JP4149208B2 - Peptides controlling thrombus dissolution and use thereof - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬品、バイオテクノロジーに属し、血栓の溶解を制御するポリペプチドに関し、より詳細には、プラスミン酵素活性を効率的に向上または抑制することにより、血栓の溶解を制御するポリペプチドおよびその利用方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
通常、正常血管の内膜とは異なる表面（例えば、出血傾向にある異物面）と血液とが接触した場合、血液凝固反応が引き起こされる。生体内では、微量の組織トロンボプラスチンの存在下で、障害血管に粘着・凝集した血小板の表面に血液凝固因子が濃縮され、タンパク分解を繰り返す血液凝固過程が進行し、最終的にフィブリン（線維素）を生じて血栓を形成し血液凝固が起こる。
【０００３】
止血のためであっても血管内に血栓が生ずることは、血液循環を障害する可能性があり、好ましいことではない。しかし、生体内には不要となったフィブリン（血栓）を溶解する作用（いわゆる、線維素溶解現象（線溶現象））が存在する。この線溶現象について簡単に説明すると、生体内にフィブリンが生じると、血流中のプラスミノゲンはフィブリンに吸着される。一方、血管壁の細胞中には、組織プラスミノゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）が含まれていて、血管の障害、拡張、収縮などに伴いこれが放出され、同様にフィブリンに吸着される。こうして、ｔ−ＰＡ、プラスミノゲン、フィブリンの三量体を形成した後、プラスミノゲンはフィブリン上でｔ−ＰＡによってプラスミンに活性化される。そして、このプラスミンがフィブリンを分解して可溶性のＦＤＰ（fibrin degradation products）とし、血栓が溶解されるのである。
【０００４】
このように、生体内では、線溶現象のバランスをとることによって、血栓の形成と溶解とが制御されている。そして、線溶現象を制御する医薬品は、血栓の溶解を促進する血栓溶解薬、血栓の溶解を抑制する抗線溶薬（抗プラスミン薬）として使用されている。
【０００５】
血栓溶解薬の代表的なものとしては、ウロキナーゼおよびｔ−ＰＡが知られている。これらの薬物の作用機序は、不活性のプラスミノゲンを活性のプラスミンとする反応を促進してプラスミンをより多く生成させ、フィブリンに対する溶解率を向上させるものである。すなわち、生成されるプラスミン量の増加により、線溶現象を亢進して、血栓の溶解が促進されるものである。ところが、ウロキナーゼやｔ−ＰＡはいずれも生体由来のものであり、これらを製造するためには高精度の技術および人員を必要としている。
【０００６】
一方、抗線溶薬（抗プラスミン薬）の代表的なものとしては、イプシロンアミノカプロン酸、その誘導体であるトラネキサム酸が知られている。これらの薬物の作用機序は、プラスミノゲンに存在しフィブリンに結合する部位であるリジン結合部位（Lysine‐Binding‐Site）にこれらの薬物が結合することにより、プラスミノゲンのフィブリンへの結合が阻害される結果、プラスミンを減少させ、フィブリンに対する溶解率を低下させるものである。すなわち、フィブリンに結合するプラスミン量の減少することにより、線溶現象を抑制して、血栓の溶解が抑制されるものである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このように、プラスミンによる線溶現象は血栓の溶解を制御する上で極めて重要な役割を果たしており、プラスミン活性を制御することができれば、血栓溶解薬や抗線溶薬として利用可能と考えられる。ところが、現在医薬品として使用されている血栓溶解薬や抗線溶薬は、プラスミンの量を増減させるものであり、プラスミン活性を制御するものではない。
【０００８】
それゆえ、もし、プラスミン活性を制御することができれば、血栓の溶解を促進または抑制して、従来とは全く異なる作用機序をもった、新しいタイプの血栓溶解薬または抗線溶薬の開発が期待される。
【０００９】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、これまでのようにプラスミンの量を増減させるのではなく、プラスミン自身の酵素活性を効率的に亢進または抑制することによって、血栓の溶解を制御する物質を提供するとともに、その利用方法を提案することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意に検討した結果、血栓溶解酵素であるプラスミンに、動物の赤血球を加えると線溶現象が格段に亢進されることを発見し、その作用を発揮する物質がウシ・ヘモグロビンのβ鎖にあることを確認した。そして、ウシ・ヘモグロビンの中に、血栓溶解を亢進する構造と抑制する構造とが組み込まれていること見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
本発明にかかるポリペプチドは、上記の課題を解決するために、プラスミン活性を制御することにより、血栓の溶解を制御することを特徴としている。
【００１２】
すなわち、本発明にかかるポリペプチドは、プラスミン活性を制御することにより、血栓の溶解を制御するポリペプチドであって、以下の（ａ）〜（ｄ）の少なくとも１つを含むポリペプチドである。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を亢進する機能を有するポリペプチド。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を亢進する機能を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を抑制する機能を有するポリペプチド。
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を抑制する機能を有するポリペプチド。
【００１３】
ここで、「プラスミン活性を制御」とは、プラスミンの酵素活性を亢進または抑制することを意味し、「血栓の溶解を制御」とは、血栓の溶解を促進または抑制することを意味する。
【００１４】
本発明にかかるプラスミン活性を亢進するポリペプチドは、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドである。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を亢進する機能を有するポリペプチド。
（ｂ） 配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を亢進する機能を有するポリペプチド。
【００１５】
本発明にかかる血栓の溶解を抑制するペプチドは、以下の（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドである。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を抑制する機能を有するポリペプチド。
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を抑制する機能を有するポリペプチド。
【００１６】
また、本発明にかかるプラスミン活性を抑制するポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３番目のアラニンからアスパラギンへ置換、および、１５番目のリジンからメチオニンへ置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。すなわち、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。換言すれば、上記（ｄ）のポリペプチドは、例えば、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００１７】
上記配列番号１ないし配列番号３に示される血栓の溶解を制御するポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、ヘモグロビン、より詳細にはウシ・ヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列に基づいて製造することができる。
【００１８】
本発明にかかる抗体は、上記ポリペプチドを特異的に認識することを特徴としている。
【００１９】
本発明にかかる血栓の溶解を制御するポリペプチドの検出方法は、試料と上記抗体とを反応させることを特徴としている。
【００２０】
すなわち、本発明にかかるプラスミン活性を亢進する機能を有するポリペプチドの検出方法は、試料と上記プラスミン活性を亢進するポリペプチドを特異的に認識する抗体とを反応させることを特徴としている。
【００２１】
同様に、本発明にかかるプラスミン活性を抑制する機能を有するポリペプチドの検出方法は、試料と上記プラスミン活性を抑制するポリペプチドを特異的に認識する抗体とを反応させることを特徴としている。
【００２２】
上記抗体は、血栓の溶解を制御するポリペプチドを特異的に認識するため、試料と反応させることにより、試料中の上記ポリペプチドを検出することができる。
【００２３】
本発明にかかる血栓の溶解を制御するポリペプチドのスクリーニング方法は、試料となるポリペプチドのフィブリン溶解率を、フィブリン平板法によって評価することを特徴としている。
【００２４】
すなわち、本発明にかかるプラスミン活性を亢進する機能を有するポリペプチドのスクリーニング方法は、上記プラスミン活性を亢進するポリペプチド、または、上記プラスミン活性を亢進するポリペプチドの検出方法によって得られたポリペプチドのフィブリン溶解率を、フィブリン平板法によって評価することを特徴としている。
【００２５】
同様に、プラスミン活性を抑制する機能を有するポリペプチドのスクリーニング方法は、上記プラスミン活性を抑制するポリペプチド、または、上記プラスミン活性を抑制するポリペプチドの検出方法によって得られたポリペプチドのフィブリン溶解率を、フィブリン平板法によって評価することを特徴としている。
【００２６】
本発明には、上記スクリーニング方法によって得られる血栓の溶解を制御するポリペプチドが含まれる。
【００２７】
本発明にかかる血栓溶解薬は、プラスミン活性を亢進して血栓溶解を促進することを特徴としている。
【００２８】
上記血栓溶解薬は、例えば、上記（ａ）または（ｂ）のポリペプチド、または、上記プラスミン活性を亢進するポリペプチドのスクリーニング方法によって得られるポリペプチドを含んでいればよい。
【００２９】
本発明にかかる抗線溶薬は、プラスミン活性を抑制して血栓溶解を抑制することを特徴としている。
【００３０】
上記抗線溶薬は、例えば、上記（ｃ）または（ｄ）のポリペプチド、または、上記プラスミン活性を抑制するポリペプチドのスクリーニング方法によって得られるポリペプチドを含んでいればよい。
【００３１】
最後に、本発明にかかる遺伝子は、上記ポリペプチド、または、上記スクリーニング方法によって得られるポリペプチドをコードする遺伝子である。
【００３２】
本発明によれば、これまでのようにプラスミンの量を増減させるのではなく、プラスミン自身の酵素活性を効率的に亢進または抑制することによって、血栓の溶解を制御するポリペプチド、およびその利用方法を提供することができる。
【００３３】
【本発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について、図１ないし図４に基づいて説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３４】
（１）本発明の経緯
まず、本発明の説明に先立ち、本発明に至った経緯について説明する。
【００３５】
本願発明者等は、血栓溶解酵素であるプラスミンに、動物（ウシ、マウス、ニワトリで試験した）の赤血球を加えると、血液凝固因子の１つであり血栓となるフィブリンを溶解する機能が格段に亢進することを発見した。赤血球中には血栓の溶解を亢進する酵素は認められず、赤血球内の水溶性成分とプラスミンを混合した時にのみ上記の機能が認められたことから、赤血球中の水溶性成分中にあるプラスミン活性を増強する機能を発揮する物質の特定を試みた。
【００３６】
具体的には、赤血球の水溶性成分を、ハイドロキシアパタイトによる親和性クロマトグラフィ、リジン−セファロース親和性クロマトグラフィによるプラスミン関連物質の除去、逆相クロマトグラフィによる分子サイズによる分画、等によって、プラスミンの作用を増強する画分を得た。そして、この画分中に含まれる成分のアミノ酸配列を検討した結果、分子量が１万前後のウシ・ヘモグロビンのβ鎖であることが確認された。なお、ウシ・ヘモグロビンは２本のα鎖と２本のβ鎖とからなる４量体で形成されている。
