JP4210787B2 - Peptide for female hormone detection reagent - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、雌性ホルモンのエストロンまたはプロゲステロンに結合性を有する雌性ホルモン検出試薬用ペプチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ウシの妊娠診断の指標として使用されている性ホルモン、ウシエストロンおよびプロゲステロンの測定方法としては、ウシエストロンおよびプロゲステロン精製品をマウスやウサギなどに免疫することにより得た抗体を用いる高感度酵素免疫測定法（EIA）や放射免疫測定法（RIA）があり、通常では、乳汁、尿または血清に存在する微量なエストロンを測定している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、エストロンやプロゲステロンなどのホルモンは分子量３００前後と小さいため、それを抗原として実験動物に免疫しても安定した高力価の抗体を得ることは容易ではなく、さらに特異的な抗体を得ることは困難である。
【０００４】
また、従来、雌性ホルモンの検出試薬として用いられている抗体は、実験動物を用いてホルモンを抗原として作製されたものであるから、目的の抗体を得るまでに長い時間を要し、そのために効率よく量産することが困難である。さらに、このような抗体は、精製しても抗体生産単位の各ロット毎に試薬の品質が変わる可能性があり、品質の安定化が困難であるという問題点もある。
【０００５】
そこで、この発明の課題は上記した問題点を解決し、特定のアミノ酸配列で示される合成可能なショートペプチドで雌性ホルモン検出試薬を構成することにより、雌性ホルモン検出試薬の品質および製造効率の向上と安定化を図ることである。
【０００６】
因みに、動物間でのエストロンおよびプロゲステロンの化学構造の違いは報告されておらず、そのため、この発明のペプチドを利用した検査試薬は、ウシだけでなく、ヒトまたはその他の哺乳類にも応用できる可能性があると考えられる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、本願の請求項１に係る発明では、配列表の配列番号１〜３のいずれか１つのアミノ酸配列からなり、エストロンと結合性を有する雌性ホルモン検出試薬用ペプチドとしたのである。
【０００８】
また、同様に本願の請求項２に係る発明では、配列表の配列番号４〜６のいずれか１つのアミノ酸配列からなり、プロゲステロンと結合性を有する雌性ホルモン検出試薬用ペプチドとしたのである。
【０００９】
上記したように構成されるこの発明のエストロンまたはプロゲステロン結合性のペプチドは、それぞれ所定の雌性ホルモンと特異的に結合するため、従来の測定試薬に使用されていた抗体に代替可能な新規な雌性ホルモン検出試薬として使用できるものである。
【００１０】
そして、配列表の配列番号１〜６のいずれか１つのアミノ酸配列からなるエストロンおよびプロゲステロン結合性ペプチドは、いずれも周知の化学合成法等によって効率よく生産できる。
【００１１】
そのため、この発明のペプチドを用いて検査試薬を開発することにより、安定した試薬製品の生産が可能になる。また、この発明のペプチドをいくつか架橋して倍増させれば、検出感度の向上が期待できる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
この発明における配列番号１〜６で示される所定のアミノ酸配列からなるペプチドは、上述のように化学合成法などの周知のペプチド調整方法により自動ペプチド合成装置（バイオシステム社製など）を用いて製造できる。
【００１３】
因みに、固相合成法により任意のペプチドを合成するには、架橋ポリスチレンなどの不溶性支持体上に合成すべきペプチドのＣ末端のアミノ酸を固定し、それを起点としてマイクロコンピュータで制御された市販の合成装置でN−α―ｔ−ブトキシカルボニル化アミノ酸（Boc-アミノ酸）またはN−α―９フルオレニルメトキシカルボニル化アミノ酸（Fmoc-アミノ酸）に対して、適宜に保護基を除去して順に所要のペプチド鎖を伸張させることにより行える。
【００１４】
次に、Boc法またはFmoc法にて得られたエストロンおよびプロゲステロン結合性ペプチドは、水晶発振子マイクロバランスを用いた生体分子間相互作用定量装置を用いて、それぞれ雌性ホルモンとの親和性の確認を行うことができる。
【００１５】
代表的な生体分子間相互作用定量装置の測定原理は、圧電特性、化学的性質、熱的安定性に優れた水晶板の両面に電極を取り付け、これに電圧を与えることによって生じる逆電圧効果を利用している。すなわち、水晶板は、水晶発振子として水晶板のもつ固有振動数で共振させることができ、このとき水晶発振子である電極上に物質が付着すると、振動数が減少する現象を利用している。
【００１６】
水晶発振子の振動数変化と付着物質の質量との関係は、下記の数１の「Sauerbrey式」と呼ばれる式で表され、電極上での質量変化は、振動数変化と比例関係にあることが確認されている。
【００１７】
【数１】

