JP4175994B2 - Isoamyl alcohol and isoamyl acetate high-producing yeast strains, screening methods thereof, and methods of using these strains - Google Patents
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Description
本発明は、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株のスクリーニング方法、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株の作製方法、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株の利用方法、特に、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株を用いたイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの製造方法に関する。 The present invention relates to isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate high-producing yeast strain, isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate high-producing yeast strain, isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate high-producing yeast strain, isoamyl alcohol and / or Alternatively, the present invention relates to a method for using isoamyl acetate high-producing yeast strains, and more particularly, to a method for producing isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate using isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate high-producing yeast strains.
清酒中には香りを呈する成分が非常に多く含まれており、数百種類に及ぶ成分が微妙に調和されてその香りが形作られている。中でも酢酸イソアミルは、吟醸香の主成分の一つであり香りの華やかさという点では特に重要な成分である。酢酸イソアミルはアセチルＣｏＡおよびイソアミルアルコールから、酵母サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルコールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡＴＦａｓｅ）を介して生成される。 Sake contains a lot of scented ingredients, and several hundreds of ingredients are finely harmonized to form the scent. Among them, isoamyl acetate is one of the main components of Ginjo incense, and is an especially important component in terms of fragrance. Isoamyl acetate is produced from acetyl CoA and isoamyl alcohol via the alcohol Saccharomyces cerevisiae alcohol acetyltransferase (AATFase).
酢酸イソアミルの生産量を増加させるには、基質となるイソアミルアルコールの生産量を増加させることが一つの手段である。イソアミルアルコールの基質はロイシンであることが知られている。一方、イソアミルアルコール合成経路の律速酵素であるα−イソプロピルマレートシンターゼ（α−ＩＰＭ）はロイシンによるフィードバック阻害を受けることが知られているため、ロイシン濃度を上げてもイソアミルアルコール生産量は頭打ちとなると考えられている。 One way to increase the production of isoamyl acetate is to increase the production of isoamyl alcohol as a substrate. It is known that the substrate for isoamyl alcohol is leucine. On the other hand, α-isopropylmalate synthase (α-IPM), which is the rate-limiting enzyme of the isoamyl alcohol synthesis pathway, is known to be subject to feedback inhibition by leucine. It is thought to be.
α−イソプロピルマレートシンターゼ（α−ＩＰＭ）のフィードバック阻害を受けない変異株の育種方として、ロイシンアナログである５−５−５−トリフロオロロイシン（ＴＦＬ）耐性株の取得が報告されている（例えば、非特許文献１：栗山と水津、「清酒酵母のＡＡＡＦａｓｅについて」、清酒酵母の研究（１９９２）ｐ. １４５；または、非特許文献２：アシダ エフ, コダマ ワイ, アシカリ ティ（Ａｓｈｉｄａ Ｆ，Ｋｏｄａｍａ Ｙ，Ａｓｈｉｋａｒｉ Ｔ. ），Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８７）Ｖｏｌ．４８，ｐ. ２０７参照。）。この方法で取得された変異株のうちいくつかはα−イソプロピルマレートシンターゼ（α−ＩＰＭ）をコードするＬＥＵ４遺伝子における変異であることが示されている。しかしながら、スクリーニングの原理からしてこの方法では、そもそもロイシンを細胞外から十分に取り込めない変異株が多く取得されることになるので、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産株をスクリーニングする方法としては効率的ではない。 As a method of breeding mutants that are not subject to feedback inhibition of α-isopropylmalate synthase (α-IPM), acquisition of a leucine analog 5-5-5-trifluoroleucine (TFL) resistant strain has been reported. (For example, Non-Patent Document 1: Kuriyama and Mizutsu, “AAAAFase of Sake Yeast”, Research on Sake Yeast (1992) p. 145; or Non-Patent Document 2: Ashida F, Kodama Wai, Ashikari (Ashida F, Kodama Y, Ashikari T.), Agric. Biol. Chem. (1987) Vol. 48, p. 207). Some of the mutant strains obtained by this method have been shown to be mutations in the LEU4 gene encoding α-isopropylmalate synthase (α-IPM). However, because of the screening principle, many mutant strains that cannot sufficiently take leucine from the outside of the cell will be obtained in the first place. Therefore, as a method for screening high isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate producing strains, Not efficient.
一方、酵母のユビキチンリガーゼＲｓｐ５の発現量が低下した変異株ｎｐｉｌでは、ロイシン輸送体であるＢａｐ２の発現量が増大することが報告されているが、（例えば、非特許文献３：オームラ エフ, コダマ ワイ, アシカリ ティ（Ｏｍｕｒａ Ｆ，Ｋｏｄａｍａ Ｙ，Ａｓｈｉｋａｒｉ Ｔ．），「酵母パーミアーゼＢａｐ２ｐのＮ−末端はその分解に重要な役割を果たす（Ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｐｅｒｍｅａｓｅ Ｂａｐ２ｐ ｐｌａｙｓ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｔｓ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）」，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００１，Ｖｏｌ．２８７，ｐ．１０４５−１０５０；または、非特許文献４：オームラ エフ, コダマ ワイ, アシカリ ティ（Ｏｍｕｒａ Ｆ，Ｋｏｄａｍａ Ｙ，Ａｓｈｉｋａｒｉ Ｔ．），「酵母の分枝鎖アミノ酸の基礎代謝回転にはC-末端尾部を必要とする」（Ｔｈｅ ｂａｓａｌ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｈａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｅｒｍｅａｓｅ Ｂａｐ２ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｉｔｓ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔａｉｌ）」，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２００１．ｖｏｌ．１９４，ｐ. ２０７−２１４参照。）、実際のロイシン取り込み速度やイソアミルアルコール生産能については何ら報告されていない。 On the other hand, in the mutant npil in which the expression level of yeast ubiquitin ligase Rsp5 is reduced, the expression level of Bap2, which is a leucine transporter, has been reported to increase (for example, Non-Patent Document 3: Omura F, Kodama Wye, Ashikariti (Omura F, Kodama Y, Ashikari T.), “The N-terminal of the yeast permease bap2p is a major role in its degradation. ”, Biochem Biophys Res. Commun., 2001, Vol. 287, p. 1045-1050; or Non-Patent Document 4: Omura F, Kodama Wai, Ashikarite (Omura F, Kodama Y, Ashikari T.), “The basic turnover of yeast branched-chain amino acids requires a C-terminal tail” (The basal turnover of yeast amino acid permease permease permease acid permease permease acid perme2 terminal tail "), FEMS Microbiol Lett. 2001. vol. 194, p. 207-214.) No actual leucine uptake rate or isoamyl alcohol-producing ability has been reported.