【００３７】
そこで、本願発明者等は、なぜ、血栓の溶解に、酸素を運搬する役割しか知られていないヘモグロビンが関与しているのかを解明すべく、プラスミンとヘモグロビンとが会合したときの分子的な変化を調べることとした。種々検討した結果、ウシ・ヘモグロビンにプラスミンを加え、３７℃で１時間加温するとヘモグロビンは分解され、Sephacryl G-200 ゲルクロマトグラフィによる分画ではいくつかのプラスミン活性を亢進する画分と、プラスミン活性を抑制する画分とが認められた。この結果は、（ｉ）ヘモグロビンがプラスミンによって分解されること、（ ii ）ヘモグロビン分子中に血栓の溶解を亢進する構造と抑制する構造とが組み込まれており、プラスミンによる分解作用を受けてそれらの機能が顕性化することを意味している。
【００３８】
そこで、本願発明者は、ウシ・ヘモグロビンに存在する、プラスミン血栓の溶解を促進するペプチドと、血栓の溶解を抑制するペプチドとを解明するために、ウシ・ヘモグロビンのβ鎖を構成するアミノ酸配列の中から、リジンを含む領域に着目してペプチドを合成して、プラスミンに対する溶解率のスクリーニング試験を行ったのである。なお、今回リジンを含む領域に着目したのは、リジンとプラスミンとの親和性が高いことが知られているためである。
【００３９】
（２）本発明のポリペプチド
本発明にかかるポリペプチドは、プラスミン活性を亢進または抑制することにより、血栓の溶解を制御するものであって、以下の（ａ）〜（ｄ）の少なくとも１つを含むポリペプチドである。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を亢進する機能を有するポリペプチド。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を亢進する機能を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を抑制する機能を有するポリペプチド。
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を抑制する機能を有するポリペプチド。
【００４０】
ここで、「プラスミン活性を亢進」とは、プラスミンの酵素活性を亢進することを意味する。
【００４１】
また、「プラスミン活性を抑制」とは、プラスミンの酵素活性を抑制することを意味する。これは、例えば、ポリペプチド自身がプラスミンよりもフィブリンと容易に結合し、その結果プラスミンの機能が抑制されることによるものである。
【００４２】
そして、「血栓の溶解を制御」とは、血栓の溶解を促進または抑制することを意味する。
【００４３】
すなわち、本発明にかかるポリペプチドは、（ｉ）プラスミン活性を亢進して血栓の溶解を促進するポリペプチド（便宜上、「第１のペプチド」という）と（ ii ）プラスミン活性を抑制して血栓の溶解を抑制するポリペプチド（便宜上、「第２のペプチド」という）とを含んでいる。
【００４４】
上記第１のペプチドは、例えば、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドである。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を亢進する機能を有するポリペプチド。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を亢進する機能を有するポリペプチド。
【００４５】
第１のペプチドは、プラスミン活性を亢進する機能を有し、血栓の溶解を促進する。それゆえ、第１のペプチドは、血栓の予防および／または治療のための血栓溶解薬として有用であるばかりでなく、心筋梗塞や脳梗塞、あるいは動脈硬化や糖尿病などの成人病の予防または治療に有効利用できる可能性がある。また、線溶抑制が関与すると考えられる疾患の予防または治療に有効利用できる可能性がある。
【００４６】
上記第２のペプチドは、例えば、以下の（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドである。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を抑制する機能を有するポリペプチド。
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を抑制する機能を有するポリペプチド。
【００４７】
第２のペプチドは、プラスミン活性を抑制する機能を有し、血栓の溶解を抑制する。それゆえ、第２のペプチドは、抗線溶薬として有用であるばかりでなく、線溶亢進が関与すると考えられる疾患の予防または治療に有効利用できる可能性がある。
【００４８】
ここで、上記「ポリペプチド」は、化学合成されたものであってもよいし、細胞、組織などから単離精製された状態であってもよいし、ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよい。また、本発明にかかるポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨＡやＦＬＡＧ等によって本発明のポリペプチドがエピトープ標識されるような場合が挙げられる。また、本発明にかかるポリペプチドは、プラスミン活性を亢進または抑制する機能を失わない限り、主鎖または側鎖に置換基または官能基が導入されていてもよいし、当該官能基が保護されていてもよいし、アミノ基が保護されていてもよいし、カルボキシル基が金属塩などの塩となっていてもよい。すなわち、上記ポリペプチドには、それらの誘導体も含まれる。
【００４９】
また、上記「１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加」とは、例えば、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、１３番目のグリシンをアスパラギンに、１５番目のリジンをメチオニンに置換したポリペプチドを作製することなどを意味する。
【００５０】
また、遺伝子工学的手法を用いる場合、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されるものであってもよい。このように、遺伝子工学的手法を用いた場合、上記（ｂ）のポリペプチドは、換言すれば、上記（ａ）のポリペプチドの変異体であり、上記（ｄ）のポリペプチドは、換言すれば、上記（ｃ）のポリペプチドの変異体である。例えば、上記（ｄ）のポリペプチドの１つである配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号２に示される上記（ｃ）のポリペプチドの変異体である。ここにいう「変異」は、主として、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異体を単離精製したものであってもよい。
【００５１】
このように、本発明のポリペプチドは、（１）化学合成する方法（いわゆるペプチド合成）、（２）生体または培養細胞から精製単離する方法、または（３）遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、などによって取得することができる。
【００５２】
なお、配列番号１ないし配列番号３に示されるような、２０アミノ酸程度の比較的短鎖のアミノ酸からなるポリペプチドであれば、ペプチド合成により容易かつ簡便に取得することができる。また、ペプチド合成としては、ある担体に、アミノ基が保護されたアミノ酸を順次導入してペプチドを形成させる固相法を好適に用いることができる。
【００５３】
また、多数のアミノ酸からなる長鎖のポリペプチドであれば、遺伝子組換え技術を用いて取得することが、工業的には好ましい。遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
【００５４】
なお、上記第１のペプチドおよび第２のペプチドの由来は、特に限定されるものではないが、例えば、ヘモグロビンに含まれるアミノ酸配列に含まれており、より詳細には、ウシ・ヘモグロビンβ鎖におけるリジンを含む領域に由来するポリペプチドである。
【００５５】
具体的には、配列番号１に示される第１のペプチドは、本願発明者がウシ・ヘモグロビンβ鎖をモデルに合成し、ＦＯ１５２−１と名付けられたポリペプチドである。なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列は、配列番号４に示されるウシ・ヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列における、Ｎ末端のメチオニンから２０番目のアスパラギン酸までの領域に相当する。
【００５６】
また、配列番号２に示される第２のペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４に示されるウシ・ヘモグロビンβ鎖のＮ末端側から６１番目のアラニンから７５番目のリジンまでの領域のアミノ酸配列に相当する。
【００５７】
さらに、配列番号３に示される第２のペプチドは、本願発明者がウシ・ヘモグロビンβ鎖をモデルに合成し、ＦＯ１５２−２と名付けられたポリペプチドである。すなわち、配列番号３に示される第２のペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３番目のグリシンがアスパラギンに、１５番目のリジンがメチオニンに置換されたポリペプチドである。換言すれば、配列番号３に示される第２のポリペプチドは、配列番号４に示されるウシ・ヘモグロビンβ鎖の６１番目のグリシンから７５番目のリジンまでのアミノ酸配列において、７３番目のグリシンがアスパラギンに、７５番目のリジンがメチオニンに置換されたポリペプチドである。
【００５８】
なお、配列番号１ないし配列番号３に示されるポリペプチド以外にも、ウシ・ヘモグロビンβ鎖におけるアミノ酸配列に基づいて、第１のペプチドおよび第２のペプチドと同様に、血栓の溶解を制御するポリペプチドが得られる可能性がある。この場合、ウシ・ヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列のうち、リジンを含む領域が、血栓の溶解を制御する可能性が高い。
【００５９】
（３）本発明にかかる抗体
次に、本発明にかかる抗体について説明する。
【００６０】
本発明にかかる抗体は、プラスミン活性を亢進または抑制することにより、血栓の溶解を制御するポリペプチドを特異的に認識する抗体である。換言すれば、上記（１）で説明したポリペプチドを特異的に認識する抗体である。
【００６１】
すなわち、本発明にかかる抗体は、（ｉ）血栓の溶解を促進する第１のペプチドを特異的に認識する抗体（便宜上、「第１の抗体」という）または（ ii ）血栓の溶解を抑制するポリペプチド（第２のペプチド）を特異的に認識する抗体（便宜上、「第２の抗体」という）である。換言すれば、本発明にかかる抗体は、上記第１のペプチドまたは第２のペプチドを抗原とする抗体である。なお、当該抗体は、第１のペプチドまたは第２のペプチド、あるいはその断片を特異的に認識すればよい。
【００６２】
ここで、上記「抗体」は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。なお、モノクローナル抗体は、抗原として第１のペプチドまたは第２のペプチド、あるいはそのフラグメントを用いて、常法のハイブリドーマ技術によって製造することができる。また、ポリクローナル抗体は、宿主動物、例えばラットまたはウサギに、第１のペプチドまたは第２のペプチド、あるいは、そのフラグメントを接種し、感作された血清を回収することからなる常法によって製造することができる。
【００６３】
上記第１の抗体は、プラスミン活性を亢進する機能を有するポリペプチドを特異的に認識することができ、第２の抗体は、プラスミン活性を抑制する機能を有するポリペプチドを特異的に認識することができる。
【００６４】
したがって、上記の抗体によれば、上記第１の抗体を用いて第１のペプチドを、第２の抗体を用いて第２のペプチドを定量することができる。また、後述のように、本発明にかかる血栓の溶解を制御するポリペプチドの検出方法に使用する検出試薬として利用することができる。
【００６５】
また、上記抗体は、上記第１のペプチドまたは第２のペプチドの関係するヒトや動物の疾患を治療する抗体医薬品、診断薬（すなわち検出試薬）として利用できる可能性がある。なお、診断薬として用いる場合の診断方法は、上記ペプチドの関係する疾患を発症していると思われる動物の血液などの試料と上記抗体とを免疫反応することにより、容易に上記ペプチドを検出することができ、当該疾患を発症しているか否かを判定することができる。すなわち、試料と抗体とが免疫反応をしていれば、試料中に上記ペプチドが存在することを意味するので上記ペプチドの関係する疾患を発症していると判定できる。一方、免疫反応をしていなければ、試料中に上記ペプチドが存在しないことを意味するので上記ペプチドの関係する疾患を発症していないと判定できる。
