JP4170743B2 - Use of novel gene asb4, its transformant and gene product - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、麹菌のフェリクローム生合成に関与するペプチドシンテターゼ蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体、該遺伝子を含有する組み換え麹菌、該形質転換体を用いるフェリクローム生合成に関与するペプチドシンテターゼ蛋白質を生産させることによってフェリクローム高生産麹菌を育種する方法、蛋白質の発現を麹菌菌体内で抑制させフェリクローム非生産麹菌を育種する方法、蛋白質を麹菌以外の生物で発現させフェリクローム類を生産する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
鉄イオンは一部の乳酸菌を除く、ほとんどすべての生物にとって必須の原子である。鉄は、生体内ではＦｅ（II）やＦｅ（III）の形態で利用され、主に酸化還元に関与する酵素群の補欠因子として機能する。しかしながら、一般的に鉄は自然界において鉄鉱石として存在し、可溶化されたイオン状態としてはほとんど存在しない。さらに鉄鉱石から微生物の働きにより可溶化された鉄イオンも、すぐに不溶性の酸化物や水酸化物となるため、生物が利用できる鉄イオンはきわめて微量である。細菌や放線菌、真核微生物は、このような微量な鉄イオンを効率的に獲得するために、シデロフォアと呼ばれる分子量１５００以下の低分子の鉄イオンキレート物質を生産する。このシデロフォアに鉄イオンをキレートすることにより、貴重な鉄イオンの不溶化を防ぎ、鉄イオンを優先的に利用することを図っている。また鉄イオンは生物にとって必須のイオンであるが、過剰に存在すると遊離のラジカルの発生を促し、逆に生体に危害を加える。シデロフォアは鉄イオンの獲得と同時に、このような鉄イオンの無害化にも大きく寄与している。シデロフォアは非キレート状態では無色であるが、鉄イオンをキレートすると、赤色を示し、可視光の吸収を示すことが知られている。
【０００３】
現在までに様々なシデロフォアが同定されているが、糸状菌が生産するシデロフォアはhydroxamates familyと呼ばれ、一般に構成アミノ酸誘導体としてＮ−ヒドロキシオルニチンを含む。研究用モデル糸状菌、工業用微生物、病原性糸状菌として幅広く研究が進められているアスペルギルス属糸状菌は、hydroxamates familyの中でもヘキサペプチドであるフェリクローム類とフザリニン類と呼ばれるシデロフォアを生産する。前者は、Ｎ−ヒドロキシオルニチンのトリペプチドにグリシン、セリン、アラニンが環状ペプチドを形成している。一方、後者では一部のＮ−ヒドロキシオルニチンのＮ位が無水メバロン酸によってアシル化されている特徴を有する。糸状菌はこのような多種多様なシデロフォアを生産することにより、鉄イオンを優先的に獲得し、自然界での生存競争に活用しているものと考えられる。
【０００４】
一方、清酒醸造では、アスペルギルス・オリゼを蒸米上に生育させて「麹」を作成し、清酒醸造の副原料として利用している。この麹造りにおいてアスペルギルス・オリゼが大量のフェリクローム類（中でも主成分はフェリクリシン）を生産し、これが酒造用水の鉄イオンをキレートし、清酒が着色することが知られている。従って、清酒醸造においては、シデロフォアであるフェリクローム類が、品質劣化の原因であり、できるだけフェリクローム類を生産しない菌株の育種が進められてきた（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
このように、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）はフェリクローム類を大量に生産することが古くから知られているが、その生合成系に関しては、２００１年までにはほとんど明らかになっていない。よって、フェリクローム低生産菌の育種は主に、スクリーニング法や変異法に頼っていた。また、清酒醸造とは別の側面からは、近年、このシデロフォアの鉄キレート力は、貧血症の医薬としても利用される可能性が指摘されている。麹菌が産生するフェリクロームも鉄イオン結合能力については非常に優れているが、その生産性の向上が困難で工業レベルでの生産の対象とはなっていない。よって、フェリクローム類の生合成遺伝子の同定は、麹菌によるフェリクローム類の生産を自由に調節できる可能性を与える。すなわち、清酒醸造においては、フェリクリシン生合成に関与する遺伝子の発現が抑制できれば、全くフェリクリシンを生産しない株の育種が可能となる。また、医薬品製造においては、生合成系をより活発に誘導させることにより、大量のフェリクリシン生産が可能となる。さらに麹菌が生産するフェリクリシンは清酒や酒粕として長年摂取されており、極めて安全性の高い物質である。麹菌によりフェリクリシンが大量に生産できれば、医薬品から食品まで幅広い応用が可能となる。
【０００６】
現在までに我々は、麹菌のフェリクローム生合成に関与する遺伝子群として、フェリクローム生合成を負に制御する転写制御因子ｓｒｅＯ（特願２００１−８３６４０）とフェリクローム生合成の第一段階を触媒するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードするａｓｂ１（特願２００１−１７６２６４）、麹菌のフェリクローム生合成に関与するペプチドシンテターゼ遺伝子をコードするａｓｂ２（特願２００１−３２４１１２）、麹菌のフェリクローム生合成に関与するクラスター遺伝子ａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｎｋＯ、ａｓｂＲ（特願２００１−３２４１８１）がクローニングされている。
【０００７】
しかし、フェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼ遺伝子ａｓｂ２にはｐｆａｍによるドメイン構造解析（例えば、非特許文献２参照）から２つのアミノ酸活性化領域しかコードされておらず、６アミノ酸からなるフェリクロームを合成するためには別のペプチドシンテターゼ遣伝子の存在が示唆されていた。２００２年度に一部公開された麹菌のゲノム遺伝子配列から、上記のフェリクローム生合成に関与する新規なペプチドシンテターゼ遺伝子を探索することにより、有意な遺伝子のクローニングが可能であるとの新規着想を得た。
【０００８】
【非特許文献１】
蔭山公雄編、「灘の酒用語集」、灘酒研究会、昭和５４年１０月１日、Ｐ．１４５
【非特許文献２】
ベイトマン他（Ｂａｔｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、「ニュークレイック アシッズ リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」、３０（１）、２００２、ｐ．２７６−２８０。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのフェリクローム生産を自由に制御するために、麹菌のフェリクローム生合成に関与するペプチドシンテターゼ遺伝子を提供することにある。本発明の他の目的は、本遺伝子を含有する組み換えベクターとこの組み換えベクターを含有する形質転換体を提供することにある。
【００１０】
現在までに麹菌のフェリクローム生合成に関与する遺伝子群としてフェリクローム生合成を負に制御する転写制御因子ｓｒｅＯ（特願２００１−８３６４０）、フェリクローム生合成の第−段階を触媒するオルニチンＮ５オキシゲナーゼをコードするａｓｂ１（特願２００１−１７６２６４）、麹菌のフェリクローム生合成に関与するペプチドシンテターゼ遺伝子をコードするａｓｂ２（特願２００１−３２４１１２）、麹菌のフェリクローム生合成に関与するクラスター遺伝子ａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｎｋＯ、ａｓｂＲ（特願２００１−３２４１８１）がクローニングされている。しかし、フェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼ遺伝子ａｓｂ２にはｐｆａｍによるドメイン構造解析から、２つのアミノ酸活性化領域しかコードされておらず、６アミノ酸からなるフェリクロームを合成するためには別のペプチドシンテターゼ遺伝子の存在が示唆されていた。
【００１１】
しかしながら、従来、このようなフェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与する新規なペプチドシンテターゼ遺伝子が取得できていないために、麹菌のフェリクローム生産についてはさまざまな分野に応用が期待されるがいまだに効率的な活用がなされていない。従って、２００２年度に一部公開された麹菌のゲノム遺伝子配列から新規なペプチドシンテターゼ遺伝子が取得できれば麹菌でのフェリクローム生合成メカニズムがすべて解明され、フェリクローム生産抑制や高生産が容易に制御できるといった有用な用途への途が拓ける。
【００１２】
このような観点から、本発明の目的の一つは、上記形質転換体を用いるペプチドシンテターゼ蛋白質の麹菌体内での発現を抑制することによって、米麹を用いた固体培養でフェリクロームを生産しない麹菌を提供することにある。その結果、該麹菌を清酒、味噌、醤油、味醂などの我が国独自の醸造産業へ利用することが可能となる。もう一つの目的は、該遺伝子の発現を遺伝子工学的手法を用いて高めることによって、あらゆる培養条件下でフェリクロームを高生産する麹菌を提供することにある。またこうして生産されたフェリクロームを鉄キレート剤としての試薬、ならびに貧血の改善効果が期待できる機能性食品への添加に提供することが可能となる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、先ずはじめに、麹菌について検討を行った。
麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅは清酒、醤油、味噌などの我が国の伝統的酵素産業で使用されてきた糸状菌である。本菌株の特徴は、上記発酵産業で有用な蛋白質や低分子成分を非常に大量に生産することである。本菌株が持つ高い蛋白質生産能と醸造微生物としての安全性から、異種蛋白質生産の宿主として注目されている（Biotechnology, 6, 1419 (1988)、特開昭６２−２７２９８８）。本発明者らの研究から、Ａ．ｏｒｙｚａｅを用いた異種蛋白質生産においては、アスペルギルス属などの近種の遺伝子であれば、その生産能はさらに増大することが認められた。特に、Ａ．ｏｒｙｚａｅの遺伝子を、Ａ．ｏｒｙｚａｅの高発現プロモーター制御下で発現させた場合、非常に大量の蛋白質が生産されることを見出した（特開平１１−１５４２７１、特願２０００−３６７５４）。また、Ａ．ｏｒｙｚａｅは、上記のような蛋白質、酵素のみならず、産業的にも非常に貴重な低分子成分の生産も報告されている。なかでも、麹菌が固体培養で生産するフェリクロームも貧血などの鉄欠乏症用の機能性成分としても非常に注目されている物質である。