本発明の目的は、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株をスクリーニングする方法を提供することである。
また、本発明の目的はイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを簡便かつ効率的に製造する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能の増大した酵母株を作製する方法を提供することである。本発明の目的は、酵母株、特に醸造用酵母株のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能を増大させる方法を提供することでもある。
It is an object of the present invention to provide a method for screening yeast strains that produce high isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate.
Another object of the present invention is to provide a method for easily and efficiently producing isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate.
Another object of the present invention is to provide a method for producing a yeast strain having an increased ability to produce isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate. The object of the present invention is also to provide a method for increasing the ability of yeast strains, in particular brewing yeast strains, to produce isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate.
本発明者らは、生体膜に何らかの変異を有する酵母株の特性を解析するため、高圧下または低温下でも増殖可能な変異株を多数取得し、これらの酵母株を解析してきた。その解析過程において、高圧または低温下で酵母を培養することによってイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの生産能が著しく増大した酵母株を取得し得ることを見出した。
本発明は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する酵母を１０〜１００ＭＰａの圧力下で培養し、前記圧力下で増殖し得る酵母を選抜することを含む、前記配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する酵母株に比較してイソアミルアルコール生産能が少なくとも１．５倍、好ましくは１．６〜５．０倍、より好ましくは１．８〜２．８倍、および／または酢酸イソアミルの生産能が少なくとも１．５倍、好ましくは１．６〜１０倍、より好ましくは２〜７．６倍に増大した、配列番号８、１０または１２に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを保持する酵母株をスクリーニングする方法である。
更に、本発明は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する酵母の培養が２０〜６０ＭＰａ、特に好ましくは３０〜６０ＭＰａで行われる、上記配列番号８、１０または１２に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを保持する酵母株である、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株をスクリーニングする方法である。
In order to analyze the characteristics of yeast strains having some mutation in the biological membrane, the present inventors have obtained a large number of mutant strains that can grow even under high pressure or low temperature, and have analyzed these yeast strains. In the analysis process, it was found that yeast strains with significantly increased ability to produce isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate can be obtained by culturing yeast under high pressure or low temperature.
The present invention includes culturing a yeast having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 under a pressure of 10 to 100 MPa and selecting a yeast capable of growing under the pressure, wherein the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 The ability to produce isoamyl alcohol is at least 1.5 times, preferably 1.6 to 5.0 times, more preferably 1.8 to 2.8 times, and / or isoamyl acetate. A polynucleotide encoding a polypeptide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 8, 10 or 12, wherein at least 1.5 times, preferably 1.6 to 10 times, more preferably 2 to 7.6 times increased This is a method for screening yeast strains to be retained .
Furthermore, the present invention provides a polypeptide having the sequence described in SEQ ID NO: 8, 10 or 12, wherein the yeast having the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 is cultured at 20-60 MPa, particularly preferably 30-60 MPa. a yeast strain carrying a polynucleotide encoding is a method of screening for isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate high-producing yeast strains.
また、本発明は配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する酵母を２４℃で培養し、４〜１７℃の温度条件下で増殖し得る酵母を選抜することを含む、前記配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する酵母株に比較してイソアミルアルコールの生産能が少なくとも１．５倍、好ましくは１．６〜５．０倍、より好ましくは１．８〜２．８倍および／または酢酸イソアミルの生産能が少なくとも１．５倍、好ましくは１．６〜１０倍、より好ましくは２〜７．６倍に増大した、配列番号６に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを保持する酵母株をスクリーニングする方法である。
更に本発明は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する酵母の培養が４〜１５℃、特に好ましくは６〜１０℃で行われる、上記配列番号６に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを保持する酵母株である、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株をスクリーニングする方法である。
Further, the present invention by culturing a yeast having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 at 24 ° C., comprising selecting a yeast that can be grown at a temperature of 4 to 17 ° C., according to the SEQ ID NO: 1 The ability to produce isoamyl alcohol is at least 1.5 times, preferably 1.6 to 5.0 times, more preferably 1.8 to 2.8 times and / or isoamyl acetate compared to yeast strains having a nucleotide sequence. Holds a polynucleotide encoding a polypeptide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 6, having a productivity increased by at least 1.5 times, preferably 1.6 to 10 times, more preferably 2 to 7.6 times A method for screening yeast strains.
Furthermore, the present invention encodes a polypeptide having the sequence shown in SEQ ID NO: 6, wherein the yeast having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is cultured at 4-15 ° C, particularly preferably 6-10 ° C. This is a method of screening a yeast strain that produces isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate , which is a yeast strain carrying a polynucleotide .
本発明の、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株をスクリーニングする方法において、必要に応じてイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの生産能について評価する工程が更に追加される。 In the method for screening a yeast strain producing high isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate according to the present invention, a step of evaluating the ability to produce isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate is further added as necessary .
本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列においてＰｒｏ514 がＴｈｒ514 に置換されたアミノ酸配列（配列番号６）を有するポリペプチド、Ｃｙｓ517 がＴｙｒ517 に置換されたアミノ酸配列（配列番号８）を有するポリペプチド、Ｃｙｓ517 がＰｈｅ517 に置換されたアミノ酸配列（配列番号１０）を有するポリペプチド、または、Ａｌａ799 がＴｈｒ799 に置換されたアミノ酸配列（配列番号１２）を有するポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド（それぞれ、配列番号５、７、９および１１に記載の配列を有する）を保持する酵母を培養してイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを前記酵母株に産生させることを特徴とする、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの製造方法である。 The present invention relates to a polypeptide having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) in which Pro 514 is substituted with Thr 514 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and an amino acid sequence in which Cys 517 is substituted with Tyr 517 (SEQ ID NO: 8). A polypeptide having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) in which Cys 517 is replaced with Phe 517 , or a polypeptide having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) in which Ala 799 is replaced with Thr 799. Culturing a yeast carrying the encoding polynucleotide (having the sequences set forth in SEQ ID NOs: 5, 7, 9 and 11 respectively) to produce isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate in the yeast strain. , Isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate.