【００６６】
なお、上記免疫反応を判定する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、蛍光抗体法、免疫沈降法、ウェスタンブロット法、アフィニティークロマトグラフィー法、コロニーブロット法などを用いることができる。これら方法を用いることで、本発明にかかる検出方法の精度や信頼性をより一層向上させることができる。
【００６７】
さらに、上記抗体は、後述のように、機能が不明である多くのタンパク質（ポリペプチド）を含む試料から、本発明にかかるポリペプチドと同様の性質を有する可能性のあるポリペプチドを検出するための試薬（検出試薬）として利用することができる。すなわち、本発明には、第１のペプチドまたは第２のペプチド、およびそれらと同様の性質を有する可能性のあるペプチドを検出するために、上記第１抗体または第２の抗体を含んでいることを特徴とする検出試薬も含まれる。
【００６８】
（４）本発明にかかる検出方法およびスクリーニング方法
次に、本発明にかかる検出方法およびスクリーニング方法について説明する。
【００６９】
本発明にかかる検出方法は、試料とプラスミン活性を亢進または抑制することにより、血栓の溶解を制御するポリペプチドを特異的に認識する抗体とを免疫反応させることにより、試料中から血栓の溶解を制御するポリペプチドを検出する方法である。すなわち、試料と上記（３）で説明した抗体とを免疫反応させるものである。
【００７０】
したがって、上記検出方法は、第１の抗体、または、第２の抗体を用いることを特徴としている。換言すれば、上記検出方法は、（ｉ）第１の抗体を用いて血栓の溶解を亢進する第１のペプチドを検出する方法、または、（ ii ）第２の抗体を用いて血栓の溶解を抑制する第２のペプチドを検出する方法である。
【００７１】
前述のように、第１の抗体および第２の抗体は、第１のペプチドおよび第２のペプチドを特異的に認識する。したがって、例えば、この抗体と、多数のポリペプチドおよびタンパク質試料とを反応させれば、上記（１）のポリペプチドと血栓の溶解を制御するポリペプチドを、容易に検出することができる。すなわち、試料と、検出試薬としての上記抗体との免疫反応有無を調べることにより、試料中に第１のペプチドまたは第２のペプチドが含まれているか否かを検出することができる。なお、免疫反応の判定は、上記（２）で説明した方法によって行うことができる。
【００７２】
上記の検出方法によれば、第１のペプチドまたは第２のペプチドを含むポリペプチドの関係するヒトや動物の疾患の診断に利用することができる。上記抗体が診断薬として利用される場合、上記第１の抗体または第２の抗体を担体に固定して、キット化されていることが好ましい。これにより、血液などの試料から、容易に第１のペプチドまたは第２のペプチドを検出することができる。したがって、本発明には検出試薬として上記抗体を含むことを特徴とする検出キットが含まれる。
【００７３】
なお、上記検出キットは、試料と検出試薬としての上記抗体との反応の精度を挙げるための試薬、検出用試薬の利便性や保存性等を向上させるための試薬が、さらに添加されていてもよい。例えば、試料の保存のために、防腐剤が添加されていてもよい。
【００７４】
本発明にかかるスクリーニング方法は、試料のフィブリン溶解率をフィブリン平板法によって活性評価する方法である。
【００７５】
すなわち、上記スクリーニング方法は、（ｉ）プラスミン活性を亢進することにより血栓の溶解を促進するポリペプチドをスクリーニングする方法、または、（ ii ）プラスミン活性を抑制することにより血栓の溶解を抑制するポリペプチドの活性を評価する方法である。
【００７６】
本発明のスクリーニング方法に用いる試料としては、特に限定されるものではないが、例えば、上記第１のペプチドおよび第２のペプチド、上記検出方法によって得られたポリペプチド、などを用いることができる。
【００７７】
上記フィブリン平板法は、後述の実施例のように、フィブリノーゲンとトロンビンとからフィブリン膜を作製したシャーレに、プラスミンと試料となるペプチドとを混合して加え、フィブリンの溶解部を観察してプラスミン活性を評価するものである。すなわち、プラスミンのみをフィブリン膜に加えた場合のフィブリン溶解部と、試料とプラスミンの混合物を加えた場合のフィブリン溶解部とを比較することより、プラスミンのみの場合よりも溶解部が大きくなっていれば、試料のペプチドにプラスミン活性を亢進する機能があると評価し、反対に、溶解部が小さくなっていれば、試料のペプチドにプラスミン活性を抑制する機能があると評価するものである。
【００７８】
なお、本発明には、上記スクリーニング方法によって得られるポリペプチドも含まれる。すなわち、上記スクリーニング方法によって得られるプラスミン活性を亢進または抑制する機能を有するポリペプチドが含まれる。
【００７９】
したがって、本発明のスクリーニング方法によれば、プラスミン活性を亢進または抑制する機能を有することが分かっていない試料から、当該機能を有する試料のみを取り出すことができる。このスクリーニング方法によって得られたペプチドは、血栓溶解薬または抗線溶薬として利用することができる。
【００８０】
（５）本発明にかかる血栓溶解薬および抗線溶薬
上記（１）で説明したポリペプチド、および、上記（４）で説明したスクリーニング方法によって得られたポリペプチドは、いずれも血栓の溶解を制御するポリペプチドである。それゆえ、血栓溶解薬または抗線溶薬として利用することができる。
【００８１】
すなわち、本発明には、（ｉ）プラスミン活性を亢進することにより血栓の溶解を促進する血栓溶解薬、（ ii ）プラスミン活性を抑制することにより血栓の溶解を抑制する抗線溶薬、が含まれる。
【００８２】
上記血栓溶解薬は、上記（１）で説明したプラスミン活性を亢進するポリペプチド、または、上記（５）で説明したプラスミン活性を促進するポリペプチドのスクリーニング方法によって得られたポリペプチドが含まれていればよい。
【００８３】
また、上記抗線溶薬は、上記（１）で説明したプラスミン活性を抑制するポリペプチド、または、上記（５）で説明したプラスミン活性を抑制するポリペプチドのスクリーニング方法によって得られたポリペプチドが含まれていればよい。
【００８４】
本発明の血栓溶解薬または抗線溶薬の作用機序は、プラスミンの酵素活性を亢進または抑制するものである。それゆえ、従来のように、プラスミンの量を増減させるのとは全く作用機序の異なる、新しいタイプの血栓溶解薬または抗線溶薬を提供することができる。
【００８５】
なお、本発明の血栓溶解薬または抗線溶薬は、体内でその効果を発揮すればよいので、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを投与してもよいし、プロドラッグ化して体内で代謝されて当該ポリペプチドが発現されてもよい。すなわち、本発明の血栓溶解薬または抗線溶薬は、上記本発明のポリペプチドがプロドラッグ化されていてもよい。
【００８６】
また、本発明の血栓溶解薬または抗線溶薬には、１種類以上の賦形剤、１種類以上の結合剤、１種類以上の崩壊剤、１種類以上の滑沢剤、１種類以上の緩衝剤、のように、医薬品として許容される添加物が含まれていてもよい。
【００８７】
（６）本発明にかかる遺伝子
本発明にかかる遺伝子は、上記（１）で説明したポリペプチド、上記（４）で説明したスクリーニング方法によって得られたポリペプチド、上記（６）で説明した血栓溶解薬または抗線溶薬をコードする遺伝子である。
【００８８】
上記の遺伝子は、本発明のポリペプチドをコードしているので、適当な宿主（例えば細菌、酵母）に導入して、本発明のポリペプチドを発現させることができる。
【００８９】
なお、上記「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「遺伝子」は、上記本発明のポリペプチドをコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。例えば、上記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする配列をベクター配列につないで本発明の遺伝子を構成し、これを適当な宿主で増幅させることにより、本発明の遺伝子を所望に増幅させることができる。また、本発明の遺伝子の一部配列をプローブに用いてもよい。
【００９０】
（７）本発明の有用性
以上のように、上記第１のペプチドおよび第２のペプチドは、プラスミン活性を亢進または抑制することにより、血栓の溶解を制御することができる。それゆえ、本発明は、以下に示すような有用性がある。
【００９１】
Ａ．第１のペプチドに関連する有用性
（ｉ）これまでに例のない、全く新しい作用機序をもった血栓溶解薬を提供することができる。血栓の溶解（フィブリン分解）を亢進する医薬品はこれまで例がない。フィブリン分解産物に同様な作用が認められたが、この場合は、臨床検査キットの中で酵素作用補助剤として用いられており、今日では使われていない。
【００９２】
（ ii ）第１ペプチドは、血栓の治療・予防薬、プラスミンの臨床診断薬としての応用が期待される。
【００９３】
（ iii ）第１のペプチドを認識する抗体を用いて、第１のペプチドの検出、第１のペプチドと同様の作用を有する可能性の高いポリペプチドを検出することができる。
【００９４】
（ iv ）第１のペプチドを認識する抗体を用いて得られるポリペプチドから、特に、プラスミン活性を亢進する機能が高いポリペプチドをスクリーニングすることができる。これにより得られたポリペプチドは、特に血栓溶解薬として有用である。
【００９５】
Ｂ．第２のペプチドに関連する有用性
（ｉ）第２のペプチドは、抗線溶薬として利用可能である。適応症としては、作用が類似する抗線溶薬として市販されているイプシロンアミノカプロン酸（第一製薬、イプシロン（登録商標））、トラネキサム酸（バソラミンおよびトランサミン（いずれも登録商標））と同様の症状に適応可能と考えられる。すなわち、第２のペプチドの効能・効果は、抗プラスミン作用、止血作用、抗アレルギー・抗炎症作用にあり、適応症としては、全身性線溶亢進が関与すると考えられる出血傾向（白血病、再生不良性貧血、紫斑病など、および手術中・術後の異常出血）、局所線溶亢進が関与すると考えられる異常出血（肺出血、鼻出血、性器出血、腎出血、前立腺手術中・術後の異常出血）、紅斑・腫脹・掻痒を伴う以下の疾患（湿疹およびその類症、蕁麻疹、薬疹、中毒疹）、咽頭痛・発赤・充血・腫脹などの症状を伴う以下の疾患（扁桃炎、咽喉頭炎）、口内炎における口内痛および口内粘膜アフターなどが挙げられる。
【００９６】
（ ii ）抗線溶薬は、一般向け市販薬の中でも、風邪薬、美白・シミ取り薬、歯磨き粉に配合されているものがある。したがって、第２のペプチドも、これらにも適応可能である。
【００９７】
（ iii ）抗線溶薬は、研究報告として、マウスすい臓癌に対する抑制効果があるとする報告がある。したがって、第２ペプチドも、これにも適応可能である。
【００９８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例の記載に限定されるものではなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能である。
【００９９】
〔実施例１〕ウシ・ヘモグロビンのβ鎖のアミノ酸配列に基づく、血栓の溶解を制御するポリペプチド（候補化合物）の合成
ウシ・ヘモグロビンのβ鎖のアミノ酸配列に基づいて、リジンを含む領域を合常法に従って、ポリペプチドを合成した。すなわち、配列番号４に示されるウシ・ヘモグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、第１のペプチド（ＦＯ１５２−１）として、Ｎ末端のメチオニンから２０番目のアスパラギン酸までの２０ｍｅｒからなるペプチド（配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）を、第２のペプチド（ＦＯ１５２−２）として、配列番号４に示されるウシ・ヘモグロビンのβ鎖アミノ酸配列における６１番目のアラニンから７５番目のリジンまでの配列のうち、７３番目のグリシンをアスパラギンに、７５番目のリジンをメチオニンに置換した１５ｍｅｒからなるペプチド（配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）を合成した。図３にはウシ・ヘモグロビンβ鎖構造内における第１のペプチド（ＦＯ１５２−１）に相当する部位（図中Ｍ１〜Ｄ２０）がリボン状で示される。同様に、図４には第２のペプチド（ＦＯ１５２−２）に相当する部位（図中Ａ６１〜Ｋ７５）がリボン状で示される。ただし図４には示されないが、前述のようにＦＯ１５２−２は、７３番目のグリシンがアスパラギンに、７５番目のリジンがメチオニンに置換されている。なお、図４に示されるリボン状の部分は、配列番号２に示されるアミノ酸からなるポリペプチドに相当する部分でもある。
