公知）はアップステート・バイオテクノロジー社（Upstate Biotechnology, Inc.（Lake Placid, NY））から購入した。全てのプラスチックは培養の滅菌増殖に必要であり、走化性アッセイはフィッシャー・サイエンティフィック（Fisher Scientific（Newark, DE））から購入した。ミリセル（Millicell）-PCF（１２．０μｍ）インサートは、ミリポア社（Bedford, MA）から購入した。ヘパリンは、アップジョン社（Upjohn Company（Kalamazoo,MI））から購入した。
細胞培養
１２６継代のＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection, Rickville, MD）から購入した。継代１２９−１３３からの培養を走化性アッセイで使用した。培養は１０％ウシ血清およびほぼ１％の抗生物質抗真菌剤溶液を補足したＤＭＥＭ中で増殖させた。ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）はクローンティクス社（Clonetics, Inc.（San Diego, CA））から継代２にて購入した。培養は２０％ＦＢＳ（Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT）およびほぼ１％の抗生物質抗真菌剤溶液（Gibco, Grand Island, N.Y.）を補足したＤＭＥＭ中で培養させた。
細胞走化性アッセイ
細胞走化性を測定するのに使用した手法は、２つの公知の方法の組合せであった。ボイデン（Boyden）のチャンバーの修飾を以下のごとく用いた：ミリセル-PCF（ミリポア社，Bedford, MA）（１２．０μｍ）、１２．０ｍｍ直径インサートを２４ウェルプレートの個々のプレートに入れて、上方および下方走化性チャンバーを得た。走化性結果は、細胞および成長因子の各組合せにつきチェッカーボード（checkerboard）分析を行うことによって得た。材料セクションで記載した全ての細胞型に関し、ヘパリン（１０Ｕ／ｍｌ）の添加の有り無しにて、０．１、１、１０、１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度を、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２（ヘパリン無し）およびＦＧＦ−４に対して使用した。略言すると、培養をトリプシン処理し、５％ＣＯ₂湿潤チャンバー中、３７℃のＤＭＥＭ＋０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma Chemical Co., St. Luois, MO）にほぼ１時間入れた。インサート当たり５０μｌ中の２ないし２．５×１０⁵細胞を、２４ウェルプレートの構成体の上方チャンバーに添加した。前記したごとくに処理を施した。アッセイは、５％ＣＯ₂湿潤チャンバー中、３７℃ら４時間維持した。テストした全ての組合せは三連で行った。４時間の最後に、プレートをインキュベーターから取り出し、ミリセル−PCFインサートに含まれる染色プロトコルに従ってフィルターを染色した。簡単に述べると、該ミリセルl-PCFインサートの内部および外部を囲む流体を取り出した。３％グルタルアルデヒド（Sigma Chemical Co., St. Louise, MO）を該インサートの内部および外部にほぼ２０分間で添加した。３．０％グルタルアルデヒドの除去に続き、０．５％トリトンＸ−１００（E.M.Science, Cherry Hill, NJ）を５−７分で添加した。０．５％トリトンＸ−１００の除去に際し、フィシャーのヘマトキシリン溶液のギルの処方（Fisher’s Hematoxylin Solution Gill’s Formulation）（Fisher Scientific, Newark, DE）Ｎｏ．１を約１０分間で添加した。この溶液を流しつつある蒸留水中で約５分間洗浄した。綿棒を用いて、フィルターの上部を拭いて、移動しなかった細胞を除去した。クリスタル・マウント（Crystal Mount）^TM（Biomeda, Inc., Foster City, CA）溶液中のスライド上に面する下方スライドにフィルターを取り付け、フィルターの下面の細胞の数を自動的に数えるイメージ分析システム（Image Analysing System）を用いて、４００倍および２００倍の双方にて、スライド当たり１０のランダムな視野を計数した。
チェッカーボード分析
要すれば、チェッカーボード分析を行って、ランダム移動、ならびに陽性および陰性走化性を測定した。成長因子を上方および／下方チャンバーに添加して、細胞がＧＦ単独に向けて移動したか否か（走化性）、成長因子を上方または下方チャンバーに添加したにも拘わらず移動がランダムか否か（ケモキネシス）、または細胞移動が走化性グラジエントに抗するものか否か（陰性走化性）を観察した。
ＦＧから放出されたＦＧＦに対する細胞移動アッセイ