本発明に使用するイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母はＲＳＰ５遺伝子内、特にＨＥＣＴドメインをコードする領域に変異を有する酵母である。より具体的には、本発明に使用する酵母は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列において塩基番号１３４８〜２４２７の領域に変異を有する配列によって定義されるポリヌクレオチドであって、前記変異によって前記領域がコードするアミノ酸配列に変異が生じている前記ポリヌクレオチドを保持する酵母のうち、配列番号２に記載のアミノ酸配列においてＰｒｏ514 がＴｈｒ514 に置換されたアミノ酸配列（配列番号６）を有するポリペプチド、Ｃｙｓ517 がＴｙｒ517 に置換されたアミノ酸配列（配列番号８）を有するポリペプチド、Ｃｙｓ517 がＰｈｅ517 に置換されたアミノ酸配列（配列番号１０）を有するポリペプチド、または、Ａｌａ799 がＴｈｒ799 に置換されたアミノ酸配列（配列番号１２）を有するポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド（それぞれ、配列番号５、７、９および１１）を保持する酵母である。本発明に使用するイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する酵母株に比較してイソアミルアルコール生産能が少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも１．６倍、より好ましくは少なくとも１．８倍に増大し、および／または、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する酵母株に比較して酢酸イソアミルの生産能が少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも１．６倍、より好ましくは少なくとも２倍に増大している。 The isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate high-producing yeast used in the present invention is a yeast having a mutation in the RSP5 gene, particularly in the region encoding the HECT domain. More specifically, the yeast used in the present invention is a polynucleotide defined by a sequence having a mutation in the region of base numbers 1348 to 2427 in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the region is A polypeptide having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) in which Pro 514 is substituted with Thr 514 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 among yeasts that retain the polynucleotide in which a mutation has occurred in the amino acid sequence encoded by , A polypeptide having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) in which Cys 517 is replaced with Tyr 517 , a polypeptide having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) in which Cys 517 is replaced with Phe 517 , or Ala 799 is Thr 799 A polypeptide encoding a polypeptide having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) substituted with Nucleotides (respectively, SEQ ID NO: 5, 7, 9 and 11) is a yeast that holds. The isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate high-producing yeast strain used in the present invention has an isoamyl alcohol-producing ability of at least 1.5 times, preferably at least 1.5 times that of the yeast strain having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. 6-fold, more preferably at least 1.8-fold, and / or the ability to produce isoamyl acetate is at least 1.5-fold, preferably at least compared to the yeast strain having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 It is increased 1.6 times, more preferably at least 2 times.
このような酵母株は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＡＹ１８Ａ （受託番号ＦＥＲＭＰ−１９５３２）、ＦＡＹ１２Ｃ（受託番号ＦＥＲＭＰ−１９５３３）、ＦＡＹ１７１Ｅ（受託番号ＦＥＲＭＰ−１９５３４）、ＦＡＹ２９Ｅ（受託番号ＦＥＲＭＰ−１９５３５）によって特定される酵母株である。
また、本発明は、上述したイソアミルアルコールおよび／または上述した酢酸イソアミル高生産酵母株自体である。特に本発明は上述したポリヌクレオチドを有するイソアミルアルコールおよび／または上述した酢酸イソアミル高生産酵母株自体でもある。
Such yeast strains are Saccharomyces cerevisiae FAY18A (Accession Number FERMP-19532), FAY12C (Accession Number FERMP-19533), FAY171E (Accession Number FERMP-19534), FAY29E (Accession Number FERMP-135). Yeast strain identified .
Moreover, this invention is the isoamyl alcohol mentioned above and / or the above-mentioned isoamyl acetate high-producing yeast strain itself. In particular, the present invention is isoamyl alcohol having the above-mentioned polynucleotide and / or the above-mentioned isoamyl acetate high-producing yeast strain itself.
更に本発明は、上記いずれかのスクリーニング方法によって得られるイソアミルアルコールおよび／または上述した酢酸イソアミル高生産酵母株を培養し、前記酵母株にイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを産生させることを特徴とする、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの製造方法である。 Furthermore, the present invention is characterized by culturing isoamyl alcohol obtained by any of the above screening methods and / or the above-mentioned isoamyl acetate high-producing yeast strain, and causing the yeast strain to produce isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate. , Isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate.
また、本発明は、醸造に用いられている酵母菌株等を親株として、本発明の、または本発明の方法によって得られるイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株とを接合させて胞子を形成させ、この胞子から得られる酵母から親株に比較してイソアミルアルコール生産能が少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも１．６倍、より好ましくは少なくとも１．８倍増大し、および／または酢酸イソアミル生産能が少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも１．６倍、より好ましくは少なくとも２倍に増大した酵母株を選抜することを特徴とする、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能が増大した酵母株を作製する方法、または、前記親株のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能を増大させる方法である。 In addition, the present invention forms a spore by joining a yeast strain used for brewing as a parent strain and isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate high-producing yeast strain of the present invention or obtained by the method of the present invention. And isoamyl alcohol-producing ability is increased by at least 1.5 times, preferably at least 1.6 times, more preferably at least 1.8 times, and / or isoamyl acetate production from yeast obtained from this spore compared to the parent strain A yeast strain having an increased ability to produce isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate, characterized by selecting a yeast strain having an ability increased by at least 1.5 times, preferably at least 1.6 times, more preferably at least 2 times Or isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate of the parent strain It is a method of increasing the capacity.
本発明において、特に、本発明の酵母、本発明によってスクリーニングされる酵母または本発明の方法に使用する酵母はサッカロミセス属酵母、特にサッカロミセス・セレビシアエである。 In the present invention, in particular, the yeast of the present invention, the yeast screened according to the present invention, or the yeast used in the method of the present invention is Saccharomyces yeast, particularly Saccharomyces cerevisiae.
本発明により、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する酵母株に比較してイソアミルアルコールの生産能が少なくとも１．５倍および／または酢酸イソアミルの生産能が少なくとも１．５倍増大した、サッカロミセス属酵母株であるサッカロミセス・セレビシアエが得られる。また、本発明により、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを効率的かつ簡便に生産することができる。さらに、本発明により、醸造に用いられている酵母のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能を増大させることができる。 According to the present invention, the ability to produce isoamyl alcohol is increased by at least 1.5 times and / or the ability to produce isoamyl acetate by at least 1.5 times compared to the yeast strain having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. The yeast strain Saccharomyces cerevisiae is obtained. Further, according to the present invention, isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate can be produced efficiently and simply. Furthermore, according to the present invention, the ability of yeast used for brewing to produce isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate can be increased.