【０１００】
なお、合成方法はアミノ基をＦｍｏｃ基で保護した、固相合成で行った。
【０１０１】
〔実施例２〕プラスミンに対する溶解率の評価
実施例１で製造したポリペプチドのフィブリンに対する溶解率を常法にしたがって、フィブリン平板法によって検討した。
ウシ・フィブリノーゲン（Fibrinogen from bovine plasma, lot.309-03663, Ito Ham Foods, 大阪）を凝固タンパクとして０．４％となるよう１％ＮａＣｌ加１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。このフィブリノーゲン液８ｍｌを９ｃｍ径のプラスチック製シャーレに取り、２００ＩＵ／ｍＬのヒト・トロンビン（トロンビン−ヨシトミ ５００単位、吉富製薬、大阪）０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ 溶液を１００μＬ加えて、水平面上に室温下で６０分放置して凝固させ、フィブリン平板を作製した。
０．５ＩＵ／ｍＬのヒト・プラスミン（Plasmin from human plasma, Ｐ4895, lot. 89H7614, SIGMA, USA）０．８５％生理食塩水溶液に、等容量のサンプルを混合し、直ちにこの混合液２０μＬをフィブリン平板上に静置、水平を保った３７℃の恒温室内でインキュベートした。１８時間後にフィブリン膜の溶解部の長径と短径を測定（ｍｍ）、長径×短径を溶解面積（ｍｍ^２ ）とした。測定は２回行い、両者の平均値を当該検体の活性値とした。また対照にはサンプルの代わりに０．８５％生理食塩水を用い、サンプルに対して行ったと同様に測定した。
【０１０２】
なお、インキュベート処理（３７℃で１時間の加熱処理）は、サンプル（実施例１で合成したポリペプチド）とヒト・プラスミンとの反応を進行させるためのものである。すなわち、例えば、ＦＯ１５１−１とプラスミンとを混合して３７℃で１時間加温することは、両者が反応して得られる生成物（この場合、両者の複合体の形成と推測される）を形成させるための条件を十分に与えるためのものである。
【０１０３】
溶解率は、サンプルの変わりに生食を加えた対照の溶解面積−（サンプル＋プラスミンの溶解面積）／サンプルの変わりに生食を加えた対照の溶解面積 × １００ （％）で表した。
【０１０４】
この試験において得られた結果は以下のようである。まずＦＯ１５２−１についてであるが、プラスミンとＦＯ１５２−１とを混合後直ちに、平板上に置いた場合と、混合後の１時間を３７℃でインキュベートしてからフィブリン膜上に静置した場合の２つの条件を変えた試験を行った（図１）。
【０１０５】
本試験の結果、ＦＯ１５２−１とヒト・プラスミンとの関係には２つの特徴が示された。第１は至適濃度のあることで、プラスミンに対して適当な濃度範囲を越えると、濃くても薄くても反応は低下することである。第２はプラスミンと予め加温することで、反応が強調されることである。十分な反応（１時間の加温下で）なしに基質（フィブリン）と会合した場合、プラスミンの反応は抑制気味であることから、ＦＯ１５２−１はフィブリンとの反応性がプラスミンに対する反応性よりも強いと考えられる。
【０１０６】
具体的には、ＦＯ１５２−１は酵素プラスミンと基質フィブリンとの結合を仲介する役割を果たしていると考えられる。しかしながら、ＦＯ１５２−１は、プラスミンよりもフィブリンと容易に結合し、ＦＯ１５２−１がフィブリンとプラスミンとの両者にほぼ同時に会合した場合にはフィブリンを選択して結合し、ＦＯ１５２−１−フィブリン複合体を生成すると推定される。この複合体生成のため、ＦＯ１５２−１はプラスミンとの結合の仲介する役割を果たさなくなり、フィブリン側のプラスミン結合部位をブロックすると推測される。上記した「十分な反応（１時間の加温下で）なしに基質（フィブリン）と会合した場合、プラスミンの反応は抑制気味である」というのは、この結果から推測したものである。
【０１０７】
これに対して、ＦＯ１５２−１とプラスミンとを３７℃で１時間インキュベーションして、ＦＯ１５２−１−プラスミン複合体を形成させると、この複合体のＦＯ１５２−１はフィブリンと結合しやすいためフィブリンに結合しようとする。その結果、ＦＯ１５２−１−プラスミン複合体とフィブリンとの距離が近くなり、プラスミンの酵素活性が亢進されていると推測される。
【０１０８】
なお、ＦＯ１５２−１にフィブリンを分解する酵素作用は全くなく、フィブリンとプラスミンとの間に介在することにより、プラスミン活性を亢進しているので、ＦＯ１５２−１は「線溶増強作用：accelerating activity」を有するということもできる。
【０１０９】
このことは治療目的で本物質を用いる場合の投与量、投与の順序あるいは混合剤の組み合わせを考えるうえで重要となる。本実験の結果では、ヒト・プラスミン（０．５ＩＵ／ｍＬ）と６２．５μｇ／ｍＬのＦＯ１５２−１の等容量混合液を、３７℃、１時間の加温をした後にフィブリン膜上に置いたとき、プラスミン活性は最も高く現われ、対照に比べ２２．３％の溶解率の増加（Accelerating activity）を示した。
【０１１０】
次に、フィブリン平板法で測定したＦＯ１５２−２濃度と溶解率との関係は、図２に示した。
【０１１１】
前述のＦＯ１５２−１の場合と同様、３７℃、１時間の加温を行った場合にＦＯ１５２−２のプラスミン抑制効果は顕著に出現した。本実験結果では、０．５ＩＵ／ｍＬのヒト・プラスミンと等容量の２５０μｇ／ｍＬ ＦＯ１５２−２生理食塩水溶液に混合後、３７℃で１時間加温したものが最もプラスミンに対する抑制効果が高く、対照に比べ８３％の溶解率抑制が認められた。
【０１１２】
なお、ＦＯ１５２−２については、以下の実験により、プラスミンの酵素活性を抑制することが確認された。すなわち、第１に電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果である。図示しないが、プラスミンとヘモグロビンとを混ぜ合わせると、ヘモグロビンが分解され、プラスミンのバンドも移動するため、プラスミンとヘモグロビンあるいはヘモグロビンの一部とが結合していると考えられる。フィブリンは固体のため電気泳動ができないので、フィブリンの代わりにフィブリノーゲンを使用したが、フィブリノーゲンとヘモグロビンとを混ぜ合わせた場合も、ヘモグロビンのバンドが薄くなることから、フィブリノーゲンとヘモグロビンとが結合していると考えられる。
【０１１３】
第２に、図２に示されるグラフの結果である。Non incubationの場合（プラスミンとＦＯ１５２−２とを混ぜ合わせ、直ちにフィブリン膜に接触させた場合）は、どの濃度においても３０％〜４０％の溶解率の減少（すなわちプラスミンの抑制効果）を示している。これに対して、Incubationの場合（プラスミンとＦＯ１５２−２とを混ぜ合わせ、その混合液を３７℃で１時間置き、両者をよく反応させた後、フィブリン膜に接触させた場合）は、２５０μｇ／ｍＬのＦＯ１５２−２に対し、０．５ＩＵ／ｍＬのヒト・プラスミンを当量混ぜ合わせたときに（全て同条件で測定）、Non incubationの場合の約２倍と最も抑制効果が強く現われている。
【０１１４】
これらの結果より、プラスミンとＦＯ１５２−２との結合性が高くなる条件において、プラスミンの酵素活性を抑制する効果が顕著になると判断することができる。
【０１１５】
【発明の効果】
以上のように、本発明のポリペプチドは、プラスミン自身の酵素活性を効率的に亢進または抑制することによって血栓の溶解を制御するという、これまでに全く知られていない作用をもったポリペプチドである。それゆえ、これまでの作用機序とは全く異なる、新しいタイプの血栓溶解薬または抗線溶薬を提供することができる。
【０１１６】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Japan Science and Technology Agency
<120> Novel polypeptides for controlling thrombolysis.
<130> A251P02
<140>
<141>
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Peptide Sequence
<400> 1
Met Leu Thr Ala Glu Glu Lys Ala Ala Val Thr Ala Phe Trp Gly Lys
1 5 10 15
Val Lys Val Asp
20
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Peptide Sequence
<400> 2
Ala His Gly Lys Lys Val Leu Asp Ser Phe Ser Asn Gly Lys Lys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Peptide Sequence
<400> 3
Ala His Gly Lys Lys Val Leu Asp Ser Phe Ser Asn Asn Lys Met
1 5 10 15
<210> 4
<211> 145
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 4
Met Leu Thr Ala Glu Glu Lys Ala Ala Val Thr Ala Phe Trp Gly Lys
1 5 10 15
Val Lys Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu Leu Val
20 25 30
Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp Leu Ser
35 40 45
Thr Ala Asp Ala Val Met Asn Asn Pro Lys Val Lys Ala His Gly Lys
50 55 60
Lys Val Leu Asp Ser Phe Ser Asn Gly Met Lys His Leu Asp Asp Leu
65 70 75 80
Lys Gly Thr Phe Ala Ala Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys Leu His
85 90 95
Val Asp Pro Glu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Val Val
100 105 110
Leu Ala Arg Asn Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Val Leu Gln Ala Asp
115 120 125
Phe Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Arg Tyr
130 135 140
His
145
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒト・プラスミンのフィブリン溶解能に対する本発明のポリペプチドであるＦＯ１５２−１ペプチドの濃度の影響を示したグラフである。
【図２】 ヒト・プラスミンのフィブリン溶解能に対する本発明のポリペプチドであるＦＯ１５２−２ペプチドの濃度の影響を示したグラフである。
【図３】 ウシ・ヘモグロビンβ鎖構造内におけるＦＯ１５２−１に相当する部位（Ｎ末端のメチオニン（Ｍ１）〜２０番目のアスパラギン酸（Ｄ２０））の模式図である。
【図４】 ウシ・ヘモグロビンβ鎖構造内におけるＦＯ１５２−２に相当する部位（Ｎ末端側から６１番目のアラニン（Ａ６１）〜７５番目のリジン（Ｋ７５））の模式図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  The present invention relates to a polypeptide that belongs to pharmaceuticals and biotechnology and controls thrombolysis, and more specifically, a polypeptide that controls thrombolysis by efficiently improving or suppressing plasmin enzyme activity and its polypeptide It is about usage.
