JP4190562B2 - 遺伝子配列検査法 - Google Patents
遺伝子配列検査法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4190562B2 JP4190562B2 JP2006547816A JP2006547816A JP4190562B2 JP 4190562 B2 JP4190562 B2 JP 4190562B2 JP 2006547816 A JP2006547816 A JP 2006547816A JP 2006547816 A JP2006547816 A JP 2006547816A JP 4190562 B2 JP4190562 B2 JP 4190562B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- exonuclease
- nucleic acid
- target nucleic
- probe
- oligonucleotide probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
- C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
- C12Q2521/319—Exonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
- C12Q2561/101—Taqman
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/30—Detection characterised by liberation or release of label
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は臨床医学、法医学、薬物化学、生化学、食品化学、農芸化学などの分野における、主として遺伝子解析方法に関するものであり、ゲノム遺伝子、ウイルス又は細菌等の遺伝子の変異又は多型の解析に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子多型（以下、「多型」）とは、全個体中１％以上の頻度で存在するゲノムの多様性のことであり、１塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）の他、１〜数十塩基の欠損もしくは挿入、数塩基〜数十塩基からなる繰り返し配列（マイクロサテライト）における繰り返し回数の違いなどが含まれる。
【０００３】
遺伝子配列の変異や多型を解析することは、臨床医学、法医学、薬物化学、生化学、食品化学、農芸化学などの多岐にわたる分野で重要である。ヒトの場合を挙げれば、遺伝子の変異（一般的には出現頻度が１％未満のものを指す）は、遺伝病、癌などと深く関わりのあることが示されているし、多型（一般的には出現頻度が１％以上のものを指す）は、疾患の発症リスク、薬剤感受性、薬剤代謝速度などとの関わりが示されている。また、ウイルスや細菌の場合、薬剤耐性、病原性などとの関わりのあることが知られている。さらに、個人及び個体識別や農産物の品種同定などにも利用される。
【０００４】
現在、遺伝子配列の変異や多型を最も精度よく解析するために、主にサンガー法による塩基配列の決定が行われている。近年では、塩基配列決定の手順の一部が自動化されているが、なお操作が煩雑であり、解析に長時間を要し、高価な装置と試薬とを必要とする。
【０００５】
より簡便、迅速、安価な多型解析の方法として、サンガー法による塩基配列決定以外の方法が開発されており、なかでもハイブリダイゼーションを基盤とした方法は広く利用されている一般的なものである。ハイブリダイゼーションを基盤とした方法は、主にマイクロプレート、メンブレン、ビーズ、スライドガラスなどの固相に、一般的には１５〜２５塩基長程度のプローブを固定させ、これに標的核酸をハイブリダイズさせることによってヘテロディプレックスを形成させる。そして、該ヘテロディプレックス中に塩基対のミスマッチのある場合とない場合との融解温度（以下、Ｔｍという）の差異（以下、ΔＴｍ）を利用し、ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション後の洗浄操作においてｐＨ、塩濃度、温度などを適切に調整することによって、ミスマッチのあるヘテロディプレックスのみを選択的に解離させ除去する、いわゆるＢ／Ｆ分離と呼ばれる手法に基づいている。この際、プローブの鎖長が長くなるとＴｍが高くなり、ΔＴｍが全体のＴｍに占める割合が小さくなるため、この微小なΔＴｍを利用してミスマッチのある標的核酸とミスマッチのない標的核酸とを洗浄条件の調整によって分離することが困難となる。また鎖長が短くなるとハイブリダイゼーションの特異性が低くなるだけでなく、全体のＴｍも低くなるため、プローブと標的核酸との結合の親和性も下がり、プローブが効率よくハイブリダイズしないことがある。そのため、たとえ穏やかな条件下でハイブリダイズさせたとしても、親和性が低いためにマッチした標的核酸とミスマッチのある標的核酸がともに除去されてしまい、結果としてマッチとミスマッチを区別することが困難となることが多い。
【０００６】
他の方法としては、被検ＤＮＡを鋳型として、プライマー伸長法によって一塩基または数塩基のヌクレオチドの取り込みを行い、鋳型ＤＮＡの配列に応じて取り込まれたヌクレオチドの種類を同定することによって多型を解析する、ミニシークエンスと呼ばれる方法がある。ミニシークエンス法では、しばしばＰＣＲによって増幅されたＤＮＡが鋳型として用いられるが、プライマー伸長を行う前に残存するＰＣＲプライマーやヌクレオチドの除去、反応液の交換などのためにＰＣＲ産物の精製が不可欠であり、操作が煩雑である。また、取り込まれたヌクレオチドの種類を同定するための最新の方法として質量分析法が使用されることがあるが、非常に高価な装置を必要とする。このように、ミニシークエンス法においては、経済性、迅速性の点での問題を指摘することができる。
【特許文献１】
特開平６−３２７４９９
【特許文献２】
国際公開公報ＷＯ２００２／０７７２８２
【特許文献３】
国際公開公報ＷＯ２００３／０３５８６４
【特許文献４】
国際公開公報ＷＯ０１／２３５８３
【非特許文献１】
ＢｉｏＴｅｃｎｉｑｕｅｓ，１３，８８８−８９２，１９９２
【非特許文献２】
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５８（２），７１９−７２６（１９６７）
【非特許文献３】
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，１０１５６−１０１６３（１９９８）
【非特許文献４】
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２２，１８５９（１９８１）
【非特許文献５】
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８、３４６８−３４７７（１９９９）
【非特許文献６】
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８，ｅ６３（２０００）
【非特許文献７】
臨床病理 ５０、５２８−５３２（２００２）
【非特許文献８】
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２（１０），４６４１−４６４５（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、エキソヌクレアーゼを用いた遺伝子配列の検査法に関して、簡便、迅速且つ高精度な均一測定法であり、従来困難であった標的核酸とプローブとの間のミスマッチによって生じるＴｍの差に基づく遺伝子配列の差異の検出において、感度及び特異性を著しく向上させ得る技術を提供する。また、本発明は、その実施において必要とされる材料及び試薬類がすべて容易に入手でき、且つ極めて安価なものばかりであり、経済性に優れる検出技術を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
二本鎖ＤＮＡを特異的に消化するλエキソヌクレアーゼ （非特許文献１）やエキソヌクレアーゼＩＩＩ（特許文献１）を用いたサイクリングアッセイ法では、放射性物質を標識したオリゴヌクレオチドプローブが相補的な配列とハイブリダイズして形成された二本鎖ＤＮＡにエキソヌクレアーゼを作用させ、消化に伴って短くなったプローブが標的核酸から解離した後、新たなプローブがハイブリダイズし、さらにこれが消化される行程が繰り返されることによってサイクリング反応が成立する。該プローブの分解産物をオートラジオグラフィやシンチレーションカウンターなどで検出することにより、標的核酸の有無あるいは量の判定が可能であることが示されている。
【０００９】
さらに、放射性物質を用いないエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイの均一測定系が報告されている（特許文献２および３）。当該測定系は、蛍光物質及びクエンチング物質（クエンチャー）を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いたもので、プローブが消化を受けていないときは蛍光物質から発せられる蛍光エネルギーはクエンチャーによって吸収されているため、蛍光を発しないか微弱な蛍光しか発しない。プローブがエキソヌクレアーゼによって分解されると、蛍光物質がプローブから遊離してクエンチャーとの距離が広がり、蛍光エネルギーを吸収することができなくなる。その結果、蛍光物質がその固有の波長の蛍光を発するようになり、該蛍光を検出することによって、プローブの分解量を測定することができる。このような蛍光物質およびその蛍光エネルギーを効率的に吸収することのできるクエンチャーを標識物質として用いる手法は、一般的に蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）として公知である（非特許文献２）。
【００１０】
上記のように、エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイによって特定の標的配列を定量的に検出できることは公知であるが、エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイによって遺伝子多型の検出が可能なことは示されていない。本発明者は鋭意研究を重ねた結果、エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイの均一測定系によって、標的遺伝子上のわずか１塩基あるいは２塩基以上の塩基配列の差異を簡便、迅速、安価且つ高精度に識別できることを見出した。
【００１１】
プローブのハイブリダイゼーションの特異性を高めるには、プローブの塩基長は十分に長い方が好ましい。しかし、長鎖のプローブ、例えば２５塩基以上の長いプローブを用いた場合、該プローブと標的核酸との間のミスマッチ（以下、特に示さない限り「ミスマッチ」には非相補的な塩基対およびループ構造が含まれる）の有無を、ハイブリダイゼーションの有無で感度及び特異性良く区別することは概して困難である。なぜなら、長いプローブを用いた場合、ミスマッチのあるときとないときのＴｍの差（ΔＴｍ）は、それらをＢ／Ｆ分離のための洗浄条件の調整によって区別するにはあまりにも小さすぎるからである。本発明は、ハイブリダイゼーションに基づく方法でありながら、十分に長い、例えば２５塩基以上のプローブを用いることが可能であり、多型の存否に関わらず、標的となる核酸配列に非常に親和性の高いハイブリダイゼーションが可能である。さらに、条件によって変化するため一概には言えないが、エキソヌクレアーゼによる分解作用でプローブが短くなったときに多型を検出する場合、本発明は５〜１５塩基程度に短くなったときのミスマッチの有無によって生じるＴｍの差（ΔＴｍ）を利用しているため、全体のＴｍに占めるΔＴｍの割合が大きくなり、従来のより長いプローブを用いたハイブリダイゼーション法に比べて、多型識別の感度と特異性がともに高いことが特徴である。
［００１２］
また、本発明は、操作が簡便で、従来のハイブリダイゼーション法のように標的核酸とのミスマッチを有するプローブ、またはプローブとのミスマッチを有する標的核酸を除くための洗浄操作、いわゆるＢ／Ｆ分離の操作を必要としない。また、本発明は、遺伝子増幅法で増幅した産物を精製することなく、直ちにエキソムクレアーゼサイクリングアッセイに用いることができ、二本鎖ＤＮＡを披検資料としたときも変性操作を必要とせず、極めて迅速性と簡便性に優れる。さらに、本発明に必要な試薬は全て商業的に安価に入手可能なものであり、遺伝子解析で最も一般的に用いられる器具及び装置のみを必要とするため、極めて経済性と汎用性に優れるものである。
［００１３］
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の所定の部位との間で完全に相補的な塩基対を形成するときは、該オリゴヌクレオチドプローブが５’→３’エキソヌクレアーゼまたは３’→５’エキソヌクレアーゼによる消化を受けるため、標識物質を含むモノヌクレオチドが該オリゴヌクレオチドプローブから遊離して、その結果有意なシグナルの上昇が起こることを検出すること、および、標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の所定の部位との間で少なくとも１塩基以上の相補的でない塩基対を形成するとき、あるいは標的核酸における１塩基以上の挿入または欠損によってオリゴヌクレオチドプローブとの間でループ構造を形成するときに、該オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸とハイブリダイズしないため５’→３’エキソヌクレアーゼまたは３’→５’エキソヌクレアーゼによる消化を受けないか、ハイブリダイズした後５’→３’エキソヌクレアーゼまたは３’→５’エキソヌクレアーゼによる消化によって該オリゴヌクレオチドプローブに含まれる標識物質が遊離する前に、該オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸から離脱するために標識物質の遊離が起こらず、その結果有意なシグナルの上昇が起こらないことを検出することにより、標的核酸を、該標的核酸とは１塩基以上の置換または１塩基以上の挿入あるいは欠損を含む核酸と区別して検出する方法。
２．エキソヌクレアーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼであって、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の所定の部位との間で形成し得る少なくとも１塩基以上の相補的でない塩基対部分またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの３’末端と標識物質が標識された部位との間に位置するように設計された上記１に記載の方法。
３．エキソヌクレアーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼであって、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の所定の部位との間で形成し得る少なくとも１塩基以上の相補的でない塩基対部分またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの５’末端と標識物質が標識された部位との間に位置するように設計された上記１に記載の方法。
４．標識物質が蛍光物質であって、該蛍光物質が発する蛍光を有効に減弱する効果を有するクエンチング物質が蛍光物質の３’側に標識された上記２に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
５．標識物質がクエンチング物質であって、該クエンチング物質によって有効に蛍光が減弱され得る蛍光物質がクエンチング物質の３’側に標識された上記２に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
６．標識物質が蛍光物質であって、該蛍光物質が発する蛍光を有効に減弱する効果を有するクエンチング物質が蛍光物質の５’側に標識された上記３に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
７．標識物質がクエンチング物質であって、該クエンチング物質によって有効に蛍光が減弱され得る蛍光物質がクエンチング物質の５’側に標識された上記３に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
８．標識物質が標的ＤＮＡ中のグアニン、アデニン、チミン、シトシンのいずれかとワトソン―クリックの法則に従った塩基対を形成し得る蛍光性ヌクレオチドアナログである上記２または３に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
９．蛍光性ヌクレオチドアナログが２−アミノプリンである上記８に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
１０．５’→３’エキソヌクレアーゼがλエキソヌクレアーゼまたはＴ７ Ｇｅｎｅ６エキソヌクレアーゼである上記２に記載の方法。
１１．３’→５’エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼＩＩＩである上記３に記載の方法。
１２．エキソヌクレアーゼが耐熱性酵素である上記１から３のいずれか１に記載の方法。
１３．耐熱性酵素がＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓに由来する上記１２に記載の方法。
１４．ＲＮＡより逆転写反応により合成したｃＤＮＡ、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法）または逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法）にて増幅した産物を精製することなく被検試料として用いる上記１から３のいずれか１に記載の方法。
１５．オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸との間に相補的でない塩基対またはループ構造を形成させるために、一つ以上の塩基の置換、挿入または欠損を意図的に導入することによって、該標的核酸と、該標的核酸とは少なくとも１塩基以上の置換を含む核酸、または１塩基以上の挿入あるいは欠損を含む核酸との識別能力を向上させることのできる上記４から９のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドプローブを利用した上記１から３及び１０から１４のいずれか１に記載の方法。
１６．上記１から３及び１０から１５のいずれか１に記載の方法に使用する測定試薬またはキット。
［発明の効果］
［００１４］
本発明によれば、特定の塩基配列を有する標的核酸を、その標的核酸とは一塩基以上の置換、挿入あるいは欠損配列を有する核酸と区別して定量的に検出することが可能である。また、高価な試薬原料を必要としないためランニングコストが安価である。さらに、操作は極めて簡便で、ＰＣＲ反応後の産物の精製および変性操作も不要であり、シグナルのリアルタイム測定も可能であり、極めて迅速な検査方法を提供することができる。
［発明を実施するための最良の形態］
［００１５］
本発明は標的核酸配列を定量的に測定し、さらに標的核酸配列中の多型または変異を識別するための方法である。本発明は、標識物質を結合させたオリゴヌクレオチドプローブ（以下「プローブ」という）を標的核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションさせて、標的核酸配列中の多型部位または変異部位周辺の配列が、原則としてプローブ配列と完全に相補的である場合のみに、標的核酸に結合したプローブからエキソヌクレアーゼの作用によって標識物質が遊離することによりシグナルが得られる機構を利用している。
【００１６】
本発明の標識物質とは、シグナルの発生またはその制御に関わるものであり、より具体的には、蛍光を発する物質または別の物質が発する蛍光を減弱させる物質である。１分子のプローブＤＮＡは１個ないし２個の標識物質が含まれる。
【００１７】
１個の標識物質のみを用いる場合、標識物質として蛍光性のヌクレオチドアナログが使用できる。蛍光性のヌクレオチドアナログの中には、モノヌクレオチドのときは強い蛍光を発するが、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの中に含まれるときにはその蛍光が減弱され、さらに他の塩基とワトソン−クリックの法則に合致した塩基対を形成するものがある。そのようなヌクレオチドアナログとして、特にこれに限定されないが、２−アミノプリンを例示することができる。２−アミノプリンはアデニンと置き換えることによってチミンと塩基対を形成し、さらに２−アミノプリンを含む核酸はエキソヌクレアーゼの基質となり得る（非特許文献３）。したがって、２−アミノプリンを含むプローブを用いてエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイを行うと、標的核酸と結合した２−アミノプリンを含むプローブがエキソヌクレアーゼによって分解され、プローブから遊離した２−アミノプリンが発する蛍光を検出することによって、特定核酸配列の均一測定が可能となる。