走化性チャンバーおよび細胞を前記してごとくに用いた。８ｍｇ／ｍｌの局所用フィブリノーゲン複合体（Topical Fibrinogen Complex）（TFC，米国赤十字，Rockville, MD）の５０μｌを２４ウェルプレートの底部に添加した。終濃度１０Ｕ／ｍｌのテスト成長因子＋／−ヘパリン（ヘパリンを含むＦＧＦ−１、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−２単独）の５０μｌをＴＦＣに添加し、徹底的に混合した。１０μｌのウシトロンビン（Armour Pharmaceutical Company, Kankakee, IL）を添加し、徹底的に混合した。成分を室温で３０分間ゲル化させた。下方および上方チャンバーの合計容量は０．５ｍｌで、各々、ＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡを含んでいた。ＴＦＣに添加されたＦＧＦ類の濃度を調整して、以下により決定される所望の総濃度とした。
総ＦＧＦ濃度＝ＴＦＣに添加されたＦＧＦのｍｇ
上方チャンバーの容量＋
下方チャンバー中のＦＧ＆液体の容量
アッセイは、５％ＣＯ₂湿潤チャンバー中、３７℃でほぼ２４時間行った。２４時間の最後に、フィルターを取り出し、固定し、染色し、フィルターの下面の細胞数を前記したごとくに計数した。
結果
線維芽細胞の移動の能力
ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞が種々のよく知られた走化性剤に向けて移動する能力を測定して、本アッセイで使用した細胞がその能力を保有したことを確認した。フィブロネクチンは、ＮＩＨ ３Ｔ３およびＨＤＦ類の双方でテストした最も効果的な走化性剤であり、２０μｇ／ｍｌで最大応答が起こった（図３１、表７）。しかる後、２０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンを移動の陽性対照として用いた。
ＦＧＦ−１に向けてのＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞の走化性
ＦＧＦ−１によるＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞の移動の最大刺激は、１０Ｕ／ｍｌのヘパリンの存在下、１０ｎｇ／ｍｌで観察された。チェッカーボード分析は、ＦＧＦ−１がＮＩＮ ３Ｔ３細胞を走化させることを明らかとした（表８）。
ＦＧＦ−２に向けてのＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞の走化性
ＦＧＦ−２によるＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞の移動の最大刺激は、ＦＧＦ−２の１ｎｇ／ｍｌで観察された（図３３）。チェッカーボード分析は、ＦＧＦ−２がＮＩＨ ３Ｔ３細胞を走化させることを示した（データは示さず）。
ＦＧＦ−４に向けてのＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞の走化性
ＦＧＦ−４によるＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞の移動の最大刺激は、１０ｎｇ／ｍｌで観察された（図３４）。チェッカーボード分析は、ＦＧＦ−４がＮＩＨ ３Ｔ３細胞を走化させることを明らかとした（データは示さず）。
ＦＧＦ−１に向けてのＨＤＦ類の走化性
ＦＧＦ−１によるＨＤＦ類の移動の最大刺激は、１０ｎｇ／ｍｌで観察された（図３５）。チェッカーボード分析は、ＦＧＦ−１がＨＤＦ類を走化させることを明らかとした（表９）。
ＦＧＦ−２に向けてのＨＤＦ類の走化性
ＦＧＦ−２によるＨＤＦ類の移動の最大刺激は、１０ｎｇ／ｍｌで観察された（図３６）。チェッカーボード分析はＦＧＦ−２がＨＤＦ類を走化させることを明らかとした（データは示さず）。
ＦＧＦ−４に向けてのＨＤＦ類の走化性
ＦＧＦ−４によるＨＤＦ類の移動の最大刺激は１０ｎｇ／ｍｌで観察された（図３７）。チェッカーボード分析は、ＦＧＦ−４がＨＤＦ類を走化させることを示した（データは示さず）。
ＦＧに取り込んだＦＧＦ−１、−２および−４へのヒト皮膚線維芽細胞移動
ＦＧから放出されたＦＧＦに対する最大移動応答は、取り込まれたＦＧにおけるＦＧＦ−４の全濃度が１ｎｇ／ｍｌで誘導された（図３８）。ピーク走化性応答を誘導したＦＧＦ−２の濃度は０．０１ｍｇ／ｍｌであったことを除き、同様の結果が、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２をＦＧに取り込んだ場合（データは示さず）に見い出された。

考察
ＦＧＦ類はＨＤＦ類において大きな走化性応答を生じた。ＨＤＦ類で行った各走化性アッセイでは、陰性対照および最大移動応答を誘導したＦＧＦの濃度の間に非常に良好な区別が得られた（各々、ＦＧＦ−１、−２および−５に応答して１８、１２および１０倍）。
成長因子による走化性の刺激は、恐らくは、ＨＤＦ類と比較してＮＩＨ ３Ｔ３細胞の利用可能なストック培養の高継代数のため、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞ではＨＤＦ類ほど高くはなかった。
ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２およびＦＧＦ−４は、線維芽細胞走化性の優れた刺激剤であることが判明した。前記成長因子のうちの１種またはそれらの組合せによる線維芽細胞の指向された移動の結果、損傷部位に線維芽細胞を存在させることができ、それにより、線維増殖ならびにコラーゲンおよび細胞外マトリックスの生成に導かれた。かくして、そのよく認識された血管形成特性の他に、ＦＧＦ類は、創傷治癒で役割を演じ、単独で、あるいはＰＤＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＴＧＦ−βおよび／または他の因子と組み合わせて作用する。
創傷治癒を速めるためのＦＧＦ類の使用についての従前の研究は、有意な結果を生じていない（Carterら，1988）。これは、最大応答のためのイン・ビボでの因子に対する細胞の延長された暴露の要件によるものであろう（Prestaら，Cell Regul. 2:719-726（1991）およびRusnatiら，J. Cell. Physiol. 154:152-161（1993））。不運なことに、治癒過程に干渉しない条件下でそのように長期間、成長因子を創傷に送達するのは困難である。
ＦＧＦをＦＧに取り込む本発明は、細胞のＦＧＦ類への延長された暴露を可能とし、創傷に適用できる。得られたフィブリンコーティングは、成長因子を創傷部位に直接送達しつつ、組織損傷に対する天然応答に似るものである。本発明者らるよる従前の研究では、ＦＧＦ−１を含有するＦＧを用いて、人工血管移植片を内張りした（本明細書実施例８）。これらの移植片をウサギの血管に入れると、ＦＧＦ−１は２８日間まで放出された。イヌ移植片に関するさらなる実験において、ＦＧＦ−１を移植片壁に取り込んだ効果は、同一期間内における人工移植片の全内皮形成であった（Greslerら，Surgery 112:244-255（1992））。かくして、この形態の適用は、イン・ビボにて高い生物学的効果を誘導する。線維芽細胞はＦＧから放出されたＦＧＦに向けて誘因される。この特性はＧＦ−補足ＴＳで創傷を治療するのに有用であろう。
実施例１８
血管形成性物質を送達するためのＴＳを用いる部位特異的血管形成
本態様は、体内で制御された方法にて新しい血管の指向された形成を可能とする。本態様では、ＴＳは、線維芽細胞成長因子−１（ＦＧＦ−１）のごとき血管形成性物質を、補足ＴＳから放出されるその濃度が血管形成を誘導するのに効果的である量で含有しそれを放出する。
本態様は、心臓、脳および筋肉組織、ならびに網膜のごとき適当な血液供給が欠乏した身体領域に、制御された方法で血管を再形成するのに使用される。本態様は、移植された器官または再付着された四肢への循環を回復または改善するのに使用される。本態様は、人工器官または小器官の生成、遺伝子治療でまたは遺伝子治療の標的として使用する細胞の送達および／または局所化および／または栄養付与のために、組織増大用の細胞の栄養付与および／または局所化のために、血管ネットワークまたは「血管床」を生成するのに使用できる。また、本態様は、血管形成または下層にある器官の機能を危うくしかねない外来身体または他の過剰な炎症反応を誘導し得るデバイスまたは物質の移植の必要性を排除する。
本発明は、適当な濃度のＦＧＦ−１のごとき血管形成性物質を入れた、フィブリノーゲンおよび／またはコラーゲンを含むまたは含まない（フィブリンの形成に適した）フイブリノーゲンの処方からなる。また、該フィブリノーゲンはトロンビンの蛋白分解活性に対して保護するための安定化剤を含有することもできる。ＦＧＦ−１の場合、ヘパリン硫酸（１−１０００Ｕ／ｍｌ）を、１ｎｇ／ｍｌないし１ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で安定化剤として使用できる。別法として、トロンビン、カルシウムまたは水成分に、適当な濃度で、血管形成性物質を含有させる。次いで、この処方をトロンビンと混合し、所望の部位を結ぶ線状にて、あるいは単一の部位に、身体内に迅速に適用する。次いで、フィブリノーゲン−トロンビン混合物は重合してＦＧを形成する。ＦＧＦ−１または他の血管形成性物質は、遊離形態としてあるいは安定化剤またはマトリックスのもう１つの成分に結合して、ＦＧマトリックスに捕らえられたままとなる。１の態様において、ＴＳ中のＦＧＦ−１の濃度は０．１ｎｇ／ｍｌないし１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌないし１００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１００ｎｇ／ｍｌないし１０μｇ／ｍｌとすべきである。ＦＧＦ−１または他の血管形成性物質は移植されたＦＧの身体内での血管形成を誘導する。
実施例１９
部位特異的軟骨誘導