【００１８】
また、基本振動数の変化と時間との関係を図１（ａ）に示し、τ＝結合定数の逆数と試料濃度の関係を図１（ｂ）に示す。
【００１９】
上記したような測定原理の生体分子間相互作用定量装置（生体分子間相互作用解析装置とも別称される。）は、株式会社イニシアム社から製品名：ＡＦＦＩＮＩＸ Ｑとして市販されている。
【００２０】
雌性ホルモンとの親和性が確認されたペプチドは、必要に応じて周知の標識物質（酵素や発色性物質など）と結合させることにより、前記雌性ホルモンを有しているウシその他の動物が雌性ホルモンを分泌している状態を確認でき、例えば動物の妊娠検査試薬などに用いられるものである。
【００２１】
【実施例および比較例】
〔実施例１〜６、比較例１、２〕
自動ペプチド合成機（日本パーセプティブ社製：パイオニア）を用い、ｔ−Ｂｏｃ法による固相合成法で配列番号１〜３に示したアミノ酸配列のエストロン結合性ペプチドおよび配列番号４〜６に示したアミノ酸配列のプロゲステロン結合性ペプチドを製造した。
【００２２】
これらのペプチドを水晶発振子マイクロバランスを用いた生体分子間相互作用定量装置（イニシアム社製：ＡＦＦＩＮＩＸ Ｑ）を用いて、それぞれホルモンとの親和性の確認した。
【００２３】
生体分子間相互作用定量装置（イニシアム社製：ＡＦＦＩＮＩＸ Ｑ）の測定に際し、金膜センサーチップ上にエストロン結合性ペプチドおよびプロゲステロン結合性ペプチドを固定し、それぞれの抗体を比較例１、２とした。それぞれ１μｇ／ｍｌを前記チップ上に添加した後、１時間静置し、精製水で金膜を洗浄した。次いでブロッキング液（大日本製薬社製：ブロックエース）を添加後、１時間静置し、蒸留水で洗浄後、生体分子間相互作用定量装置にセットした。
【００２４】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈したエストロン(Ｓｉｇｍａ社製：Ｅ９７５０)を１μｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、1ｐｇ／ｍｌを添加し、市販の抗体（比較例１、２）および実施例１〜６のペプチドとの分子間相互作用を検討し、図２にエストロンに対する抗体とペプチドの親和性とを比較するための検量線を示し、同様に図３にはプロゲステロンに対する抗体とペプチドの親和性とを比較するための検量線を示した。
【００２５】
また、以下の表１に実施例１〜３と比較例１のエストロン濃度に対する結合定数（τ値）と結合速度定数（Ｋａ値）を示した。
【００２６】
【表１】

【００２７】
以下の表２に実施例４〜６と比較例２のプロゲステロン濃度に対する結合定数（τ値）と結合速度定数（Ｋａ値）を示した。
【００２８】
【表２】

【００２９】
図２および表１の結果から、実施例１〜３のエストロン結合性ペプチド▲１▼〜▲３▼は、エストロンと確実に結合することが確認できた。
【００３０】
また、図３および表２の結果から、実施例４〜６のプロゲステロン結合性ペプチド▲４▼〜▲６▼は、プロゲステロンと確実に結合することが確認でき、さらに実施例４のプロゲステロン結合性ペプチドは、比較例２の抗体よりも強い親和性のあることが確認された。
【００３１】
実施例１〜３のエストロン結合性ペプチド▲１▼〜▲３▼のうち、最も親和性の高かったのはペプチド▲１▼であり、また実施例４〜６のプロゲステロン結合性ペプチド▲４▼〜▲６▼のうち、最も親和性の高かったペプチド▲４▼を用いて牛唾液中のエストロンの検出が可能であるかを検討した結果を表３に示した。なお、表中の妊娠初期は種付け後１ヶ月、妊娠後期は種付け後６ヶ月、非妊娠は種付け後１ヶ月の検出時期を示している。
【００３２】
【表３】

