JP4223536B2 - 脳型有機アニオントランスポーターとその遺伝子 - Google Patents
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Description
尿細管細胞や肝細胞の側底膜を介した有機アニオンの取り込みについては、これまで摘出臓器灌流法や単離細胞膜小胞系などを用いた実験系により研究されてきた。
一方、脳においても有機アニオン輸送がおこなわれていることも複数の実験結果から推測されている。脳における有機アニオン輸送は、主に内因性および外来性の有機アニオンの脳外への***に働いているものと考えられる。
脳における有機アニオン輸送は、内因性アニオンおよび外来性異物の脳からの排除という重要な役割を担っていると予想されているにも関わらず、生理的実験が困難なことから、腎臓や肝臓以上にその輸送の詳細は不明である。
昨年、本発明者らは独自に、腎臓での有機アニオン輸送において最も重要な役割を果たしている有機アニオントランスポーターOAT1の単離に成功し(Sekine, T.ら、J Biol Chem 272巻, 18526-9頁、1997)、既に特許出願済みである。OAT1は化学構造の異なる多くの有機アニオンを輸送することの出来るトランスポーターであり、種々のアニオン性薬物の輸送も行っている。
最近本発明者らはさらに、OAT1とアミノ酸レベルで40%台の弱い相同性を持つ肝特異的有機アニオントランスポーター(OAT2)を同定した(FEBS letter 429巻、179-182頁、1998年)(特願平10−169174号)。
OAT1およびOAT2の単離、同定は有機アニオントランスポーターがファミリーを形成することを示している。さらにOAT2が肝特異的に発現していることから、このファミリーが腎特異的ではなく、種々の臓器にも発現していることも示唆する。
他方、肝臓の側底膜における有機アニオン輸送は複雑であり、特に肝細胞内で多量に産生される抱合体(その多くは有機アニオン)の血中への流出経路は未だ不明である。この肝臓での有機アニオン輸送についても、OAT2を含む上記有機アニオントランスポーターのみでは説明しきれず、さらなる未知のトランスポーターの存在が予想される
本発明のタンパク質は、前記した有機アニオントランスポーターOAT3である配列番号2(ヒト)又は4(ラット)で示されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば、配列番号2又は4で示されたアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとは、通常、ハイブリダイゼーションを、5×SSC又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、37〜42℃の温度条件下、約12時間行い、5×SSCまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で予備洗浄を行った後に、1×SSC又はこれと同等の塩濃度で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジェンシーを得るためには、洗浄を0.1×SSC又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
さらに、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸の部分配列又は当該配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチドに関する。
また、本発明は、本発明のタンパク質または、これと免疫学的同等性を有するポリペプチドに対する抗体に関する。
遺伝子のスクリーニングおよび単離は、ホモロジースクリーニングおよびPCRスクリーニングなどにより好適に実施できる。得られたcDNAは、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質、即ちOAT3のアミノ酸配列を決定することができる。
得られたcDNAが有機アニオントランスポーター遺伝子のcDNAであること、即ちcDNAにコードされた遺伝子産物が有機アニオントランスポーターであることは、例えば次のようにして検証することができる。即ち、得られたOAT3遺伝子から調製したcRNAを卵母細胞に導入して発現させ、有機アニオンを細胞内に輸送する(取り込む)能力を、適当な有機アニオンを基質とする通常の取り込み実験(Sekine, T.ら、J Biol Chem 272巻, 18526-9頁、1997)により、細胞内への基質取り込みを測定することにより確認できる。
また、発現細胞に同様の取り込み実験を応用して、OAT3の輸送特性や基質特異性などを調べることができる。
配列表の配列番号1にこのような方法により得られたヒトの有機アニオントランスポーターOAT3のcDNAの塩基配列を示し、配列番号2にそのアミノ酸配列を示す。
cDNAライブラリー及びゲノミックDNAライブラリー等のDNAライブラリーは例えば、「Molecular Cloning;Sambrook, J., Fritsh, E.F.およびManiatis, T.著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊」に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合にはこれを用いてもよい。