本発明において、最初に配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する酵母を通常の培地、例えばＹＰＤ（１％バクトイーストエクストラクト、２％バクトペプトン、２％Ｄ−グルコース）培養液で、酵母培養に用いられる通常の温度、例えば２４℃〜３７℃、好ましくは２４℃〜３０℃にて終夜振盪培養を行う。これを前培養物として用いて続く操作を行う。本発明の方法を適用し得る酵母、および本発明の方法に使用し得る酵母はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）酵母のうち、サッカロミセス・セレビシアエ（出芽酵母）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。これらの酵母は醸造工業にも広く利用されており、中でも酒類、特に清酒醸造用にこれらの酵母がよく使用されている。 In the present invention, yeast having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is first subjected to yeast culture in a normal medium such as YPD (1% bacto yeast extract, 2% bactopeptone, 2% D-glucose) culture solution. The shaking culture is performed overnight at the usual temperature used, for example, 24 ° C to 37 ° C, preferably 24 ° C to 30 ° C. The subsequent operation is performed using this as a preculture. The yeast to which the method of the present invention can be applied and the yeast that can be used for the method of the present invention is Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) among Saccharomyces yeasts . These yeasts are widely used in the brewing industry, and among them, these yeasts are often used for alcoholic beverages, particularly sake brewing.
上記終夜振盪した細胞培養液を適切な新しい培養液、好ましくは終夜培養に用いたのと同じ組成の培養液、に一定量加える。新たな培地を添加する終夜培養液（前培養物）の量は一般には新たな培地の０．０１％〜１０％、好ましくは０．１％〜５％（体積％）である。また、培養液の全量は特に限定されず、処理の簡便性、必要な上清またはイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの量を考慮して決定することができる。終夜培養液を添加した新しい培養液を含む容器に入れ、容器全体を高圧容器内に入れる。次に、高圧ハンドポンプを用いて容器内部を加圧し、好ましくは１０〜１００ＭＰａ（約１００〜１０００気圧）、より好ましくは２０〜６０ＭＰａ、特に好ましくは３０〜６０ＭＰａ、の圧力条件下で好ましくは１週間〜３ヶ月間、より好ましくは３週間〜２ヶ月培養する。培養温度は、酵母の培養に通常使用される温度、例えば、２４℃〜３７℃、好ましくは２４℃〜３０℃でよく、一般には約２４℃が利用される。培養後、容器を減圧し、細胞培養液１００〜５００μｌをＹＰＤ寒天培地に塗布し、一般的な実験室条件にて培養、すなわち、大気圧下、前述した通常の培養温度にて培養して出現したコロニーを別個に独立した菌株として回収することができる。大気圧とは、大気によって生じる圧力を言い、一般に１０１．３ｋＰａ程度の圧力であって、自然環境下で通常発生し得る圧力をいう。酵母、特にサッカロミセス・セレビシアエは１５〜２５ＭＰａの圧力下で顕著な増殖阻害が起こることが知られている。従って、このとき得られる菌株を本明細書において特に高圧増殖変異株と呼ぶこともある。得られた高圧増殖変異株を更にイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル産生能について評価することができる。 A certain amount of the above-obtained overnight cell culture is added to a suitable new culture, preferably the same composition used for overnight culture. The amount of the overnight culture medium (preculture) to which a new medium is added is generally 0.01% to 10%, preferably 0.1% to 5% (volume%) of the new medium. Further, the total amount of the culture solution is not particularly limited, and can be determined in consideration of the ease of processing, the necessary supernatant or the amount of isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate. Place in a container containing fresh broth with overnight broth and place the entire vessel in a high pressure vessel. Next, the inside of the container is pressurized using a high-pressure hand pump, preferably 10 to 100 MPa (about 100 to 1000 atm), more preferably 20 to 60 MPa, particularly preferably 30 to 60 MPa, preferably 1 The culture is performed for 3 weeks to 3 months, more preferably 3 weeks to 2 months. The culture temperature may be a temperature usually used for yeast culture, for example, 24 ° C to 37 ° C, preferably 24 ° C to 30 ° C, and generally about 24 ° C is used. After culturing, the container is decompressed, and 100 to 500 μl of cell culture solution is applied to the YPD agar medium, and cultured under general laboratory conditions, that is, cultured under the normal culture temperature described above under atmospheric pressure. Colonies can be collected separately as independent strains. The atmospheric pressure refers to a pressure generated by the atmosphere, generally a pressure of about 101.3 kPa, and a pressure that can normally be generated in a natural environment. Yeast, particularly Saccharomyces cerevisiae, is known to undergo significant growth inhibition under pressures of 15-25 MPa. Therefore, the strain obtained at this time may be particularly referred to as a high-pressure growth mutant in this specification. The obtained high-pressure growth mutant can be further evaluated for the ability to produce isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate.
あるいは、上述のように終夜振盪した培養液（前培養物）１００〜５００μｌを酵母培養に使用される通常の寒天培地、例えばＹＰＤ寒天培地に塗布し、大気圧下、４〜１７℃、好ましくは４〜１５℃、より好ましくは６℃〜１０℃という低温条件下で好ましくは１週間〜３ヶ月間、より好ましくは３週間〜２ヶ月間培養して出現したコロニーを独立した菌株として個別に回収する。本明細書において、この条件下で得られる菌株を特に低温増殖変異株と呼ぶことがある。得られた低温増殖変異株についても更にイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル産生能について評価することができる。 Alternatively, 100 to 500 μl of the culture solution (preculture) shaken overnight as described above is applied to a normal agar medium used for yeast culture, such as a YPD agar medium, and 4 to 17 ° C. under atmospheric pressure, preferably Colonies that emerge after culturing for 4 to 15 ° C., more preferably 6 to 10 ° C., preferably 1 week to 3 months, more preferably 3 weeks to 2 months are individually collected as independent strains. To do. In the present specification, a strain obtained under these conditions may be referred to as a cold growth mutant. The obtained cold-growing mutant strain can be further evaluated for isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate production ability.