【００３３】
表３の結果からも明らかなように、発情期の指標であるエストロンに対する結合ペプチドと非妊娠期の牛唾液との結合が高くなっており、この結果から牛の発情状態を牛唾液により検出できることがわかる。
【００３４】
また、妊娠マーカーとなるプロゲステロンに対する結合性ペプチドは、妊娠初期から後期にかけて反応性の上昇が確認できた。
【００３５】
また、エストロンおよびプロゲステロン結合性ペプチドをともに金チップに固相化した場合には、相乗した反応が確認できたことから、複数物質（蛋白、ペプチド、化学物質など）を固相化した場合による検出目的物質との反応性確認も可能であることがわかる。
【００３６】
【発明の効果】
本願のエストロン結合性ペプチドに係る発明では、以上説明したように、配列表の配列番号１〜３のいずれか１つのアミノ酸配列からなり、エストロンと結合性を有する雌性ホルモン検出試薬用ペプチドとしたので、このような特定のアミノ酸配列で示される合成可能なショートペプチドは、従来のように動物から精製する抗体を使用した試薬に比べて、安定した物性を示し雌性ホルモン検出試薬の品質が高められたものであり、このものは周知の化学合成法等により比較的簡単に生産できるから、製造効率の向上も図れる利点がある。
【００３７】
また、同様にプロゲステロン結合性ペプチドに係る発明では、配列表の配列番号４〜６のいずれか１つのアミノ酸配列からなり、プロゲステロンと結合性を有する雌性ホルモン検出試薬用ペプチドとしたので、このような特定のアミノ酸配列で示される合成可能なショートペプチドは、安定した物性を示すので、雌性ホルモン検出試薬の品質が高くなり、このものは周知の化学合成法等によって比較的簡単に生産できるから、製造効率の向上も図れる利点がある。
【００３８】
また、エストロンおよびプロゲステロンの化学構造は動物間での違いは報告されていないため、この発明のペプチドを用いた検査試薬はウシだけでなく、ヒトあるいはその他の哺乳動物にも応用できるものであるといえる。
【００３９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）水晶発振子の基本振動数の変化と時間との関係を示す図表（ｂ）試料中の水晶発振子に物質が付着するときのτ＝結合定数の逆数と試料濃度の関係を示す図表
【図２】エストロンに対する抗体とペプチドの親和性とを比較するための検量線を示し、実施例と比較例の濃度と結合定数の逆数との関係を表す図表
【図３】プロゲステロンに対する抗体とペプチドの親和性とを比較するための検量線を示し、実施例と比較例の濃度と結合定数の逆数との関係を表す図表[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a peptide for detecting a female hormone having a binding property to the female hormone estrone or progesterone.
[0002]
[Prior art]
Highly sensitive enzyme immunoassay using antibodies obtained by immunizing mice and rabbits with bovine estrone and purified progesterone as a method for measuring sex hormones, bovine estrone and progesterone, which are used as indicators for bovine pregnancy diagnosis Method (EIA) and radioimmunoassay (RIA), which usually measure traces of estrone in milk, urine or serum.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
However, since hormones such as estrone and progesterone are as small as about 300 in molecular weight, it is not easy to obtain stable high-titer antibodies even when immunized with experimental animals as antigens, and to obtain more specific antibodies. It is difficult.
[0004]
In addition, since the antibody conventionally used as a reagent for detecting female hormones has been prepared using hormones as antigens in experimental animals, it takes a long time to obtain the desired antibody, and thus efficiency is increased. It is difficult to mass-produce well. Furthermore, even if such an antibody is purified, there is a possibility that the quality of the reagent may change for each lot of the antibody production unit, and it is difficult to stabilize the quality.
[0005]
Accordingly, the object of the present invention is to solve the above-mentioned problems and to improve the quality and production efficiency of the female hormone detection reagent by constituting the female hormone detection reagent with a synthesizable short peptide represented by a specific amino acid sequence. It is to stabilize.
[0006]
By the way, the difference in the chemical structure of estrone and progesterone between animals has not been reported, so the test reagent using the peptide of the present invention may be applicable not only to cattle but also to humans or other mammals. It is thought that there is.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problem, in the invention according to claim 1 of the present application, a peptide for a female hormone detection reagent comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 in the sequence listing and having binding properties with estrone, It was.
[0008]
Similarly, in the invention according to claim 2 of the present application, it is a peptide for a female hormone detection reagent comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4 to 6 in the sequence listing and having a binding property to progesterone.
[0009]
Since the estrone or progesterone-binding peptide of the present invention configured as described above specifically binds to a predetermined female hormone, it is a novel female hormone that can replace the antibody used in the conventional measuring reagent. It can be used as a detection reagent.
[0010]
And the estrone and progesterone binding peptide which consist of any one amino acid sequence of sequence number 1-6 of a sequence table can be efficiently produced by the well-known chemical synthesis method etc., respectively.
[0011]
Therefore, stable reagent products can be produced by developing a test reagent using the peptide of the present invention. In addition, if several peptides of the present invention are cross-linked and doubled, an improvement in detection sensitivity can be expected.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The peptide consisting of the predetermined amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 6 in the present invention is produced using an automatic peptide synthesizer (manufactured by Biosystems, etc.) by a known peptide preparation method such as a chemical synthesis method as described above. it can.
[0013]
Incidentally, in order to synthesize any peptide by the solid-phase synthesis method, a C-terminal amino acid of the peptide to be synthesized is immobilized on an insoluble support such as crosslinked polystyrene, and a commercially available computer controlled by a microcomputer is used as the starting point. Protective group is removed as needed for N-α-t-butoxycarbonylated amino acid (Boc-amino acid) or N-α-9 fluorenylmethoxycarbonylated amino acid (Fmoc-amino acid) in a synthesizer. This can be done by extending the peptide chain.
[0014]
Next, the estrone and progesterone-binding peptides obtained by the Boc method or the Fmoc method are used to confirm the affinity with female hormones using a biomolecular interaction quantification device using quartz crystal microbalance. It can be carried out.
[0015]
The measurement principle of a typical biomolecule interaction quantification device is to measure the reverse voltage effect caused by attaching electrodes to both sides of a quartz plate with excellent piezoelectric characteristics, chemical properties, and thermal stability, and applying voltage to it. We are using. In other words, the crystal plate can resonate at the natural frequency of the crystal plate as a crystal oscillator, and the phenomenon that the frequency decreases when a substance adheres to the electrode that is the crystal oscillator at this time is used. .
[0016]
The relationship between the change in the frequency of the crystal oscillator and the mass of the adhering substance is expressed by the expression called “Sauerbrey's equation” below, and the change in the mass on the electrode is proportional to the change in the frequency. Has been confirmed.
[0017]
[Expression 1]

[0018]
FIG. 1A shows the relationship between the change of the fundamental frequency and time, and FIG. 1B shows the relationship between the inverse of τ = coupling constant and the sample concentration.
[0019]
A biomolecule interaction quantification apparatus (also referred to as a biomolecule interaction analysis apparatus) based on the measurement principle as described above is commercially available from Inicium Co., Ltd. under the product name: AFFINIX Q.
[0020]
Peptides that have been confirmed to have affinity for female hormones are bound to known labeling substances (enzymes, chromogenic substances, etc.) as necessary, so that bovine and other animals having the female hormones can be treated with female hormones. Can be confirmed, and is used, for example, as an animal pregnancy test reagent.
[0021]
Examples and Comparative Examples
[Examples 1 to 6, Comparative Examples 1 and 2]
Using an automatic peptide synthesizer (Nippon Perceptive: Pioneer), the estrone-binding peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 and the amino acids shown in SEQ ID NOs: 4 to 6 by the solid-phase synthesis method by the t-Boc method A progesterone-binding peptide of sequence was produced.
[0022]
The affinity of each of these peptides with a hormone was confirmed using a biomolecule interaction quantification apparatus (Initium Co., Ltd .: AFFINIX Q) using a quartz crystal microbalance.
[0023]
In the measurement of a biomolecule interaction quantification apparatus (Initiam Co., Ltd .: AFFINIX Q), an estrone-binding peptide and a progesterone-binding peptide were immobilized on a gold film sensor chip, and the respective antibodies were used as Comparative Examples 1 and 2. Each 1 μg / ml was added onto the chip, and then allowed to stand for 1 hour, and the gold film was washed with purified water. Next, after adding a blocking solution (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd .: Block Ace), the mixture was allowed to stand for 1 hour, washed with distilled water, and set in a biomolecule interaction quantification apparatus.
[0024]
1 μg / ml, 1 ng / ml, 1 pg / ml of estrone (Sigma: E9750) diluted with dimethyl sulfoxide (DMSO) was added, and commercially available antibodies (Comparative Examples 1 and 2) and peptides of Examples 1-6 Fig. 2 shows a calibration curve for comparing the affinity of the antibody and the peptide for estrone, and Fig. 3 similarly compares the affinity of the antibody and the peptide for progesterone. The calibration curve for this is shown.
[0025]
Table 1 below shows binding constants (τ values) and binding rate constants (Ka values) with respect to the estrone concentrations of Examples 1 to 3 and Comparative Example 1.
[0026]
[Table 1]

[0027]
Table 2 below shows binding constants (τ values) and binding rate constants (Ka values) with respect to progesterone concentrations in Examples 4 to 6 and Comparative Example 2.
[0028]
[Table 2]

[0029]
From the results shown in FIG. 2 and Table 1, it was confirmed that the estrone-binding peptides (1) to (3) of Examples 1 to 3 surely bind to estrone.
[0030]
Further, from the results shown in FIG. 3 and Table 2, it can be confirmed that the progesterone-binding peptides (4) to (6) of Examples 4 to 6 are surely bound to progesterone, and further the progesterone-binding peptide of Example 4 Was confirmed to have stronger affinity than the antibody of Comparative Example 2.
[0031]
Among the estrone-binding peptides (1) to (3) of Examples 1 to 3, the peptide (1) had the highest affinity, and the progesterone-binding peptides (4) to (4) to Table 3 shows the results of examining whether it is possible to detect estrone in bovine saliva using peptide (4) having the highest affinity among (6). In the table, the initial pregnancy period is 1 month after seeding, the late pregnancy period is 6 months after seeding, and the non-pregnancy period is 1 month after seeding.
[0032]
[Table 3]

[0033]
As is clear from the results in Table 3, the binding of estrone, which is an indicator of the estrous period, to the non-pregnant bovine saliva is high, and from this result, the estrous state of the cow can be detected by bovine saliva. I understand.
[0034]
In addition, an increase in the reactivity of the binding peptide to progesterone, which is a pregnancy marker, was confirmed from the early stage to the late stage of pregnancy.
[0035]
In addition, when both estrone and progesterone-binding peptide were immobilized on a gold chip, a synergistic reaction was confirmed, so detection by immobilizing multiple substances (protein, peptide, chemical substance, etc.) It can be seen that the reactivity with the target substance can be confirmed.
[0036]
【The invention's effect】
In the invention relating to the estrone-binding peptide of the present application, as described above, the peptide for a female hormone detection reagent comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 in the sequence listing and having binding properties to estrone is used. The synthesizable short peptide represented by such a specific amino acid sequence showed stable physical properties and improved the quality of the female hormone detection reagent as compared with the conventional reagent using an antibody purified from an animal. Since this can be produced relatively easily by a known chemical synthesis method or the like, there is an advantage that the production efficiency can be improved.
[0037]
Similarly, in the invention relating to the progesterone-binding peptide, the peptide for a female hormone detection reagent comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4 to 6 in the sequence listing and having a binding property to progesterone is used. Since a short peptide that can be synthesized represented by a specific amino acid sequence exhibits stable physical properties, the quality of the female hormone detection reagent is high, and it can be produced relatively easily by well-known chemical synthesis methods. There is an advantage that efficiency can be improved.
[0038]
In addition, since the chemical structure of estrone and progesterone has not been reported between animals, the test reagent using the peptide of the present invention can be applied not only to cattle but also to humans or other mammals. I can say that.
[0039]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1A is a chart showing the relationship between a change in the fundamental frequency of a crystal oscillator and time. FIG. 1B is a diagram showing the relationship between τ = reciprocal of coupling constant and sample concentration when a substance adheres to a crystal oscillator in a sample. Diagram showing the relationship Fig. 2 shows a calibration curve for comparing the affinity of antibody and peptide for estrone, and shows the relationship between the concentration of Examples and Comparative Examples and the reciprocal of the binding constant. Fig. 3 Progesterone Is a graph showing a calibration curve for comparing the affinity of an antibody and a peptide against the relationship between the concentration of Examples and Comparative Examples and the reciprocal of the binding constant

Claims (2)

配列表の配列番号１〜３のいずれか１つのアミノ酸配列からなり、エストロンと結合性を有する雌性ホルモン検出試薬用ペプチド。A peptide for a female hormone detection reagent comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 in the sequence listing and having binding properties to estrone. 配列表の配列番号４〜６のいずれか１つのアミノ酸配列からなり、プロゲステロンと結合性を有する雌性ホルモン検出試薬用ペプチド。A peptide for a female hormone detection reagent comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4 to 6 in the sequence listing and having a binding property to progesterone.

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