JP4197545B2 - 特異的細胞除去材料 - Google Patents
特異的細胞除去材料 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4197545B2 JP4197545B2 JP34361197A JP34361197A JP4197545B2 JP 4197545 B2 JP4197545 B2 JP 4197545B2 JP 34361197 A JP34361197 A JP 34361197A JP 34361197 A JP34361197 A JP 34361197A JP 4197545 B2 JP4197545 B2 JP 4197545B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- protein
- cells
- peptide
- removal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、多孔質材料表面に細胞表面と親和性を有するタンパク質及び/又はペプチドを有する細胞除去材料に関する。本発明の細胞除去材料は、血液等の細胞集団からの特定の細胞の除去・回収に使用される。
【0002】
【従来の技術】
近年、全身性エリテマトーデス、悪性関節リウマチ、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病等の自己免疫性疾患、白血病、癌などの治療、或いは移植前の免疫抑制の目的で白血病等を選択的に除去する技術が進歩してきた。
このように、細胞を選択的に分離、除去等する目的で、ペプチド、タンパク質、合成物等を固定した材料が開発されている。特に、抗体、ペプチド等のタンパク質を固定した材料を用いて血液細胞を特異的に除去する技術が進歩してきている。
タンパク質及びペプチドはアミノ酸がペプチド結合によって結合した化合物であり、アミノ酸は酸性であるカルボキシル基と塩基性であるアミノ基を共有する電解質である。タンパク質及びペプチドの立体構造は、ペプチド結合や−S−S−結合のような共有結合の他に水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力のような弱い非共有結合により保持されているため、構造上極めて不安定な物質である。よって、物理的、化学的、生物学的な要因によりタンパク質及びペプチド固有の立体構造が破壊される変性が極めて起こり易い。特に水溶液中では、室温で1日程度放置しておくだけで、その固有の機能を発揮しなくなるのが一般的である。更には、冷蔵保存によっても長期の保存は不可能とされている。このようにタンパク質及びペプチドは安定性の面で問題があるため、機能を維持するためには特別の工夫をして立体構造を安定に保つ必要がある。多孔質材料表面に細胞表面と親和性を有するタンパク質及び/又はペプチドを有する細胞除去材料において、溶液中でタンパク質及び/又はペプチドの立体構造を安定に保持する方法はこれまでになく、タンパク質を安定に保持する方法が強く望まれていた。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記タンパク質及び/又はペプチドの不安定性の問題点に鑑み、タンパク質及び/又はペプチドの立体構造を安定に保持する特異的白血球除去材料を提供する事を目的とする。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、多孔質材料表面に細胞表面と親和性を有するタンパク質及び/又はペプチドと共にポリオキシエチレン鎖を含む非イオン性界面活性剤を存在させることにより驚くべき程、タンパク質及び/又はペプチドの立体構造を安定に保持することができ、細胞特異性の保持に大きく効果があることを見出した。即ち本発明は、多孔質材料表面に細胞表面と親和性を有するタンパク質及び/又はペプチドを有する細胞除去材料であって、細胞除去材料表面にポリオキシエチレン鎖を含む非イオン性界面活性剤を有することを特徴とする特異的細胞除去材料である。
【0005】
本発明で言う多孔質材料とは、細胞が通過できるポアを持ち、細胞が接触できる表面を持つ多孔質な材料の事を言う。形状は、液層で細胞が高頻度に接触できるようにするため、表面積が大きいことが好ましい。好ましい形状の例を挙げると、不織布状、繊維状、綿状、糸状、束状、簾状、織布状等の繊維構造体、スポンジ等の高分子多孔質体、ビーズ状、ゲル状等の形状が挙げられる。特に血液成分のうち白血球を除去する場合、除去効率の面より、織布、不織布がより好ましい。中でも構造の安定性、制御のし易さ、表面積が大きい等の点で不織布が最も好ましい。
【0006】