【００１４】
この麹菌のフェリクロームを医薬・食品に利用するためには、生産性をさらに向上させる必要があるが、変異法などの既存の菌株育種方法では、工業生産レベルにまで生産性が向上した変異株の取得はできなかった。そこで、フェリクローム生合成に関与する遺伝子を単離し、これらの遺伝子の発現能を強化することによりフェリクロームの大量生産が可能であると考えた。麹菌におけるフェリクローム生合成経路については、その生合成の第一段階はオルニチンＮ５−オキシゲナーゼによるオルニチンのヒドロキシル化であり、続いてペプチドシンテターゼによるＮ−ヒドロキシオルニチンのトリペプチドにグリシン、セリン、アラニンの環状ペプチド化であると考えられる。
【００１５】
現在までに菌のフェリクローム生合成に関与する遺伝子群としてフェリクローム生合成を負に制御する転写制御因子ｓｒｅＯ（特願２００１−８３６４０）、フニリクローム生合成の第一段階を触媒するオルニチンＮ５オキシゲナーゼをコードするａｓｂ１（特願２００１−１７６２６４）、麹菌のフェリクローム生合成に関与するペプチドシンテターゼ遺伝子をコードするａｓｂ２（特願２００１−３２４１１２）、麹菌のフェリクローム生合成に関与するクラスター遺伝子ａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｎｋＯ、ａｓｂＲ（特願２００１−３２４１８１）がクローニングされている。しかし、フェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼ遺伝子ａｓｂ２にはｐｆａｍによるドメイン構造解析から２つのアミノ酸活性化領城しかコードされておらず、６アミノ酸からなるフェリクロームを合成するためには別のペプチドシンテターゼ遺伝子の存在が示唆されていた。このようなフェリクローム合成に関与する新規のペプチドシンテターゼ遺伝子が取得できていないために、麹菌のフェリクローム生産についてはさまざまな分野に応用が期待されるがいまだに効率的な活用がなされていない。そこでこの新規なペプチドシンテターゼの遺伝子が取得できれば、フェリクローム生合成メカニズムの分子レベルでの全容が解明され、フェリクロームの生産を自由に制御できる遺伝子組み換え麹菌を育種でき、フェリクロームの工業生産が可能になるとの新規着想を得た。
【００１６】
以下は麹菌が生産するフェリクローム類の中でも、最も含有量の多いフェリクリシンの生産を中心に記述するが、本発明は全てのフェリクローム類に応用が可能な技術であり、フェリクリシンだけに限定するものではない。
【００１７】
本発明において、清酒醸造において清酒の着色を起こす鉄イオンキレート低分子フェリクリシンを貧血改善用の機能性成分などとして大量生産させるために、フェリクリシン生合成に関与する新規なペプチドシンテターゼ蛋白質の遺伝子クローニングを行い、フェリクリシンの工業生産に適した遺伝子組み換え麹菌を育種することを試みた。
【００１８】
まず、２００２年度に一部公開された麹菌のゲノム遺伝子配列から上記のフェリクローム生合成に関与する新規なペプチドシンテターゼ遺伝子の探索が可能であると考えた。麹菌ゲノムデータに含まれるコンティグ配列の中でＢｌａｓｔ検索結果から、多機能性合成酵素遺伝子と考えられる遺伝子を抽出した。その中でＧｅｎｅ ＦｉｎｄｉｎｇされたＣｏｎ１３４１＿ｈ＿７１４とＣｏｎ１３４１＿ｍｉｄ−Ｃｏｎ１３４１＿２７２４−ｒ１は、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓとＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓのフェリクローム生合成ペプチドシンテターゼ遺伝子と高い相同性を示した。両遺伝子は同じコンティグ上に存在し、さらに塩基配列の確認とＢｌａｔ、ＦＡＳＴＡによる相同性検索から１本のポリペプチドをコードする１つの連続した遺伝子をコードする事が判明した。さらに相同性からＮ末端に１つのイントロンの存在が示唆された。鉄制限培養した麹菌菌体から調製したポリＡ＋ＲＮＡを鋳型にＮ末端付近のｃＤＮＡ解析から１つのイントロンの位置を決定した。
【００１９】
その結果、本遺伝子は、４７６０アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、イントロンを１つ含んでいた。また、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓのｓｉｄ２遺伝子産物とアミノ酸レベルで２７％の相同性を有していた。得られた遺伝子をａｓｂ４と命名した。ａｓｂ４はノザン解析の結果、他のフェリクローム生合成遺伝子であるａｓｂ１、ａｓｂ２、ａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｓｂＲ同様に鉄制限培養条件下で発現が認められ、鉄存在下でその発現の抑制が認められた。
【００２０】
次に、ａｓｂ４の機能を同定するために、本遺伝子の麹菌での大量発現を試みた。フェリローム生合成遺伝子であるａｓｂ１、ａｓｂ２、ａｓｂ３をｍｅｌＯプロモーター（特願平１１−１５４２７１）支配下で高発現させた麹菌のａｓｂ４の５’非翻訳領域１−ｋｂを、ピリチミン耐性遺伝子（Ｋｕｂｏｄｅｒａ Ｔｅｔａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、６４（７）、ｐｐ１４１６−１４２１、２０００）をマーカーとして、ｍｅｌＯプロモーターと置換した。得られた形質転換体は、親株の１．４倍のフェリクローム量を生産し、最大０．７ｇ／１Ｌ−ｂｒｏｔｈのフェリクロームの菌体外生産を示した。本菌株を用いることによって、鉄制限培養条件下で大量の麹菌フェリクロームを提供することが可能である。
【００２１】
このように単離した遺伝子は、単独であるいはｍｅｌ０やｇｌａＢ遺伝子プロモーター（特願平１１−１５４２７１、特開平１１−２４３９６５）のような高発現プロモーターと共に、Ａ．ｏｒｙｚａｅにて発現させて、フェリクリシンの生産を制御しうるものである。遺伝子導入方法は、例えば、宿主としてｎｉａＤ変異株を用いる公知方法により、目的遺伝子とマーカー遺伝子であるｎｉａＤ遺伝子を同時に導入する。（Ｓ．ＵｎｋｌｅらＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，ｐ．９９−１０４、１９８９）この遺伝子導入の際に、ベクター配列などの異種遺伝子を排除することにより、異種遺伝子を全く含まないセルフクローニング株の形質転換体を得ることができる。ｎｉａＤ変異株は、硝酸を資化できない麹菌変異株（Ｎｉｔｒａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ欠損株）であって、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ１０１３−ｎｉａＤ（ＦＥＲＭ Ｐ−１７７０７）が挙げられる。
【００２２】
以下に、本発明の詳細について述べる。
【００２３】
既にクローニングした麹菌のフェリクローム生合成に関与するペプチドシンテターゼ遺伝子ａｓｂ２（特願２００１−３２４１１２）の１９２４アミノ酸残基には、ｐｆａｍ解析から、２つのアミノ酸活性化領域（８２−４９０アミノ酸残基と９８０−１３６７アミノ酸残基）しか同定されていない。しかし、ペプチドシンテターゼは、−般に生合成されるペプチドの構成アミノ酸数とアミノ酸活性化領域数は一致している。よって、６アミノ酸残基からなる麹菌のフェリクロームの合成には、ａｓｂ２以外に理論上４つのアミノ酸活性化領域をもつペプチドシンテターゼが必要と考えられる。
【００２４】
しかし、フェリクロームクラスター遺伝子内の６０−ｋｂにはａｓｂ２以外のペプチドシンテターゼ遺伝子は存在しなかった。そこで、麹菌のゲノム遺伝子コンティグ中に新規なフェリクローム合成に関与するペプチドシンテターゼ遺伝子が存在することが示唆されているとの新規着想を得た。そして麹菌ゲノムデータに含まれるコンティグ配列の中でＢｌａｓｔ検索結果から、多機能性合成酵素遺伝子と考えられる遺伝子を抽出した。その中でＧｅｎｅ ＦｉｎｄｉｎｇされたＣｏｎ１３４１＿ｈ＿７１４とＣｏｎ１３４＿ｍｉｄ−Ｃｏｎ１３４１−２７２４−ｒ１は、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓとＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓのフェリクローム生合成ペプチドシンテターゼ遺伝子と高い相同性を示した。両遺伝子は同じコンティグ上に存在し、さらに塩基配列の確認とＢｌａｓｔ、ＦＡＳＴＡによる相同性検索から、１本のポリペプチドをコードする１つの連続した遺伝子をコードする事が判明した。さらに、相同性からＮ末端１−ｋｂ中に１つのイントロンの存在が示唆された。
【００２５】
鉄制限培養した麹菌菌体から調製したポリＡ＋ＲＮＡを鋳型にＮ末端１−ｋｂのｃＤＮＡ解析を取得し、塩基配列を決定した結果、１つのイントロンの位置を決定した。本遺伝子は、配列番号１（図５〜７）に示す４７６０アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、イントロンを１つ含んでいた。コーディング領域は配列番号２（図８〜１５）の１から１４３４１ｂｐであり、イントロンは５３８−５９５ｂｐである。また、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓのｓｉｄ２遺伝子産物とアミノ酸レベルで２７％の相同性を有していた。得られた遺伝子をａｓｂ４と命名した。
【００２６】
ａｓｂ４にコードされる４７６０アミノ酸残基のｐｆａｍ解析から、３つのアミノ酸活性化領域（３０５−８１５アミノ酸残基、１４６６−１９５７アミノ酸残基、２５８２−３０６６アミノ酸残基）、５つの縮合領域（９７３−１２７０アミノ酸残基、２１２１−２３８７アミノ酸残基、３２０５−３４９３アミノ酸残基、３７５２−４０３５アミノ酸残基、４３０５−４５９３アミノ酸残基）、５つのアシルキャリアー蛋白質（８５８−９２０アミノ酸残基、１９８５−２０４７アミノ酸残基、３１０２−３１６３アミノ酸残基、３６４９−３７１３アミノ酸残基、４２０６−４２６８アミ残基）からなるという新規な予測を得た。
【００２７】
次にａｓｂ４の発現条件の解析を行うためにノザン解析を行った。本遺伝子は他のフェリクローム生合成遺伝子であるａｓｂ１、ａｓｂ２、ａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｓｂＲ同様に鉄制限培養条件下で発現が認められ、鉄存在下でその発現の抑制が認められた。
【００２８】