【００１８】
２個の標識物質を用いる場合、標識物質として蛍光物質及びその蛍光を有効に減弱させる性質を有する物質（以下、クエンチャー）が使用できる。蛍光物質およびその蛍光を有効に減弱させるクエンチャーの組み合わせは、このような機能を有する組み合わせであればよく、さらにプローブＤＮＡと標的核酸とのハイブリダイゼーション及びエキソヌクレアーゼによる消化を実質的に妨害しないものであれば特に限定されない。具体的にはｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ユウロピウムなどの蛍光性物質とその蛍光波長と一致した吸収波長、もしくは近傍に吸収波長を有している、より長波長の蛍光を発する別の蛍光性物質がクエンチャーとして組み合わせて用いられることは、一般的に蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）として公知である（非特許文献２）。また、吸収エネルギーを蛍光ではなく熱として放出する非蛍光性の物質をクエンチャーとして使用することもできる。これらはダーククエンチャーと呼ばれ、蛍光の減弱効率に優れるものが多い。具体的にはＤａｂｃｙｌ、ＥｃｌｉｐｓｅやＢＨＱ（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を例示することができる。
【００１９】
２個の標識物質のうち、エキソヌクレアーゼ反応によってプローブから遊離させられるものは蛍光物質またはクエンチャーのいずれでもよい。ただし、いずれの場合もプローブ上で蛍光物質の蛍光を有効に減弱するようにクエンチャーを配置させ、蛍光物質またはクエンチャーのいずれか一方がプローブから遊離した場合に、それを蛍光強度の上昇として検出できようにする必要がある。
【００２０】
プローブとして利用される一本鎖ＤＮＡは、一般的にはアミダイト法で有機化学的に合成される（非特許文献４）。蛍光物質及びクエンチャー標識プローブも、各標識アミダイト試薬と自動合成装置を用いて容易に合成されることは当業者に広く知られるところである。また、アミノ化を施したアミダイト試薬を用いてＤＮＡを合成した後に、スクシンイミドなどの活性エステルを導入した標識物質とカップリングさせることもできる。これらの方法による標識ＤＮＡは、商業的サービスを利用して入手することができる。
【００２１】
１個ないし２個の標識物質を用いるいずれの場合においても、標的核酸中の特定領域の配列がプローブ配列と完全に相補的である場合のみ標識物質（２個の標識物質を用いる場合は少なくともいずれか一方の標識物質）がエキソヌクレアーゼの作用によって遊離する（図１左）。また、標的核酸配列の特定領域に存在する多型または変異によってプローブ配列と一塩基または二塩基以上のミスマッチ、またはループ構造を形成する場合には、標的核酸とプローブのＴｍが完全に相補的な場合より低くなるため、プローブが標的核酸にハイブリダイズすることができない（図１右）。あるいは、ハイブリダイズした後にエキソヌクレアーゼによる分解に伴ってプローブの鎖長が短くなると、Ｔｍの低下によって標的核酸とプローブが二本鎖を維持できなくなり、エキソヌクレアーゼが標識物質を遊離する前にプローブが標的核酸から離脱し、その結果、蛍光の発生がないか、あるいは最小限となる（図１中央）。本発明の方法は、これらのことを利用して標的核酸中の多型または変異を識別することを特徴としている。
【００２２】
プローブの設計は、エキソヌクレアーゼが５´→３´エキソヌクレアーゼの場合には、第一標識物質（以下、２個の標識物質のうち、エキソヌクレアーゼ反応によってプローブから最初に遊離される標識物質を「第一標識物質」と呼ぶ。プローブが１個の標識物質のみを含む場合は、「第一標識物質」とはその標識物質を表す）の標識部位とプローブの３´末端と間に標的核酸の多型または変異部位が相当するように行う。一方、エキソヌクレアーゼが３´→５´エキソヌクレアーゼの場合には、第一標識物質の標識部位とプローブの５´末端との間に標的核酸の多型または変異部位が相当するように行う。
【００２３】
プローブと標的核酸のハイブリッド中のミスマッチがプローブの末端近傍に存在している場合、ミスマッチがプローブの中央付近に存在するときに比べて、ミスマッチが標的核酸とプローブのハイブリッドの安定性に及ぼす影響が少ない。したがって、プローブの鎖長を十分に長くすればミスマッチの有無に関わらずプローブを標的核酸に効率的にハイブリダイズさせることができる。次いで、標的核酸にハイブリダイズしたプローブがエキソヌクレアーゼの作用による分解で短縮されるにしたがってＴｍが下がり、ハイブリッド形成が不安定となる。その際に、プローブと標的核酸との間に一塩基以上のミスマッチがあると、ミスマッチがない場合と比較してさらにＴｍが小さくなり、ハイブリッドの安定性がさらに低下する。その結果、エキソヌクレアーゼが第一標識物質を遊離させる前にプローブが標的核酸から離脱することになる（図１）。
【００２４】
第一標識物質の標識部位は、エキソヌクレアーゼによって短縮されたプローブの残存部が標的核酸から離脱するときの鎖長を考慮して決定されなければならない。すなわち、プローブの残存部と標的核酸の間にミスマッチがない場合、エキソヌクレアーゼによって第一標識物質が遊離された後にプローブの残存部が標的核酸から離脱する。また、ミスマッチがある場合、第一標識物質が遊離される前にプローブの残存部が標的核酸から離脱するか、あるいはプローブが全くハイブリダイズしない。その結果として第一標識物質が遊離しないよう、第一標識物質の標識部位を決定する必要がある。
【００２５】
標的核酸に完全に相補的なプローブが標的核酸から離脱する際の鎖長は、プローブ残存部の塩基組成、反応温度、溶液のｐＨ、塩濃度の影響を受ける。一般に、グアニンとシトシンの含量が高く、反応温度が低く、ｐＨが低く、また塩濃度が高いほど、標的核酸から離脱する際の鎖長は短くなる。そのため、これに限定されないが、本技術の一般的な実施条件の範囲内（反応温度が２５℃〜４５℃、ｐＨが７．０〜１０．０、塩濃度が１０ｍＭ〜２００ｍＭ）では、プローブＤＮＡが標的ＤＮＡから離脱するときの鎖長は、５〜１５塩基程度である。したがって、第一標識物質のプローブ上の標識部位は、エキソヌクレアーゼが５´→３´エキソヌクレアーゼの場合は３´末端から数えて６塩基目から１６塩基目、エキソヌクレアーゼが３´→５´エキソヌクレアーゼの場合は５´末端から数えて６塩基目から１６塩基目のヌクレオチドに標識するのが好適である。そして、プローブと標的核酸の間にミスマッチが存在する場合、プローブが標的核酸から離脱するときの鎖長が、ミスマッチの存在しない場合に離脱するときの鎖長より有意に長くなるように反応条件を設定する必要がある。
【００２６】
しかしながら、多型の存在する部位周辺の塩基配列によっては、エキソヌクレアーゼによって分解を受けたプローブが標的核酸から離脱するときの長さが、ミスマッチのある場合とない場合とで顕著に変化しないこともある。特に、ＧＣ含量の高い領域の場合、比較的Ｔｍが高くなるため、わずか１塩基のミスマッチが存在してもΔＴｍの影響は概して大きくないことが多い。また、ミスマッチ塩基対の中でも、Ｇ／Ｇペア及びＧ／Ｔペアの水素結合は他のミスマッチ塩基対に対して比較的安定であり（非特許文献５）、ＧＣ含量の高い領域内の該ミスマッチ塩基対をΔＴｍによって識別することは、従来のハイブリダイゼーションを基盤とした方法でも概して困難である。そのような場合には、標的核酸との間に別のミスマッチを生じさせるように、意図的にプローブの一部の塩基を置換、挿入または欠損させることで改善できる。人為的ミスマッチの導入部位及び導入の仕方（置換、挿入または欠損させる塩基の種類など）は、標的核酸の多型に由来するミスマッチのあるときとないときで、エキソヌクレアーゼによって消化を受けたプローブの残存部が標的核酸から離脱するときの長さに有意な差を生じればよく、特に限定されない。例えば、ＧＣ含量の高い領域において一部のＧ／Ｃ塩基対をＧ／Ｇ、Ｇ／ＴまたはＧ／Ａミスマッチとなるようにプローブの塩基を置換することで、多型存在部位周辺のプローブと標的核酸のＴｍを下げ、ミスマッチの有無によるΔＴｍの差の影響を大きくすることができる。また、このようなプローブへの人為的ミスマッチの導入によって、多型部位と完全にマッチしたときだけプローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、マッチしないときにはハイブリダイズさせないようにすることも可能である。
【００２７】
本発明の利点の一つは、ハイブリダイゼーションを基盤にした多型または変異の検出方法でありながら、使用するプローブの鎖長に特に制限がないことである。例えば、４種類の塩基からランダムな順列組合せで作製される１６塩基長のプローブは約４３億通りある。したがって、ヒトの塩基数は約３０億塩基対であるので、ヒトのゲノムに対して特異性の高いプローブを作製するには１６塩基以上の鎖長が必要であり、高い特異性が要求されるハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法では、２０〜３０塩基長のプローブやプライマーが用いられるのが一般的である。しかし、従来のハイブリダイゼーションの後に洗浄によるＢ／Ｆ分離によって塩基の差異を識別する方法では、プローブ長に制限がある。すなわち、プローブの鎖長が長くなるほどマッチのＴｍに対するΔＴｍの占める割合が小さくなり、ミスマッチとの識別が困難となるため、できる限りプローブは短い方が好ましい。しかし、前述した通り、Ｔｍに対するΔＴｍの占める割合を大きくするためにプローブの鎖長を短くすると、標的核酸に対する特異性と親和性が低下するという問題が生じる。
【００２８】
本発明によれば、プローブの鎖長は、エキソヌクレアーゼの作用によって標的配列特異的に遊離させることのできるシグナル発生物質、すなわち第一標識物質をプローブ上の好適な部位に標識できる最小限の鎖長を確保している限りその長さに特に制限はない。したがって、ゲノムサイズの大きな生物を解析対象とする場合も、プローブの塩基長を長くすることによって、十分な特異性と親和性を確保することができる。一般的な合成装置では１００塩基以上のオリゴマーＤＮＡの作製も可能であるが、鎖長が長くなるほど完全長のＤＮＡの合成効率が下がるため、過剰に長鎖のプローブを使用することは経済上有利ではない。また、鎖長が長くなることによって、エキソヌクレアーゼによる消化に時間を要し、サイクリング反応が効率的に行われなくなる恐れがある。したがって、本発明の方法では、１８塩基から５０塩基ほどのプローブが好適に使用されるが、この範囲外でも使用可能である。
【００２９】
プローブにおける第二標識物質（以下、プローブに２個の標識物質が含まれる場合に、第一標識物質と対を成してＦＲＥＴ現象を成立させるもう一つの標識物質を「第二標識物質」と呼称する）の標識部位は、エキソヌクレアーゼによって第一標識物質より先に遊離されず、且つ第一標識物質の蛍光を有効に減弱することができれば特に限定されない。例えば、エキソヌクレアーゼが５´→３´エキソヌクレアーゼの場合は３´末端に、エキソヌクレアーゼが３´→５´エキソヌクレアーゼの場合は５´末端に第二標識物質を標識したプローブを使用することができる。
【００３０】
ただし、第一標識物質と第二標識物質の距離が離れると、クエンチャーによる蛍光の減弱効果が弱まり、バックグラウンドの蛍光シグナルが増大することがある。そのような場合には、両標識物質の距離を短くするために第二標識物質をプローブの鎖内に標識することも可能である。すなわち、エキソヌクレアーゼが５´→３´エキソヌクレアーゼの場合には３´末端と第一標識物質の間のヌクレオチドに、エキソヌクレアーゼが３´→５´エキソヌクレアーゼの場合には５´末端と第一標識物質の間のヌクレオチドに鎖内標識することが可能である。このことにより、第二標識物質が第一標識物質より先にエキソヌクレアーゼによって遊離されることはなく、また両標識物質の距離の短縮によりクエンチング効果を向上させ、バックグラウンド・シグナルを低減させることができる。
【００３１】
核酸配列の検出法において使用されるエキソヌクレアーゼとしては、標的核酸にハイブリダイズしたプローブ中の第一標識物質が標識されたヌクレオチドを該プローブＤＮＡ鎖から遊離することのできるものであれば良く、特に限定されない。例えば、５´エキソヌクレアーゼとしてλエキソヌクレアーゼ、Ｔ７ Ｇｅｎｅ６ エキソヌクレアーゼを挙げることができる。また、３´エキソヌクレアーゼとして大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩを挙げることができる。これらはいずれも商業的に入手可能である。また、エキソヌクレアーゼによっては蛍光物質またはクエンチャーの標識による立体障害によって、標識部位のヌクレオチドを遊離できない可能性がある。しかしながら、そのような場合でも蛍光性ヌクレオチドアナログを標識物質として用いれば、いかなるエキソヌクレアーゼの基質ともなり得るので、効果的にプローブから遊離させることができる。
【００３２】
本発明による方法において完全マッチとミスマッチとの判別が困難な場合、より高い温度で反応させて、ミスマッチを含む標的核酸とプローブとのハイブリッド形成を不安定化することにより、完全マッチとミスマッチとの判別を容易にすることができる。例えば、３７℃の反応で完全マッチとミスマッチとの間で十分なシグナル差あるいはＳ／Ｎ比が確保できない場合は、例えば３７℃から４５℃までの間で反応を行うことで改善できることがある。しかし、一般の酵素は３７℃付近が至適反応温度であり、それ以上温度を上昇させると酵素活性そのものが低下することにより十分なシグナルが得られなくなることがある。そのような場合、より至適反応温度の高い耐熱性酵素を使用することが好ましい。例えば、好熱性細菌のＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ａｆｕ）から二本鎖ＤＮＡ特異的３´→５´エキソヌクレアーゼが単離されている（特許文献４）。このような耐熱性エキソヌクレアーゼの利用によって、本発明における反応温度の設定範囲を拡大し、種々の配列のターゲットについてより好適な反応条件の設定を可能にすることができる。
【００３３】
さらに、本発明の実施条件について詳細に説明するが、これらは例示的に示すものであり、限定されるものではない。
【００３４】
検体としては、使用されるエキソヌクレアーゼの基質となり得る核酸であり、例示したλエキソヌクレアーゼ、Ｔ７ Ｇｅｎｅ６ エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ａｆｕ由来３´→５´エキソヌクレアーゼの場合にはＤＮＡが使用される。生物試料から抽出されたＤＮＡを直接用いることもできるが、解析に用いるには量が不十分なことが多い。そのような場合には、生物試料から抽出された核酸をＰＣＲ法などによって増幅したＤＮＡ産物を本発明による遺伝子変異解析に用いることができる。また、逆転写反応後にＤＮＡとして増幅する技術（ＲＴ−ＰＣＲなど）によってＲＮＡをＤＮＡに変換して増幅することができ、そのような増幅産物を解析することもできる。
【００３５】
ＰＣＲ法以外では、ＬＡＭＰ法（非特許文献６）、ＩＣＡＮ法（非特許文献７）、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ法（非特許文献８）などで増幅されたＤＮＡも本発明の方法の検体として使用できる。これらの方法による増幅産物のように末端を有する直鎖状ＤＮＡであれば、当該ＤＮＡとハイブリダイズしたプローブがエキソヌクレアーゼの基質となり得るからである。また、標的核酸が環状であっても、エキソヌクレアーゼＩＩＩなどは環状一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを基質とし得るので、本発明による方法にサンプルとして使用できる。増幅された核酸以外では、ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを使用できる。逆転写反応後はＲＮＡとｃＤＮＡのハイブリッドが得られる。したがって変性操作の後にプローブのハイブリダイゼーションを行うか、あるいはＲＮａｓｅＨによってＲＮＡのみを分解することで一本鎖のｃＤＮＡを得て当該ｃＤＮＡにプローブをハイブリダイズさせることにより、エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイを実施することが可能であり、ＲＮＡの定量的検出と多型解析が可能である。また、エキソヌクレアーゼＩＩＩはＲＮａｓｅＨ活性を有するので、特に別のＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を作用させることなしにエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイを実施することも可能である。
【００３６】
サンガー法による塩基配列決定法やミニシークエンス法などのように、酵素反応を利用した多型解析法の多くが、ＰＣＲなどによる増幅産物を検体とする場合には、残存する酵素、プライマー、デオキシヌクレオチド、塩類、あるいはｐＨなどの影響を受けることがある。これらの影響を除くために増幅産物の精製が不可欠である場合が多く、これらの方法の操作は非常に煩雑となっている。本発明では、反応液成分の過剰な持込によってエキソヌクレアーゼ反応やプローブのハイブリダイゼーションが著しく阻害されない範囲に限って、ＰＣＲ産物や逆転写反応産物の精製を行うことなく解析に使用することができるため、極めて簡便且つ迅速である。
【００３７】
本発明における標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーションは、通常は該標的核酸が二本鎖ＤＮＡの場合は変性により一本鎖とした後に行われる。該標的核酸が一本鎖であれば変性の必要はなく、そのままプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションさせることが可能である。本発明における変性の方法は通常行われる方法に従えば良い。例えば熱変性によるものと化学的変性によるものが例示される。具体的な方法として、熱変性による方法は、通常９０℃以上に加熱することにより行われる。好ましくは、９４℃〜９８℃で約１〜５分間加熱することにより変性が行われる。化学的変性による方法は尿素、ホルムアルデヒド等の変性剤の作用により、またはｐＨを上昇させることにより行われる。ｐＨは０．１〜１ｍｏｌ／ｌ ＮａＯＨを用いることにより上昇させることができるが、操作の簡便性などの点からから熱変性による方法が好適に用いられる。
【００３８】
ハイブリダイゼーションを行う場合、ハイブリダイゼーションの方法は通常行われる方法に従えば良いが、その条件はプローブ又は変性標的核酸の鎖長、塩基配列、Ｔｍにより異なる。一般的にはｐＨ６．５〜９．５で、１０〜１０００ｍＭのナトリウムまたはカリウムイオン存在下にて室温〜７０℃の温度下でハイブリダイゼーションが行われる。ただし、過剰のナトリウムまたはカリウムイオン存在下ではエキソヌクレアーゼ活性が阻害されることがあるため、１０〜１０００ｍＭの範囲内で十分なシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を得るような条件を見出す必要がある。
【００３９】
エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法に使用するエキソヌクレアーゼの作用によって、標的核酸であるＰＣＲ産物などの直鎖状二本鎖ＤＮＡの標的配列部位が一本鎖化される場合は、必ずしも変性操作を必要としない。例えば、３´→５´エキソヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いた場合、標的ＰＣＲ産物はエキソヌクレアーゼＩＩＩの触媒活性によって両鎖の３´末端からの消化を受け、部分的に一本鎖となる。この一本鎖化された領域を標的配列としたプローブを用いれば、変性操作を行うことなく、該ＰＣＲ産物にエキソヌクレアーゼＩＩＩ及びプローブを含んだ試薬を添加して、一定温度で反応を実施するだけでエキソヌクレアーゼサイクリング反応が成立することから、本発明の方法は簡便性及び迅速性の点で大いに利点がある。
【００４０】
他のエキソヌクレアーゼ、例えばλエキソヌクレアーゼを用いる場合、ＰＣＲプライマーの一方のみを５´末端リン酸化したプライマーセットで増幅したＤＮＡを標的核酸として用いれば、λエキソヌクレアーゼによって５´末端がリン酸化された鎖のみが消化され、リン酸化されていない鎖が残り、その結果、標的ＤＮＡは一本鎖化される。当該一本鎖ＤＮＡに対して相補的な配列を有し、５´末端がリン酸化されたプローブを用いれば、やはり変性操作を行うことなくλエキソヌクレアーゼを利用したエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイが可能となる。このように、本発明によればエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイを完全に一定の温度で実施することが可能であり、複雑な温度制御を行う機器を必要としない。
【００４１】