得られた高圧増殖変異株または低温増殖変異株のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの生産能は、これらの酵母株を通常の条件下（常温および通常の大気圧条件を含む）で培養し、培養上清中のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを測定することによって評価することができる。本発明の方法に使用する、または本発明の方法によって得られるイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株は、酵母が生理的に活性である培地（但しロイシンを含む）を用いて一般的な培養条件を用いて培養することによりイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを多量に産生することができる。酵母が生理的に活性である培地とは、酵母がイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを合成し得る培地をいい、これらには酵母培養用に調製された実験室内培養用培地だけでなく、醸造工程において酵母がイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを合成し得る、固体、半固体、流動体、液体等の状態である外部環境を構成する物質、組成物、又は混合物も含まれる。一般には、本発明の、または本発明の方法によって得られる酵母は大気圧下、すなわち、約１０１．３ｋＰａ（約１気圧）程度であって自然環境下で一般に生じ得る圧力下で培養されるが、大気圧の２５０倍までの高圧下で培養しても大気圧下と同等の効率で同等の量のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを産生させることができる。 The ability to produce isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate of the obtained high-pressure growth mutant or low-temperature growth mutant is obtained by culturing these yeast strains under normal conditions (including normal temperature and normal atmospheric pressure conditions). It can be evaluated by measuring isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate in the supernatant. Isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate high-producing yeast strains used in the method of the present invention or obtained by the method of the present invention are commonly used in a medium in which the yeast is physiologically active (including leucine). A large amount of isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate can be produced by culturing using the culture conditions. A medium in which yeast is physiologically active refers to a medium in which yeast can synthesize isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate, including not only a laboratory culture medium prepared for yeast culture but also a brewing process. Also included are substances, compositions, or mixtures that constitute the external environment in a solid, semi-solid, fluid, liquid, etc. state in which yeast can synthesize isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate. In general, the yeast of the present invention or obtained by the method of the present invention is cultivated under atmospheric pressure, that is, about 101.3 kPa (about 1 atm) and pressure that can generally occur in a natural environment. Even if the culture is performed under a high pressure up to 250 times the atmospheric pressure, the same amount of isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate can be produced with the same efficiency as that under atmospheric pressure.
イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの生産能の評価は、例えば、野生型酵母および上記変異株を、１ｇ／Ｌ〜２ｇ／Ｌ程度のロイシンを含む、酵母に用いられる通常のロイシン含有培地（例えばＹＰＤ培地）中の通常の条件下、例えば大気圧下、２４〜３０℃にて振盪培養し、例えば１２時間後、２４時間後、好ましくは４８時間後の培養上清中のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル濃度を測定することによって行うことができる。溶液中のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル濃度の測定方法および測定装置は当業者にはよく知られており、例えばガスクロマトグラフィー分析によって測定することができる。これにより、本発明のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株の培養上清には培養開始２４時間後および４８時間後には、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する酵母株に比較して、１．５倍以上の酢酸イソアミルが蓄積されることを確認することができる。
培養上清に蓄積されたイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルは上清中に存在したまま使用することも、常法に従って回収および精製することもできる。培養上清が醸造生産物として使用される場合は一般にはイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを回収する必要はない。
Evaluation of the ability to produce isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate is carried out, for example, by using wild-type yeast and the above-described mutant strain in a normal leucine-containing medium (for example, YPD) used in yeast containing about 1 g / L to 2 g / L of leucine. Medium) under normal conditions, for example, shaking at 24-30 ° C. under atmospheric pressure, for example, after 12 hours, after 24 hours, preferably after 48 hours, isoamyl alcohol and / or acetic acid in the culture supernatant This can be done by measuring the isoamyl concentration. Methods and apparatus for measuring isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate concentrations in a solution are well known to those skilled in the art and can be measured, for example, by gas chromatography analysis. Thus, the culture supernatant of the isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate high-producing yeast strain of the present invention is compared with the yeast strain having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 after 24 hours and 48 hours from the start of the culture. It can be confirmed that 1.5 times or more of isoamyl acetate is accumulated .
Isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate accumulated in the culture supernatant can be used as they are in the supernatant, or can be recovered and purified according to a conventional method. When the culture supernatant is used as a brewed product, it is generally not necessary to recover isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate.
得られた変異株について、更に遺伝的背景を解析することができる。例えば、まず、変異株からゲノムＤＮＡを抽出し、適切なクローニングベクターに挿入してライブラリーを作製する。使用するベクターは後に簡便に回収できることが望ましく、例えば、複製可能な非組み込み型ベクターが好ましい。
作製したライブラリーを酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法等を用いて野生型酵母に導入し、上述した温度条件、または圧力条件下で、通常の培地を用いて１週間〜３週間培養する。更に、得られたクローンに対して上述したようにイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能を評価し、これらの生産能が増大したクローンからプラスミドＤＮＡを回収する。回収したプラスミドＤＮＡに含まれるゲノム遺伝子断片の配列を調べることによって、ゲノム上に生じた変異の位置および変異配列を特定することができる。酵母からのゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡの抽出、適切なクローニングベクター、酵母の遺伝子導入方法、ヌクレオチド配列決定法、一般的な核酸の取り扱い方法を含む分子生物学的技術は当業者にはよく知られたものである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ II（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ（１９９４）；また、サッカロミセス・セレビシアエのゲノムの遺伝地図、物理地図に関する情報はｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ／等から入手可能である。）。
The genetic background of the obtained mutant strain can be further analyzed. For example, first, genomic DNA is extracted from a mutant strain and inserted into an appropriate cloning vector to prepare a library. It is desirable that the vector to be used can be easily recovered later. For example, a replicable non-integrated vector is preferable.
The prepared library is introduced into wild-type yeast using a lithium acetate method, an electroporation method, or the like, and cultured for 1 week to 3 weeks using a normal medium under the temperature condition or pressure condition described above. Furthermore, isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate production ability is evaluated for the obtained clones as described above, and plasmid DNA is recovered from the clones with increased production ability. By examining the sequence of the genomic gene fragment contained in the recovered plasmid DNA, the position and mutation sequence of the mutation that has occurred on the genome can be identified. Molecular biological techniques, including extraction of genomic and plasmid DNA from yeast, appropriate cloning vectors, yeast gene transfer methods, nucleotide sequencing methods, and general nucleic acid handling methods are well known to those skilled in the art. (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. A. N. Glover ed. 1985), FM Ausubel et al., Current Protocol. s in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc (1994); information on the genetic and physical maps of Saccharomyces cerevisiae genome is available at http://genome-www.stanford.edu/saccharomyces/etc. ).
