JP4200196B2 - Dioxin decomposition method and dioxin treatment agent by complex microorganism system - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複合微生物系によるダイオキシンの分解方法およびダイオキシン処理剤に関する。
さらに詳しく言えば、テラバクター（Terrabacter）属に属するダイオキシン分解性微生物と、前記ダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する微生物とを併用するダイオキシンの分解方法、ダイオキシン処理剤およびダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する微生物に関する。
【０００２】
【従来技術とその課題】
酸素で架橋された２個のベンゼン核の１乃至８個の水素が塩素により置換されたクロロジベンゾジオキシンには７５個の異性体が存在する。これらは毒性が高く、人体に対しては、例えば皮膚の色素沈着、脱毛、多毛、肝機能異常などを引き起こすことが知られ、環境汚染との関わりでダイオキシンと呼ばれている。中でも２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシンは最も毒性が高く、この化合物自体をダイオキシンと呼ぶ場合もあるが、本発明は前記クロロジベンゾジオキシン類を分解の対象とする。
【０００３】
ダイオキシン類は、近年、ごみ焼却施設の焼却灰や集塵灰からも検出されており、焼却によりダイオキシン類を生ずる可能性のある物質の使用を規制する等の対策が採られつつあるが、一旦生成したダイオキシン類についてはこれをいち早く分解して無毒化する必要がある。
【０００４】
ダイオキシンを分解する方法としては、従来、シュードモナス（Pseudomonas）等の細菌を用いた方法（例えば、中宮邦近ら、第１０回廃棄物学会研究発表会講演論文集、p.880,1999）や白色腐朽菌を用いた方法（例えば、近藤隆一郎ら、第１０回廃棄物学会研究発表会講演論文集、p.877,1999）等の微生物学的な方法が報告されているが、ダイオキシン分解活性は十分満足できるものではない。
本発明の課題は、ダイオキシンを効率よく分解出来る微生物系を見出し、微生物を利用したダイオキシンの分解方法及び分解処理剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ダイオキシン分解活性を有する微生物に着目し、これら微生物を用いたダイオキシンの分解能を向上させるべく鋭意検討を行なった結果、日本各地から採取した土壌や水サンプルの中からダイオキシン類を良好に分解する微生物系を見出した。本発明者らは、その微生物系を詳細に調べた結果、その微生物系の中でダイオキシン分解活性を有するものはテラバクター（Terrabacter）属に属する微生物であり、それ以外の微生物はダイオキシン分解活性を有さないが前記テラバクター属に属する微生物と併用したとき、テラバクター属に属する微生物単独による場合に比べてダイオキシン分解活性が向上することを見出した。テラバクター属に属する特定の微生物がダイオキシン分解活性を有することは従来知られているが（J. Ferment. Bioeng., 84, 387-399 (1997), J. Bacteriol., 172, 53-62 (1997)）、他の微生物を共存させたときにダイオキシン分解活性が向上することは本発明者らが今回初めて見出したことである。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の複合微生物系によるダイオキシン分解方法、ダイオキシン処理剤、ダイオキシン分解活性を有する新規な微生物およびダイオキシンの分解活性を増強する新規な微生物を提供するものである。
【０００７】
１．テラバクター（Terrabacter）属に属するダイオキシン分解性微生物と、前記ダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する微生物とを用いてダイオキシンを処理することを特徴とするダイオキシン分解方法。
２．ダイオキシン分解性微生物が、テラバクター・エスピー（Terrabacter sp.）ＨＮ−１株（FERM P-18227）である前記１に記載のダイオキシン分解方法。
３．ダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する微生物が、アルカリゲネス（Alcaligenes）属またはステノトロホモナス（Stenotrophomonas）属に属する菌である前記１または２に記載のダイオキシン分解方法。
４．ダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する微生物として、アルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する菌およびステノトロホモナス（Stenotrophomonas）属に属する菌を併用する前記１または２に記載のダイオキシン分解方法。
５．前記アルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する菌が、アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＨＮ−２株（FERM P-18228）である前記３または４に記載のダイオキシン分解方法。
６．前記ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）属に属する菌が、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）ＨＮ−３株（FERM P-18229）である前記３または４に記載のダイオキシン分解方法。
７．テラバクター（Terrabacter）属に属するダイオキシン分解性微生物と、前記ダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する微生物とを含むことを特徴とするダイオキシン処理剤。
８．ダイオキシン分解性微生物が、テラバクター・エスピー（Terrabacter sp.）ＨＮ−１株（FERM P-18227）である前記７に記載のダイオキシン処理剤。
９．ダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する微生物が、アルカリゲネス（Alcaligenes）属またはステノトロホモナス（Stenotrophomonas）属に属する菌である前記７または８に記載のダイオキシン処理剤。
１０．ダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する微生物として、アルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する菌およびステノトロホモナス（Stenotrophomonas）属に属する菌を併用する前記７または８に記載のダイオキシン処理剤。
１１．前記アルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する菌が、アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＨＮ−２株（FERM P-18228）である前記９または１０に記載のダイオキシン分解方法。
１２．前記ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）属に属する菌が、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）ＨＮ−３株（FERM P-18229）である前記９または１０に記載のダイオキシン分解方法。
１３．ダイオキシン分解活性を有するテラバクター・エスピー（Terrabacter sp.）ＨＮ−１株（FERM P-18227）。