[0002]
[Prior art]
  Usually, when blood contacts a surface different from the intima of normal blood vessels (for example, a foreign body surface that tends to bleed), a blood coagulation reaction is caused. In the living body, in the presence of a small amount of tissue thromboplastin, blood coagulation factors are concentrated on the surface of platelets that adhere to and coagulate with damaged blood vessels, and a blood coagulation process that repeats proteolysis proceeds, and finally fibrin (fibrin). Causes blood clots to form.
[0003]
  Even if it is for hemostasis, the formation of a thrombus in a blood vessel may impair blood circulation and is not preferable. However, there is an action (so-called fibrinolysis phenomenon (fibrinolysis phenomenon)) that dissolves fibrin (thrombus) that is no longer necessary in the living body. Briefly explaining this fibrinolysis phenomenon, when fibrin is generated in a living body, plasminogen in the bloodstream is adsorbed by fibrin. On the other hand, tissue plasminogen activator (t-PA) is contained in the cells of the blood vessel wall, and is released along with vascular injury, dilation, contraction, etc., and is similarly adsorbed to fibrin. Thus, after forming a trimer of t-PA, plasminogen, fibrin, plasminogen is activated to plasmin by t-PA on fibrin. The plasmin degrades fibrin to form soluble FDP (fibrin degradation products), and the thrombus is dissolved.
[0004]
  Thus, in the living body, the formation and dissolution of thrombus is controlled by balancing the fibrinolysis phenomenon. A pharmaceutical agent that controls the fibrinolysis phenomenon is used as a thrombolytic agent that promotes thrombolysis and an anti-fibrinolytic agent (antiplasmin agent) that inhibits thrombus dissolution.
[0005]
  Urokinase and t-PA are known as typical thrombolytic drugs. The mechanism of action of these drugs is to promote the reaction of inactive plasminogen into active plasmin to produce more plasmin and improve the dissolution rate in fibrin. That is, an increase in the amount of plasmin produced enhances the fibrinolysis phenomenon and promotes thrombus dissolution. However, both urokinase and t-PA are derived from living organisms, and high-precision technology and personnel are required to produce them.
[0006]
  On the other hand, epsilon aminocaproic acid and its derivative tranexamic acid are known as typical antifibrinolytic drugs (antiplasmin drugs). The mechanism of action of these drugs is that the binding of plasminogen to fibrin is inhibited by the binding of these drugs to the lysine binding site (Lysine-Binding-Site) that exists in plasminogen and binds to fibrin. As a result, plasmin is decreased and the dissolution rate for fibrin is decreased. That is, by reducing the amount of plasmin bound to fibrin, the fibrinolysis phenomenon is suppressed and thrombus dissolution is suppressed.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
  Thus, the fibrinolysis phenomenon by plasmin plays an extremely important role in controlling the dissolution of thrombus, and if plasmin activity can be controlled, it can be used as a thrombolytic drug or an anti-fibrinolytic drug. However, thrombolytic agents and anti-fibrinolytic agents currently used as pharmaceuticals increase or decrease the amount of plasmin and do not control plasmin activity.
[0008]
  Therefore, if plasmin activity can be controlled, the development of a new type of thrombolytic or anti-fibrinolytic agent that promotes or inhibits thrombus dissolution and has a completely different mechanism of action has been developed. Be expected.
[0009]
  The present invention has been made in view of the above problems, and its purpose is not to increase or decrease the amount of plasmin as in the past, but to efficiently enhance or suppress the enzyme activity of plasmin itself, The object is to provide a substance for controlling the dissolution of a thrombus and to propose a method for using the substance.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
  As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventor has discovered that the addition of animal erythrocytes to plasmin, a thrombolytic enzyme, significantly enhances the fibrinolysis phenomenon and exhibits its action Was found in the β chain of bovine hemoglobin. The inventors have found that bovine hemoglobin incorporates a structure that enhances thrombus dissolution and a structure that suppresses thrombolysis, and has completed the present invention.
[0011]
  In order to solve the above-mentioned problems, the polypeptide according to the present invention is characterized by controlling the thrombolysis by controlling the plasmin activity.
[0012]
  That is, the polypeptide according to the present invention is a polypeptide that controls thrombolysis by controlling plasmin activity, and is a polypeptide comprising at least one of the following (a) to (d).
(A) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a function of enhancing plasmin activity.
(B) 1 or in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1severalA polypeptide having an amino acid sequence in which the amino acid is substituted, deleted, inserted, and / or added, and having a function of enhancing plasmin activity.
(C) A polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a function of suppressing plasmin activity.
(D) 1 or in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2severalA polypeptide having the function of suppressing plasmin activity, comprising an amino acid sequence in which the amino acid is substituted, deleted, inserted and / or added.
[0013]
  Here, “controlling plasmin activity” means enhancing or suppressing the enzyme activity of plasmin, and “controlling thrombus dissolution” means promoting or suppressing thrombus dissolution.
[0014]
  The polypeptide that enhances plasmin activity according to the present invention is the following polypeptide (a) or (b).
(A) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a function of enhancing plasmin activity.
(B) 1 or in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1severalA polypeptide having an amino acid sequence in which the amino acid is substituted, deleted, inserted, and / or added, and having a function of enhancing plasmin activity.
[0015]
  The peptide which suppresses thrombolysis according to the present invention is the following polypeptide (c) or (d).
(C) A polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a function of suppressing plasmin activity.
(D) 1 or in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2severalA polypeptide having the function of suppressing plasmin activity, comprising an amino acid sequence in which the amino acid is substituted, deleted, inserted and / or added.
[0016]
  The polypeptide that suppresses plasmin activity according to the present invention comprises an amino acid sequence in which the 13th alanine is substituted with asparagine and the 15th lysine is substituted with methionine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. It may be a polypeptide. That is, it may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. In other words, the polypeptide of (d) is a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, for example.
[0017]
  The amino acid sequence of the polypeptide that controls the dissolution of the thrombus shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3 can be produced, for example, based on the amino acid sequence of hemoglobin, more specifically bovine hemoglobin β chain.
[0018]
  The antibody according to the present invention is characterized by specifically recognizing the polypeptide.
[0019]
  The method for detecting a polypeptide for controlling the dissolution of a thrombus according to the present invention is characterized by reacting a sample with the antibody.
[0020]
  That is, the method for detecting a polypeptide having a function of enhancing plasmin activity according to the present invention is characterized by reacting a sample with an antibody that specifically recognizes the polypeptide that enhances plasmin activity.
[0021]
  Similarly, the method for detecting a polypeptide having a function of suppressing plasmin activity according to the present invention is characterized by reacting a sample with an antibody that specifically recognizes the polypeptide that suppresses plasmin activity.
[0022]
  Since the antibody specifically recognizes a polypeptide that controls thrombolysis, the polypeptide in the sample can be detected by reacting with the sample.
[0023]
  The method for screening a polypeptide for controlling the dissolution of a thrombus according to the present invention comprises the steps of:Fibrin dissolution rateTheFibrin plate methodIt is characterized by evaluating by.
[0024]
  That is, the method for screening a polypeptide having a function of enhancing plasmin activity according to the present invention is a method for detecting a polypeptide that enhances the plasmin activity or a polypeptide obtained by the method for detecting a polypeptide that enhances the plasmin activity.Fibrin dissolution rateTheFibrin plate methodIt is characterized by evaluating by.
[0025]
  Similarly, a method for screening a polypeptide having a function of suppressing plasmin activity is a method for detecting a polypeptide that suppresses the plasmin activity or a polypeptide obtained by the method for detecting a polypeptide that suppresses the plasmin activity.Fibrin dissolution rateTheFibrin plate methodIt is characterized by evaluating by.
[0026]
  The present invention includes a polypeptide that controls thrombolysis obtained by the above screening method.
[0027]
  The thrombolytic drug according to the present invention is characterized by enhancing plasmin activity and promoting thrombolysis.
[0028]
  The thrombolytic drug may contain, for example, the polypeptide obtained by the method for screening a polypeptide of (a) or (b) above or a polypeptide that enhances the plasmin activity.
[0029]
  The anti-fibrinolytic agent according to the present invention is characterized by suppressing plasmin activity to inhibit thrombolysis.
[0030]
  The anti-fibrinolytic agent only needs to contain, for example, the polypeptide obtained by the method for screening a polypeptide of (c) or (d) above or a polypeptide that suppresses the plasmin activity.
[0031]
  Finally, the gene according to the present invention is a gene encoding the above polypeptide or the polypeptide obtained by the above screening method.
[0032]
  According to the present invention, a polypeptide that controls thrombolysis by efficiently increasing or suppressing the enzyme activity of plasmin itself, instead of increasing or decreasing the amount of plasmin as in the past, and a method for using the same Can be provided.
[0033]
[Embodiments of the Invention]
  An embodiment of the present invention will be described below with reference to FIGS. Note that the present invention is not limited to this.
[0034]
  (1) Background of the present invention
  First, prior to the description of the present invention, the background to the present invention will be described.
[0035]
  The inventors of the present application, when adding erythrocytes of animals (tested in cattle, mice, and chickens) to plasmin, a thrombolytic enzyme, has a remarkable ability to dissolve fibrin, which is one of the blood coagulation factors and becomes a thrombus. It was found to be enhanced. No enzyme that promotes thrombus lysis was found in erythrocytes, and the above function was observed only when water-soluble components in erythrocytes and plasmin were mixed. Therefore, plasmin activity in water-soluble components in erythrocytes Attempts were made to identify substances that exert the function of enhancing the function.
[0036]
  Specifically, the action of plasmin is enhanced by removing water-soluble components of erythrocytes by affinity chromatography with hydroxyapatite, removal of plasmin-related substances by lysine-sepharose affinity chromatography, fractionation by molecular size by reverse phase chromatography, etc. The fraction to be obtained was obtained. And as a result of examining the amino acid sequence of the component contained in this fraction, it was confirmed that it was a β chain of bovine hemoglobin having a molecular weight of around 10,000. Bovine hemoglobin is formed of a tetramer composed of two α chains and two β chains.
[0037]
  Therefore, the inventors of the present application, in order to elucidate why hemoglobin, which is known only for the role of transporting oxygen, is involved in the dissolution of thrombus, the molecular change when plasmin and hemoglobin are associated I decided to investigate. As a result of various studies, plasmin was added to bovine hemoglobin, and when heated at 37 ° C for 1 hour, hemoglobin was decomposed, and fractions that increased plasmin activity by fractionation by Sephacryl G-200 gel chromatography and plasmin activity And a fraction that inhibits The result is(I)Hemoglobin is degraded by plasmin,( ii )The hemoglobin molecule incorporates a structure that enhances thrombus dissolution and a structure that inhibits thrombus dissolution, which means that the function is revealed by the degradation action of plasmin.
[0038]
  Therefore, in order to elucidate the peptide that promotes lysis of plasmin thrombus and the peptide that suppresses thrombolysis, the present inventor of the present invention has the amino acid sequence constituting the β chain of bovine hemoglobin. A peptide was synthesized focusing on the region containing lysine, and a plasmin solubility screening test was conducted. The reason for focusing on the region containing lysine is that it is known that the affinity between lysine and plasmin is high.
[0039]
  (2) Polypeptide of the present invention
  The polypeptide according to the present invention controls thrombolysis by enhancing or suppressing plasmin activity, and is a polypeptide comprising at least one of the following (a) to (d).
(A) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a function of enhancing plasmin activity.
(B) 1 or in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1severalA polypeptide having an amino acid sequence in which the amino acid is substituted, deleted, inserted, and / or added, and having a function of enhancing plasmin activity.
(C) A polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a function of suppressing plasmin activity.
(D) 1 or in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2severalA polypeptide having the function of suppressing plasmin activity, comprising an amino acid sequence in which the amino acid is substituted, deleted, inserted and / or added.
[0040]
  Here, “enhance plasmin activity” means enhancing enzyme activity of plasmin.
[0041]
  Further, “suppressing plasmin activity” means suppressing plasmin enzyme activity. This is due to, for example, that the polypeptide itself binds more easily to fibrin than plasmin, and as a result, the function of plasmin is suppressed.
[0042]
  “Controlling thrombus dissolution” means promoting or suppressing thrombus dissolution.
[0043]
  That is, the polypeptide according to the present invention is(I)A polypeptide that enhances plasmin activity and promotes thrombus dissolution (for convenience, referred to as the “first peptide”);( ii )And a polypeptide that suppresses thrombolysis by suppressing plasmin activity (for convenience, referred to as “second peptide”).
[0044]
  The first peptide is, for example, the following polypeptide (a) or (b).
(A) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a function of enhancing plasmin activity.
(B) 1 or in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1severalA polypeptide having an amino acid sequence in which the amino acid is substituted, deleted, inserted, and / or added, and having a function of enhancing plasmin activity.
[0045]
  The first peptide has a function of enhancing plasmin activity and promotes thrombolysis. Therefore, the first peptide is not only useful as a thrombolytic agent for the prevention and / or treatment of thrombosis, but also for the prevention or treatment of myocardial or cerebral infarction, or adult diseases such as arteriosclerosis and diabetes. There is a possibility of effective use. In addition, there is a possibility that it can be effectively used for the prevention or treatment of diseases considered to involve fibrinolysis suppression.
[0046]
  The second peptide is, for example, the following polypeptide (c) or (d).
(C) A polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a function of suppressing plasmin activity.
(D) 1 or in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2severalA polypeptide having the function of suppressing plasmin activity, comprising an amino acid sequence in which the amino acid is substituted, deleted, inserted and / or added.
[0047]
  The second peptide has a function of suppressing plasmin activity and suppresses thrombolysis. Therefore, the second peptide is not only useful as an anti-fibrinolytic drug, but may be effectively used for the prevention or treatment of a disease that is considered to involve enhanced fibrinolysis.
[0048]
  Here, the “polypeptide” may be chemically synthesized, isolated and purified from cells, tissues, or the like, or a gene encoding the polypeptide may be introduced into a host cell. It may be in a state of being introduced and expressing the polypeptide intracellularly. The polypeptide according to the present invention may include an additional polypeptide. Examples of the case where such a polypeptide is added include a case where the polypeptide of the present invention is epitope-tagged with HA, FLAG, or the like. In addition, the polypeptide according to the present invention may have a substituent or a functional group introduced into the main chain or side chain as long as the function of enhancing or suppressing plasmin activity is not lost, and the functional group is protected. Alternatively, the amino group may be protected, and the carboxyl group may be a salt such as a metal salt. That is, the above polypeptides also include derivatives thereof.
[0049]
  In addition, the above “1 orseveralAs used in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, for example, the 13th glycine is changed to asparagine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. , Means to produce a polypeptide in which the 15th lysine is substituted with methionine.
[0050]
  In addition, when using genetic engineering techniques, substitution, deletion, insertion, and / or number of amino acids that can be substituted, deleted, inserted and / or added by known mutant protein production methods such as site-directed mutagenesis And / or may be added. Thus, when genetic engineering techniques are used, the polypeptide of (b) above is, in other words, a variant of the polypeptide of (a) above, and the polypeptide of (d) above is, in other words, For example, it is a variant of the polypeptide of (c) above. For example, a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 which is one of the polypeptides of (d) above is a variant of the polypeptide of (c) shown in SEQ ID NO: 2. “Mutation” here means a mutation artificially introduced mainly by a known mutant protein production method, but may be a product obtained by isolating and purifying a similar naturally occurring mutant.
[0051]
  As described above, the polypeptide of the present invention is produced using (1) a chemical synthesis method (so-called peptide synthesis), (2) a purification and isolation method from a living body or cultured cells, or (3) a gene recombination technique. Can be obtained by methods, etc.
[0052]
  A polypeptide consisting of a relatively short chain of about 20 amino acids as shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3 can be easily and conveniently obtained by peptide synthesis. For peptide synthesis, a solid phase method in which an amino acid protected amino group is sequentially introduced into a carrier to form a peptide can be suitably used.
[0053]
  In addition, it is industrially preferable to obtain a long-chain polypeptide consisting of a large number of amino acids using a gene recombination technique. Examples of the expression system (host-vector system) for producing a polypeptide using a gene recombination technique include bacterial, yeast, insect cell and mammalian cell expression systems.
[0054]
  The origin of the first peptide and the second peptide is not particularly limited. For example, the first peptide and the second peptide are included in the amino acid sequence included in hemoglobin, and more specifically, in the bovine hemoglobin β chain. A polypeptide derived from a region containing lysine.
[0055]
  Specifically, the first peptide represented by SEQ ID NO: 1 is a polypeptide named as FO152-1, which was synthesized by the present inventor using a bovine hemoglobin β chain as a model. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 corresponds to the region from the N-terminal methionine to the 20th aspartic acid in the amino acid sequence of the bovine hemoglobin β chain shown in SEQ ID NO: 4.
[0056]
  The amino acid sequence of the second peptide shown in SEQ ID NO: 2 corresponds to the amino acid sequence of the region from the 61st alanine to the 75th lysine from the N-terminal side of the bovine hemoglobin β chain shown in SEQ ID NO: 4 To do.
[0057]
  Furthermore, the second peptide shown in SEQ ID NO: 3 is a polypeptide named FO152-2, which was synthesized by the present inventor using a bovine hemoglobin β chain as a model. That is, the second peptide shown in SEQ ID NO: 3 is a polypeptide in which the 13th glycine is substituted with asparagine and the 15th lysine is substituted with methionine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. In other words, the second polypeptide represented by SEQ ID NO: 3 is an amino acid sequence from the 61st glycine to the 75th lysine of the bovine hemoglobin β chain represented by SEQ ID NO: 4, wherein the 73rd glycine is an asparagine. The 75th lysine is a polypeptide in which methionine is substituted.
[0058]
  In addition to the polypeptides shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3, a polypeptide that controls thrombolysis based on the amino acid sequence in bovine hemoglobin β-chain, similar to the first peptide and the second peptide. Peptides can be obtained. In this case, the region containing lysine in the amino acid sequence of bovine hemoglobin β chain is highly likely to control thrombolysis.
[0059]
  (3) Antibody according to the present invention
  Next, the antibody according to the present invention will be described.
[0060]
  The antibody according to the present invention is an antibody that specifically recognizes a polypeptide that controls thrombolysis by enhancing or suppressing plasmin activity. In other words, the antibody specifically recognizes the polypeptide described in (1) above.
[0061]
  That is, the antibody according to the present invention is(I)An antibody that specifically recognizes the first peptide that promotes thrombolysis (referred to as "first antibody" for convenience) or( ii )An antibody that specifically recognizes a polypeptide (second peptide) that suppresses thrombolysis (referred to as “second antibody” for convenience). In other words, the antibody according to the present invention is an antibody having the first peptide or the second peptide as an antigen. The antibody only needs to specifically recognize the first peptide, the second peptide, or a fragment thereof.
[0062]
  Here, the “antibody” may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. The monoclonal antibody can be produced by a conventional hybridoma technique using the first peptide, the second peptide, or a fragment thereof as an antigen. A polyclonal antibody is produced by a conventional method comprising inoculating a host animal such as a rat or a rabbit with the first peptide, the second peptide, or a fragment thereof, and collecting the sensitized serum. Can do.
[0063]
  The first antibody can specifically recognize a polypeptide having a function of enhancing plasmin activity, and the second antibody specifically recognizes a polypeptide having a function of suppressing plasmin activity. Can do.
[0064]
  Therefore, according to the above antibody, the first peptide can be quantified using the first antibody, and the second peptide can be quantified using the second antibody. Further, as described later, it can be used as a detection reagent used in a method for detecting a polypeptide that controls dissolution of a thrombus according to the present invention.
[0065]
  In addition, the antibody may be used as an antibody drug or a diagnostic agent (that is, a detection reagent) for treating human or animal diseases related to the first peptide or the second peptide. The diagnostic method when used as a diagnostic agent is that the peptide is easily detected by immunoreacting a sample such as blood of an animal suspected of developing a disease related to the peptide with the antibody. It is possible to determine whether or not the disease has developed. That is, if the sample and the antibody are immunoreactive, it means that the peptide is present in the sample, so that it can be determined that a disease related to the peptide has developed. On the other hand, if there is no immune reaction, it means that the peptide is not present in the sample, so it can be determined that a disease related to the peptide has not occurred.