例示したエキソヌクレアーゼのうち、λエキソヌクレアーゼ、Ｔ７ Ｇｅｎｅ６ エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩを使用する場合、２５℃〜４５℃の間で反応を行うのが好適である。一般的にはこれらいずれの酵素も３７℃で使用されることが多いが、本発明によりミスマッチを識別する場合には、マッチとミスマッチのシグナル比が十分大きくなるように反応温度が設定されるので、必ずしも３７℃が好適とは限らない。しかし、これらの酵素を３７℃以上で使用すると、反応温度の上昇に伴って酵素活性は低下するため、過剰に高い温度、例えば５０℃以上の温度でサイクリングアッセイを行う場合には適さない。このような場合には、耐熱性の酵素を用いるのが好ましい。耐熱性のエキソヌクレアーゼとしては、Ａｆｕ由来の３´→５´エキソヌクレアーゼ（特許文献４）が報告されており、このような酵素を用いることで、より高温、すなわち５０℃以上でも好適なエキソヌクレアーゼサイクリング反応を実施することが可能となる。
【００４２】
酵素濃度とプローブ濃度は、標的核酸特異的なシグナル及びバックグラウンド・シグナルの両方に影響を及ぼす。好適な酵素濃度とプローブ濃度の組合せは、酵素の種類、使用される標的核酸及びプローブの配列毎に異なり、それぞれの場合において高いＳ／Ｎ比を得るような条件を見出す必要がある。
【００４３】
ＦＲＥＴの場合の蛍光の検出条件として、例えばプローブの５´末端にＤａｂｃｙｌ修飾、鎖内にＦＩＴＣ修飾の場合、３´→５´エキソヌクレアーゼの作用によりプローブが３´末端より分解されるに伴って発せられる蛍光は、最大励起波長４９４ｎｍ、最大蛍光波長５１８ｎｍの条件で蛍光光度計を用いて検出される。本発明による方法は、操作が簡便であるために、自動化システムの構築も容易である。特にハイスループットなシステムを構築するには、マイクロプレートを用いるのが便利である。マイクロプレートを用いた場合の蛍光の検出には、マイクロプレートに対応した蛍光測定装置が使用される。このような装置としては、特に限定されないが、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ Ｓｅｒｉｅｓ ４０００（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）やＷａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマーライフサイエンス社）などを例示することができる。このような装置を使用する場合、励起波長及び蛍光測定波長の選択は、装置に装備されたフィルターの種類によって限定されるが、蛍光物質の励起及び蛍光波長から適切なフィルターを選択して使用する。例えば、Ｗａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒの場合、４８５ｎｍの励起用フィルターと５３５ｎｍの蛍光測定用フィルターを使用して、好適に測定することができる。
【００４４】
エキソヌクレアーゼによるプローブの分解によって生じるシグナルは、プローブのサイクル反応によって増幅され、反応の進行中にそのシグナルの推移を測定することが可能であり、適切な反応時間を選択することにより、再現性並びに定量性の向上及び測定時間の短縮が図れる。反応時間は数秒から６０分の間が好ましい。シグナルのリアルタイムモニターについては、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、それぞれの装置に対応した蛍光物質を標識したプローブを用いて実施できる。リアルタイムＰＣＲ装置としては、ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ社）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）、Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍ（宝バイオ社）などが挙げられる。これらの装置は、いずれも４℃から１００℃の間での厳密な反応温度の制御が可能であり、さらに種々の波長の蛍光測定に対応しており、本発明において好適に使用される。
【００４５】
さらに本発明によれば、特定部位の多型だけでなく、連続する数塩基の領域に存在する１個または複数の変異を識別することができる。例えば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子は、１２番目のコドン（ＧＧＴ）にアミノ酸置換、特にグリシンからバリン、アスパラギン酸あるいはアルギニンへの置換を伴う変異が生じた場合に発癌遺伝子として働くことが知られている。Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異は大腸癌の約４０％、肺癌の約２０％、膵癌の約８０〜９０％で検出されており、臨床検体からの検査にも利用されている。コドン１２の３番目の塩基であるチミンは、他のいずれの塩基に置き換わってもアミノ酸の置換はないが、１番目及び２番目の塩基はいずれの塩基に換わってもアミノ酸の置換を伴う。したがって、部位特異的な一塩基多型検査技術を利用した場合、野生型配列に加えて１番目及び２番目の塩基置換に対応した計７組のプローブを用意することが不可欠である。しかし、本発明によれば、連続する３塩基以上の領域のいずれかに塩基置換があった場合においても蛍光強度の著しい低下を引き起こし、特定の配列との区別を可能としており、一塩基多型のみならず癌関連遺伝子の変異検出にも有効である。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４７】
実施例１
（１）標的核酸の調製
ヒトゲノムＤＮＡからＫ−ｒａｓ遺伝子の一部をＰＣＲにて増幅した産物を標的核酸とした。上流及び下流プライマーの配列は以下の通りである。なお、以下に示す全てのオリゴマーＤＮＡの合成は、日本バイオサービスに依頼した。
【００４８】
配列番号１：ＧＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧ
配列番号２：ＣＣＴＣＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣ
ＰＣＲの条件は、１．２５ＵのＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝バイオ）、１Ｘ Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液（宝バイオ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２００ｎＭの各プライマー、１０〜１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを含む５０μｌの反応液を調製し、９４℃／２０秒、５５℃／２０秒、７２℃／２０秒のサイクル反応を４０回行った。また、ヒトゲノムＤＮＡを含まない反応液で同様にサイクル反応を行い、陰性コントロールとした。
【００４９】
（２）プローブＤＮＡ
５´末端にＤａｂｃｙｌ、鎖内にＦＩＴＣを標識したプローブの配列は、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の一部の塩基配列を有しており、以下の通りである。ただし、配列中の“Ｚ”はＦＩＴＣ標識デオキシチミジン（ＦＩＴＣ−ｄＴ）を表す。
【００５０】
配列番号３：５´−ＧＣＴＣＣＡＡＣＺＡＣＣＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡＧＴＣ
【００５１】
（３）エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ
上記（１）のＫ−ｒａｓ遺伝子の増幅産物をＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）で定量した後、陰性コントロールで２倍段階希釈を行った。この２倍希釈系列及び陰性検体を、配列番号３によって示された配列を有し、５´末端にＤａｂｃｙｌが標識されたプローブを用いてエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法で測定を行った。すなわち、２Ｘ エキソヌクレアーゼＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、７５ｍＭ ＮａＣｌ、７５０ｎＭプローブＤＮＡ、２μｌの検体ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）を含む１０μｌの反応液を調製し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ（エッペンドルフ社）を用いて９５℃で２分間加熱した後、３７℃で５秒間加温した。直ちに１０μｌの１．３５Ｕ／μｌ エキソヌクレアーゼＩＩＩを添加して３７℃にてさらに３０分間保温した。次いで７０℃にて１０分間加温して酵素を失活させた後、３０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加え、全量を蛍光測定用の９６穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に移し、プレートリーダーＷａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマーライフサイエンス社）にて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光を測定した。
【００５２】
その結果、図２に示した通り、その標準曲線は非常に直線性に優れ、最低検出感度は３ｆｍｏｌ／ａｓｓａｙ以下であった。
【００５３】
実施例２
（１）変性操作工程の有無
上記実施例１（３）で示した方法では、エキソヌクレアーゼの添加の前に、標的二本鎖ＤＮＡの熱変性の工程が含まれている。この工程が必須であるか検証するため、上記実施例１（１）で調製した１７０ｆｍｏｌのＫ−ｒａｓ ＰＣＲ産物と陰性検体を上記実施例１（３）の熱変性の工程を含む方法と熱変性の工程を含まない方法とで比較した。熱変性の工程を含まない方法は、１Ｘ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、３７．５ｍＭ ＮａＣｌ、３７５ｎＭプローブ、２μｌの検体ＤＮＡ（１７０ｆｍｏｌのＰＣＲ反応液）及び０．６７５Ｕ／μｌのエキソヌクレアーゼＩＩＩを含む２０μｌの反応液を調製し、３７℃にて３０分間保温した後、さらに７０℃で１０分間加温して酵素を失活させ、プレートリーダーＷａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマーライフサイエンス社）にて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光を測定することによって実施した。その結果、図３に示した通り、熱変性の工程を含まない方法では、標的核酸を含まないＰＣＲ反応液のシグナル及び１７０ｆｍｏｌの標的配列を含むＰＣＲ反応液のシグナルともに、熱変性の工程を含む方法によるシグナルとほぼ同程度であった。このことから、熱変性の工程は必須でないことが分かった。
【００５４】
実施例３
（１）合成標的核酸
エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法の一塩基の置換を識別する能力を検証するため、標的核酸として１３種の化学合成ＤＮＡを用いた。各化学合成標的ＤＮＡの塩基配列は以下の通りである。
【００５５】
配列番号４：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号５：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号６：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＴＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号７：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号８：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号９：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号１０：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号１１：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＣＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号１２：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＴＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号１３：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＴＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号１４：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＣＧＣＴＴＧＴ
配列番号１５：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＴ
配列番号１６：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＴＧＴ
【００５６】
ここで、配列番号４はヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の野生型の配列であり、配列番号３で示されたプローブＤＮＡの塩基配列と完全に相補的な配列を含む。一方、配列番号５から配列番号１６は配列番号４のいずれかの一塩基を他の塩基に置換したものであり、それぞれを配列番号３で示されたプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションさせた場合、形成された二本鎖ＤＮＡ中には一塩基のミスマッチを含む。それらのミスマッチの位置を図４に示した。図４において下線のある塩基は、配列番号３で示されたプローブＤＮＡとハイブリダイズしたときにミスマッチを形成する塩基である。
【００５７】
（２）合成標的核酸を用いた一塩基ミスマッチの検出
本発明による一塩基ミスマッチの識別能力を、合成標的核酸を用いて検証するため、以下のような条件でエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイを実施した。すなわち、１Ｘ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、３７．５ｍＭ ＮａＣｌ、３７５ｎＭプローブＤＮＡ、０．６７５Ｕ／μｌ エキソヌクレアーゼＩＩＩ（宝バイオ）、１００ｆｍｏｌ合成標的ＤＮＡまたはその代わりに精製水を含む２０μｌの反応液をＰＣＲ反応チューブに調製し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ（エッペンドルフ社）を用いて直ちに３７℃または４１℃にて３０分間加温した。酵素を失活させるため７０℃にて１０分間加熱した後、３０μｌのＴＥ緩衝液を加え、全量を蛍光測定用の９６穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に移し、プレートリーダーＷａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマーライフサイエンス社）にて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光を測定し、各合成標的核酸をサンプルとしたときの相対蛍光強度（ＲＦＵ）から精製水をサンプルとして測定したときのＲＦＵを減じた値（ΔＲＦＵ）を求めた。
【００５８】
その結果、３７℃での反応では、配列番号７及び９から１６で示された標的核酸において、配列番号４で示された完全マッチの標的核酸と比べてある程度のシグナルの低下が認められた（図５）。次いで、反応温度を４１℃とすると、配列番号９から１５で示された標的核酸で顕著なシグナルの低下が認められ、バックグラウンド・シグナル、すなわち標的核酸を含まないときとほぼ同程度のシグナルを示し、プローブとミスマッチを形成するこれらの標的核酸と、プローブと完全に相補的な配列を有する標的核酸とを明確に識別できることが示された（図６）。このことは、本発明によって、１箇所の特定の部位だけでなく、近傍の数塩基に渡る領域の遺伝子変異をも検出し得ることを示している。
【００５９】
実施例４
（１）合成標的核酸
エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法の一塩基以上の挿入又は欠損配列を識別する能力を検証するため、標的核酸として４種の化学合成ＤＮＡを用いた。各化学合成標的ＤＮＡの塩基配列は以下の通りである。
【００６０】
配列番号１７：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号１８：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号１９：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号２０：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
【００６１】
図７において、配列番号４はヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の野生型の配列であり、配列番号３で示されたプローブＤＮＡの塩基配列と完全に相補的な配列を含む。一方、配列番号１７から配列番号２０は、それぞれ配列番号４に一塩基又は三塩基の挿入又は欠損を含むものであり、それぞれを配列番号３で示されたプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションさせた場合、形成された二本鎖ＤＮＡのいずれかのＤＮＡ鎖がループ構造を形成する。図７においてハイフンで示した部分は塩基の欠損部分であり、下線を付した塩基は挿入配列である。
【００６２】
（２）合成標的核酸を用いた挿入及び欠損配列の検出
本発明による挿入及び欠損配列の識別能力を、合成標的核酸を用いて検証するため、以下のような条件でエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイを実施した。すなわち、１Ｘ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、３７．５ｍＭ ＮａＣｌ、３７５ｎＭプローブＤＮＡ、０．６７５Ｕ／μｌ エキソヌクレアーゼＩＩＩ（宝バイオ）、３００ｆｍｏｌ合成標的ＤＮＡまたは精製水を含む２０μｌの反応液を蛍光測定用ＰＣＲプレートに調製し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ（エッペンドルフ社）を用いて直ちに４１℃にて３０分間加温した。酵素を失活させるため７０℃にて１０分間加熱した後、３０μｌのＴＥ緩衝液を加え、全量を蛍光測定用の９６穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に移し、プレートリーダーＷａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマーライフサイエンス社）にて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光を測定し、各合成標的核酸をサンプルとしたときの相対蛍光強度（ＲＦＵ）から精製水をサンプルとして測定したときのＲＦＵを減じた値（ΔＲＦＵ）を求めた。
【００６３】
その結果、一塩基の置換を有する配列番号１１で示された合成標的ＤＮＡ及び挿入又は欠損を含む配列番号１７から２０で示されたいずれの合成標的ＤＮＡにおいても、配列番号４で示された合成標的核酸よりも顕著に低い蛍光強度が観察された（図８）。このことから、本発明による方法によって、特定の配列を有する標的核酸を、一塩基以上の挿入または欠損配列を有する標的核酸とも明確に識別して検出できることが示された。
【００６４】
実施例５
（１）ヒトアルデヒド脱水素酵素２遺伝子のＰＣＲ
化学合成したＤＮＡを標的核酸とした場合のみならず、実際の生体試料の多型解析が可能であることを示すため、ヒトのアルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）遺伝子の多型検出系を構築した。ＡＬＤＨ２遺伝子のエクソン１２には正常型の「Ｇ」と変異型「Ａ」の一塩基多型が存在する。この多型をエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法によって識別するため、ＡＬＤＨ２の遺伝子型が既知の検体ＤＮＡから、ＰＣＲによってこの多型部位を含む領域を増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は以下の通りである。
【００６５】
配列番号２１：ＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＧＣＧＡＧ
配列番号２２：ＧＣＣＣＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＣＣＡＡＴＣ
【００６６】
