JP4213759B2 - Genotype of target nucleic acid and method for determining mutation, method for immobilizing nucleic acid fragment on insoluble support, method for purifying and amplifying desired nucleic acid, and genotype assay kit - Google Patents
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本発明は、標的核酸の遺伝子型、および変異の判定法に関する。また、本発明は、不溶性支持体に核酸断片を固定化する方法に関する。さらに、本発明は、精製・増幅が可能な方法、およびキットに関する。 The present invention relates to a genotype of a target nucleic acid and a method for determining a mutation. The present invention also relates to a method for immobilizing nucleic acid fragments on an insoluble support. Furthermore, the present invention relates to a method and kit capable of purification and amplification.
特に、本発明は、ウイルス性肝炎の症状を呈する患者に対し、病態の把握や予後の予測、治療方針の決定に役立てる目的で、患者体内のウイルスの有無、感染しているウイルスの遺伝子型等を簡便に測定する方法に関する。さらに、プローブDNA断片を、不溶性支持体に効率よく固相化するための方法に関する。 In particular, the present invention, for patients presenting with symptoms of viral hepatitis, for the purpose of grasping the disease state, predicting the prognosis, determining the treatment policy, the presence or absence of virus in the patient body, the genotype of the infected virus, etc. The present invention relates to a method for simply measuring the above. Furthermore, the present invention relates to a method for efficiently immobilizing a probe DNA fragment on an insoluble support.
たとえば、マイクロタイタープレート及びマイクロアレイ、DNAチップなどのための不溶性支持体に固定化した１本鎖の核酸断片に、被検検体から採取したウイルスゲノムを基に作成した増幅DNA断片を特異的にハイブリダイゼーションさせ、被検検体に感染しているウイルスゲノムの塩基配列の変異を検出する方法に関する。さらにC型肝炎ウイルスの遺伝子型を決めるための遺伝子型特異的な配列を数箇所含む領域をPCRにて増幅させる方法とそのために必要なプライマー、その産物をマイクロタイタープレート等の不溶性支持体に固定化した遺伝子型別のDNA断片に特異的にハイブリダイゼーションさせることによりC型肝炎ウイルスの遺伝子型を判別する方法、固定化したプローブへのハイブリダイゼーションを利用して血清サンプルからウイルスゲノムを抽出し、検出に必要な精製、増幅までの工程を簡単に行う方法、およびキットに関する。 For example, a single-stranded nucleic acid fragment immobilized on an insoluble support for a microtiter plate, a microarray, a DNA chip, etc., and an amplified DNA fragment prepared on the basis of a viral genome collected from a test sample is specifically high. The present invention relates to a method for detecting a mutation in the base sequence of a viral genome that is hybridized and infects a test sample. In addition, a method for amplifying a region containing several genotype-specific sequences for determining the hepatitis C virus genotype by PCR, and the primers and products required for the amplification are fixed to an insoluble support such as a microtiter plate. A method of discriminating the genotype of hepatitis C virus by specifically hybridizing to a segmented genotype DNA fragment, extracting the viral genome from a serum sample using hybridization to an immobilized probe, The present invention relates to a purification method necessary for detection, a method for simply performing steps up to amplification, and a kit.
C型肝炎ウイルス（HCV）は、日本国内で約２００万人が感染していると言われている。感染後１０年から２０年の経過の後に、高率に肝癌を発症することがわかっており、慢性肝炎のうちにウイルスを完全に排除しておくことが強く望まれている。その治療には、主にインターフェロン療法が行なわれている。しかし、治療には多くの副作用を伴ううえに多額の費用がかかるといった問題があり、実際には３割程度の患者でしか行われていない。このため、治療開始前にインターフェロン療法の効果をある程度予測し、治療が奏効する可能性のある患者を選び出すことが、患者の負担を軽減するために重要な意味をもつと考えられており、治療効果に影響を及ぼすとされている感染ウイルスの特徴を簡便に測定する方法の開発が待たれている。 Hepatitis C virus (HCV) is said to have been infected by about 2 million people in Japan. It has been found that liver cancer develops at a high rate after the lapse of 10 to 20 years after infection, and it is strongly desired to completely eliminate the virus in chronic hepatitis. Interferon therapy is mainly used for the treatment. However, there are problems that treatment involves many side effects and is expensive, and is actually performed only by about 30% of patients. For this reason, it is considered that predicting the effects of interferon therapy to some extent before starting treatment and selecting patients who may be effective in treatment has an important meaning to reduce the burden on patients. Development of a method for simply measuring the characteristics of an infectious virus that is said to affect the effect is awaited.
特にC型慢性肝炎の場合、インターフェロン療法の効果は、主にウイルス側の要因によって規定されていると考えられていることもあり、様々な予測法が用いられてきた。最も影響すると考えられている要因は感染したウイルスの型であり、これはウイルスゲノムの特徴によっていくつかに分類されている。日本人に多く見られる型は1ｂ、2ａ、2ｂ型でそれぞれ感染者の約68％、17％、6％を占める。またウイルスタンパク質に対する抗体を用いたタイプ分け（血清型）も行われており、その場合は遺伝子型の1ｂ型は血清型の1型、同じく2ａ、2ｂ型は2型と判定される。インターフェロン療法がよく効くとされているのは、2ａ、2ｂ型（血清型2型）であり、その7割程度に著効する。一方の1ｂ型（血清型１型）では、2割程度しか著効は望めない。
Particularly in the case of chronic hepatitis C, the effect of interferon therapy is considered to be mainly defined by factors on the virus side, and various prediction methods have been used. The factor most likely to be affected is the type of virus that has been infected, which is divided into several categories according to the characteristics of the viral genome. The types commonly found in Japanese are
もう一つ、インターフェロン療法の効果に大きく影響するとされている要因は、C型肝炎ウイルスの血中濃度であり、血中ウイルス量が多い症例では、治療効果が得られにくい。逆に血中ウイルス量が少ない患者では、高い治療効果が得られる確率が高いとされている。また、このウイルス量は、先述のウイルスの遺伝子型との関連が大きく、遺伝子型1ｂではウイルス量が多くなる傾向があり、逆に2ａ、2ｂ型では、ウイルス量があまり多くならないという大まかな相関が認められる。
Another factor that is considered to have a large effect on the effect of interferon therapy is the blood concentration of hepatitis C virus, and it is difficult to obtain a therapeutic effect in cases where the amount of virus in the blood is large. On the other hand, it is said that there is a high probability that a high therapeutic effect will be obtained in patients with low blood viral load. In addition, this viral load is largely related to the genotype of the virus described above, and there is a tendency that the viral load tends to increase with
一方、その他の肝炎ウイルスにおいても、ウイルスゲノムの塩基配列の違いで、病態に変化をもたらす例が報告されている。例えば、B型肝炎は重症化や劇症化に関する変異株がいくつか報告されている。劇症肝炎に関する報告では、1896番目の塩基がGからAに変異したpre-core変異株(非特許文献1、非特許文献2を参照)、1762番目の塩基がAからTに、1764番目の塩基がGからAに変異したcore-promoter変異株(非特許文献3を参照)などが知られている。
On the other hand, other hepatitis viruses have also been reported to cause changes in disease states due to differences in the viral genome base sequence. For example, hepatitis B has been reported several mutant strains related to severe and fulminant. In the report on fulminant hepatitis, the pre-core mutant strain in which the 1896th base was mutated from G to A (see Non-Patent
以上の感染ウイルスゲノムの特徴を検出するには、これまで主に遺伝子のシーケンシング解析が行なわれていた。しかし、この方法は特別な解析装置が必要であり簡便な方法とはいえない。また、その他の方法として制限酵素による切断を利用したRFLP法を使用する場合には、変異箇所にちょうどよい制限酵素切断部位が存在することが必須条件であり、すべての変異部位に対応できる方法とは言えなかった。 In order to detect the characteristics of the above-mentioned infectious virus genome, gene sequencing analysis has been mainly performed so far. However, this method requires a special analysis device and cannot be said to be a simple method. In addition, when using the RFLP method that utilizes restriction enzyme cleavage as another method, it is an essential condition that there is an appropriate restriction enzyme cleavage site at the mutation site. I could not say.
また、あるDNA断片の一部の変異を見る場合、これまではニトロセルロース等からなる膜にターゲットである核酸を結合させた後、該膜に目的のDNA断片に対するプローブをハイブリダイゼーションさせて検出していた。しかし、膜を扱うことは非常に煩雑な作業をともない、洗浄やハイブリダイゼーションに必要な液も大量に必要であるといった問題があった。 In addition, when observing a partial mutation of a DNA fragment, the target nucleic acid is bound to a membrane made of nitrocellulose or the like, and then a probe for the target DNA fragment is hybridized to the membrane for detection. It was. However, handling the membrane is very complicated, and there is a problem that a large amount of solution is required for washing and hybridization.
作業が簡便で必要とする液量も少ない方法として、マイクロタイタープレートにDNA断片を固定化して変異を見る方法が考えられるが、これまでの方法は、オリゴヌクレオチドではなく長いDNA断片（PCR産物など）を固定化する場合の効率が悪く、実用化には至っていなかった。 As a method that is simple and requires a small amount of liquid, a method of observing mutations by immobilizing a DNA fragment on a microtiter plate can be considered, but the conventional method is not a oligonucleotide but a long DNA fragment (such as a PCR product). ) Is not efficient and has not been put to practical use.
また、C型肝炎ウイルスの2要因、すなわち、遺伝子型および血中濃度を測定するために、従来は別々の方法を使用して測定していた。まずC型肝炎ウイルスの遺伝子型は、PCR法を用いて測定するのが一般的である（たとえば、特許文献3、4を参照）。たとえば、センス側のプライマーを各遺伝子型に共通の配列に基づいて一箇所設定し、アンチセンス側のプライマーを各遺伝子型に特異的な配列に基づいて設定する。その際、各遺伝子型特異的なプライマーの配置は、遺伝子型別にずらして設計する。すると各遺伝子型毎に増幅産物の長さが異なり、電気泳動の移動度が異なることとなり、これを利用して遺伝子型の判定が可能となる。たとえば、ゲノムサイエンス研究所製のスマイテスト HCVジェノタイプ等の製品が、上述の原理を使用している。しかし、この方法では数種類のプライマ−を同時に持ち込んでPCR反応を行うため、プライマ−の特異性を維持させるために特別な処置が必要であった（ホットスタート法や、Taqを保護する抗体の利用など）。また、ちょうど型によって異なった特徴を示す箇所が、適当な距離だけ離れて存在しているような領域を探すことが困難なウイルスゲノムの場合、この系は簡単に組むことができないといった問題もあった。
In addition, in order to measure two factors of hepatitis C virus, that is, genotype and blood concentration, it has been conventionally measured using different methods. First, the genotype of hepatitis C virus is generally measured using the PCR method (see, for example,
さらに、ウイルス型の判定を抗体によって検出する血清型の方法も報告されている。この方法では、C14-1及びC14-2抗体（非特許文献4を参照）を用いたELIZA法によって測定される。しかし、血清型では、1型、2型との大まかな区別しかできないうえに、ウイルス量が少ない場合などに誤判定する可能性も報告されている。
Furthermore, a serotype method has also been reported in which determination of the virus type is detected by an antibody. In this method, measurement is performed by the ELIZA method using C14-1 and C14-2 antibodies (see Non-Patent Document 4). However, serotypes can only be roughly distinguished from
したがって、上記報告された各種のウイルス遺伝子型の判定方法では、その判定精度、判定効率、操作の煩雑さ、判定に要する時間、コストなどにおいて、充分に満足できるものではなく、新たなウイルス遺伝子型の判定方法を確立すること、および簡易・迅速に遺伝子型判定できる系の開発が望まれている。 Therefore, the various methods for determining virus genotypes reported above are not sufficiently satisfactory in the determination accuracy, determination efficiency, complexity of operation, time required for determination, cost, etc. Therefore, it is desired to establish a determination method for this and to develop a system capable of genotyping simply and quickly.
上記のような解析を行う際には、ハイブリダイゼーション、およびDNAチップといった技術を使用することが不可欠である。しかし、プローブを容易に、かつ効率よく不溶性支持体に固定化するための従来法はなく、実験者が自分で所望のプローブを不溶性支持体に固定化することが困難であった。 When performing the analysis as described above, it is essential to use techniques such as hybridization and a DNA chip. However, there is no conventional method for easily and efficiently immobilizing a probe on an insoluble support, and it has been difficult for an experimenter to immobilize a desired probe on the insoluble support.
従来、不溶性支持体に核酸を固定化するための方法として、主に1Ｍ以下（主に0.15M）という希薄な塩化ナトリウム溶液を用いる方法が用いられていた。この方法は、0.15M 塩化ナトリウム溶液に所望の核酸を溶解し、不溶性支持体にこの溶液を添加するというものである。また、その他にも、タンパク質を固相する際に用いる希薄な炭酸塩（0.15M K2CO3)を含む緩衝液が用いられている例もあるが、いずれの方法においても十分な固定化量は得られていなかった。特にＰＣＲ産物を固定化する場合には、固定化される核酸の量が非常に少なく、プローブの固定化が非常に困難であるという問題があった。 Conventionally, as a method for immobilizing a nucleic acid on an insoluble support, a method using a dilute sodium chloride solution of 1 M or less (mainly 0.15 M) has been used. This method involves dissolving the desired nucleic acid in a 0.15 M sodium chloride solution and adding the solution to an insoluble support. In addition, there are other examples in which a buffer solution containing dilute carbonate (0.15MK 2 CO 3 ) used when solidifying a protein is used, but the amount of immobilization sufficient in either method is It was not obtained. In particular, when a PCR product is immobilized, there is a problem that the amount of nucleic acid to be immobilized is very small and it is very difficult to immobilize the probe.
一方、感染したウイルス型の特徴を検出するためには、ウイルスゲノムを包んでいる殻を壊して、殻の主な成分であるたんぱく質を除去して精製しなければならない。さらに、必要な酵素反応を経てゲノムを増幅することによってはじめて遺伝子型の検出が可能になっていた。これは、被検体試料中には様々な物質が含まれており、直接PCRを行っても、PCR反応が阻害されるのを防止しなければならない等の理由によるものである。しかし、その工程は煩雑で、またPCR等によって増幅を行うことからコンタミネーションを生じる可能性があり、慎重さを要求される検出系であった。加えて、ウイルスゲノムを精製後、PCRのために新たなチューブを用意して、PCR反応を行う必要もあった。 On the other hand, in order to detect the characteristics of an infected virus type, it is necessary to break the shell that encloses the viral genome, remove the protein that is the main component of the shell, and purify it. Furthermore, genotypes could only be detected by amplifying the genome through the necessary enzyme reaction. This is because various substances are contained in the specimen sample, and it is necessary to prevent inhibition of the PCR reaction even if direct PCR is performed. However, the process is complicated, and since it is amplified by PCR or the like, there is a possibility of causing contamination, and this detection system requires carefulness. In addition, after purifying the viral genome, it was also necessary to prepare a new tube for PCR and perform a PCR reaction.