また、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸の部分配列又は当該配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチドに関する。このようなヌクレオチドとしては、例えば、配列番号1又は3で示される塩基配列の中の通常、連続する14塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドを用いることができ、ハイブリダイズをより特異的とするためには、部分配列としてより長い配列、例えば20塩基以上あるいは30塩基以上の配列を用いても良い。これらのヌクレオチドは、必要に応じて放射性元素や、蛍光性物質又は化学発光物質などを用いて標識化することもできる。
本発明の配列番号1又は3で示される塩基配列の中の連続する14塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドは、本発明の有機アニオントランスポーターOAT3をコードする塩基配列中の特異的な塩基配列を有するものが好ましく、必要により標識化されていてもよい。
多選択性有機アニオントランスポーター3(OAT3)cDNAの単離とその解析
(1)OAT1、OAT2、OCT1の塩基配列情報を基にしたデジェネレイトプライマー(degenerate primer)の作成
既に本発明者らが単離したOAT1、OAT2、および報告されているOCT1の塩基配列情報から、これら3つのトランスポーター間で共通するアミノ酸配列(OAT1のアミノ酸配列の267−275および447−452に相当部分)より、デジェネレイトプライマー(degenerate primer)を作成した。
このPCR産物を、TAクローニングキット(インヴィトロゲン社製)を用いてクローン化し、そのいくつかの塩基配列を決定したところ、OAT1とアミノ酸レベルで50%台の相同性を有する新規cDNA(B10)が得られた。
(1)上記により得られたクローン(rkl411)を含むプラスミドから、T7RNAポリメラーゼを用いて、インビトロでcRNA(cDNAに相補的なRNA)を調製した(Sekine, T., et al. J Biol Chem 272巻、18526-9頁、1997年参照)。
得られたcRNAを、既に報告されている方法に従い(Sekine, T., et al. J Biol Chem 272巻、18526-9頁、1997年)、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細胞について放射能標識された種々の有機アニオンおよび有機カチオンによる取り込み実験を行った。この結果、図1に示すようにrkl411を発現させた卵母細胞は14C−PAH(パラアミノ馬尿酸)、3H−オクラトキシンA、3H−エストロン硫酸の取り込みを示すことが判明した。これに対して代表的な有機カチオンである14C−TEA(テトラエチルアンモニウム)を輸送しなかった。
ラットの各組織におけるOAT3遺伝子の発現(ノーザンブロッティング)の解析を行った。OAT3 cDNAの全長を32P−dCTPでラベルし、これをプローブとして用いてラットの種々の組織から抽出したRNAに対してノーザンブロッティングを以下のように行った。3μgのポリ(A)+RNAを1%アガロース/ホルムアルデヒドゲルで電気泳動した後にニトロセルロースフィルターにトランスファーした。このフィルターを42℃で、32P−dCTPでラベルしたOAT3 cDNA全長を含んだハイブリダイゼーション液で一晩ハイブリダイセーションを行った。フィルターを65℃にて、0.1%SDSを含む0.1xSSCで洗浄した。
ノーザンブロットの結果(図4参照)、腎臓、肝臓、脳において、2.4Kb付近に強いバンドが検出された。また目に弱い発現が観察された。
OAT3がOATファミリーのメンバーの中では最も強く脳に発現していたため、その脳での役割を推測する試みとして、神経伝達物質の種々の代謝物(主に有機アニオン)によるOAT3の輸送阻害実験を行った。図5に示すように、ノルアドレナリンやセロトニン代謝物はOAT3によるエストロン硫酸輸送を阻害し、それら自身がOAT3の基質となる可能性を示した。この事実は、OAT3の脳型での役割のひとつとして神経伝達物質の代謝物の脳外排出作用を示唆するものである。
ヒト型多選択性有機アニオントランスポーター3(OAT3)cDNAの単離とその解析
既に本発明者らが単離したラットOAT3のcDNAを用いてEST(expressed sequence tag)データベースを検索したところ、ラットOAT3と高い相同性を有するヒトESTクローン(H20345)を同定した。このクロ−−ンの塩基配列の一部(333bp)をPCR法を用いて合成した。このcDNA断片を32Pでラベルしたものをプローブとして用い、以下のようにスクリーニングを行った。
また、cDNAの塩基配列を表2〜6に示し、そのアミノ酸配列を塩基配列と対応させて表3に示す。
hOAT3の機能の特定