１４．アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＨＮ−２株（FERM P-18228）およびステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）ＨＮ−３株（FERM P-18229）からなる群より選ばれるダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する微生物。
【０００８】
以下、本発明について詳述する。
（１）ダイオキシン分解性微生物
本発明のダイオキシン分解方法で使用するダイオキシン分解性微生物は、テラバクター（Terrabacter）属に属するダイオキシン分解活性を有する微生物である。好ましくは本発明者らが土壌より分離した微生物の一種であり、平成１３年２月２３日付で経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所にテラバクター・エスピー（Terrabacter sp.）ＨＮ−１株（FERM P-18227）として寄託されている。
【０００９】
以下に、その菌学的性状を示す。
（ｉ）コロニーの形態（３１℃、１日培養）
・培地名 ：ＳＣＤ（Soybean Casein Digest）寒天培地
・コロニーの大きさ ：０.５ｍｍ未満
・コロニーの形 ：点状
・コロニーの*** ：扁平状
・コロニー周辺の形状：全円
・コロニー表面の形状：平滑
・コロニーの質 ：バター質
・コロニーの透明度 ：不透明
・コロニーの光沢 ：湿光
・コロニーの色調 ：ベージュ
【００１０】
（ii）微生物の形状
・微生物の形態 ：短桿性
・微生物の運動性 ：なし
・微生物の大きさ（幅）：０.６〜０.８μｍ
【００１１】
（iii）生理的性状（＋：陽性、−：陰性、±：擬陽性）
・グラム染色 （−）
・β−ガラクトシダーゼ （−）
・アルギニンジヒドロラーゼ （−）
・リジンデカルボキシラーゼ （−）
・オルニチンデカルボキシラーゼ （−）
・クエン酸の利用性 （−）
・硫化水素産生 （−）
・ウレアーゼ （−）
・マッコンキー培地生育 （＋）
・トリプトファンデアミナーゼ （−）
・インドール産生 （−）
・アセトイン産生 （−）
・ゼラチン液化 （−）
・グルコース （−）
・マンニトール （−）
・イノシトール （−）
・ソルビトール （−）
・ラムノース （−）
・白糖 （−）
・メリビオース （−）
・アミグダリン （−）
・アラビノース （−）
・硝酸塩還元 （−）
・窒素ガス産生 （−）
・オキシダーゼ （−）
【００１２】
以上の菌学的性状から、本微生物はアシネトバクター（Acinetobacter）属に属するものと当初考えられたが、後述する実施例２のｒＤＮＡ遺伝子分析の結果からテラバクター属に属するものと同定した。
【００１３】
（２）ダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する微生物
本発明において、上記テラバクター属に属する微生物と併用するダイオキシン分解活性を増強する微生物としては、例えばアルカリゲネス（Alcaligenes）属またはステノトロホモナス（Stenotrophomonas）属に属する菌がある。特にこの二種の菌を共存させたときにダイオキシン分解活性が増強される。
【００１４】
アルカリゲネス属に属する菌としては、例えば本発明者らが土壌より分離した微生物で、平成１３年２月２３日付で経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所にアルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＨＮ−２株（FERM P-18228）として寄託した菌株が挙げられる。
ステノトロホモナス属に属する菌としては、例えば本発明者らが土壌より分離した微生物の一種であり、平成１３年２月２３日付で同研究所にステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）ＨＮ−３株（FERM P-18229）として寄託した菌株が挙げられる。
上記の２種の菌株の菌学的性状を示す。
【００１５】
アルカリゲネス・エスピーＨＮ−２株（ FERM P-18228 ）の菌学的性状
（ｉ）コロニーの形態（３１℃、１日培養）
・培地名 ：ＳＣＤ（Soybean Casein Digest）寒天培地
・コロニーの大きさ ：０.５ｍｍ未満
・コロニーの形 ：点状
・コロニーの*** ：扁平状
・コロニー周辺の形状：全円
・コロニー表面の形状：平滑
・コロニーの質 ：バター質
・コロニーの透明度 ：不透明
・コロニーの光沢 ：湿光
・コロニーの色調 ：黄褐色
【００１６】
（ii）微生物の形状
・微生物の形態 ：長桿性
・微生物の運動性 ：あり
・微生物の大きさ（幅）：０.４μｍ
【００１７】
（iii）生理的性状（＋：陽性、−：陰性、±：擬陽性）
・グラム染色 （−）
・芽胞形成 （−）
・オキシダーゼ （＋）
・硝酸塩還元 （−）
・インドール産生 （−）
・グルコース酸化（嫌気） （−）
・アルギニンジヒドロラーゼ （−）
・ウレアーゼ （−）
・エスクリン加水分解 （−）
・ゼラチン液化 （−）
・β−ガラクトシダーゼ （−）
・グルコース（同化） （−）
・アラビノース（同化） （−）
・マンノース（同化） （−）
・マンニトール（同化） （−）
・Ｎ−アセチルグルコサミン（同化） （−）
・マルトース（同化） （−）
・グルコン酸カリウム（同化） （−）
・ｎ−カプリン酸（同化） （＋）
・アジピン酸（同化） （±）
・ｄｌ−リンゴ酸（同化） （＋）
・クエン酸ナトリウム（同化） （＋）
・酢酸フェニル（同化） （＋）
【００１８】
ステノトロホモナス・マルトフィリアＨＮ−３株（ FERM P-18229 ）の菌学的性状
（ｉ）コロニーの形態（３１℃、１日培養）
・培地名 ：ＳＣＤ（Soybean Casein Digest）寒天培地
・コロニーの大きさ ：０.５ｍｍ
・コロニーの形 ：点状
・コロニーの*** ：扁平状
・コロニー周辺の形状：全円
・コロニー表面の形状：平滑
・コロニーの質 ：バター質
・コロニーの透明度 ：不透明
・コロニーの光沢 ：湿光
・コロニーの色調 ：黄色
【００１９】
（ii）微生物の形状
・微生物の形態 ：長桿性
・微生物の運動性 ：あり
・微生物の大きさ（幅）：０.４μｍ
【００２０】
（iii）生理的性状（＋：陽性、−：陰性、±：擬陽性）
・グラム染色 （−）
・芽胞形成 （−）
・オキシダーゼ （±）
・硝酸塩還元 （−）
・インドール産生 （−）
・グルコース酸化（嫌気） （−）
・アルギニンジヒドロラーゼ （−）
・ウレアーゼ （−）
・エスクリン加水分解 （＋）
・ゼラチン液化 （＋）
・β−ガラクトシダーゼ （＋）
・グルコース（同化） （＋）
・アラビノース（同化） （−）
・マンノース（同化） （＋）
・マンニトール（同化） （−）
・Ｎ−アセチルグルコサミン（同化） （＋）
・マルトース（同化） （＋）
・グルコン酸カリウム（同化） （−）
・ｎ−カプリン酸（同化） （−）
・アジピン酸（同化） （−）
・ｄｌ−リンゴ酸（同化） （＋）
・クエン酸ナトリウム（同化） （＋）
・酢酸フェニル（同化） （−）
【００２１】
（３）培養条件
本発明においては、テラバクター属に属するダイオキシン分解性微生物とダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する微生物は、好気的または嫌気的条件、好ましくは好気的条件下で培養し増殖することができる。
好気培養は、通常の中温菌の培養に準じ、静置培養でも振盪培養でも良い。培養液のｐＨは２〜８、好ましくは５〜８である。
【００２２】
培養温度は１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃である。培養を継続する時間は、目的とするダイオキシン含有物質中のダイオキシンを分解するに十分な時間であり、通常は１〜２０日間、好ましくは２週間程度である。
嫌気培養は、上記の好気培養に準じ、静置培養にて行なう。
培地は、通常の微生物に用いるものであれば特に制限されない。例えば、ブイヨン培地、Ｌ培地等を用いることができる。
【００２３】
培地には、必要に応じて各種の炭素源あるいは窒素源を添加することができる。炭素源としては、ブドウ糖、ショ糖、マルトース、サッカロース、上白糖、黒糖、糖蜜、廃糖蜜、マルツエキス等が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、グルテンミール、大豆粉、乾燥酵母、酵母エキス、硫酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム塩、尿素等が挙げられる。その他、必要に応じて、ナトリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、カルシウム塩、リン酸塩、亜鉛塩等の無機塩類や、イノシトール、ビタミンＢ₁塩酸塩、Ｌ−アスパラギン、ビオチン等のビタミン類を添加してもよい。
【００２４】
（４）ダイオキシン分解方法
本発明のダイオキシン分解方法は、上記ダイオキシン分解性微生物とダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する菌とを複合した培養物またはその処理物でダイオキシンを処理することにより行なわれる。例えば、上記の培養液にダイオキシン含有物質を添加するか、逆にダイオキシン含有物質に上記の培養液またはその抽出成分を添加して処理する。
【００２５】
反応は、バッチ法、連続法、半連続法等のいずれでも行なうことができる。また、ダイオキシン分解活性を有する菌とダイオキシン分解活性を増強する菌とを含有するものであれば、他のダイオキシン分解菌と共に用いてもよい。
培養液にダイオキシン含有物質を添加して処理する場合の培養は上記の培養条件に準じて行なうことが出来る。
【００２６】
（５）ダイオキシン処理剤
本発明によるダイオキシン処理剤は、前記ダイオキシン分解性微生物とダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する菌を含むものであり、液状であると固体状であるとを問わない。すなわち、上記のダイオキシン分解活性菌と分解活性増強菌とを含有する培養液自体をダイオキシン処理剤として用いることができる。また、培養液を乾燥し製造助剤を加えて固形剤としたものを、処理するダイオキシン含有物質自体に、または処理媒体中に添加して使用することもできる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１：微生物の単離
表１に示す最少培地２.５ｍｌをネジ付き試験管（２０ｍｍ×１２５ｍｍ）に分注し、ダイオキシン類のモデル化合物としてのジベンゾフラン（ＤＢＦ）２.５ｍｇ（１０００ｍｇ／ｌ）を加え、炭素源の分散剤としてジメチルホルムアミド５μｌ（０.２％（ｖ／ｖ））を添加した。ここに日本各地から採集した土壌や水のサンプルを少量接種し、３０℃、１４０ｒｐｍにて振盪培養を行なった。数回の継代培養後も良好な生育を示す培養系が得られたため、培養液の一部を最少培地寒天プレートに塗布し、ＤＢＦのエーテル溶液を噴霧して３０℃にて静置培養を行なったところ、ＤＢＦ層が溶解したコロニーが形成された（図１および図２参照）。
この培養液を希釈してNutrient broth寒天プレート上に塗布して３０℃で静置培養することによりＤＢＦ分解菌の単離を行なった。その結果、この培養系は３種類の菌より構成されていることが明らかになった。
この３種の菌を単離し（ＨＮ−１株、ＨＮ−２株、ＨＮ−３株）、菌学的性状を調べた結果は前述の通りであった。
【００２９】
【表１】

【００３０】
実施例２：微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のシーケンス決定
上記３種の菌について近隣結合法による系統解析を行なうため、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のシーケンスを決定し、シーケンス解析により微生物の属種の同定を行なった。
【００３１】
（１）ＤＮＡ抽出
菌体からのＤＮＡ抽出は以下のように行なった。Ｃ培地で３０℃、２００ｒｐｍで２日間培養した菌体を5000ｒｐｍ、３分の遠心により集菌して菌体を得た。菌体は３６０μｌのＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ8.0）、１ｍＭＥＤＴＡ）に再懸濁し、４０μｌの１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム（最終濃度１ｍｇ／ｍ１）を加えて、５０℃で３０分インキュベートした。さらにｌ００μｌの１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（最終濃度０.１ｍｇ／ｍｌ）と５００μｌのＢＬ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐΗ8.0；４０ｍＭ）、Tween 20（１％）、Nonidet P-40（０.２％）、ＥＤＴＡ（０.２ｍＭ））を加えてさらに３０分インキュベートした。その後、凍結・融解を２回行ない、９０℃、１０分のインキュベーションでプロテイナーゼＫを失活させた後、その１μｌを以下に示すＰＣＲ反応に用いた。
【００３２】
（２）ＰＣＲ増幅
ＰＣＲ反応はタカラ・ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰ（Takara PCR Thermal Cycler MP ；宝酒造製）を用いて行なった。ＰＣＲに用いたプライマー・セットは真正細菌の小サブユニット・リボソーマルＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）遣伝子のほぼ全長（11〜1511塩基部位）を特異的に増幅できるように設計し、Ｅｕｂ１１ｆ３ｍｘ（５'−ｔｇｒｇｔｔｔｇａｔｃｍｔｇｇｃｔｙａｇ（配列番号１））ならびにＥｕｂ１５１１ｒ１ｍｘ（５'−ｔｇｇｈｔａｃｃｔｔｇｔｔａｃｇａｃｔｔ（配列番号２））を用いた。ＰＣＲのサイクル・プログラムは９５℃、３分のプレヒーティングの後に、３５サイクルのＰＣＲを行なった。１サイクルの構成は、変性ステップを９５℃、３０秒、アニーリング・ステップを５０℃、３０秒、伸長ステップを７２℃、１.５分として行なった。
得られたＰＣＲの増幅産物を１％のアガロースゲル電気泳動により生成量及び長さを確認した後、スピン・カラム（QIA quick PCR Purification Kit，QIAGEN製）によって精製してシーケンス用の鋳型ＤＮＡとした。
【００３３】
（３）シーケンス決定
シーケンスの決定はクローニングを介さずにＰＣＲ増幅産物のダイレクト・シーケンスによって行なった。シーケンスの決定は増幅された１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のほぼ全長にあたる約１.４ｋｂについて行なった。シーケンス・プライマーとしてはＥｕｂ１１ｆ３ｍｘ（配列番号１）、Ｅｕｂ５１４ｆ１ｍｘ（５'−ｇｔｇｃｃａｇｃｍｇｃｃｇｃｇｇｔａａ（配列番号３））、Ｅｕｂ９０６ｆ１ｍｘ（５'−ａａａｃｔｃａａａｇｇａａｔｔｇｒｃｇｇ（配列番号４））、Ｅｕｂ５３２ｒ（５'−ｔｔａｃｃｇｃｇｇｃｋｇｃｔｇｇｃａｃ（配列番号５））、Ｅｕｂ９２０ｒ１ｍｘ（５'−ｃｃｇｙｃａａｔｔｃｃｔｔｔｇａｇｔｔｔ（配列番号６））およびＥｕｂ１４０５ｒ（５'−ｇａｃｇｇｇｃｇｇｔｇｔｇｔｒｃａ（配列番号７））を用い、シーケンスの決定はＡＢＩ３７７蛍光自動シーケンサー（パーキン・エルマー製）を用い、シーケンス反応は専用キットであるビッグ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンス・キット（BigDye terminator Cycle sequence kit；パーキン・エルマー製）を用いて行なった。その結果、ＨＮ−１株、ＨＮ−２株およびＨＮ−３株についてそれぞれ配列番号８、９および１０に示す配列を得た。
【００３４】
（４）系統解析
前記で得たシーケンス・データをデータ・ベース（GenBank, EMBL, DDBJ, RDP）から集めた既に報告されている１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列とともにプログラム・パッケージＣｌｕｓｔａｒ−Ｘを用いてアライメントした。近隣結合法による系統解折は系統解析プログラムＰＨＹＬＩＰを用いて行なった。
【００３５】
ＨＮ−１株のシーケンス・データ（配列番号８）は、統計的処理で遺伝子レベルについて比較したところ、テラバクター・エスピー（Terrabacter sp.）の遺伝子データと９９.７０％一致した。他のテラバクターグループの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列と近隣結合法による遺伝子レベルで比較した系統樹を図３に示す。
【００３６】
以上の結果から、ＨＮ−１株を、テラバクター・エスピー（Terrabacter sp.）であると同定し、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所にテラバクター・エスピー（Terrabacter sp.）ＨＮ−１株（FERM P-18227）として寄託した。
【００３７】
また、ＨＮ−２株およびＨＮ−３株についても同様に分析し、それぞれアルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）およびステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）であると同定し、それぞれアルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＨＮ−２株（FERM P-18228）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）ＨＮ−３株（FERM P-18229）として経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に寄託した。
【００３８】
実施例３：
単離した各微生物を液体最少培地に接種したところ、テラバクター・エスピー（Terrabacter sp.）ＨＮ−１株（FERM P-18227）のみがＤＢＦを資化可能であり、他の２株はＤＢＦを資化しなかった。
そこで、最少培地寒天プレート上でテラバクター・エスピーＨＮ−１株（FERM P-18227）を単独培養したところ、１０日目にＤＢＦ層が溶解したコロニーを形成した。一方、他の２株を共存させて培養を行なうと５日目にコロニーが形成された。
このことから、テラバクター・エスピーＨＮ−１株単独で処理するよりも、３種類の菌株を混合した複合微生物系により処理することで増殖速度が向上することが分かる。
【００３９】
実施例４：休止菌体によるＤＢＦの分解試験
３種の菌株の複合微生物系の休止菌体を調製しＤＢＦ分解試験を行なった。
液体最少培地にて複合微生物系を培養し、遠心分離にて集菌後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）にて２回洗浄を行なった。この菌体をリン酸緩衝液にＯ.Ｄ.６６０＝２.０となるように懸濁したものを反応に用いた。共栓付き試験管（１８ｍｍ×１８０ｍｍ）に休止菌体懸濁液２ｍｌを分注し、１０ｍＭ ＤＢＦのジメチルホルムアミド溶液２０μｌを添加（ＤＢＦ終濃度１００μＭに相当）して３０℃、１４０ｒｐｍにて振とう反応を行なった。反応後、１２Ｎ塩酸４０μｌと内部標準として５ｍＭアントラセンジメチルホルムアミド溶液１０μｌを添加した（アントラセン終濃度２５μＭに相当）。ここに酢酸エチル２ｍｌにて抽出を行ないＧＣ−ＭＳによる分析を行なった。
また、対照として休止菌体をオートクレーブ滅菌したものについて同様に処理し、ＧＣ−ＭＳによる分析を行なった。
【００４０】
ＧＣ−ＭＳによる測定条件は以下の通りである。
ＧＣ−ＭＳ装置：Turbo Mass GC Mass Spectrometer （Perkin Elmer社製）、
イオン源（Ion source）：７０ｅＶ、
カラム：NEUTRA BOND-1 column（GL Science社製）；内径０.２５ｍｍ、長さ３０ｍ、
オーブンプログラム：初期温度１００℃で２分間維持→１０℃／分で昇温し２００℃となったところで２分間維持→１０℃／分で昇温し３００℃となったところで６分間維持。
【００４１】
結果を図４に示す。反応開始直後ではＤＢＦのピークが検出されたが（図４Ａ）、１時間後の反応液中にはＤＢＦの存在は全く確認されなかった（図４Ｂ）。オートクレーブ処理した休止菌体を用いた場合には２４時間の反応後もＤＢＦの減少が確認されなかった（図４Ｃ）。したがって、複合微生物系の休止菌体では１００μＭのＤＢＦを１時間で分解可能であることが分った。
【００４２】
【発明の効果】
本発明によれば、テラバクター（Terrabacter）属に属するダイオキシン分解性微生物と、前記ダイオキシン分解活性を増強する微生物とを共存させた複合微生物系を用いることにより、ダイオキシンを効果的に分解することができる。
【００４３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の複合微生物系により形成されたコロニーの写真。
【図２】 図１における菌体濃度を１０^-4倍に希釈した場合のコロニーの写真。
【図３】 近隣結合法によるテラバクター・エスピー（Terrabacter sp.）ＨＮ−１株（FERM P-18227）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析の系統樹である。図中の目盛りの「0.01」は遺伝的近隣度を表わしている。
【図４】 休止菌体を用いたジベンゾフランの分解を示すＧＣ−ＭＳクロマトグラムであり、（Ａ）は反応開始直後、（Ｂ）は反応開始１時間経過後のものであり、（Ｃ）はオートクレーブ処理した休止菌体を用いた場合の２４時間経過後のものである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for decomposing dioxins by a complex microorganism system and a dioxin treatment agent.
More specifically, a dioxin decomposing method using a dioxin degrading microorganism belonging to the genus Terrabacter and a microorganism enhancing the decomposing activity of the dioxin decomposing microorganism, a dioxin treating agent, and a dioxin degrading microorganism decomposing activity. It relates to microorganisms that enhance
[0002]
[Prior art and its problems]
There are 75 isomers in chlorodibenzodioxin in which 1 to 8 hydrogens of two benzene nuclei bridged with oxygen are replaced by chlorine. These are highly toxic and are known to cause pigmentation of the skin, hair loss, hirsutism, abnormal liver function, etc. to the human body, and are called dioxins in connection with environmental pollution. Among these, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin has the highest toxicity, and this compound itself may be called dioxin, but the present invention targets the chlorodibenzodioxins for decomposition.