上述したウイルスの遺伝子型の検出を行う際に、被検体試料から容易にウイルスを精製し、かつそのまま増幅することができれば非常に便利であるが、このような方法は開発されていなかった。従来法では、精製後にサンプルを移し替える必要があり、操作の煩雑さ、判定に要する時間、コストなどにおいて、充分に満足できるものではなく、簡易かつ迅速に遺伝子を増幅するための新たな系の開発が望まれていた。
上記の状況に鑑み、本発明は、個々の感染患者についての病態の把握や病気の進行の予測、さらに各種治療の効果が期待できるかどうかをあらかじめ予測するための簡便な方法を提供することを目的とする。すなわち、遺伝子型、または変異を、特にウイルス性肝炎患者に感染したウイルスゲノムの遺伝子型を簡単な方法で検出することを目的とする。 In view of the above situation, the present invention provides a simple method for grasping the pathology of each infected patient, predicting the progression of the disease, and predicting in advance whether or not various treatment effects can be expected. Objective. That is, it aims at detecting a genotype or a mutation, in particular, a genotype of a viral genome infected with a viral hepatitis patient by a simple method.
また、上記方法の実施には、核酸断片の固定化が不可欠であることに鑑み、オリゴヌクレオチドのみならず比較的長い核酸断片をも不溶性支持体（たとえばマイクロタイタープレート）に固定化することが可能な、簡便、かつ効率のよい方法を提供することを目的とする。さらに、該方法を応用して核酸の塩基配列の変異を簡単に検出する方法を提供することを目的とする。 In addition, in view of the necessity of immobilizing nucleic acid fragments for the above method, not only oligonucleotides but also relatively long nucleic acid fragments can be immobilized on an insoluble support (for example, a microtiter plate). Another object is to provide a simple and efficient method. It is another object of the present invention to provide a method for easily detecting a mutation in the base sequence of a nucleic acid by applying the method.
加えて、本発明は、上記ウイルスゲノムの遺伝子型、および変異の検出において必要とされるウイルスゲノムの抽出、精製、増幅までの工程を簡略化することによって、血清サンプルからウイルスゲノムの特徴を容易に調べることが可能な方法、およびキットを提供することを目的とする。 In addition, the present invention makes it easy to characterize a viral genome from a serum sample by simplifying the process of extracting, purifying, and amplifying the viral genome required for detecting the genotype and mutation of the viral genome. It is an object of the present invention to provide a method and a kit that can be examined.
本発明者らは、ウイルスの型によってウイルスゲノムの特定領域に変異がみられることに着目し、この特定領域の配列をプローブとして利用することによりウイルス型を判別することに成功した。特に、HCV遺伝子のタイプ1a、2a、およびタイプ2a、2b、を確実に判定することができるという事実を見出した。またこの知見を基礎として、臨床検体中のB型肝炎ウイルスが野生型、または変異型であるのか確実に判定することにも成功し、簡便な操作により短時間で遺伝子型判定を行うことができる新たな方法（系）を完成するに至った。さらに、上記知見から、遺伝子型、または変異を簡便かつ短時間に判定することができる方法を完成するに至った。
The present inventors paid attention to the fact that a mutation occurs in a specific region of the viral genome depending on the type of virus, and succeeded in discriminating the virus type by using the sequence of this specific region as a probe. In particular, the present inventors have found the fact that
第一の側面において、本発明は、所望の核酸配列中の遺伝子型、または変異の判定を簡便に行うための方法を提供する。 In the first aspect, the present invention provides a method for easily determining a genotype or mutation in a desired nucleic acid sequence.
すなわち、遺伝子型、または変異の判定方法であって、
1.前記遺伝子型、または変異に特徴的な配列を選び出す工程と、
2.前記配列を含む核酸を増幅する工程と、
3.前記増幅された核酸を、前記遺伝子型、または変異に特異的なプローブにハイブリダイゼーションさせる工程と、
4.前記プローブにハイブリダイズした核酸を検出して、ハイブリダイズパターンを解析する工程と、
を含む方法を提供する。
That is, a genotype or mutation determination method,
1. selecting a sequence characteristic of the genotype or mutation;
2. amplifying a nucleic acid comprising said sequence;
3. hybridizing the amplified nucleic acid to a probe specific for the genotype or mutation;
4. detecting a nucleic acid hybridized to the probe and analyzing a hybridization pattern;
A method comprising:
上記方法の好ましい態様において、前記遺伝子型は、C型肝炎ウイルスの遺伝子型であり、前記遺伝子型に特徴的な配列は、a〜e領域の配列であり、かつ前記遺伝子型特異的なプローブは、各遺伝子型のa〜e領域の配列に相補的な配列を有するプローブである。 In a preferred embodiment of the above method, the genotype is a hepatitis C virus genotype, the characteristic sequence of the genotype is a sequence of a to e region, and the genotype-specific probe is A probe having a sequence complementary to the sequence of the a to e region of each genotype.
また、本発明者は、上記問題を解決するために鋭意研究を行った結果、核酸を不溶性支持体に固定化する際の被覆用溶液の濃度と固定化される核酸量の関係、および固定化する核酸（DNA）断片の長さと固定化される核酸量の関係について明らかにし、その結果に基づいて、核酸の固定化に使用する被覆用溶液として最適な塩、および最適な条件の塩濃度を見出すことに成功した。本発明者は、従来想定されなかったほど高濃度の炭酸塩溶液に核酸を溶解した被覆用溶液を使用することによって、不溶性支持体に核酸（DNA）断片を高率で固定化することに成功した事実に基づいて本発明を完成するに至った。 In addition, as a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has found that the relationship between the concentration of the coating solution and the amount of nucleic acid to be immobilized when immobilizing nucleic acid on an insoluble support, and immobilization. The relationship between the length of the nucleic acid (DNA) fragment to be immobilized and the amount of nucleic acid to be immobilized is clarified. I succeeded in finding it. The present inventor succeeded in immobilizing nucleic acid (DNA) fragments on an insoluble support at a high rate by using a coating solution in which a nucleic acid was dissolved in a carbonate solution having a concentration as high as never considered before. Based on these facts, the present invention has been completed.
すなわち、その第二の側面において、本発明は、不溶性支持体に核酸断片を固定化するための方法であって、前記核酸断片を溶解する被覆用溶液の塩濃度が1〜5Mであることを特徴とする方法を提供する。 That is, in its second aspect, the present invention is a method for immobilizing a nucleic acid fragment on an insoluble support, wherein the salt concentration of the coating solution for dissolving the nucleic acid fragment is 1 to 5M. A featured method is provided.
上記方法の好ましい態様において、前記被覆用溶液に使用する塩は、K2CO3、Rb2CO3、Cs2CO3、Na2CO3、KCl、NaClの群から選択される塩であり、さらに好ましくは、前記被覆用溶液に使用する塩は、K2CO3、Rb2CO3、Cs2CO3、Na2CO3、の群から選択される炭酸塩である。 In a preferred embodiment of the above method, the salt used in the coating solution is a salt selected from the group of K 2 CO 3 , Rb 2 CO 3 , Cs 2 CO 3 , Na 2 CO 3 , KCl, NaCl, More preferably, the salt used in the coating solution is a carbonate selected from the group of K 2 CO 3 , Rb 2 CO 3 , Cs 2 CO 3 , Na 2 CO 3 .
本発明者らは、さらに鋭意研究を行い、上記固定化方法を応用して上記第一の側面の発明、および以下に記載する第三の側面の発明を完成するに至った。 The inventors have further conducted intensive research and applied the above-described immobilization method to complete the above first aspect of the invention and the third aspect of the invention described below.
すなわち、本発明者は、血清サンプルから、簡便かつ迅速にウイルスゲノムを精製し、増幅するための新たな系を開発するに至った。従来、PCRチューブ、マイクロタイタープレート等の反応容器は、核酸断片等の吸着をできるだけ少なくなるように工夫されており、逆に、反応容器に核酸を固定化するという発想はなかった。本方法は、このような反応容器に高効率で核酸を固定化できる方法を応用することにより完成された。 That is, the present inventor has developed a new system for purifying and amplifying a viral genome simply and rapidly from a serum sample. Conventionally, reaction vessels such as PCR tubes and microtiter plates have been devised so as to minimize the adsorption of nucleic acid fragments and the like, and conversely, there was no idea of immobilizing nucleic acids in the reaction vessel. The present method was completed by applying a method capable of immobilizing nucleic acids with high efficiency in such a reaction vessel.
したがって、その第三の側面において、本発明は、所望の核酸を精製し、かつ増幅するための方法であって、
1．所望のウイルスゲノムに対応するプローブを不溶性支持体からなる反応容器の内面に固定化する工程と、
2．前記反応容器に、前記所望のウイルスを含むサンプル液を添加して前記ウイルスゲノムをハイブリダイズさせる工程と、
3．前記サンプル液を除去する工程と、
4．前記反応容器にPCR反応液を添加して、PCR反応により前記核酸を増幅する工程と、
を含む方法を提供する。
Accordingly, in its third aspect, the present invention provides a method for purifying and amplifying a desired nucleic acid comprising:
1． Immobilizing a probe corresponding to a desired viral genome on the inner surface of a reaction vessel made of an insoluble support;
2． Adding a sample solution containing the desired virus to the reaction vessel to hybridize the virus genome;
3． Removing the sample liquid;
Four. Adding a PCR reaction solution to the reaction vessel and amplifying the nucleic acid by a PCR reaction;
A method comprising:
その好ましい態様において、前記ウイルスゲノムは、C型肝炎ウイルスゲノムであり、前記プローブは、それぞれa〜e領域に対応する配列の核酸であり、かつ前記PCR反応によって前記C型肝炎ウイルスゲノムが増幅される。 In a preferred embodiment thereof, the viral genome is a hepatitis C virus genome, the probes are nucleic acids having sequences corresponding to regions a to e, respectively, and the hepatitis C virus genome is amplified by the PCR reaction. The
さらに、本発明は、前記方法を使用して所望の核酸を精製し、かつ増幅するためのキットであって、
前記核酸に相補的な配列を有するプローブを固相化するための被覆用溶液が添加されている不溶性支持体からなる反応容器と、
前記核酸が含まれているサンプルを稀釈するための稀釈液と、
前記核酸を増幅するためのPCR反応液と、
が含まれることを特徴とするキットを提供する。
Furthermore, the present invention provides a kit for purifying and amplifying a desired nucleic acid using the above method,
A reaction vessel comprising an insoluble support to which a coating solution for immobilizing a probe having a sequence complementary to the nucleic acid is added;
A diluting solution for diluting a sample containing the nucleic acid;
A PCR reaction solution for amplifying the nucleic acid;
Is provided.
好ましい態様において、本発明は、B型肝炎ウイルスの遺伝子型、および変異株を判別するためのアッセイキットであって、
前記B型肝炎ウイルスゲノムの各遺伝子型、および変異株について、1762番および1764番目の塩基を含む領域に相補的な配列を有するプローブが、それぞれ固定化された不溶性支持体と、
前記B型肝炎ウイルスゲノムをPCRで増幅させるためのプライマーを含むPCR反応液と、
を含むアッセイキットである。
In a preferred embodiment, the present invention provides an assay kit for discriminating hepatitis B virus genotypes and mutants,
For each genotype and variant of the hepatitis B virus genome, probes having a sequence complementary to the region containing the 1762th and 1764th bases are respectively immobilized on an insoluble support,
A PCR reaction solution containing primers for amplifying the hepatitis B virus genome by PCR;
Is an assay kit.
本発明の第一の側面に従った方法により、個々の感染患者についての病態の把握や病気の進行の予測、さらに各種治療の効果が期待できるかどうかをあらかじめ予測を簡便に行うことが可能となる。すなわち、ウイルス性肝炎患者に感染したウイルスゲノムの遺伝子型を簡単に検出することが可能となる。 By the method according to the first aspect of the present invention, it is possible to easily predict in advance whether or not the effect of various treatments can be expected, ascertaining the pathological condition of each infected patient, predicting the progression of the disease, and further. Become. That is, it becomes possible to easily detect the genotype of a viral genome that has infected a patient with viral hepatitis.
また、本発明の第二の側面に従った方法により、簡便、かつ効率のよく、オリゴヌクレオチドのみならず比較的長い核酸断片をも不溶性支持体（たとえばマイクロタイタープレート）に固定化することが可能なる。該方法を応用して核酸の塩基配列の変異を簡単に検出する方法を提供することを目的とする。 In addition, by the method according to the second aspect of the present invention, not only oligonucleotides but also relatively long nucleic acid fragments can be immobilized on an insoluble support (for example, a microtiter plate) easily and efficiently. Become. An object of the present invention is to provide a method for easily detecting a mutation in the base sequence of a nucleic acid by applying the method.
加えて、本発明の第三の側面に従った方法、およびキットにより、上記ウイルスゲノムの遺伝子型、および変異株の検出において必要とされるウイルスゲノムの抽出、精製、増幅までの工程を簡略化することが可能となる。すなわち、これまで必要だと思われていた血清サンプルからの煩雑なウイルスゲノムの抽出、精製工程を行わなくとも、PCRチューブに特異的に必要なウイルスゲノムを吸着させることによって、簡単にPCR反応まで持ち込むことが可能となる。 In addition, the method and kit according to the third aspect of the present invention simplify the steps from extraction, purification, and amplification of the viral genome required for detection of the above-mentioned genotypes and mutants of the viral genome. It becomes possible to do. In other words, it is easy to perform PCR reaction by adsorbing the necessary viral genome specifically to the PCR tube without the complicated extraction and purification process of the viral genome from the serum sample that was considered necessary so far. It can be brought in.
本発明の第一の側面に従う方法によれば、標的核酸の遺伝子型、または変異を正確に判定することが可能である。 According to the method according to the first aspect of the present invention, it is possible to accurately determine the genotype or mutation of the target nucleic acid.