[0066]
  The method for determining the immune reaction is not particularly limited, and for example, a fluorescent antibody method, an immunoprecipitation method, a Western blot method, an affinity chromatography method, a colony blot method and the like can be used. By using these methods, the accuracy and reliability of the detection method according to the present invention can be further improved.
[0067]
  Furthermore, as described later, the above-described antibody is used to detect a polypeptide that may have the same properties as the polypeptide according to the present invention from a sample containing many proteins (polypeptides) whose functions are unknown. It can be used as a reagent (detection reagent). That is, the present invention includes the first antibody or the second antibody in order to detect the first peptide or the second peptide, and a peptide that may have the same property as the first peptide or the second peptide. Also included is a detection reagent characterized by
[0068]
  (4) Detection method and screening method according to the present invention
  Next, the detection method and screening method according to the present invention will be described.
[0069]
  In the detection method according to the present invention, the thrombolysis can be dissolved in the sample by immunoreacting the sample with an antibody that specifically recognizes a polypeptide that controls thrombolysis by enhancing or suppressing the plasmin activity. It is a method for detecting a polypeptide to be controlled. That is, the sample is immunoreacted with the antibody described in (3) above.
[0070]
  Therefore, the detection method is characterized by using the first antibody or the second antibody. In other words, the detection method is(I)A method for detecting a first peptide that enhances thrombolysis using a first antibody, or( ii )This is a method for detecting a second peptide that suppresses thrombus dissolution using a second antibody.
[0071]
  As described above, the first antibody and the second antibody specifically recognize the first peptide and the second peptide. Therefore, for example, if this antibody is reacted with a large number of polypeptide and protein samples, the polypeptide (1) and the polypeptide that controls thrombolysis can be easily detected. That is, whether or not the first peptide or the second peptide is contained in the sample can be detected by examining the presence or absence of an immune reaction between the sample and the antibody as a detection reagent. The immune reaction can be determined by the method described in (2) above.
[0072]
  According to said detection method, it can utilize for the diagnosis of the disease of the human or animal to which the polypeptide containing the 1st peptide or the 2nd peptide is related. When the antibody is used as a diagnostic agent, it is preferable that the first antibody or the second antibody is immobilized on a carrier to form a kit. Thereby, the first peptide or the second peptide can be easily detected from a sample such as blood. Accordingly, the present invention includes a detection kit comprising the above-described antibody as a detection reagent.
[0073]
  The detection kit may further include a reagent for increasing the accuracy of the reaction between the sample and the antibody as a detection reagent, and a reagent for improving the convenience and storage stability of the detection reagent. Good. For example, a preservative may be added for the preservation of the sample.
[0074]
  The screening method according to the present invention comprises a sampleFibrin dissolution rateTheFibrin plate methodThis is a method for evaluating the activity.
[0075]
  That is, the screening method is(I)A method of screening for a polypeptide that promotes thrombolysis by enhancing plasmin activity, or( ii )It is a method for evaluating the activity of a polypeptide that inhibits thrombolysis by inhibiting plasmin activity.
[0076]
  The sample used for the screening method of the present invention is not particularly limited, and for example, the first peptide and the second peptide, the polypeptide obtained by the detection method, and the like can be used.
[0077]
  the aboveFibrin plate methodIn the petri dish in which a fibrin membrane was prepared from fibrinogen and thrombin as in the examples described later, plasmin and a peptide as a sample were mixed and added, and the dissolved part of fibrin was observed to evaluate plasmin activity. It is. That is, by comparing the fibrin dissolution part when only plasmin is added to the fibrin membrane and the fibrin dissolution part when the mixture of the sample and plasmin is added, the dissolution part should be larger than that of plasmin alone. For example, it is evaluated that the peptide of the sample has a function of enhancing plasmin activity, and conversely, if the dissolution part is small, the peptide of the sample is evaluated to have a function of suppressing plasmin activity.
[0078]
  In addition, the polypeptide obtained by the said screening method is also contained in this invention. That is, a polypeptide having a function of enhancing or suppressing plasmin activity obtained by the screening method is included.
[0079]
  Therefore, according to the screening method of the present invention, only a sample having the function can be taken out from a sample that is not known to have a function of enhancing or suppressing plasmin activity. Peptides obtained by this screening method can be used as thrombolytic drugs or antifibrinolytic drugs.
[0080]
  (5) Thrombolytic agent and antifibrinolytic agent according to the present invention
  Both the polypeptide described in (1) above and the polypeptide obtained by the screening method described in (4) above are polypeptides that control thrombolysis. Therefore, it can be used as a thrombolytic agent or an anti-fibrinolytic agent.
[0081]
  That is, the present invention includes(I)A thrombolytic drug that promotes thrombolysis by enhancing plasmin activity,( ii )Antifibrinolytic agents that inhibit thrombus dissolution by inhibiting plasmin activity are included.
[0082]
  The thrombolytic drug includes a polypeptide that enhances the plasmin activity described in (1) above or a polypeptide obtained by the method for screening a polypeptide that promotes plasmin activity described in (5) above. Just do it.
[0083]
  The anti-fibrinolytic agent is a polypeptide obtained by the method for screening a polypeptide that suppresses plasmin activity described in (1) above or a polypeptide that suppresses plasmin activity described in (5) above. It only has to be included.
[0084]
  The mechanism of action of the thrombolytic agent or anti-fibrinolytic agent of the present invention is to enhance or suppress the enzyme activity of plasmin. Therefore, it is possible to provide a new type of thrombolytic agent or anti-fibrinolytic agent which has a completely different mechanism of action from that of increasing / decreasing the amount of plasmin as in the prior art.
[0085]
  The thrombolytic agent or anti-fibrinolytic agent of the present invention only needs to exert its effect in the body. For example, a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be administered, or a prodrug The polypeptide may be expressed by being metabolized in the body. That is, in the thrombolytic agent or anti-fibrinolytic agent of the present invention, the above-mentioned polypeptide of the present invention may be converted into a prodrug.
[0086]
  The thrombolytic or antifibrinolytic agent of the present invention includes one or more excipients, one or more binders, one or more disintegrants, one or more lubricants, A pharmaceutically acceptable additive, such as a buffer, may be included.
[0087]
  (6) Gene according to the present invention
  The gene according to the present invention encodes the polypeptide described in (1) above, the polypeptide obtained by the screening method described in (4) above, and the thrombolytic drug or anti-fibrinolytic drug described in (6) above. It is a gene to do.
[0088]
  Since the above gene encodes the polypeptide of the present invention, it can be introduced into an appropriate host (eg, bacteria, yeast) to express the polypeptide of the present invention.
[0089]
  The “gene” includes not only double-stranded DNA but also single-stranded DNA and RNA such as sense strand and antisense strand constituting the DNA. Furthermore, the “gene” may include a sequence such as an untranslated region (UTR) sequence and a vector sequence (including an expression vector sequence) in addition to the sequence encoding the polypeptide of the present invention. . For example, the gene of the present invention is constructed by connecting the sequence encoding the polypeptide of (a) or (b) above to a vector sequence and amplifying it in an appropriate host, thereby amplifying the gene of the present invention as desired. Can be made. Moreover, you may use the partial arrangement | sequence of the gene of this invention for a probe.
[0090]
  (7) Usefulness of the present invention
  As described above, the first peptide and the second peptide can control thrombolysis by enhancing or suppressing plasmin activity. Therefore, the present invention has the following utility.
[0091]
  A. Usefulness associated with the first peptide
  (I)An unprecedented thrombolytic drug with a completely new mechanism of action can be provided. There are no pharmaceuticals that enhance thrombolysis (fibrin degradation). A similar effect was observed on fibrin degradation products, but in this case it is used as an enzyme action aid in clinical test kits and is not used today.
[0092]
  ( ii )The first peptide is expected to be used as a therapeutic / preventive agent for thrombus and as a clinical diagnostic agent for plasmin.
[0093]
  ( iii )By using an antibody that recognizes the first peptide, it is possible to detect the first peptide, and a polypeptide having a high possibility of having the same action as the first peptide.
[0094]
  ( iv )From a polypeptide obtained using an antibody that recognizes the first peptide, in particular, a polypeptide having a high function of enhancing plasmin activity can be screened. The polypeptide thus obtained is particularly useful as a thrombolytic agent.
[0095]
  B. Usefulness related to the second peptide
  (I)The second peptide can be used as an anti-fibrinolytic agent. The indications are similar to those of epsilon aminocaproic acid (Daiichi Pharmaceutical, Epsilon (registered trademark)) and tranexamic acid (basolamine and transamine (both registered trademarks)) marketed as anti-fibrinolytic agents with similar effects. It is considered to be applicable to That is, the second peptide has anti-plasmin action, hemostasis action, anti-allergy / anti-inflammatory action, and the indication is bleeding tendency (leukemia, poor regeneration) Anemia, purpura, etc., and abnormal bleeding during and after surgery), abnormal bleeding considered to be related to increased local fibrinolysis (pulmonary bleeding, nasal bleeding, genital bleeding, renal bleeding, abnormalities during and after prostate surgery) Bleeding), the following diseases with erythema / swelling / pruritus (eczema and its symptom, urticaria, drug eruption, poisoning rash), the following diseases with symptoms such as sore throat, redness, hyperemia, swelling (tonsilitis, Pharyngopharyngitis), oral pain in stomatitis, and oral mucosal after-sales.
[0096]
  ( ii )Among anti-fibrinolytic drugs, there are those that are blended in cold medicines, whitening / staining removers, and toothpastes. Therefore, the second peptide can also be applied to these.
[0097]
  ( iii )As a research report, there is a report that antifibrinolytic drugs have an inhibitory effect on mouse pancreatic cancer. Therefore, the second peptide can also be applied to this.
[0098]
【Example】
  Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. In addition, this invention is not limited to description of a following example, A various change is possible within the scope of the present invention.
[0099]
  [Example 1] Synthesis of polypeptide (candidate compound) that controls thrombolysis based on the amino acid sequence of the β chain of bovine hemoglobin
  Based on the amino acid sequence of the β chain of bovine hemoglobin, a polypeptide was synthesized in accordance with the usual method for the region containing lysine. That is, in the amino acid sequence of the β-chain of bovine hemoglobin shown in SEQ ID NO: 4, as the first peptide (FO152-1), a peptide consisting of a 20mer from the N-terminal methionine to the 20th aspartic acid (SEQ ID NO: (Polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in 1) as the second peptide (FO152-2), from the 61st alanine to the 75th lysine in the β-chain amino acid sequence of bovine hemoglobin shown in SEQ ID NO: 4 Among the sequences, a peptide consisting of 15mer (polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3) in which the 73rd glycine was substituted with asparagine and the 75th lysine was substituted with methionine was synthesized. FIG. 3 shows a portion (M1 to D20 in the figure) corresponding to the first peptide (FO152-1) in the bovine hemoglobin β chain structure in a ribbon shape. Similarly, in FIG. 4, a portion (A61 to K75 in the figure) corresponding to the second peptide (FO152-2) is shown in a ribbon shape. However, although not shown in FIG. 4, as described above, in FO152-2, the 73rd glycine is substituted with asparagine and the 75th lysine is substituted with methionine. The ribbon-like portion shown in FIG. 4 is also a portion corresponding to the polypeptide consisting of the amino acid shown in SEQ ID NO: 2.