[0003]
In recent years, dioxins have also been detected from incineration ash and dust collection ash at waste incineration facilities, and measures such as restricting the use of substances that can generate dioxins by incineration are being taken. The generated dioxins need to be quickly decomposed and detoxified.
[0004]
As a method for degrading dioxin, a conventional method using bacteria such as Pseudomonas (for example, Kunika Nakamiya et al., Proceedings of the 10th Annual Conference of the Waste Society, p.880, 1999) or white Microbiological methods such as methods using decaying fungi (for example, Ryuichiro Kondo et al., Proceedings of the 10th Annual Meeting of the Waste Society, p.877, 1999) have been reported. It is not satisfactory enough.
An object of the present invention is to find a microorganism system capable of efficiently decomposing dioxins, and to provide a method for decomposing dioxins and a decomposition treatment agent using the microorganisms.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors paid attention to microorganisms having dioxin-degrading activity, and as a result of intensive studies to improve the resolution of dioxins using these microorganisms, dioxins were collected from soil and water samples collected from various parts of Japan. We have found a microbial system that degrades well. As a result of detailed examination of the microbial system, the present inventors have found that those having a dioxin decomposing activity are microorganisms belonging to the genus Terrabacter , and other microorganisms have a dioxin degrading activity. However, it has been found that when combined with the microorganism belonging to the genus Terrabacter, the dioxin degrading activity is improved as compared with the case of using the microorganism belonging to the genus Terrabacter alone. Although it has been conventionally known that specific microorganisms belonging to the genus Terrabacter have dioxin degrading activity (J. Ferment. Bioeng., 84 , 387-399 (1997), J. Bacteriol., 172 , 53-62 (1997). This is the first time that the present inventors have found that dioxin degrading activity is improved when other microorganisms are allowed to coexist.
[0006]
That is, the present invention provides a dioxin decomposing method using the following complex microbial system, a dioxin treating agent, a novel microorganism having a dioxin decomposing activity, and a novel microorganism that enhances the dioxin decomposing activity.
[0007]
1. A dioxin decomposing method comprising treating dioxin using a dioxin degrading microorganism belonging to the genus Terrabacter and a microorganism enhancing the degrading activity of the dioxin degrading microorganism.
2. 2. The dioxin decomposing method according to 1 above, wherein the dioxin degrading microorganism is Terrabacter sp. HN-1 strain (FERM P-18227).
3. 3. The dioxin decomposing method according to 1 or 2, wherein the microorganism that enhances the decomposing activity of the dioxin degrading microorganism is a bacterium belonging to the genus Alcaligenes or Stenotrophomonas.
4). 3. The dioxin decomposing method according to 1 or 2 above, wherein a microorganism belonging to the genus Alcaligenes and a bacterium belonging to the genus Stenotrophomonas are used in combination as microorganisms that enhance the degrading activity of the dioxin-degrading microorganism.
5. 5. The method for decomposing dioxins according to 3 or 4 above, wherein the bacterium belonging to the genus Alcaligenes is Alcaligenes sp. HN-2 strain (FERM P-18228).
6). The Stenotrophomonas (Stenotrophomonas) bacteria belonging to the genus, Stenotrophomonas maltophilia (Stenotrophomonas maltophilia) HN-3 strain (FERM P-18229) dioxin decomposition method according to the 3 or 4 is.
7). A dioxin treating agent comprising a dioxin-degrading microorganism belonging to the genus Terrabacter and a microorganism that enhances the degradation activity of the dioxin-degrading microorganism.
8). 8. The dioxin treating agent according to 7 above, wherein the dioxin-degrading microorganism is Terrabacter sp. HN-1 strain (FERM P-18227).
9. Microorganisms to enhance the degradation activity of dioxin degradable microorganisms, dioxin treatment agent according to the 7 or 8 is a bacterium belonging to Alcaligenes (Alcaligenes) genus or Stenotrophomonas (Stenotrophomonas) genus.
10. As microorganisms to enhance the degradation activity of dioxin decomposition microorganisms, dioxin treatment agent according to the 7 or 8 in combination with bacteria belonging to fungi and Stenotrophomonas (Stenotrophomonas) genus belonging to Alcaligenes (Alcaligenes) genus.
11. 11. The method for decomposing dioxins according to 9 or 10, wherein the bacterium belonging to the genus Alcaligenes is Alcaligenes sp. HN-2 strain (FERM P-18228).
12 The Stenotrophomonas (Stenotrophomonas) bacteria belonging to the genus, Stenotrophomonas maltophilia (Stenotrophomonas maltophilia) HN-3 strain (FERM P-18229) dioxin decomposition method according to the 9 or 10 is.
13. Terrabacter sp. HN-1 strain (FERM P-18227) having dioxin degrading activity.
14 Alcaligenes sp (Alcaligenes sp.) HN-2 strain (FERM P-18228) and Stenotrophomonas maltophilia (Stenotrophomonas maltophilia) HN-3 strain of dioxin decomposition microorganisms selected from the group consisting of (FERM P-18229) Microorganisms that enhance degradation activity.
[0008]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(1) Dioxin-degrading microorganism The dioxin-degrading microorganism used in the dioxin decomposing method of the present invention is a microorganism having dioxin degrading activity belonging to the genus Terrabacter . Preferably, the present inventors are a kind of microorganisms separated from the soil. On February 23, 2001, the Ministry of Economy, Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Biotechnology Institute of Technology, Terrabacter sp. Deposited as 1 share (FERM P-18227).
[0009]
The mycological properties are shown below.
(I) Colony morphology (31 ° C., 1 day culture)
-Medium name: SCD (Soybean Casein Digest) agar medium-Colony size: less than 0.5 mm-Colony shape: dot-like, colony bulge: flat shape, shape around colony: whole circle, shape of colony surface: Smoothness / Colony quality: Butter quality / Colony transparency: Opaque / Glossy colony: Humid light / Colony color: Beige [0010]
(Ii) Microorganism shape / microorganism morphology: short fertility / microorganism mobility: none / microorganism size (width): 0.6 to 0.8 μm
[0011]
(Iii) Physiological properties (+: positive,-: negative, ±: false positive)
・ Gram staining (-)
・ Β-Galactosidase (-)
Arginine dihydrolase (-)
・ Lysine decarboxylase (-)
・ Ornithine decarboxylase (-)
・ Usability of citric acid (-)
-Hydrogen sulfide production (-)
・ Urease (-)
・ McConkey medium growth (+)
Tryptophan deaminase (-)
・ Indole production (-)
-Acetoin production (-)
-Gelatin liquefaction (-)
・ Glucose (-)
・ Mannitol (-)
・ Inositol (-)
・ Sorbitol (-)
・ Rhamnose (-)
・ Sucrose (-)
・ Meribiose (-)
・ Amygdalin (-)
-Arabinose (-)
・ Nitrate reduction (-)
・ Nitrogen gas production (-)
・ Oxidase (-)
[0012]
From the above bacteriological properties, this microorganism was initially considered to belong to the genus Acinetobacter, but was identified as belonging to the genus Terrabacter from the results of rDNA gene analysis in Example 2 described later.
[0013]
(2) in a microorganism present invention to enhance the degradation activity of dioxin decomposition microorganisms, as microorganisms to enhance the dioxins decomposition activity in combination with a microorganism belonging to the Terabakuta genus, for example, Alcaligenes (Alcaligenes) genus or Stenotrophomonas (Stenotrophomonas) There are bacteria belonging to the genus. In particular, the dioxin decomposition activity is enhanced when these two types of bacteria coexist.
[0014]
Examples of the bacteria belonging to the genus Alkaligenes are microorganisms isolated from soil by the present inventors. As of February 23, 2001, the Ministry of Economy, Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology ( AIST ) .) The strain deposited as HN-2 strain (FERM P-18228).
The bacteria belonging to the Stenotrophomonas genus, for example, is a kind of microorganism to which the present invention we have isolated from soil, 2001 to the institute in the February 23 date Stenotrophomonas maltophilia (Stenotrophomonas maltophilia) HN- The strain deposited as 3 strains (FERM P-18229) is mentioned.
The mycological properties of the above two strains are shown.
[0015]
Mycological properties of Alkaligenes sp. Strain HN-2 ( FERM P-18228 ) (i) Morphology of colonies (31 ° C, 1 day culture)
-Medium name: SCD (Soybean Casein Digest) agar medium-Colony size: less than 0.5 mm-Colony shape: dot-like, colony bulge: flat shape, shape around colony: whole circle, shape of colony surface: Smoothness / Colony quality: Butter quality / Transparency of colony: Opaque / Glossy colony: Humid light / Colony color: Yellowish brown [0016]
(Ii) Microorganism shape / microorganism morphology: long habit / microorganism mobility: yes / microorganism size (width): 0.4 μm
[0017]
(Iii) Physiological properties (+: positive,-: negative, ±: false positive)
・ Gram staining (-)
・ Spore formation (-)
・ Oxidase (+)
・ Nitrate reduction (-)
・ Indole production (-)
・ Glucose oxidation (anaerobic) (-)
Arginine dihydrolase (-)
・ Urease (-)
・ Esculin hydrolysis (-)
-Gelatin liquefaction (-)
・ Β-Galactosidase (-)
・ Glucose (anabolic) (-)
-Arabinose (anabolic) (-)
・ Mannose (anabolic) (-)
・ Mannitol (anabolic) (-)
・ N-acetylglucosamine (anabolic) (-)
-Maltose (anabolic) (-)
・ Potassium gluconate (anabolic) (-)
N-Capric acid (anabolic) (+)
・ Adipic acid (anabolic) (±)
Dl-malic acid (anabolic) (+)
・ Sodium citrate (anabolic) (+)
・ Phenyl acetate (anabolic) (+)
[0018]
Mycological properties of Stenotrohomomonas maltophilia strain HN-3 ( FERM P-18229 ) (i) Colony morphology (31 ° C, 1 day culture)
-Medium name: SCD (Soybean Casein Digest) agar medium-Colony size: 0.5 mm
-Colony shape: Dots-Colony protuberance: Flat shape-Colony shape: Full circle-Colony surface shape: Smooth-Colony quality: Butter quality-Transparency of colony: Opaque-Gloss of colony: Wet light Colony color: Yellow 【0019】
(Ii) Microorganism shape / microorganism morphology: long habit / microorganism mobility: yes / microorganism size (width): 0.4 μm
[0020]
(Iii) Physiological properties (+: positive,-: negative, ±: false positive)
・ Gram staining (-)
・ Spore formation (-)
・ Oxidase (±)
・ Nitrate reduction (-)
・ Indole production (-)
・ Glucose oxidation (anaerobic) (-)
Arginine dihydrolase (-)
・ Urease (-)
・ Esclin hydrolysis (+)
・ Gelatin liquefaction (+)
・ Β-Galactosidase (+)
・ Glucose (anabolic) (+)
-Arabinose (anabolic) (-)
・ Mannose (anabolic) (+)
・ Mannitol (anabolic) (-)
・ N-acetylglucosamine (anabolic) (+)
Maltose (anabolic) (+)
・ Potassium gluconate (anabolic) (-)
N-Capric acid (anabolic) (-)
・ Adipic acid (anabolic) (-)
Dl-malic acid (anabolic) (+)
・ Sodium citrate (anabolic) (+)
・ Phenyl acetate (anabolic) (-)
[0021]
(3) Culture conditions In the present invention, the dioxin-degrading microorganisms belonging to the genus Terrabacter and the microorganisms that enhance the degradation activity of the dioxin-degrading microorganisms are cultured under aerobic or anaerobic conditions, preferably aerobic conditions. Can proliferate.
The aerobic culture may be a stationary culture or a shaking culture according to the culture of a normal mesophilic bacterium. The pH of the culture solution is 2-8, preferably 5-8.
[0022]
The culture temperature is 10 to 40 ° C, preferably 20 to 30 ° C. The duration of culturing is sufficient for decomposing dioxin in the target dioxin-containing substance, and is usually 1 to 20 days, preferably about 2 weeks.
Anaerobic culture is performed by stationary culture according to the above-described aerobic culture.
The medium is not particularly limited as long as it is used for ordinary microorganisms. For example, bouillon medium, L medium, or the like can be used.
[0023]
Various carbon sources or nitrogen sources can be added to the medium as necessary. Examples of the carbon source include glucose, sucrose, maltose, saccharose, sucrose, brown sugar, molasses, waste molasses, malt extract and the like. Examples of the nitrogen source include meat extract, peptone, gluten meal, soybean flour, dry yeast, yeast extract, ammonium sulfate, ammonium tartrate, urea and the like. In addition, if necessary, inorganic salts such as sodium salt, magnesium salt, manganese salt, iron salt, calcium salt, phosphate, zinc salt, vitamins such as inositol, vitamin B ₁ hydrochloride, L-asparagine, biotin, etc. Kinds may be added.