本態様は、身体内での、新しい軟骨の制御された生成ならびに損傷した軟骨の導かれた再生を可能とする。本態様では、ＴＳは、軟骨誘導因子−Ａおよび／または−Ｂ（各々、ＴＧＦ−ＢおよびＴＧＦ−Ｂ２としても知られている、各々、ＣＩＦ−ＡおよびＣＩＦ−Ｂ）のごとき軟骨促進因子（類）および／または類骨誘導因子（ＯＩＦ）のごときもう１つの因子（類）を、補足ＴＳから放出される誘導因子（類）の濃度が軟骨形成を誘導するのに効果的である量にて、含有しそれを送達する。１の態様において、誘導因子類の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌないし１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌないし５００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは１００ないし２５０ｎｇ／ｍｌとすべきである。また、本態様は、ＴＳ中に、抗生物質のごとき薬物類、およびＥＧＦ、ＰＤＧＦおよびｂＦＧＦのごとき他の成長因子類を含有することもできる。軟骨誘導物質は、ＴＳを調製するのに使用されるフィブリノーゲンまたはカルシウムまたは水成分（類）に適当な濃度で含有させる。
補足ＴＳは、移植に先立って所望の最終軟骨形態に予め形状付与しておくか、あるいはＴＳを混合し重合させるときに、液体形態で受容者の身体に移植することができる。次いで、得られた形態を望むように細工して、必要な軟骨の所要形状を得る。また、軟骨誘導ＴＳ（ＣＩ−ＴＳ）混合物を用いて通常の移植体をプレコートすることもでき、結果は生体軟骨のコーティングを持つ通常の移植体となる。
前記したいずれかの技術を用い、次いで、ＣＩ−ＴＳを受容者の体内に移植する。この移植は異所性または正常位性とすることができる。適当な間隔の後、元のＣＩ−ＴＳ移植体の形態を持つ生体軟骨によってＣＩ−ＴＳは置き換えられる。
かかる移植体を用いて、損傷したまたは失われた軟骨を置き換え、あるいは人工移植体の組織一体性および／または機能を改良することができる。かかる使用の例は、鼻または耳組織の置き換えまたは再構築、イン・ビボで成長させた骨移植体上の機能的関節表面の生成、または人工移植体上の同様の表面を含む。また、関節に対して新しく平滑な軟骨を生じさせるためにＣＩ−ＴＳを用いて、慢性関節リウマチのごとき疾患によって損傷した軟骨の修復を達成することもできる。プラスチック／再構築外科処置におけるスペース充填適用に意図した移植体は、組織一体性を促進し、また外来性身体反応を低下させるために、ＣＩ−ＴＳから形成でき、あるいはＣＩ−ＴＳをコートすることができる。
現在の技術では、軟骨の導かれた再生は不可能であるので、本発明は進んでいる。何故ならば、本発明は、身体の天然に造りを十分に模擬する必要がある軟骨組織の再生を可能とするからである。この結果、整形外科適用および他の適用にための、改良された関節修復、人工関節および他の移植体が可能となる。
例えば、本態様は、外傷による、改良された整形外科移植体または改良されたプラスチック／再構築移植体を製造するために：先天的または病理学的に損傷または機能不全の軟骨につき関節修復のために：それらの組織一体性を増加させ、外来性身体反応を低下させるためにペースメーター移植体およびワイア類のコーティングを製造するために使用できる。
実施例２０
自己含有ＴＳ創傷包帯剤
本態様は自己含有ＴＳ創傷包帯剤または包帯であり、これは、ＦＧのトロンビンおよびフィブリノーゲン両成分を含有する。カルシウムはトロンビンおよび／またはフィブリノーゲン成分（類）に含有させる。トロンビンまたはフィブリノーゲン成分のいずれかまたは双方には、ＦＧＦまたはｂＦＧＦのごとき成長因子（類）、あるいは感染を阻害でき、創傷治癒を促進できおよび／または瘢痕形成を阻害できる鎮痛剤、抗生物質または他の薬物（類）のごとき薬物（類）を補足できるが、必ずしもそうする必要はない。補足は、意図した目的に効果的なように、例えば抗生物質が微生物の増殖を阻害し、鎮痛剤が苦痛を和らげるようなＴＳ中濃度である。
トロンビンおよびフィブリノーゲンは、不浸透性膜によって相互に離しておき、その対は膜のごとき他のもので覆う。トロンビンおよびフィブリノーゲンは、速蒸発性ゲル（例えば、メチルセルロース／アルコール／水）に含有させる。包帯は表面にコートできる。すなわち、ゲルパッドが使用の間に所定の位置に止まることを保証するためにゲルと接触させておくことができる（図３９参照）。
操作において、２成分を離しておく膜を取り除き、２成分を混合させる。次いで、外方膜を取り除き、包帯を創傷部位に適用する。トロンビンおよびフィブリノーゲン調製物の他の成分類は、丁度それらがＦＳのいずれかの適用でそうするように、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換を引き起こす。この結果、血液および流体の創傷からの喪失が自然に阻止され、感染に対する自然のバリアーが確立される。
同様の態様において、トロンビン成分とトロンビンゲルおよびフィブリノーゲンゲルを分離するプラスチックフィルムとを省くこともできる。従前にはトロンビンゲル中に入れたカルシウムは所望ならばフィブリノーゲンゲルに含ませることができ、あるいは含ませなくてもよい。操作において、外方不通気性プラスチックフィルムを取り除き、前記したごとくに包帯を創傷部位に直接適用する。トロンビンおよびカルシウムは当然創傷部位に存在し、次いで、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を誘導し、前記したごとく血液および流体の創傷からの喪失を阻止する。本態様は製造が簡便で、安価で容易であるという利点を有する。しかしながら、患者の創傷は不十分なトロンビンしか有しないという状況があり得る。それらの場合には、本発明の先の態様を使用すべきである。