[0100]
  The synthesis method was solid phase synthesis in which the amino group was protected with an Fmoc group.
[0101]
  [Example 2] Evaluation of dissolution rate in plasmin
  The dissolution rate of the polypeptide produced in Example 1 with respect to fibrin was examined by a fibrin plate method according to a conventional method.
Dissolve bovine fibrinogen (Fibrinogen from bovine plasma, lot. 309-03663, Ito Ham Foods, Osaka) in 1% NaCl-added 1 / 15M phosphate buffer (pH 7.4) to 0.4% as a coagulation protein. did. Take 8 ml of this fibrinogen solution in a 9 cm plastic petri dish, 200 IU / mL human thrombin (500 units of thrombin-Yoshitomi, Yoshitomi Pharmaceutical, Osaka) 0.1M CaCl₂ 100 μL of the solution was added and allowed to solidify on a horizontal surface at room temperature for 60 minutes to prepare a fibrin plate.
Equal volume of sample is mixed with 0.5 IU / mL human plasmin (Plasmin from human plasma, P4895, lot. 89H7614, SIGMA, USA) 0.85% saline solution, and immediately 20 μL of this mixture is added to a fibrin plate. It left still and it incubated in the 37 degreeC constant temperature room kept horizontal. After 18 hours, the major axis and minor axis of the dissolved part of the fibrin membrane were measured (mm), and the major axis x minor axis were determined as the dissolved area (mm² ). The measurement was performed twice, and the average value of both was used as the activity value of the sample. In addition, 0.85% physiological saline was used instead of the sample as a control, and the measurement was performed in the same manner as performed on the sample.
[0102]
  The incubation treatment (heat treatment at 37 ° C. for 1 hour) is for advancing the reaction between the sample (polypeptide synthesized in Example 1) and human plasmin. That is, for example, mixing FO151-1 and plasmin and heating at 37 ° C. for 1 hour results in a product obtained by reacting both of them (in this case, the formation of a complex of both). This is to sufficiently give the conditions for forming.
[0103]
  The dissolution rate was expressed as: dissolution area of control added with raw food instead of sample− (sample + lysis area of plasmin) / dissolved area of control added with raw food instead of sample × 100 (%).
[0104]
  The results obtained in this test are as follows. First, about FO152-1, when plasmin and FO152-1 are mixed and immediately placed on a plate, and after incubation for 1 hour at 37 ° C. and then left on a fibrin membrane. A test was performed with two different conditions (FIG. 1).
[0105]
  As a result of this test, two characteristics were shown in the relationship between FO152-1 and human plasmin. The first is that there is an optimum concentration, and if the concentration exceeds an appropriate concentration range with respect to plasmin, the reaction is lowered even if the concentration is high or low. The second is that the reaction is enhanced by preheating with plasmin. When associated with the substrate (fibrin) without sufficient reaction (under 1 hour of warming), the reaction of plasmin appears to be inhibitory, so FO152-1 is more reactive with fibrin than with plasmin. It is considered strong.
[0106]
  Specifically, FO152-1 is considered to play a role in mediating the binding between the enzyme plasmin and the substrate fibrin. However, FO152-1 binds more easily to fibrin than plasmin, and when FO152-1 associates with both fibrin and plasmin almost simultaneously, fibrin is selected and bound, and FO152-1-fibrin complex Is estimated to generate Due to the formation of this complex, FO152-1 no longer plays a role in mediating the binding to plasmin, and is presumed to block the plasmin binding site on the fibrin side. It is estimated from this result that “the reaction of plasmin seems to be suppressed when it is associated with the substrate (fibrin) without sufficient reaction (under heating for 1 hour)” as described above.
[0107]
  In contrast, when FO152-1 and plasmin are incubated at 37 ° C. for 1 hour to form FO152-1-plasmin complex, FO152-1 of this complex easily binds to fibrin and thus binds to fibrin. try to. As a result, the distance between the FO152-1-plasmin complex and fibrin is close, and it is presumed that the enzyme activity of plasmin is enhanced.
[0108]
  In addition, since FO152-1 has no enzyme action to decompose fibrin and is interspersed between fibrin and plasmin, plasmin activity is enhanced. Therefore, FO152-1 has an “accelerating activity”. It can also be said that it has.
[0109]
  This is important when considering the dose, order of administration or combination of agents when using this substance for therapeutic purposes. In the results of this experiment, an equal volume mixture of human plasmin (0.5 IU / mL) and 62.5 μg / mL FO152-1 was placed on the fibrin membrane after heating at 37 ° C. for 1 hour. At the time, plasmin activity appeared the highest and showed a 22.3% increase in dissolution rate (Accelerating activity) compared to the control.
[0110]
  Next, the relationship between the FO152-2 concentration measured by the fibrin plate method and the dissolution rate is shown in FIG.
[0111]
  As in the case of FO152-1, the plasmin inhibitory effect of FO152-2 appeared remarkably when heated at 37 ° C. for 1 hour. In this experimental result, 0.5 IU / mL human plasmin and an equal volume of 250 μg / mL FO152-2 physiological saline solution were mixed and then heated at 37 ° C. for 1 hour had the highest inhibitory effect on plasmin. As a result, 83% suppression of dissolution rate was observed.
[0112]
  In addition, about FO152-2, it was confirmed by the following experiment that the enzyme activity of plasmin is suppressed. That is, the first is the result of electrophoresis (SDS-PAGE). Although not shown, when plasmin and hemoglobin are mixed, hemoglobin is decomposed and the plasmin band moves, so that it is considered that plasmin and hemoglobin or a part of hemoglobin are bound. Fibrinogen was used instead of fibrin because fibrin cannot be electrophoresed because fibrin is solid, but when fibrinogen and hemoglobin are mixed, the hemoglobin band becomes thin, so fibrinogen and hemoglobin are bound. it is conceivable that.
[0113]
  Second, the result of the graph shown in FIG. In the case of non-incubation (when plasmin and FO152-2 are mixed and immediately brought into contact with the fibrin membrane), 30% to 40% decrease in the dissolution rate (ie, the inhibitory effect of plasmin) is shown at any concentration. Yes. On the other hand, in the case of incubation (when plasmin and FO152-2 are mixed, the mixture is left at 37 ° C. for 1 hour, both are reacted well, and then brought into contact with the fibrin membrane), 250 μg / When an equivalent amount of 0.5 IU / mL human plasmin was mixed with mL of FO152-2 (all measured under the same conditions), the inhibitory effect was the strongest, about twice that of non-incubation.
[0114]
  From these results, it can be determined that the effect of suppressing the enzyme activity of plasmin becomes remarkable under the condition that the binding property between plasmin and FO152-2 is high.
[0115]
【The invention's effect】
  As described above, the polypeptide of the present invention is a polypeptide having an action that has never been known so far, which controls thrombolysis by efficiently enhancing or suppressing the enzyme activity of plasmin itself. is there. Therefore, it is possible to provide a new type of thrombolytic agent or anti-fibrinolytic agent that is completely different from the conventional mechanism of action.
[0116]
[Sequence Listing]
                               SEQUENCE LISTING
<110> Japan Science and Technology Agency
<120> Novel compositions for controlling thrombolysis.
<130> A251P02
<140>
<141>
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
      Synthesized Peptide Sequence
<400> 1
Met Leu Thr Ala Glu Glu Lys Ala Ala Val Thr Ala Phe Trp Gly Lys
  1 5 10 15
Val Lys Val Asp
             20
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
      Synthesized Peptide Sequence
<400> 2
Ala His Gly Lys Lys Val Leu Asp Ser Phe Ser Asn Gly Lys Lys
  1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
      Synthesized Peptide Sequence
<400> 3
Ala His Gly Lys Lys Val Leu Asp Ser Phe Ser Asn Asn Lys Met
  1 5 10 15
<210> 4
<211> 145
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 4
Met Leu Thr Ala Glu Glu Lys Ala Ala Val Thr Ala Phe Trp Gly Lys
  1 5 10 15
Val Lys Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu Leu Val
             20 25 30
Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp Leu Ser
         35 40 45
Thr Ala Asp Ala Val Met Asn Asn Pro Lys Val Lys Ala His Gly Lys
     50 55 60
Lys Val Leu Asp Ser Phe Ser Asn Gly Met Lys His Leu Asp Asp Leu
65 70 75 80
Lys Gly Thr Phe Ala Ala Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys Leu His
                 85 90 95
Val Asp Pro Glu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Val Val
            100 105 110
Leu Ala Arg Asn Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Val Leu Gln Ala Asp
        115 120 125
Phe Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Arg Tyr
    130 135 140
His
145
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a graph showing the influence of the concentration of FO152-1 peptide, which is a polypeptide of the present invention, on the fibrinolytic ability of human plasmin.
FIG. 2 is a graph showing the effect of the concentration of FO152-2 peptide, which is the polypeptide of the present invention, on the fibrinolytic ability of human plasmin.
FIG. 3 is a schematic diagram of a site (N-terminal methionine (M1) to 20th aspartic acid (D20)) corresponding to FO152-1 in the bovine hemoglobin β-chain structure.
FIG. 4 is a schematic diagram of a site (61st alanine (A61) to 75th lysine (K75) from the N-terminal side) corresponding to FO152-2 in the bovine hemoglobin β chain structure.

Claims (4)

プラスミン活性を亢進するポリペプチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を亢進する機能を有するポリペプチド。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プラスミン活性を亢進する機能を有するポリペプチド。A polypeptide that enhances plasmin activity, the following polypeptide (a) or (b):
(A) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a function of enhancing plasmin activity.
(B) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a function of enhancing plasmin activity . ヘモグロビンに由来する請求項１に記載のポリペプチド。  The polypeptide according to claim 1, which is derived from hemoglobin. 請求項１または２に記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。  An antibody that specifically recognizes the polypeptide according to claim 1 or 2. 請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする遺伝子。  A gene encoding the polypeptide according to claim 1 or 2.

Images