[0024]
(4) Dioxin Decomposing Method The dioxin decomposing method of the present invention is carried out by treating dioxin with a culture in which the dioxin degrading microorganism and a fungus that enhances the decomposing activity of the dioxin degrading microorganism are combined or a treated product thereof. . For example, the dioxin-containing substance is added to the culture medium, or conversely, the culture liquid or an extract component thereof is added to the dioxin-containing substance.
[0025]
The reaction can be carried out by any of batch method, continuous method, semi-continuous method and the like. Moreover, as long as it contains the microbe which has a dioxin decomposing activity, and the microbe which enhances a dioxin decomposing activity, you may use with other dioxin decomposing bacteria.
The culture in the case where the dioxin-containing substance is added to the culture solution for treatment can be performed according to the culture conditions described above.
[0026]
(5) Dioxin treatment agent The dioxin treatment agent according to the present invention contains the dioxin-degrading microorganism and a fungus that enhances the decomposition activity of the dioxin-degrading microorganism, and it does not matter whether it is liquid or solid. That is, the culture solution itself containing the dioxin decomposing active bacteria and the decomposing activity enhancing bacteria can be used as the dioxin treating agent. Moreover, what dried the culture solution and added the manufacturing auxiliary agent and was made into the solid agent can also be used by adding to the dioxin containing material itself to process, or a processing medium.
[0027]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, this invention is not limited to these examples.
[0028]
Example 1: Isolation of microorganisms 2.5 ml of the minimum medium shown in Table 1 was dispensed into a threaded test tube (20 mm x 125 mm), and 2.5 mg (1000 mg / l) of dibenzofuran (DBF) as a model compound of dioxins. ) And 5 μl (0.2% (v / v)) of dimethylformamide as a carbon source dispersant. A small amount of soil or water sample collected from various parts of Japan was inoculated here, followed by shaking culture at 30 ° C. and 140 rpm. Since a culture system showing good growth was obtained after several subcultures, a portion of the culture solution was applied to a minimal medium agar plate, sprayed with an ether solution of DBF, and incubated at 30 ° C. As a result, colonies in which the DBF layer was dissolved were formed (see FIGS. 1 and 2).
The culture broth was diluted, applied on a Nutrient broth agar plate, and statically cultured at 30 ° C. to isolate DBF-degrading bacteria. As a result, it was revealed that this culture system is composed of three types of bacteria.
These three types of bacteria were isolated (HN-1 strain, HN-2 strain, HN-3 strain), and the results of examining mycological properties were as described above.
[0029]
[Table 1]

[0030]
Example 2: Sequence determination of 16S rRNA gene of microorganism In order to carry out systematic analysis by the neighbor binding method for the above three types of bacteria, the sequence of 16S rRNA gene was determined, and the genus species of the microorganism was identified by sequence analysis.
[0031]
(1) DNA extraction DNA extraction from cells was performed as follows. The bacterial cells cultured in C medium at 30 ° C. and 200 rpm for 2 days were collected by centrifugation at 5000 rpm for 3 minutes to obtain bacterial cells. The cells were resuspended in 360 μl of TE (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA), 40 μl of 10 mg / ml lysozyme (final concentration 1 mg / m1) was added, and incubated at 50 ° C. for 30 minutes. Furthermore, 100 μl of 1 mg / ml proteinase K (final concentration 0.1 mg / ml) and 500 μl of BL buffer (Tris-HCl (pΗ8.0; 40 mM), Tween 20 (1%), Nonidet P-40 (0.2 %), EDTA (0.2 mM)) and further incubated for 30 minutes. Thereafter, freezing and thawing were performed twice, proteinase K was inactivated by incubation at 90 ° C. for 10 minutes, and 1 μl thereof was used for the PCR reaction shown below.
[0032]
(2) PCR amplification PCR reaction was performed using Takara PCR Thermal Cycler MP (Takara Shuzo). The primer set used for PCR was designed to specifically amplify the almost full length (11-1511 base sites) of the eubacterial small subunit ribosomal RNA (16SrRNA) gene, and Eub11f3mx (5′-tgrgtttgatcmgtggctyag (SEQ ID NO: 1)) and Eub1111r1mx (5′-tgghtactttgtacacactt (SEQ ID NO: 2)) were used. The PCR cycle program was performed at 95 ° C. for 3 minutes, followed by 35 cycles of PCR. One cycle configuration was performed with a denaturation step at 95 ° C. for 30 seconds, an annealing step at 50 ° C. for 30 seconds, and an extension step at 72 ° C. for 1.5 minutes.
After confirming the amount and length of the PCR amplification product obtained by 1% agarose gel electrophoresis, it was purified by a spin column (QIA quick PCR Purification Kit, manufactured by QIAGEN) to obtain a template DNA for sequencing. .
[0033]
(3) Sequencing Determination The sequence was determined by direct sequencing of PCR amplification products without cloning. The sequence was determined for about 1.4 kb, which is almost the entire length of the amplified 16S rRNA gene. As sequence primers, Eub11f3mx (SEQ ID NO: 1), Eub514f1mx (5'-gtgccagcmgccgcggtaa (SEQ ID NO: 3)), Eub906f1mx (5'-aaactcaagagattgrcgg (SEQ ID NO: 4) gcgg5gc5 , EuB920r1mx (5′-ccgycaattccttttgagtt (SEQ ID NO: 6)) and Eub1405r (5′-gacggggcgtgtgtrca (SEQ ID NO: 7)) were used, and the sequence was determined using the ABI377 fluorescence automatic sequencer (manufactured by Perkin Elmer) BigDye terminator cycle sequence kit (BigDye terminator Cycle sequence kit) sequence kit (manufactured by Perkin Elmer). As a result, the sequences shown in SEQ ID NOs: 8, 9 and 10 were obtained for HN-1, HN-2 and HN-3 strains, respectively.
[0034]
(4) Phylogenetic analysis The sequence data obtained above were aligned using the program package Clustar-X together with the previously reported 16S rRNA gene sequences collected from the database (GenBank, EMBL, DDBJ, RDP). System analysis by the neighbor connection method was performed using the system analysis program PHYLIP.
[0035]
The sequence data (SEQ ID NO: 8) of the HN-1 strain was 99.70% identical with the genetic data of Terrabacter sp. FIG. 3 shows a phylogenetic tree comparing 16S rRNA gene sequences of other Terrabacter groups at the gene level according to the neighborhood joining method.
[0036]
Based on the above results, the HN-1 strain was identified as Terrabacter sp. And the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology ( METI ), Biotechnology Institute of Technology, Terrabacter sp. HN- Deposited as 1 strain (FERM P-18227).