本態様は現行の技術よりも進んでいる。というのは、成分の可溶化および混合に関する時間的遅延なくしてＴＳの創傷への迅速な適用を可能とするからである。また、それは、操作するのに技術的知識または技量を要しない。これらの特徴は、兵士用の外傷パック、救助労働者、救急／医療補助員チーム、消防士のごとき野外適用においての使用、一般公衆のための応急キットにおいての使用、および病院の緊急ルーム員による使用を理想的とする。小バージョンも一般公衆による使用に有用であり得る。
実施例２１
生体材料用の表面コーティングとしての補足ＴＳ
本態様は、動物の身体に移植すべき整形外科デバイスおよび他の生体材料の表面用コーティングとしての補足ＴＳを使用する。これらのデバイスの例は尿カテーテル、縫合、血管補綴、眼内レンズ、コンタクトレンズ、心臓弁、肩／肘／臀部／膝置換デバイス、全人工心臓である。不運なことに、これらの生体材料は細菌の接着およびコロニー化のための部位となり、これは結局は動物の生命を危険とする臨床的感染に導きかねない。この問題を最小化するために、生体材料を補足ＴＳでコートする。
本態様では、ＴＳを、成長因子（類）；抗生物質のごとき薬物（類）；ＢＭＰ；および／または培養細胞等で補足できる。ＴＳに取り込むことができる抗生物質の例は、限定されるものではないが、ペニシリン類；セファロスポリン類；テトラサイクリン類；クロラムフェニコール類；メトロニダゾール類；およびアミノグリコシド類を含む。ＴＳに取り込むことができる成長因子の例は、限定されるものではないが、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βを含む。ＴＳに取り込むことができるＢＭＰ類の例はＢＭＰ１ないし８を含む。ＤＢＭをＴＳに添加することもできる。ＴＳに取り込むことができる培養細胞の例は、限定されるものではないが、内皮細胞、骨芽細胞、線維芽細胞等を含む。
補足物（類）は、トロンビン、フィブリノーゲン、カルシウムまたは水成分（類）に含有させることができる。ＴＳ中の補足物の濃度は、その意図する目的に効果的であるように適当なものとする。例えば、抗生物質は生体材料上の微生物の増殖を阻止し、成長因子はＴＳ中および／または生体材料の表面の所望の細胞型（類）の増殖を誘導するようなものとする。
本発明は、チタンまたはチタン合金デバイス（例えば、固定プレート、肩／肘／臀部／膝置換デバイス、骨一体化歯科インプラント等）、固体シリコーン製品（例えば、Silastic鼻移植体、液体および／またはゲルシリコーン製品（例えば、***移植体および精巣移植体）、およびモノフィラメント、繊維集合体（例えば、綿、紙、不織布）、フィルム、スポンジ、バッグ等のごとき種々の形態であってもよい、創傷部位において通常の材料として使用される天然または合成ポリマーを含む、現行の生体材料製品についての改良である。
ＦＧは３成分：フィブリノーゲン（例えば、ＴＦＣ）：およびトロンビン（これらは共に凍結乾燥形態であってもよい）；ならびにカルシウムから製造される。凍結乾燥フィブリノーゲンは滅菌水で復元され、他方、トロンビン成分は塩化カルシウム溶液で復元される。補足物は混合に先立って３成分のいずれかに添加することができる。カルシウムを含有する適当な容量のフィブリノーゲンおよびトロンビンを混合してＦＧを得る。次いで、例えば、噴霧、塗布等によって、ＦＧをそのコーティングとして生体材料表面に適用する。別法として、移植体をＦＧが依然液体である間にそれに浸漬する。補足物は、ＦＧが生体材料表面にコートされる前または後にＦＧに添加することができる。例えば、ＦＧ−被覆移植体を、抗生物質がＴＳに拡散するような時間、抗生物質溶液に浸漬する。もう１つの例はＴＳでのデバイスのコーティングであり、その後、培養細胞をフィブリンコーティングに接種する。動物に移植される生体材料の表面を補足ＴＳでコーティングすると、細菌の生体材料への接着の阻止；生体材料に接着した細菌の増殖の阻止；局所免疫刺激および／または正規化；創傷治癒の促進；および周囲組織への生体材料の移植の促進を含めた種々の目的を達成するであろう。
実施例２２
さらなる自己含有ＴＳ創傷包帯剤
ＴＳ類は、ＦＧの必要なトロンビンおよびフィブリノーゲン成分を含有する、自己含有創傷包帯剤、またはフィブリンシーラント包帯として処方できる。自己含有包帯剤または包帯は使用が容易で、操作するのに進歩した技術的知識または技量を必要としない。
フィブリンシーラント包帯
本発明者らは、患者における創傷組織へ組織シール性組成物を適用するためのフィブリンシーラント包帯を調製し、ここに、該包帯は、順に：（１）閉塞性裏打ち；（２）該裏打ちの表面に面する創傷上の薬理学的に許容される接着剤層；および（３）接着剤層または裏打ちの表面に面する創傷に付着させた、有効量の（ａ）乾燥したウイルス不活化生成組織フィブリノーゲン複合体、（ｂ）乾燥したウイルス不活化トロンビンの組合せ、および（ｃ）塩化カルシウムよりなる乾燥物質の層を包含する。取り外し可能な耐水性軟プラスチック保護フィルムを乾燥物質の層および安定な貯蔵目的の包帯の露出した接着剤表面に置いた。操作において、耐水性保護フィルムを、創傷組織上への包帯の適用に先立って除去する。該包帯を、ＴＳが標的領域上で形成されるまで圧力をかけて適用した。
フィブリンシーラント包帯は、３０ｃｍ²の合計面積を有する、６ｃｍ×５ｃｍの寸法の通常の接着性シリコーンパッチを用いてテストした。水和に際して、ＴＳによって形成されるフィブリンの合計容量が１５ｃｃ（３０ｃｍ²×１／２ｃｍ）に等しくなるように、乾燥成分を接着性パッチ上に１／２ｃｍの深さまで置いた。使用した物質は：前記した局所用フィブリノーゲン複合体（ＴＦＣ）３６０ｍｇ；やはり前記したほぼ３４０Ｕのトロンビン：および８８ｍｇのＣａＣｌ₂（４０ｍＭ）であった。
乾燥物質層のための包帯の結合能力は、部分的には、均一に粉砕した微細な粉末としての乾燥物質の適用に依存していた。塩化カルシウムは粉砕して微細粉末とし、微細に粉砕した凍結乾燥ＴＦＣおよびトロンビンと混合し、粉末としてシリコーンパッチの接着剤層に適用し、接着させてフィブリンシーラントパッチを形成させた。フィブリンシーラント包帯のさらなるバージョンにおいて、乾燥物質を混合し、一緒に粉砕した。
圧力をかけると、有意により多い微粉砕粉末がシリコーンパッチに接着した。しかしながら、フィブリンシーラント包帯に適用した乾燥物質の量は定量可能であった。例えば、シリコーンパッチ裏打ちを用いる１の適用において、乾燥フィブリン成分で完全に覆われると、領域２×１ｃｍ²は重量で３０ｍｇだけ増加した。この測定値を、１５ｍｇ／ｃｍ²の裏打ち上に覆われた面積当たりの乾燥フィブリン成分質量に外挿した。
フィブリンシーラントパッチは、該フィブリンシーラント成分をスポンジの表面に隣接するように、組織創傷の見本として湿ったセルローススポンジに適用した。該スポンジは室温の蒸留水で従前に湿らせておいたものである。
フィブリンの形成は適用の３０秒以内に進行し始めた。適用から３分以内に、フィブリンゲルが形成され、組織シール性フィブリン血餅をスポンジに付着させた。内因的に利用可能な液体によって水和されたこの第１のパッチはＦＳＢ＃１と標識した。
従前の工程を反復して、パッチＦＳＢ＃２ないしＦＳＢ＃５を調製した。しかしながら、フィブリンシーラント包帯を湿ったセルローススポンジに対して置くに先立って、８ｍｌの暖かいＰＢＳを、パッチに付着した乾燥フィブリン成分に適用した。適用したパッチＦＳＢ＃２ないしＦＳＢ＃５のインキュベーションは、室温ではなく３７℃においてであった。

表１０に記載する結果は、乾燥物質が適用に先立って外因的に水和されるフィブリンシーラント包帯態様の適用を例示する。
パッチＦＳＢ＃３はトロンビン成分が存在しないことを除きＦＳＢ＃１と同様に調製した。パッチＦＳＢ＃４は、ＴＦＣ成分が存在しないことを除きＦＳＢ＃１と同様に調製した。パッチＦＳＢ＃５は、塩化カルシウム成分が存在しないことを除きＦＳＢ＃１と同様に調製した。各テストの結果は経時的に評価した。表１０に示すごとく、フィブリン成分をＰＢＳで水和させた場合に形成された凝固ゲルは、フィブリノーゲンまたはトロンビン成分をフィブリンシーラント包帯組成物から除くと溶液のままであった。同様に、カルシウム成分を、フィブリンシーラント包帯から、および水和する流体から除くと、３０分後に弱い水っぽいゲルが形成されたが、組成物は組織シール性フィブリン血餅に進展することはできなかった。
フィブリン血餅り形成およびそれが隣接する表面に結合した程度をより明確に可視化するために、少量のトルイジンブルーを粉砕して、色インジケーターとして粉末化フィブリン成分に入れた。
事実、十分に水和すると、シリコーンパッチは、乾燥フィブリン成分層の水和後に、フィブリン血餅から容易に除去された。
また、前記したごとくシリコーンパッチ上に処方されたフィブリンシーラント包帯は、ゼラチン表面でおよびイン・ビボにてラット組織上でテストすると、フィブリンシールを効果的に形成することが判明した。損傷していないラットについての基本的なイン・ビボテストを含めた、種々の材料および組織に対するフィブリンシールの成功した形成に基づき、前記実施例に記載したごとくに動物実験を続け、ＴＳ成分を評価して、フィブリンシーラント包帯の止血利用性を最適化し、適用すべき補足成分、例えば、成長ホルモン類、薬物類、抗生物質類、防腐剤等の送達動態を確立した。
自己発泡性フィブリンシーラント
本発明者らは、患者における創傷組織に組織シール性組成物を適用するための自己発泡性フィブリンシーラント包帯剤を調製し、ここに、有効量の（１）ウイルス不活化精製フィブリノーゲン複合体、（２）ウイルス不活化精製トロンビン、（３）カルシウム、および（４）生理学上許容される水和剤の組合せよりなる発泡性フォームとして包帯剤を適用し、ここに、該組成物は十分な厚みの皮膚創傷治癒を有意には阻害しない。実施において、成分が発泡性フォームとして創傷部位に送達され、それが数分内にフィブリンシールを形成するように、従前に記載したＴＳ成分は、加圧プロペラントと共に小型容器またはタンクに貯蔵されるであろう。