ＰＣＲの条件は、１Ｘ Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２００ｎＭの各プライマー、０．６２５ＵのＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝バイオ）、１０〜５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを含む２５μｌの反応液を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＡＢＩ社）を用いて、９４℃／２分の変性処理の後、９４℃／２０秒、６３℃／２０秒、７２℃／２０秒を４０サイクル、さらに７２℃／２分の伸長反応を行った。増幅の成否は、２％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色することによって確認した。
【００６７】
（２）エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法による野生型ＡＬＤＨ２遺伝子配列の特異的検出
１Ｘ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、４０ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｎＭプローブＤＮＡ、０．４Ｕ／μｌ エキソヌクレアーゼＩＩＩ（宝バイオ）、５μｌの上記ＰＣＲ反応液または精製水を含む２０μｌの反応液をＰＣＲ反応チューブに調製し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ（エッペンドルフ社）を用いて直ちに３７℃にて３０分間加温した。酵素を失活させるため７０℃にて１０分間加熱した後、３０μｌのＴＥ緩衝液を加え、全量を蛍光測定用の９６穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に移し、プレートリーダーＷａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマーライフサイエンス社）にて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光を測定した。このときに用いたプローブＤＮＡは正常型の「Ｇ」を有する標的核酸と完全マッチする配列からなり、その配列は以下の通りである。
【００６８】
配列番号２３：ＴＴＴＣＡＣＴＴＣＡＧＺＧＴＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣ
【００６９】
ここで、ＺはＦＩＴＣ標識ｄＴを示しており、該プローブの５´末端にはダーククエンチャーであるＤａｂｃｙｌが標識されている（図９）。その結果、Ａ／Ａ型では、Ｇ／Ｇ型及びＧ／Ａ型に比べて著しく低いＲＦＵ値を示した（図１０）。このことから、本発明による方法は、生体試料中の一塩基の置換の有無を明確に識別できることが示された。
【００７０】
実施例６
（１）人為的ミスマッチを導入したプローブ
ミスマッチ塩基対のうちでも、Ｇ／ＧやＧ／Ｔ塩基対は比較的水素結合が強く、そのため通常のハイブリダイゼーション法では、他のミスマッチ塩基対に比べて完全マッチの塩基対と区別して検出することは比較的困難である。本発明においても同様の傾向があるが、プローブ配列の一部を意図的に置換し、標的配列との間でミスマッチを形成するようにすることで、この問題を回避することができる。その一例を示すために変異型ＡＬＤＨ２に含まれる「Ａ」と野生型に含まれる「Ｇ」を識別して検出するための２種のプローブを以下に示す通り設計した。
【００７１】
配列番号２４：ＣＡＣＴＴＴＡＧＴＧＺＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＴＡ
配列番号２５：ＣＡＣＴＴＴＡＧＴＧＺＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＴＡ
【００７２】
ここで、ＺはＦＩＴＣ標識ｄＴを示しており、該プローブの５´末端にはダーククエンチャーであるＤａｂｃｙｌが標識されている。
【００７３】
また、標的核酸として野生型及び変異型ＡＬＤＨ２の配列からなる以下に示すオリゴマーＤＮＡを合成した。
【００７４】
配列番号２６：ＧＡＧＴＡＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧＴ
配列番号２７：ＧＡＧＴＡＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧＴ
【００７５】
これらのプローブと標的ＤＮＡの関係を図１１に示した。配列番号２４からなるプローブは配列番号２７からなる変異型標的ＤＮＡと完全に相補的であるが、配列番号２６からなる野生型標的ＤＮＡとは、多型部位でＧ／Ｔミスマッチ塩基対を形成する。一方、配列番号２５からなるプローブは、配列番号２４のＦＩＴＣ標識部位から３’側に数えて４番目の塩基をＣからＴに置換しており（下線）、野生型及び変異型標的ＤＮＡともにこの部位でミスマッチ塩基対を形成するように設計した。
【００７６】
（２）プローブへの人為的ミスマッチ導入による多型識別能の向上
これらのＤＮＡを用いて、１Ｘ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、４０ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｎＭプローブＤＮＡ、０．０５Ｕ／μｌエキソヌクレアーゼＩＩＩ（宝バイオ）、１００ｆｍｏｌの合成標的ＤＮＡを含む２０μｌの反応液を９６穴の蛍光測定用ＰＣＲプレートに調製し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ（エッペンドルフ社）を用いて直ちに３７℃にて３０分間加温し、次いで酵素を失活させるため７０℃にて５分間加熱した後、プレートリーダーＷａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマーライフサイエンス社）にて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光を測定した。また、盲検として標的ＤＮＡを添加せずに反応及び蛍光測定を行った。
【００７７】
その結果を図１２に示す。野生型配列に完全マッチするプローブを用いたときは、野生型及び変異型標的ＤＮＡに対するＲＦＵ値ともに盲検に比べて顕著に上昇し、シグナル値から両者を区別することは困難であった。しかしながら、人為的ミスマッチを導入したプローブを用いたときは、野生型及び変異型標的ＤＮＡに対するＲＦＵ値に顕著な差が認められ、一塩基多型の判別の特異性を向上させることができた。
【００７８】
実施例７
（１）生体試料のＡＬＤＨ２遺伝子型判定
ＡＬＤＨ２遺伝子の野生型及び変異型をそれぞれ特異的に検出するためのプローブのデザインを最適化し、それらを用いたエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイによる測定条件を至適化して、ヒト由来サンプルのＡＬＤＨ２遺伝子の遺伝子型判定を試みた。
【００７９】
２３検体のヒトゲノムＤＮＡ１〜５０ｎｇ及び陰性検体としてＤＮＡの代わりに精製水から、実施例５と同じ方法でＡＬＤＨ２遺伝子の多型存在部位を含む領域を増幅し、それぞれ５μｌをＡＬＤＨ２遺伝子の野生型検出系及び変異型検出系を用いてアッセイした。すなわち、４℃に保ったサーマルサイクラー上で蛍光測定用ＰＣＲプレートに１Ｘ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、４０ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｎＭのプローブＤＮＡ、５μｌのＰＣＲ産物、０．２Ｕ／μｌ（野生型検出系）または０．０３７５Ｕ／μｌ（変異型検出系）のエキソヌクレアーゼＩＩＩ（宝バイオ）を含む２０μｌの反応液を調製し、３７℃／３０分、次いで７０℃／５分間インキュベートし、プレートリーダーＷａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマーライフサイエンス社）にて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光を測定した。このとき用いた野生型及び変異型をそれぞれ特異的に検出するためのプローブの配列を配列番号２３および２５に示す。
【００８０】
野生型検出系のＲＦＵ値を横軸（Ｇアレル）、変異型検出系のＲＦＵ値を縦軸（Ａアレル）とし、各試料の蛍光シグナルの分布を示したのが図１３である。蛍光シグナルの分布は明確に３つのグループに分けられ、それぞれのグループがサンガー法で遺伝子型が決定されたＧ／Ｇホモ、Ｇ／Ａヘテロ、Ａ／Ａホモの３つの検体群と完全に一致した。このことから、本発明が実際の生体試料の遺伝子型判定において極めて有用であることが示された。
【００８１】
実施例８
（１）混合試料のアレル含有率の定量
ＡＬＤＨ２の遺伝子型がＧ／ＧホモのゲノムＤＮＡ及びＡ／ＡホモのゲノムＤＮＡを混合し、Ｇ／ＧホモのゲノムＤＮＡの含有率が１００％、７５％、５０％、２５％、０％となるように試料を調製した。これらの混合試料１０ｎｇを請求項５と同じ方法でＰＣＲを行った。それらのＰＣＲ産物５μｌを実施例７と同じ方法でＡＬＤＨ２遺伝子の野生型検出系及び変異型検出系を用いて２回ずつアッセイした。
【００８２】
その結果、混合比の異なるそれぞれの試料のシグナルはそれぞれに独立した分布を示し、それぞれのアレルの含有率を定量可能であることが示された（図１４）。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】遺伝子多型または遺伝子変異の均一測定を可能にするエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイの原理を示す図である。
【図２】エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイの均一測定系の標準曲線を示す図である。（実施例１）
【図３】エキソヌクレアーゼ添加前のＤＮＡの熱変性工程の有無による測定結果を示す図である。（実施例２）
【図４】プローブと合成標的核酸の配列を示す図である。（実施例３）
【図５】反応温度３７℃で実施したエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイの均一測定系によってミスマッチの検出を試みた結果を示す図である。（実施例３）
【図６】反応温度４１℃で実施したエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイの均一測定系によってミスマッチの検出を試みた結果を示す図である。（実施例３）
【図７】プローブと合成標的核酸の配列を示す図である。（実施例４）
【図８】エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイの均一測定系によって挿入及び欠損配列の検出を試みた結果を示す図である。（実施例４）
【図９】ＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型を含む領域の配列と野生型ＡＬＤＨ２遺伝子特異的プローブＤＮＡの配列を示す図である。（実施例５）
【図１０】エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイの均一測定系によるＡＬＤＨ２遺伝子の多型検出の結果を示す図である。（実施例５）
【図１１】プローブと合成標的核酸の配列を示す図である。（実施例６）
【図１２】エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイにおいて、人為的ミスマッチ導入プローブを用いることによって一塩基置換の検出の特異性の改善を試みた結果を示す図である。（実施例６）
【図１３】エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイによって、生体試料からＡＬＤＨ２の遺伝子型の判定を実施した結果を示す図である。（実施例７）
【図１４】ＡＬＤＨ２の遺伝子型が異なる２種のヒトゲノムＤＮＡを異なる比で混合して調製した試料を、エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイによってアッセイした結果を示す図である。（実施例８）
【０００１】
本発明は臨床医学、法医学、薬物化学、生化学、食品化学、農芸化学などの分野における、主として遺伝子解析方法に関するものであり、ゲノム遺伝子、ウイルス又は細菌等の遺伝子の変異又は多型の解析に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子多型（以下、「多型」）とは、全個体中１％以上の頻度で存在するゲノムの多様性のことであり、１塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）の他、１〜数十塩基の欠損もしくは挿入、数塩基〜数十塩基からなる繰り返し配列（マイクロサテライト）における繰り返し回数の違いなどが含まれる。
【０００３】
遺伝子配列の変異や多型を解析することは、臨床医学、法医学、薬物化学、生化学、食品化学、農芸化学などの多岐にわたる分野で重要である。ヒトの場合を挙げれば、遺伝子の変異（一般的には出現頻度が１％未満のものを指す）は、遺伝病、癌などと深く関わりのあることが示されているし、多型（一般的には出現頻度が１％以上のものを指す）は、疾患の発症リスク、薬剤感受性、薬剤代謝速度などとの関わりが示されている。また、ウイルスや細菌の場合、薬剤耐性、病原性などとの関わりのあることが知られている。さらに、個人及び個体識別や農産物の品種同定などにも利用される。
【０００４】
現在、遺伝子配列の変異や多型を最も精度よく解析するために、主にサンガー法による塩基配列の決定が行われている。近年では、塩基配列決定の手順の一部が自動化されているが、なお操作が煩雑であり、解析に長時間を要し、高価な装置と試薬とを必要とする。
【０００５】
より簡便、迅速、安価な多型解析の方法として、サンガー法による塩基配列決定以外の方法が開発されており、なかでもハイブリダイゼーションを基盤とした方法は広く利用されている一般的なものである。ハイブリダイゼーションを基盤とした方法は、主にマイクロプレート、メンブレン、ビーズ、スライドガラスなどの固相に、一般的には１５〜２５塩基長程度のプローブを固定させ、これに標的核酸をハイブリダイズさせることによってヘテロディプレックスを形成させる。そして、該ヘテロディプレックス中に塩基対のミスマッチのある場合とない場合との融解温度（以下、Ｔｍという）の差異（以下、ΔＴｍ）を利用し、ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション後の洗浄操作においてｐＨ、塩濃度、温度などを適切に調整することによって、ミスマッチのあるヘテロディプレックスのみを選択的に解離させ除去する、いわゆるＢ／Ｆ分離と呼ばれる手法に基づいている。この際、プローブの鎖長が長くなるとＴｍが高くなり、ΔＴｍが全体のＴｍに占める割合が小さくなるため、この微小なΔＴｍを利用してミスマッチのある標的核酸とミスマッチのない標的核酸とを洗浄条件の調整によって分離することが困難となる。また鎖長が短くなるとハイブリダイゼーションの特異性が低くなるだけでなく、全体のＴｍも低くなるため、プローブと標的核酸との結合の親和性も下がり、プローブが効率よくハイブリダイズしないことがある。そのため、たとえ穏やかな条件下でハイブリダイズさせたとしても、親和性が低いためにマッチした標的核酸とミスマッチのある標的核酸がともに除去されてしまい、結果としてマッチとミスマッチを区別することが困難となることが多い。
【０００６】
他の方法としては、被検ＤＮＡを鋳型として、プライマー伸長法によって一塩基または数塩基のヌクレオチドの取り込みを行い、鋳型ＤＮＡの配列に応じて取り込まれたヌクレオチドの種類を同定することによって多型を解析する、ミニシークエンスと呼ばれる方法がある。ミニシークエンス法では、しばしばＰＣＲによって増幅されたＤＮＡが鋳型として用いられるが、プライマー伸長を行う前に残存するＰＣＲプライマーやヌクレオチドの除去、反応液の交換などのためにＰＣＲ産物の精製が不可欠であり、操作が煩雑である。また、取り込まれたヌクレオチドの種類を同定するための最新の方法として質量分析法が使用されることがあるが、非常に高価な装置を必要とする。このように、ミニシークエンス法においては、経済性、迅速性の点での問題を指摘することができる。
【特許文献１】
特開平６−３２７４９９
【特許文献２】
国際公開公報ＷＯ２００２／０７７２８２
【特許文献３】
国際公開公報ＷＯ２００３／０３５８６４
【特許文献４】
国際公開公報ＷＯ０１／２３５８３
【非特許文献１】
ＢｉｏＴｅｃｎｉｑｕｅｓ，１３，８８８−８９２，１９９２
【非特許文献２】
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５８（２），７１９−７２６（１９６７）
【非特許文献３】
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，１０１５６−１０１６３（１９９８）
【非特許文献４】
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２２，１８５９（１９８１）
【非特許文献５】
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８、３４６８−３４７７（１９９９）
【非特許文献６】
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８，ｅ６３（２０００）
【非特許文献７】
臨床病理 ５０、５２８−５３２（２００２）
【非特許文献８】
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２（１０），４６４１−４６４５（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、エキソヌクレアーゼを用いた遺伝子配列の検査法に関して、簡便、迅速且つ高精度な均一測定法であり、従来困難であった標的核酸とプローブとの間のミスマッチによって生じるＴｍの差に基づく遺伝子配列の差異の検出において、感度及び特異性を著しく向上させ得る技術を提供する。また、本発明は、その実施において必要とされる材料及び試薬類がすべて容易に入手でき、且つ極めて安価なものばかりであり、経済性に優れる検出技術を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
二本鎖ＤＮＡを特異的に消化するλエキソヌクレアーゼ （非特許文献１）やエキソヌクレアーゼＩＩＩ（特許文献１）を用いたサイクリングアッセイ法では、放射性物質を標識したオリゴヌクレオチドプローブが相補的な配列とハイブリダイズして形成された二本鎖ＤＮＡにエキソヌクレアーゼを作用させ、消化に伴って短くなったプローブが標的核酸から解離した後、新たなプローブがハイブリダイズし、さらにこれが消化される行程が繰り返されることによってサイクリング反応が成立する。該プローブの分解産物をオートラジオグラフィやシンチレーションカウンターなどで検出することにより、標的核酸の有無あるいは量の判定が可能であることが示されている。
【０００９】
さらに、放射性物質を用いないエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイの均一測定系が報告されている（特許文献２および３）。当該測定系は、蛍光物質及びクエンチング物質（クエンチャー）を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いたもので、プローブが消化を受けていないときは蛍光物質から発せられる蛍光エネルギーはクエンチャーによって吸収されているため、蛍光を発しないか微弱な蛍光しか発しない。プローブがエキソヌクレアーゼによって分解されると、蛍光物質がプローブから遊離してクエンチャーとの距離が広がり、蛍光エネルギーを吸収することができなくなる。その結果、蛍光物質がその固有の波長の蛍光を発するようになり、該蛍光を検出することによって、プローブの分解量を測定することができる。このような蛍光物質およびその蛍光エネルギーを効率的に吸収することのできるクエンチャーを標識物質として用いる手法は、一般的に蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）として公知である（非特許文献２）。
【００１０】
上記のように、エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイによって特定の標的配列を定量的に検出できることは公知であるが、エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイによって遺伝子多型の検出が可能なことは示されていない。本発明者は鋭意研究を重ねた結果、エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイの均一測定系によって、標的遺伝子上のわずか１塩基あるいは２塩基以上の塩基配列の差異を簡便、迅速、安価且つ高精度に識別できることを見出した。
【００１１】