本発明で言う細胞表面と親和性を有するタンパク質及び/又はペプチドとは、細胞に特異的或いは選択的に親和性を有する物質である。一般に細胞表面抗原と相互作用を成すタンパク質或いはペプチド等が用いられる。好ましくは、アミノ酸数3〜50程度のペプチド、アフィニティの高さより抗体等が挙げられる。更に好ましくは細胞とのアフィニティの高さからモノクローナル抗体或いはその一部からなるペプチドが良好に用いられる。抗体をその機能により例示すると、抗CD4、抗CD8、抗CD3、抗CD2、抗CD1a,抗CD1b,抗CD5,抗CD3R、抗CD6、抗CD7、抗CD9、抗CD10、抗CDlla,抗CD18,抗CD19,抗CD20,抗CD21,抗CD22,抗CD23,抗CD24,抗CD37,抗CD40,抗CD72,抗CD77,抗CDl6,抗CD32,抗CD33,抗CD34,抗CD35,抗CD64、抗CD65,抗CDw65,抗CD66b、抗CD66e、抗CD89,抗CDw90,抗CD56,抗CD57,抗CD94,抗CD105,抗CD106,抗CD46,抗CD31,抗CDw36,抗CD41,抗CD42a,抗CD42b,抗CD63,抗CD11a,抗CD11b,抗CD11c、抗CD18,抗CD29,抗CD44,抗CD48,抗CD49a,抗CD49b,抗CD49c,抗CD49d,抗CD49e,抗CD49f,抗CD50,抗CD51,、抗CD54,抗CD58,抗CD61,抗CD62E、抗CD62L、抗CD62P、抗CD103,抗CD26,抗CD30、抗CD69、抗CD70、抗CD71、抗CD95、抗CD25、抗CD117、抗CD122、抗CDw124,抗CD126,抗CD127、抗IL−2R等の抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。更にこれらの抗体は単独で用いることができるが、複数固定しても良い。更にこれらの抗体の一部よりなるペプチドも良好に用いることができる。
【0007】
本発明の特異的細胞除去材料には、タンパク質及び/又はペプチドが多孔質材料表面に直接結合していてもよいし、活性基を介して結合していてもよい。固定時の結合方法はタンパク質及び/又はペプチドの活性を維持できる方法であればいずれの反応も良好に用いることができるが、敢えて例示すると、置換反応、縮合反応、開環反応等を用いることができる。前記活性基は、タンパク質及び又はペプチドを結合できる構造であれば公知のいずれの官能基であってもよい。例示すれば、N−ヒドロキシメチルヨードアセトアミド、N−ヒドロキシメチルブロモアセトアミド、N−ヒドロキシメチルクロロアセトアミド等のN−ヒドロキシメチルハロアセトアミド等を用いて多孔質材料表面を活性化したα−アセトアミノハロゲン基、N−ヒドロキシメチルジハロプロピオンアミド等を用いて多孔質材料表面を活性化したα、β−プロピオンアミノハロゲン基、N−ヒドロキシメチルジハロアセトアミド等を用いて多孔質材料表面を活性化したα、α−アセトアミノジハロゲン基、N−ヒドロキシメチルトリハロアセトアミド等を用いて多孔質材料表面を活性化したα、α、α−アセトアミノトリハロゲン基等のハロアセトアミノアルカン化剤を用いた活性基、エピクロロヒドリン等を用いて多孔質材料を活性化したエポキシ基等が挙げられる。他にイソシアネート基、イソチアシアネート基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、ビニル基、ブロモシアンによる活性基等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。特にタンパク質及び/又はペプチドの活性を維持できる点、穏和な条件で反応できる点より、好ましくは、ハロアセトアミノアルカン化剤を用いた活性基が良好に用いられる。
【0008】
本発明でいうタンパク質安定化剤とは、多孔質材料表面の細胞表面と親和性を有するタンパク質及び/又はペプチド近傍に存在し、タンパク質及び/又はペプチドを室温或いは低温状態で長期に安定に保つことができる材料である。タンパク質安定化剤としては、疎水基と親水基を共有する界面活性剤が良好に用いられる。疎水基を有することで多孔質材料表面或いはタンパク質及び/又はペプチドの疎水部分に吸着され、親水基を有することで材料表面を親水化することにより、タンパク質及び/又はペプチドを安定に保持できるものと考えられる。物質的に安定で、電気的に中性な界面活性剤が好ましいことが判った。電気的に中性であることで、不要な荷電を有さず物質的に安定化することができる。非イオン性界面活性剤が、両イオン性界面活性剤よりも物質的に安定しているため更に好ましく、親水性部分にポリオキシエチレン鎖を含む構造である非イオン性界面活性剤が最も好ましい。
界面活性剤の基本的構造は、1分子の中に親水性部分と疎水性部分を共有している化合物である。界面活性剤を水に溶解又は分散させた場合に、その疎水性部分が一部解離した時に示すイオン性により大別して分類している。
ポリオキシエチレンの構造を含む非イオン性界面活性剤の例を挙げると、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンポリスチリルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレングリセリンエステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。最も好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンエステルに属するポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート等が挙げられる。