特に、本発明の、および本発明の方法によって得られる、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株は一般に第５染色体右腕に存在するＲＳＰ５遺伝子内、具体的にはＨＥＣＴ型ユビキチンリガーゼＲＳＰ５遺伝子内に変異を有する。より具体的には、それらの変異はＨＥＣＴ型ユビキチンリガーゼＲｓｐ５をコードするＲＳＰ５遺伝子中の触媒部位であるＨＥＣＴドメイン（配列番号３および４参照）をコードする領域にあり、アミノ酸置換を生じるようなタイプの変異である。このような変異型ＲＳＰ５遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の列を配列番号５〜１２に示した。Ｒｓｐ５のアミノ酸配列はサッカロミセス・セレビシアエ間、特にサッカロミセス・セレビシアエ、サッカロミセス・バヤヌス、サッカロミセス・パストリアヌスの間では非常によく保存されている。特にＨＥＣＴドメインのアミノ酸配列は、酵母間、特にサッカロミセス属酵母間でよく保存されており、サッカロミセス・セレビシアエの種々の株、例えば、ビール酵母、清酒酵母、ワイン酵母の間ではほぼ１００％保存されている。 In particular, the isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate high-producing yeast strains of the present invention and obtained by the method of the present invention are generally present in the RSP5 gene present in the right arm of chromosome 5 , specifically in the HECT ubiquitin ligase RSP5 gene. Have mutations. More specifically, these mutations are in the region encoding the HECT domain (see SEQ ID NOs: 3 and 4), which is the catalytic site in the RSP5 gene encoding the HECT-type ubiquitin ligase Rsp5, and a type that causes an amino acid substitution It is a mutation. Nucleotide and amino acid sequences of such mutant RSP5 gene are shown in SEQ ID NOs: 5-12. The amino acid sequence of Rsp5 is very well conserved among Saccharomyces cerevisiae, especially Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, and Saccharomyces pastorianus. In particular, the amino acid sequence of the HECT domain is well conserved among yeasts, particularly among Saccharomyces yeasts, and is almost 100% conserved among various strains of Saccharomyces cerevisiae, such as beer yeast, sake yeast, and wine yeast. Yes.
本発明のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株は、上述したように単一の遺伝子に変異を生じさせることによって作製できるため、本発明のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株を他の酵母（親株）と接合させて胞子を形成させ、４分子解析によって上述した変異を有する酵母株を選抜する、および／またはこれらの胞子から得られる酵母からイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能が親株に比較して増大した酵母株を選抜することにより、親株に比較してイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能を増大させた酵母株を容易に得ることができる。より具体的には、前述した方法により、醸造工程で使用される有用な酵母株、例えば、清酒酵母のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能を増大することができる。 Since the isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate high-producing yeast strain of the present invention can be produced by mutating a single gene as described above, the isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate high-producing yeast strain of the present invention is selected. Ability to produce isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate from yeast obtained by mating with other yeast (parent strain) to form spores, selecting the yeast strains having the mutations described above by four-molecule analysis, and / or these spores By selecting a yeast strain having increased compared to the parent strain, a yeast strain having an increased ability to produce isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate compared to the parent strain can be easily obtained. More specifically, the above-described method can increase the ability to produce isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate of a useful yeast strain used in the brewing process, for example, sake yeast.
１）イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株の作製およびスクリーニング
出芽酵母サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＰＨ４９９株（ＭＡＴａ ｈｉｓ３−Δ２００ ｌｅｕ２−Δ１ ｌｙｓ２−８０１ ｔｒｐ１−Δ１ ａｄｅ２−１０１ ｕｒａ３−５２）、（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｒ．Ｓ．，ａｎｄ Ｈｉｅｔｅｒ，Ｐ．（１９８９），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２２，１９−２７）をＹＰＤ（１％バクトイーストエクストラクト、２％バクトペプトン、２％Ｄ−グルコース）１５ｍｌの培養液中、２４℃にて終夜振盪培養を行った。得られた培養液の１００〜５００μｌをＹＰＤ寒天培地に塗布し、大気圧下（一般実験室内気圧下）（約１０１．３ｋＰａ）、４℃、６℃、８℃、１０℃、１５℃、１７℃にて１週間〜３ヶ月間培養した。
出現したコロニーを逐次取得しそれらをイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産候補株（低温増殖変異株）として単離した。低温増殖変異株が２００株得られた。
1) Production and Screening of Yeast Strains with High Production of Isoamyl Alcohol and / or Isoamyl Acetate Saccharomyces cerevisiae YPH499 strain (MATa his3-Δ200 leu2-Δ1 lys2-801 trp1-Δ1 ade2-101 ura, (Sikorski, RS, and Hieter, P. (1989), Genetics, 122, 19-27) in YPD (1% bacto yeast extract, 2% bactopeptone, 2% D-glucose) in 15 ml of culture medium The medium was shaken overnight at 24 ° C. 100 to 500 μl of the obtained culture solution was applied to a YPD agar medium, and under atmospheric pressure (under general laboratory pressure) (about 101.3 kPa), 4 ° C., 6 ° C., 8 ° C., 10 ° C., 15 ° C., 17 Culturing was performed at a temperature of 1 week to 3 months.
Appearing colonies were sequentially obtained and isolated as isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate high production candidate strains (cold growth mutant). 200 cold-growing mutant strains were obtained.
同様に終夜振盪培養を行うことにより得た酵母細胞培養液１ｍｌをＹＰＤ培養液１５ｍｌに投与しパラフィルムで密封した。これを高圧容器（離合社製）内に入れ、高圧ハンドポンプ（離合社製）を用いて加圧し、２４℃にて、１０ＭＰａ、２０ＭＰａ、３０ＭＰａ、４０ＭＰａ、５０ＭＰａ、６０ＭＰａ、１００ＭＰａ（それぞれ、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、１０００気圧に相当）の圧力条件下で１週間〜３ヶ月間培養した。培養後、容器を減圧し、細胞培養液１００〜５００μｌをＹＰＤ寒天培地に塗布し、大気圧下、２４℃で培養した。
出現したコロニーを逐次取得しそれらをイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産候補株（高圧増殖変異株とも呼ぶ）として単離した。高圧増殖変異株も２００株得られた。
Similarly, 1 ml of a yeast cell culture obtained by overnight shaking culture was administered to 15 ml of YPD culture and sealed with parafilm. This is put in a high-pressure container (made by Koiso Co., Ltd.), pressurized using a high-pressure hand pump (made by Koiso Co., Ltd.), 10 MPa, 20 MPa, 30 MPa, 40 MPa, 50 MPa, 60 MPa, 100 MPa (each about 100 MPa at 24 ° C. , 200, 300, 400, 500, 600, and 1000 atm) for 1 week to 3 months. After culturing, the container was decompressed, and 100 to 500 μl of cell culture solution was applied to a YPD agar medium and cultured at 24 ° C. under atmospheric pressure.
The emerged colonies were sequentially obtained and isolated as isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate high production candidate strains (also called high-pressure growth mutants). 200 high-pressure growth mutants were also obtained.