ベンチモデルテスト系を標準アミコン（Amicon）圧力チャンバーから調製して最適粒子サイズを決定する。粒子サイズは重要であることが判明した。予備実験により、ＴＦＣ、フィブリンおよびカルシウム成分の粒子サイズの減少の結果、試薬を水和するのに要する時間が有意に減少することが明らかにされた。
また、テストは、全ての試薬を単一貯蔵器内で合する可能性、あるいは各成分を適用まで別々の貯蔵器中に維持するのが有利か否かを決定することにも関連する。
恐らくはより高価ではあるが、後者の（多数の別々の貯蔵器を有する）小型容器の試作品は安定性および長期貯蔵の点で有利と判明するであろう。
テスト系は、医薬上許容される水和剤（例えば、水またはＰＢＳ）、および加圧圧縮ガスシリンダーを含有する加圧貯蔵器によって駆動される１または２の圧力容器よりなる。試薬は、適当なチャンバー（類）に入れ、貯蔵器には所望の圧力にてプロペラントで飽和させた水和剤を充填する。それらの貯蔵器中の水および試薬の混合は結合バルブを開くことによって達成される。出力は単一のラインに向けられるか、あるいは成分が別々のままである場合には、ヘメデイクス・シーラント・ディスペンサー（Hemedics Fibrin Sealant Dispenser）の連結ピースに向けられる。
本ケースでは、ＴＦＣを３ｃｃの水で再水和させ、３７℃まで加温して表１１に示す濃度とした。トロンビンは０．５ｃｃのＣａＣｌ₂溶液（１００ｍＭ）で再水和させて表１１に示した濃度とした。水和させた成分を混合し、炭酸水（１０ｃｃ）を添加して、表１１に示した容量を得た。得られた発泡性混合物を真空ジャーに入れ、発泡を増大させた。フォームが乾燥するまで真空圧をかけた。その結果、永久的一体性のフィブリンの発泡性塊となり、これはほぼ５倍発砲し、自己接着性であって隣接する組織表面にも接着性であった。
また、フォームを較正したプラスチックビーカー中で定量的に測定した。２分後、フォームの容量を測定し、質量を穏やかに精査して、それが凝固したことを判断した。自己発泡性フィブリンシーラントの発泡の定量的測定は表１１に示す。一旦凝固したら、発泡性フォームはもはや新しい表面に対して接着性ではなかった。
自己発泡性フィブリン包帯剤の成功した形成に基づき、前記実施例のごとく動物実験を行って、ＴＳ組成物を評価し、自己発泡フィブリンシーラント包帯剤の止血利用性を最適化し、添加すべき補足成分、例えば、成長ホルモン類、薬物類、抗生物質類の送達動態が確立されるであろう。
本明細書およびここに開示した本発明の実施を考慮することより、本発明の他の態様は当業者に明らかであろう。修飾は当業者に明らかであるので、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されることを意図する。

Claims (27)

1. （ｉ）閉塞性の吸収性または非吸収性の裏打ち、（ｉｉ）生理学上許容される接着剤層、および（ｉｉｉ）第ＸＩＩＩ因子、トロンビンおよびＣａ⁺⁺の存在下でフィブリンマトリックスを形成できる量のフィブリノーゲンを含む、止血性を有する乾燥物質の成分層を包含し、該接着剤層が、第ＸＩＩＩ因子、トロンビンおよびＣａ⁺⁺の存在下でフィブリノーゲンから形成されるフィブリンマトリックスよりも低い剪断または引張強度を有する少なくとも１種の物質を含み、それにより、フィブリンマトリックスまたは創傷を囲む組織に対する損傷なくして裏打ちの除去を可能とすることを特徴とするフィブリンシーラント包帯。
2. 第ＸＩＩＩ因子、トロンビンおよびＣａ⁺⁺よりなる群から選択される少なくとも１の成分をさらに含む請求項１記載のフィブリンシーラント包帯。
3. 第ＸＩＩＩ因子、トロンビンおよびＣａ⁺⁺を含む請求項１記載のフィブリンシーラント包帯。
4. 該成分層が、該接着剤層の創傷に面する表面に付着されている請求項１ないし３のいずれか１項記載のフィブリンシーラント包帯。
5. 該生理学上許容される接着剤層が、裏打ちの特定の領域に付着されている請求項１ないし４のいずれか１項記載のフィブリンシーラント包帯。
6. 患者への該包帯の適用に際して、妨害のない（unencumbered）接着剤層を創傷に隣接する組織に直接適用し得、成分層を創傷の上に置くように、接着剤層が成分層を越えて伸びる請求項５記載のフィブリンシーラント包帯。
7. 該接着剤層が適用に際して可溶化されあるいは粘着性が低くなり、それにより、フィブリンマトリックスからの裏打ちの除去を可能とするものである請求項１ないし６のいずれか１項記載のフィブリンシーラント包帯。
8. 該裏打ちが、生理学的に許容される接着剤層であり、これに成分層が創傷に面する表面において付着されている請求項１ないし７のいずれか１項記載のフィブリンシーラント包帯。
9. 成分層および該接着剤の露出表面上に取り外し可能で耐水性の保護フィルムをさらに含み、該フイルムは該包帯の適用に先立って除去されるものである請求項１ないし８のいずれか１項記載のフィブリンシーラント包帯。