但し例外として、膜タンパク質可溶化作用を有する界面活性剤、例として非イオン性であるオクチルβ−グルコシド、オクチルβ−D−グルコピラノサイ、両イオン性である3−コールアミドプロピルジメチルアンモニオ−1−プロパンスルホン酸、3−3−コールアミドプロピルジメチルアンモニオ−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホン酸等は好ましくない。
【0009】
本発明の特異的細胞除去材料はそのままの状態はもとより、少なくとも入口と出口を有する容器に充填して、細胞の特異的除去或いは回収や、細胞特異除去を目的とする体外循環用用途に有効に用いられる。これらの特異的細胞除去材料を用いて、白血球、リンパ球、単球、顆粒球等の各分画細胞の特異的分離又は吸着、除去等に有効に活用できる。更に、血漿成分の特異的除去及び回収にも良好に用いることができる。
本発明における細胞の状態は全血のみならず、リンパ球浮遊液、単核球浮遊液、骨髄液、バフィーコート等に加え、血小板濃厚液、赤血球濃厚液等の処理を施した血液も含まれる。更に体外循環やG−CSF等の造血因子を投与した末梢血等についても良好に用いることができる。また、これらに必要に応じて抗凝固剤や血液保存液等を加えて良好に用いることができる。
以下に、本発明の実施例を比較例と共に示すが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【0010】
【実施例1】
ガラス製のフラスコにN−ヒドロキシメチルヨードアセトアミド0.6g、濃硫酸5.7mL及びニトロベンゼン7.2mLを加えて攪拌溶解し、更に氷浴中でパラホルムアルデヒド0.04gを加え、攪拌した。これにポリプロピレンからなる不織布(平均繊維直径3.3μm)0.3gを入れ4時間反応した。4時間反応後不織布を取り出し、エタノール及び純水にて洗浄し、これを真空乾燥して、活性化不織布を得た。
この活性化不織布を直径0.68cmの円に切断したもの4枚をカルシウム、マグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩液(以下PBS(−))に溶解した抗ヒトCD4モノクローナル抗体液(以下抗ヒトCD4液と略す)400μL(16μg/400μL)に2.5時間浸し、モノクローナル抗体(以下抗体と略す)を固定後、2.5時間後PBS(−)で洗浄した。次に0.2%ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート/PBS(−)溶液(以下Tween20溶液と略す)を加え2.5時間固定した後、PBS(−)で洗浄し、CD4陽性細胞(以下CD4(+)細胞と略す)を特異的に除去する特異的細胞除去材料を得た。
入口と出口を有する容量1mLの容器に上記特異的細胞除去材料を4枚充填(充填密度0.1g/cm3)し、充填液としてPBS(−)を充填し特異的細胞除去器を作成した。
ACD−A加ヒト新鮮血液5mL(血液:ACD−A=8:1)をシリンジポンプにて流速1mL/minで送液し、カラムの入口より流した。カラム出口より処理後の液を回収した。更に残留した血液は、空気により圧をかけて回収した。
この時のCD4(+)細胞の除去率を、フローサイトメーター(COULTER EPICS ELITE ESP ASSY NO.66056078)で測定し、処理前後の細胞の存在率より求めたCD4(+)細胞の除去率は96%であった。また、この時CD8(+)細胞の除去率は33%、Bリンパ球の除去率は40%、血小板の除去率は15%であり、CD4(+)細胞を特異的に除去できた。
【0011】
【実施例2】
実施例1と同様に作成した特異的細胞除去器を50℃で1時間加温後、PBS(−)で洗浄した。
ACD−A加ヒト新鮮血液5mL(血液:ACD−A=8:1)をシリンジポンプにて流速1mL/minで送液し、カラムの入口より流した。カラム出口より処理後の液を回収した。更に残留した血液は、空気により圧をかけて回収した。
この時のCD4(+)細胞の除去率を、フローサイトメーター(COULTER EPICS ELITE ESP ASSY NO.66056078)で測定し、処理前後の細胞の存在率より求めたCD4(+)細胞の除去率は96%であった。また、この時CD8(+)細胞の除去率は33%、Bリンパ球の除去率は27%、血小板の除去率は10%であり、CD4(+)細胞を特異的に除去できた。
【0012】
【比較例1】
0.2%Tween20溶液を用いる代わりにPBS(−)溶液を用いた以外は実施例1と同様に行い、特異的細胞除去材料を作成し、実施例2と同様の実験操作を行ったところ、この時のCD4(+)細胞の除去率は23%であった。またこの時CD8(+)細胞の除去率は10%、Bリンパ球の除去率は10%、血小板の除去率は30%であり、加温によるタンパク質の変性が起こったものと考えられた。
【0013】
【実施例3】