２）培養上澄中のイソアミルアルコールおよび酢酸イソアミルの定量
１）において得られた低温増殖変異株および高圧増殖変異株について、それぞれ、イソアミルアルコールおよび酢酸イソアミルの生産能を調べた。
野生型であるＹＰＨ４９９株および上記１）で得られたそれぞれの変異株を１ｇ／Ｌまたは２ｇ／Ｌのロイシンを含むＹＰＤ培養液中で２４℃にて大気圧下で振盪培養を行った。２４時間後および４８時間後に細胞を遠心操作によって除去し、培養上澄を得た。上澄中に含まれるイソアミルアルコールおよび酢酸イソアミルの定量は、島津テクノリサーチ社によるヘッドスペースガスサンプラーを用いたガスクロマトグラフィー分析によって行った。
上記において、２４℃で２４時間振盪培養を行って得られた培養上澄中のイソアミルアルコールおよび酢酸イソアミルの量（結果１）を下記表１に、２４℃で４８時間振盪培養を行って得られた培養上澄中のイソアミルアルコールおよび酢酸イソアミルの量（結果２）を下記表２に示す。
2) Quantification of isoamyl alcohol and isoamyl acetate in culture supernatant The low-temperature and high-pressure growth mutants obtained in 1) were examined for the ability to produce isoamyl alcohol and isoamyl acetate, respectively.
The wild-type YPH499 strain and each mutant obtained in 1) above were subjected to shaking culture at 24 ° C. under atmospheric pressure in a YPD culture solution containing 1 g / L or 2 g / L leucine. After 24 hours and 48 hours, the cells were removed by centrifugation to obtain a culture supernatant. The quantification of isoamyl alcohol and isoamyl acetate contained in the supernatant was performed by gas chromatography analysis using a headspace gas sampler by Shimadzu Techno Research.
The amounts of isoamyl alcohol and isoamyl acetate (result 1) in the culture supernatant obtained by shaking culture at 24 ° C. for 24 hours in the above are shown in Table 1 below and obtained by shaking culture at 24 ° C. for 48 hours. Table 2 below shows the amounts of isoamyl alcohol and isoamyl acetate (result 2) in the culture supernatant.
その結果、イソアミルアルコールの生産量は、２４時間後にＦＡＹ１８Ａ、ＦＡＹ１２Ｃ、ＦＡＹ１７１Ｅ、ＦＡＹ２９Ｅ株では野生株のそれぞれ１．８、２．０、２．３、１．９倍、４８時間に野生株のそれぞれ２．３、２．４、２．８、２．３倍に増大することが示された。一方、酢酸イソアミルの生産量は、２４時間後にＦＡＹ１８Ａ、ＦＡＹ１２Ｃ、ＦＡＹ１７１Ｅ、ＦＡＹ２９Ｅ株では野生株のそれぞれ２．０、２．７、２．９、２．２倍、４８時間に野生株のそれぞれ３．８、５．１、７．６、５．０倍に増大することが示された。 As a result, the production amount of isoamyl alcohol was 1.8, 2.0, 2.3, 1.9 times that of the wild strain in each of the FAY18A, FAY12C, FAY171E, and FAY29E strains after 24 hours, and each of the wild strains in 48 hours. 2.3, 2.4, 2.8, 2.3-fold increase was shown. On the other hand, the production amount of isoamyl acetate was 2.0, 2.7, 2.9, 2.2 times that of the wild strain in the FAY18A, FAY12C, FAY171E, and FAY29E strains after 24 hours, and 3 times that of the wild strain in 48 hours. .8, 5.1, 7.6, 5.0-fold increase.
これらのうち、低温増殖変異株群から単離されたＦＡＹ１８Ａ株および、高圧増殖変異株群から単離されたＦＡＹ１２Ｃ株、ＦＡＹ１７１Ｅ株、ＦＡＹ２９Ｅ株は、いずれも２００３年９月２５日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９５３２（ＦＡＹ１８Ａ株）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９５３３（ＦＡＹ１２Ｃ株）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９５３４（ＦＡＹ１７１Ｅ株）、およびＦＥＲＭ Ｐ−１９５３５（ＦＡＹ２９Ｅ株）が付与されている。 Among these, the FAY18A strain isolated from the low-temperature growth mutant group, and the FAY12C strain, the FAY171E strain, and the FAY29E strain isolated from the high-pressure growth mutant group are all independent administrations as of September 25, 2003. The National Institute of Advanced Industrial Science and Technology has been deposited with the Patent Biological Depositary Center (Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan 1-1-1, Higashi 1-1-1, postal code 305-8656), with accession number FERM P-19532 (FAY18A stock) and accession number, respectively. FERM P-19533 (FAY12C strain), accession numbers FERM P-19534 (FAY171E strain), and FERM P-19535 (FAY29E strain) are assigned.
＜イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株の原因遺伝子の同定＞
実施例１で得られたＦＡＹ１８Ａ株、ＦＡＹ１２Ｃ株、ＦＡＹ１７１Ｅ株およびＦＡＹ２９Ｅ株をザイモリエース（生化学工業）によって細胞溶解度、フェノール・クロロホルム法／エタノール沈でん法によってＤＮＡを抽出し、ＹＣｐｌａｃ１１１ベクターを用いてゲノムライブラリーを作製した。それぞれのライブラリーを酢酸リチウム法を用いて野生型ＹＰＨ４９９株に導入し、ＳＤ寒天培地（０．６７％Ｄｉｆｃｏイーストナイトロジェンベースｗ／ｏアミノ酸、２０ｍｇ／アデニン、２０ｍｇ／メチオニン、２０ｍｇ／Ｌ−トリプトファン、３０ｍｇ／Ｌ−ロイシン、３０ｍｇ／Ｌ−リジン、２０ｍｇ／Ｌ−ヒスチジン、２％Ｄ−グルコース、１．５％精製寒天）に塗布し、実施例１に記載した条件、すなわち、大気圧下（一般実験室内気圧下）（約１０１．３ｋＰａ）、４℃、６℃、８℃、１０℃、１５℃、１７℃にて（条件１）、あるいは、１０ＭＰａ、２０ＭＰａ、３０ＭＰａ、４０ＭＰａ、５０ＭＰａ、６０ＭＰａ、１００ＭＰａの圧力条件下（条件２）で２４℃にて１週間〜３ヶ月間培養した。
<Identification of genes responsible for isoamyl alcohol and / or isoamyl acetate high-producing yeast strain>
The FAY18A strain, the FAY12C strain, the FAY171E strain, and the FAY29E strain obtained in Example 1 were extracted with zymolyce (Seikagaku Corporation) using a cell solubility, phenol / chloroform method / ethanol precipitation method, and genome live using the YCplac111 vector. A rally was made. Each library was introduced into the wild type YPH499 strain using the lithium acetate method, and SD agar medium (0.67% Difco yeast nitrogen base w / o amino acid, 20 mg / adenine, 20 mg / methionine, 20 mg / L-tryptophan). , 30 mg / L-leucine, 30 mg / L-lysine, 20 mg / L-histidine, 2% D-glucose, 1.5% purified agar) and the conditions described in Example 1, ie under atmospheric pressure ( (Under general laboratory pressure) (about 101.3 kPa) at 4 ° C., 6 ° C., 8 ° C., 10 ° C., 15 ° C., 17 ° C. (Condition 1), or 10 MPa, 20 MPa, 30 MPa, 40 MPa, 50 MPa, 60 MPa The culture was performed at 24 ° C. for 1 week to 3 months under a pressure condition of 100 MPa (condition 2).