10. 該マトリックスまたは成分層が、以下の補足物類：鎮痛剤類、抗微生物組成物類、抗生物質類、抗凝固剤類、抗炎症剤組成物類、抗増殖剤、サイトカイン類、細胞毒類、細胞増殖阻害剤類、化学治療剤類、成長因子類、ホルモン類、インターフェロン類、脂質類、オリゴヌクレオチド類、骨誘導剤類、ポリマー類、多糖類、プロテオグリカン類、ポリペプチド類、プロテアーゼ阻害剤類、ステロイド類、血管収縮剤類、血管拡張剤類、ビタミン類、ミネラル類および安定化剤類よりなる群から選択される少なくとも１種の化合物をさらに含む請求項１ないし９のいずれか１項記載のフィブリンシーラント包帯。
11. 該成長因子が、線維芽細胞成長因子−１、線維芽細胞成長因子−２および線維芽細胞成長因子−４等の線維芽細胞成長因子類；血小板由来成長因子；インスリン結合成長因子−１およびインスリン結合成長因子−２等のインスリン結合成長因子類；表皮細胞成長因子；形質転換成長因子−αおよび形質転換成長因子−β等の形質転換成長因子類；軟骨誘導因子−Ａおよび軟骨誘導因子−Ｂ等の軟骨誘導因子類；類骨誘導因子；オステオゲニンおよび他の骨成長因子；骨形態発生成長因子；コラーゲン成長因子；ヘパリン結合成長因子−１およびヘパリン結合成長因子−２等のヘパリン結合成長因子類；サイトカイン類；インターフェロン類；ホルモン類および該成長因子類の生物学的に活性な誘導体類よりなる群から選択される請求項１０記載のフィブリンシーラント包帯。
12. 該マトリックスまたは成分層が、さらに、有効量の１種以上の阻害性化合物類、１種以上の促進性化合物類、およびその生物学的適合誘導体類よりなる群から選択される少なくとも１種以上の化合物を含み、該阻害性化合物類は該成長因子の生物学的機能に干渉する因子類の生化学的活性を阻害し、他方、該促進性化合物類は該成長因子の生物学的活性を促進しおよび／または媒介するものである請求項１０または１１記載のフィブリンシーラント包帯。
13. 該細胞毒性または細胞増殖阻害性組成物が、アルキル化剤類、酵素阻害剤類、増殖阻害剤類、溶解剤類、ＤＮＡ合成阻害剤類、膜浸透性修飾剤類、ＤＮＡインターカレーター類、代謝物類、マスタード誘導体類、蛋白質生産阻害剤類、リボソーム阻害剤類、アポトーシスのインデューサー類、インスリン類、ステロイド類、エテトロゲン、テストステロン、ホルモン類似体類、インスリン類、タキソール、タキソテーレ、ゲンタマイシン、リシン、ジフテリア毒素、神経毒素類、ヘビ毒およびそれらの機能的等価類似体よりなる群から選択される化学療法で用いる少なくとも１種の組成物を含む請求項１０記載のフィブリンシーラント包帯。
14. 該化合物が長期間放出される請求項１ないし１３のいずれか１項記載のフィブリンシーラント包帯。
15. 該化合物が固体形態にある請求項１ないし１４のいずれか１項記載のフィブリンシーラント包帯。
16. 適用に際して、該化合物が担体中の溶液中の該マトリックスに導入され、該担体はそこに含有される該化合物よりも高い溶解速度を有して、それにより該化合物は固体沈殿としてマトリックス内に沈積される請求項１５記載のフィブリンシーラント包帯。
17. 該化合物が該フィブリンマトリックスと相互作用する請求項１４記載のフィブリンシーラント包帯。
18. 該化合物が十分に低溶解度のものであって、該フィブリンマトリックスからの局所化された持続性放出を可能とする請求項１４記載のフィブリンシーラント包帯。
19. 該化合物の質量が、該フィブリンマトリックスの容量に溶解する量を超え、それにより、該フィブリンマトリックスからの局所化された持続性放出を可能とする請求項１４記載のフィブリンシーラント包帯。
20. 適用に際して、該化合物がエマルジョンとして該マトリックスに導入される請求項１９記載のフィブリンシーラント包帯。
21. 該マトリックスまたは成分層が、さらに、以下の：ヒト無機質脱落骨マトリックスを含めた無機質脱落骨マトリックス；骨形態発生蛋白質１ないし８；およびそれらの生物学的適合誘導体類のうちの少なくとも１種を含む請求項１ないし２０のいずれか１項記載のフィブリンシーラント包帯。
22. 該マトリックスおよび／または成分層がフィブリン、コラーゲン、ゼラチン、キチンまたはキトサン、あるいはそれらの生物学的適合誘導体を含む請求項１ないし２１のいずれか１項記載のフィブリンシーラント包帯。
23. 吸収性裏打ちがフィブリン、コラーゲン、ゼラチン、キチンまたはキトサン、あるいはそれらの生物学的適合誘導体を含む請求項１ないし２２のいずれか１項記載のフィブリンシーラント包帯。
24. 生理学上許容される水和剤が該包帯の別の層に含有される請求項１ないし２３のいずれか１項記載のフィブリンシーラント包帯。
25. 該成分類が、水和に際して気体を生じる少なくとも１種の物質を含む請求項１ないし２４のいずれか１項に記載のフィブリンシーラント包帯。
26. 化学発泡剤および／または水和剤を含む請求項２５記載のフィブリンシーラント包帯。
27. 発泡が、発泡を引き起こすのに十分な量の水和に際しての成分物質；活性化または放出に際して、フィブリン形成性成分類の発泡を引き起こす、気体で過飽和された水和剤；または活性化または放出に際してフィブリン形成性成分類の発泡を引き起こすプロペラントから生じた気体に由来する請求項２５または２６記載のフィブリンシーラント包帯。

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