本発明の方法による遺伝子型、または変異の判定の原理をウイルスの遺伝子型の判定を例にして以下に簡単に説明する。 The principle of determination of genotype or mutation according to the method of the present invention will be briefly described below with reference to determination of virus genotype.
まず、患者血清などから抽出したウイルスゲノムDNA（RNAウイルスであればRNAを逆転写反応によってｃDNA化する）を鋳型として、PCRを行う。このPCRは、以下の工程でハイブリダイゼーションに必要なコピー数を得るためにおこなわれる。この時、ターゲットにラベルが必要な検出系を使用するのであれば、PCRに用いるプライマーにビオチン等のラベルをしておくことによりハイブリダイゼーション後に検出可能となる。電流検出型DNAチップ等のようにハイブリダイゼーション時に挿入剤を添加する系の場合、通常のプライマーを使用する。 First, PCR is performed using a viral genomic DNA extracted from patient serum or the like (in the case of an RNA virus, RNA is converted to cDNA by reverse transcription reaction) as a template. This PCR is performed in order to obtain the copy number necessary for hybridization in the following steps. At this time, if a detection system that requires a label as a target is used, detection can be performed after hybridization by placing a label such as biotin on a primer used for PCR. In the case of a system in which an intercalating agent is added at the time of hybridization, such as a current detection type DNA chip, a normal primer is used.
一方、マイクロタイタープレートの基底部分に、各遺伝子型特異的なプローブを固相化しておき、適当なブロッキング処理の後、前記PCR産物とのハイブリダイゼーションを行う。たとえば、C型肝炎ウイルスの遺伝子型判定のためには、1検体あたり10種類のプローブとの結合の有無を見ることが好ましいため、1検体あたり10個のウェルを使用してハイブリダイゼーションを行う。ゲノムの変異度の低いウイルスのであれば、野生株と変異株の最低２種類のプローブによって判別可能な場合もある。変異のバリエーションに応じて、プローブ数を適宜変更することになる。 On the other hand, each genotype-specific probe is immobilized on the base of the microtiter plate, and after appropriate blocking treatment, hybridization with the PCR product is performed. For example, in order to determine the genotype of hepatitis C virus, since it is preferable to check the presence or absence of binding to 10 types of probes per sample, hybridization is performed using 10 wells per sample. In the case of a virus having a low degree of genome mutation, it may be discriminated by at least two types of probes, a wild strain and a mutant strain. The number of probes will be changed as appropriate according to the variation of the mutation.
増幅したウイルスゲノムの特徴によって、該PCR産物が、ハイブリダイゼーションできるプローブとできないプローブがあるため、適当な洗浄操作の後、あらかじめPCR産物にラベルしておいたビオチン等の標識を検出することにより（あるいは、ハイブリダイゼーションの結果できた２本鎖に結合した挿入剤を利用することにより）、ハイブリダイゼーションの有無を確認することができる。ハイブリダイゼーションの結果から、ウイルスゲノムの変異のバリエーションを判別することができ、この変異の種類から遺伝子型を推定することにより型判定が可能になるというものである。 Depending on the characteristics of the amplified viral genome, the PCR product has probes that can be hybridized and probes that cannot be hybridized. After appropriate washing operations, by detecting a label such as biotin previously labeled on the PCR product ( Alternatively, the presence or absence of hybridization can be confirmed by using an intercalating agent bonded to a double strand obtained as a result of hybridization. From the result of the hybridization, the variation of the virus genome mutation can be discriminated, and the type can be determined by estimating the genotype from the mutation type.
以下、より詳細に本発明の方法を説明する。 Hereinafter, the method of the present invention will be described in more detail.
本方法の第一の工程は、核酸配列（ゲノム）中の遺伝子型、または変異に特徴的な配列を選び出す工程である。本発明において、前記遺伝子型、または変異に特徴的な配列とは、既知の核酸配列において変異の見出されている配列を意味する。このような配列は、種々のゲノムにおいて見出されており、たとえばヒトの多型部位（一塩基多型等）の配列なども、該配列に該当する。特にウイルスの場合であれば、ウイルスの遺伝子型によって配列が異なっている（すなわち変異が存在する）領域の配列を意味する。たとえば、C型肝炎ウイルスでは、タイプ1並びにサブタイプ2a、2bおよび3aといったウイルス型が知られているが、以下の実施例に示したようなa〜e（a、b、c、およびe）領域では、ウイルス型により配列が異なっている。このような領域の配列が、前記ウイルスゲノム中の遺伝子型に特徴的な配列に該当する。b領域を例にしてより詳細に説明すると、図1に示したように、タイプ1bの配列では、231/229の塩基は、ぞれぞれT/Cであるが、タイプ2a、および2bにおいて対応する塩基はそれぞれC/Tに変異しており、遺伝子型に特徴的な配列となっている。その他a領域、c領域、e領域にも同様に変異が存在し、これらが遺伝子型に特徴的な配列であることがわかる。また、B型肝炎ウイルスでは、以下の実施例に示した通り野生型と変異型が存在し、一定の配列の変異（野生株A1762/C1764、変異株T1762/A1764）が明らかとなっているが、この配列が前記遺伝子型に特徴的な配列に該当する。このような、ウイルスの型によって配列が異なった領域は、当業者であればそのゲノム配列を比較することにより、容易に選出することができるであろう。また、比較に使用するためのゲノム配列は、GeneBank等に登録された株から各ウイルス型の配列を入手することができるであろう。
The first step of this method is a step of selecting a genotype in a nucleic acid sequence (genome) or a sequence characteristic of mutation. In the present invention, the above-mentioned genotype or sequence characteristic for mutation means a sequence in which a mutation is found in a known nucleic acid sequence. Such sequences have been found in various genomes. For example, sequences of human polymorphic sites (single nucleotide polymorphisms, etc.) also correspond to such sequences. Particularly in the case of a virus, it means a sequence in a region where the sequence differs depending on the genotype of the virus (ie, there is a mutation). For example, for hepatitis C virus, virus types such as
本方法の第二の工程は、前記遺伝子型、または変異に特徴的な配列を含む核酸を増幅する工程である。前記増幅は、当業者に周知の方法を使用して増幅すればよく、たとえば前記配列を挟むように設計されたプライマーを使用してPCRを行って増幅すればよい。前記遺伝子型に特徴的な配列を増幅するためには、該配列が増幅されるように、すなわち該配列を挟むように設計されたプライマーを使用してPCRを行えばよい。ウイルス量が少ないサンプルの場合には、充分な感度で検出できるようにnested PCRによって増幅することが好ましい。前記遺伝子型に特徴的な配列が、ウイルス内に数個存在する場合には、それぞれの領域をすべて含むように増幅することが好ましい。たとえば、本発明者がC型肝炎ウイルスにおいて確認した配列には、a〜e領域の4種類に遺伝子型特徴的な配列が存在する。上記したように、この領域をすべて挟むように設計したプライマーを使用して増幅すれば、以下の工程で使用するための増幅が一回だけでよいことになる。 The second step of the method is a step of amplifying a nucleic acid containing a sequence characteristic to the genotype or mutation. The amplification may be performed using a method well known to those skilled in the art. For example, PCR may be performed using primers designed to sandwich the sequence. In order to amplify a sequence characteristic of the genotype, PCR may be performed using primers designed to amplify the sequence, that is, sandwich the sequence. In the case of a sample with a small amount of virus, it is preferable to amplify by nested PCR so that it can be detected with sufficient sensitivity. When several sequences characteristic of the genotype are present in the virus, it is preferable to amplify so as to include all of the respective regions. For example, in the sequence confirmed by the inventor in the hepatitis C virus, there are genotype-characteristic sequences in four types of a to e regions. As described above, if amplification is performed using a primer designed so as to sandwich this entire region, amplification for use in the following steps may be performed only once.
具体的には、C型肝炎ウイルスの遺伝子型を判別する場合であれば、以下の実施例に示した通り、第一のPCRのプライマーとして、a〜e領域の配列をすべてを挟むように設計された配列番号11、12のプライマーを使用し、第二のPCRのプライマーとして、配列番号12、13のプライマーを使用してnested PCRで増幅すればよい。 Specifically, if the genotype of hepatitis C virus is to be discriminated, as shown in the following examples, as a primer for the first PCR, it is designed to sandwich the entire sequence of a to e region The primers of SEQ ID NOs: 11 and 12 are used, and amplification by nested PCR may be performed using the primers of SEQ ID NOs: 12 and 13 as primers for the second PCR.
また、テンプレートにはウイルスゲノムを使用するが、患者に感染したウイルスのウイルスの型を判定したい場合には、被検検体から採取したウイルスゲノムをテンプレートとして増幅すればよい。被検検体からのウイルスゲノムを抽出するには、通常のいずれの方法を使用してもよいが、たとえばSepa-Gene-RV-R（三光純薬 社製）等のキットを使用すればよい。 Moreover, although a viral genome is used for the template, when it is desired to determine the virus type of the virus that has infected the patient, the viral genome collected from the test sample may be amplified as a template. To extract the viral genome from the test sample, any ordinary method may be used. For example, a kit such as Sepa-Gene-RV-R (manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.) may be used.
前記ウイルスがRNAウイルス（たとえばC型肝炎ウイルス）の場合には、得られたウイルスゲノムをPCRに使用するために逆転写反応を行わなければならない。このような逆転写反応も、通常の方法を使用して行えばよいが、たとえばHexa-deoxyribonucleotide mixture(TAKARA社製)を用いて、M-MLVReverse Transcriptase(LIFE TECHNOLOGIES社製)によって逆転写することができる。 If the virus is an RNA virus (eg, hepatitis C virus), a reverse transcription reaction must be performed in order to use the resulting viral genome for PCR. Such a reverse transcription reaction may be carried out using a normal method.For example, reverse transcription can be performed with M-MLV Reverse Transcriptase (LIFE TECHNOLOGIES) using Hexa-deoxyribonucleotide mixture (TAKARA). it can.
以下の工程において、ハイブリダイゼーションの検出に標識（蛍光標識、放射線標識等）を使用する場合、前記PCRの際に使用するプライマーをあらかじめ標識しておけばよい。nested PCRによって増幅するのであれば、一度目のPCRは標識なしのプライマー対を用いて行い、内側のプライマーで行う２度目のPCRにおいて、一方のプライマーにビオチン標識したプライマーを使用すればよい。電流検出型DNAチップ等のようにハイブリダイゼーション時に挿入剤を添加する場合は、標識されていない通常のプライマーを使用すればよい。 In the following steps, when a label (fluorescent label, radiolabel, etc.) is used for detection of hybridization, the primer used for the PCR may be labeled in advance. If amplification is performed by nested PCR, the first PCR may be performed using an unlabeled primer pair, and in the second PCR performed using the inner primer, a primer labeled with biotin may be used for one primer. When an intercalating agent is added at the time of hybridization as in a current detection type DNA chip or the like, a normal unlabeled primer may be used.
本方法の第三の工程は、前記増幅された核酸を、前記遺伝子型、または変異に特異的なプローブにハイブリダイゼーションさせる工程である。 The third step of the method is a step of hybridizing the amplified nucleic acid to a probe specific for the genotype or mutation.
ここで、遺伝子型、または変異に特異的なプローブとは、前記「遺伝子型、または変異に特徴的な配列」にハイブリダイズすることが可能な配列を有するプローブを意味する。すなわち、前記遺伝子型、または変異に特徴的な配列に相補的な配列を有するプローブを意味する。たとえば、前記C型肝炎ウイルスのb領域の場合であれば、タイプ1bに対するプローブは、配列番号4のプローブである。このプローブを使用した場合、ウイルス型がタイプ1bであれば、前記増幅された核酸がプローブにハイブリダイズするが、2a、2b等の他のタイプであれば、ハイブリダイズしないことになる。このような遺伝子型特異的なプローブの一例として、C型肝炎ウイルスの遺伝子型を判別する場合は、各遺伝子型のa〜e領域に相補的な配列を有するプローブである。具体的には、配列番号1〜10の配列を有するプローブである。
Here, the probe specific to the genotype or mutation means a probe having a sequence capable of hybridizing to the “sequence characteristic to the genotype or mutation”. That is, it means a probe having a sequence complementary to the genotype or a sequence characteristic of mutation. For example, in the case of the hepatitis C virus b region, the probe for
その他の遺伝子型、または変異を判別するためのプローブとして適切な配列、および適切な長さ等は、当業者であれば、前記遺伝子型、および変異に特徴的な配列に基づいて容易に判断することができるであろう。たとえば、ヒトの一塩基多型等を検出するのであれば、検出したい多型部位に基づいてプローブを作製することができる。また、このようなプローブは、DNA合成等の通常の合成方法を使用して容易に作成することが可能である。さらに、前記ハイブリダイゼーションさせるための最適なバッファー、およびハイブリダイゼーション条件は、当業者であればプローブのTm等から容易に判断することができるであろう。 Those skilled in the art can easily determine other genotypes or sequences suitable as probes for discriminating mutations, appropriate lengths, and the like based on the genotypes and sequences characteristic of the mutations. Would be able to. For example, if a human single nucleotide polymorphism is detected, a probe can be prepared based on the polymorphic site to be detected. Moreover, such a probe can be easily prepared using a normal synthesis method such as DNA synthesis. Furthermore, those skilled in the art will be able to easily determine the optimal buffer for hybridization and hybridization conditions from the Tm of the probe and the like.
前記プローブは、不溶性支持体に固定化された１本鎖の核酸断片（プローブ）であることが好ましい。特に、前記プローブは、不溶性支持体（たとえばマイクロタイタープレートまたはDNAチップなど）に固定化されている必要がある。 The probe is preferably a single-stranded nucleic acid fragment (probe) immobilized on an insoluble support. In particular, the probe needs to be immobilized on an insoluble support (for example, a microtiter plate or a DNA chip).
前記プローブを不溶性支持体に固定するためには、当業者に既知のいずれの方法を使用してもよいが、以下に詳述する本発明の第二の側面に従う方法を使用することができる。該方法を使用すれば、不溶性支持体（マイクロタイタープレートなど）に高率にプローブを固定化することが可能となり、高感度でハイブリダイズしたことを検出することができるであろう。このように核酸を容易かつ高率に不溶性支持体に固定化する手段は、従来法にはなく、本工程においても特に有用な手段である。 Any method known to those skilled in the art may be used to immobilize the probe to the insoluble support, but the method according to the second aspect of the present invention detailed below may be used. If this method is used, it will be possible to immobilize the probe at a high rate on an insoluble support (such as a microtiter plate), and it will be possible to detect hybridization with high sensitivity. Thus, means for easily and efficiently immobilizing nucleic acids on an insoluble support is not available in the conventional method, and is also particularly useful in this step.