充填液としてPBS(−)を用いる代わりに1%キトサン/PBS(−)(以下キトサン溶液と略す)を用いた以外は全く実施例1と同様に行い、特異的細胞除去器を作成した。この特異的細胞除去器にγ線50kGyを照射して滅菌した後、50℃で1時間加温し、PBS(−)で洗浄した。
ACD−A加ヒト新鮮血液5mL(血液:ACD−A=8:1)をシリンジポンプにて流速1mL/minで送液し、カラムの入口より流した。カラム出口より処理後の液を回収した。更に残留した血液は、空気により圧をかけて回収した。
この時のCD4(+)細胞の除去率を、フローサイトメーター法で測定し、処理前後の細胞の存在率より求めたCD4(+)細胞の除去率は97%であった。また、この時CD8(+)細胞の除去率は24%、Bリンパ球の除去率は30%、血小板の除去率は16%であり、CD4(+)細胞を特異的に除去できた。
【0014】
【比較例2】
0.2%Tween20溶液を用いる代わりにキトサン溶液を用いた以外は実施例1と同様に行い、特異的細胞除去材料を作成し、充填液としてPBS(−)液を用いる代わりにキトサン溶液を用いた以外は実施例1と同様に行い、特異的細胞除去器を作成した。この後、実施例3と同様の実験操作を行ったところ、この時のCD4(+)細胞の除去率は50%であった。またこの時CD8(+)細胞の除去率は35%、Bリンパ球の除去率は38%、血小板の除去率は30%であった。
【0015】
【発明の効果】
本発明の特異的細胞除去材料は、多孔質材料表面に細胞表面と親和性を有するタンパク質及び/又はペプチドを有する細胞除去材料表面にタンパク質安定化剤を保有させたことにより、タンパク質の立体構造を安定に保持することができ、タンパク質及び/又はペプチドの細胞特異性の保存安定性が大幅に改善された。更に滅菌保護剤と組合せることにより、滅菌保護剤との親和性も上がり、細胞特異性の保存安定性が更に向上した。
本発明の特異的細胞除去材料はタンパク質及び/又はペプチドの構造を室温及び低温保存でも長期間安定に保持するので、血液等の細胞浮遊液から目的細胞を特異的に除去することが実用的に行える様になった。
Claims (2)
- 多孔質材料表面に細胞表面と親和性を有するタンパク質及び/又はペプチドを有する細胞除去材料であって、細胞除去材料表面にポリオキシエチレン鎖を含む非イオン性界面活性剤を有することを特徴とする特異的細胞除去材料。
- 細胞表面と親和性を有するタンパク質及び/又はペプチドが、細胞表面抗原に対する抗体及び/又はその一部である請求項1記載の特異的細胞除去材料。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP34361197A JP4197545B2 (ja) | 1997-12-01 | 1997-12-01 | 特異的細胞除去材料 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP34361197A JP4197545B2 (ja) | 1997-12-01 | 1997-12-01 | 特異的細胞除去材料 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH11158076A JPH11158076A (ja) | 1999-06-15 |
JP4197545B2 true JP4197545B2 (ja) | 2008-12-17 |
Family
ID=18362881
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP34361197A Expired - Lifetime JP4197545B2 (ja) | 1997-12-01 | 1997-12-01 | 特異的細胞除去材料 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4197545B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20090007642A (ko) * | 2006-05-12 | 2009-01-19 | 아이비디 컬럼 세라피스 인터네셔널 아베 | 염증성 장질환을 치료하기 위한 방법 및 수단 |
CA2697681C (en) * | 2007-08-31 | 2013-06-11 | The Regents Of The University Of Michigan | Selective cytopheresis devices and related methods thereof |
US8877177B2 (en) | 2008-09-10 | 2014-11-04 | Ith Immune Therapy Holdings Ab | Chemokine containing apheresis column and methods of use |
JP6741021B2 (ja) * | 2015-12-15 | 2020-08-19 | 日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社 | 線維芽細胞増殖因子−23の安定化剤 |
-
1997