プローブのハイブリダイゼーションの特異性を高めるには、プローブの塩基長は十分に長い方が好ましい。しかし、長鎖のプローブ、例えば２５塩基以上の長いプローブを用いた場合、該プローブと標的核酸との間のミスマッチ（以下、特に示さない限り「ミスマッチ」には非相補的な塩基対およびループ構造が含まれる）の有無を、ハイブリダイゼーションの有無で感度及び特異性良く区別することは概して困難である。なぜなら、長いプローブを用いた場合、ミスマッチのあるときとないときのＴｍの差（ΔＴｍ）は、それらをＢ／Ｆ分離のための洗浄条件の調整によって区別するにはあまりにも小さすぎるからである。本発明は、ハイブリダイゼーションに基づく方法でありながら、十分に長い、例えば２５塩基以上のプローブを用いることが可能であり、多型の存否に関わらず、標的となる核酸配列に非常に親和性の高いハイブリダイゼーションが可能である。さらに、条件によって変化するため一概には言えないが、エキソヌクレアーゼによる分解作用でプローブが短くなったときに多型を検出する場合、本発明は５〜１５塩基程度に短くなったときのミスマッチの有無によって生じるＴｍの差（ΔＴｍ）を利用しているため、全体のＴｍに占めるΔＴｍの割合が大きくなり、従来のより長いプローブを用いたハイブリダイゼーション法に比べて、多型識別の感度と特異性がともに高いことが特徴である。
［００１２］
また、本発明は、操作が簡便で、従来のハイブリダイゼーション法のように標的核酸とのミスマッチを有するプローブ、またはプローブとのミスマッチを有する標的核酸を除くための洗浄操作、いわゆるＢ／Ｆ分離の操作を必要としない。また、本発明は、遺伝子増幅法で増幅した産物を精製することなく、直ちにエキソムクレアーゼサイクリングアッセイに用いることができ、二本鎖ＤＮＡを披検資料としたときも変性操作を必要とせず、極めて迅速性と簡便性に優れる。さらに、本発明に必要な試薬は全て商業的に安価に入手可能なものであり、遺伝子解析で最も一般的に用いられる器具及び装置のみを必要とするため、極めて経済性と汎用性に優れるものである。
［００１３］
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の所定の部位との間で完全に相補的な塩基対を形成するときは、該オリゴヌクレオチドプローブが５’→３’エキソヌクレアーゼまたは３’→５’エキソヌクレアーゼによる消化を受けるため、標識物質を含むモノヌクレオチドが該オリゴヌクレオチドプローブから遊離して、その結果有意なシグナルの上昇が起こることを検出すること、および、標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の所定の部位との間で少なくとも１塩基以上の相補的でない塩基対を形成するとき、あるいは標的核酸における１塩基以上の挿入または欠損によってオリゴヌクレオチドプローブとの間でループ構造を形成するときに、該オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸とハイブリダイズしないため５’→３’エキソヌクレアーゼまたは３’→５’エキソヌクレアーゼによる消化を受けないか、ハイブリダイズした後５’→３’エキソヌクレアーゼまたは３’→５’エキソヌクレアーゼによる消化によって該オリゴヌクレオチドプローブに含まれる標識物質が遊離する前に、該オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸から離脱するために標識物質の遊離が起こらず、その結果有意なシグナルの上昇が起こらないことを検出することにより、標的核酸を、該標的核酸とは１塩基以上の置換または１塩基以上の挿入あるいは欠損を含む核酸と区別して検出する方法。
２．エキソヌクレアーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼであって、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の所定の部位との間で形成し得る少なくとも１塩基以上の相補的でない塩基対部分またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの３’末端と標識物質が標識された部位との間に位置するように設計された上記１に記載の方法。
３．エキソヌクレアーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼであって、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の所定の部位との間で形成し得る少なくとも１塩基以上の相補的でない塩基対部分またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの５’末端と標識物質が標識された部位との間に位置するように設計された上記１に記載の方法。
４．標識物質が蛍光物質であって、該蛍光物質が発する蛍光を有効に減弱する効果を有するクエンチング物質が蛍光物質の３’側に標識された上記２に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
５．標識物質がクエンチング物質であって、該クエンチング物質によって有効に蛍光が減弱され得る蛍光物質がクエンチング物質の３’側に標識された上記２に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
６．標識物質が蛍光物質であって、該蛍光物質が発する蛍光を有効に減弱する効果を有するクエンチング物質が蛍光物質の５’側に標識された上記３に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
７．標識物質がクエンチング物質であって、該クエンチング物質によって有効に蛍光が減弱され得る蛍光物質がクエンチング物質の５’側に標識された上記３に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
８．標識物質が標的ＤＮＡ中のグアニン、アデニン、チミン、シトシンのいずれかとワトソン―クリックの法則に従った塩基対を形成し得る蛍光性ヌクレオチドアナログである上記２または３に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
９．蛍光性ヌクレオチドアナログが２−アミノプリンである上記８に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
１０．５’→３’エキソヌクレアーゼがλエキソヌクレアーゼまたはＴ７ Ｇｅｎｅ６エキソヌクレアーゼである上記２に記載の方法。
１１．３’→５’エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼＩＩＩである上記３に記載の方法。
１２．エキソヌクレアーゼが耐熱性酵素である上記１から３のいずれか１に記載の方法。
１３．耐熱性酵素がＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓに由来する上記１２に記載の方法。
１４．ＲＮＡより逆転写反応により合成したｃＤＮＡ、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法）または逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法）にて増幅した産物を精製することなく被検試料として用いる上記１から３のいずれか１に記載の方法。
１５．オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸との間に相補的でない塩基対またはループ構造を形成させるために、一つ以上の塩基の置換、挿入または欠損を意図的に導入することによって、該標的核酸と、該標的核酸とは少なくとも１塩基以上の置換を含む核酸、または１塩基以上の挿入あるいは欠損を含む核酸との識別能力を向上させることのできる上記４から９のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドプローブを利用した上記１から３及び１０から１４のいずれか１に記載の方法。
１６．上記１から３及び１０から１５のいずれか１に記載の方法に使用する測定試薬またはキット。
［発明の効果］
［００１４］
本発明によれば、特定の塩基配列を有する標的核酸を、その標的核酸とは一塩基以上の置換、挿入あるいは欠損配列を有する核酸と区別して定量的に検出することが可能である。また、高価な試薬原料を必要としないためランニングコストが安価である。さらに、操作は極めて簡便で、ＰＣＲ反応後の産物の精製および変性操作も不要であり、シグナルのリアルタイム測定も可能であり、極めて迅速な検査方法を提供することができる。
［発明を実施するための最良の形態］
［００１５］
本発明は標的核酸配列を定量的に測定し、さらに標的核酸配列中の多型または変異を識別するための方法である。本発明は、標識物質を結合させたオリゴヌクレオチドプローブ（以下「プローブ」という）を標的核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションさせて、標的核酸配列中の多型部位または変異部位周辺の配列が、原則としてプローブ配列と完全に相補的である場合のみに、標的核酸に結合したプローブからエキソヌクレアーゼの作用によって標識物質が遊離することによりシグナルが得られる機構を利用している。
【００１６】
本発明の標識物質とは、シグナルの発生またはその制御に関わるものであり、より具体的には、蛍光を発する物質または別の物質が発する蛍光を減弱させる物質である。１分子のプローブＤＮＡは１個ないし２個の標識物質が含まれる。
【００１７】
１個の標識物質のみを用いる場合、標識物質として蛍光性のヌクレオチドアナログが使用できる。蛍光性のヌクレオチドアナログの中には、モノヌクレオチドのときは強い蛍光を発するが、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの中に含まれるときにはその蛍光が減弱され、さらに他の塩基とワトソン−クリックの法則に合致した塩基対を形成するものがある。そのようなヌクレオチドアナログとして、特にこれに限定されないが、２−アミノプリンを例示することができる。２−アミノプリンはアデニンと置き換えることによってチミンと塩基対を形成し、さらに２−アミノプリンを含む核酸はエキソヌクレアーゼの基質となり得る（非特許文献３）。したがって、２−アミノプリンを含むプローブを用いてエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイを行うと、標的核酸と結合した２−アミノプリンを含むプローブがエキソヌクレアーゼによって分解され、プローブから遊離した２−アミノプリンが発する蛍光を検出することによって、特定核酸配列の均一測定が可能となる。
【００１８】
２個の標識物質を用いる場合、標識物質として蛍光物質及びその蛍光を有効に減弱させる性質を有する物質（以下、クエンチャー）が使用できる。蛍光物質およびその蛍光を有効に減弱させるクエンチャーの組み合わせは、このような機能を有する組み合わせであればよく、さらにプローブＤＮＡと標的核酸とのハイブリダイゼーション及びエキソヌクレアーゼによる消化を実質的に妨害しないものであれば特に限定されない。具体的にはｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ユウロピウムなどの蛍光性物質とその蛍光波長と一致した吸収波長、もしくは近傍に吸収波長を有している、より長波長の蛍光を発する別の蛍光性物質がクエンチャーとして組み合わせて用いられることは、一般的に蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）として公知である（非特許文献２）。また、吸収エネルギーを蛍光ではなく熱として放出する非蛍光性の物質をクエンチャーとして使用することもできる。これらはダーククエンチャーと呼ばれ、蛍光の減弱効率に優れるものが多い。具体的にはＤａｂｃｙｌ、ＥｃｌｉｐｓｅやＢＨＱ（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を例示することができる。
【００１９】
２個の標識物質のうち、エキソヌクレアーゼ反応によってプローブから遊離させられるものは蛍光物質またはクエンチャーのいずれでもよい。ただし、いずれの場合もプローブ上で蛍光物質の蛍光を有効に減弱するようにクエンチャーを配置させ、蛍光物質またはクエンチャーのいずれか一方がプローブから遊離した場合に、それを蛍光強度の上昇として検出できようにする必要がある。
【００２０】
プローブとして利用される一本鎖ＤＮＡは、一般的にはアミダイト法で有機化学的に合成される（非特許文献４）。蛍光物質及びクエンチャー標識プローブも、各標識アミダイト試薬と自動合成装置を用いて容易に合成されることは当業者に広く知られるところである。また、アミノ化を施したアミダイト試薬を用いてＤＮＡを合成した後に、スクシンイミドなどの活性エステルを導入した標識物質とカップリングさせることもできる。これらの方法による標識ＤＮＡは、商業的サービスを利用して入手することができる。
【００２１】
１個ないし２個の標識物質を用いるいずれの場合においても、標的核酸中の特定領域の配列がプローブ配列と完全に相補的である場合のみ標識物質（２個の標識物質を用いる場合は少なくともいずれか一方の標識物質）がエキソヌクレアーゼの作用によって遊離する（図１左）。また、標的核酸配列の特定領域に存在する多型または変異によってプローブ配列と一塩基または二塩基以上のミスマッチ、またはループ構造を形成する場合には、標的核酸とプローブのＴｍが完全に相補的な場合より低くなるため、プローブが標的核酸にハイブリダイズすることができない（図１右）。あるいは、ハイブリダイズした後にエキソヌクレアーゼによる分解に伴ってプローブの鎖長が短くなると、Ｔｍの低下によって標的核酸とプローブが二本鎖を維持できなくなり、エキソヌクレアーゼが標識物質を遊離する前にプローブが標的核酸から離脱し、その結果、蛍光の発生がないか、あるいは最小限となる（図１中央）。本発明の方法は、これらのことを利用して標的核酸中の多型または変異を識別することを特徴としている。
【００２２】
プローブの設計は、エキソヌクレアーゼが５´→３´エキソヌクレアーゼの場合には、第一標識物質（以下、２個の標識物質のうち、エキソヌクレアーゼ反応によってプローブから最初に遊離される標識物質を「第一標識物質」と呼ぶ。プローブが１個の標識物質のみを含む場合は、「第一標識物質」とはその標識物質を表す）の標識部位とプローブの３´末端と間に標的核酸の多型または変異部位が相当するように行う。一方、エキソヌクレアーゼが３´→５´エキソヌクレアーゼの場合には、第一標識物質の標識部位とプローブの５´末端との間に標的核酸の多型または変異部位が相当するように行う。
【００２３】
プローブと標的核酸のハイブリッド中のミスマッチがプローブの末端近傍に存在している場合、ミスマッチがプローブの中央付近に存在するときに比べて、ミスマッチが標的核酸とプローブのハイブリッドの安定性に及ぼす影響が少ない。したがって、プローブの鎖長を十分に長くすればミスマッチの有無に関わらずプローブを標的核酸に効率的にハイブリダイズさせることができる。次いで、標的核酸にハイブリダイズしたプローブがエキソヌクレアーゼの作用による分解で短縮されるにしたがってＴｍが下がり、ハイブリッド形成が不安定となる。その際に、プローブと標的核酸との間に一塩基以上のミスマッチがあると、ミスマッチがない場合と比較してさらにＴｍが小さくなり、ハイブリッドの安定性がさらに低下する。その結果、エキソヌクレアーゼが第一標識物質を遊離させる前にプローブが標的核酸から離脱することになる（図１）。
【００２４】
第一標識物質の標識部位は、エキソヌクレアーゼによって短縮されたプローブの残存部が標的核酸から離脱するときの鎖長を考慮して決定されなければならない。すなわち、プローブの残存部と標的核酸の間にミスマッチがない場合、エキソヌクレアーゼによって第一標識物質が遊離された後にプローブの残存部が標的核酸から離脱する。また、ミスマッチがある場合、第一標識物質が遊離される前にプローブの残存部が標的核酸から離脱するか、あるいはプローブが全くハイブリダイズしない。その結果として第一標識物質が遊離しないよう、第一標識物質の標識部位を決定する必要がある。
【００２５】
標的核酸に完全に相補的なプローブが標的核酸から離脱する際の鎖長は、プローブ残存部の塩基組成、反応温度、溶液のｐＨ、塩濃度の影響を受ける。一般に、グアニンとシトシンの含量が高く、反応温度が低く、ｐＨが低く、また塩濃度が高いほど、標的核酸から離脱する際の鎖長は短くなる。そのため、これに限定されないが、本技術の一般的な実施条件の範囲内（反応温度が２５℃〜４５℃、ｐＨが７．０〜１０．０、塩濃度が１０ｍＭ〜２００ｍＭ）では、プローブＤＮＡが標的ＤＮＡから離脱するときの鎖長は、５〜１５塩基程度である。したがって、第一標識物質のプローブ上の標識部位は、エキソヌクレアーゼが５´→３´エキソヌクレアーゼの場合は３´末端から数えて６塩基目から１６塩基目、エキソヌクレアーゼが３´→５´エキソヌクレアーゼの場合は５´末端から数えて６塩基目から１６塩基目のヌクレオチドに標識するのが好適である。そして、プローブと標的核酸の間にミスマッチが存在する場合、プローブが標的核酸から離脱するときの鎖長が、ミスマッチの存在しない場合に離脱するときの鎖長より有意に長くなるように反応条件を設定する必要がある。
【００２６】
しかしながら、多型の存在する部位周辺の塩基配列によっては、エキソヌクレアーゼによって分解を受けたプローブが標的核酸から離脱するときの長さが、ミスマッチのある場合とない場合とで顕著に変化しないこともある。特に、ＧＣ含量の高い領域の場合、比較的Ｔｍが高くなるため、わずか１塩基のミスマッチが存在してもΔＴｍの影響は概して大きくないことが多い。また、ミスマッチ塩基対の中でも、Ｇ／Ｇペア及びＧ／Ｔペアの水素結合は他のミスマッチ塩基対に対して比較的安定であり（非特許文献５）、ＧＣ含量の高い領域内の該ミスマッチ塩基対をΔＴｍによって識別することは、従来のハイブリダイゼーションを基盤とした方法でも概して困難である。そのような場合には、標的核酸との間に別のミスマッチを生じさせるように、意図的にプローブの一部の塩基を置換、挿入または欠損させることで改善できる。人為的ミスマッチの導入部位及び導入の仕方（置換、挿入または欠損させる塩基の種類など）は、標的核酸の多型に由来するミスマッチのあるときとないときで、エキソヌクレアーゼによって消化を受けたプローブの残存部が標的核酸から離脱するときの長さに有意な差を生じればよく、特に限定されない。例えば、ＧＣ含量の高い領域において一部のＧ／Ｃ塩基対をＧ／Ｇ、Ｇ／ＴまたはＧ／Ａミスマッチとなるようにプローブの塩基を置換することで、多型存在部位周辺のプローブと標的核酸のＴｍを下げ、ミスマッチの有無によるΔＴｍの差の影響を大きくすることができる。また、このようなプローブへの人為的ミスマッチの導入によって、多型部位と完全にマッチしたときだけプローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、マッチしないときにはハイブリダイズさせないようにすることも可能である。
【００２７】
本発明の利点の一つは、ハイブリダイゼーションを基盤にした多型または変異の検出方法でありながら、使用するプローブの鎖長に特に制限がないことである。例えば、４種類の塩基からランダムな順列組合せで作製される１６塩基長のプローブは約４３億通りある。したがって、ヒトの塩基数は約３０億塩基対であるので、ヒトのゲノムに対して特異性の高いプローブを作製するには１６塩基以上の鎖長が必要であり、高い特異性が要求されるハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法では、２０〜３０塩基長のプローブやプライマーが用いられるのが一般的である。しかし、従来のハイブリダイゼーションの後に洗浄によるＢ／Ｆ分離によって塩基の差異を識別する方法では、プローブ長に制限がある。すなわち、プローブの鎖長が長くなるほどマッチのＴｍに対するΔＴｍの占める割合が小さくなり、ミスマッチとの識別が困難となるため、できる限りプローブは短い方が好ましい。しかし、前述した通り、Ｔｍに対するΔＴｍの占める割合を大きくするためにプローブの鎖長を短くすると、標的核酸に対する特異性と親和性が低下するという問題が生じる。
【００２８】
本発明によれば、プローブの鎖長は、エキソヌクレアーゼの作用によって標的配列特異的に遊離させることのできるシグナル発生物質、すなわち第一標識物質をプローブ上の好適な部位に標識できる最小限の鎖長を確保している限りその長さに特に制限はない。したがって、ゲノムサイズの大きな生物を解析対象とする場合も、プローブの塩基長を長くすることによって、十分な特異性と親和性を確保することができる。一般的な合成装置では１００塩基以上のオリゴマーＤＮＡの作製も可能であるが、鎖長が長くなるほど完全長のＤＮＡの合成効率が下がるため、過剰に長鎖のプローブを使用することは経済上有利ではない。また、鎖長が長くなることによって、エキソヌクレアーゼによる消化に時間を要し、サイクリング反応が効率的に行われなくなる恐れがある。したがって、本発明の方法では、１８塩基から５０塩基ほどのプローブが好適に使用されるが、この範囲外でも使用可能である。
【００２９】
プローブにおける第二標識物質（以下、プローブに２個の標識物質が含まれる場合に、第一標識物質と対を成してＦＲＥＴ現象を成立させるもう一つの標識物質を「第二標識物質」と呼称する）の標識部位は、エキソヌクレアーゼによって第一標識物質より先に遊離されず、且つ第一標識物質の蛍光を有効に減弱することができれば特に限定されない。例えば、エキソヌクレアーゼが５´→３´エキソヌクレアーゼの場合は３´末端に、エキソヌクレアーゼが３´→５´エキソヌクレアーゼの場合は５´末端に第二標識物質を標識したプローブを使用することができる。