本方法の第四の工程は、前記プローブにハイブリダイズした核酸を検出して、ハイブリダイズパターンを解析する工程である。 The fourth step of this method is a step of detecting the nucleic acid hybridized to the probe and analyzing the hybridization pattern.
前記ハイブリダイゼーションした核酸を検出する方法も、慣用されている方法から適宜選択することができる。一例として、PCRで増幅する際にあらかじめプライマーをラベルしておき、増幅産物のラベルを検出してハイブリダイゼーションの状態を検出する方法を概説する。例えば発色によって検出する場合には、あらかじめプライマーにビオチンラベルを施しておき、このビオチンラベルプライマーを使用して前記増幅工程を行う。次の工程で、増幅産物をプローブにハイブリダイズさせる。次いで、25％FCSを含むTBS緩衝液中に、何らかの標識したストレプトアビジンを最終濃度7.5ｍUになるように溶解した溶液でウェルを被覆し、振とうしながら室温で1時間程度インキュベートすることにより、ビオチンに標識を結合させる。標識の種類は、特に限定されないが、例えばペルオキシダーゼ標識のものであればペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）等の市販の試薬を利用することができる。次いで、ツイーン20を含む2ｘSSC緩衝液にてウェルを洗い、ペルオキシダーゼの発色性基質、例えばTMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)-ELIZA液（ライフテックオリエンタル社製）等を用いて発色させ、吸光度を測定する。吸光度が高ければ、ハイブリダイズした核酸の量が多いことがわかる。
The method for detecting the hybridized nucleic acid can also be appropriately selected from commonly used methods. As an example, an outline of a method in which primers are labeled in advance when amplifying by PCR and the label of the amplification product is detected to detect the state of hybridization. For example, when detecting by color development, a biotin label is applied to the primer in advance, and the amplification step is performed using this biotin label primer. In the next step, the amplification product is hybridized to the probe. Next, the wells are covered with a solution obtained by dissolving some labeled streptavidin to a final concentration of 7.5 mU in TBS buffer containing 25% FCS, and incubated at room temperature for about 1 hour while shaking. Bind label to biotin. The type of label is not particularly limited. For example, if it is a peroxidase label, a commercially available reagent such as peroxidase labeled streptavidin (Roche Diagnostics) can be used. Next, the well is washed with 2 × SSC
また、上記ハイブリダイゼーションを検出するための方法のもう一つの例として、電流型DNAチップ（たとえば、特許文献2を参照）等を検出に用いることもできる。該DNAチップを使用した場合は、PCRの際にプライマーにラベルを施す必要はなく、ハイブリダイゼーションされた２本鎖部分に電位を発生させる挿入剤（たとえば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、ビスアクリジン等のビスインターカレーターなど）を結合させることによって測定する方法が選択できる。該電流型DNAチップによる検出の場合、前記工程3においてプローブを固定化する不溶性支持体は、マイクロタイタープレートではなく、所定のDNAチップを使用することになる。
As another example of the method for detecting the hybridization, a current-type DNA chip (see, for example, Patent Document 2) or the like can be used for detection. When the DNA chip is used, it is not necessary to label the primer at the time of PCR, and an intercalating agent (such as Hoechst 33258, acridine orange, bisacridine, etc.) that generates a potential in the hybridized double-stranded portion. A measurement method can be selected by binding a bisintercalator or the like. In the case of detection using the current-type DNA chip, the insoluble support on which the probe is immobilized in the
ここで、ハイブリダイズパターンの解析とは、前記ハイブリダイゼーションの結果に基づいて、核酸配列が、いずれの配列を有するゲノムであるかを明らかにし、いずれの遺伝子型であるか、または変異配列であるのかを型判定することである。 Here, the analysis of the hybridization pattern is based on the result of the hybridization to clarify which sequence the nucleic acid sequence has, and which genotype or variant sequence. It is to determine the type.
たとえば、C型肝炎ウイルス1b型について解析した場合、増幅した配列を、配列番号1〜10（a〜e領域のそれぞれの領域に相補的な配列を有するプローブ）のすべてのプローブとハイブリダイズさせた結果、配列番号1、4、6のプローブとハイブリダイズすることになる（図4）。ハイブリダイズしたプローブの配列は、すべて1b型のウイルスに対応する配列であることから、ウイルス型も1b型であることが導き出される。
For example, when analyzed for hepatitis
このようにして、数領域のハイブリダイズパターンを基にすれば、容易にウイルスゲノム配列を推定することができるため、ハイブリダイズパターンからウイルス型を特定することが可能であり、シーケンシングを行わずに遺伝子型を判定することが可能となる。 In this way, since the viral genome sequence can be easily estimated based on the hybridization pattern of several regions, the virus type can be identified from the hybridization pattern, and sequencing is not performed. It is possible to determine the genotype.
上記方法の一つの態様として、たとえばC型肝炎ウイルスの遺伝子型を型判定するための方法であって、前記マイクロタイタープレートに固相したC型肝炎ウイルスの遺伝子型に特異的な数種のプローブに対して、PCRで増幅したウイルス由来の産物をハイブリダイゼーションさせ、前記プローブとのハイブリダイゼーションの有無を調べることによって遺伝子型を判定する方法が提供される。 As one embodiment of the above method, for example, a method for determining the genotype of hepatitis C virus, which is several probes specific to the hepatitis C virus genotype solid-phased on the microtiter plate In contrast, there is provided a method for determining a genotype by hybridizing a product derived from a virus amplified by PCR and examining the presence or absence of hybridization with the probe.
本発明のもう一つの態様において、前記方法を利用することにより、遺伝子型、または変異を判定するためのキットを提供することもできる。たとえば、前記工程2の核酸を増幅するためのプライマー（C型肝炎ウイルスの場合であれば、a〜e領域の配列をすべて含む一領域を増幅できるプライマー、すなわち配列番号11、12のプライマー）と、前記工程3において使用する遺伝子型、または変異に特異的なプローブ（C型肝炎ウイルスの場合であれば、a〜e領域の配列の各遺伝子型に対するプローブ、すなわち配列番号1〜10の配列のプローブ）が固定化された不溶性支持体（マイクロタイタープレートなど）とを含むキットである。該キットを使用すれば、使用者は、キットに含まれているプライマーを使用して前記遺伝子型、または変異に特徴的な配列を含む領域を増幅するだけで、前記工程1において配列を選び出す必要はなく、また工程3において必要なプローブも自分で準備する必要もないため、非常に簡便、かつ迅速に遺伝子型、または変異を判定することが可能となるであろう。
In another embodiment of the present invention, a kit for determining genotype or mutation can be provided by using the above method. For example, a primer for amplifying the nucleic acid of step 2 (in the case of hepatitis C virus, a primer that can amplify a region including all the sequences of the a to e regions, ie, primers of SEQ ID NOs: 11 and 12) , A genotype used in the above-mentioned
本発明の第二の側面に従う方法を使用することにより、不溶性支持体に、高率で核酸断片を固相化することができる。 By using the method according to the second aspect of the present invention, nucleic acid fragments can be immobilized on an insoluble support at a high rate.
ここで、不溶性支持体とは、マイクロタイタープレートに代表される核酸（プローブ）を固相化するための支持体を意味し、その素材は、プラスチック材料からなる支持体をいう。前記プラスチック材料には、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリビニル、その他いずれのプラスチック材料も含むが、特に、前記不溶性支持体の素材には、ポリスチレン、ポリビニルが好ましい。実際の研究において核酸の固相化が必要であるにもかかわらず固相化が困難である素材は、前記プラスチック材料の製品であり、製品例としては、ELISA-PLATE, MICROLON, 96W, FLAT-BOTT, MEDIUM BINDING(グライナー社製)などが挙げられる。本発明の方法によって固定化される不溶性支持体の形態は、特に限定されず、マイクロタイタープレート、各種PCRチューブ、DNAチップその他の目的に使用するためのプラスチック材料、その他の形態の不溶性支持体に核酸を固相化するために使用することができる。 Here, the insoluble support means a support for immobilizing a nucleic acid (probe) represented by a microtiter plate, and the material is a support made of a plastic material. The plastic material includes polyethylene, polystyrene, polyvinyl, and any other plastic material. In particular, the material of the insoluble support is preferably polystyrene or polyvinyl. The material that is difficult to immobilize in spite of the necessity of immobilizing nucleic acid in actual research is the product of the plastic material. Examples of products include ELISA-PLATE, MICROLON, 96W, FLAT- BOTT, MEDIUM BINDING (made by Greiner) are listed. The form of the insoluble support immobilized by the method of the present invention is not particularly limited, and may be a microtiter plate, various PCR tubes, a DNA chip, a plastic material for use for other purposes, or other forms of insoluble supports. It can be used to immobilize nucleic acids.
本発明の方法は、まず、固相化したい核酸を被覆用溶液に溶解して使用する。本発明の方法において、前記被覆用溶液は、塩溶液であることを特徴とする。該溶液に使用するための塩は、K2CO3、Rb2CO3、Cs2CO3、Na2CO3、KCl、NaClの群から選択される塩である必要がある。特に、好ましい塩は、K2CO3、Rb2CO3、Cs2CO3、Na2CO3の群から選択される炭酸塩である。また、前記被覆用溶液は、通常、単一の塩の塩溶液であるが、数種類の塩を混合した塩溶液であってもよい。 In the method of the present invention, first, a nucleic acid to be immobilized is dissolved in a coating solution and used. In the method of the present invention, the coating solution is a salt solution. The salt for use in the solution should be a salt selected from the group of K 2 CO 3 , Rb 2 CO 3 , Cs 2 CO 3 , Na 2 CO 3 , KCl, NaCl. Particularly preferred salts are carbonates selected from the group of K 2 CO 3 , Rb 2 CO 3 , Cs 2 CO 3 , Na 2 CO 3 . The coating solution is usually a salt solution of a single salt, but may be a salt solution in which several kinds of salts are mixed.
また、本方法において、前記被覆用溶液は、塩濃度が、1M〜10Mであることを特徴とする。前記塩濃度は、好ましくは1M〜5Mであり、より好ましくは、1M〜4Mである。以下の実施例において示したように、固相化に最適な塩濃度、使用する核酸の量によって多少異なるため、核酸の量にあわせて最適な濃度を使用することが望ましい。最適な濃度は、図2のグラフを参照することにより、容易に判断できるであろう。しかし、いずれの塩を使用した場合であっても、核酸を高率で固相化するには、1M以上の高濃度で使用しなければならないことが図2のグラフからも明らかである。 In the present method, the coating solution has a salt concentration of 1M to 10M. The salt concentration is preferably 1M to 5M, more preferably 1M to 4M. As shown in the following examples, since it differs somewhat depending on the optimum salt concentration for solid-phase immobilization and the amount of nucleic acid to be used, it is desirable to use the optimum concentration according to the amount of nucleic acid. The optimal concentration can be easily determined by referring to the graph of FIG. However, even if any salt is used, it is clear from the graph of FIG. 2 that the nucleic acid must be used at a high concentration of 1 M or higher in order to immobilize the nucleic acid at a high rate.
本方法に使用する核酸の濃度は、いずれの濃度であってもよいが、被覆用溶液に含まれる核酸の濃度が高い方が、固相化される核酸の量が多くなるであろうことは、当業者であれば明らかである。 The concentration of the nucleic acid used in this method may be any concentration, but the higher the concentration of the nucleic acid contained in the coating solution, the more nucleic acid will be immobilized. It will be apparent to those skilled in the art.
本方法は、前期所望の核酸を溶解した被覆用溶液を不溶性支持体上に滴下すればよい。たとえば、マイクロタイタープレートであれば、適量を分注して、適当な時間（1時間から一晩程度）静置すればよい。 In this method, a coating solution in which a desired nucleic acid is dissolved in the previous period may be dropped on an insoluble support. For example, in the case of a microtiter plate, an appropriate amount may be dispensed and allowed to stand for a suitable time (about 1 hour to overnight).
ここで、本方法の実施態様の一例を概説する。3Mの炭酸カリウム溶液に、DNA（プローブ等）を0.4μMとなるように溶解する（この溶液が被覆溶液である）。次いで、該溶液を固定化したい不溶性支持体（たとえばマイクロタイタープレート）に適量を分注し、4℃において一晩静置する。これだけの操作を行うだけで、核酸を高率で不溶性支持体に固定化することができる。 Here, an example of an embodiment of the method will be outlined. Dissolve DNA (probe, etc.) in 3M potassium carbonate solution to a concentration of 0.4 μM (this solution is a coating solution). Next, an appropriate amount is dispensed onto an insoluble support (for example, a microtiter plate) to which the solution is to be immobilized, and the solution is allowed to stand overnight at 4 ° C. By simply performing these operations, the nucleic acid can be immobilized on the insoluble support at a high rate.
以下の実施例に示したように、本方法によって、ハイブリダイズ実験に使用するためのプローブを、マイクロタイタープレートまたはDNAチップにDNAを固定化することもできる。さらに、本方法によれば、プローブをPCRチューブ内に固定化することも可能となり、以下に詳述したように、テンプレートDNAの精製、およびその後の増幅を同じチューブ内で行うことも可能となる。 As shown in the Examples below, this method can also immobilize DNA on a microtiter plate or DNA chip using a probe for use in hybridization experiments. Furthermore, according to this method, the probe can be immobilized in the PCR tube, and as described in detail below, the template DNA can be purified and then amplified in the same tube. .
本発明の第三の側面に従う方法によれば、テンプレート核酸の精製、および増幅の工程を簡略化したPCRが可能となる。 According to the method according to the third aspect of the present invention, PCR with simplified template nucleic acid purification and amplification steps becomes possible.
詳細には、不溶性支持体からなる反応容器の内面に固定化したプローブへのハイブリダイゼーションを利用して、未精製サンプルから複雑な精製工程を経ずに（たとえば、熱処理を行うのみでよく、チューブの移し替えが不要）検出に必要な精製、増幅までの工程を簡略化するPCR方法であり、目的のターゲットのみを固定化したプローブにハイブリダイゼーションさせてトラップし、そのままPCR反応液を添加してPCR反応を開始できる方法である。 Specifically, by utilizing hybridization to a probe immobilized on the inner surface of a reaction vessel made of an insoluble support, an unpurified sample is not subjected to complicated purification steps (for example, only by heat treatment, tube This is a PCR method that simplifies the steps required for detection and purification required for detection. Only the target of interest is hybridized to the immobilized probe, trapped, and the PCR reaction solution is added as is. This is a method that can initiate a PCR reaction.
以下、図6を参照して本方法を説明する。 Hereinafter, this method will be described with reference to FIG.
本方法の第一の工程は、所望の核酸に相補的な配列を有するプローブを不溶性支持体からなる反応容器の内面に固定化する工程である（図6-1、2、3）。 The first step of this method is a step of immobilizing a probe having a sequence complementary to a desired nucleic acid on the inner surface of a reaction vessel made of an insoluble support (FIGS. 6-1, 2, and 3).
前記所望の核酸は、PCRによって増幅したい核酸であり、いずれの核酸であってもよく、好ましくはウイルスゲノム、より好ましくはB型肝炎ウイルスゲノムである。したがって、これらの核酸を増幅したい場合、前記プローブには、これら核酸の相補的な配列を有するプローブを使用すればよい。このようなプローブは、通常の合成方法を使用して作製することができる。前記プローブとして適切な配列、および長さ等は、当業者であれば、前記核酸配列に基づいて容易に判断することができるであろう。 The desired nucleic acid is a nucleic acid to be amplified by PCR, and may be any nucleic acid, preferably a viral genome, more preferably a hepatitis B virus genome. Therefore, when it is desired to amplify these nucleic acids, a probe having a complementary sequence of these nucleic acids may be used as the probe. Such probes can be made using conventional synthesis methods. Those skilled in the art will be able to easily determine the appropriate sequence, length, and the like for the probe based on the nucleic acid sequence.
本方法に使用する不溶性支持体は、PCRに使用可能な支持体であればいずれのものでもよいが、通常は、ポリスチレン、ポリビニル等を素材とするPCRチューブである。 The insoluble support used in this method may be any support that can be used for PCR, but is usually a PCR tube made of polystyrene, polyvinyl, or the like.
前記プローブを不溶性支持体に固定するためには、当業者に既知のいずれの方法を使用してもよいが、上述した本発明の第二の側面に従う方法を使用することができる。該方法を使用すれば、不溶性支持体（マイクロタイタープレートなど）に高率にプローブを固定化することが可能となり、高感度でハイブリダイズさせることができるであろう。該方法のように、核酸を容易かつ高率に不溶性支持体に固定化する方法は、従来法にはなく、本発明は、該固相化法が発明されたことによって容易に実施可能となったといえる。 Any method known to those skilled in the art may be used to immobilize the probe to the insoluble support, but the method according to the second aspect of the invention described above may be used. By using this method, it becomes possible to immobilize the probe at a high rate on an insoluble support (such as a microtiter plate), and it will be possible to hybridize with high sensitivity. There is no conventional method for immobilizing nucleic acids on an insoluble support easily and at a high rate as in this method, and the present invention can be easily carried out by inventing the solid phase immobilization method. It can be said that.
また、プローブを固定化したPCRチューブ等は、そのままの状態で以下の工程に使用することも可能であるが、非特異的な結合を防止するためにブロッキングを行っておくことが好ましい。たとえば、ブロッキングは、6xSSC, 0.01M EDTA(pH8.0), 5x Denhardt’s solution, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNAからなる溶液を分注し、１時間程度室温にて軽く振とうしながらインキュベートすることによって行うことができる。 In addition, the PCR tube or the like on which the probe is immobilized can be used as it is in the following steps, but it is preferable to perform blocking in order to prevent non-specific binding. For example, for blocking, dispense a solution consisting of 6xSSC, 0.01M EDTA (pH 8.0), 5x Denhardt's solution, 100μg / ml Sheared, denatured salmon sperm DNA, and incubate for about 1 hour with gentle shaking at room temperature. Can be done.
本方法の第二の工程は、前記不溶性支持体（プローブが固定化されている）に、増幅したい核酸を含むサンプル液を添加して、該核酸を前記プローブにハイブリダイズさせる工程である（図6-4、5、図7-6）。 The second step of this method is a step of adding a sample solution containing the nucleic acid to be amplified to the insoluble support (where the probe is immobilized) and hybridizing the nucleic acid to the probe (FIG. 6-4, 5, Fig. 7-6).
この工程では、使用する核酸を適切な溶液（生理食塩水等）に溶解または稀釈してサンプル溶液を作製する。サンプルとして、ウイルス、細菌、細胞等を直接使用する場合（たとえば、患者検体から採取した血清など）は、効率よくウイルスゲノム等を露出させるために、ウイルスを1％ SDS、1％ 2-メルカプトエタノールを含む溶液（サンプル稀釈液）に溶解してサンプル液とし、さらにこのサンプル液を95℃において10分間程度加熱処理をすることが好ましい。しかし、以下の実施例において示したように、このような処理を行わなくても単に生理食塩水で適切な濃度にサンプル（ウイルスを含む血清など）ウイルスを稀釈して、95℃において10分間加熱するだけでもよい。また、サンプルとして、超音波処理された細胞、cDNAライブラリー等を使用する場合は、すでに核酸が露出した状態になっているため、該サンプルを適切な溶液に溶解するだけで、加熱処理を行わなくてもよいであろう。 In this step, a sample solution is prepared by dissolving or diluting the nucleic acid to be used in an appropriate solution (such as physiological saline). When using viruses, bacteria, cells, etc. directly as samples (for example, serum collected from patient specimens), in order to efficiently expose the virus genome, etc., the virus is 1% SDS, 1% 2-mercaptoethanol. It is preferable that the sample solution is dissolved in a solution containing the sample (sample dilution solution), and the sample solution is further heated at 95 ° C. for about 10 minutes. However, as shown in the examples below, without such treatment, simply dilute the sample (such as serum containing virus) virus to an appropriate concentration in physiological saline and heat at 95 ° C. for 10 minutes. Just do it. In addition, when using sonicated cells, cDNA libraries, etc. as samples, the nucleic acid is already exposed, so heat treatment is performed simply by dissolving the sample in an appropriate solution. It may not be necessary.
その後のブロッキング、ハイブリダイゼーションの条件は、特に限定するものではなく、慣用されている方法から適宜選択可能である。ハイブリダイゼーションのためには、前記不溶性支持体からなる反応容器（たとえばPCRチューブ）に、適切なハイブリダイゼーションバッファー（たとえば、6xSSC, 0.01M EDTA(pH8.0), 5x Denhardt’s solution, 0.5% SDS, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNA）を分注し（PCRチューブであれば50μl程度が好ましい）、適切なハイブリダイゼーション温度に加温しておく。次いで、上記の通り溶解したサンプル液を95℃で処理した後、直ちに氷中に移して1本鎖の状態を維持しておき、ハイブリダイゼーション溶液を分注して加温してある反応容器に添加する。適切なハイブリダイゼーション温度において、適切な時間（たとえば2時間程度）振とうしながらインキュベーションすることによってハイブリダイゼーションを行えばよい。上記適切なハイブリダイゼーションバッファー、およびハイブリダイゼーション条件等は、通常使用されるものを用いればよく、当業者であればプローブのTm等から容易に判断できるであろう。 Subsequent blocking and hybridization conditions are not particularly limited, and can be appropriately selected from commonly used methods. For hybridization, the reaction vessel (eg, PCR tube) comprising the insoluble support is placed in a suitable hybridization buffer (eg, 6xSSC, 0.01M EDTA (pH 8.0), 5x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 100 μg). / ml Sheared, denatured salmon sperm DNA) (approx. 50 μl is preferable for PCR tubes) and warm to an appropriate hybridization temperature. Next, after the sample solution dissolved as described above is treated at 95 ° C., it is immediately transferred to ice to maintain the single-stranded state, and the hybridization solution is dispensed into a heated reaction container. Added. Hybridization may be performed by incubation at an appropriate hybridization temperature while shaking for an appropriate time (for example, about 2 hours). The appropriate hybridization buffer, hybridization conditions, and the like may be those commonly used, and those skilled in the art can easily determine from the Tm of the probe.
本方法の第三の工程は、前記サンプル液を除去する工程である。 The third step of the method is a step of removing the sample solution.
前記工程においてサンプル液を添加して、適切な条件でハイブリダイゼーションさせた後、PCRチューブ等の反応容器（固定化プローブには核酸がハイブリダイズしている）から該サンプル液を除去する。除去後、適切な洗浄液（通常は、ツイーン20を含む２ｘSSC緩衝液、生理食塩水等である）で1回程度洗浄しておくことが好ましい。
After the sample solution is added and hybridized under appropriate conditions in the above step, the sample solution is removed from a reaction vessel such as a PCR tube (the nucleic acid is hybridized to the immobilized probe). After removal, it is preferable to wash about once with an appropriate washing solution (usually 2 × SSC
増幅したい核酸がRNAである場合（たとえばC型肝炎ウイルスゲノムの場合）は、次の工程の前にRNAをDNAに転写しておく必要がある。すなわち、得られたウイルスゲノムをPCRに使用するために逆転写反応を行わなければならない。このような逆転写反応は、ハイブリダイズしたRNAをテンプレートとして、通常の方法、およびキット等を使用して行えばよいが、たとえばHexa-deoxyribonucleotide mixture(TAKARA社製)を用いて、M-MLVReverse Transcriptase(LIFE TECHNOLOGIES社製)によって逆転写することができる。 When the nucleic acid to be amplified is RNA (for example, in the case of hepatitis C virus genome), it is necessary to transcribe RNA into DNA before the next step. That is, a reverse transcription reaction must be performed in order to use the obtained viral genome for PCR. Such a reverse transcription reaction may be performed using a hybridized RNA as a template by using a usual method and a kit. For example, using Hexa-deoxyribonucleotide mixture (manufactured by TAKARA), M-MLV Reverse Transcriptase Reverse transcription can be performed by (LIFE TECHNOLOGIES).
本方法の第四の工程は、前記反応容器にPCR反応液を添加して、PCR反応により前記核酸を増幅する工程である（図7-7、8）。 The fourth step of this method is a step of adding a PCR reaction solution to the reaction vessel and amplifying the nucleic acid by a PCR reaction (FIGS. 7-7 and 8).
本工程で行われるPCRは、プローブにハイブリダイズした核酸をテンプレートとして使用する。したがって、プライマーは、ハイブリダイズした核酸（核酸がRNAの場合は、逆転写したDNA）を増幅するための適切なプライマーを使用すればよく、このようなプライマーを設計して作製することは、当業者であれば容易に行うことができるであろう。たとえば、B型肝炎ウイルスゲノムの1762番および1764番目の塩基を含む領域を増幅するのであれば、配列番号20、21のプライマーを使用して、通常のPCR反応を行えばよい。 PCR performed in this step uses a nucleic acid hybridized to a probe as a template. Therefore, an appropriate primer for amplifying the hybridized nucleic acid (or reverse transcribed DNA if the nucleic acid is RNA) may be used as a primer. A trader can easily do this. For example, if a region containing the 1762th and 1764th bases of the hepatitis B virus genome is amplified, a normal PCR reaction may be performed using the primers of SEQ ID NOs: 20 and 21.
上記方法の一つの態様において、患者検体から得られた血清中のB型肝炎ウイルスの遺伝子型、および変異株を判別するために、該ウイルスゲノムの変異領域（1762番および1764番目の塩基を含む領域）を増幅したい場合、前記第一の工程において、B型肝炎ウイルスゲノムに相補的な配列を有するプローブ（たとえば、配列番号22または23）を不溶性支持体からなる反応容器の内面に固定化し、第二の工程において、血清サンプルを添加してB型肝炎ウイルスゲノムをプローブにハイブリダイズさせ、第四の工程において、上述した領域を増幅させるためのプライマー（たとえば、配列番号20または21）を使用してPCRを行うことによって、血清中のB型肝炎ウイルスゲノムの変異領域を容易に増幅させることが可能となる。 In one embodiment of the above method, in order to determine the genotype of hepatitis B virus in the serum obtained from a patient sample and the mutant strain, the mutant region of the viral genome (including the 1762th and 1764th bases) is included. In the first step, a probe having a sequence complementary to the hepatitis B virus genome (for example, SEQ ID NO: 22 or 23) is immobilized on the inner surface of a reaction vessel made of an insoluble support, In the second step, a serum sample is added to hybridize the hepatitis B virus genome to the probe, and in the fourth step, a primer (eg, SEQ ID NO: 20 or 21) is used to amplify the region described above. By performing PCR, it is possible to easily amplify the mutated region of the hepatitis B virus genome in the serum.
また、本発明のもう一つの側面に従えば、前記方法を利用して所望の核酸を精製、増幅するためのキットが提供される。該キットは、プローブを固定化するための被覆用溶液が添加された不溶性支持体からなる反応容器（PCRチューブなど）と、前記核酸が含まれたサンプルを稀釈するための稀釈液と、前記核酸をPCRで増幅させるためのPCR反応液を含む。 According to another aspect of the present invention, a kit for purifying and amplifying a desired nucleic acid using the method is provided. The kit includes a reaction vessel (PCR tube or the like) composed of an insoluble support to which a coating solution for immobilizing a probe is added, a dilution solution for diluting a sample containing the nucleic acid, and the nucleic acid. A PCR reaction solution for amplifying the product by PCR is included.
たとえば、キットの構成要素として、下記の（a）〜（e）を含むことができる。 For example, the following (a) to (e) can be included as components of the kit.
（a）PCRチューブに2M〜3M Na2CO3 or K2CO3溶液を分注したもの(適切なプローブを予め加えておき、特定の核酸を増幅するためのキットとすることもできる)
（b）希釈液 (1%SDS, 1% 2-メルカプトエタノール等)
（c）Hybri. Sol (6xSSC, 0.01M EDTA(pH8.0), 5x Denhardt’s solution, 0.5% SDS, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNA, 50%ホルムアミド等)
（d）洗浄液 (Tween-20を含む2xSSC等)
（e）PCR反応液（PCR pre-mixture） (Taq polymerase, PCR buffer, dNTPs,等通常のPCRに必要な試薬を含む。適切なプライマーを予め加えておき、特定の核酸を増幅するためのキットとすることもできる)。
(A) PCR tubes 2M~3M Na 2 CO 3 or K 2 CO 3 solution that dispensed (in advance adding an appropriate probe may be a kit for amplifying a specific nucleic acid)
(B) Diluent (1% SDS, 1% 2-mercaptoethanol, etc.)
(C) Hybri. Sol (6xSSC, 0.01M EDTA (pH8.0), 5x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 100μg / ml Sheared, denatured salmon sperm DNA, 50% formamide, etc.)
(D) Cleaning solution (2xSSC containing Tween-20, etc.)
(E) PCR pre-mixture (Includes reagents necessary for normal PCR, such as Taq polymerase, PCR buffer, dNTPs, etc. Kit for amplifying specific nucleic acids by adding appropriate primers in advance. Can also be.)
前記所望の核酸とは、ユーザーが増幅したい核酸であり、いずれの核酸であってもよい。ユーザーは、前記核酸に相補的なキットに含まれていないプローブ、および前記核酸を増幅できるプライマーの配列を選択し、準備することになる。このようなプローブ、およびプライマーは、当業者であれば容易に選択することができるであろう。しかし、増幅する核酸をあらかじめ決定しておき、該核酸を増幅するためのキットとして提供されてもよく、この場合には、前記被覆用溶液に適切なプローブを添加し、該プローブを不溶性支持体からなる反応容器に固定しておき、前記PCR反応液には、該核酸の増幅に適したプライマーを添加しておいてもよい。 The desired nucleic acid is a nucleic acid that the user wants to amplify and may be any nucleic acid. The user selects and prepares a probe that is not included in the kit complementary to the nucleic acid and a primer sequence that can amplify the nucleic acid. Such probes and primers can be easily selected by those skilled in the art. However, the nucleic acid to be amplified may be determined in advance, and provided as a kit for amplifying the nucleic acid. In this case, an appropriate probe is added to the coating solution, and the probe is added to the insoluble support. And a primer suitable for amplification of the nucleic acid may be added to the PCR reaction solution.
また、前記被覆用溶液は、上記本発明の第二の側面に関して記載した塩溶液である。好ましくは、2〜3MのK2CO3またはNa2CO3溶液である。 The coating solution is the salt solution described with respect to the second aspect of the present invention. Preferably, a K 2 CO 3 or solution of Na 2 CO 3 in 2 to 3 m.
前記稀釈液は、たとえば生理食塩水、1%SDS, 1% 2-メルカプトエタノール液等である。 The dilution solution is, for example, physiological saline, 1% SDS, 1% 2-mercaptoethanol solution or the like.
前記PCR反応液は、通常のPCR反応に必要な試薬が含まれたpre-mixture溶液であり、Taq polymerase, PCR buffer, dNTPs,等通常のPCRに必要な試薬を含む。上述の通り、該反応液には、適切なプライマーが含まれていてもよい。 The PCR reaction solution is a pre-mixture solution containing reagents necessary for a normal PCR reaction, and includes reagents necessary for normal PCR, such as Taq polymerase, PCR buffer, and dNTPs. As described above, the reaction solution may contain an appropriate primer.
該キットの操作手順は、第三の側面において説明したPCR法に従って、該方法の第二工程から実施すればよい。たとえば患者検体から得られた血清中のウイルスを精製、増幅する場合、該血清を稀釈で稀釈してサンプル液を作製し、加熱処理を行っておく。この溶液をキットに含まれている反応容器（プローブが固相化されたPCRチューブ）に添加して、ハイブリダイゼーションを行う。次いで、サンプル液を除去し、適切なプライマーを含むPCR反応液（キットに含まれている）を前記反応容器に添加する。これを通常と同様の条件でPCRにかければ、ウイルスゲノムが増幅される。このような操作手順（ハイブリダイゼーション条件、PCR条件等）についての解説書をキットに含めておくことが望ましい。 The operation procedure of the kit may be carried out from the second step of the method according to the PCR method described in the third aspect. For example, when purifying and amplifying a virus in serum obtained from a patient specimen, a sample solution is prepared by diluting the serum with dilution, followed by heat treatment. This solution is added to a reaction vessel (PCR tube on which the probe is immobilized) included in the kit, and hybridization is performed. Next, the sample solution is removed, and a PCR reaction solution containing the appropriate primer (included in the kit) is added to the reaction vessel. If this is subjected to PCR under the same conditions as usual, the viral genome is amplified. It is desirable to include in the kit a manual for such operating procedures (hybridization conditions, PCR conditions, etc.).
上記のようなキットの一例として、B型肝炎ウイルスの重症化株として知られているT1762A1764について検出するキットについて記載する。本キットのユーザーは、被検患者から得た血清サンプルとPCR機、ピペッター、電気泳動装置等を準備するだけでよい。 As an example of the kit as described above, a kit for detecting T 1762 A 1764, which is known as a severe strain of hepatitis B virus, is described. The user of this kit only needs to prepare a serum sample obtained from the patient to be tested, a PCR machine, a pipetter, an electrophoresis apparatus, and the like.
キットに含まれるPCRチューブには、予め必要な2箇所の変異を検出するためのプローブ、すなわち前記B型肝炎ウイルスゲノムの各遺伝子型について、1762番および1764番目の塩基を含む領域に相補的な配列を有するプローブが固定化されている。野生型プローブ（たとえば、配列番号22）と変異型プローブ（たとえば、配列番号23）を別々のチューブに固定化し、1検体について2本の反応を行う。ユーザーは、そのチューブに入っている液体（乾燥を防ぐための1ｘＴＥや、もしくはプローブ固定化液）を除去して、血清を20μｌ程度添加する。それに、添付の希釈液を入れて（80μｌ程度）、95℃にしたPCR機にセットして10分放置する。その後は直ちに氷上に移す。 The PCR tube included in the kit contains a probe for detecting necessary two mutations in advance, that is, complementary to the region containing the 1762th and 1764th bases for each genotype of the hepatitis B virus genome. A probe having a sequence is immobilized. A wild type probe (for example, SEQ ID NO: 22) and a mutant type probe (for example, SEQ ID NO: 23) are immobilized in separate tubes, and two reactions are performed for one specimen. The user removes the liquid contained in the tube (1xTE to prevent drying or the probe immobilization solution) and adds about 20 μl of serum. Add the attached diluent (about 80 μl), set in a PCR machine at 95 ° C. and leave for 10 minutes. Immediately move to ice.
さらに、42℃のPCR機にセットし、上から42℃にあたためたhybro.solを100μｌ添加し、30分から1時間放置する。 Further, set in a PCR machine at 42 ° C., add 100 μl of hybro.sol warmed to 42 ° C. from the top, and leave it for 30 minutes to 1 hour.
その後、チューブ内の液体を捨て、洗浄液を200μｌ添加して数回ピペッティングして捨てる。 Thereafter, the liquid in the tube is discarded, and 200 μl of the washing solution is added and pipetted several times to discard.
次に添付のPCR反応液をチューブに添加する。この反応液には、B型肝炎ウイルスゲノムをPCRで増幅ためのプライマー（たとえば、配列番号20、21）が、すでに添加されている。適切な反応条件も指定しておくので、ユーザーは、その条件で反応を開始するだけである。 Next, the attached PCR reaction solution is added to the tube. Primers (for example, SEQ ID NOs: 20, 21) for amplifying the hepatitis B virus genome by PCR have already been added to this reaction solution. Appropriate reaction conditions are also specified so that the user only starts the reaction under those conditions.
その後、PCR精製産物を電気泳動などによって確認する。被検検体に野生型のウイルスが存在した場合、野生型のプローブを固相化したチューブのみが増幅されてシグナルが得られ、変異型のプローブを固相化したチューブでは、増幅されずに陰性となる。 Thereafter, the PCR purified product is confirmed by electrophoresis or the like. When wild-type virus is present in the test sample, only the tube on which the wild-type probe is immobilized is amplified and a signal is obtained, and in the tube on which the mutant-type probe is immobilized, the amplification is negative. It becomes.
以上の方法を用いることによって、これまで必要だと思われていた血清サンプルからの煩雑なウイルスゲノムの抽出、精製工程を行う必要がなくなり、PCRチューブに適切な配列のプローブを固定化しておくことによって、簡単にPCR反応まで持ち込むことが可能となる。 By using the above method, it is not necessary to perform complicated virus genome extraction and purification steps from serum samples that were thought to be necessary so far, and a probe with an appropriate sequence should be immobilized on the PCR tube. This makes it possible to easily bring in PCR reactions.
実施例1
ＨＢＶB型肝炎患者のうち肝炎を発症した症例のもつウイルスから高率に検出される変異株（T1762A1764）の検出法
1.患者検体の採取法
測定すべき患者から末梢血を採血し、ゼリー管等の採血管に採取した。十分に凝固させたのち3000rpm, 10分間程度の遠心を行い、血球成分を除いて血清を得た。血清は数本の保存用試験管に分注したのち-20℃以下の冷凍庫内に保存した。
Example 1
A method for detecting a mutant strain (T 1762 A 1764 ) detected at a high rate from a virus of a patient who developed hepatitis among HBVB hepatitis patients
1. Collection of patient specimens Peripheral blood was collected from patients to be measured and collected in blood collection tubes such as jelly tubes. After sufficiently coagulating, centrifugation was performed at 3000 rpm for about 10 minutes to remove serum components and obtain serum. Serum was dispensed into several storage tubes and then stored in a freezer below -20 ° C.
2.B型肝炎ウイルスのゲノム抽出
ウイルスゲノムの抽出には、1検体あたり血清25μlを用いて行った。抽出は、スマイテストEX-R&D（ゲノムサイエンス研究所製）キットを用いて、付属の説明書にしたがって行った。
2. Genomic extraction of hepatitis B virus The viral genome was extracted using 25 μl of serum per specimen. Extraction was performed using a Smite Test EX-R & D (Genome Science Laboratory) kit according to the attached instructions.
3.B型肝炎ウイルスゲノムのPCR
PCRは、ウイルス量が少ないサンプルでも十分な感度で検出できるようにnested PCRによって行った。1st PCRは、ビオチン標識なしのプライマー対（primer #eP1-1：5’-gcatggagaccaccgtgaac-3’配列番号18、primer #eP1-2：5’-ggaaagaagtcagaaggcaa-3’配列番号19）を使用して行った。反応条件は、94℃で4分間処理した後、94℃で1分、55℃で1.5分、72度で2分を1サイクルとする反応を35回繰り返し、最後に72℃で7分の処理を行った。2nd PCRは、ビオチンで標識したプライマ−対を用いて（#eP2-1：5’-cataagaggactcttggact-3’配列番号20、primer #eP2-2：5’-ggcaaaaaagagagtaactc-3’配列番号21）、反応条件は、94℃で4分間処理した後、94℃で1分、55℃で1分、72度で1.5分を1サイクルとする反応を30回繰り返し、最後に72℃で7分の処理を行った。
3. PCR of hepatitis B virus genome
PCR was performed by nested PCR so that even a sample with a small amount of virus could be detected with sufficient sensitivity. 1 st PCR uses a biotin-labeled primer pair (primer # eP1-1: 5'-gcatggagaccaccgtgaac-3 'SEQ ID NO: 18, primer # eP1-2: 5'-ggaaagaagtcagaaggcaa-3' SEQ ID NO: 19) went. The reaction conditions were 94 ° C for 4 minutes, 35 cycles of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1.5 minutes, 72 ° C for 2 minutes, and finally 7 minutes at 72 ° C for 7 minutes. Went. 2 nd PCR is labeled primer with biotin - with pairs (# eP2-1: 5'-cataagaggactcttggact- 3 ' SEQ ID NO: 20, primer # eP2-2: 5'- ggcaaaaaagagagtaactc-3' SEQ ID NO: 21), The reaction conditions were as follows: 94 ° C for 4 minutes, then 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1.5 minutes for 30 cycles, and finally 72 ° C for 7 minutes. Went.
4.マイクロタイタープレートへのプローブの固相
ELISA-PLATE, MICROLON, 96W, FLAT-BOTT, MEDIUM BINDING(グライナー社製)に、プローブを0.4μMになるように3M炭酸カリウム溶液で調整した被覆液を分注し、4℃で一晩保温した。プローブは、野生型プローブ(5’-taggttaaaggtctttgta-3’配列番号22と変異型プローブ(5’-taggttaatgatctttgta-3’配列番号23)の2種類を固定化した。
4. Probe solid phase on microtiter plate
Dispensing the coating solution prepared with 3M potassium carbonate solution to ELISA-PLATE, MICROLON, 96W, FLAT-BOTT, MEDIUM BINDING (manufactured by Greiner) so that the probe was 0.4 μM, and kept at 4 ° C. overnight. . Two types of probes, a wild type probe (5′-taggttaaaggtctttgta-3 ′ SEQ ID NO: 22) and a mutant probe (5′-taggttaatgatctttgta-3 ′ SEQ ID NO: 23), were immobilized.
5.増幅したB型肝炎ウイルスゲノムとのハイブリダイゼーション
次に、ツイーン20を含むTBS緩衝液にてウェルを洗浄し、6xSSC、0.01M EDTA(pH8.0)、5x Denhardt’s solution, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNAからなる溶液を各ウェルに100μlずつ分注し、１時間程度室温にて軽く振とうしながらインキュベートすることによってブロッキングを行った。その後ツイーン20を含むTBS緩衝液にてウェルを洗い、6xSSC, 0.01M EDTA(pH8.0), 5x Denhardt’s solution, 0.5% SDS, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNAからなるハイブリダイゼーション溶液を50μlずつ分注して、今回のハイブリダイゼーションの温度である50℃に加温しておいた。ターゲットとなるPCR産物を98℃で2分間処理し、ただちに氷中に移して１本鎖の状態を維持させておき、ハイブリダイゼーション溶液を分注して加温してあるウェルに添加した。50℃で2時間程度軽く振とうしながらインキュベートすることによってハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後は、ツイーン20を含む2ｘSSC緩衝液にてウェルを洗浄した。
5.Hybridization with amplified hepatitis B virus genome Next, the wells were washed with TBS
6.検出
次に、25％FCSを含むTBS緩衝液中に、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を最終濃度7.5ｍUになるように溶解したもの（50μl）でウェルを被覆し、振とうしながら室温で１時間程度インキュベートした。さらにツイーン20を含む2ｘSSC緩衝液にてウェルを洗浄し、TMB(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)-ELIZA液（ライフテックオリエンタル社製）を50μlずつ添加した。十分に発色するまで暗所に静置したのち、反応停止液（2N硝酸ナトリウム）を50μlずつ添加して、492nmにおける吸光度を測定した。吸光度の測定はマルチスキャン バイクロマティック（ラボシステムズ ジャパン社製）を用いて行った。
6. Detection Next, the well is coated with a solution (50 μl) of peroxidase-labeled streptavidin (Roche Diagnostics) dissolved in TBS buffer containing 25% FCS to a final concentration of 7.5 mU. And incubated for about 1 hour at room temperature with shaking. Furthermore, the wells were washed with 2 × SSC
7.結果
結果を図3に示した。図3は、ダイレクトシークエンス法により予め明らかであった配列に応じて、各サンプルを野生型、変異型、その中間型にわけて表記してある。HBe抗原陽性時から、Hbe抗体陽性時を経て、慢性肝炎患者へと病態が進むにつれて変異型の割合が増加していることがわかる。また、ダイレクトシークエンスの結果と本発明の結果が一致していることがわかる。
7. Results The results are shown in FIG. FIG. 3 shows each sample divided into a wild type, a mutant type, and an intermediate type according to the sequence previously revealed by the direct sequencing method. It can be seen that the percentage of mutants increases as the condition progresses from HBe antigen positive to Hbe antibody positive to chronic hepatitis patients. Moreover, it turns out that the result of a direct sequence and the result of this invention correspond.
実施例2
C型肝炎ウイルスの遺伝子型判定法
1.患者検体の採取法
測定すべき患者から末梢血を採血し、ゼリー管等の採血管に採取した。十分に凝固させたのち3000rpm, 10分間程度の遠心を行い、血球成分を除いて血清を得た。血清は数本の保存用試験管に分注したのち-20℃以下の冷凍庫内に保存した。
Example 2
Genotyping method for hepatitis C virus
1. Collection of patient specimens Peripheral blood was collected from patients to be measured and collected in blood collection tubes such as jelly tubes. After sufficiently coagulating, centrifugation was performed at 3000 rpm for about 10 minutes to remove serum components and obtain serum. Serum was dispensed into several storage tubes and then stored in a freezer below -20 ° C.
2.C型肝炎ウイルスのゲノム抽出法
ウイルスゲノムの抽出には、１検体あたり血清100μlを用いて行った。抽出にはSepa-Gene-RV-R（三光純薬 社製）キットを用いた。これにより必要なHCV RNAを含む分画がペレットとして得られた。そのペレットを1unit/μlの濃度で含む1mM DTT溶液9μlにて溶解し、逆転写反応に供するHCV RNAサンプルとした。
2. Genomic extraction method for hepatitis C virus The viral genome was extracted using 100 μl of serum per specimen. Sepa-Gene-RV-R (Sanko Junyaku Co., Ltd.) kit was used for extraction. As a result, a fraction containing the necessary HCV RNA was obtained as a pellet. The pellet was dissolved in 9 μl of a 1 mM DTT solution containing 1 unit / μl to prepare an HCV RNA sample for use in the reverse transcription reaction.
3.C型肝炎ウイルスゲノムRNAの逆転写反応
逆転写反応は、Hexa-deoxyribonucleotide mixture(TAKARA社製)を用いて、M-MLVReverse Transcriptase(LIFE TECHNOLOGIES社製)にて、先ほどのHCV RNAサンプル9μlを加えて総量20μlとして、42℃で30分間インキュベートすることによって行った。
3. Reverse transcription reaction of hepatitis C virus genomic RNA Reverse transcription reaction was performed using Hexa-deoxyribonucleotide mixture (manufactured by TAKARA) and M-MLV Reverse Transcriptase (manufactured by LIFE TECHNOLOGIES) with 9 μl of HCV RNA sample. In addition, a total volume of 20 μl was performed by incubating at 42 ° C. for 30 minutes.
4.C型肝炎ウイルスの遺伝子型を判別するためのPCR
PCRは、ウイルス量が少ないサンプルでも十分な感度で検出できるようにnested PCRにて行った。一度目のPCRはビオチン標識なしのプライマー対を用いて行い、二度目のPCRは、内側のプライマーを使用して、片方のプライマーには、ビオチン標識して行った。反応条件は、94℃で4分間処理した後、94℃で30秒、55℃で30秒、72度で1分を1サイクルとする反応を1度目のPCRでは25回、2度目のPCRでは30回繰り返し、それぞれ最後に72℃で7分の処理を行った。PCRは、GeneTaq(和光純薬社製)を使用して行った。一度目、二度目共に総量50μlとして行った。
4. PCR to determine hepatitis C virus genotype
PCR was performed by nested PCR so that even a sample with a small amount of virus could be detected with sufficient sensitivity. The first PCR was performed using a primer pair without biotin labeling, and the second PCR was performed using the inner primer and one primer labeled with biotin. The reaction conditions were 94 ° C for 4 minutes, 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute for one cycle, 25 times for the first PCR, and for the second PCR. The treatment was repeated 30 times, and each was finally treated at 72 ° C. for 7 minutes. PCR was performed using GeneTaq (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The total was 50 μl for the first time and the second time.
5.マイクロタイタープレートへのプローブの固相
ELISA-PLATE, MICROLON, 96W, FLAT-BOTT, MEDIUM BINDING(グライナー社製)に、プローブを0.4μMになるように３M炭酸カリウム溶液で調整した被覆液を分注し、4℃で一晩保温した。プローブは、１検体につきC型肝炎ウイルスの遺伝子型を調べる目的で１０種類（配列番号1〜10）を使用した。
5. Solid phase of probe on microtiter plate
A coating solution prepared by adjusting the probe to 0.4 μM with 3M potassium carbonate solution was dispensed to ELISA-PLATE, MICROLON, 96W, FLAT-BOTT, MEDIUM BINDING (manufactured by Greiner), and kept at 4 ° C. overnight. . Ten probes (SEQ ID NOs: 1 to 10) were used for the purpose of examining the genotype of hepatitis C virus per specimen.
プローブを固定化した後、ツイーン20を含むTBS緩衝液にてウェルを洗浄し、6xSSC, 0.01M EDTA(pH8.0), 5x Denhardt’s solution, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNAからなる溶液を各ウェルに100μlずつ分注して、１時間程度室温にて軽く振とうしながらインキュベートすることによってブロッキングを行った。
After immobilization of the probe, the wells were washed with TBS
6.ハイブリダイゼーション
その後、ツイーン20を含むTBS緩衝液にてウェルを洗い、6xSSC, 0.01M EDTA(pH8.0), 5x Denhardt’s solution, 0.5% SDS, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNAからなるハイブリダイゼーション溶液を50μlずつ分注して、今回のハイブリダイゼーションの温度である50℃に加温しておいた。ターゲットとなるPCR産物を98℃で2分間処理し、ただちに氷中に移して1本鎖の状態を維持させておき、ハイブリダイゼーション溶液を分注して加温してあるウェルに添加した。50℃で2時間程度軽く振とうしながらインキュベートすることによってハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後は、ツイーン２０を含む2ｘSSC緩衝液にてウェルを洗浄した。
6.Hybridization After that, the wells were washed with TBS
7.検出
次に、25％FCSを含むTBS緩衝液中に、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を最終濃度7.5ｍUになるように溶解したもの50μlでウェルを被覆し、振とうしながら室温で1時間程度インキュベートした。さらにツイーン20を含む2ｘSSC緩衝液にてウェルを洗い、TMB(3,3’,5, 5’-tetramethylbenzidine)-ELIZA液（ライフテックオリエンタル社製）を50μlずつ添加した。十分に発色するまで暗所に静置したのち反応停止液（２N硫酸）を50μlずつ添加して、492nmにおける吸光度を測定した。吸光度の測定はマルチスキャン バイクロマティック（ラボシステムズ ジャパン社製）を使用して行った。
7. Detection Next, the well was coated with 50 μl of peroxidase-labeled streptavidin (Roche Diagnostics) dissolved in TBS buffer containing 25% FCS to a final concentration of 7.5 mU, The mixture was incubated at room temperature for about 1 hour with shaking. Further, the wells were washed with 2 × SSC
8.結果
結果は図4に示した通りである。12検体はそれぞれ1〜4までが1b型、5〜8までが2a型、9〜12までが2b型である。それぞれのグラフは、ターゲットの遺伝子型別に示した。マイクロプレートに分注して固相したプローブを、増幅した各サンプル由来の産物をグラフの横軸に示した。ビオチンが多く検出されたウェルに固相してあったプローブから型判定を行った結果、それぞれの遺伝子型において、各サンプルとも予想されたプローブにハイブリダイゼーションした。
8. Results The results are as shown in FIG. Twelve specimens are 1b type from 1 to 4, 2a type from 5 to 8, and 2b type from 9 to 12, respectively. Each graph is shown by target genotype. A probe dispensed on a microplate and a solid phase was amplified, and the product derived from each sample was shown on the horizontal axis of the graph. As a result of performing type determination from a probe solid-phased in a well in which a large amount of biotin was detected, each sample hybridized to the expected probe in each genotype.
a領域では、1b型の場合a-12にハイブリダイゼーションし、2a型ではa-20、2b型では、a-32にハイブリダイゼーションしていることがわかる。b領域では、1b型の場合、b-11にハイブリダイゼーションし、2a、2b型では、b-21にハイブリダイゼーションしている。ｃ領域では、1b型の場合、c-11にハイブリダイゼーションし、2a型では、c-21、2b型はc-31にハイブリダイゼーションしている。e領域では、1b型の場合、e-21にハイブリダイゼーションし、2a、2b型では、e-31にハイブリダイゼーションしている。
In the a region, it can be seen that the
今回検討した1b、2a、2b型のそれぞれ4例では、それぞれ予想されたプローブにハイブリダイゼーションしていることがわかり、プローブにハイブリダイゼーションしたパターンを解析することによって、C型肝炎ウイルスの遺伝子型が測定できることが明らかとなった。また、低い数値ながら予想されたプローブ以外にハイブリダイゼーションする場合もみられたが、4種の領域を調べ総合的に判断することにより、遺伝子型を判別することが可能であった。
In each of the 4 cases of
実施例3
核酸固定化のための最適条件の検討
不溶性支持体（マイクロタイタープレート）にプローブを固相化するための最適な条件を検討した。数種類の塩溶液を数段階の濃度に溶解して、この被覆用溶液中に、20塩基からなるプローブを0.4μMの濃度に溶解し、マイクロタイタープレートに分注して4℃で一晩放置し、ツイーン20を含むTBS（トリス・バッファード・セリン）緩衝液にてウェルを洗い、プローブ固相化の操作とした。
Example 3
Examination of optimum conditions for immobilization of nucleic acid The optimum conditions for immobilizing the probe on an insoluble support (microtiter plate) were examined. Dissolve several salt solutions to several levels, dissolve 20 base probe to a concentration of 0.4 μM in this coating solution, dispense into a microtiter plate and leave at 4 ° C overnight. The wells were washed with a TBS (Tris Buffered Serine) buffer
図2にその結果を示した。図2−aでは、20塩基からなるプローブをビオチンラベルした後に、また図2−bでは、221bpの長さのＰＣＲ産物をビオチンラベルした後に、図中に示した12種類の溶媒に溶解し、該溶液をプレートに滴下してプローブを固相化し、固定化されたビオチン量を測定することによって、固相化量を検出した結果をグラフに示した。グラフの横軸は各塩溶液の濃度を示している。この検討の結果、20塩基のプローブをもっとも効率よく固相化することができた塩溶液は、2M炭酸カリウム溶液、および2〜3Ｍ炭酸ナトリウム溶液であり、221bpのPCR産物の場合に最も効率がよかったものは、3Ｍ炭酸カリウム溶液、および3Ｍ炭酸ナトリウム溶液であることが確認された。 Figure 2 shows the results. In FIG. 2-a, after biotin labeling a probe consisting of 20 bases, and in FIG. 2-b, after biotin labeling a PCR product having a length of 221 bp, it was dissolved in 12 kinds of solvents shown in the figure, The result of detecting the amount of immobilized solid phase by dropping the solution onto a plate and immobilizing the probe and measuring the amount of immobilized biotin is shown in the graph. The horizontal axis of the graph indicates the concentration of each salt solution. As a result of this study, the salt solutions that were able to immobilize the 20-base probe most efficiently were 2M potassium carbonate solution and 2-3M sodium carbonate solution, and the most efficient in the case of a 221 bp PCR product. What was good was confirmed to be 3M potassium carbonate solution and 3M sodium carbonate solution.
実施例4
従来の抽出法を使用しないでHBVの増幅を行う方法
1.患者検体の採取法
測定すべき患者から末梢血を採血し、ゼリー管等の採血管に採取した。十分に凝固させたのち3000rpm, 10分間程度の遠心を行い、血球成分を除いて血清を得た。血清は数本の保存用試験管に分注したのち-20℃以下の冷凍庫内に保存した。
Example 4
A method to amplify HBV without using conventional extraction methods
1. Collection of patient specimens Peripheral blood was collected from patients to be measured and collected in blood collection tubes such as jelly tubes. After sufficiently coagulating, centrifugation was performed at 3000 rpm for about 10 minutes to remove serum components and obtain serum. Serum was dispensed into several storage tubes and then stored in a freezer below -20 ° C.
2.従来法でのB型肝炎ウイルスのゲノム抽出法
従来法の例では、ウイルスゲノムの抽出に、1検体あたり血清25μlを用いて行った。抽出には、スマイテストEX-R&D（ゲノムサイエンス研究所製）キットを使用した。
2. Conventional method for extracting hepatitis B virus genome In the example of the conventional method, 25 µl of serum per sample was used for virus genome extraction. For the extraction, a Sumitest EX-R & D (Genomic Science Laboratories) kit was used.
3.マイクロタイタープレートにDNA断片の固定化
プローブとして使用するために、PCRチューブには、10μMのHBV S領域に特異的なプライマ−HS1-1(5’-tcgtgttacaggcggggttt-3’配列番号14)とHS1-2(5’-cgaaccactgaacaaatggc-3’配列番号15)を0.4μMになるように2M炭酸カリウム溶液で調整した被覆溶液を50μｌずつ分注し、4℃で一晩保温した。プライマー（プローブ）を固定化した後、ツイーン20を含むTBS緩衝液にてウェルを洗浄し、6xSSC, 0.01M EDTA(pH8.0), 5x Denhardt’s solution, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNAからなる溶液を各ウェルに100μlずつ分注し、1時間程度室温にて軽く振とうしながらインキュベートすることによってブロッキングを行った。
3. Immobilization of DNA fragment on microtiter plate For use as a probe, a PCR tube contains 10 μM HBVS region specific primer HS1-1 (5'-tcgtgttacaggcggggttt-3 'SEQ ID NO: 14) and 50 μl of a coating solution prepared by adjusting HS1-2 (5′-cgaaccactgaacaaatggc-3 ′ SEQ ID NO: 15) with a 2 M potassium carbonate solution to 0.4 μM was dispensed and kept at 4 ° C. overnight. After immobilizing the primer (probe), wash the well with TBS
4.血清の前処理
血清は、前処理をしない場合（5μｌの血清に生理食塩水を加えて95℃にて10分間処理したもの）と、前処理あり（5μｌの血清に対して、1% SDS, 2% 2-mercaptoethanol, 2%ツイーン20、プロテアーゼ K（ＰＫ）等を様々に加えた溶液を添加し、それぞれ95℃にて10分間処理）の場合をテストした。
4. Serum pre-treatment Serum was pre-treated (5 μl serum added with physiological saline and treated at 95 ° C. for 10 minutes) and pre-treated (1% for 5 μl serum) A case was tested in which a solution containing various additions of SDS, 2% 2-mercaptoethanol, 2
5.ハイブリダイゼーション
プライマ−（プローブ）を固定化してブロッキングを行ったPCRチューブを、ツイーン２０を含むTBS緩衝液にて洗い、6xSSC, 0.01M EDTA(pH8.0), 5x Denhardt’s solution, 0.5% SDS, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNA、50％ホルムアミドからなる基本ハイブリダイゼーションバッファー、もしくはULTRA hyb(Ambion社製)を50μlずつ分注して、今回のハイブリダイゼーションの温度である42℃に加温しておいた。4．の工程の前処理後のサンプルをターゲットとして、または2．の工程の抽出サンプルをコントロールとして使用し、95℃で処理した後、ただちに氷中に移して1本鎖の状態を維持させておき、ハイブリダイゼーション溶液を分注して加温してあるPCRチューブに添加した。42℃で2時間程度軽く振とうしながらインキュベートすることによってハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後は、ツイーン20を含む生理食塩水にてPCRチューブ内を1回洗浄した。
5. Hybridization Primer (probe) immobilized PCR tube was washed with TBS
6.PCR
PCRのプライマ−には、PCRチューブに固定化した2種のプライマ−より内側に位置するプライマ−HS2-1(5’-caaggtatgttgcccgtttg-3’配列番号16)、HS2-2(5’-ggcactagtaaactgagcca-3’配列番号17)を使用した。PCR反応に必要な酵素、プライマ−、dNTPs、バッファー等は、予め調整しておき、ハイブリダイゼーション後に1回洗浄したPCRチューブに50μｌずつ添加して、そのままPCR反応を開始した
7.検出
2％アガロースゲルにて電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色を行って、紫外線下で写真撮影をおこなった。
6.PCR
PCR primers include primers located within the two primers immobilized on the PCR tube, HS2-1 (5'-caaggtatgttgcccgtttg-3 'SEQ ID NO: 16), HS2-2 (5'-ggcactagtaaactgagcca- 3 ′ SEQ ID NO: 17) was used. Enzymes, primers, dNTPs, buffers, etc. necessary for the PCR reaction were adjusted in advance, and 50 μl each was added to the PCR tube washed once after hybridization, and the PCR reaction was started as it was.
7.Detection
Electrophoresis was performed on a 2% agarose gel, ethidium bromide staining was performed, and a photograph was taken under ultraviolet light.
8.結果
結果を図5に示した。（1）は、抽出HBV DNAと血清サンプルに1％SDS，2％ 2−メルカプトエタノール処理した場合の比較で、a,b２種類の陽性サンプルについて検出を行った結果である。ハイブリダイゼーションバッファーとして、6xSSC, 0.01M EDTA(pH8.0), 5x Denhardt’s solution, 0.5% SDS, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNA、50％ホルムアミドからなる溶液（基本的ハイブリダイゼーションバッファーとする）とULTRA hybを比較した。その結果、ハイブリダイゼーションに用いるバッファーとして、ULTRAhybより基本ハイブリダイゼーションバッファーの方がよかった。ULTRAhybを用いた場合は、今回のハイブリダイゼーション条件では検出できなかったが、基本的ハイブリダイゼーションバッファーではうまく検出できた。また、既成の抽出キットを用いたサンプルと、PCRチューブ内で簡単な前処理をしたのみのサンプルとではほぼ同程度の増幅をしめした。抽出したHBV-DNAと同様に、チューブ内で1% SDS, 2% 2-mercaptoethanolで熱処理しただけのサンプルでも、同様に目的の産物が増幅された。
8. Results The results are shown in FIG. (1) is a result of detection of two types of positive samples a and b in comparison with the case where the extracted HBV DNA and serum samples were treated with 1% SDS and 2% 2-mercaptoethanol. Hybridization buffer: 6xSSC, 0.01M EDTA (pH 8.0), 5x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 100μg / ml Sheared, denatured salmon sperm DNA, 50% formamide solution (basic hybridization buffer) ULTRA hyb was compared. As a result, the basic hybridization buffer was better than ULTRAhyb as the buffer used for hybridization. When ULTRAhyb was used, it could not be detected under the present hybridization conditions, but was successfully detected with the basic hybridization buffer. In addition, almost the same level of amplification was shown for the sample using the existing extraction kit and the sample that had been simply pretreated in the PCR tube. Similarly to the extracted HBV-DNA, the target product was similarly amplified in the sample that was just heat-treated with 1% SDS and 2% 2-mercaptoethanol in the tube.
（2）は、血清サンプルに対する様々な前処理方法を比較検討した。その結果、1% SDS, 2% ツイーン20によって前処理した場合では、若干増幅量が落ちていたが、前処理に2％ツイーン20を添加した4番以外のチューブでは、ほぼ同程度の増幅をしめした。特に、6番のチューブは、前処理として熱処理のみであったが、他の前処理ありのサンプルと同程度に増幅可能であった。すなわち、前処理なしの生理食塩水希釈のみでも、前処理ありの場合と同様の増幅効率を示すことが明らかとなった。
(2) compared and examined various pretreatment methods for serum samples. As a result, when pre-treated with 1% SDS and 2
以上の結果から、本発明を用いることによって、従来のウイルスゲノム抽出法を用いることなく、血清サンプルに熱処理を行うのみで、目的の産物を１チューブ内で増幅まで行うことができることがわかった。 From the above results, it was found that by using the present invention, the desired product can be amplified in one tube only by heat-treating the serum sample without using the conventional viral genome extraction method.
ここで、上述の発明の詳細な説明、および実施例において使用したプローブ、およびプライマーを簡単に説明する。 Here, the detailed description of the above-described invention and the probes and primers used in the examples are briefly described.
a領域
a-12 ctc aat gcc tgg aga ttt ggg（配列番号1）
a-20 tct atg ccc ggc cat ttg gg（配列番号2）
a-32 ctc tat gtc cgg tca ttt ggg（配列番号3）
b領域
b-11 agt agt gtt ggg tcg cga a（配列番号4）
b-21 agt agc gtt ggg ttg cga a（配列番号5）
c領域
c-11 gag cgg tcg caa cct cgt g（配列番号6）
c-21 gag cgg tcc cag cca cgt（配列番号7）
c-31 agc gat ccc agc cgc gtg（配列番号8）
e領域
e-21 cga ggt tcc cgt ccc tct t（配列番号9）
e-31 cgc ggg tct cgt cct act t（配列番号10）
PCR primers for HCV genotyping (semi nested PCR)
1st PCR
nt2 ccc tgt gag gaa cta ctg tc（配列番号11）
core1 gga atg tac ccc atg agg tc（配列番号12）
2nd PCR
nc4 tct gcg gaa ccg gtg agt ac（配列番号13）
core 1 1stと同じ
PCR primers for HBV
HS1-1 5’-tcgtgttacaggcggggttt-3’（配列番号14）
HS1-2 5’-cgaaccactgaacaaatggc-3’（配列番号15）
HS2-1 5’-caaggtatgttgcccgtttg-3’（配列番号16）
HS2-2 5’-ggcactagtaaactgagcca-3’（配列番号17）
PCR primers for HBV
eP1-1：5’-gcatggagaccaccgtgaac-3’（配列番号18）
eP1-2：5’-ggaaagaagtcagaaggcaa-3’（配列番号19）
eP2-1：5’-cataagaggactcttggact-3’（配列番号20）
eP2-2：5’-ggcaaaaaagagagtaactc-3’（配列番号21）
proves for HBV
wildtype 5’-taggttaaaggtctttgta-3’（配列番号22）
mutant 5’-taggttaatgatctttgta-3’（配列番号23)
a area
a-12 ctc aat gcc tgg aga ttt ggg (SEQ ID NO: 1)
a-20 tct atg ccc ggc cat ttg gg (SEQ ID NO: 2)
a-32 ctc tat gtc cgg tca ttt ggg (SEQ ID NO: 3)
b area
b-11 agt agt gtt ggg tcg cga a (SEQ ID NO: 4)
b-21 agt agc gtt ggg ttg cga a (SEQ ID NO: 5)
c area
c-11 gag cgg tcg caa cct cgt g (SEQ ID NO: 6)
c-21 gag cgg tcc cag cca cgt (SEQ ID NO: 7)
c-31 agc gat ccc agc cgc gtg (SEQ ID NO: 8)
e area
e-21 cga ggt tcc cgt ccc tct t (SEQ ID NO: 9)
e-31 cgc ggg tct cgt cct act t (SEQ ID NO: 10)
PCR primers for HCV genotyping (semi nested PCR)
1 st PCR
nt2 ccc tgt gag gaa cta ctg tc (SEQ ID NO: 11)
core1 gga atg tac ccc atg agg tc (SEQ ID NO: 12)
2 nd PCR
nc4 tct gcg gaa ccg gtg agt ac (SEQ ID NO: 13)
same as
PCR primers for HBV
HS1-1 5'-tcgtgttacaggcggggttt-3 '(SEQ ID NO: 14)
HS1-2 5'-cgaaccactgaacaaatggc-3 '(SEQ ID NO: 15)
HS2-1 5'-caaggtatgttgcccgtttg-3 '(SEQ ID NO: 16)
HS2-2 5'-ggcactagtaaactgagcca-3 '(SEQ ID NO: 17)
PCR primers for HBV
eP1-1: 5'-gcatggagaccaccgtgaac-3 '(SEQ ID NO: 18)
eP1-2: 5'-ggaaagaagtcagaaggcaa-3 '(SEQ ID NO: 19)
eP2-1: 5'-cataagaggactcttggact-3 '(SEQ ID NO: 20)
eP2-2: 5'-ggcaaaaaagagagtaactc-3 '(SEQ ID NO: 21)
proves for HBV
wildtype 5'-taggttaaaggtctttgta-3 '(SEQ ID NO: 22)
mutant 5'-taggttaatgatctttgta-3 '(SEQ ID NO: 23)
Claims (7)
１．前記所望の核酸に相補的な配列からなるプローブを、１Ｍ〜５Ｍの濃度のＲｂ ２ ＣＯ ３ 、Ｃｓ ２ ＣＯ ３、 １M〜４Mの濃度のＫ ２ ＣＯ ３ および２M〜４Mの濃度のＮａ ２ ＣＯ ３ の群から選択される炭酸塩を含む溶液からなる被覆用溶液に溶解し、これを不溶性支持体からなる反応容器に添加することを具備する前記プローブを前記反応容器の内面に固定化する工程と、
２．前記反応容器に、核酸を含むサンプル液を添加して前記核酸を前記プローブにハイブリダイズさせる工程と、
３．ハイブリダイズに供されなかった核酸を含む前記サンプル液を除去する工程と、
４．前記３．の工程後に前記反応容器において、増幅反応により前記核酸を増幅する工程と、
を含む方法。 A method for purifying and amplifying a desired nucleic acid comprising:
1. The desired probes having a sequence complementary to the nucleic acid, the concentration of Rb 2 CO 3 in 1M~5M, Cs 2 CO 3, at a concentration of 1M~4M K 2 CO 3 and 2M~4M concentrations of Na 2 CO The step of immobilizing the probe on the inner surface of the reaction vessel, comprising dissolving in a coating solution comprising a carbonate selected from the group of 3 and adding it to a reaction vessel comprising an insoluble support When,
2. Adding a sample solution containing nucleic acid to the reaction vessel to hybridize the nucleic acid to the probe;
3. Removing the sample solution containing nucleic acid that has not been subjected to hybridization;
4). 3 above. Amplifying the nucleic acid by an amplification reaction in the reaction vessel after the step;
Including methods.
前記核酸に相補的な配列からなるプローブを固相化するための、１Ｍ〜５Ｍの濃度のＲｂ ２ ＣＯ ３ 、Ｃｓ ２ ＣＯ ３ 、１M〜４Mの濃度のＫ ２ ＣＯ ３ および２M〜４Mの濃度のＮａ ２ ＣＯ ３ の群から選択される炭酸塩を含む溶液からなる被覆用溶液と、
反応容器と、
前記核酸を含むサンプル液を稀釈するための稀釈液と、
前記核酸を増幅するための反応液と、
を具備するアッセイキット。 An assay kit for performing the method according to any one of claims 1 to 5,
For immobilizing the probe having a sequence complementary to said nucleic acid, Rb 2 CO 3 concentration of 1M~5M, Cs 2 CO 3, the concentration of K 2 CO 3 and 2M~4M concentrations 1M~4M A coating solution consisting of a solution comprising a carbonate selected from the group of Na 2 CO 3
A reaction vessel;
A diluting solution for diluting the sample solution containing the nucleic acid;
A reaction solution for amplifying the nucleic acid;
An assay kit comprising:
前記Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの各遺伝子型について、１７６２番および１７６４番目の塩基を含む領域に相補的な配列からなるプローブが、１Ｍ〜５Ｍの濃度のＲｂ ２ ＣＯ ３ 、Ｃｓ ２ ＣＯ ３ 、１M〜４Mの濃度のＫ ２ ＣＯ ３ および２M〜４Mの濃度のＮａ ２ ＣＯ ３ の群から選択される炭酸塩を含む溶液からなる被覆用溶液を用いてそれぞれ固定化された反応容器と、
前記Ｂ型肝炎ウイルスゲノムを増幅させるためのプライマーを含む反応液と、
を含むアッセイキット。 An assay kit for performing the method of claim 5, comprising:
Wherein for each genotype of hepatitis B virus genome, a probe having a sequence complementary to a region including 1762 and No. 1764 th bases, Rb 2 CO 3 concentration of 1M~5M, Cs 2 CO 3, 1M~ a reaction vessel which is respectively fixed with a coating solution consisting of a solution containing a carbonate salt selected from the group of 4M concentration of K 2 CO 3 and 2M~4M concentrations of Na 2 CO 3,
A reaction solution containing a primer for amplifying the hepatitis B virus genome;
An assay kit comprising:
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