- 1997-12-01 JP JP34361197A patent/JP4197545B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH11158076A (ja) | 1999-06-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2137271C (fr) | Dispositif permettant l'obtention d'un surnageant de thrombocytes actives, procede mettant en oeuvre le dispositif et surnageant obtenu | |
AU621148B2 (en) | Removal of process chemicals from labile biological mixtures by hydrophobic interaction chromatography | |
US4086218A (en) | Method of preserving blood plasma II | |
US8603821B2 (en) | Method for preparing serum and serum preparation apparatus | |
KR100273010B1 (ko) | 혈액-유래조성물로부터 응고인자를 보존시키며 항체를 제거하는 방법 | |
JP4197545B2 (ja) | 特異的細胞除去材料 | |
US20170281679A1 (en) | Method for preparing universal plasma | |
JPH114682A (ja) | 有核細胞保存方法、有核細胞保存用組成物及び有核細胞分離方法 | |
WO2011111386A1 (ja) | 細胞濃縮・回収方法及び細胞回収液 | |
JP4071283B2 (ja) | 滅菌保護剤及び滅菌方法 | |
CA2394797A1 (en) | Process for producing virus-free plasma protein composition by porous membrane treatment, virus-free plasma protein composition and method of removing viruses | |
JP4190456B2 (ja) | 細胞吸着材の照射滅菌方法および照射滅菌された細胞吸着材 | |
US4137223A (en) | Method of preserving blood plasma II | |
JP2004129550A (ja) | 単球の分離回収方法 | |
JP2002505674A (ja) | 生物材料中のウイルスおよび分子病原体を除去する方法 | |
JP2007307280A (ja) | 特定細胞吸着装置 | |
JP2004105529A (ja) | 細胞吸着材および細胞吸着器の滅菌方法ならびに細胞吸着器 | |
JP3945725B2 (ja) | 細胞分離方法 | |
JP2000325071A (ja) | 細胞分離回収方法 | |
Karger et al. | Inline-filtration | |
JP2521090B2 (ja) | 血球分離装置 | |
JPH11266852A (ja) | 細胞分離器 | |
JP7163187B2 (ja) | 血液からの免疫グロブリンの濃縮のための方法および装置 | |
JPH10313855A (ja) | 細胞分離方法 | |
JPH0923879A (ja) | 骨髄細胞濃縮方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041025 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080711 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080813 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080925 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080929 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111010 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111010 Year of fee payment: 3 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111010 Year of fee payment: 3 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111010 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121010 Year of fee payment: 4 |