【００３０】
ただし、第一標識物質と第二標識物質の距離が離れると、クエンチャーによる蛍光の減弱効果が弱まり、バックグラウンドの蛍光シグナルが増大することがある。そのような場合には、両標識物質の距離を短くするために第二標識物質をプローブの鎖内に標識することも可能である。すなわち、エキソヌクレアーゼが５´→３´エキソヌクレアーゼの場合には３´末端と第一標識物質の間のヌクレオチドに、エキソヌクレアーゼが３´→５´エキソヌクレアーゼの場合には５´末端と第一標識物質の間のヌクレオチドに鎖内標識することが可能である。このことにより、第二標識物質が第一標識物質より先にエキソヌクレアーゼによって遊離されることはなく、また両標識物質の距離の短縮によりクエンチング効果を向上させ、バックグラウンド・シグナルを低減させることができる。
【００３１】
核酸配列の検出法において使用されるエキソヌクレアーゼとしては、標的核酸にハイブリダイズしたプローブ中の第一標識物質が標識されたヌクレオチドを該プローブＤＮＡ鎖から遊離することのできるものであれば良く、特に限定されない。例えば、５´エキソヌクレアーゼとしてλエキソヌクレアーゼ、Ｔ７ Ｇｅｎｅ６ エキソヌクレアーゼを挙げることができる。また、３´エキソヌクレアーゼとして大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩを挙げることができる。これらはいずれも商業的に入手可能である。また、エキソヌクレアーゼによっては蛍光物質またはクエンチャーの標識による立体障害によって、標識部位のヌクレオチドを遊離できない可能性がある。しかしながら、そのような場合でも蛍光性ヌクレオチドアナログを標識物質として用いれば、いかなるエキソヌクレアーゼの基質ともなり得るので、効果的にプローブから遊離させることができる。
【００３２】
本発明による方法において完全マッチとミスマッチとの判別が困難な場合、より高い温度で反応させて、ミスマッチを含む標的核酸とプローブとのハイブリッド形成を不安定化することにより、完全マッチとミスマッチとの判別を容易にすることができる。例えば、３７℃の反応で完全マッチとミスマッチとの間で十分なシグナル差あるいはＳ／Ｎ比が確保できない場合は、例えば３７℃から４５℃までの間で反応を行うことで改善できることがある。しかし、一般の酵素は３７℃付近が至適反応温度であり、それ以上温度を上昇させると酵素活性そのものが低下することにより十分なシグナルが得られなくなることがある。そのような場合、より至適反応温度の高い耐熱性酵素を使用することが好ましい。例えば、好熱性細菌のＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ａｆｕ）から二本鎖ＤＮＡ特異的３´→５´エキソヌクレアーゼが単離されている（特許文献４）。このような耐熱性エキソヌクレアーゼの利用によって、本発明における反応温度の設定範囲を拡大し、種々の配列のターゲットについてより好適な反応条件の設定を可能にすることができる。
【００３３】
さらに、本発明の実施条件について詳細に説明するが、これらは例示的に示すものであり、限定されるものではない。
【００３４】
検体としては、使用されるエキソヌクレアーゼの基質となり得る核酸であり、例示したλエキソヌクレアーゼ、Ｔ７ Ｇｅｎｅ６ エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ａｆｕ由来３´→５´エキソヌクレアーゼの場合にはＤＮＡが使用される。生物試料から抽出されたＤＮＡを直接用いることもできるが、解析に用いるには量が不十分なことが多い。そのような場合には、生物試料から抽出された核酸をＰＣＲ法などによって増幅したＤＮＡ産物を本発明による遺伝子変異解析に用いることができる。また、逆転写反応後にＤＮＡとして増幅する技術（ＲＴ−ＰＣＲなど）によってＲＮＡをＤＮＡに変換して増幅することができ、そのような増幅産物を解析することもできる。
【００３５】
ＰＣＲ法以外では、ＬＡＭＰ法（非特許文献６）、ＩＣＡＮ法（非特許文献７）、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ法（非特許文献８）などで増幅されたＤＮＡも本発明の方法の検体として使用できる。これらの方法による増幅産物のように末端を有する直鎖状ＤＮＡであれば、当該ＤＮＡとハイブリダイズしたプローブがエキソヌクレアーゼの基質となり得るからである。また、標的核酸が環状であっても、エキソヌクレアーゼＩＩＩなどは環状一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを基質とし得るので、本発明による方法にサンプルとして使用できる。増幅された核酸以外では、ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを使用できる。逆転写反応後はＲＮＡとｃＤＮＡのハイブリッドが得られる。したがって変性操作の後にプローブのハイブリダイゼーションを行うか、あるいはＲＮａｓｅＨによってＲＮＡのみを分解することで一本鎖のｃＤＮＡを得て当該ｃＤＮＡにプローブをハイブリダイズさせることにより、エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイを実施することが可能であり、ＲＮＡの定量的検出と多型解析が可能である。また、エキソヌクレアーゼＩＩＩはＲＮａｓｅＨ活性を有するので、特に別のＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を作用させることなしにエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイを実施することも可能である。
【００３６】
サンガー法による塩基配列決定法やミニシークエンス法などのように、酵素反応を利用した多型解析法の多くが、ＰＣＲなどによる増幅産物を検体とする場合には、残存する酵素、プライマー、デオキシヌクレオチド、塩類、あるいはｐＨなどの影響を受けることがある。これらの影響を除くために増幅産物の精製が不可欠である場合が多く、これらの方法の操作は非常に煩雑となっている。本発明では、反応液成分の過剰な持込によってエキソヌクレアーゼ反応やプローブのハイブリダイゼーションが著しく阻害されない範囲に限って、ＰＣＲ産物や逆転写反応産物の精製を行うことなく解析に使用することができるため、極めて簡便且つ迅速である。
【００３７】
本発明における標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーションは、通常は該標的核酸が二本鎖ＤＮＡの場合は変性により一本鎖とした後に行われる。該標的核酸が一本鎖であれば変性の必要はなく、そのままプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションさせることが可能である。本発明における変性の方法は通常行われる方法に従えば良い。例えば熱変性によるものと化学的変性によるものが例示される。具体的な方法として、熱変性による方法は、通常９０℃以上に加熱することにより行われる。好ましくは、９４℃〜９８℃で約１〜５分間加熱することにより変性が行われる。化学的変性による方法は尿素、ホルムアルデヒド等の変性剤の作用により、またはｐＨを上昇させることにより行われる。ｐＨは０．１〜１ｍｏｌ／ｌ ＮａＯＨを用いることにより上昇させることができるが、操作の簡便性などの点からから熱変性による方法が好適に用いられる。
【００３８】
ハイブリダイゼーションを行う場合、ハイブリダイゼーションの方法は通常行われる方法に従えば良いが、その条件はプローブ又は変性標的核酸の鎖長、塩基配列、Ｔｍにより異なる。一般的にはｐＨ６．５〜９．５で、１０〜１０００ｍＭのナトリウムまたはカリウムイオン存在下にて室温〜７０℃の温度下でハイブリダイゼーションが行われる。ただし、過剰のナトリウムまたはカリウムイオン存在下ではエキソヌクレアーゼ活性が阻害されることがあるため、１０〜１０００ｍＭの範囲内で十分なシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を得るような条件を見出す必要がある。
【００３９】
エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法に使用するエキソヌクレアーゼの作用によって、標的核酸であるＰＣＲ産物などの直鎖状二本鎖ＤＮＡの標的配列部位が一本鎖化される場合は、必ずしも変性操作を必要としない。例えば、３´→５´エキソヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いた場合、標的ＰＣＲ産物はエキソヌクレアーゼＩＩＩの触媒活性によって両鎖の３´末端からの消化を受け、部分的に一本鎖となる。この一本鎖化された領域を標的配列としたプローブを用いれば、変性操作を行うことなく、該ＰＣＲ産物にエキソヌクレアーゼＩＩＩ及びプローブを含んだ試薬を添加して、一定温度で反応を実施するだけでエキソヌクレアーゼサイクリング反応が成立することから、本発明の方法は簡便性及び迅速性の点で大いに利点がある。
【００４０】
他のエキソヌクレアーゼ、例えばλエキソヌクレアーゼを用いる場合、ＰＣＲプライマーの一方のみを５´末端リン酸化したプライマーセットで増幅したＤＮＡを標的核酸として用いれば、λエキソヌクレアーゼによって５´末端がリン酸化された鎖のみが消化され、リン酸化されていない鎖が残り、その結果、標的ＤＮＡは一本鎖化される。当該一本鎖ＤＮＡに対して相補的な配列を有し、５´末端がリン酸化されたプローブを用いれば、やはり変性操作を行うことなくλエキソヌクレアーゼを利用したエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイが可能となる。このように、本発明によればエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイを完全に一定の温度で実施することが可能であり、複雑な温度制御を行う機器を必要としない。
【００４１】
例示したエキソヌクレアーゼのうち、λエキソヌクレアーゼ、Ｔ７ Ｇｅｎｅ６ エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩを使用する場合、２５℃〜４５℃の間で反応を行うのが好適である。一般的にはこれらいずれの酵素も３７℃で使用されることが多いが、本発明によりミスマッチを識別する場合には、マッチとミスマッチのシグナル比が十分大きくなるように反応温度が設定されるので、必ずしも３７℃が好適とは限らない。しかし、これらの酵素を３７℃以上で使用すると、反応温度の上昇に伴って酵素活性は低下するため、過剰に高い温度、例えば５０℃以上の温度でサイクリングアッセイを行う場合には適さない。このような場合には、耐熱性の酵素を用いるのが好ましい。耐熱性のエキソヌクレアーゼとしては、Ａｆｕ由来の３´→５´エキソヌクレアーゼ（特許文献４）が報告されており、このような酵素を用いることで、より高温、すなわち５０℃以上でも好適なエキソヌクレアーゼサイクリング反応を実施することが可能となる。
【００４２】
酵素濃度とプローブ濃度は、標的核酸特異的なシグナル及びバックグラウンド・シグナルの両方に影響を及ぼす。好適な酵素濃度とプローブ濃度の組合せは、酵素の種類、使用される標的核酸及びプローブの配列毎に異なり、それぞれの場合において高いＳ／Ｎ比を得るような条件を見出す必要がある。
【００４３】
ＦＲＥＴの場合の蛍光の検出条件として、例えばプローブの５´末端にＤａｂｃｙｌ修飾、鎖内にＦＩＴＣ修飾の場合、３´→５´エキソヌクレアーゼの作用によりプローブが３´末端より分解されるに伴って発せられる蛍光は、最大励起波長４９４ｎｍ、最大蛍光波長５１８ｎｍの条件で蛍光光度計を用いて検出される。本発明による方法は、操作が簡便であるために、自動化システムの構築も容易である。特にハイスループットなシステムを構築するには、マイクロプレートを用いるのが便利である。マイクロプレートを用いた場合の蛍光の検出には、マイクロプレートに対応した蛍光測定装置が使用される。このような装置としては、特に限定されないが、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ Ｓｅｒｉｅｓ ４０００（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）やＷａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマーライフサイエンス社）などを例示することができる。このような装置を使用する場合、励起波長及び蛍光測定波長の選択は、装置に装備されたフィルターの種類によって限定されるが、蛍光物質の励起及び蛍光波長から適切なフィルターを選択して使用する。例えば、Ｗａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒの場合、４８５ｎｍの励起用フィルターと５３５ｎｍの蛍光測定用フィルターを使用して、好適に測定することができる。
【００４４】
エキソヌクレアーゼによるプローブの分解によって生じるシグナルは、プローブのサイクル反応によって増幅され、反応の進行中にそのシグナルの推移を測定することが可能であり、適切な反応時間を選択することにより、再現性並びに定量性の向上及び測定時間の短縮が図れる。反応時間は数秒から６０分の間が好ましい。シグナルのリアルタイムモニターについては、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、それぞれの装置に対応した蛍光物質を標識したプローブを用いて実施できる。リアルタイムＰＣＲ装置としては、ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ社）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）、Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍ（宝バイオ社）などが挙げられる。これらの装置は、いずれも４℃から１００℃の間での厳密な反応温度の制御が可能であり、さらに種々の波長の蛍光測定に対応しており、本発明において好適に使用される。
【００４５】
さらに本発明によれば、特定部位の多型だけでなく、連続する数塩基の領域に存在する１個または複数の変異を識別することができる。例えば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子は、１２番目のコドン（ＧＧＴ）にアミノ酸置換、特にグリシンからバリン、アスパラギン酸あるいはアルギニンへの置換を伴う変異が生じた場合に発癌遺伝子として働くことが知られている。Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異は大腸癌の約４０％、肺癌の約２０％、膵癌の約８０〜９０％で検出されており、臨床検体からの検査にも利用されている。コドン１２の３番目の塩基であるチミンは、他のいずれの塩基に置き換わってもアミノ酸の置換はないが、１番目及び２番目の塩基はいずれの塩基に換わってもアミノ酸の置換を伴う。したがって、部位特異的な一塩基多型検査技術を利用した場合、野生型配列に加えて１番目及び２番目の塩基置換に対応した計７組のプローブを用意することが不可欠である。しかし、本発明によれば、連続する３塩基以上の領域のいずれかに塩基置換があった場合においても蛍光強度の著しい低下を引き起こし、特定の配列との区別を可能としており、一塩基多型のみならず癌関連遺伝子の変異検出にも有効である。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４７】
実施例１
（１）標的核酸の調製
ヒトゲノムＤＮＡからＫ−ｒａｓ遺伝子の一部をＰＣＲにて増幅した産物を標的核酸とした。上流及び下流プライマーの配列は以下の通りである。なお、以下に示す全てのオリゴマーＤＮＡの合成は、日本バイオサービスに依頼した。
【００４８】
配列番号１：ＧＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧ
配列番号２：ＣＣＴＣＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣ
ＰＣＲの条件は、１．２５ＵのＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝バイオ）、１Ｘ Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液（宝バイオ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２００ｎＭの各プライマー、１０〜１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを含む５０μｌの反応液を調製し、９４℃／２０秒、５５℃／２０秒、７２℃／２０秒のサイクル反応を４０回行った。また、ヒトゲノムＤＮＡを含まない反応液で同様にサイクル反応を行い、陰性コントロールとした。
【００４９】
（２）プローブＤＮＡ
５´末端にＤａｂｃｙｌ、鎖内にＦＩＴＣを標識したプローブの配列は、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の一部の塩基配列を有しており、以下の通りである。ただし、配列中の“Ｚ”はＦＩＴＣ標識デオキシチミジン（ＦＩＴＣ−ｄＴ）を表す。
【００５０】
配列番号３：５´−ＧＣＴＣＣＡＡＣＺＡＣＣＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡＧＴＣ
【００５１】
（３）エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ
上記（１）のＫ−ｒａｓ遺伝子の増幅産物をＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）で定量した後、陰性コントロールで２倍段階希釈を行った。この２倍希釈系列及び陰性検体を、配列番号３によって示された配列を有し、５´末端にＤａｂｃｙｌが標識されたプローブを用いてエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法で測定を行った。すなわち、２Ｘ エキソヌクレアーゼＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、７５ｍＭ ＮａＣｌ、７５０ｎＭプローブＤＮＡ、２μｌの検体ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）を含む１０μｌの反応液を調製し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ（エッペンドルフ社）を用いて９５℃で２分間加熱した後、３７℃で５秒間加温した。直ちに１０μｌの１．３５Ｕ／μｌ エキソヌクレアーゼＩＩＩを添加して３７℃にてさらに３０分間保温した。次いで７０℃にて１０分間加温して酵素を失活させた後、３０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加え、全量を蛍光測定用の９６穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に移し、プレートリーダーＷａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマーライフサイエンス社）にて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光を測定した。
【００５２】
その結果、図２に示した通り、その標準曲線は非常に直線性に優れ、最低検出感度は３ｆｍｏｌ／ａｓｓａｙ以下であった。
【００５３】
実施例２
（１）変性操作工程の有無
上記実施例１（３）で示した方法では、エキソヌクレアーゼの添加の前に、標的二本鎖ＤＮＡの熱変性の工程が含まれている。この工程が必須であるか検証するため、上記実施例１（１）で調製した１７０ｆｍｏｌのＫ−ｒａｓ ＰＣＲ産物と陰性検体を上記実施例１（３）の熱変性の工程を含む方法と熱変性の工程を含まない方法とで比較した。熱変性の工程を含まない方法は、１Ｘ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、３７．５ｍＭ ＮａＣｌ、３７５ｎＭプローブ、２μｌの検体ＤＮＡ（１７０ｆｍｏｌのＰＣＲ反応液）及び０．６７５Ｕ／μｌのエキソヌクレアーゼＩＩＩを含む２０μｌの反応液を調製し、３７℃にて３０分間保温した後、さらに７０℃で１０分間加温して酵素を失活させ、プレートリーダーＷａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマーライフサイエンス社）にて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光を測定することによって実施した。その結果、図３に示した通り、熱変性の工程を含まない方法では、標的核酸を含まないＰＣＲ反応液のシグナル及び１７０ｆｍｏｌの標的配列を含むＰＣＲ反応液のシグナルともに、熱変性の工程を含む方法によるシグナルとほぼ同程度であった。このことから、熱変性の工程は必須でないことが分かった。
【００５４】
実施例３
（１）合成標的核酸
エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法の一塩基の置換を識別する能力を検証するため、標的核酸として１３種の化学合成ＤＮＡを用いた。各化学合成標的ＤＮＡの塩基配列は以下の通りである。