[0037]
Further, also similarly analyzed for HN-2 strains and HN-3 strain, respectively identified as Alcaligenes sp (Alcaligenes sp.) And Stenotrophomonas maltophilia (Stenotrophomonas maltophilia), respectively Alcaligenes sp (Alcaligenes sp.) HN-2 strain (FERM P-18228), Stenotrophomonas maltophilia (Stenotrophomonas maltophilia) HN-3 strain (FERM P-18229) as the Ministry of economy, Trade and industry National Institute of Advanced industrial Science and technology life Institute of Advanced industrial Science and technology Deposited.
[0038]
Example 3:
When each isolated microorganism was inoculated into a liquid minimal medium, only the Terrabacter sp. HN-1 strain (FERM P-18227) can assimilate DBF, and the other two strains contributed to DBF. It did not turn.
Therefore, when Terrabacter sp. Strain HN-1 (FERM P-18227) was cultured alone on a minimal medium agar plate, a colony having a DBF layer dissolved was formed on the 10th day. On the other hand, when the other two strains were co-cultured, colonies were formed on the fifth day.
From this, it can be seen that the growth rate is improved by treatment with a complex microorganism system in which three types of strains are mixed, rather than treatment with Terrabacter sp. HN-1 strain alone.
[0039]
Example 4: DBF degradation test with resting cells A resting cell of a complex microbial system of three strains was prepared and subjected to a DBF degradation test.
The complex microorganism system was cultured in a liquid minimal medium, collected by centrifugation, and washed twice with 50 mM phosphate buffer (pH 7.0). What suspended this microbial cell in the phosphate buffer so that it might become OD660 = 2.0 was used for reaction. Dispense 2 ml of resting cell suspension into a test tube with a stopper (18 mm × 180 mm), add 20 μl of 10 mM DBF in dimethylformamide (corresponding to a final DBF concentration of 100 μM), and shake at 30 ° C. and 140 rpm. Reaction was performed. After the reaction, 40 μl of 12N hydrochloric acid and 10 μl of 5 mM anthracene dimethylformamide solution as an internal standard were added (corresponding to an anthracene final concentration of 25 μM). This was extracted with 2 ml of ethyl acetate and analyzed by GC-MS.
As a control, resting cells were autoclaved and treated in the same manner, and analyzed by GC-MS.
[0040]
The measurement conditions by GC-MS are as follows.
GC-MS apparatus: Turbo Mass GC Mass Spectrometer (Perkin Elmer),
Ion source: 70 eV,
Column: NEUTRA BOND-1 column (manufactured by GL Science); inner diameter 0.25 mm, length 30 m,
Oven program: maintained at an initial temperature of 100 ° C. for 2 minutes → heated at 10 ° C./minute and maintained at 200 ° C. for 2 minutes → heated at 10 ° C./minute and maintained at 300 ° C. for 6 minutes.
[0041]
The results are shown in FIG. Although the DBF peak was detected immediately after the start of the reaction (FIG. 4A), the presence of DBF was not confirmed at all in the reaction solution after 1 hour (FIG. 4B). When the autoclaved resting cells were used, DBF reduction was not confirmed even after 24 hours of reaction (FIG. 4C). Therefore, it was found that 100 μM DBF can be degraded in one hour in the resting cells of the complex microorganism system.
[0042]
【The invention's effect】
According to the present invention, dioxins can be effectively decomposed by using a complex microorganism system in which a dioxin-degrading microorganism belonging to the genus Terrabacter and a microorganism that enhances the dioxin-degrading activity coexist. .
[0043]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph of a colony formed by a complex microbial system of the present invention.
FIG. 2 is a photograph of colonies when the bacterial cell concentration in FIG. 1 is diluted 10 ⁻⁴ times.
FIG. 3 is a phylogenetic tree of 16S rRNA gene analysis of Terrabacter sp. HN-1 strain (FERM P-18227) by the neighborhood joining method. The scale “0.01” in the figure represents the degree of genetic proximity.
FIG. 4 is a GC-MS chromatogram showing the decomposition of dibenzofuran using resting cells, (A) is immediately after the start of the reaction, (B) is one hour after the start of the reaction, (C) is 24 hours after using autoclaved resting cells.

Claims (3)

ダイオキシン分解性微生物と、前記ダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する微生物とを用いてダイオキシンを処理するダイオキシン分解方法において、ダイオキシン分解性微生物が、テラバクター・エスピー（Terrabacter sp.）ＨＮ−１株（FERM P-18227）であり、ダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する微生物が、アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＨＮ−２株（FERM P-18228）及びステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）ＨＮ−３株（FERM P-18229）を併用することを特徴とするダイオキシン分解方法。In a dioxin decomposing method of treating dioxin using a dioxin degrading microorganism and a microorganism that enhances the decomposing activity of the dioxin degrading microorganism, the dioxin degrading microorganism is a Terrabacter sp. HN-1 strain ( is FERM P-18227), the microorganisms to enhance the decomposition activity of dioxin degrading microorganisms, Alcaligenes sp. (Alcaligenes sp.) HN-2 strain (FERM P-18228) and Stenotrophomonas maltophilia (Stenotrophomonas maltophilia) A dioxin decomposition method characterized by using HN-3 strain (FERM P-18229) in combination. ダイオキシン分解性微生物と、前記ダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する微生物とを含むダイオキシン処理剤において、ダイオキシン分解性微生物が、テラバクター・エスピー（Terrabacter sp.）ＨＮ−１株（FERM P-18227）であり、ダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する微生物が、アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＨＮ−２株（FERM P-18228）及びステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）ＨＮ−３株（FERM P-18229）を併用することを特徴とするダイオキシン処理剤。In the dioxin treating agent comprising a dioxin degrading microorganism and a microorganism that enhances the degrading activity of the dioxin degrading microorganism, the dioxin degrading microorganism is Terrabacter sp. HN-1 strain (FERM P-18227) , and the microorganisms to enhance the degradation activity of dioxin degradable microorganisms, Alcaligenes sp (Alcaligenes sp.) HN-2 strain (FERM P-18228) and Stenotrophomonas maltophilia (Stenotrophomonas maltophilia) HN-3 strain ( A dioxin treating agent characterized by using FERM P-18229) together. アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＨＮ−２株（FERM P-18228）およびステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）ＨＮ−３株（FERM P-18229）からなる群より選ばれるダイオキシン分解性微生物の分解活性を増強する微生物。Alcaligenes sp (Alcaligenes sp.) HN-2 strain (FERM P-18228) and Stenotrophomonas maltophilia (Stenotrophomonas maltophilia) HN-3 strain of dioxin decomposition microorganisms selected from the group consisting of (FERM P-18229) Microorganisms that enhance degradation activity.

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