さらに、ａｓｂ４の麹菌での発現解析を行った。先ず、ａｓｂ１、ａｓｂ２、ａｓｂ３をｍｅｌＯプロモーター支配下で高発現させた形質転換体を作製した。本菌株は、ａｓｂ１、ａｓｂ２、ａｓｂ３を液体培養で高発現しており、３０℃７日間の鉄制限の液体培養で対照株の約１７倍に相当する０．５ｇ／１Ｌ−ｂｒｏｔｈのフェリクローム生産量を示した。次に、本形質転換体のａｓｂ４遺伝子の高発現を試みた。すなわち、上記形質転換体のａｓｂ４の５’非翻訳領域１−ｋｂを、ピリチミン耐性遺伝子（Ｋｕｂｏｄｅｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、６４（７）、ｐｐ１４１６−１４２１、２０００）をマーカーとしてｍｅｌＯプロモーターと置換した。得られた形質転換体３株は、親株の１．４倍のフェリクローム量を生産し、最大０．７ｇ／１Ｌ−ｂｒｏｔｈのフェリクロームの菌体外生産を示した。本菌株を用いることによって、麹菌のフェリクロームの大量生産が可能となることが確認された。
【００２９】
プラスミドｐＵＣ１１９にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ、ｍｅｌＯプロモーター、ａｓｂ３、ｍｅｌＯプロモーター、ａｓｂ１を組み込んでプラスミドｐＮＩＡ１３を構築した。また、プラスミドｐＵＣ１１８にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＳＣ、ａｓｂ２、ｍｅｌＯプロモーターを組み込んでプラスミドｐＳＣ２を構築した。このようにして構築したプラスミドｐＳＣ２、ｐＮＩＡ１３の順にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｍ−ＮＳ４（ｎｉａＤ、ＳＣ）に形質転換した。この形質転換体は、ａｓｂ１、ａｓｂ２、ａｓｂ３遺伝子を含んでおり、ｍｅｌＯプロモーター支配下で高発現することが上記のように確認された。
【００３０】
また、プラスミドｐＵＣ１１８に、ａｓｂ４のプロモーターの一部、Ａ．ｏｒｙｚａｅのピリチアミン耐性遺伝子（ＰＴ）、ｍｅｌＯプロモーター、ａｓｂ４のコード領域の一部を組み込んだプラスミドｐＰＴ４を構築した。
【００３１】
上記によって得たａｓｂ１、ａｓｂ２、ａｓｂ３で形質転換した形質転換体と組み換えプラスミドｐＰＴ４を混合して、該形質転換体にｐＰＴ４を形質転換した。得られた形質転換体は、これをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＡＳＢ１−４と命名した。この新規形質転換体は、ａｓｂ１、ａｓｂ２、ａｓｂ３、ａｓｂ４を含有した新規組換えベクターｐＡＳＢ１−４を含有するものであった。ｐＳＣ２、ｐＮＩＡＢ、ｐＰＴ４の宿主であるA．oryzae Ｍ−ＮＳ４（niaＤ、sＣ）は、独立行政法人酒類総合研究所より申請により分譲してもらった株である。（参考文献：Yamada．Ｏet al．Bioeci Biotechnol Biochem． 61，pp 1367-1369，1997）また、上記プラスミドの形質転換は、公知方法に従った。予って本形質転換体は、当業者に容易に育種できる。
【００３２】
以上の結果より、クローニングした遺伝子断片ａｓｂ４には、フェリクローム生合成に関与するペプチドシンテターゼがコードされていることが確認できた。また、この遺伝子を用いて、麹菌のフェリクローム生合成を鉄制限下で高生産あるいは非生産させることが可能であり、用途に応じたフェリクローム生産の改変が分子レベルで可能となり、様々な産業分野に応用が可能であることも確認した。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００３３】
【実施例１】
麹菌ゲノム配列コンティグからの新規なペプチドシンテターゼ遺伝子のクローニング
麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅのフェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与する新規なペプチドシンテターゼの遺伝子クローニングを行うために、麹菌ゲノム配列コンティグの検索を行った。麹菌ゲノムデータに含まれるコンティグ配列の中で、Ｂｌａｓｔ検索結果から、多機能性合成酵素遺伝子と考えられる遺伝子を抽出した。その中でＧｅｎｅ ＦｉｎｄｉｎｇされたＣｏｎ１３４１＿ｈ＿７１４とＣｏｎ１３４１−ｍｉｄ−Ｃｏｎ１３４１−２７２４−ｒ１は、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓとＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓのフェリクローム生合成ペプチドシンテターゼ遺伝子と高い相同性を示した。両遺伝子は同じコンティグ上に存在し、さらに塩基配列の確認とＢｌａｓｔ、ＦＡＳＴＡによる相同性検索から１本のポリペプチドをコードする１つの連続した遺伝子をコードする事が判明した。さらに相同性からＮ末端１−ｋｂ中に１つのイントロンの存在が示唆された。
【００３４】
この１−ｋｂの領域のｃＤＮＡを得るためにＲＴ−ＰＣＲを行った。３０℃、４日間鉄制限培地（２％グルコース、０．６％アスパラギン、０．１％リン酸１水素２カリウム、０．１％硫酸マグネシウム、０．０４％塩化カルシウム、ｐＨ６．０）で液体培養した麹菌菌体からニッポンジーン社ＩＳＯＧＥＮを利用して全ＲＮＡを抽出した。その全ＲＮＡから宝酒造Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡ０．５μｇをもとに宝酒造のＴａｋａｒａ ＲＮＡ ＬＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（ＡＭＶ） ｖｅｒ．１．１によりＲＴ−ＰＣＲを試みた。プライマーはＰ１：配列番号３（図１６）とＰ２：配列番号４（図１７）を利用した。反応条件は、以下に従った。
【００３５】
ＰＣＲ条件
・３０℃（１０分）、４２℃（６０分）、９９℃（５分）、５℃（５分）、９６℃（５分）、１サイクル
・９６℃（２０秒）、４５℃（３０秒）、７２℃（３分）、３０サイクル
・７２℃（７分）、１サイクル
【００３６】
反応液をアガロースゲル電気泳動で解析を行っ結果、約１−ｋｂのフラグメントの増幅が認められた。本増輻産物の塩基配列を決定した結果、１つのイントロンの位置を決定した。本遺伝子は配列番号１に示す４７６０アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、イントロンを１つ含んでいた。コーディング領域は配列番号２の１から１４３４１ｂｐであり、イントロンは５３８−５９５ｂｐである。また、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓのｓｉｄ２遺伝子産物とアミノ酸レベルで２７％の相同性を有していた。得られた遺伝子をａｓｂ４と命名した。
【００３７】
【実施例２】
ａｓｂ４遺伝子産物のｐｆａｍによる蛋白質モチーフ解析
フェリクローム生合成に関与するペプチドシンテターゼａｓｂ２、ａｓｂ４は多機能ドメインからなる蛋白質をコードする。これらのドメイン解析をＰｆａ（Ｂａｔｅｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３０（１），ｐｐ２７６−２８０，２００２）により同定した。その結果、図１（図中、ＡＭＰはアミノ酸活性化ドメイン、四角はアシルキャリアー蛋白質、ＣＯＮＤＥＮＳＡＴＩＯＮは縮合ドメイン、数字はアミノ酸残基の位置をそれぞれ示す。）に示すようなドメイン構造を有することが明らかとなった。以下の表１に詳細なドメイン情報を示した。
【００３８】
（表１）
ａｓｂ２、ａｓｂ４遺伝子産物のドメイン構造
ａｓｂ２
─────────────────────────
８２−４９０ アミノ酸活性化ドメイン
９８０−１３６７ アミノ酸活性化ドメイン
６０２−６６７ アシルキャリアー蛋白質
１４０６−１４９９ アシルキャリアー蛋白質
７０６−９７８ 縮合ドメイン
１５１２−１７８７ 縮合ドメイン
ａｓｂ４
─────────────────────────
３０５−８１５ アミノ酸活性化ドメイン
１４６６−１９５７ アミノ酸活性化ドメイン
２５８２−３０６６ アミノ酸活性化ドメイン
８５８−９２０ アシルキャリアー蛋白質
１９８５−２０４７ アシルキャリアー蛋白質
３１０２−３１６３ アシルキャリアー蛋白質
３６４９−３７１３ アシルキャリアー蛋白質
４２０６−４２６８ アシルキャリアー蛋白質
９７３−１２７０ 縮合ドメイン
２１２１−２３８７ 縮合ドメイン
３２０５−３４９３ 縮合ドメイン
３７５２−４０３５ 縮合ドメイン
４３０５−４５９３ 縮合ドメイン
─────────────────────────
【００３９】
【実施例３】
ａｓｂ４遺伝子のノザン解析
ａｓｂ４遺伝子の発現条件を検討するためにノザン解析を行った。実施例１のＰ１、Ｐ２プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲで得られた１−ｋｂのｃＤＮＡをプローブとした。培養は月桂冠保存株である麹歯Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＯＳＩ１０１３株を鉄含有と鉄制限培地で３０℃、４日間行った。鉄制限培地の組成は（２％グルロース、０．６％アスパラギン、０．１％リン酸１水素２カリウム、０．１％硫酸マグネシウム、０．０４％塩化カルシウム、ｐＨ６．０）で、鉄含有培地の組成は（２％グルコース、０．６％アスパラギン、０．１％リン酸１水素２カリウム、０．１％硫酸マグネシウム、０．０４％塩化カルシウム、０．０１％硫酸鉄、ｐＨ６．０）である。
【００４０】
両培地で液体培養した麹菌菌体からニッポンジーン社ＩＳＯＧＥＮを利用して全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡを１％ホルムアルデヒド変性アガロースゲルで電気泳動後、アマシャムファルマシア社製のハイボンドＮ＋ヘアルカリトランスファーを行った。ハイブリダイゼーションは、アマシャムファルマシア社製のＧｅｎｅ Ｉｍａｇｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔを使用した。
【００４１】
得られた結果を図２（図面代用写真）に示した。図中、−（左側のパターン）は鉄制限培地、＋（右側のパターン）は鉄含有培地を示す。図２に示すように、ａｓｂ４は、鉄制限条件下でのみ約１５−ｋｂの巨大トランスクリプトが確認された。本遺伝子は他のフェリクローム生合成遺伝子であるａｓｂ１、ａｓｂ２、ａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｓｂＲ同様に鉄制限培養条件下で発現が認められ、鉄存在下でその発現の抑制が認められた。
【００４２】
【実施例４】
ａｓｂ４遺伝子の麹菌での高発現
麹菌でのａｓｂ４の機能を決定するために高発現を試みた。まず図３に示した各種プラスミドを構築した。ｐＮＩＡ１３は、ｐＵＣ１１９のＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIIIにＡ．ｏｒｙｚａｅの４．５−ｋｂ ｎｉａＤ、ｍｅＯプロモーター１−ｋｂとａｓｂ３１ １−ｋｂのＰｓｔＩ、ｍｅｌＯプロモーター１−ｋｂとａｓｂ１ １．５−ｋｂのＳａｌＩの順にサブクローニングした。ｐＳＣ２は、ｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩにＡ．ｏｒｙｚａｅの３−ｋｂ ｓＣ、ｍｅｌＯプロモーター１−ｋｂとａｓｂ２ ６−ｋｂのＢａｍＨＩの順にサブクローニングした。ｐＰＴ４は、ｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩにａｓｂ４のプロモーター４７００から−３０００の領城（ａｓｂ４−ｕｐ１）、ＰｓｔＩにＡ．ｏｒｙｚａｅの２−ｋｂピリチアミン耐性遺伝子（ＰＴ）、ＨｉｎｄIIIにｍｅｌＯプロモーター１−ｋｂとａｓｂ４の開始コドンから２０００ｂｐ（ａｓｂ４−ｕｐ２）を組み込んだ。この組み換えプラスミドｐＰＴ４には、ａｓｂ４のプロモーター、コーディーング領域部分を含有している。
【００４３】
形質転換は、Ａ、ｏｒｙｚａｅ Ｍ−ＮＳ４（ｎｉａＤ、ｓＣ）にｐＳＣ２、ｐＮＩＡ１３の順に形質転換した。得られた形質転換体にｐＰＴ４を形質転換し、相同組み換えによりゲノム中のａｓｂ４の開始コドン上流１０００ｂｐをｍｅｌＯプロモーター１−ｋｂに置換した。この新規形質転換体は、ａｓｂ１、ａｓｂ２、ａｓｂ３、ａｓｂ４を組み込んだ新規組換えベクターｐＡＳＢ１−４を含有するものであり、その発現も以下により確認された。
【００４４】
得られた形質転換体を鉄制限培地にて、３０℃、７日間の液体培養を行った。得られた結果を図４（図面代用写真）に示す。図４（Ａ）に示すように、ｐＳＣ２、ｐＮＩＡ１３の形質転換体（ａｓｂ１〜３：＋、ａｓｂ４：−）は、０．５２ｇ／１Ｌ−ブロスのフェリクロームを菌体外に分泌し、一方、本発明に係る形質転換体Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＡＳＢ１−４、すなわちｐＳＣ２、ｐＮＩＡ１３、ｐＰＴ４の形質転換体（ａｓｂ１〜４：＋）は、０．７４ｇ／１Ｌ−ブロスという著量のフェリクロームを菌体外に分泌した。
【００４５】
培養液に最終１０００ｐｐｍの三塩化鉄溶液を添加した結果、図４（Ｂ）に示すように著量のフェリクロームが観察された。よって、ａｓｂ４は、麹菌のフェリクローム生合成に関与するペプチドシンテターゼ遺伝子であることが証明された。
【００４６】
【発明の効果】
本発明により、クローニングした遺伝子断片ａｂｓ４には、フェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与する新規なペプチドシンテターゼがコードされていることが確認できた。またこの遺伝子を用いて、麹菌のフェリクローム類生合成を鉄制限下で高生産あるいは非生産させることが可能であり、用途に応じたフェリクローム類生産の改変が分子レベルで可能となり、様々な産業分野に応用が可能であることも確認した。
【００４７】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ａｓｂ４及びａｓｂ２のドメイン構造を示す。
【図２】ａｓｂ４の鉄制限培養条件下でのノザン解析の結果を示す図面代用写真である。
【図３】麹菌フェリクローム生合成遺伝子高発現プラスミドを示す。
【図４】麹菌フェリクローム生合成遺伝子高発現形質転換体のフェリクローム生産を示す図面代用写真である。
【図５】本ペプチドシンテターゼ蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【図６】同上続きを示す。
【図７】同上続きを示す。
【図８】本ペプチドシンテターゼ遺伝子の塩基配列を示す。
【図９】同上続きを示す。
【図１０】同上続きを示す。
【図１１】同上続きを示す。
【図１２】同上続きを示す。
【図１３】同上続きを示す。
【図１４】同上続きを示す。
【図１５】同上続きを示す。
【図１６】プライマーＰ１を示す。
【図１７】プライマーＰ２を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a peptide synthetase protein involved in ferrichrome biosynthesis of Neisseria gonorrhoeae, a gene encoding the protein, a recombinant vector containing the gene, a transformant containing the recombinant vector, a recombinant Neisseria gonorrhoeae containing the gene, A method for breeding a high ferrichrome-producing koji mold by producing a peptide synthetase protein involved in ferrichrome biosynthesis using the transformant, a method for breeding a non-ferrichrome-producing koji mold by suppressing protein expression in the koji mold The present invention relates to a method for producing ferrichromes by expressing proteins in organisms other than Neisseria gonorrhoeae.
[0002]
[Prior art]
Iron ions are essential atoms for almost all living organisms except some lactic acid bacteria. Iron is used in the form of Fe (II) or Fe (III) in vivo, and functions as a prosthetic factor for a group of enzymes mainly involved in redox. However, in general, iron exists as iron ore in nature and hardly exists as a solubilized ionic state. Furthermore, since iron ions solubilized from iron ore by the action of microorganisms immediately become insoluble oxides and hydroxides, the amount of iron ions that can be used by organisms is extremely small. Bacteria, actinomycetes, and eukaryotic microorganisms produce a low-molecular-weight iron ion chelate substance having a molecular weight of 1500 or less called a siderophore in order to efficiently acquire such a small amount of iron ions. By chelating iron ions with this siderophore, insolubilization of valuable iron ions is prevented, and iron ions are used preferentially. Iron ions are essential for living organisms, but if they are present in excess, they promote the generation of free radicals, which in turn harm the living organisms. Siderophores contribute greatly to the detoxification of iron ions as well as the acquisition of iron ions. It is known that siderophores are colorless in an unchelated state, but when chelated with iron ions, they show a red color and absorb visible light.
[0003]
Various siderophores have been identified to date, but the siderophores produced by filamentous fungi are called the hydroxamates family and generally contain N-hydroxyornithine as a constituent amino acid derivative. Aspergillus fungi, which are widely studied as research model filamentous fungi, industrial microorganisms, and pathogenic fungi, produce hexalopeptide ferrichromes and siderophores called fusarinins in the hydroxamates family. In the former, glycine, serine and alanine form a cyclic peptide on a tripeptide of N-hydroxyornithine. On the other hand, the latter is characterized in that the N-position of some N-hydroxyornithine is acylated with mevalonic anhydride. By producing such a wide variety of siderophores, filamentous fungi preferentially acquire iron ions and use them for survival competition in nature.
[0004]
On the other hand, in sake brewing, Aspergillus oryzae is grown on steamed rice to make “boiled rice”, which is used as an auxiliary material for sake brewing. In this koji making, it is known that Aspergillus oryzae produces a large amount of ferrichromes (especially ferriclysin), which chelate iron ions in brewing water and color sake. Therefore, in sake brewing, ferrichromes that are siderophores are the cause of quality degradation, and breeding of strains that do not produce ferrichromes as much as possible has been promoted (see, for example, Non-Patent Document 1).
[0005]
As described above, A. oryzae has been known for a long time to produce ferrichromes in large quantities, but its biosynthetic system has hardly been clarified by 2001. Therefore, breeding of low ferrichrome producing bacteria mainly relies on screening and mutation methods. In addition, from the aspect different from sake brewing, in recent years, it has been pointed out that the iron chelating power of this siderophore may be used as an anemia medicine. Ferrichrome produced by Neisseria gonorrhoeae is also excellent in iron ion binding ability, but it is difficult to improve its productivity and is not a target for production at the industrial level. Thus, the identification of ferrichrome biosynthetic genes offers the possibility of freely regulating the production of ferrichromes by Neisseria gonorrhoeae. That is, in sake brewing, if expression of a gene involved in ferriclicin biosynthesis can be suppressed, breeding of a strain that does not produce ferriclicin at all becomes possible. In pharmaceutical production, a large amount of ferricrisin can be produced by more actively inducing a biosynthetic system. Furthermore, ferriclysin produced by koji mold has been ingested as sake and sake lees for many years and is a very safe substance. If ferriclysin can be produced in large quantities by Neisseria gonorrhoeae, a wide range of applications from pharmaceuticals to foods will be possible.
[0006]
To date, we have catalyzed the transcriptional regulator sreO (Japanese Patent Application No. 2001-83640) that negatively regulates ferrichrome biosynthesis and the first stage of ferrichrome biosynthesis as genes involved in ferrichrome biosynthesis in Neisseria gonorrhoeae. Asb1 encoding ornithine N5-oxygenase (Japanese Patent Application No. 2001-176264), asb2 encoding a peptide synthetase gene involved in the biosynthesis of Aspergillus oryzae (Japanese Patent Application No. 2001-324112), involved in the biosynthesis of Aspergillus oryzae Cluster genes asb3, asbT, ankO, asbR (Japanese Patent Application No. 2001-324181) have been cloned.
[0007]
However, the peptide synthetase gene asb2 involved in the synthesis of peptide bonds in ferrichrome biosynthesis is encoded by only two amino acid activation regions from domain structure analysis by pfam (see, for example, Non-Patent Document 2). The existence of another peptide synthetase gene has been suggested to synthesize ferrichromes. By searching for a novel peptide synthetase gene involved in ferrichrome biosynthesis from the genome gene sequence of Neisseria gonorrhoeae partly released in 2002, we obtained a new idea that significant gene cloning is possible. It was.
[0008]
[Non-Patent Document 1]
Edited by Kimio Hatakeyama, “Sake no Sake Glossary”, Sake Sake Study Group, October 1, 1979, p. 145
[Non-Patent Document 2]
Bateman et al., “Nucleic Acids Res.”, 30 (1), 2002, p.276-280.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a peptide synthetase gene involved in ferrichrome biosynthesis of Neisseria gonorrhoeae in order to freely control the production of Aspergillus oryzae ferrichrome. Another object of the present invention is to provide a recombinant vector containing this gene and a transformant containing this recombinant vector.
[0010]
Transcription regulator sreO (Japanese Patent Application No. 2001-83640) that negatively regulates ferrichrome biosynthesis as a gene group involved in ferrichrome biosynthesis of Neisseria gonorrhoeae, ornithine N5 oxygenase that catalyzes the first step of ferrichrome biosynthesis Encoding asb1 (Japanese Patent Application No. 2001-176264), asb2 encoding a peptide synthetase gene involved in the biosynthesis of Neisseria gonorrhoeae (Japanese Patent Application No. 2001-324112), cluster genes asb3, involved in the biosynthesis of Neisseria gonorrhoeae, asbT , AnkO, asbR (Japanese Patent Application No. 2001-324181) has been cloned. However, the peptide synthetase gene asb2, which is involved in the synthesis of peptide bonds in ferrichrome biosynthesis, encodes only two amino acid activation regions from the domain structure analysis by pfam, and synthesizes ferrichrome consisting of 6 amino acids. Suggested the existence of another peptide synthetase gene.
[0011]
However, since a novel peptide synthetase gene involved in the synthesis of peptide bonds in such ferrichrome biosynthesis has not been obtained so far, it is expected to be applied in various fields for the production of Neisseria gonorrhoeae. Efficient use is not made. Therefore, if a novel peptide synthetase gene can be obtained from the genome gene sequence of Neisseria gonorrhoeae partially released in 2002, all the ferrichrome biosynthesis mechanisms in Neisseria gonorrhoeae will be elucidated and ferrichrome production suppression and high production can be easily controlled. Open the way to useful applications.
[0012]
From such a viewpoint, one of the objects of the present invention is to suppress the expression of the peptide synthetase protein using the transformant in the koji mold so that the koji mold does not produce ferrichrome in solid culture using rice koji. Is to provide. As a result, the koji mold can be used in Japanese brewing industries such as sake, miso, soy sauce, and miso. Another object is to provide a koji mold that highly produces ferrichrome under all culture conditions by enhancing the expression of the gene using genetic engineering techniques. Moreover, it becomes possible to provide the ferrichrome thus produced for addition to a reagent as an iron chelating agent and to a functional food that can be expected to improve anemia.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has been made in order to achieve the above object, and firstly, koji molds were examined.
Neisseria gonorrhoeae A. oryzae is a filamentous fungus that has been used in traditional enzyme industries in Japan such as sake, soy sauce, and miso. The feature of this strain is that it produces very large amounts of proteins and low-molecular components useful in the fermentation industry. Due to the high protein-producing ability of this strain and the safety as a brewing microorganism, it has been attracting attention as a host for producing heterologous proteins (Biotechnology, 6, 1419 (1988), JP-A-62-272988). From our study, A.I. In the production of heterologous proteins using oryzae, it was confirmed that the production ability of a gene of a nearby species such as Aspergillus was further increased. In particular, A.I. oryzae gene It was found that a very large amount of protein was produced when expressed under the control of an oryzae high expression promoter (Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-154271, Japanese Patent Application No. 2000-36754). A. Oryzae has been reported to produce not only proteins and enzymes as described above but also industrially very valuable low molecular components. Among them, ferrichrome produced by Koji molds in solid culture is also a substance that has attracted much attention as a functional component for iron deficiency such as anemia.
[0014]
In order to use this koji mold ferrichrome for pharmaceuticals and foods, it is necessary to further improve the productivity, but with existing strain breeding methods such as the mutation method, the mutant strain whose productivity has been improved to the level of industrial production. Could not get. Therefore, it was considered that mass production of ferrichrome is possible by isolating genes involved in ferrichrome biosynthesis and enhancing the expression ability of these genes. Regarding the ferrichrome biosynthetic pathway in Aspergillus oryzae, the first step of biosynthesis is hydroxylation of ornithine with ornithine N5-oxygenase, followed by cyclic synthesis of glycine, serine and alanine with tripeptide of N-hydroxyornithine by peptide synthetase. It is considered to be peptidized.
[0015]
Transcription regulator sreO (Japanese Patent Application No. 2001-83640) that negatively regulates ferrichrome biosynthesis as a gene group involved in bacterial ferrichrome biosynthesis to date, ornithine N5 oxygenase that catalyzes the first stage of funilchrome biosynthesis Encoding asb1 (Japanese Patent Application No. 2001-176264), asb2 (Japanese Patent Application No. 2001-324112) encoding a peptide synthetase gene involved in the biosynthesis of Neisseria gonorrhoeae, cluster genes asb3, asbT involved in the biosynthesis of Neisseria gonorrhoeae ankO, asbR (Japanese Patent Application No. 2001-324181) has been cloned. However, the peptide synthetase gene asb2, which is involved in the synthesis of peptide bonds in ferrichrome biosynthesis, encodes only two amino acid activation regions from the domain structure analysis by pfam, and synthesizes ferrichrome consisting of 6 amino acids. Suggested the existence of another peptide synthetase gene. Since such a novel peptide synthetase gene involved in the synthesis of ferrichrome has not been obtained, the ferrichrome production of Neisseria gonorrhoeae is expected to be applied in various fields, but has not yet been efficiently used. Therefore, if this new peptide synthetase gene can be obtained, the entire level of the mechanism of ferrichrome biosynthesis will be elucidated, genetically modified gonococci that can freely control ferrichrome production can be bred, and ferrichrome can be produced industrially I got a new idea.
[0016]
The following description focuses on the production of ferriclysin with the highest content among ferricchromes produced by Neisseria gonorrhoeae, but the present invention is a technology that can be applied to all ferrichromes and is limited to ferriclysin. Not what you want.
[0017]
In the present invention, a gene cloning of a novel peptide synthetase protein involved in biosynthesis of ferriclicin in order to mass-produce iron ion chelate low molecular weight ferriclicin which causes coloration of sake in sake brewing as a functional component for improving anemia And tried to breed genetically modified koji molds suitable for industrial production of ferricricin.
[0018]
First, we thought that it was possible to search for a novel peptide synthetase gene involved in the ferrichrome biosynthesis from the genome gene sequence of Neisseria gonorrhoeae partially released in 2002. Genes considered to be multifunctional synthase genes were extracted from the Blast search results in the contig sequence included in the Aspergillus genome data. Among them, Gene Finded Con1341_h_714 and Con1341_mid-Con1341_2724-r1 showed high homology with the fertilome biosynthetic peptide synthetase genes of Ustilago maydis and Aureobasidium pullulans. Both genes exist on the same contig, and further, it was found from the confirmation of the base sequence and the homology search by Blat and FASTA that one continuous gene encoding one polypeptide was encoded. Furthermore, the homology suggested the presence of one intron at the N-terminus. The position of one intron was determined from cDNA analysis near the N-terminus using poly A + RNA prepared from Aspergillus oryzae cells subjected to iron-restricted culture as a template.
[0019]
As a result, this gene encoded a protein consisting of 4760 amino acid residues and contained one intron. Moreover, it had 27% homology with the sid2 gene product of Ustilago maydis at the amino acid level. The resulting gene was named asb4. Asb4 was found to be expressed under iron-restricted culture conditions as well as other ferrichrome biosynthetic genes asb1, asb2, asb3, asbT, and asbR, and its expression was suppressed in the presence of iron. .
[0020]
Next, in order to identify the function of asb4, large-scale expression of this gene in bacilli was attempted. A 5 ′ untranslated region 1-kb of asb4 of Aspergillus oryzae in which asb1, asb2, and asb3, which are ferrilome biosynthetic genes, are highly expressed under the control of the melO promoter (Japanese Patent Application No. 11-154271), is converted into a pyrithimine resistance gene (Kubodera Tetal. Biosci.Biotechnol Biochem, 64 (7), pp1416-1421, 2000) was substituted for the melO promoter. The obtained transformant produced 1.4 times the amount of ferrichrome of the parent strain, and showed the maximum extracellular production of 0.7 g / 1 L-broth ferrichrome. By using this strain, it is possible to provide a large amount of Neisseria gonorrhoeae ferrichrome under iron-restricted culture conditions.
[0021]
The gene isolated in this manner can be used alone or in combination with a high expression promoter such as the mel0 or glaB gene promoter (Japanese Patent Application No. 11-154271, Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-243965). It can be expressed in oryzae to control the production of ferriclysin. As a gene introduction method, for example, a target gene and a niaD gene which is a marker gene are simultaneously introduced by a known method using a niaD mutant as a host. (S. Unkle et al., Mol. Gen. Genet., 218, p. 99-104, 1989) Self-cloning strains that do not contain any heterologous genes by excluding heterologous genes such as vector sequences during the gene introduction. Can be obtained. The niaD mutant is a gonococcal mutant that cannot assimilate nitric acid (Nitrate Reductase-deficient strain), and examples thereof include Aspergillus oryzae 1013-niaD (FERM P-17707).
[0022]
Details of the present invention will be described below.
[0023]
The 1924 amino acid residue of the peptide synthetase gene asb2 (Japanese Patent Application No. 2001-324112) involved in the biosynthesis of Aspergillus oryzae already cloned has two amino acid activation regions (82-490 amino acid residues and 980) from pfam analysis. -1367 amino acid residues) have only been identified. However, in peptide synthetases, the number of amino acids constituting the peptide generally biosynthesized and the number of amino acid activation regions are the same. Therefore, in order to synthesize a Neisseria gonorrhoeae ferrichrome consisting of 6 amino acid residues, it is considered that a peptide synthetase having theoretically four amino acid activation regions other than asb2 is necessary.
[0024]
However, there was no peptide synthetase gene other than asb2 at 60-kb in the ferrichrome cluster gene. Therefore, the inventors have obtained a new idea that it is suggested that a novel peptide synthetase gene involved in ferrichrome synthesis exists in the genomic gene contig of Aspergillus oryzae. Then, genes considered to be multifunctional synthase genes were extracted from the BLAST search results in the contig sequences contained in the Aspergillus genome data. Among them, Gene Finded Con1341_h_714 and Con134_mid-Con1341-2724-r1 showed high homology with the ferrichrome biosynthetic peptide synthetase genes of Ustilago maydis and Aureobasidium pullulans. Both genes exist on the same contig, and it was found that a single continuous gene encoding a single polypeptide was encoded by confirmation of the base sequence and homology search by Blast and FASTA. Furthermore, the homology suggested the presence of one intron in the N-terminal 1-kb.
[0025]
N-terminal 1-kb cDNA analysis was obtained using poly A + RNA prepared from Aspergillus oryzae cells subjected to iron-restricted culture as a template, and the nucleotide sequence was determined. As a result, the position of one intron was determined. This gene encoded a protein consisting of 4760 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 1 (FIGS. 5 to 7), and contained one intron. The coding region is from 1 to 14341 bp of SEQ ID NO: 2 (FIGS. 8-15) and the intron is 538-595 bp. Moreover, it had 27% homology with the sid2 gene product of Ustilago maydis at the amino acid level. The resulting gene was named asb4.
[0026]
From the pfam analysis of 4760 amino acid residues encoded by asb4, three amino acid activation regions (305-815 amino acid residues, 1466-1957 amino acid residues, 2582-3066 amino acid residues) and five condensation regions (973- 1270 amino acid residues, 2121-2387 amino acid residues, 3205-3493 amino acid residues, 3752-4035 amino acid residues, 4305-4593 amino acid residues), 5 acyl carrier proteins (858-920 amino acid residues, 1985-2047) A new prediction was obtained, consisting of amino acid residues, 3102-3163 amino acid residues, 3649-3713 amino acid residues, 4206-4268 amino acid residues).
[0027]
Next, Northern analysis was performed to analyze the expression conditions of asb4. This gene was expressed under iron-restricted culture conditions as in the other ferrichrome biosynthesis genes asb1, asb2, asb3, asbT, and asbR, and its expression was suppressed in the presence of iron.
[0028]
Further, the expression analysis of asb4 in Aspergillus was performed. First, a transformant in which asb1, asb2, and asb3 were highly expressed under the control of the melO promoter was prepared. This strain highly expressed asb1, asb2, and asb3 in liquid culture, and produced 0.5 g / 1 L-broth of ferrichrome equivalent to about 17 times that of the control strain in iron-limited liquid culture at 30 ° C. for 7 days. Amount indicated. Next, high expression of the asb4 gene of this transformant was tried. That is, the 5 ′ untranslated region 1-kb of asb4 of the above transformant was converted into a melO promoter using the pyrithimine resistance gene (Kubodera T et al. Biosci. Biotechnol Biochem, 64 (7), pp1416-1421, 2000) as a marker. Replaced. The obtained three transformant strains produced 1.4 times the amount of ferrichrome of the parent strain, and showed the maximum extracellular production of 0.7 g / 1 L-broth ferrichrome. By using this strain, it was confirmed that mass production of Neisseria gonorrhoeae ferrichrome becomes possible.
[0029]
Aspergillus oryzae niaD, melO promoter, asb3, melO promoter and asb1 were incorporated into plasmid pUC119 to construct plasmid pNIA13. Further, plasmid pSC2 was constructed by incorporating the Aspergillus oryzae SC, asb2, and melO promoters into plasmid pUC118. Plasmids pSC2 and pNIA13 constructed in this way were transformed into Aspergillus oryzae M-NS4 (niaD, SC) in this order. This transformant contained asb1, asb2, and asb3 genes and was confirmed to be highly expressed under the control of the melO promoter as described above.
[0030]
In addition, a part of the promoter of asb4, A. Plasmid pPT4 was constructed in which a part of the oryzae pyrithyamine resistance gene (PT), melO promoter, and asb4 coding region was incorporated.
[0031]
The transformant transformed with asb1, asb2, and asb3 obtained above and the recombinant plasmid pPT4 were mixed, and the transformant was transformed with pPT4. The obtained transformant was named Aspergillus oryzae ASB1-4. This novel transformant contained the novel recombinant vector pASB1-4 containing asb1, asb2, asb3 and asb4. A. pSC2, pNIAB, pPT4 hosts oryzae M-NS4 (niaD, sC) is a stock distributed by application from the Research Institute for Liquors. (Reference: Yamada. O et al. Bioeci Biotechnol Biochem. 61, pp 1367-1369, 1997) Moreover, the transformation of the above-mentioned plasmid was performed according to a known method. The transformant can be easily bred by those skilled in the art.
[0032]
From the above results, it was confirmed that the cloned gene fragment asb4 encoded a peptide synthetase involved in ferrichrome biosynthesis. In addition, this gene can be used to produce high or non-producing ferrichrome biosynthesis under the restriction of iron, and ferrichrome production can be modified at the molecular level according to the application. It was also confirmed that it could be applied in the field.
Examples of the present invention will be described below.
[0033]
[Example 1]
Cloning of a novel peptide synthetase gene from Aspergillus genome sequence contig
Neisseria gonorrhoeae A. In order to perform gene cloning of a novel peptide synthetase involved in the synthesis of peptide bonds in oryzae ferrichrome biosynthesis, the genome sequence contig of Neisseria gonorrhoeae was searched. Among contig sequences included in Aspergillus genome data, genes considered to be multifunctional synthase genes were extracted from Blast search results. Among them, GeneFinded Con1341_h_714 and Con1341-mid-Con1341-2724-r1 showed high homology with the ferrichrome biosynthetic peptide synthetase genes of Ustilago maydis and Aureobasidium pullulans. Both genes exist on the same contig, and further, it was found that one continuous gene encoding one polypeptide was encoded by confirmation of the base sequence and homology search by Blast and FASTA. Furthermore, the homology suggested the presence of one intron in the N-terminal 1-kb.
[0034]
RT-PCR was performed in order to obtain cDNA of this 1-kb region. Liquid at 30 ° C for 4 days in iron-restricted medium (2% glucose, 0.6% asparagine, 0.1% dipotassium hydrogen phosphate, 0.1% magnesium sulfate, 0.04% calcium chloride, pH 6.0) Total RNA was extracted from cultured gonococcal cells using Nippon Gene ISOGEN. From the total RNA, mRNA was extracted using Takara Shuzo Oligotex-dT30 <Super> mRNA purification kit. Based on 0.5 μg of the obtained mRNA, Takara Shuzo Takara RNA LA PCR kit (AMV) ver. RT-PCR was attempted according to 1.1. Primers used were P1: SEQ ID NO: 3 (FIG. 16) and P2: SEQ ID NO: 4 (FIG. 17). The reaction conditions were as follows.
[0035]
PCR conditions
・ 30 ℃ (10 minutes), 42 ℃ (60 minutes), 99 ℃ (5 minutes), 5 ℃ (5 minutes), 96 ℃ (5 minutes), 1 cycle
96 ° C (20 seconds), 45 ° C (30 seconds), 72 ° C (3 minutes), 30 cycles
・ 72 ℃ (7 minutes), 1 cycle
[0036]
As a result of analyzing the reaction solution by agarose gel electrophoresis, amplification of a fragment of about 1-kb was observed. As a result of determining the base sequence of this amplified product, the position of one intron was determined. This gene encoded a protein consisting of 4760 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 1 and contained one intron. The coding region is from 1 to 14341 bp of SEQ ID NO: 2, and the intron is 538-595 bp. Moreover, it had 27% homology with the sid2 gene product of Ustilago maydis at the amino acid level. The resulting gene was named asb4.
[0037]
[Example 2]
Protein motif analysis by pfam of asb4 gene product
Peptide synthetases asb2 and asb4 involved in ferrichrome biosynthesis encode proteins consisting of multifunctional domains. These domain analyzes were identified by Pfa (Bateman et al, Nucleic Acids Res, 30 (1), pp 276-280, 2002). As a result, it is clear that it has a domain structure as shown in FIG. 1 (in the figure, AMP is an amino acid activation domain, squares are acyl carrier proteins, CONDENSATION is a condensation domain, and numbers indicate the positions of amino acid residues). It became. Table 1 below shows detailed domain information.
[0038]
(Table 1)
Domain structure of asb2 and asb4 gene products
asb2
─────────────────────────
82-490 Amino Acid Activation Domain
980-1367 Amino Acid Activation Domain
602-667 acyl carrier protein
1406 to 1499 acyl carrier protein
706-978 condensation domain
1512-1787 condensation domain
asb4
─────────────────────────
305-815 Amino Acid Activation Domain
1466-1957 amino acid activation domain
2582-3066 Amino Acid Activation Domain
858-920 acyl carrier protein
1985-2047 Acyl carrier protein
3102-3163 acyl carrier protein
3649-3713 acyl carrier protein
4206-4268 acyl carrier protein
973-1270 condensation domain
2121-1387 Condensation domain
3205-3493 condensation domain
3752-4035 condensation domain
4305-4593 condensation domain
─────────────────────────
[0039]
[Example 3]
Northern analysis of asb4 gene
Northern analysis was performed to examine the expression conditions of the asb4 gene. The probe was 1-kb cDNA obtained by RT-PCR using the P1 and P2 primers of Example 1. Cultivation was carried out by a laurel wreath stock strain A. oryzae OSI1013 strain was subjected to iron-containing and iron-restricted medium at 30 ° C. for 4 days. The composition of the iron-restricted medium is (2% gulose, 0.6% asparagine, 0.1% dipotassium hydrogen phosphate, 0.1% magnesium sulfate, 0.04% calcium chloride, pH 6.0), containing iron The composition of the medium is (2% glucose, 0.6% asparagine, 0.1% dipotassium hydrogen phosphate, 0.1% magnesium sulfate, 0.04% calcium chloride, 0.01% iron sulfate, pH 6.0 ).
[0040]
Total RNA was extracted from Aspergillus oryzae cultured in both media using Nippon Gene ISOGEN. The obtained total RNA was electrophoresed on a 1% formaldehyde-denatured agarose gel, and then subjected to high bond N + alkali transfer manufactured by Amersham Pharmacia. For hybridization, Gene Image Labeling and Detection kit manufactured by Amersham Pharmacia was used.
[0041]
The obtained result is shown in FIG. 2 (drawing substitute photograph). In the figure,-(left pattern) indicates an iron-restricted medium, and + (right pattern) indicates an iron-containing medium. As shown in FIG. 2, asb4 was confirmed to have a large transcript of about 15-kb only under iron-restricted conditions. This gene was expressed under iron-restricted culture conditions as in the other ferrichrome biosynthesis genes asb1, asb2, asb3, asbT, and asbR, and its expression was suppressed in the presence of iron.
[0042]
[Example 4]
High expression of asb4 gene in Aspergillus oryzae
High expression was attempted to determine the function of asb4 in Neisseria gonorrhoeae. First, various plasmids shown in FIG. 3 were constructed. pNIA13 is an A. pneumoniae to PstI-HindIII of pUC119. Oryzae 4.5-kb niaD, meO promoter 1-kb and asb31 1-kb PstI, melO promoter 1-kb and asb1 1.5-kb SalI were subcloned in this order. pSC2 was transferred from BUCHI of pUC118 to A.I. The subcloning was performed in the order of oryzae 3-kb sC, melO promoter 1-kb and asb2 6-kb BamHI. pPT4 consists of BamHI of pUC118, asb4 promoter 4700 to -3000 castle (asb4-up1) and A. pstI. The melO promoter 1-kb and 2000 bp (asb4-up2) from the start codon of asb4 were incorporated into the 2-kb pyrithiamine resistance gene (PT) of Oryzae and HindIII. This recombinant plasmid pPT4 contains the promoter and coding region portion of asb4.
[0043]
In the transformation, A, oryzae M-NS4 (niaD, sC) was transformed in the order of pSC2 and pNIA13. The obtained transformant was transformed with pPT4, and 1000 bp upstream of the start codon of asb4 in the genome was replaced with melO promoter 1-kb by homologous recombination. This novel transformant contains a novel recombinant vector pASB1-4 incorporating asb1, asb2, asb3, asb4, and its expression was also confirmed by the following.
[0044]
The obtained transformant was subjected to liquid culture at 30 ° C. for 7 days in an iron-restricted medium. The obtained results are shown in FIG. 4 (drawing substitute photograph). As shown in FIG. 4 (A), transformants of pSC2 and pNIA13 (asb1-3: +, asb4 :-) secrete 0.52 g / 1L-broth ferrichrome outside the cells, The transformant Aspergillus oryzae ASB1-4 according to the present invention, that is, the transformants of pSC2, pNIA13, and pPT4 (asb1-4: +) has a significant amount of 0.74 g / 1L-broth ferrichrome outside the cell. Secreted.
[0045]
As a result of adding the final 1000 ppm iron trichloride solution to the culture solution, a significant amount of ferrichrome was observed as shown in FIG. 4 (B). Therefore, it was proved that asb4 is a peptide synthetase gene involved in the ferrichrome biosynthesis of Neisseria gonorrhoeae.
[0046]
【The invention's effect】
According to the present invention, it was confirmed that the cloned gene fragment abs4 encoded a novel peptide synthetase involved in peptide bond synthesis in ferrichrome biosynthesis. Using this gene, it is possible to produce ferrichrome biosynthesis in Aspergillus oryzae with high or non-production under iron restriction, making it possible to modify ferrichrome production at the molecular level according to the application. It was also confirmed that it can be applied in the industrial field.
[0047]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the domain structure of asb4 and asb2.
FIG. 2 is a drawing-substituting photograph showing the results of Northern analysis of asb4 under iron-restricted culture conditions.
FIG. 3 shows a high expression plasmid for Neisseria gonorrhoeae ferrichrome biosynthesis gene.
FIG. 4 is a drawing-substituting photograph showing the production of ferrichrome of a transformant with high expression of the Neisseria gonorrhoeae ferrichrome biosynthesis gene.
FIG. 5 shows the amino acid sequence of the peptide synthetase protein.
FIG. 6 shows the continuation of the above.
FIG. 7 shows the continuation of the above.
FIG. 8 shows the base sequence of this peptide synthetase gene.
FIG. 9 shows the continuation of the above.
FIG. 10 shows the continuation of the above.
FIG. 11 shows the continuation of the above.
FIG. 12 shows the continuation of the above.
FIG. 13 shows the continuation of the above.
FIG. 14 shows the continuation of the above.
FIG. 15 shows the continuation of the above.
FIG. 16 shows primer P1.
FIG. 17 shows primer P2.

Claims (5)

配列番号１で表されるアミノ酸配列からなり、かつフェリクローム生合成に関与するペプチドシンテターゼ蛋白質。A peptide synthetase protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and involved in ferrichrome biosynthesis. 配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸が１個もしくは数個欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフェリクローム生合成に関与するペプチドシンテターゼ蛋白質。A peptide synthetase protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and which is involved in ferrichrome biosynthesis. 配列番号２の塩基配列で示される、請求項１記載の蛋白質をコードする遺伝子、または、該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする請求項２に記載の蛋白質をコードする遺伝子。 The gene encoding the protein according to claim 1, which is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or the gene encoding the protein according to claim 2, which hybridizes with the gene under stringent conditions . 請求項３に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。A recombinant vector containing the gene according to claim 3 . 麹菌のフェリクローム類生産の改変が分子レベルで可能な、請求項３に記載の遺伝子のプロモーター及びコーディング領域部分を含有する組換えベクターｐＰＴ４。Recombinant vector pPT4 containing the promoter and coding region part of the gene according to claim 3, wherein the alteration of the production of Aspergillus oryzae ferrichromes is possible at the molecular level .

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