条件１または条件２の下で増殖または生存したそれぞれの形質変換株からプラスミドを回収し、再度ＹＰＨ４９９株を形質変換して、同じ条件で培養およびスクリーニングを行った。得られたプラスミドに含まれるゲノム遺伝子断片をＡＢＩ３７７ＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列の決定を行った。
その結果ＦＡＹ１８Ａ株、ＦＡＹ１２Ｃ株、ＦＡＹ１７１Ｅ株およびＦＡＹ２９Ｅ株の全てにおいて、酵母の第５番染色体右腕に存在するＲＳＰ５遺伝子内に塩基置換変異が生じていることがわかった。ＦＡＹ１８Ａ株、ＦＡＹ１２Ｃ株、ＦＡＹ１７１Ｅ株およびＦＡＹ２９Ｅ株が保持する変異型ＲＳＰ５のコード領域をそれぞれ配列番号５（ＦＡＹ１８Ａ株）、７（ＦＡＹ１２Ｃ株）、９（ＦＡＹ１７１Ｅ株）および１１（ＦＡＹ２９Ｅ株）に示す。ＲＳＰ５はＨＥＣＴ型に属するユビキチンリガーゼＲｓｐ５をコードする遺伝子であり、いずれの変異も酵素の触媒部位であるＨＥＣＴドメインにアミノ酸置換を誘発していた。
The plasmid was recovered from each transformed strain that grew or survived under the condition 1 or 2, and the YPH499 strain was transformed again and cultured and screened under the same conditions. The nucleotide sequence of the genomic gene fragment contained in the obtained plasmid was determined using an ABI377 DNA sequencer.
As a result, it was found that in all of the strains FAY18A, FAY12C, FAY171E and FAY29E, a base substitution mutation occurred in the RSP5 gene present in the right arm of chromosome 5 of yeast. The coding regions of mutant RSP5 retained by the FAY18A strain, the FAY12C strain, the FAY171E strain and the FAY29E strain are shown in SEQ ID NOs: 5 (FAY18A strain), 7 (FAY12C strain), 9 (FAY171E strain) and 11 (FAY29E strain), respectively. RSP5 is a gene encoding ubiquitin ligase Rsp5 belonging to the HECT type, and each mutation induced an amino acid substitution in the HECT domain that is the catalytic site of the enzyme.
具体的には、ＦＡＹ１８Ａ株においてはプロリンをコードするコドンＣＣＡがスレオニンをコードするＡＣＡに変異したことにより配列番号２に示したアミノ酸配列において５１４番のプロリンがスレオニンに置換されていた（配列番号５および６）。ＦＡＹ１２Ｃ株においては、システインをコードするコドンＴＧＴがチロシンをコードするＴＡＴに変異したことにより、配列番号２に示したアミノ酸配列において５１７番のシステインがチロシンに置換されていた（配列番号７および８）。同様に、ＦＡＹ１７１Ｅ株においては、コドンＴＧＴがＴＴＴに変異することにより、配列番号２に示したアミノ酸配列において５１７番のシステインがフェニルアラニンに置換されていた（配列番号９および１０）。また、ＦＡＹ２９Ｅ株においてはコドンＧＣＣがＡＣＣに変異したことにより７９９番のアラニンがスレオニンに置換されていた（配列番号１１および１２）。 Specifically, in the strain FAY18A, the proline-encoding codon CCA was mutated to threonine-encoding ACA, whereby the 514th proline was replaced by threonine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 5). And 6). In the FAY12C strain, the codon TGT encoding cysteine was changed to TAT encoding tyrosine, whereby the cysteine at position 517 was substituted with tyrosine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NOs: 7 and 8). . Similarly, in the FAY171E strain, the codon TGT was mutated to TTT, whereby the cysteine at position 517 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 was substituted with phenylalanine (SEQ ID NOs: 9 and 10). In the FAY29E strain, the alanine at position 799 was replaced with threonine by codon GCC mutation to ACC (SEQ ID NOs: 11 and 12).
＜放射性ロイシンを用いたロイシンの取り込み試験＞
実施例１で得られたＦＡＹ１８Ａ株、ＦＡＹ１２Ｃ株、ＦＡＹ１７１Ｅ株、ＦＡＹ２９Ｅ株並びに野生株の各々を１５ｍｌのＳＣ（ＳＤ＋Ｓｅｒｉｎｅ ４００ｍｇ／Ｌ、ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ １００ｍｇ／Ｌ、Ａｓｐａｒａｔｉｏ ａｃｉｄ １００ｍｇ／Ｌ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ２００ｍｇ／Ｌ、Arginine ２０ｍｇ／Ｌ、Tyrosine ３０ｍｇ／Ｌ、Isoleucine ３０ｍｇ／Ｌ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ５０ｍｇ／Ｌ）培養液で大気圧下、２４℃にて２０時間培養し、3 Ｈ−ロイシンを１０００倍希釈の濃度で投与し、１時間後、フィルター濾過によって細胞を回収し、細胞内の放射性物質の量を液体シンチレーションカウンターにより測定した。結果を下記表３に示す。
下記表３に示す通り、これらの変異によってロイシンの取り込み量が野生株に比して増大することがわかった。
<Leucine uptake test using radioactive leucine>
Each of the FAY18A strain, the FAY12C strain, the FAY171E strain, the FAY29E strain, and the wild strain obtained in Example 1 were each 15 ml of SC (SD + Serine 400 mg / L, glutaric acid 100 mg / L, Aspartioacid 100 mg / L, Throneine 200 mg / L, Arginine 20 mg / L, Tyrosine 30 mg / L, Isoleucine 30 mg / L, Phenylalanine 50 mg / L) cultured at 24 ° C. for 20 hours under atmospheric pressure, and 3 H-leucine was administered at a 1000-fold dilution, After 1 hour, the cells were collected by filter filtration, and the amount of radioactive substance in the cells was measured with a liquid scintillation counter. The results are shown in Table 3 below.
As shown in Table 3 below, it was found that these mutations increase the uptake of leucine compared to the wild type.
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