上記により得られたhOAT3を含むブラスミドから、T7RNAボリメラーセを用いて、インビトロでcRNA(cDNAに相補的なRNA)をセキネらの方法(Sekine, T., et al., J. Biol. Chem., 272, 18526-9 (1997))に準じて調製した。
得られたhOAT3 cRNAを、既に報告されているセキネらの方法(Sekine, T., et al., J. Biol. Chem., 272, 18526-9 (1997))に従い、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細胞について放射能標識された種々の有機アニオンおよび有機カチオンの取り込み実験を行った。コントロール卵母細胞(hOAT3 cRNAを注入していない卵母細胞)、およびhOAT3 cRNAを注入した卵母細胞を、以下の放射能標識体を含む緩衝液中で1時間培養し、卵母細胞内への放射能標識体の取り込みを測定した。
この結果を図6〜図18に示す。各図の白色(open column)の方はコントロール卵母細胞を用いた場合を示し、黒色(closed column)の方はhOAT3 cRNAを注入した卵母細胞を用いた場合を示す。図6は14C−PAH(パラアミノ馬尿酸)(10μM)、図7は3H−エストロン硫酸(50nM)、図8は3H−デヒドロエピアンドロステロン硫酸(50nM)、図9は3H−オクラトキシンA(100nM)、図10は3H−シメチジン(150nM)、図11は3H−エストラジオールグルクロニド(50nM)、図12は3H−プロスタグランジンE2(1nM)、図13は14C−タウロコール酸(1μM)、図14は14C−グルタル酸(10μM)、図15は3H−メトトレキセート(100nM)、図16は14C−サリチル酸(1μM)、図17は14C−インドメタシン(10μM)、図18は14C−コール酸(10μM)の場合をそれぞれ示す。
この結果、hOAT3を発現させた卵母細胞は、14C−PAH(パラアミノ馬尿酸)、3H−エストロン硫酸、3H−デヒドロエピアンドロステロン硫酸、3H−オクラトキシンA、3H−シメチジン、3H−エストラジオールグルクロニド、3H−プロスタグランジンE2、14C−タウロコール酸、14C−グルタル酸、3H−メトトレキセート、14C−サリチル酸、14C−インドメタシン、14C−コール酸の取り込みを示すことが判明した。 これに対して、hOAT3は代表的な有機カチオンである14C−TEA(テトラエチルアンモニウム)を輸送しなかった(図には示さず)。
3H−エストロン硫酸の取り込み実験は、hOAT3 cRNAを注入した卵母細胞を用い、前記に記載した方法に準じて実施した。
即ち、コントロール卵母細胞(hOAT3 cRNAを注入していない卵母細胞)、およびhOAT3 cRNAを注入した卵母細胞を、50nM3H−エストロン硫酸単独、又は500μM若しくは図に表示されている濃度の放射能非標識化合物を含む緩衝液中で1時間培養し、3H−工スト口ン硫酸の取り込みを測定した。結果は、50nM3H−エスト口ン硫酸単独を含む緩衝液中でのhOAT3 cRNAを注入した卵母細胞の示す取り込みを100%とし、阻害薬を含む緩衝液中での各々の値を%で表示した。
本発明の有機アニオントランスポーターは、種々の薬物の細胞への取り込みに関与しており、薬物の生体内での動態にも関与している。したがって、本発明の有機アニオントランスポーターは、細胞の維持や活性化のみならず、薬物の動態をスクリーニングする際にも有用なものである。
Claims (8)
- 配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる有機アニオントランスポーターOAT3を発現する組み換え細胞と化合物とを溶液中で培養することを特徴とする、化合物の前記組み換え細胞への取込能の測定方法。
- 少なくとも以下の(1)〜(3)の工程;
(1)配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる有機アニオントランスポーターOAT3を発現する組み換え細胞を得る工程、
(2)化合物を工程(1)で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、当該細胞内への化合物の取り込み量を測定する工程、及び
(3)工程(2)で得られた測定値がコントロール細胞を用いて同様の操作を行った場合の測定値と比較して有意な差を示した化合物を選択する工程
を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 少なくとも以下の(1)〜(4)の工程;
(1)配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる有機アニオントランスポーターOAT3を発現する組み換え細胞を得る工程、
(2)有機アニオントランスポーターOAT3によって前記組み換え細胞内に取り込まれることが確認された化合物を少なくとも2種以上選択し、それぞれを単独で、工程(1)で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、前記組み換え細胞への各化合物の取り込み量を測定する工程、
(3)工程(2)で選択した2種以上の化合物を組み合わせて、工程(1)で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、工程(2)と同一条件下で同一時間培養後、前記組み換え細胞内へのそれぞれの化合物の取り込み量を測定する工程、及び
(4)工程(3)で得られた測定値を工程(2)で得られた測定値と比較することで、選択された2種以上の化合物同士の相互作用を観察する工程、
を含むことを特徴とする、請求項1に記載の測定方法。 - 配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる有機アニオントランスポーターOAT3を発現する組み換え細胞と化合物とを溶液中で培養することを特徴とする、化合物の脳細胞への取込能の測定方法。
- 少なくとも以下の(1)〜(3)の工程;
(1)配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる有機アニオントランスポーターOAT3を発現する組み換え細胞を得る工程、
(2)化合物を工程(1)で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、当該細胞内への化合物の取り込み量を測定する工程、及び
(3)工程(2)で得られた測定値がコントロール細胞を用いて同様の操作を行った場合の測定値と比較して有意な差を示した化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とする、請求項4に記載の方法。 - 前記化合物の脳細胞への取り込み能が、脳細胞内に取り込まれることが既知の2種以上の化合物同士の相互作用に基づく取り込み能であって、少なくとも以下の(1)〜(4)の工程を含むことを特徴とする、請求項4に記載の測定方法;
(1)配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる有機アニオントランスポーターOAT3を発現する組み換え細胞を得る工程、
(2)脳細胞内に取り込まれることが既知の化合物を少なくとも2種以上選択し、それぞれを単独で、工程(1)で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、前記組み換え細胞への各化合物の取り込み量を測定する工程、
(3)工程(2)で選択した2種以上の化合物を組み合わせて、工程(1)で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、工程(2)と同一条件下で同一時間培養後、前記組み換え細胞内へのそれぞれの化合物の取り込み量を測定する工程、及び
(4)工程(3)で得られた測定値を工程(2)で得られた測定値と比較することで、選択された2種以上の脳細胞内に取り込まれることが既知の化合物同士の相互作用を観察する工程。 - 少なくとも以下の(1)〜(4)の工程;
(1)配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる有機アニオントランスポーターOAT3を発現する組み換え細胞を得る工程;
(2)有機アニオントランスポーターOAT3によって前記組み換え細胞内に取り込まれることが確認された化合物を、工程(1)で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、当該組み換え細胞内への当該確認された化合物の取り込み量を測定する工程、
(3)試験化合物を工程(2)で用いたと同一の確認された化合物と共に工程(1)で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、工程(2)と同一条件下で同一時間培養後、当該組み換え細胞内への前記確認された化合物の取り込み量を測定する工程、及び
(4)工程(3)で得られた測定値が工程(2)で得られた測定値と比較して有意な差を示した場合の試験化合物を選択する工程、
を含む、有機アニオントランスポーターOAT3の有機アニオン取り込み能を促進又は阻害する化合物をスクリーニングする方法。 - 少なくとも以下の(1)〜(4)の工程;
(1)配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる有機アニオントランスポーターOAT3を発現する組み換え細胞を得る工程;
(2)脳細胞内に取り込まれることが既知の化合物を工程(1)で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、一定時間培養後、当該組み換え細胞内への当該既知の化合物の取り込み量を測定する工程、
(3)試験化合物を、工程(2)で用いたと同一の化合物と共に、工程(1)で得られた組み換え細胞を含む溶液に添加し、工程(2)と同一条件下で同一時間培養後、当該組み換え細胞内への前記確認された化合物の取り込み量を測定する工程、及び
(4)工程(3)で得られた測定値が工程(2)で得られた測定値と比較して有意な差を示した場合の試験化合物を選択する工程。
を含む、脳細胞内に取り込まれることが既知の化合物の脳細胞への取り込み能を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法。
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