【００５５】
配列番号４：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号５：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号６：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＴＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号７：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号８：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号９：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号１０：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号１１：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＣＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号１２：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＴＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号１３：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＴＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号１４：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＣＧＣＴＴＧＴ
配列番号１５：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＴ
配列番号１６：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＴＧＴ
【００５６】
ここで、配列番号４はヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の野生型の配列であり、配列番号３で示されたプローブＤＮＡの塩基配列と完全に相補的な配列を含む。一方、配列番号５から配列番号１６は配列番号４のいずれかの一塩基を他の塩基に置換したものであり、それぞれを配列番号３で示されたプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションさせた場合、形成された二本鎖ＤＮＡ中には一塩基のミスマッチを含む。それらのミスマッチの位置を図４に示した。図４において下線のある塩基は、配列番号３で示されたプローブＤＮＡとハイブリダイズしたときにミスマッチを形成する塩基である。
【００５７】
（２）合成標的核酸を用いた一塩基ミスマッチの検出
本発明による一塩基ミスマッチの識別能力を、合成標的核酸を用いて検証するため、以下のような条件でエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイを実施した。すなわち、１Ｘ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、３７．５ｍＭ ＮａＣｌ、３７５ｎＭプローブＤＮＡ、０．６７５Ｕ／μｌ エキソヌクレアーゼＩＩＩ（宝バイオ）、１００ｆｍｏｌ合成標的ＤＮＡまたはその代わりに精製水を含む２０μｌの反応液をＰＣＲ反応チューブに調製し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ（エッペンドルフ社）を用いて直ちに３７℃または４１℃にて３０分間加温した。酵素を失活させるため７０℃にて１０分間加熱した後、３０μｌのＴＥ緩衝液を加え、全量を蛍光測定用の９６穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に移し、プレートリーダーＷａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマーライフサイエンス社）にて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光を測定し、各合成標的核酸をサンプルとしたときの相対蛍光強度（ＲＦＵ）から精製水をサンプルとして測定したときのＲＦＵを減じた値（ΔＲＦＵ）を求めた。
【００５８】
その結果、３７℃での反応では、配列番号７及び９から１６で示された標的核酸において、配列番号４で示された完全マッチの標的核酸と比べてある程度のシグナルの低下が認められた（図５）。次いで、反応温度を４１℃とすると、配列番号９から１５で示された標的核酸で顕著なシグナルの低下が認められ、バックグラウンド・シグナル、すなわち標的核酸を含まないときとほぼ同程度のシグナルを示し、プローブとミスマッチを形成するこれらの標的核酸と、プローブと完全に相補的な配列を有する標的核酸とを明確に識別できることが示された（図６）。このことは、本発明によって、１箇所の特定の部位だけでなく、近傍の数塩基に渡る領域の遺伝子変異をも検出し得ることを示している。
【００５９】
実施例４
（１）合成標的核酸
エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法の一塩基以上の挿入又は欠損配列を識別する能力を検証するため、標的核酸として４種の化学合成ＤＮＡを用いた。各化学合成標的ＤＮＡの塩基配列は以下の通りである。
【００６０】
配列番号１７：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号１８：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号１９：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
配列番号２０：５´−ＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
【００６１】
図７において、配列番号４はヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の野生型の配列であり、配列番号３で示されたプローブＤＮＡの塩基配列と完全に相補的な配列を含む。一方、配列番号１７から配列番号２０は、それぞれ配列番号４に一塩基又は三塩基の挿入又は欠損を含むものであり、それぞれを配列番号３で示されたプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションさせた場合、形成された二本鎖ＤＮＡのいずれかのＤＮＡ鎖がループ構造を形成する。図７においてハイフンで示した部分は塩基の欠損部分であり、下線を付した塩基は挿入配列である。
【００６２】
（２）合成標的核酸を用いた挿入及び欠損配列の検出
本発明による挿入及び欠損配列の識別能力を、合成標的核酸を用いて検証するため、以下のような条件でエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイを実施した。すなわち、１Ｘ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、３７．５ｍＭ ＮａＣｌ、３７５ｎＭプローブＤＮＡ、０．６７５Ｕ／μｌ エキソヌクレアーゼＩＩＩ（宝バイオ）、３００ｆｍｏｌ合成標的ＤＮＡまたは精製水を含む２０μｌの反応液を蛍光測定用ＰＣＲプレートに調製し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ（エッペンドルフ社）を用いて直ちに４１℃にて３０分間加温した。酵素を失活させるため７０℃にて１０分間加熱した後、３０μｌのＴＥ緩衝液を加え、全量を蛍光測定用の９６穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に移し、プレートリーダーＷａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマーライフサイエンス社）にて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光を測定し、各合成標的核酸をサンプルとしたときの相対蛍光強度（ＲＦＵ）から精製水をサンプルとして測定したときのＲＦＵを減じた値（ΔＲＦＵ）を求めた。
【００６３】
その結果、一塩基の置換を有する配列番号１１で示された合成標的ＤＮＡ及び挿入又は欠損を含む配列番号１７から２０で示されたいずれの合成標的ＤＮＡにおいても、配列番号４で示された合成標的核酸よりも顕著に低い蛍光強度が観察された（図８）。このことから、本発明による方法によって、特定の配列を有する標的核酸を、一塩基以上の挿入または欠損配列を有する標的核酸とも明確に識別して検出できることが示された。
【００６４】
実施例５
（１）ヒトアルデヒド脱水素酵素２遺伝子のＰＣＲ
化学合成したＤＮＡを標的核酸とした場合のみならず、実際の生体試料の多型解析が可能であることを示すため、ヒトのアルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）遺伝子の多型検出系を構築した。ＡＬＤＨ２遺伝子のエクソン１２には正常型の「Ｇ」と変異型「Ａ」の一塩基多型が存在する。この多型をエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法によって識別するため、ＡＬＤＨ２の遺伝子型が既知の検体ＤＮＡから、ＰＣＲによってこの多型部位を含む領域を増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は以下の通りである。
【００６５】
配列番号２１：ＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＧＣＧＡＧ
配列番号２２：ＧＣＣＣＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＣＣＡＡＴＣ
【００６６】
ＰＣＲの条件は、１Ｘ Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２００ｎＭの各プライマー、０．６２５ＵのＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝バイオ）、１０〜５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを含む２５μｌの反応液を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＡＢＩ社）を用いて、９４℃／２分の変性処理の後、９４℃／２０秒、６３℃／２０秒、７２℃／２０秒を４０サイクル、さらに７２℃／２分の伸長反応を行った。増幅の成否は、２％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色することによって確認した。
【００６７】
（２）エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法による野生型ＡＬＤＨ２遺伝子配列の特異的検出
１Ｘ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、４０ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｎＭプローブＤＮＡ、０．４Ｕ／μｌ エキソヌクレアーゼＩＩＩ（宝バイオ）、５μｌの上記ＰＣＲ反応液または精製水を含む２０μｌの反応液をＰＣＲ反応チューブに調製し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ（エッペンドルフ社）を用いて直ちに３７℃にて３０分間加温した。酵素を失活させるため７０℃にて１０分間加熱した後、３０μｌのＴＥ緩衝液を加え、全量を蛍光測定用の９６穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に移し、プレートリーダーＷａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマーライフサイエンス社）にて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光を測定した。このときに用いたプローブＤＮＡは正常型の「Ｇ」を有する標的核酸と完全マッチする配列からなり、その配列は以下の通りである。
【００６８】
配列番号２３：ＴＴＴＣＡＣＴＴＣＡＧＺＧＴＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣ
【００６９】
ここで、ＺはＦＩＴＣ標識ｄＴを示しており、該プローブの５´末端にはダーククエンチャーであるＤａｂｃｙｌが標識されている（図９）。その結果、Ａ／Ａ型では、Ｇ／Ｇ型及びＧ／Ａ型に比べて著しく低いＲＦＵ値を示した（図１０）。このことから、本発明による方法は、生体試料中の一塩基の置換の有無を明確に識別できることが示された。
【００７０】
実施例６
（１）人為的ミスマッチを導入したプローブ
ミスマッチ塩基対のうちでも、Ｇ／ＧやＧ／Ｔ塩基対は比較的水素結合が強く、そのため通常のハイブリダイゼーション法では、他のミスマッチ塩基対に比べて完全マッチの塩基対と区別して検出することは比較的困難である。本発明においても同様の傾向があるが、プローブ配列の一部を意図的に置換し、標的配列との間でミスマッチを形成するようにすることで、この問題を回避することができる。その一例を示すために変異型ＡＬＤＨ２に含まれる「Ａ」と野生型に含まれる「Ｇ」を識別して検出するための２種のプローブを以下に示す通り設計した。
【００７１】
配列番号２４：ＣＡＣＴＴＴＡＧＴＧＺＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＴＡ
配列番号２５：ＣＡＣＴＴＴＡＧＴＧＺＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＴＡ
【００７２】
ここで、ＺはＦＩＴＣ標識ｄＴを示しており、該プローブの５´末端にはダーククエンチャーであるＤａｂｃｙｌが標識されている。
【００７３】
また、標的核酸として野生型及び変異型ＡＬＤＨ２の配列からなる以下に示すオリゴマーＤＮＡを合成した。
【００７４】
配列番号２６：ＧＡＧＴＡＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧＴ
配列番号２７：ＧＡＧＴＡＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧＴ
【００７５】
これらのプローブと標的ＤＮＡの関係を図１１に示した。配列番号２４からなるプローブは配列番号２７からなる変異型標的ＤＮＡと完全に相補的であるが、配列番号２６からなる野生型標的ＤＮＡとは、多型部位でＧ／Ｔミスマッチ塩基対を形成する。一方、配列番号２５からなるプローブは、配列番号２４のＦＩＴＣ標識部位から３’側に数えて４番目の塩基をＣからＴに置換しており（下線）、野生型及び変異型標的ＤＮＡともにこの部位でミスマッチ塩基対を形成するように設計した。
【００７６】
（２）プローブへの人為的ミスマッチ導入による多型識別能の向上
これらのＤＮＡを用いて、１Ｘ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、４０ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｎＭプローブＤＮＡ、０．０５Ｕ／μｌエキソヌクレアーゼＩＩＩ（宝バイオ）、１００ｆｍｏｌの合成標的ＤＮＡを含む２０μｌの反応液を９６穴の蛍光測定用ＰＣＲプレートに調製し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ（エッペンドルフ社）を用いて直ちに３７℃にて３０分間加温し、次いで酵素を失活させるため７０℃にて５分間加熱した後、プレートリーダーＷａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマーライフサイエンス社）にて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光を測定した。また、盲検として標的ＤＮＡを添加せずに反応及び蛍光測定を行った。
【００７７】
その結果を図１２に示す。野生型配列に完全マッチするプローブを用いたときは、野生型及び変異型標的ＤＮＡに対するＲＦＵ値ともに盲検に比べて顕著に上昇し、シグナル値から両者を区別することは困難であった。しかしながら、人為的ミスマッチを導入したプローブを用いたときは、野生型及び変異型標的ＤＮＡに対するＲＦＵ値に顕著な差が認められ、一塩基多型の判別の特異性を向上させることができた。
【００７８】
実施例７
（１）生体試料のＡＬＤＨ２遺伝子型判定
ＡＬＤＨ２遺伝子の野生型及び変異型をそれぞれ特異的に検出するためのプローブのデザインを最適化し、それらを用いたエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイによる測定条件を至適化して、ヒト由来サンプルのＡＬＤＨ２遺伝子の遺伝子型判定を試みた。
【００７９】
２３検体のヒトゲノムＤＮＡ１〜５０ｎｇ及び陰性検体としてＤＮＡの代わりに精製水から、実施例５と同じ方法でＡＬＤＨ２遺伝子の多型存在部位を含む領域を増幅し、それぞれ５μｌをＡＬＤＨ２遺伝子の野生型検出系及び変異型検出系を用いてアッセイした。すなわち、４℃に保ったサーマルサイクラー上で蛍光測定用ＰＣＲプレートに１Ｘ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、４０ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｎＭのプローブＤＮＡ、５μｌのＰＣＲ産物、０．２Ｕ／μｌ（野生型検出系）または０．０３７５Ｕ／μｌ（変異型検出系）のエキソヌクレアーゼＩＩＩ（宝バイオ）を含む２０μｌの反応液を調製し、３７℃／３０分、次いで７０℃／５分間インキュベートし、プレートリーダーＷａｌｌａｃ Ａｒｖｏ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマーライフサイエンス社）にて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで蛍光を測定した。このとき用いた野生型及び変異型をそれぞれ特異的に検出するためのプローブの配列を配列番号２３および２５に示す。
【００８０】
野生型検出系のＲＦＵ値を横軸（Ｇアレル）、変異型検出系のＲＦＵ値を縦軸（Ａアレル）とし、各試料の蛍光シグナルの分布を示したのが図１３である。蛍光シグナルの分布は明確に３つのグループに分けられ、それぞれのグループがサンガー法で遺伝子型が決定されたＧ／Ｇホモ、Ｇ／Ａヘテロ、Ａ／Ａホモの３つの検体群と完全に一致した。このことから、本発明が実際の生体試料の遺伝子型判定において極めて有用であることが示された。
【００８１】
実施例８
（１）混合試料のアレル含有率の定量
ＡＬＤＨ２の遺伝子型がＧ／ＧホモのゲノムＤＮＡ及びＡ／ＡホモのゲノムＤＮＡを混合し、Ｇ／ＧホモのゲノムＤＮＡの含有率が１００％、７５％、５０％、２５％、０％となるように試料を調製した。これらの混合試料１０ｎｇを請求項５と同じ方法でＰＣＲを行った。それらのＰＣＲ産物５μｌを実施例７と同じ方法でＡＬＤＨ２遺伝子の野生型検出系及び変異型検出系を用いて２回ずつアッセイした。
【００８２】
その結果、混合比の異なるそれぞれの試料のシグナルはそれぞれに独立した分布を示し、それぞれのアレルの含有率を定量可能であることが示された（図１４）。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】遺伝子多型または遺伝子変異の均一測定を可能にするエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイの原理を示す図である。
【図２】エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイの均一測定系の標準曲線を示す図である。（実施例１）
【図３】エキソヌクレアーゼ添加前のＤＮＡの熱変性工程の有無による測定結果を示す図である。（実施例２）
【図４】プローブと合成標的核酸の配列を示す図である。（実施例３）
【図５】反応温度３７℃で実施したエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイの均一測定系によってミスマッチの検出を試みた結果を示す図である。（実施例３）
【図６】反応温度４１℃で実施したエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイの均一測定系によってミスマッチの検出を試みた結果を示す図である。（実施例３）
【図７】プローブと合成標的核酸の配列を示す図である。（実施例４）
【図８】エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイの均一測定系によって挿入及び欠損配列の検出を試みた結果を示す図である。（実施例４）
【図９】ＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型を含む領域の配列と野生型ＡＬＤＨ２遺伝子特異的プローブＤＮＡの配列を示す図である。（実施例５）
