JP4214109B2 - 畜水産物中の残留動物用薬剤の抽出液 - Google Patents
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Description
動物用薬剤の中でも、特に抗菌性物質(例えば抗生物質、合成抗菌剤等)は、現在の大量飼育方式により種類・使用量ともに増加傾向がみられており、畜水産物への残留の可能性が指摘されている。
しかし、現在、食品衛生法で定められている動物用薬剤の中でも、スピラマイシン、チルミコシン、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、ネオマイシンなどの抗生物質類やキノキサリンカルボン酸、シロマジンなど極性の高い化合物を多成分同時に分析する手法は開発されておらず、問題となっている。係る多成分同時分析を行うには、検体である畜水産物から複数の残留動物用薬剤を一斉に抽出する必要がある。有機溶媒に可溶性の動物用薬剤については、抽出液として有機溶媒を使用することにより、係る問題を解消し得ることが明らかとなった(例えば、非特許文献1参照)。しかし、有機溶媒難溶性の薬剤については、有機溶剤は使用し得ないので、抽出工程に問題があった。
Howells, L., Sauer, M. J., Analyst, 126, 155-160 (2001)
本発明者らは、係る問題点を解消するために種々検討した結果、特定の性状からなる抽出液を使用することにより、複数の残留動物用薬剤を変性させることなく且つ効率よく、一斉に抽出することが可能であることを見出した。本発明は係る知見に基づくものであって、畜水産物中に残留する動物用薬剤、特に抗菌性物質の一斉抽出に有用な抽出液を提供するものである。
まず、抽出液の極性に基づいて、対象物質を2つに分けた。対象その1として有機溶媒にも可溶なテトラサイクリン等の21化合物を選択し、対象その2としては極性が高く有機溶媒に溶けにくいアミノグリコシド系抗生物質4化合物(ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシン、スペクチノマイシン及びゲンタマイシン)を選択した。
まず、牛肉に所定量の対象物質を添加した検体から、pH7.0のマキルベン緩衝液・EDTA・メタノール混合溶媒による抽出及びC18固相抽出カラムを用いた精製による添加回収試験を実施した。
対象1の21化合物に関しては、20ppbの濃度で添加回収試験を行った結果、回収率ならびに変動係数は概ね公定書の基準に準じた結果が得られた。
しかし、このような抽出溶媒を用いるとエリスロマイシンなど酸性条件下で不安定な化合物が分解されてしまう。そのため多成分一斉分析法には低pHの抽出液を使用することができない。一方、クロルテトラサイクリンなどアルカリ条件下で不安定になる化合物もあるため、多成分を一斉に測定するためには中性条件下で抽出する必要がある。そこで、中性付近の条件で抽出法を検討した。
このような結果から、本発明者らは、後記実施例に示されるように、抽出液の液性及びメタリン酸濃度を種々検討し、液性が中性付近であっても、特定のメタリン酸濃度とすることにより、より具体的には0.05〜1%のメタリン酸を含有し、pH6.0〜7.0の緩衝液からなる抽出液を使用することにより、動物用薬剤、特に抗菌性物質をその安定性を損なうことなく一斉に抽出し得ることが明らかとなった。なお、このような濃度・pHのメタリン酸含有緩衝液には、公定法で使用される目的である除タンパク質の効果は認められず、化合物としてのメタリン酸の存在自体が抽出効果に重要であると考えられた。
また、メタリン酸濃度は0.05〜1%に調整され、好ましくは0.1〜0.5%である。メタリン酸濃度が0.05%未満ではゲンタマイシンの抽出ができないおそれがある。
本発明の抽出液は、上記の適当なpHの緩衝液に、メタリン酸が上記の濃度となるように添加することにより調製することができる。この際、抽出効率を向上させるため、必要に応じて、EDTAなどのキレート剤、メタノールなどの水性有機溶媒を添加してもよい。好ましくは、上記緩衝液:キレート剤:メタノールを、15:1:4程度の割合からなる抽出液が使用される。
上記の検体に対する抽出液の使用量としては、検体と抽出液の比が1:1〜10(w/v比、以下同様)、好ましくは1:2〜8、より好ましく1:2.5〜5程度となるように調整する。検体1に対する抽出液量が1未満であると抽出が不十分になるおそれがあり、また10を越えても抽出の点では問題はないが、抽出液量が増えて操作が煩雑になるおそれがある。
検体である畜水産物としては、畜肉(例えば牛肉、豚肉、鶏肉、兎肉、羊肉、アヒル肉等)、水産物(例えばハマチ、タイ、フグ、エビ、ウナギ、コイ、マス、カキ等)が挙げられる。なお、動物用薬剤による環境汚染を調査するような場合には、自然界から採取した動物を検体とすることもできる。
精製法としては、例えばC18固相抽出カラムなどが使用され、この際、当該カラムに吸着させるために抽出液にイオンペア試薬であるHFBAを添加してもよい。
また、残留動物用薬剤の測定には高速液体クロマトグラフィー/質量分析法などにより行うことができる。
以下の方法で、添加回収試験を行った。なお、アミノグリコシド系の添加回収試験は食品衛生法で定められている残留基準値を勘案して200ppbの添加量で実施した。
アミノグリコシド系抗生物質(ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ゲンタマイシン)の標準試料のいずれかを200ppbの濃度になるように添加した、又は添加しなかった(コントロール用)検体(牛肉)5gを、0.1%メタリン酸含有pH 7マキルベン溶液・EDTA・メタノール混合溶媒25mlでホモジナイズして抽出した。
抽出後の上澄みを25mlの10mM HFBAで希釈し、C18固相抽出カラム(12cc 500mg)に付加した後、5mM HFBA 5mlで洗浄し、HFBA/MeOH (1:1)20mlで溶出した。
溶出液を濃縮・乾固した後、DMSO/水混合溶媒(1.0ml)で再溶解し、以下の条件でLC/MS/MSによる分析に供し、回収率(%)を求めた。高速液体クロマトグラフィー部分の移動層にはA液(0.3% 酢酸、10mM 酢酸アンモニウム)とB液(20%メタノール含有アセトニトリル)のグラジエントを用い、親水クロマトカラムより流速220μl/minで溶出を行った。質量分析は、装置にアプライドバイオシステムズ社API2000を、イオン化モードはESIポジティブならびにネガティブを用い、Spray Voltage (Pos):5000、Spray Voltage (Neg):-4200、ターボガス温度:550 ℃で実施した。
抽出液の0.1%メタリン酸含有pH7マキルベン溶液の代わりに、0.3%メタリン酸含有pH6マキルベン溶液を使用し回収を行った以外は、実施例1の通り測定した。
抽出液の0.1%メタリン酸含有pH7マキルベン溶液の代わりに、0.5%メタリン酸含有pH6マキルベン溶液を使用し回収を行った以外は、実施例1の通り測定した。
抽出液の0.1%メタリン酸含有pH7マキルベン溶液の代わりに、1%メタリン酸含有pH6マキルベン溶液を使用し回収を行った以外は、実施例1の通り測定した。
抽出液の0.1%メタリン酸含有pH7マキルベン溶液の代わりに、メタリン酸非含有pH6マキルベン溶液を使用し回収を行った以外は、実施例1の通り測定した。
抽出液の0.1%メタリン酸含有pH7マキルベン溶液の代わりに、0.01%メタリン酸含有pH6マキルベン溶液を使用し回収を行った以外は、実施例1の通り測定した。
上記の実施例1、実施例2、実施例3、実施例4にて、LC/MS/MSで得られたクロマトグラムを観察したところ、肉抽出液にはピークがほとんど検出されず定性がしやすく擬陽性が出にくいことがわかった。また、ベースラインも低いことからS/Nから求められる定量下限も数十ppb前後まで可能であることがわかった。
前記の対象その1である有機溶媒にも可溶なテトラサイクリン等19化合物について、実施例1と同様に、0.1%メタリン酸含有pH 7マキルベン溶液・EDTA・メタノール混合溶媒を抽出液として使用して添加回収試験を行った。その結果を表2に示す。
表2に示されるように、係る対象その1である物質についても良好な抽出結果が得られた。
前記の結果と併せて、本発明の抽出液を使用することにより、幅広い残留動物用薬剤の抽出が可能になることを確認することができ、抗生物質等の高極性化合物であっても多成分一斉分析の実施が可能となった。
Claims (4)
- 0.05〜1%(w/v)のメタリン酸を含有し、pH6.0〜7.0の緩衝液からなる畜水産物中の残留動物用薬剤の抽出液。
- 動物用薬剤が、抗菌性物質である請求項1記載の畜水産物中の残留動物用薬剤の抽出液。
- 抗菌性物質が、アミノグリコシド系抗生物質である請求項2記載の畜水産物中の残留動物用薬剤の抽出液。
- 緩衝液がマキルベン緩衝液である請求項1〜3の何れかに記載の畜水産物中の残留動物用薬剤の抽出液。
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