【図１０】エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイの均一測定系によるＡＬＤＨ２遺伝子の多型検出の結果を示す図である。（実施例５）
【図１１】プローブと合成標的核酸の配列を示す図である。（実施例６）
【図１２】エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイにおいて、人為的ミスマッチ導入プローブを用いることによって一塩基置換の検出の特異性の改善を試みた結果を示す図である。（実施例６）
【図１３】エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイによって、生体試料からＡＬＤＨ２の遺伝子型の判定を実施した結果を示す図である。（実施例７）
【図１４】ＡＬＤＨ２の遺伝子型が異なる２種のヒトゲノムＤＮＡを異なる比で混合して調製した試料を、エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイによってアッセイした結果を示す図である。（実施例８）
Claims (7)
- 標的核酸を、該標的核酸とは１塩基以上の置換、１塩基以上の挿入、及び／又は１塩基以上の欠損を含む核酸と区別して検出する方法であって、標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブが、標的核酸との間に１塩基以上の相補的でない塩基対を形成する場合において、並びに／又は１塩基以上の挿入及び／若しくは１塩基以上の欠損によって該標的核酸との間でループ構造を形成する場合において、該相補的でない塩基対及び／又は該ループ構造の形成により、
（１）該標的核酸と該オリゴヌクレオチドプローブ間のハイブリダイズが行われない場合には、該オリゴヌクレオチドプローブはエキソヌクレアーゼによる消化を受けないので該標識物質が該オリゴヌクレオチドプローブから遊離せず、又は
（２）該標的核酸と該オリゴヌクレオチドプローブ間のハイブリダイズが行われた場合には、エキソヌクレアーゼによる消化に伴って該オリゴヌクレオチドプローブの鎖長が短くなり、該オリゴヌクレオチドプローブは該標的核酸との二本鎖を維持できなくなり、該標識物質が該オリゴヌクレオチドプローブから遊離する前に、該オリゴヌクレオチドプローブが該標的核酸から離脱するために該標識物質が該オリゴヌクレオチドプローブから遊離せず、
その結果、該標識物質が遊離しないことによる有意なシグナル上昇が起こらないことを検出すること、並びに
（Ａ）該エキソヌクレアーゼが５´→３´エキソヌクレアーゼの場合には、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸との間で形成し得る少なくとも１塩基以上の相補的でない塩基対部分またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの３´末端と標識物質が標識された部位との間に位置するように設計されていること、又は
（Ｂ）該エキソヌクレアーゼが３´→５´エキソヌクレアーゼの場合には、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸との間で形成し得る少なくとも１塩基以上の相補的でない塩基対部分またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの５´末端と標識物質が標識された部位との間に位置するように設計されていること、
を特徴とする方法。 - ５´→３´エキソヌクレアーゼがλエキソヌクレアーゼまたはＴ７ Ｇｅｎｅ６ エキソヌクレアーゼである請求項１に記載の方法。
- ３´→５´エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼＩＩＩである請求項１に記載の方法。
- エキソヌクレアーゼが耐熱性酵素である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 耐熱性酵素がアーキオグロバス フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）に由来する請求項４に記載の方法。
- ＲＮＡより逆転写反応により合成したｃＤＮＡ、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法）または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法にて増幅した産物を精製することなく被検試料として用いる請求項１〜５のいずれか１に記載の方法。
- 標的核酸を、該標的核酸とは１塩基以上の置換、１塩基以上の挿入、及び／又は１塩基以上の欠損を含む核酸と区別して検出する能力を向上させるために、１塩基以上の置換、１塩基以上の挿入、及び／又は１塩基以上の欠損をオリゴヌクレオチドプローブに意図的に導入する請求項１〜６のいずれか１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004354915 | 2004-12-08 | ||
| JP2004354915 | 2004-12-08 | ||
| PCT/JP2005/021554 WO2006061994A1 (ja) | 2004-12-08 | 2005-11-24 | 遺伝子配列検査法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2006061994A1 JPWO2006061994A1 (ja) | 2008-08-07 |
| JP4190562B2 true JP4190562B2 (ja) | 2008-12-03 |
Family
ID=36577825
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006547816A Active JP4190562B2 (ja) | 2004-12-08 | 2005-11-24 | 遺伝子配列検査法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20080213762A1 (ja) |
| EP (1) | EP1829964A4 (ja) |
| JP (1) | JP4190562B2 (ja) |
| KR (1) | KR20070090233A (ja) |
| WO (1) | WO2006061994A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1431398A1 (en) * | 2002-12-20 | 2004-06-23 | Evotec OAI AG | A method for detecting in a mixture an amount of analytes |
| US20120058471A1 (en) * | 2007-08-13 | 2012-03-08 | University Of Strathclyde | Identification of nucleic acid sequences |
| WO2011027966A2 (en) * | 2009-09-03 | 2011-03-10 | Seegene, Inc. | Td probe and its uses |
| CN102115782B (zh) * | 2009-12-30 | 2014-06-18 | 北京雅康博生物科技有限公司 | 用于定量检测K-ras突变的试剂盒 |
| KR20120042100A (ko) * | 2010-10-22 | 2012-05-03 | 주식회사 씨젠 | 이중표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출 |
| EP2607495A1 (en) * | 2011-12-23 | 2013-06-26 | Genomica S.A.U. | Method for detection of KRAS mutations |
| WO2013120089A1 (en) * | 2012-02-10 | 2013-08-15 | Raindance Technologies, Inc. | Molecular diagnostic screening assay |
| US10246739B2 (en) * | 2013-03-15 | 2019-04-02 | Georgetown University | Exonuclease cycling assay |
| DK3109324T5 (en) * | 2015-06-23 | 2019-02-11 | Zytovision Gmbh | PROCEDURE FOR THE DETECTION OF CHROMOSOMA DIFFERENCES |
| US10584363B2 (en) * | 2016-06-03 | 2020-03-10 | Takara Bio Usa, Inc. | Methods of producing and using single-stranded deoxyribonucleic acids and compositions for use in practicing the same |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU5640090A (en) * | 1989-03-21 | 1990-11-05 | Collaborative Research Inc. | A dna diagnostic test using an exonuclease activity |
| US5210015A (en) * | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| US5744306A (en) * | 1993-04-19 | 1998-04-28 | Emory University | Methods for nucleic acid detection, sequencing, and cloning using exonuclease |
| US5538848A (en) * | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| US5919623A (en) * | 1994-04-27 | 1999-07-06 | St. James's And Seacroft University Hospitals Nhs Trust | Nucleic acid mutation assays |
| US7432048B2 (en) * | 1996-11-29 | 2008-10-07 | Third Wave Technologies, Inc. | Reactions on a solid surface |
| CA2286310A1 (en) * | 1997-04-22 | 1998-10-29 | Bavarian Nordic Research Institute A/S | Taqmantm-pcr for the detection of pathogenic e. coli strains |
| US6544730B1 (en) * | 1997-10-27 | 2003-04-08 | Prescott Deininger | High density polymorphic genetic locus |
| AU758463B2 (en) * | 1998-02-04 | 2003-03-20 | Applied Biosystems, Llc | Determination of a genotype of an amplification product at multiple allelic sites |
| ATE286981T1 (de) * | 1999-09-28 | 2005-01-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Thermostabiles enzym welches die genauigkeit thermostabiler dna polymerasen erhöht - zur verbesserung der nucleinsäuresynthese und in vitro amplifikation |
| US7118860B2 (en) * | 1999-10-29 | 2006-10-10 | Stratagene California | Methods for detection of a target nucleic acid by capture |
| JP2002369700A (ja) * | 2000-10-11 | 2002-12-24 | Internatl Reagents Corp | 核酸分析方法 |
| JP2002119299A (ja) * | 2000-10-16 | 2002-04-23 | Internatl Reagents Corp | 遺伝子変異分析法 |
| DE10156249A1 (de) * | 2001-11-15 | 2003-05-28 | Bayer Ag | Regulation der cGMP-spezifischen Phosphodiesterase 9A |
| CN1537954A (zh) * | 2003-04-18 | 2004-10-20 | ������������ʽ���� | 表达基因分析方法以及用于表达基因分析的探针试剂盒 |
| WO2007025085A2 (en) * | 2005-08-24 | 2007-03-01 | Genizon Biosciences Inc. | Genemap of the human genes associated with crohn's disease |
-
2005
- 2005-11-24 EP EP05809430A patent/EP1829964A4/en not_active Withdrawn
- 2005-11-24 US US11/792,662 patent/US20080213762A1/en not_active Abandoned
- 2005-11-24 KR KR1020077015419A patent/KR20070090233A/ko not_active Application Discontinuation
- 2005-11-24 WO PCT/JP2005/021554 patent/WO2006061994A1/ja active Application Filing
- 2005-11-24 JP JP2006547816A patent/JP4190562B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1829964A1 (en) | 2007-09-05 |
| JPWO2006061994A1 (ja) | 2008-08-07 |
| KR20070090233A (ko) | 2007-09-05 |
| EP1829964A4 (en) | 2009-03-04 |
| WO2006061994A1 (ja) | 2006-06-15 |
| US20080213762A1 (en) | 2008-09-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4190562B2 (ja) | 遺伝子配列検査法 | |
| JP5112592B2 (ja) | ハイブリダイゼーション・ビーコン、並びに迅速に配列を検出および判別する方法 | |
| US7998673B2 (en) | Hybridisation beacon and method of rapid sequence detection and discrimination | |
| KR100557329B1 (ko) | 혼성화 부위 조절 올리고뉴클레오타이드 및 그의 용도 | |
| EP2756101B1 (en) | Probe: antiprobe compositions for high specificity dna or rna detection | |
| EP2980224B1 (en) | Kits for analyzing single-stranded nucleic acid sequences | |
| WO2003066803A2 (en) | Pyrophosphorolysis and incorporation of nucleotide method for nucleic acid detection | |
| JP2010519896A (ja) | 核酸配列の検出方法 | |
| WO2003052140A2 (en) | High throughput analysis and detection of multiple target sequences | |
| KR102371222B1 (ko) | 표적핵산 증폭방법 및 표적핵산 증폭용 조성물 | |
| Bustin | Real-time PCR | |
| KR102323375B1 (ko) | 다중 프로브 | |
| Lu et al. | Rapid and highly specific detection of communicable pathogens using one-pot loop probe-mediated isothermal amplification (oLAMP) | |
| JP5207355B2 (ja) | 標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法、プローブセット、及び核酸の識別方法 | |
| CN111996244B (zh) | 一种单核苷酸多态性检测用组合物及其应用 | |
| WO2013093432A1 (en) | Method for enriching and detection of variant target nucleic acids | |
| WO2006112939A2 (en) | Compositions, methods, and kits for analyzing dna methylation | |
| JP5720564B2 (ja) | 遺伝子型の識別方法 | |
| JP6389473B2 (ja) | 高解像能融解の較正の改善 | |
| KR102486630B1 (ko) | 중합효소연쇄반응을 기반으로 한 표적 점 돌연변이의 검출 방법 | |
| KR102575618B1 (ko) | 가이드 프로브 및 클램핑 프로브를 이용한 표적핵산 증폭방법 및 이를 포함하는 표적핵산 증폭용 조성물 | |
| EP1606389B1 (en) | Methods for polynucleotide sequence detection | |
| WO2006031061A1 (en) | Fret gene probe selection method using pcr screening | |
| Ünsal et al. | A novel method of multiplex SNP genotyping assay through variable fragment length allele-specific polymerase chain reaction: Multiplex VFLASP-ARMS | |
| JP4310675B2 (ja) | 塩基多型の同定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080910 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080916 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110926 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110926 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110926 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120926 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120926 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120926 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130926 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S801 | Written request for registration of abandonment of right |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R311801 |
|
| ABAN | Cancellation due to abandonment | ||
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |