JP4147038B2 - Rakan fruit glycosides with improved taste and method for producing the same - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、羅漢果配糖体に１個以上のグルコース残基が結合している高度グリコシル化化合物およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年では、消費者の低甘味嗜好の高まり、エネルギーの摂り過ぎ（特に、ショ糖の摂り過ぎ）による健康面への懸念に対する認識などの要因により、「砂糖控えめ」、「砂糖無添加」などを表記した食品が数多く上市されるようになってきた。
【０００３】
実際、わが国の食糧事情は「飽食の時代」を反映し、エネルギーの過剰摂取が日常化している。高エネルギーの摂取および脂質エネルギー比率の増加は、生活習慣病の発生の原因になることが明確にされている。
【０００４】
したがって、エネルギー摂取を制限されている人（例えば、肥満症患者および糖尿病患者）、ダイエットを要求される人などは、自らが疾病に罹るのを予防するため、自らの疾病を改善するため、または健康管理をするために、ショ糖および脂質の摂りすぎを抑えて、生活スタイルを改善して健康的な生活を取り戻すことが重要であるといわれている。
【０００５】
これらのことからショ糖に代わる甘味料、なかでもショ糖と比較してエネルギーを実質的に抑制し得る高甘味度甘味料の開発が要求されてきた。
【０００６】
以下、本明細書中では、このように、ショ糖よりも実質的にエネルギーが低い甘味料組成物をエネルギー抑制甘味料という。ここで「エネルギー」とは、人間がある物質を一定量（例えば、１００グラム）飲食した場合に体内に吸収されかつ代謝により生体内に放出される熱量をいう。
【０００７】
しかし、エネルギー抑制甘味料には様々な問題がある。最も大きな問題は甘味質の問題である。人間はショ糖の甘味質に極めて慣れ親しんでいるため、ショ糖と少しでも異なる甘味質を有する甘味料には違和感を感じやすいからである。以下に従来の各種の高甘味度甘味料について具体的に説明する。
【０００８】
高甘味度甘味料は、ショ糖の数百倍もの甘味強度を有する。高甘味度甘味料は、一般的に人工甘味料（合成甘味料ともいう）と天然甘味料とに分類することができる。人工の高甘味度甘味料としては、サッカリン、アスパルテーム、スクラロース、アセスルファムカリウムなどを挙げることができる。
【０００９】
サッカリンは古くから使用されている人工甘味料である。しかし、発癌性の疑いが持たれているので、現在、国内では使用対象品目が制限され、使用基準量にも制限が設けられている。
【００１０】
アスパルテームは、１９８１年米国ＦＤＡによって認可された人工甘味料であるが、認可を受けるまで、神経伝達系統に障害を生じる点に対して、激しい論争がなされてきた。さらに、アスパルテームは、加熱分解されるので、安定性に対する欠点も指摘されている。
【００１１】
スクラロース、アセスルファムカリウムなどの人工の高甘味度甘味料は、現時点において、安全性に対して議論の対象にはなっていないが、甘味質が十分とはいえない。たとえば、スクラロースの甘味発現時間は著しく長く、いつまでも甘味質が後引きすることが知られている。対照的に、アセスルファムカリウムの口腔内での甘味発現時間はきわめて短いために、甘味剤として単独で利用できない。またアセスルファムカリウムには苦みを有するという大きな欠点もある。
【００１２】
このように、人工の高甘味度甘味料には、甘味質がショ糖と比べて不十分であるだけでなく、絶えず安全性に対する評価をめぐる議論がつきまとう。
【００１３】
一方、天然の高甘味度甘味料としては、甘草抽出物、ステビア抽出物、羅漢果抽出物などがある。これらの天然甘味料は植物由来であり、人体に対して安全性が高い。
【００１４】
甘草は豆科に属する多年生植物であり、その甘味成分であるグリチルリチンは甘草の根茎中に含有されている。しかし、その甘味質はショ糖を代表とする糖類の甘味質とは異なり、甘味がいつまでも残留し、多量に使用すると苦みを感じたり、頬の両壁に収斂味を感じることがある。
【００１５】
ステビアはキク科の多年生植物であり、その甘味成分はステビオサイド、レバウディオサイドなどである。ステビアの甘味成分のなかでもステビオサイドは、強い苦みおよび渋味を有し、その甘味は著しい後引きがある。
【００１６】
天然の高甘味度甘味料のなかでも特に羅漢果エキスは、羅漢果の乾燥果実から得られ、強い甘味質を有する薬用の甘味料として知られている。羅漢果は、中国桂林周辺の特産品の一つであるウリ科の多年生薬用植物である。羅漢果エキスは、もともと古代より中国での甘味料および民間薬として広く利用されている。羅漢果エキスの薬効としては、のどの荒れの改善、痛みの緩和、咳止め、去痰などが知られている。羅漢果エキスは、甘味と同時に人に対して有益な効果が期待できることから、菓子類、飲料類、シロップなどの甘味成分として用いることが提案されてきた（特開昭５３−９３５２号公報および特開昭５３−９３５９号公報）。具体的には、例えば、飲料用に、羅漢果エキスをペースト状にまで濃縮した羅漢果ペーストエキスを希釈して利用することが行われている。これは、羅漢果エキスを濃縮せずに用いる場合には羅漢果エキスの貯蔵運搬にコストがかかるため、および羅漢果エキスに微生物が発生し易く、羅漢果エキスの品質が低下し易いためである。
【００１７】
しかし、羅漢果エキスは以下の欠点を有している。つまり、黒砂糖などの焦げ味に似た羅漢果特有の焦げ味、独特の匂い、苦み、甘みの残留性などがあるため、飲食の際に非常に不快感を伴う。さらに、羅漢果エキスの添加により飲食物が黄褐色に呈色するために食品への利用には適さない場合が多い。
【００１８】
このように、天然の高甘味度甘味料は安全性が高いが、反面、ショ糖の代替品として単独で用いられる甘味料としては甘味質が不十分である。
【００１９】
一方、羅漢果エキスの味質改善については、羅漢果エキス中に含有される甘味成分だけを分画、精製および粉末乾燥させた羅漢果配糖体とエリスリトールとを含有するシロップは、従来の羅漢果エキスの有する独特の焦味、匂い、苦み、甘さの残留性が弱く、良好な甘味質を呈することから、低カロリーシロップとして好適であることが記載されている（特開平１１−４６７０１号公報；特許第３１１０００５号）。
【００２０】
さらに、羅漢果配糖体の甘味成分としてモグロサイドＶ、モグロサイドＩＶ、１１−オキソ−モグロサイドＶおよびシアメノサイドＩの合計含有量が３３重量％以上である組成物の甘味質は、ショ糖の甘味質に近くなるとの報告もある（特開２００１−２１１８５４号公報）。
【００２１】
しかし、これらの甘味料は、高純度の羅漢果配糖体といえども、ショ糖の甘味質と比較した場合、「苦み、後引き、しつこさ、くせ、渋味およびすっきり感」のいずれかの項目においてショ糖と同等ではなく、ショ糖の代替品として用いられる甘味料として不十分である。そのため、これらの甘味料の消費規模および利用用途をさらに拡大させるためには、これらの甘味料の甘味質の改善および改良が望まれていた。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】
ショ糖よりもエネルギーを実質的に抑制し得る高甘味度甘味料であって、ショ糖にきわめて近い甘味質を有し、安全性が高く、かつ従来の甘味料と比較して生理的および物理的特性に遜色のない高甘味度甘味料を提供することを目的とする。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、羅漢果配糖体にさらに糖残基を付加させることによって、従来の羅漢果配糖体より、「苦み、後引き、しつこさ、くせ、渋味およびすっきり感」の味質項目において改善され、いずれの評価に対しても、ショ糖にきわめて近い甘味質を有し、さらに一般の甘味料と比較して生理的特性および物理的特性について遜色のない新規な高甘味度甘味料が得られることを見出し、これに基づいて本発明を完成した。
【００２４】
さらに、本発明者らは、シクロデキストリン合成酵素（ＥＣ ２．４．１．１９；シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼまたはシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとも呼ばれる；以下、「ＣＧＴａｓｅ」と略す）を反応に用いることにより、羅漢果配糖体に１個以上のグルコース残基がα結合している、高度グリコシル化化合物（本明細書中では、「グリコシル化羅漢果配糖体」ともいう）が、非常に効率的でかつ安価に製造できることを見い出した。
【００２５】
本発明の高度グリコシル化化合物は、羅漢果配糖体に１個以上のグルコース残基がα結合している。
【００２６】
１つの実施形態では、上記グルコース残基の数は、１〜４５個であり得る。
【００２７】
１つの実施形態では、上記グルコース残基の数は、１〜１５個であり得る。
【００２８】
１つの実施形態では、上記高度グリコシル化化合物は、以下からなる群より選択され得る：
【００２９】
【化１０】

【００３０】
【化１１】

【００３１】
【化１２】

【００３２】
【化１３】

【００３３】
【化１４】

【００３４】
【化１５】

【００３５】
【化１６】

【００３６】
【化１７】

【００３７】
【化１８】

１つの実施形態では、上記高度グリコシル化化合物において、モグロサイドＶに１個以上のグルコース残基がα結合していてもよい。
【００３８】
本発明の食品用組成物は、上記の高度グリコシル化化合物を含有する。
【００３９】
本発明の甘味料は、上記の高度グリコシル化化合物を含有する。
【００４０】
本発明の医薬品用組成物は、上記の高度グリコシル化化合物を含有する。
【００４１】
本発明の医薬部外品用組成物は、上記の高度グリコシル化化合物を含有する。
【００４２】
本発明の化粧品用組成物は、上記の高度グリコシル化化合物を含有する。
【００４３】
本発明の高度グリコシル化化合物の製造方法は、羅漢果配糖体を、α−グルカンおよび糖転移酵素と接触させて、高度グリコシル化化合物を得る工程を包含する。
【００４４】
１つの実施形態では、上記糖転移酵素は、シクロデキストリン合成酵素であり得る。
【００４５】
１つの実施形態では、上記羅漢果配糖体は、モグロサイドＶであり得る。
【００４６】
本発明の高度グリコシル化化合物は、上記の方法によって得られる。
【００４７】
本発明の、羅漢果配糖体に１〜４個のグルコース残基がα結合している高度グリコシル化化合物の製造方法は、羅漢果配糖体を、α−グルカンおよび糖転移酵素と接触させて、羅漢果配糖体に５個以上のグルコース残基がα結合している高度グリコシル化化合物を得る工程、および該羅漢果配糖体に５個以上のグルコース残基がα結合している高度グリコシル化化合物に糖質分解酵素を接触させて、羅漢果配糖体に１〜４個のグルコース残基がα結合している高度グリコシル化化合物を得る工程を包含する。
【００４８】
１つの実施形態では、上記糖質分解酵素は、グルコアミラーゼ、β−アミラーゼおよびα−アミラーゼからなる群より選択され得る。
【００４９】
１つの実施形態では、上記羅漢果配糖体は、モグロサイドＶであり得る。
【００５０】
本発明の、１〜４個のグルコース残基がα結合した高度グリコシル化化合物は、上記の方法によって得られる。
【００５１】
本発明の、羅漢果配糖体を含む甘味料の味質改善方法は、該甘味料を、α−グルカンおよび糖転移酵素と接触させる工程を包含する。
【００５２】
本発明の味質の改善された甘味料は、上記の方法によって得られる。
【００５３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００５４】
＜高度グリコシル化化合物＞
本発明の高度グリコシル化化合物は一般に、羅漢果配糖体に１個以上のグルコース残基がα結合している。
【００５５】
本明細書中で「高度グリコシル化化合物」とは、以下の化学構造１の構造を有する化合物をいう：
（化学構造１）
【００５６】
【化１９】

ここで、Ｒ₁は、−Ｇｌｃ−Ｇｌｃ−（Ｇｌｃ）ｎであって、ｎが１個以上の整数であるか、または
Ｒ₂は、−Ｇｌｃ−Ｇｌｃ−（Ｇｌｃ）ｍであって、ｍが１個以上の整数であるか、または
Ｒ₂は、
【００５７】
【化２０】

であってｈ+ｋが１個以上の整数であり、
Ｒ_3aは−ＯＨであってＲ_3bは−Ｈであるか、または
Ｒ_3aとＲ_3bとが一緒になって＝Ｏであり、そして
Ｇｌｃはグルコース残基を示す。
【００５８】
なお、ここで、Ｏ原子とＲ₁との間の結合、Ｏ原子とＲ₂との間の結合、Ｒ₁の１個目のグルコース残基と２個目のグルコース残基との間の結合、ならびにＲ₂に分岐がある場合のＲ₂中の１個目のグルコース残基と分岐したグルコース残基との間の結合はβ結合である。その他のグルコース残基間の結合はα結合である。本明細書中で特に言及しない場合も、これらの結合の関係は保たれる。
【００５９】
本明細書中で「羅漢果配糖体」とは、羅漢果に含まれる任意の配糖体をいい、モグロサイドＶ、モグロサイドＩＶ、１１−オキソ−モグロサイドＶ、シアメノサイドＩなどの高甘味度を有する配糖体を包含する。好ましくは、モグロサイドＶである。一般的には、モグロサイドＶを主成分とし、モグロサイドＩＶ、シアメノサイドＩおよび１１−オキソ−モグロサイドＶが少量混合された混合物が容易に入手でき、本発明に利用可能である。
【００６０】
羅漢果配糖体には、羅漢果配糖体化合物以外の、羅漢果由来の成分（例えば、アグリコンおよび水）が混合されていても、本発明の化合物の製造には差し支えない。本明細書において「配糖体」との用語は配糖体の混合物をも包含する。羅漢果配糖体は、羅漢果果実の甘味の主な原因である。羅漢果配糖体は、羅漢果果実中に数種類含まれるが、その中でも主に含有量が多いのは、以下の化学構造２に示す構造を有する４種の配糖体である（竹本、在原、中島、奥平、薬学雑誌１０３：１１５１−１１５４（１９８３）；竹本、在原、中島、奥平、薬学雑誌１０３：１１５５−１１６６（１９８３）；Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｒ．Ｋａｓａｉ，Ｋ．ＯｈｔａｎｉおよびＯ．Ｔａｎａｋａ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３８：２０３０−２０３２（１９９０）；ならびにＲ．Ｋａｓａｉ，Ｒ．−Ｌ．Ｎｉｅ，Ｋ．Ｎａｓｈｉ，Ｇ．−Ｄ．ＴａｏおよびＯ．Ｔａｎａｋａ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３：３３４７−３３４９（１９８７））。
【００６１】
例えば、モグロサイドＶでは、下記の化学構造２で示される骨格に対してＲ₁に２個およびＲ₂に３個の合計５個のグルコース残基が結合した構造を有するか、これにさらに１個以上のグルコース残基が結合した化合物、すなわち、Ｒ₁およびＲ₂に合計６個以上のグルコースが結合した化合物を高度グリコシル化化合物という。
【００６２】
（化学構造２）
【００６３】
【化２１】

通常の羅漢果から得られる羅漢果配糖体混合物のうち、最も含有量が多いのは、モグロサイドＶと呼ばれる配糖体であり、その甘味強度は、ショ糖の約３００倍である。モグロサイドＶ以外の羅漢果配糖体も、高い甘味強度を有する。
【００６４】
羅漢果配糖体に結合した糖残基は、羅漢果配糖体に結合し得る任意の糖残基である。このような糖残基の例としては、グルコシル基、フルクトシル基、ガラクトシル基、マンノシル基、キシロシル基、アラビノシル基、Ｎ−アセチルグルコサミニル基、Ｎ−アセチルガラクトサミニル基、グルコサミニル基、ガラクトサミニル基、グルクロニル基、ガラクツロニル基、ラムノシル基などが挙げられる。糖残基は好ましくは、グルコシル基である。
【００６５】
羅漢果配糖体と糖残基との間の結合は、α結合であってもβ結合であってもよいが、好ましくはα結合であり、より好ましくはα−１，４結合である。
【００６６】
糖残基は、上記の化学構造１のＲ₁のβ−Ｄ−グルコピラノシル末端またはＲ₂のβ−Ｄ−グルコピラノシル末端で羅漢果配糖体に結合している。複数の糖残基が結合している場合、これらの糖残基はＲ₁またはＲ₂のいずれか一方にのみ結合していてもよいし、Ｒ₁およびＲ₂の両方に分かれて結合していてもよい。Ｒ₂に２つのβ−Ｄ−グルコピラノシル末端がある場合、それらの一方に結合していてもよく、両方に結合していてもよい。
【００６７】
羅漢果配糖体に結合している糖残基の数は、Ｒ₁およびＲ₂に結合した糖残基の合計として、任意の数であり得るが、代表的には１〜４５個であり、好ましくは１〜２０個であり、より好ましくは１〜１５個であり、より好ましくは１〜１２個であり、さらにより好ましくは１〜４個である。代表的には、Ｒ₁およびＲ₂のそれぞれの位置で結合する糖残基の数はそれぞれ、１〜１５個であり、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは１〜４個である。Ｒ₂に２つのβ−Ｄ−グルコピラノシル末端がある場合は、第１のβ−Ｄ−グルコピラノシル末端に結合する数として好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個であり、第２のβ−Ｄ−グルコピラノシル末端に結合する数としては好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個である。羅漢果配糖体に結合した糖残基の数が多すぎると、得られる高度グリコシル化化合物の甘味強度がやや低下する傾向がある。羅漢果配糖体に結合した糖残基の数が１〜４個の範囲にある場合、実質的にほぼ羅漢果配糖体と同程度の甘味強度が得られ、かつ羅漢果配糖体よりも甘味質が向上するので、非常に好ましい。
【００６８】
本発明の、羅漢果配糖体に１個以上のグルコース残基がα結合している高度グリコシル化化合物は一般的に、以下の「化学構造３」によって表される。
【００６９】
（化学構造３）
【００７０】
【化２２】

これらの高度グリコシル化化合物のうち、羅漢果配糖体に１〜４個のグルコース残基がα結合している高度グリコシル化化合物（本明細書では、以下、「部分分解グリコシル化羅漢果配糖体」ともいう）は一般的に、以下の「化学構造４」によって表される。
【００７１】
（化学構造４）
【００７２】
【化２３】

本発明の高度グリコシル化化合物は好ましくは、上記の化合物番号１〜３４からなる群より選択される構造を有する。
【００７３】
本発明の高度グリコシル化化合物の中の羅漢果配糖体部分は、任意の羅漢果配糖体に由来し得るが、好ましくは、モグロサイドＶに由来する。
【００７４】
本発明の高度グリコシル化化合物は、１種類の化合物のみからなる純粋なものであってもよいし、複数種の高度グリコシル化化合物の混合物であってもよい。
【００７５】
＜高度グリコシル化化合物の原料＞
本発明の高度グリコシル化化合物の原料としては、羅漢果配糖体、糖供与体基質、糖転移酵素および糖質分解酵素が挙げられる。
【００７６】
羅漢果配糖体は、純粋な羅漢果配糖体化合物または羅漢果配糖体混合物として提供されてもよいし、羅漢果配糖体化合物以外の物質を含む、それほど純粋でない羅漢果配糖体含有組成物として提供されてもよい。羅漢果配糖体は、１種類の羅漢果配糖体化合物（例えば、モグロサイドＶ）のみからなってもよいし、複数種の羅漢果配糖体化合物の混合物（例えば、モグロサイドＶ、モグロサイドＩＶ、シアメノサイドＩ、１１−オキソ−モグロサイドＶの混合物）であってもよい。
【００７７】
羅漢果配糖体含有組成物は、羅漢果配糖体を含有するのであれば、いかなる純度のものでも用い得るが、代表的には、複数種の羅漢果配糖体の合計とし、羅漢果配糖体含有組成物の重量を基準にして、羅漢果配糖体を約５重量％以上、好ましくは約１０重量％以上、より好ましくは約１５重量％以上、より好ましくは約２０重量％以上、より好ましくは約３０重量％以上、より好ましくは約４０重量％以上、より好ましくは約５０重量％以上含有する。羅漢果配糖体の含有量が少なすぎると、得られる本発明の高度グリコシル化化合物の量が少なすぎる場合がある。羅漢果配糖体は純品であってもよいが、純品を用いるとコストが高くなりすぎる場合がある。
【００７８】
羅漢果配糖体含有組成物の例としては、羅漢果の粗エキス、部分精製物、各配糖体成分の精製物などが挙げられる。羅漢果配糖体は、一般には黄色〜黄褐色粉末の形状である。粗エキス中に含まれている果糖は本発明で用いられる糖転移酵素の受容体基質とはなり得ないので、羅漢果配糖体含有組成物中に高濃度で含有されていても全く問題ない。羅漢果配糖体含有組成物は、市販のものを利用してもよいし、製造してもよい。羅漢果配糖体含有組成物は、当業者に公知の抽出方法および分離方法を用いて製造され得る。
【００７９】
羅漢果配糖体は、例えば、羅漢果の果実を洗浄し、粉砕した後、水で抽出して得られた抽出液について濾過、カラム吸収、カラム分離、回収、濃縮、乾燥などの工程を行なうことにより製造される。羅漢果配糖体は、日本国内で市販品として入手可能である。羅漢果配糖体含有組成物は、例えば、以下の方法により製造され得る。羅漢果の果実をメタノール抽出してメタノールエキスを得る。メタノールエキスを水と混合し、ｎ−ヘキサンで脱脂する。脱脂後のメタノールエキスをカラムクロマトグラフィーにかけて水１００％、８０％メタノール、１００％メタノール、およびアセトンで順次溶出し、粗配糖体画分である８０％メタノール画分を得る。得られた粗配糖体画分をメタノールに溶解した後、シリカゲルと混合し、乾燥し、次いでこのシリカゲルをクロロホルム−メタノールの混合溶媒で溶出することにより、配糖体画分を得る。得られた配糖体画分を羅漢果配糖体含有組成物として用いてもよいし、さらに精製してもよい。さらに精製する場合、例えば、得られた配糖体画分を液体クロマトグラフィーにかけることにより、さらに高純度の配糖体画分が入手され得る。
【００８０】
羅漢果配糖体含有組成物は、得られる高度グリコシル化化合物を含む混合物に対して好ましくない味、臭いなどを与える物質を実質的に含まないことが好ましい。「実質的に含まない」とは、得られる高度グリコシル化化合物を含む混合物を官能試験した場合に好ましくない味、臭いなどが感じられない量であることをいう。
【００８１】
羅漢果配糖体とグルカンおよび糖転移酵素とを接触させる反応系において、例えば、モグロサイドＶを３０％程度含有する羅漢果精製物を用いる場合、その濃度範囲は、代表的に１〜７０％（ｗ／ｖ）（この場合、モグロサイドＶは、０．３〜２１％ ｗ／ｖとなる）、好ましくは５〜４０％（ｗ／ｖ）（この場合、モグロサイドＶは、１．５〜１２％（ｗ／ｖ）となる）である。反応系における羅漢果配糖体化合物の合計重量は、代表的に０．０１〜５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．０５〜４０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．２〜２０％（ｗ／ｗ）である。これらの濃度範囲は、使用する羅漢果配糖体含有組成物中の羅漢果配糖体の含有量により、実験的に決定されるべきであり、これらに限定されない。高濃度の羅漢果配糖体（すなわち、糖受容体基質）を含む羅漢果配糖体含有組成物を使用する場合には、糖供与体基質の濃度、酵素濃度、反応時間および反応温度を適宜上昇させることが好ましい。
【００８２】
本明細書中で「糖供与体基質」とは、他の分子に糖残基を与えることができる物質をいう。糖供与体基質の例としては、グリカン（すなわち、多糖またはオリゴ糖）および配糖体が挙げられる。本明細書中で「グリカン」とは、２以上の単糖が脱水縮合して生じた化合物をいう。通常、２〜９個の単糖が脱水縮合して生じた化合物は、オリゴ糖と呼ばれ、１０個以上の単糖が脱水縮合して生じた化合物は、多糖と呼ばれる。グリカンは、単純多糖であってもよいし、複合多糖であってもよい。単純多糖とは、構成単位となる単糖が一種類の多糖をいう。複合多糖とは、構成単位となる単糖が２種類以上の多糖をいう。グリカンの例としては、グルカン、ガラクタン、マンナン、キシラン、アラビナン、キチンおよびキトサンが挙げられる。
【００８３】
本明細書中で「グルカン」とは、Ｄ−グルコースから構成される多糖をいう。グルカンは、グルコース残基のアノマー炭素原子の配置により、α−グルカンとβ−グルカンとに分けられる。グルカンは、好ましくは、α−グルカンである。α−グルカンの例としては、デンプン、アミロース、アミロペクチン、デキストリン、シクロデキストリン、グリコーゲン、デキストラン、プルラン、ニゲラン、イソリゲナンおよびそれらの含有物が挙げられる。デンプンの例としては、可溶性デンプン、馬鈴薯デンプン、コーンスターチ、タピオカデンプンなどが挙げられる。糖供与体基質として、マルトース、マルトトリオース等のマルトオリゴ糖類またはそれらの混合物、低分子量のデキストリン等を使用することも可能であるが、その場合は、生成物中の還元糖量が、デンプンなどの高分子量のグルカンを用いる場合よりも高くなる。高分子量のグルカンを使用する場合は、グリコシル化羅漢果配糖体の収量を低下させないため、グルコース、マルトース等のＣＧＴａｓｅの良好な受容体基質となり得る還元糖を含まないことが好ましい。デンプンなど水に溶解しにくい多糖を含む基質の溶液を調製する場合は、糖転移酵素を添加する前に煮沸などにより、デンプンを十分糊化させることが好ましい。
【００８４】
β−グルカンの例としては、セルロースが挙げられる。
【００８５】
本明細書中で「配糖体」とは、糖と糖以外の物質が脱水縮合して生じた化合物をいう。配糖体の例としては、フェニルα−グルコシド、パラニトロフェニル、β−ガラクトシドなどが挙げられる。
【００８６】
糖供与体基質は、羅漢果配糖体と糖供与体基質および転移酵素とを接触させる際に、この反応系において、０．１〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜３０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲になるように使用されることが好ましいが、これらに限定されない。本発明の製造方法で用いられる反応系においては、糖供与体基質濃度を受容体基質濃度の約１／２〜１／４とすれば、グリコシル化羅漢果配糖体の十分高い合成率（反応に用いた受容体基質を１００％としたとき、約８０〜９０％）を達成することができる。高濃度の糖供与体基質を用いた場合、反応初期には鎖長の長い糖残基が糖受容体基質へ転移され、時間の経過に従って、不均化反応によって鎖長の短い糖残基が糖受容体基質へ転移されるようになるので、反応を初期で停止すれば、グルコース残基の重合度が大きいグリコシル化物が多い生成物を得ることができる。さらに反応時間の経過とともに、グルコース残基の重合度の小さいグリコシル化物の割合が徐々に増加する。ただし、これらの場合も、適切な酵素濃度、反応温度など他の条件に依存することは言うまでもなく、予備的な実験を行って決定することが望ましい。
【００８７】
本明細書中では、「糖転移酵素」とは、糖供与体基質から糖受容体基質へと糖残基を転移させる能力を有する酵素をいう。従来公知の任意の糖転移酵素が本発明に使用可能である。糖転移酵素の例としては、シクロデキストリン合成酵素（ＣＧＴａｓｅ）、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−フルクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、α−アミラーゼ、α−プルラナーゼ、デキストリンデキストラナーゼ、Ｄ酵素、アミロマルターゼ、デキストラナーゼ、ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、マルトースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、α−グルコシルトランスフェラーゼ、アミロスクラーゼ、デキストランスクラーゼ、レバンスクラーゼ、イヌリナーゼ、レバンフルクトトランスフェラーゼ、ガラクタナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、アラビナーゼ、セルラーゼ、α−キシロシダーゼ、β−キシロシダーゼ、α−アラビノシダーゼ、シクロデキストラン合成酵素、リゾチーム、アガラーゼ、ラミナリナーゼ、リケナーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、キトサナーゼ、キチナーゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、ラムノシダーゼおよびα−フコシダーゼが挙げられる。
【００８８】
糖転移酵素としては、ＣＧＴａｓｅがより好ましい。ＣＧＴａｓｅは、羅漢果配糖体のグリコシル化を非常に高い効率で触媒することができるからである。反応条件に依存するが、ＣＧＴａｓｅは、反応に用いた羅漢果配糖体のうちの９０％以上をグリコシル化し得る。この効率の高さは、ＣＧＴａｓｅが、糖転移反応と競合する加水分解反応をほとんど触媒しないことに起因する。通常の加水分解酵素を用いると、加水分解および転移の両方がある一定の割合で起こる。ＣＧＴａｓｅでは、加水分解は、反応に用いた羅漢果配糖体のうちの５％以内にしかおきない。羅漢果配糖体は、ＣＧＴａｓｅを用いた本発明の方法において極めて良好な受容体基質であり得る。
【００８９】
ＣＧＴａｓｅとしては、市販の任意のＣＧＴａｓｅを用いてもよいし、ＣＧＴａｓｅを微生物菌体、微生物培養物（例えば、培養上清）などから精製して用いてもよい。市販されるＣＧＴａｓｅの例としては、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣＧＴａｓｅ（林原生物化学研究所社製）、テルモアナエロバクター属またはテルモアナエロビウム属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｓｐ．）由来のＣＧＴａｓｅ（ノボ・ノルディスク・インダストリィ社製「ＣＧＴａｓｅ ＡＣＮ０００２」、特願平２−５００２４７、Ｂ．Ｅ．ＮｏｒｍａｎおよびＳ．Ｔ．Ｊφｒｅｎｓｅｎ，ＤｅｎｐｕｎＫａｇａｋｕ，１９９２；３９：１０１−１０８、本明細書中、以下では、「テルモアナエロバクター属」由来のＣＧＴａｓｅという）、バシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のＣＧＴａｓｅ（林原生物化学研究所社）、バシラス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）由来のＣＧＴａｓｅ（天野エンザイム社製「コンチザイム」）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）由来のＣＧＴａｓｅ（天野エンザイム社製）等が挙げられる。ＣＧＴａｓｅは、複数のメーカーが工業的に製造、販売している酵素であるので、比較的安価かつ大量に入手すること、および起源が異なる酵素の中から適宜選択することが可能である。
【００９０】
α−ガラクトシダーゼとしては、市販の任意のα−ガラクトシダーゼを用いてもよいし、α−ガラクトシダーゼを微生物菌体、微生物培養物（例えば、培養上清）などから精製して用いてもよい。市販されるα−ガラクトシダーゼの例としては、モルティエラ ビナセア（Ｍｏｒｔｉｅｌｌａ ｖｉｎａｃｅａ）由来のα−ガラクトシダーゼ（シグマ社製）、アーモンド由来の由来のα−ガラクトシダーゼ（シグマ社製）、アスペルギラス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のα−ガラクトシダーゼ（天野エンザイム社製）などが挙げられる。α−ガラクトシダーゼは、メリビオース、ラフィノースなどを糖供与体基質とする。
【００９１】
β−ガラクトシダーゼとしては、市販の任意のβ−ガラクトシダーゼを用いてもよいし、β−ガラクトシダーゼを微生物菌体、微生物培養物（例えば、培養上清）などから精製して用いてもよい。市販されるβ−ガラクトシダーゼの例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のβ−ガラクトシダーゼ（シグマ社製）、アスペルギラス オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ（黄麹菌)）由来のβ−ガラクトシダーゼ（ヤクルト本社製）、ペニシリウム マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）由来のβ−ガラクトシダーゼ（ケイアイ化成社製）、バシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のβ−ガラクトシダーゼ（大和化成社製）が挙げられる。β−ガラクトシダーゼは、乳糖、ガラクトオリゴ糖、ガラクトシド配糖体を糖供与体基質とする。
【００９２】
β−フルクトシダーゼとしては、市販の任意のβ−フルクトシダーゼを用いてもよいし、β−フルクトシダーゼを微生物菌体、微生物培養物（例えば、培養上清）などから精製して用いてもよい。市販されるβ−フルクトシダーゼの例としては、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属由来のβ−フルクトシダーゼ（ＢＩＣＯ（塩水港製糖）社製）、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、パン酵母、ビール酵母）由来のβ−フルクトシダーゼ（シグマ社製）、アスペルギラス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、黒麹菌）由来のβ−フルクトシダーゼ（日高、平山；「化学と生物」、２３、６００（１９８５））が挙げられる。β−フルクトシダーゼは、ショ糖、フラクトオリゴ糖などを糖供与体基質とする。
【００９３】
α−グルコシダーゼとしては、市販の任意のα−グルコシダーゼを用いてもよいし、α−グルコシダーゼを微生物菌体、微生物培養物（例えば、培養上清）などから精製して用いてもよい。市販されるα−グルコシダーゼの例としては、アスペルギラス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のα−グルコシダーゼ（天野エンザイム社製）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のα−グルコシダーゼ（シグマ社製）、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα−グルコシダーゼ（シグマ社製）が挙げられる。α−グルコシダーゼは、マルトース、デキストリンなどを糖供与体基質とする。
【００９４】
α−マンノシダーゼとしては、市販の任意のα−マンノシダーゼを用いてもよいし、天然のα−マンノシダーゼを微生物菌体、微生物培養物（例えば、培養上清）などから精製して用いてもよい。市販されるα−マンノシダーゼの例としては、タチナタマメ由来のα−マンノシダーゼ（シグマ社製）が挙げられる。α−マンノシダーゼは、マンノシド配糖体、マンノオリゴ糖などを糖供与体基質とする。
【００９５】
糖転移酵素は、糖転移反応に悪影響を及ぼすような他の酵素活性を含まない限り、任意の純度のものを使用し得る。糖転移酵素は、その糖転移活性を発揮し得る限り、単なる含有物、固定化酵素などのいかなる形態のものでも使用できる。
【００９６】
糖転移酵素の量は、羅漢果配糖体への糖転移反応を触媒し得る量であれば、任意の量であり得る。適切な量は、当業者によって適切に決定され得る。好ましくは基質１ｇあたり０．０１〜１００００単位であり、より好ましくは０．１〜５０００単位である。例えば、糖転移反応に使用するＣＧＴａｓｅが、バシラス・ステアロサーモフィラスまたはテルモアナエロバクター属由来のＣＧＴａｓｅである場合は、１ｇのデンプン当たり０．１〜２０００単位が好ましい。
【００９７】
糖転移酵素の量が多いほど、糖転移反応に要する反応時間を短縮できる。バシラス・マセランス由来のＣＧＴａｓｅを使用する場合は、バシラス・ステアロサーモフィラスまたはテルモアナエロバクター属由来のＣＧＴａｓｅよりも低温（５０℃）で反応を行っても他の起源のＣＧＴａｓｅとほぼ同等の収率でグリコシル化羅漢果配糖体を得ることができる。
【００９８】
１つの実施形態において、羅漢果配糖体に５個以上のグルコース残基が結合した高度グリコシル化化合物を一旦製造したのち、糖質分解酵素を作用させて羅漢果配糖体に１〜４個のグルコース残基が結合した高度グリコシル化化合物を製造する。
【００９９】
＜羅漢果配糖体に１〜４個のグルコース残基が結合した高度グリコシル化化合物＞
部分分解グリコシル化羅漢果配糖体の製造には、任意の糖質分解酵素が使用可能である。このような糖質分解酵素としては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、マルトトリオース生成アミラーゼ、マルトテトラオース生成アミラーゼ、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ、イソアミラーゼおよびプルラナーゼが挙げられるが、羅漢果配糖体に結合したグリコシル糖鎖を短くする作用を有しさえすれば、これらに限定されない。
【０１００】
α−アミラーゼは、グリコシル基の糖鎖内部をランダムに加水分解するアミラーゼである。α−アミラーゼとしては、市販の任意のα−アミラーゼを用いてもよいし、α−アミラーゼを微生物菌体、微生物培養物（例えば、培養上清）などから精製して用いてもよい。市販されるα−アミラーゼの例としては、バシラススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のα−アミラーゼ、アスペルギラス オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のα−アミラーゼ（大和化成社製およびノボノルディスクインダストリー社製）などが挙げられる。
【０１０１】
特に、デンプンの液化力の強いアミラーゼよりも、糖化力の強いα−アミラーゼの方が、部分分解グリコシル羅漢果配糖体の製造には好都合である。
【０１０２】
β−アミラーゼは、グリコシル基の非還元末端側よりマルトース単位で加水分解するアミラーゼである。β−アミラーゼとしては、市販の任意のβ−アミラーゼを用いてもよいし、β−アミラーゼを微生物菌体、微生物培養物（例えば、培養上清）などから精製して用いてもよい。市販されるβ−アミラーゼの例としては、オオムギ由来のβ−アミラーゼ、コムギ由来のβ−アミラーゼ、ダイズ由来のβ−アミラーゼ（天野エンザイム社製およびナガセケムテック社製）、サツマイモ由来のβ−アミラーゼ（シグマ社製）が挙げられる。
【０１０３】
グルコアミラーゼは、グリコシル基の非還元末端側よりグルコース単位で加水分解するアミラーゼである。グルコアミラーゼとしては、市販の任意のグルコアミラーゼを用いてもよいし、グルコアミラーゼを微生物菌体、微生物培養物（例えば、培養上清）などから精製して用いてもよい。市販されるグルコアミラーゼの例としては、リゾパス ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）由来のグルコアミラーゼ（生化学工業社製）、アスペルギラス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のグルコアミラーゼ（阪急バイオインダストリー社製）が挙げられる。
【０１０４】
＜他の成分＞
溶媒としては任意の溶媒が使用できる。例えば、水が使用できる。
【０１０５】
糖転移反応および部分分解反応の間の反応液のｐＨは、それぞれの反応を触媒する酵素が作用し得るｐＨ範囲であれば任意に設定し得るが、代表的にはｐＨ３〜１１であり、好ましくは５〜７の範囲である。反応液のｐＨは、反応に使用する酵素の至適ｐＨを考慮して適切に調整され得る。反応液のｐＨの調整方法は、当業者に周知である。
【０１０６】
緩衝液は必ずしも必要ないが、必要に応じて任意の緩衝液を使用してもよい。例えば、上記ｐＨ範囲の１０〜５００ｍＭ酢酸緩衝液およびリン酸緩衝液を使用することができる。
【０１０７】
反応系に５〜１０％（ｖ／ｖ）程度のメタノール、エタノール、イソプロパノール等の水溶性の有機溶媒を含んでいても、高度グリコシル化化合物の収率にほとんど影響はないが、非常に弱い受容体基質となるため、存在しないことが望ましい。カルシウム、マグネシウム２等の金属塩の添加は特に必要としない。
【０１０８】
＜高度グリコシル化化合物の製造方法＞
本発明の化合物を製造する方法においては、他に特定されない限り、当該分野で公知である、配糖体の抽出および分画方法、ならびに甘味料の調製方法などが採用され得る。これらの手法は、市販のカラムなどを使用して行い得る。
【０１０９】
本発明の高度グリコシル化化合物は、羅漢果配糖体を、グルカンなどの糖供与体基質および糖転移酵素と接触させて、高度グリコシル化化合物を得る工程を包含する方法によって製造される。代表的には、本発明の高度グリコシル化化合物は、羅漢果配糖体を、α−グルカンなどの糖供与体基質および糖転移酵素と接触させて、高度グリコシル化化合物を得る工程を包含する方法によって製造される。
【０１１０】
本発明の方法では、まず、羅漢果配糖体、グルカンなどの糖供与体基質および糖転移酵素を混合する。これらの混合の順序は任意の順序で行われる。すなわち、まず羅漢果配糖体との糖供与体基質とを混合した後、これに糖転移酵素を添加して混合してもよいし、まず羅漢果配糖体と糖転移酵素とを混合した後、これに糖供与体基質を添加して混合してもよいし、まず糖転移酵素と糖供与体基質とを混合した後、これに羅漢果配糖体を添加して混合してもよいし、羅漢果配糖体、糖供与体基質および糖転移酵素をいっぺんに混合してもよい。糖転移酵素としてＣＧＴａｓｅ以外の酵素を用い、糖転移酵素と糖供与体基質とを混合した後に羅漢果配糖体を添加する場合、糖転移酵素と糖供与体基質との混合から、羅漢果配糖体の添加までの時間はなるべく短いことが好ましい。混合は、羅漢果配糖体、糖供与体基質および糖転移酵素が実質的に均一に混同されるのであれば、どのような方法を用いて行ってもよいし、また、混合時間も適切に選択され得る。
【０１１１】
このようにして混合されることにより、羅漢果配糖体と糖供与体基質および糖転移酵素とが接触し得る。接触の間、この混合物は、糖転移反応に適切な温度に保たれることが好ましい。反応温度は代表的には１０〜１００℃、好ましく４０〜９０℃である。用いる糖転移酵素に適切な反応温度は、当業者に公知であり、当業者は適切に選択し得る。例えば、バチラス・ステアロサーモフィラスまたはテルモアナエロバクター属由来のＣＧＴａｓｅは耐熱性が高いので、バチラス・ステアロサーモフィラス由来のＣＧＴａｓｅは８０℃の反応において数日間、テルモアナエロバクター属由来のＣＧＴａｓｅは９０℃の反応において数日間使用することができる。一方、バシラス・マセランス由来のＣＧＴａｓｅは、それほど耐熱性が高くないので、反応温度５０℃以下で使用することが好ましい。
【０１１２】
羅漢果配糖体と、糖供与体基質および糖転移酵素とを接触させる時間は、使用する糖転移酵素を考慮して当業者によって適切に選択され得る。接触させる時間は代表的には、５分間〜１０日、好ましくは３０分間〜５日間、より好ましくは１時間〜３日間である。
【０１１３】
羅漢果配糖体と、糖供与体基質および糖転移酵素とを接触させることによって、羅漢果配糖体にグリコシル残基が転移されて、羅漢果配糖体に１個以上のグルコース残基が結合している高度グリコシル化化合物が形成される。高度グリコシル化化合物を含有する反応系は、そのまま目的の用途に使用されてもよいし、その後のさらなる糖転移反応を防ぐために糖転移酵素を失活させる処理が施されてもよいし、この反応系から高度グリコシル化化合物が部分的または完全に精製されてもよい。
【０１１４】
例えば、羅漢果配糖体の中で最も含有量が多いモグロサイドＶとデンプンおよびＣＧＴａｓｅとを接触させた場合を例示すると、ＣＧＴａｓｅの作用によって上記化学構造１の各Ｒ₁、Ｒ₂の複数のグルコース残基に対して新たに結合するグルコース残基の数（すなわち、重合度）は、通常はそれぞれ１〜１５であり、１〜５のものが比較的多い。ただしこれらの比率は、反応条件によって変化するため、限定されない。ＣＧＴａｓｅを用いることにより、モグロサイドＶのグルコース残基と新たに結合したグルコース残基との間の結合のアノマー型はα型に限定される。ＣＧＴａｓｅの作用によって得られた、新たに結合したグルコース残基の重合度が２以上の場合の、グルコース残基間の結合様式は通常、α−１，４結合のみであるが、α−１，６結合（すなわち、分岐構造）が形成されてもよい。
【０１１５】
羅漢果配糖体に５個以上のグルコース残基がα結合している高度グリコシル化化合物は、羅漢果配糖体に１〜４個のグルコース残基がα結合している高度グリコシル化化合物（すなわち、部分分解グリコシル化羅漢果配糖体）を得るために、糖質分解酵素と接触され得る。
【０１１６】
グリコシル化羅漢果配糖体は、例えば、水溶液中などで糖質分解酵素と混合されることにより、糖質分解酵素と接触し得る。グルコシル化羅漢果配糖体を含む反応液は、そのまま糖質分解酵素と混合されてもよいが、糖転移酵素を除去または失活させる処理を施した後に糖質分解酵素と混合されることが好ましい。糖転移酵素を失活させる処理の例としては、加熱、ｐＨ変化、エタノールのような有機溶媒の添加などが挙げられる。加熱の例としては、１５分間の煮沸が挙げられる。通常の糖転移酵素は、１５分間の煮沸でほぼ失活する。有機溶媒を添加して糖転移酵素を失活させた後に、グリコシル化羅漢果配糖体を糖質分解酵素で処理する場合、糖質分解酵素を添加する前に有機溶媒を留去することが好ましい。失活させるための処理を施さずに、グリコシル化羅漢果配糖体を糖質分解酵素と接触させた場合、糖質分解酵素の分解反応によって生成するグルコース、オリゴ糖などが糖転移反応の糖受容体基質となり、一旦生成したグリコシル化羅漢果配糖体が糖供与体基質として働いて羅漢果配糖体に戻り得るので、部分分解グリコシル化羅漢果配糖体の収率が低下することが起こり得る。
【０１１７】
グリコシル化羅漢果配糖体と糖質分解酵素とを接触させる間、この混合物は、糖質分解酵素によるグリコシル残基の加水分解に適切な温度に保たれ得る。適切な温度範囲は代表的には、３０〜８０℃である。
【０１１８】
グリコシル化羅漢果配糖体と糖質分解酵素とを接触させる間の混合物のｐＨは、糖転移反応を行ったｐＨ５〜７程度の範囲であれば、ｐＨの再度の調整は必要なく、そのまま継続して部分分解反応を行うことができる。
【０１１９】
グリコシル化羅漢果配糖体と糖質分解酵素とを接触させる時間は、加水分解反応に用いる糖質分解酵素の性質および所望の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体の組成を考慮して、または当該分野で公知の方法を用いて反応の進行程度を測定して、当業者によって適切に決定され得る。部分分解グリコシル化羅漢果配糖体の生成程度は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて測定（定量、分析など）され得る。
【０１２０】
このようにして部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が得られるが、部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を含有する混合物は、そのまま目的の用途に用いられてもよいし、糖質分解酵素を失活させる処理が施されてもよいし、部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を部分的または完全に精製してもよい。糖質分解酵素を失活させる処理の例としては、煮沸が挙げられる。
【０１２１】
＜高度グリコシル化化合物の単離、分析および同定方法＞
本発明の高度グリコシル化化合物は、当該分野で公知の方法によって分析され得る。このような分析方法の例としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ＴＬＣ、シリカゲルクロマトグラフィーなどが挙げられる。
【０１２２】
ＨＰＬＣに使用され得るカラムとしては、アミド系カラムが挙げられる。アミド系カラムの例としては、アサヒパックＮＨ２Ｐ−５０（ショーデックス社製）、アミド８０（東ソー社製）等が挙げられる。これらのカラムを使用する場合には、分析対象とする試料溶液に対して、同容量のアセトニトリルまたはエタノール等を添加し、予め未反応の高分子量グルカン等を沈殿として除去しておくことが好ましい。
【０１２３】
ＨＰＬＣに使用され得る溶離液として、アセトニトリル水溶液が挙げられ、代表的には５５〜８５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液が適切である。高度グリコシル化化合物は、羅漢果配糖体に結合しているグルコース残基の重合度が高くなるほど、カラムへの保持時間は長くなる。
【０１２４】
ＨＰＬＣに使用され得る他のカラムとしては、逆相系カラムが挙げられる。逆相系カラムは、沈澱処理を必要としないので、アミド系カラムを用いる場合よりも分析操作が簡便である。逆相系カラムの例としては、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ（ＹＭＣ社製）、Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＣＬＣ−ＯＤＳ（島津製作所社製）が挙げられる。逆相系カラムを用いる場合、羅漢果配糖体にα結合したグルコース残基の数が多い高度グリコシル化化合物ほど、カラムへの保持時間が短くなり、受容体基質である羅漢果配糖体は高度グリコシル化化合物よりも保持時間が長くなる傾向が認められる。
【０１２５】
薄層クロマトグラフィーを用いて反応液を分析する場合、例えば以下のようにして定性的に分析を行い得る。薄層板（キーゼルゲル６０、メルク社製）に反応液の一部をスポットし、酢酸エチル：酢酸：水（３：１：１、ｖ／ｖ）を展開溶媒として、上昇法で展開する。展開を開始してから適切な時間（代表的には、５分間〜１時間、より好ましくは１５分間〜３０分間）が経過してから、薄層板を展開溶媒から取り出し、風乾させる。高度グリコシル化羅漢果配糖体を検出するためには、風乾後の薄層板に５０％硫酸／メタノール溶液を噴霧して、１２０℃で加熱する。これにより、薄層板のうちの配糖体を含有する部分が茶褐色に変化する。グリコシル化羅漢果配糖体は、羅漢果配糖体に結合したグルコース残基の数が多いほど展開移動度が小さくなる。
【０１２６】
本発明の高度グリコシル化化合物（グリコシル化羅漢果配糖体および部分分解グリコシル化羅漢果配糖体）は、当業者に周知の精製方法を用いて精製され得る。本発明の高度グリコシル化化合物に対して逆相系カラム（例えば、ＯＤＳ）を用いた吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどを行うことによよって、少量混在するグルコース、オリゴ糖などを除去して本発明の高度グリコシル化化合物の純度を高めることができる。
【０１２７】
例えば、ＯＤＳクロマトグラフィーでは、ＯＤＳカラムを水で平衡化しておく。試料中のグルコースおよび短鎖のオリゴ糖はＯＤＳカラムに吸着されず、非吸着画分および水洗浄画分に回収される。グリコシル化羅漢果配糖体は、溶離液中のエタノール濃度またはメタノール濃度を段階的または直線的に上昇させることにより溶出され得る。その際、羅漢果配糖体に結合したグルコース残基の数が多いグリコシル化羅漢果配糖体から順番に溶出する。
【０１２８】
溶離液中のエタノール濃度は、最も高濃度のときには、９０％（ｖ／ｖ）を超えないことが好ましく、２０〜５０％（ｖ／ｖ）程度であることが適切である。
【０１２９】
使用され得るゲルろ過担体としては、セファデックスＧ−１５またはセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）、ビオゲルＰ−２（バイオラド社製）等が挙げられる。
【０１３０】
ゲル濾過クロマトグラフィーの際の溶離液としては、蒸留水、５％エタノールなどが使用され得る。
【０１３１】
＜グリコシル化羅漢果配糖体または部分分解グリコシル化羅漢果配糖体の工業レベル製造＞
工業的レベルでのグリコシル化羅漢果配糖体および部分分解グリコシル化羅漢果配糖体の製造工程の例を図１に示す。以下、この例について説明する。
【０１３２】
受容体基質には、羅漢果の粗エキス、部分精製物、各配糖体成分の精製物など、いかなる純度の混合物であっても使用することができる。また粗エキス中に含まれている果糖は糖転移酵素（例えば、ＣＧＴａｓｅ）の受容体基質となり得ないので、高濃度で受容体基質中に含有されていても全く問題ない。
【０１３３】
生産量に応じた容量の温度制御反応釜に、羅漢果エキス、デンプン、ＣＧＴａｓｅを投入し、水で全容とする。使用するＣＧＴａｓｅに応じた最適反応温度（例えば、４０℃〜９０℃）および最適反応時間（例えば、６〜４８時間）反応させた後、用いたＣＧＴａｓｅの耐熱性に応じて７０℃〜１００℃にて１５分間の加熱することにより、糖転移酵素活性を失活させる。必要に応じて糖質分解酵素を投入し、使用する糖質分解酵素に最適な反応温度（例えば、３０℃〜８０℃）で反応させ、羅漢果配糖体に１〜４個のグルコース残基が結合した部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得ることもできる。
【０１３４】
次に、高度グリコシル化羅漢果配糖体または羅漢果配糖体に１〜４個のグルコース残基が結合した部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を分離および精製するために、上記で得られた反応生成物をＯＤＳ逆相系樹脂を充填したカラムに最適流量で流し込む。このカラムを水洗後、最適アルコール濃度の水溶液でグリコシル化羅漢果配糖体または部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を溶出する。
【０１３５】
濃縮工程では、得られた溶出液量に応じた容量のアルコール回収用減圧濃縮装置を上記の溶出液に対して用いて、アルコールの回収に必要な最適真空度および濃縮温度条件でアルコールを回収し、溶出液を濃縮する。回収したアルコールはリサイクルして用いる。
【０１３６】
粉末化工程については、濃縮された溶出液の量に応じた水分蒸発量を有するスプレードライヤーに上記の濃縮された溶出液を供して、グリコシル化羅漢果配糖体または部分分解グリコシル化羅漢果配糖体の粉体乾燥物を得る。
【０１３７】
単離したグリコシル化羅漢果配糖体および部分分解グリコシル化羅漢果配糖体の化学構造は、マススペクトルで確認することができる。マススペクトルによって確認された、モグロサイドＶの化学構造を以下の化学構造４に示す。なおグルコース間の結合様式は、ＣＧＴａｓｅの特異性からα−１，４結合のみであり、単離した各重合度の生成物をＮＭＲ等で詳細に解析するまでもない。
【０１３８】
（化学構造４）
【０１３９】
【化２４】

本発明の方法では、糖転移酵素が加水分解反応をほとんど触媒しないため、羅漢果配糖体に結合した糖の重合度が異なる生成物の割合は反応経過とともに変化するが、グリコシル化羅漢果配糖体の全体の収率は反応時間が経過してもほとんど減少しない。したがって、厳密な反応条件のコントロール、反応中の生成物の頻繁なモニタリングなどは不要である。
【０１４０】
好ましくは、デンプンが糖供与体基質に用いられる。この場合、高いグリコシル化効率とも相まって、グリコシル化羅漢果配糖体の製造価格を低減させることができる。
【０１４１】
＜高度グリコシル化化合物の用途＞
羅漢果配糖体を含有する甘味料を、α−グルカンおよび糖転移酵素と接触させることにより、この甘味料中に含まれる羅漢果配糖体は高度グリコシル化化合物に変換される。高度グリコシル化化合物は、羅漢果配糖体よりもショ糖に近い、良好な甘味質を有するので、これにより、この甘味料は、味質が改善される。
【０１４２】
本発明の高度グリコシル化化合物は、食品用組成物、甘味料、医薬品用組成物、医薬部外品用組成物、化粧品用組成物として使用され得る。
【０１４３】
本発明の食品用組成物は、高度グリコシル化化合物を含有する。本明細書において「食品組成物」とは、食用に供され得る任意のものをいう。食品組成物の例としては、加熱料理；清涼飲料、機能性飲料、ゼリー飲料などの飲料類；洋菓子類、和菓子類などの菓子類；ヨーグルトなどの乳製品；調味料；健康食品；特別用途食品（特定保健用食品）が挙げられる。本発明の食品組成物における高度グリコシル化化合物の含有量は、食品組成物の形態および用途によって異なり、当業者によって適宜選択され得る。例えば、一般的な清涼飲料、機能性飲料、ゼリー飲料などの飲料類の場合は、飲料全体における高度グリコシル化化合物の含有量は、代表的には約０．００１〜約２．０重量％、好ましくは約０．００５〜約１．０重量％、さらに好ましくは約０．０１〜約０．５重量％の割合である。
【０１４４】
本発明の食品組成物は、当業者に公知の方法を用いて製造され得る。当業者は、食品組成物の形態および種類に応じて適切な製造方法を選択し得る。ここで、高度グリコシル化化合物は任意の方法で食品組成物に配合され得る。
【０１４５】
本発明の食品組成物に含有される高度グリコシル化化合物は、一般的なショ糖に代わる甘味料として、加熱料理、洋菓子類、和菓子類、飲料類、乳製品、調味料などの食品用途、健康食品用途、特別用途食品（特定保健用食品）などにも広く利用され得る。本発明の高度グリコシル化化合物は、加熱に対して安定であり、褐変および着色を生じず、酸性の食品中でも安定であることから、上記用途に特に有用である。
【０１４６】
本発明の甘味料は、高度グリコシル化化合物を含有するエネルギー抑制甘味料である。本明細書中で「甘味料」とは、食品に甘味をつけるために用いられる組成物をいう。本発明の甘味料は、低エネルギー甘味料であってもよいし、ゼロエネルギー甘味料であってもよい。あるいは、本発明の甘味料は、甘味料の単位重量あたりのエネルギーはショ糖とほぼ同等であっても、甘味強度がショ糖よりも著しく高いために、甘味料の使用量がきわめて少量ですみ、絶対使用量を減らすことができる甘味料であってもよい。栄養改善法によれば、栄養成分が少ないことを強調する表示の基準として、「低」、「軽」、「ひかえめ」、「低減」、「カット」、「オフ」などのエネルギー表示は、甘味料１００ｇあたりのエネルギーが４０ｋｃａｌ以下（ただし飲用に供する食品は２０ｋｃａｌ以下）と定められている。「無」、「ゼロ」、「ノン」などのエネルギー表示は、甘味料１００ｇあたりのエネルギーが５ｋｃａｌ以下とされている。好ましい実施態様では、本発明の甘味料は、１００ｇあたりのエネルギーが「ゼロ」または「低」を強調して表示できる甘味料であり得る。
【０１４７】
本発明の甘味料は、液体（すなわち、シロップ状）、半固体または固体（例えば、粉末状、顆粒状、結晶状、六角形の形態など）の形態であり得る。当業者は、甘味料物の用途に応じて、甘味料の形態を適宜選択し得る。
【０１４８】
本発明の甘味料における高度グリコシル化化合物の含有量は、製品の形態および用途によって異なり、当業者によって適宜選択され得る。例えば、卓上用の固体の高甘味度甘味料として用いる場合、本発明の甘味料は高度グリコシル化化合物単独からなり得る。すなわち、高度グリコシル化化合物の含有量は１００重量％であり得る。一般的な卓上用の粉末または顆粒状低エネルギー甘味料および低エネルギーシロップ類などとして用いる場合は、甘味料全体における高度グリコシル化化合物の含有量は、代表的には約０．００１〜約５重量％、好ましくは約０．００５〜約２重量％、さらに好ましくは約０．０１〜約０．５重量％である。
【０１４９】
本発明の甘味料は、その形態に適切な、当業者に公知の方法を用いて製造される。例えば、固体状の甘味料の場合、代表的には、高度グリコシル化化合物、ならびに必要に応じて他の成分を混合することにより製造される。固体状の甘味料は、必要に応じて賦形され得る。液体状の甘味料の場合、代表的には、高度グリコシル化化合物、ならびに必要に応じて他の成分と必要量の水とを混合して溶解させることにより製造される。当業者は、目的とする甘味料組成物の形態および用途に応じて適切な製造方法を選択し得る。
【０１５０】
本発明の医薬品用組成物は、高度グリコシル化化合物を含有する。本明細書において「医薬品用組成物」とは、医用に供され得る任意のものをいう。医薬品用組成物の例としては、経口投与される製剤；舌下に適用する製剤（例えば、舌下錠）；歯科外用剤および口中用剤（例えば、含嗽剤）が挙げられる。本発明の医薬品用組成物における高度グリコシル化化合物の含有量は、医薬品用組成物の形態および用途によって異なり、当業者によって適宜選択され得る。例えば、一般的な経口投与される製剤の場合は、製剤全体における高度グリコシル化化合物の含有量は、代表的には約０．００１〜約５重量％、好ましくは約０．０５〜約２重量％、さらに好ましくは約０．０１〜約０．５重量％の割合である。
【０１５１】
本発明の医薬品用組成物は、当業者に公知の方法を用いて製造され得る。当業者は、医薬品用組成物の形態および種類に応じて適切な製造方法を選択し得る。ここで、高度グリコシル化化合物は任意の方法で医薬品用組成物に配合され得る。
【０１５２】
本発明の医薬部外品用組成物は、高度グリコシル化化合物を含有する。本明細書において「医薬部外品用組成物」とは、医薬部外品用に供され得る任意のものをいう。医薬部外品用組成物の例としては、口中清涼剤（例えば、のど清涼剤、健胃清涼剤）；薬用化粧品；薬用歯磨き類が挙げられる。医薬部外品用組成物の例としては、ビタミンＣ剤、ビタミンＥ剤、ビタミンＥＣ剤、ビタミン含有保健剤、カルシウム剤であってもよい。本明細書中では、医薬部外品用組成物は、医薬部外品として使用される組成物、または新指定医薬部外品として使用される組成物の両方を含む。本発明の医薬品用組成物における高度グリコシル化化合物の含有量は、医薬品用組成物の形態および用途によって異なり、当業者によって適宜選択され得る。例えば、一般的なのど清涼剤の場合は、のど清涼剤全体における高度グリコシル化化合物の含有量は、代表的には約０．００１〜約５重量％、好ましくは約０．０５〜約２重量％、さらに好ましくは約０．０１〜約０．５重量％の割合である。
【０１５３】
本発明の医薬品用組成物は、当業者に公知の方法を用いて製造され得る。当業者は、医薬品用組成物の形態および種類に応じて適切な製造方法を選択し得る。ここで、高度グリコシル化化合物は任意の方法で医薬品用組成物に配合され得る。
【０１５４】
本発明の化粧品用組成物は、高度グリコシル化化合物を含有する。本明細書において「化粧品用組成物」とは、化粧用に供され得る任意のものをいう。化粧品用組成物の例としては、口紅および歯磨き類が挙げられる。本発明の化粧品用組成物における高度グリコシル化化合物の含有量は、化粧品用組成物の形態および用途によって異なり、当業者によって適宜選択され得る。例えば、一般的な歯磨き類の場合は、歯磨き全体における高度グリコシル化化合物の含有量は、代表的には約０．００５〜約５重量％、好ましくは約０．００５〜約２重量％、さらに好ましくは約０．０１〜約０．５重量％の割合である。
【０１５５】
本発明の化粧品用組成物は、当業者に公知の方法を用いて製造され得る。当業者は、化粧品用組成物の形態および種類に応じて適切な製造方法を選択し得る。ここで、高度グリコシル化化合物は任意の方法で化粧品用組成物に配合され得る。
【０１５６】
本発明で用いられる糖転移酵素および糖質分解酵素は、シクロデキストリン、カップリングシュガー（グリコシルスクロース）などのような、食品（例えば、甘味料）、医薬品、化粧品などの素材および添加物の工業的な製造に利用されてきた実績があるため、安全性の点でも問題はない。
【０１５７】
【実施例】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。本発明は以下の実施例のみに限定されない。
【０１５８】
＜実施例１：各種ＣＧＴａｓｅを用いたときの、モグロサイドＶへの糖転移率＞
各種ＣＧＴａｓｅによるモグロサイドＶへの糖転移率を調べるために、以下の実験を行った。まず、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に２０％（ｗ／ｖ）の羅漢果配糖体含有組成物（羅漢果配糖体としてモグロサイドＶを約３０％（ｗ／ｖ）含むもの；中国桂林思特技術公司より入手）および１０％（ｗ／ｖ）の可溶性デンプン（関東化学社製）を含む羅漢果配糖体溶液（０．９５ｍｌ）に対して、バシラス・ステアロサーモフィラス由来のＣＧＴａｓｅ（実施例１−１）、テルモアナエロバクター属由来のＣＧＴａｓｅ（実施例１−２）、バシラス・サーキュランス由来のＣＧＴａｓｅ（実施例１−３）またはバシラス・マセランス由来のＣＧＴａｓｅ（実施例１−４）（各２０単位）を加えて混合し、６０℃で２４時間および４８時間反応させた。ブランクとして、ＣＧＴａｓｅを添加せずに同じ操作を行った。
【０１５９】
２４時間または４８時間の反応後、反応液を１００℃で１５分間煮沸してＣＧＴａｓｅを失活させた。煮沸後の反応液を、ＯＤＳカラムを装着したＨＰＬＣで分析した。ブランクの反応液中のモグロサイドＶの量（ＭｏｇＶ（ｂｌａ））を１００％とし、糖転移反応後の反応液中のモグロサイドＶの量（ＭｏｇＶ（ｒｅａｃｔ））の減少率を糖転移率とみなした。すなわち、
【０１６０】
【数１】

結果を表１に示す。
【０１６１】
【表１】

いずれのＣＧＴａｓｅを用いた場合も、モグロサイドＶへの糖転移が観察された。糖転移率は、バシラス・ステアロサーモフィラス由来のＣＧＴａｓｅ、テルモアナエロバクター属由来のＣＧＴａｓｅおよびバシラス・サーキュランス由来のＣＧＴａｓｅを用いた場合に非常に高い糖転移率が示され、これら３種類の酵素では、２４時間の反応でも糖転移率は８０％以上と高かった（表１−▲２▼、表１−▲１▼および表１−▲４▼）。そのため、これらの酵素は、本発明の製造方法に好適に使用され得る。
【０１６２】
一方、バシラス・マセランス由来のＣＧＴａｓｅを用いた場合、２０単位で添加して６０℃で反応させた場合、糖転移率は５０％以下であり、それほど高くなかったので、酵素量を１００単位に増やし、反応温度を５０℃として上記と同様に実験を行った（実施例１−５）ところ、２４時間後の合成率は８０％に増大した（表１−▲５▼）。
【０１６３】
これらのことから、いずれの微生物菌体、微生物培養物（例えば、培養上清）など由来のＣＧＴａｓｅを用いた場合でも、酵素量および反応温度を適切に設定することにより、グリコシル化羅漢果配糖体の製造に好適に使用され得ることがわかった。
【０１６４】
＜実施例２：モグロサイドＶへの糖転移に及ぼす酵素添加量および反応温度の影響＞
モグロサイドＶへの糖転移に及ぼす酵素添加量および反応温度の影響を調べるために、以下の実験を行った。まず、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に２０％（ｗ／ｖ）の羅漢果配糖体含有組成物（羅漢果配糖体としてモグロサイドＶを約３０％（ｗ／ｖ）含むもの；中国桂林思特技術公司より入手）および１０％（ｗ／ｖ）の可溶性デンプン（関東化学社製）を含む羅漢果配糖体溶液（０．９５ｍｌ）に対して、ＣＧＴａｓｅ酵素（テルモアナエロバクター属由来、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社製）を、０．６７単位／ｇデンプン（試料Ａ）、１．３３単位／ｇデンプン（試料Ｂ）、３．３３単位／ｇデンプン（試料Ｃ）、６．６７単位／ｇデンプン（試料Ｄ）、１３．３３単位／ｇデンプン（試料Ｅ）、３３．３３単位／ｇデンプン（試料Ｆ）または６６．６７単位／ｇデンプン（試料Ｇ）のいずれかの濃度で添加して混合し、反応温度６０℃および８０℃で、反応時間２４時間および４８時間反応させた。ブランクとして、ＣＧＴａｓｅを添加せずに同じ操作を行った。
【０１６５】
２４時間または４８時間の反応後、反応液を１００℃で１５分間煮沸してＣＧＴａｓｅを失活させた。煮沸後の反応液を、ＯＤＳカラムを装着したＨＰＬＣで分析し、糖転移に及ぼす酵素量および反応温度の影響を判断した。実施例１と同様に、ブランクの反応液中のモグロサイドＶの量（ＭｏｇＶ（ｂｌａ））を１００％とし、糖転移反応後の反応液中のモグロサイドＶの量（ＭｏｇＶ（ｒｅａｃｔ））の減少率を糖転移率とみなした。
【０１６６】
ＣＧＴａｓｅの種々の添加量、反応温度および反応時間での糖転移率を以下の表２に示す。
【０１６７】
【表２】

表２からわかるように、添加酵素量の増加（試料Ａ→試料Ｇ）に伴い、羅漢果配糖体の主成分（モグロサイドＶ（Ｍｏｇｒｏｓｉｄｅ Ｖ））の糖転移率は増加した。反応温度を６０℃から８０℃に上昇させることによっても、糖転移率は増大した。また、反応時間が２４時間から４８時間へと長くなることによっても、糖転移率は増大した。したがって、モグロサイドＶへの糖転移率は、添加酵素量、反応温度および反応時間を適宜設定することによって、増大させることができる。それゆえ、当業者は、高度グリコシル化化合物を合成するために都合のよい条件を適宜設定し得る。
【０１６８】
＜実施例３：糖転移率に及ぼす糖供与体基質濃度の影響＞
シクロデキストリン合成酵素（ＣＧＴａｓｅ、テルモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）由来）によるモグロサイドＶへの糖転移率に及ぼす糖供与体基質（デンプン）の濃度の影響を調べた。
【０１６９】
まず、各試験管に２０％（ｗ／ｖ）の羅漢果配糖体含有組成物（中国桂林思特技術公司から入手）と各種濃度の可溶性デンプン溶液とを等量で混合して、１０％（ｗ／ｖ）羅漢果配糖体含有組成物と、０．５％（ｗ／ｖ）、１．０％（ｗ／ｖ）、２．５％（ｗ／ｖ）、５．０％（ｗ／ｖ）、７．５％（ｗ／ｖ）または９．６％（ｗ／ｖ）の可溶性デンプンとを含む反応基質液を調製した。この反応液に１０単位のＣＧＴａｓｅを添加して混合した後、６０℃で２０時間および４４時間反応させた。
【０１７０】
２４時間または４４時間の反応後、反応液を１００℃で１５分間煮沸してＣＧＴａｓｅを失活させた。煮沸後の反応液を、ＯＤＳカラムを装着したＨＰＬＣで分析し、糖転移に及ぼすデンプンの量の影響を判断した。実施例１と同様に、ブランクの反応液中のモグロサイドＶの量（ＭｏｇＶ（ｂｌａ））を１００％とし、糖転移反応後の反応液中のモグロサイドＶの量（ＭｏｇＶ（ｒｅａｃｔ））の減少率を糖転移率とみなした。羅漢果配糖体の主成分（Ｍｏｇｒｏｓｉｄｅ Ｖ）の面積値により糖転移率を測定した。
【０１７１】
結果を表３に示す。
【０１７２】
【表３】

表３から、ＣＧＴａｓｅによるモグロサイドＶへの糖転移率に及ぼす糖供与体基質（デンプン）の濃度の影響がわかる。ＨＰＬＣにおいて、いずれのデンプン濃度でも羅漢果配糖体の主成分（Ｍｏｇｒｏｓｉｄｅ Ｖ）の減少が見られ、糖転移が確認された。特にデンプン濃度２．５％以上の場合、２０時間後の糖転移率（％）は、７５％以上と高かった。さらにデンプン濃度２．５％以上の場合、４４時間後では、糖転移率（％）は、７８〜９３％と非常に高かった。以上の結果から、比較的低いデンプン濃度を用いた場合でも、反応２０時間以内で高い収率で糖転移物が生成する、きわめて生産性に優れた反応であることが示唆された。
【０１７３】
＜実施例４：部分分解グリコシル化物の合成および分析＞
高度グリコシル化化合物のβ−アミラーゼ処理による部分分解グリコシル化物の合成および分析を以下の通りに行った。
【０１７４】
まず、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に３０％（ｗ／ｖ）の羅漢果配糖体含有組成物（中国桂林思特技術公司より入手）および１５％（ｗ／ｖ）の可溶性デンプン（関東化学社製）を含む羅漢果配糖体水溶液（５０ｍｌ）に対して、ＣＧＴａｓｅ酵素（バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来、林原生物化学研究所製）を１，４００単位添加して混合し、反応温度６０℃で１８時間反応させ、高度グリコシル化化合物を合成した。１８時間の反応後、反応液を１００℃で１５分間煮沸してＣＧＴａｓｅを失活させ、９９．５％エタノール（ナカライ社製）を２倍量加えてグルカン混合物を沈澱させた。この沈澱物を遠心分離によって除去して上清を得た。この上清をエバポレーターにかけてエタノールを除去した。
【０１７５】
この溶液にβ−アミラーゼ（大豆由来、阪急バイオインダストリー社製）を加えて混合し、４０℃で１６時間反応させて、合成されたグリコシル化羅漢果配糖体から、付加した糖残基を部分分解した。１６時間の反応後、反応液をＨＰＬＣにかけてクロマトグラムを得た。
【０１７６】
得られたクロマトグラムを図２に示す。図２では、横軸はピークの高さを示し、縦軸はリテンションタイムを示す。ピークの近傍の数字は、ピークの出現したリテンションタイムを示す。各ピークに含まれる成分の分子量をＬＣマスによって測定し、グルコース残基の結合数を決定した。
【０１７７】
リテンションタイム４．５分付近に羅漢果配糖体の主成分（Ｍｏｇｒｏｓｉｄｅ Ｖ）のピークが確認された。それ以降、６分付近に、モグロサイドＶにグルコースが１残基結合したグリコシル化物のピークが、８分付近に、モグロサイドＶにグルコースが２残基結合したグリコシル化物のピークが、１１分付近に、モグロサイドＶにグルコースが３残基結合したグリコシル化物のピークが、そして１５分付近に、モグロサイドＶにグルコースが４残基結合したグリコシル化物のピークが、それぞれ確認された。
【０１７８】
図２から、部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が生成し、糖付加数によりＨＰＬＣ分離されていることが明らかである。
【０１７９】
＜実施例５：甘味強度の測定＞
（１）グリコシル化羅漢果配糖体の合成
羅漢果配糖体（羅漢果配糖体としてモグロサイドＶを約３０％（ｗ／ｖ）含む羅漢果配糖体含有組成物；中国桂林思特技術公司より入手）１５ｇおよびデンプン（溶性、１級、関東化学社製）７．５ｇを、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で５０ｍＬに調製し、ＣＧＴａｓｅ酵素（商品名；ＴＨＥＲＭＯＰＨＩＬＩＣＣＧＴａｓｅ、起源；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｏｉｌｕｓ、１，４００単位／ｇ）１ｍＬを加え、６０℃で１８時間反応させて、グリコシル化羅漢果配糖体を合成した。次いで、この反応液を熱処理してＣＧＴａｓｅを失活させた後、１０，０００ｒｐｍにて、２０分間遠心分離を行い、上清液をＯＤＳカラム（Ｏｒｇａｎｏ、φ３０ｍｍ×４５０ｍｍ）にチャージし、脱イオン水を用いて５００ｍＬを溶出して不純物を除去した後、水（０ｖ／ｖ％エタノール）から６０ｖ／ｖ％エタノールへの直線濃度勾配のエタノール／水を用いて３Ｌの溶出液を得て、この溶出液を凍結乾燥して、粉体のグリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０１８０】
（２）部分分解グリコシル化羅漢果配糖体の合成
羅漢果配糖体（羅漢果配糖体としてモグロサイドＶを約３０％（ｗ／ｖ）含む羅漢果配糖体含有組成物；中国桂林思特技術公司より入手）１５ｇおよびデンプン（溶性、１級、関東化学社製）７．５ｇを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で５０ｍＬに調製し、ＣＧＴａｓｅ酵素（商品名；ＴＨＥＲＭＯＰＨＩＬＩＣ ＣＧＴａｓｅ、起源；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｏｉｌｕｓ、１，４００単位／ｇ）１ｍＬを加え、６０℃で１８時間反応させて、グリコシル化羅漢果配糖体を合成した。次いで、この反応液を熱処理してＣＧＴａｓｅ酵素を失活させた後、エタノール（試薬特級、Ｎａｋａｒａｉ社製）１００ｍＬを加え、デンプンを沈澱させ、１０，０００ｒｐｍにて、２０分間遠心分離を行った。上清液を回収し、エバポレーターにかけてエタノールを除去し、全量が４０ｍＬになるまで濃縮した。この濃縮した溶液４０ｍＬに分解酵素（商品名：β−アミラーゼ＃１５００Ｓ、ナガセケムテックス株式会社製、１５，０００ＡＵＮ／ｇ）２０ｍｇを加え、４０℃で１６時間反応させて、部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を合成した。この反応液を熱処理して分解酵素を失活させた後、この反応液をＯＤＳカラム（Ｏｒｇａｎｏ、φ３０ｍｍ×４５０ｍｍ）にチャージし、脱イオン水を用いて１．５Ｌを溶出して不純物を除去した後、水（０ｖ／ｖ％エタノール）から６０ｖ／ｖ％エタノールへの直線濃度勾配のエタノール／水を用いて３Ｌの溶出液を得て、この溶出液を凍結乾燥して、粉体の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０１８１】
（３）グリコシル化羅漢果配糖体および部分分解グリコシル化羅漢果配糖体の甘味強度の測定
それぞれ、上記（１）および（２）で得たグリコシル化羅漢果配糖体および部分分解グリコシル化羅漢果配糖体の甘味強度を以下の方法で測定した。健常被験者１２名（男性６名、女性６名、平均年齢３１．２歳）を用い、１０％のショ糖水溶液を対象として、グリコシル化羅漢果配糖体または部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を試飲して甘味強度の相対評価を行い、ショ糖の甘味強度を１とした場合の各サンプルの甘味強度を求めた。
【０１８２】
その結果、１０％ショ糖水溶液と同等の甘味強度を得るために必要なグリコシル化羅漢果配糖体水溶液の濃度は０．１４１重量％であり、部分分解グリコシル化羅漢果配糖体水溶液の濃度は０．０５６重量％であった。したがって、グリコシル化羅漢果配糖体の甘味強度はショ糖の約７０倍、部分分解グリコシル化羅漢果配糖体はショ糖の約１８０倍の甘味強度を有することが分かった。
【０１８３】
＜比較例１：羅漢果配糖体の甘味強度の測定＞
実施例５と同様に、羅漢果配糖体（羅漢果配糖体としてモグロサイドＶを約３０％（ｗ／ｖ）含む羅漢果配糖体含有組成物；中国桂林思特技術公司より入手）の甘味強度を測定した。その結果、１０％ショ糖水溶液と同等の甘味強度を得るために必要な羅漢果配糖体水溶液の濃度は０．０４７重量％であった。したがって、羅漢果配糖体はショ糖の約２１０倍の甘味強度を有する。
【０１８４】
【表４】

＜実施例６および比較例２＞
以下に示す方法により、各種甘味料水溶液を調製した。
【０１８５】
＜実施例６：グリコシル化羅漢果配糖体および部分分解グリコシル化羅漢果配糖体水溶液の調製＞
容量５０ｍＬのガラス製ビーカーに、上記実施例５の（１）および（２）で得たグリコシル化羅漢果配糖体および部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、それぞれ０．１重量％となるように調製して、グリコシル化羅漢果配糖体水溶液および部分分解グリコシル化羅漢果配糖体水溶液を得た。
【０１８６】
＜比較例２：羅漢果配糖体水溶液の調製＞
実施例６と同様に、羅漢果配糖体水溶液を０．１重量％となるように調製した。
【０１８７】
＜実験例１：甘味料水溶液の評価＞
健常被験者１０名（男性５名、女性５名、平均年齢３１．４歳）によって、実施例２および比較例２で得られた甘味料水溶液について６要素の味覚に対して官能試験を実施した。ショ糖水溶液を基準溶液として、各種甘味料水溶液（グリコシル化羅漢果配糖体水溶液または部分分解グリコシル化羅漢果配糖体水溶液または羅漢果配糖体水溶液）を試飲し、「▲１▼苦み、▲２▼後引き、▲３▼しつこさ、▲４▼くせ、▲５▼渋味、▲６▼すっきり感」のそれぞれについて７段階の点数（０点〜６点）で評価した。評価点数は、「ショ糖溶液よりもきわめて優れている」を０点、「ショ糖溶液よりもかなり優れている」を２点、「ショ糖溶液よりもやや優れている」を２点、「ショ糖溶液と同等である」を３点、「ショ糖溶液よりもやや劣っている」を４点、「ショ糖溶液よりもかなり劣っている」を５点、「ショ糖溶液よりもきわめて劣っている」を６点とした。したがって、ショ糖の甘味質の評価点数は全ての要素において３．０となる。
【０１８８】
さらに、各要素別に得られた評価点数を基にしてレーダーチャートを作成した。すなわち、評価した６要素の味覚を６本の軸で表し、１０人の被験者の評価点数の平均値をこの軸上にそれぞれプロットし、このプロットを直線で結んで６角形を描いた。また、６要素のいずれもプロットした点が内側に来るほど甘味質が優れており、逆に外側に来るほど甘味質は劣っていることを意味する。
【０１８９】
各サンプルの各被験者による評価点数と、それらの平均値を以下の表とグラフに示した。
【０１９０】
【表５】

上記の表および図４から明らかなように、比較例２の羅漢果配糖体水溶液では、ほとんどの要素において評価点数は４．０以上となっているが、グリコシル化羅漢果配糖体水溶液の評価点数は全ての要素において約４．０を示し、羅漢果配糖体と比較して、優れた甘味質を示すことが分かった。また、部分分解グリコシル化羅漢果配糖体水溶液の評価点数は全ての要素において３．１〜３．５とショ糖に類似した評価が得られ、部分分解グリコシル化羅漢果配糖体はグリコシル化羅漢果配糖体より、さらに優れた甘味質を示すことが分かった。
【０１９１】
＜実施例７＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号１の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０１９２】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０１９３】
＜実施例８＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号２の以下の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０１９４】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０１９５】
＜実施例９＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号３の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０１９６】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０１９７】
＜実施例１０＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号４の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０１９８】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０１９９】
＜実施例１１＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号５の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２００】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２０１】
＜実施例１２＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号６の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２０２】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２０３】
＜実施例１３＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号７の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２０４】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２０５】
＜実施例１４＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号８の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２０６】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２０７】
＜実施例１５＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号９の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２０８】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２０９】
＜実施例１６＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号１０の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２１０】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２１１】
＜実施例１７＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号１１の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２１２】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２１３】
＜実施例１８＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号１２の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２１４】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２１５】
＜実施例１９＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号１３の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２１６】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２１７】
＜実施例２０＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号１４の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２１８】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２１９】
＜実施例２１＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号１５の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２２０】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２２１】
＜実施例２２＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号１６の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２２２】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２２３】
＜実施例２３＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号１７の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２２４】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２２５】
＜実施例２４＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号１８の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２２６】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２２７】
＜実施例２５＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号１９の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２２８】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２２９】
＜実施例２６＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号２０の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２３０】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２３１】
＜実施例２７＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号２１の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２３２】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２３３】
＜実施例２８＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号２２の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２３４】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２３５】
＜実施例２９＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号２３の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２３６】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２３７】
＜実施例３０＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号２４の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２３８】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２３９】
＜実施例３１＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号２５の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２４０】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２４１】
＜実施例３２＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号２６の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２４２】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２４３】
＜実施例３３＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号２７の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２４４】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２４５】
＜実施例３４＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号２８の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２４６】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２４７】
＜実施例３５＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号２９の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２４８】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２４９】
＜実施例３６＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号３０の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２５０】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２５１】
＜実施例３７＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号３１の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２５２】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２５３】
＜実施例３８＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号３２の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２５４】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２５５】
＜実施例３９＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号３３の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２５６】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２５７】
＜実施例４０＞
実施例４と同様にして多量の部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。ＨＰＬＣを行った後、ＮＭＲおよびＭＡＳＳスペクトルで構造を確認し、化合物番号３４の構造を有する部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を得た。
【０２５８】
この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体を、実施例６と同様の方法で甘味質について評価した。その結果、この部分分解グリコシル化羅漢果配糖体が、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された優れた甘味質を有することがわかった。
【０２５９】
【発明の効果】
本発明により、デンプンなどの糖供与体基質にシクロデキストリン合成酵素などの糖転移酵素を作用させて、糖転移反応によりグリコシル化羅漢果配糖体を非常に効率よくかつ安価に製造する方法およびそれを糖質分解酵素などにより部分分解した部分分解グリコシル化羅漢果配糖体の製造が提供される。
【０２６０】
本発明により、苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感の味質項目において改善され、やわらかで低刺激性の味質となる羅漢果配糖体の味質の大幅な改善方法および当該新規グリコシル化羅漢果配糖体類が提供される。
【０２６１】
本発明により得られる配糖体あるいはそれを含有する糖質は、食品、医薬品、化粧品等への高甘味度甘味料として利用できる。本発明のグリコシル化羅漢果配糖体は、羅漢果配糖体の味質と比較して特に苦味、後引き、しつこさ、くせ、渋みおよびすっきり感が大幅に改善された。
【０２６２】
本発明の高度グリコシル化化合物は、卓上甘味剤、飲料、菓子類、調味料などの食品、医薬品、化粧品などへの添加剤として利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、グリコシル化羅漢果配糖体および部分分解グリコシル化羅漢果配糖体の工業的製造方法の概略図である。
【図２】図２は、ＣＧＴａｓｅおよびβ−アミラーゼ酵素処理後の羅漢果配糖体溶液の高速液体クロマトグラムである。
【図３】図３は、ショ糖の甘味強度を１としたときの、グリコシル化羅漢果配糖体および部分分解グリコシル化羅漢果配糖体の甘味強度を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例６および比較例２の結果を示すレーダーチャートである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a highly glycosylated compound in which one or more glucose residues are bound to Rahan fruit glycoside and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
In recent years, due to factors such as increased consumer preference for low-sweetness and awareness of health concerns due to excessive consumption of energy (especially excessive consumption of sucrose), “moderate sugar”, “no added sugar”, etc. Many of the foods listed are now on the market.
[0003]
In fact, Japan's food situation reflects the “day of satiety,” and excessive intake of energy is becoming a daily routine. It has been clarified that the intake of high energy and the increase of the lipid energy ratio cause the occurrence of lifestyle-related diseases.
[0004]
Thus, people with restricted energy intake (eg, obese and diabetics), those who are on a diet, etc., to prevent their own illness, to improve their illness, or In order to manage health, it is said that it is important to suppress excessive intake of sucrose and lipids, improve lifestyle and regain healthy life.
[0005]
For these reasons, there has been a demand for the development of sweeteners that can replace sucrose, especially high-intensity sweeteners that can substantially suppress energy compared to sucrose.
[0006]
Hereinafter, in this specification, such a sweetener composition having substantially lower energy than sucrose is referred to as an energy-inhibiting sweetener. Here, “energy” refers to the amount of heat that is absorbed into the body and released into the living body through metabolism when a certain amount of a certain substance (for example, 100 grams) is consumed.
[0007]
However, energy-inhibiting sweeteners have various problems. The biggest problem is that of sweetness. This is because humans are very familiar with the sweetness of sucrose, and it is easy to feel uncomfortable with sweeteners having a slightly different sweetness from sucrose. Hereinafter, various conventional high-intensity sweeteners will be described in detail.
[0008]
High intensity sweeteners have a sweetness intensity several hundred times that of sucrose. High-intensity sweeteners can be generally classified into artificial sweeteners (also called synthetic sweeteners) and natural sweeteners. Examples of artificial high-intensity sweeteners include saccharin, aspartame, sucralose, and acesulfame potassium.
[0009]
Saccharin is an artificial sweetener that has been used for a long time. However, since there is a suspicion of carcinogenicity, currently the items to be used are restricted in Japan, and there are also restrictions on the reference amount of use.
[0010]
Aspartame is an artificial sweetener approved by the US FDA in 1981, but until it has been approved, there has been intense debate over the damage to the neurotransmitter system. Furthermore, since aspartame is thermally decomposed, a defect in stability is also pointed out.
[0011]
Artificial high-intensity sweeteners such as sucralose and acesulfame potassium are not currently the subject of discussion for safety, but the sweetness is not sufficient. For example, the sweetness expression time of sucralose is remarkably long, and it is known that the sweetness quality is forever postponed. In contrast, acesulfame potassium cannot be used alone as a sweetener because the sweetness onset time in the oral cavity is so short. Acesulfame potassium also has the major drawback of having bitterness.
[0012]
Thus, artificial high-intensity sweeteners are not only insufficient in sweetness compared to sucrose, but also continually debate over safety assessments.
[0013]
On the other hand, natural high-intensity sweeteners include licorice extract, stevia extract, and rahan fruit extract. These natural sweeteners are derived from plants and are highly safe for the human body.
[0014]
Licorice is a perennial plant belonging to legumes, and its sweet component glycyrrhizin is contained in the rhizome of licorice. However, the sweetness is different from the sweetness of saccharides such as sucrose, and the sweetness remains forever, and when used in a large amount, the bitterness may be felt or the astringent taste may be felt on both cheek walls.
[0015]
Stevia is a perennial plant belonging to the family Asteraceae, and its sweetening components include stevioside and rebaudioside. Among stevia's sweetening ingredients, stevioside has a strong bitterness and astringency, and its sweetness has a significant backlash.
[0016]
Among the natural high-sweetness sweeteners, in particular, Rahan fruit extract is obtained from the dried fruit of Rahan fruit and is known as a medicinal sweetener having strong sweetness. Luo Han Fruit is a perennial medicinal plant of the Cucurbitaceae family that is one of the special products around Guilin, China. Rahan fruit extract has been widely used as a sweetener and folk medicine in China since ancient times. As the medicinal effects of Rahan fruit extract, it is known to improve throat roughness, relieve pain, cough, and expectorant. Since Rakan fruit extract can be expected to have a beneficial effect on humans at the same time as sweetness, it has been proposed to use it as a sweetening ingredient such as confectionery, beverages and syrup (Japanese Patent Laid-Open No. 53-9352 and Japanese Patent Laid-Open No. 53-9352). Sho 53-9359). Specifically, for example, a rakan fruit paste extract obtained by concentrating a rakan fruit extract into a paste form is diluted and used for beverages. This is because, when the rahan fruit extract is used without being concentrated, it is costly to store and transport the rahan fruit extract, and microorganisms are easily generated in the rahan fruit extract, and the quality of the rahan fruit extract is likely to deteriorate.
[0017]
However, Rahan fruit extract has the following drawbacks. In other words, it has a very unpleasant sensation when eating and drinking because it has a charcoal taste peculiar to Rakan fruit, such as brown sugar, peculiar smell, bitterness and sweetness. Furthermore, since the food and drink is colored yellowish brown by the addition of Rakan fruit extract, it is often not suitable for food use.
[0018]
As described above, natural high-intensity sweeteners have high safety, but on the other hand, sweetness is insufficient as a sweetener used alone as a substitute for sucrose.
[0019]
On the other hand, for improving the taste quality of Rahan fruit extract, syrup containing Rakan fruit glycoside and erythritol, which is obtained by fractionating, purifying and powder-drying only the sweet ingredients contained in Rahan fruit extract, has the characteristics of conventional Rahan fruit extract. It is described that it is suitable as a low-calorie syrup because it has a unique charity, odor, bitterness, sweetness persistence and good sweetness (Japanese Patent Laid-Open No. 11-46701; Patent No. 3110005).
[0020]
Furthermore, the sweetness of the composition in which the total content of mogroside V, mogroside IV, 11-oxo-mogroside V and siamenoside I is 33% by weight or more as the sweetening component of Rahan fruit glycoside is close to the sweetness of sucrose. There is also a report (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2001-211184).
[0021]
However, even though these sweeteners are high-purity Rakan fruit glycosides, when compared with the sweetness of sucrose, any of the “bitterness, backlash, persistentness, habit, astringency, and refreshing sensation” It is not equivalent to sucrose in the item, and is insufficient as a sweetener used as a substitute for sucrose. Therefore, in order to further expand the consumption scale and usage of these sweeteners, it has been desired to improve and improve the sweetness quality of these sweeteners.
[0022]
[Problems to be solved by the invention]
A high-intensity sweetener that can substantially suppress energy compared to sucrose, has a sweetness very close to that of sucrose, is highly safe, and is physiological and physical compared to conventional sweeteners An object of the present invention is to provide a high-intensity sweetener that is not inferior in its characteristics.
[0023]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive research in order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have added more sugar residues to the Luohan Glycosides, thereby making it possible to “bitter, postpone, persistent” It is improved in the taste quality item of `` Saku, habit, astringency and refreshing feeling '', has a sweetness very close to sucrose for any evaluation, and has physiological characteristics and The present inventors have found that a novel high-intensity sweetener that is inferior in physical properties can be obtained, and based on this, the present invention has been completed.
[0024]
Furthermore, the present inventors reacted with cyclodextrin synthase (EC 2.4.1.19; also called cyclodextrin / glucanotransferase or cyclomaltodextrin / glucanotransferase; hereinafter abbreviated as “CGTase”). When used, highly glycosylated compounds in which one or more glucose residues are α-bonded to the Rakan fruit glycoside (also referred to herein as “glycosylated Rakan glycosides”) are very efficient. It was found that it can be manufactured inexpensively.
[0025]
In the highly glycosylated compound of the present invention, one or more glucose residues are α-bonded to Rahan fruit glycoside.
[0026]
In one embodiment, the number of glucose residues may be 1 to 45.
[0027]
In one embodiment, the number of glucose residues may be 1-15.
[0028]
In one embodiment, the hyperglycosylated compound may be selected from the group consisting of:
[0029]
[Chemical Formula 10]

[0030]
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[0031]
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[0032]
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[0033]
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[0034]
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[0035]
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[0036]
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[0037]
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In one embodiment, one or more glucose residues may be α-linked to mogroside V in the hyperglycosylated compound.
[0038]
The food composition of the present invention contains the above-mentioned highly glycosylated compound.
[0039]
The sweetener of the present invention contains the above highly glycosylated compound.
[0040]
The pharmaceutical composition of the present invention contains the above highly glycosylated compound.
[0041]
The composition for quasi drugs of the present invention contains the above highly glycosylated compound.
[0042]
The cosmetic composition of the present invention contains the above highly glycosylated compound.
[0043]
The method for producing a highly glycosylated compound of the present invention includes the step of contacting Rahan fruit glycoside with α-glucan and glycosyltransferase to obtain a highly glycosylated compound.
[0044]
In one embodiment, the glycosyltransferase can be a cyclodextrin synthase.
[0045]
In one embodiment, the Rahan fruit glycoside may be mogroside V.
[0046]
The highly glycosylated compounds of the present invention are obtained by the method described above.
[0047]
According to the present invention, a method for producing a highly glycosylated compound in which 1 to 4 glucose residues are α-bonded to Rahan fruit glycoside, the Rahan fruit glycoside is contacted with α-glucan and glycosyltransferase, A step of obtaining a highly glycosylated compound in which 5 or more glucose residues are α-bonded to the Rahan fruit glycoside, and a highly glycosylated compound in which 5 or more glucose residues are α-bonded to the Rahan fruit glycoside And a glucolytic enzyme is contacted to obtain a highly glycosylated compound in which 1 to 4 glucose residues are α-bonded to the Rahan fruit glycoside.
[0048]
In one embodiment, the carbohydrase may be selected from the group consisting of glucoamylase, β-amylase and α-amylase.
[0049]
In one embodiment, the Rahan fruit glycoside may be mogroside V.
[0050]
The highly glycosylated compound having 1 to 4 glucose residues α-linked according to the present invention can be obtained by the above method.
[0051]
The method for improving the taste of a sweetener containing Rahan fruit glycoside of the present invention includes a step of bringing the sweetener into contact with α-glucan and a glycosyltransferase.
[0052]
The sweetener with improved taste quality of the present invention is obtained by the above method.
[0053]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0054]
<Highly glycosylated compound>
In the highly glycosylated compound of the present invention, one or more glucose residues are generally α-bonded to Rahan fruit glycoside.
[0055]
As used herein, “highly glycosylated compound” refers to a compound having the structure of the following chemical structure 1:
(Chemical structure 1)
[0056]
Embedded image

Where R ₁ Is -Glc-Glc- (Glc) n, where n is an integer of 1 or more, or
R ₂ Is -Glc-Glc- (Glc) m, where m is an integer of 1 or more, or
R ₂ Is
[0057]
Embedded image

And h + k is an integer of 1 or more,
R _3a Is —OH and R _3b Is -H or
R _3a And R _3b Together with = O, and
Glc represents a glucose residue.
[0058]
Here, O atom and R ₁ Bond between and O atom and R ₂ Bond between and R ₁ The bond between the first and second glucose residues of ₂ R when there is a branch ₂ The bond between the first glucose residue and the branched glucose residue is a β bond. The bonds between other glucose residues are α bonds. Even if not specifically mentioned in this specification, the relationship of these bonds is maintained.
[0059]
In the present specification, “Rahan fruit glycoside” refers to any glycoside contained in Rahan fruit, and has high sweetness such as mogroside V, mogroside IV, 11-oxo-mogroside V, siamenoside I and the like. Includes the body. Mogroside V is preferable. In general, a mixture containing mogroside V as a main component and a small amount of mogroside IV, siamenoside I and 11-oxo-mogroside V is easily available and can be used in the present invention.
[0060]
Even if the rahan fruit glycoside is mixed with other ingredients derived from the rahan fruit glycoside other than the rahan fruit glycoside compound (eg, aglycone and water), the production of the compound of the present invention is allowed. As used herein, the term “glycoside” also includes a mixture of glycosides. Luohan fruit glycoside is the main cause of sweetness of Luo Han fruit. Rakan fruit glycosides are contained in several kinds in Rahan fruit fruit, but the main content is the four glycosides having the structure shown in chemical structure 2 below (Takemoto, Aihara, Nakajima) Okuhira, Pharmaceutical Journal 103: 1151-1154 (1983); Takemoto, Aihara, Nakajima, Okuhira, Pharmaceutical Journal 103: 1155-1166 (1983); K. Matsumoto, R. Kasai, K. Ohtani and O. Tanaka, Chem. Pharm.Bull., 38: 2030-2032 (1990); and R. Kasai, R.-L. Nie, K. Nashi, G.-D. Tao and O. Tanaka, Agric. Biol. : 3347-3349 (1987)).
[0061]
For example, in Mogroside V, R against the skeleton represented by the following chemical structure 2 ₁ 2 and R ₂ Or a compound in which one or more glucose residues are further bound, ie, R ₁ And R ₂ A compound having a total of 6 or more glucose bound thereto is called a highly glycosylated compound.
[0062]
(Chemical structure 2)
[0063]
Embedded image

Of the Luohan fruit glycoside mixture obtained from ordinary Luohan fruit, the highest content is a glycoside called Mogroside V, and its sweetness intensity is about 300 times that of sucrose. Rakan fruit glycosides other than Mogroside V also have high sweetness intensity.
[0064]
The sugar residue bound to the Rahan fruit glycoside is any sugar residue that can bind to the Rahan fruit glycoside. Examples of such sugar residues include glucosyl group, fructosyl group, galactosyl group, mannosyl group, xylosyl group, arabinosyl group, N-acetylglucosaminyl group, N-acetylgalactosaminyl group, glucosaminyl group, galactosaminyl group , Glucuronyl group, galacturonyl group, rhamnosyl group and the like. The sugar residue is preferably a glucosyl group.
[0065]
The bond between the Rahan fruit glycoside and the sugar residue may be an α bond or a β bond, but is preferably an α bond, and more preferably an α-1,4 bond.
[0066]
The sugar residue is R in the chemical structure 1 above. ₁ Β-D-glucopyranosyl terminal or R ₂ The β-D-glucopyranosyl terminus of each is bound to Rahan fruit glycoside. When multiple sugar residues are attached, these sugar residues are R ₁ Or R ₂ Or may be bonded to only one of R ₁ And R ₂ It may be divided into both and combined. R ₂ When there are two β-D-glucopyranosyl termini, they may be bound to one of them or both.
[0067]
The number of sugar residues bound to the Rahan fruit glycoside is R ₁ And R ₂ The total number of sugar residues bonded to can be any number, but is typically 1 to 45, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 15, more preferably Is 1 to 12, more preferably 1 to 4. Typically R ₁ And R ₂ The number of sugar residues bonded at each position is from 1 to 15, preferably from 1 to 5, and more preferably from 1 to 4. R ₂ When there are two β-D-glucopyranosyl ends, the number of the first β-D-glucopyranosyl ends is preferably 1-15, more preferably 1-5, and still more preferably 1-4. And the number of bonds to the second β-D-glucopyranosyl terminus is preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5, and still more preferably 1 to 4. If the number of sugar residues bound to the Rahan fruit glycoside is too large, the sweetness intensity of the resulting highly glycosylated compound tends to be slightly reduced. When the number of sugar residues bound to the Luohan Glycoside is in the range of 1 to 4, the sweetness intensity is substantially the same as that of the Luohan Glycoside, and the sweetness is higher than that of the Luohan Glycoside. Is very preferable.
[0068]
The highly glycosylated compound of the present invention in which one or more glucose residues are α-bonded to the Rahan fruit glycoside is generally represented by the following “chemical structure 3”.
[0069]
(Chemical structure 3)
[0070]
Embedded image

Among these highly glycosylated compounds, a highly glycosylated compound in which 1 to 4 glucose residues are α-bonded to the Rahan fruit glycoside (hereinafter referred to as “partially degraded glycosylated Rahan glycoside” Is also represented by the following “Chemical Structure 4”.
[0071]
(Chemical structure 4)
[0072]
Embedded image

The highly glycosylated compound of the present invention preferably has a structure selected from the group consisting of Compound Nos. 1-34 above.
[0073]
Although the Rakan fruit glycoside part in the highly glycosylated compound of the present invention can be derived from any Rakan fruit glycoside, it is preferably derived from Mogroside V.
[0074]
The highly glycosylated compound of the present invention may be pure consisting of only one compound or a mixture of a plurality of highly glycosylated compounds.
[0075]
<Raw material for highly glycosylated compounds>
Examples of the raw material for the highly glycosylated compound of the present invention include Rahan fruit glycoside, sugar donor substrate, glycosyltransferase and saccharide-degrading enzyme.
[0076]
Luohan Glycoside may be provided as a pure Luohan Glycoside Compound or Luohan Glycoside Glycoside Compound, or as a less pure Luohan Glycoside containing composition containing a substance other than Luohua Glycoside Compound. May be. The Rahan fruit glycoside may consist of only one kind of Rahan fruit glycoside compound (for example, Mogroside V), or a mixture of plural kinds of Rahan fruit glycoside compounds (for example, Mogroside V, Mogroside IV, Siamenoside I, 11-oxo-mogroside V mixture).
[0077]
The Aragon fruit glycoside-containing composition may be used in any purity as long as it contains the Rahan Fruit Glycoside. Based on the weight of the composition, the Rahan fruit glycoside is about 5% by weight or more, preferably about 10% by weight or more, more preferably about 15% by weight or more, more preferably about 20% by weight or more, more preferably about 30% by weight or more, more preferably about 40% by weight or more, more preferably about 50% by weight or more. If the content of the Rahan fruit glycoside is too small, the amount of the highly glycosylated compound of the present invention obtained may be too small. The Rahan fruit glycoside may be a pure product, but the cost may be too high when using a pure product.
[0078]
Examples of the composition containing Rahan fruit glycoside include a crude extract of Rahan fruit, a partially purified product, and a purified product of each glycoside component. Rahan fruit glycoside is generally in the form of yellow to tan powder. Since the fructose contained in the crude extract cannot be a receptor substrate for the glycosyltransferase used in the present invention, there is no problem even if it is contained in a high concentration in the Rakan fruit glycoside-containing composition. A commercially available product may be used as the Rakan fruit glycoside-containing composition, or it may be produced. The Rahan fruit glycoside-containing composition can be produced using extraction methods and separation methods known to those skilled in the art.
[0079]
Rahan fruit glycosides, for example, by washing, pulverizing the fruit of Luo Han fruit and performing extraction, extraction, water, filtration, column absorption, column separation, recovery, concentration, drying, etc. Manufactured. Rahan fruit glycoside is commercially available in Japan. The Rahan fruit glycoside-containing composition can be produced, for example, by the following method. Methanol extract of Rakan fruit is obtained. Methanol extract is mixed with water and degreased with n-hexane. The degreased methanol extract is subjected to column chromatography and eluted successively with water 100%, 80% methanol, 100% methanol and acetone to obtain an 80% methanol fraction which is a crude glycoside fraction. The obtained crude glycoside fraction is dissolved in methanol, mixed with silica gel, dried, and then this silica gel is eluted with a chloroform-methanol mixed solvent to obtain a glycoside fraction. The obtained glycoside fraction may be used as a Rakan fruit glycoside-containing composition or may be further purified. In the case of further purification, for example, a glycoside fraction with higher purity can be obtained by subjecting the obtained glycoside fraction to liquid chromatography.
[0080]
It is preferable that the composition containing Ganhan fruit glycoside is substantially free of substances that give an unfavorable taste, odor and the like to the resulting mixture containing the highly glycosylated compound. “Substantially free” means that the resulting mixture containing the highly glycosylated compound is such an amount that no unpleasant taste, odor or the like is felt when it is subjected to a sensory test.
[0081]
In a reaction system in which Rahan fruit glycoside is brought into contact with glucan and glycosyltransferase, for example, when a purified Rakan fruit product containing about 30% of mogroside V is used, the concentration range is typically 1 to 70% (w / v) (in this case, mogroside V is 0.3-21% w / v), preferably 5-40% (w / v) (in this case, mogroside V is 1.5-12% (w / V)). The total weight of the Rahan fruit glycoside compound in the reaction system is typically 0.01 to 50% (w / w), preferably 0.05 to 40% (w / w), more preferably 0.2 to 20. % (W / w). These concentration ranges should be determined experimentally according to the content of the Rahan fruit glycoside in the composition containing the Han Han glycoside to be used, but are not limited thereto. In the case of using a composition containing a rahan fruit glycoside containing a high concentration of the rahan fruit glycoside (ie, sugar acceptor substrate), the concentration of the sugar donor substrate, the enzyme concentration, the reaction time, and the reaction temperature are appropriately increased. It is preferable.
[0082]
As used herein, “sugar donor substrate” refers to a substance that can give a sugar residue to another molecule. Examples of sugar donor substrates include glycans (ie polysaccharides or oligosaccharides) and glycosides. As used herein, “glycan” refers to a compound produced by dehydration condensation of two or more monosaccharides. Usually, a compound produced by dehydration condensation of 2 to 9 monosaccharides is called an oligosaccharide, and a compound produced by dehydration condensation of 10 or more monosaccharides is called a polysaccharide. The glycan may be a simple polysaccharide or a complex polysaccharide. A simple polysaccharide refers to a polysaccharide whose monosaccharide as a constituent unit is one kind. A complex polysaccharide refers to a polysaccharide having two or more types of monosaccharides as structural units. Examples of glycans include glucan, galactan, mannan, xylan, arabinan, chitin and chitosan.
[0083]
As used herein, “glucan” refers to a polysaccharide composed of D-glucose. Glucan is divided into α-glucan and β-glucan depending on the arrangement of anomeric carbon atoms of glucose residues. The glucan is preferably α-glucan. Examples of α-glucan include starch, amylose, amylopectin, dextrin, cyclodextrin, glycogen, dextran, pullulan, nigeran, isoligenan and their contents. Examples of starch include soluble starch, potato starch, corn starch, tapioca starch and the like. As the sugar donor substrate, malto-oligosaccharides such as maltose and maltotriose or a mixture thereof, low molecular weight dextrin, etc. can be used. In this case, the amount of reducing sugar in the product is reduced to starch or the like. It becomes higher than the case of using a high molecular weight glucan. When a high molecular weight glucan is used, it is preferable not to contain a reducing sugar that can be a good acceptor substrate for CGTase such as glucose and maltose in order not to reduce the yield of glycosylated Rakan fruit glycoside. When preparing a solution of a substrate containing a polysaccharide that is difficult to dissolve in water, such as starch, it is preferable to sufficiently gelatinize the starch by boiling before adding the glycosyltransferase.
[0084]
An example of β-glucan is cellulose.
[0085]
In the present specification, the “glycoside” refers to a compound produced by dehydration condensation of sugar and a substance other than sugar. Examples of glycosides include phenyl α-glucoside, paranitrophenyl, β-galactoside and the like.
[0086]
The sugar donor substrate is 0.1 to 50% (w / v), preferably 1 to 30% (w) in this reaction system when the Rahan fruit glycoside is contacted with the sugar donor substrate and the transferase. / V) is preferably used so as to be in a concentration range, but is not limited thereto. In the reaction system used in the production method of the present invention, if the sugar donor substrate concentration is about ½ to ¼ of the acceptor substrate concentration, a sufficiently high synthesis rate of the glycosylated Rahan fruit glycoside (in the reaction) 80% to 90%) can be achieved when the receptor substrate used is 100%. When a high-concentration sugar donor substrate is used, sugar residues with a long chain length are transferred to the sugar acceptor substrate at the beginning of the reaction, and sugar residues with a short chain length are removed by disproportionation over time. Since it is transferred to a sugar acceptor substrate, if the reaction is stopped at an early stage, a product containing a large amount of glycosylated product having a high degree of polymerization of glucose residues can be obtained. Furthermore, as the reaction time elapses, the proportion of glycosylated products having a low degree of polymerization of glucose residues gradually increases. In these cases, however, it is desirable to determine by performing preliminary experiments, as a matter of course, depending on other conditions such as an appropriate enzyme concentration and reaction temperature.
[0087]
As used herein, “glycosyltransferase” refers to an enzyme having the ability to transfer a sugar residue from a sugar donor substrate to a sugar acceptor substrate. Any conventionally known glycosyltransferase can be used in the present invention. Examples of glycosyltransferases include cyclodextrin synthase (CGTase), α-galactosidase, β-galactosidase, β-fructosidase, α-glucosidase, α-mannosidase, β-mannosidase, α-amylase, α-pullulanase, Dextrin dextranase, D enzyme, amylomaltase, dextranase, phosphorylase, sucrose phosphorylase, maltose phosphorylase, trehalose phosphorylase, α-glucosyltransferase, amylosucrase, dextransucrase, levansucrase, inulinase, levanfructotransferase, galactanase, α-galactosidase, β-galactosidase, mannanase, xylanase, arabinase, cellulase, α-xylosidase, -Xylosidase, α-arabinosidase, cyclodextran synthase, lysozyme, agarase, laminarinase, lichenase, β-glucuronidase, α-glucuronidase, hyaluronidase, chitosanase, chitinase, N-acetylhexosaminidase, rhamnosidase and α-fucosidase Can be mentioned.
[0088]
As the glycosyltransferase, CGTase is more preferable. This is because CGTase can catalyze glycosylation of Rahan fruit glycoside with very high efficiency. Depending on the reaction conditions, CGTase can glycosylate more than 90% of the Rakan fruit glycosides used in the reaction. This high efficiency is attributed to the fact that CGTase hardly catalyzes the hydrolysis reaction that competes with the transglycosylation reaction. With normal hydrolases, both hydrolysis and transfer occur at a certain rate. In CGTase, hydrolysis occurs only within 5% of the Luohan Glycoside used in the reaction. Rahan fruit glycoside can be a very good receptor substrate in the method of the present invention using CGTase.
[0089]
As CGTase, any commercially available CGTase may be used, or CGTase may be purified from a microbial cell, a microorganism culture (for example, culture supernatant), or the like. Examples of commercially available CGTase include CGTase derived from Bacillus stearothermophilus (manufactured by Hayashibara Biochemical Research Co., Ltd.), Thermoanaerobacter or Thermoanaerobacter sp., Thermoanaer sp. ) Derived from CGTase (“CGTase ACN0002” manufactured by Novo Nordisk Industries, Japanese Patent Application No. 2-500247, BE Norman and ST Jφrensen, Denpun Kagaku, 1992; 39: 101-108, book In the description below, CGTase derived from "Thermoanaerobacter genus" and Bacillus circul ans) -derived CGTase (Hayashibara Biochemical Laboratories), Bacillus macerans-derived CGTase (“Contizyme” manufactured by Amano Enzyme), and CGTase derived from Brevibacterium sp. (Amano Enzyme Inc.) Manufactured) and the like. Since CGTase is an enzyme that is manufactured and sold industrially by a plurality of manufacturers, it can be obtained relatively inexpensively and in large quantities, and can be appropriately selected from enzymes having different origins.
[0090]
As the α-galactosidase, any commercially available α-galactosidase may be used, or α-galactosidase may be purified from a microbial cell, a microorganism culture (for example, a culture supernatant), or the like. Examples of commercially available α-galactosidase include α-galactosidase derived from Mortiella vinacea (manufactured by Sigma), α-galactosidase derived from almond (manufactured by Sigma), and Aspergillus niger derived from Aspergillus niger. Examples include α-galactosidase (manufactured by Amano Enzyme). α-Galactosidase uses melibiose, raffinose or the like as a sugar donor substrate.
[0091]
As β-galactosidase, any commercially available β-galactosidase may be used, or β-galactosidase may be used after being purified from microbial cells, microbial cultures (for example, culture supernatant) and the like. Examples of commercially available β-galactosidase include β-galactosidase derived from Escherichia coli (Sigma), Aspergillus oryzae derived from Aspergillus oryzae (manufactured by Yakult Honsha), Penicillium multi Examples thereof include β-galactosidase derived from color (Penicillium multicolor) (manufactured by Keiai Kasei Co., Ltd.), and β-galactosidase derived from Bacillus circulans (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.). β-galactosidase uses lactose, galactooligosaccharides, and galactoside glycosides as sugar donor substrates.
[0092]
Any commercially available β-fructosidase may be used as β-fructosidase, or β-fructosidase may be purified from a microbial cell, a microorganism culture (for example, culture supernatant), or the like. May be. Examples of commercially available β-fructosidase include β-fructosidase derived from the genus Arthrobacter (BICO (manufactured by Shimizu Minato Sugar)), Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae, baker's yeast, beer yeast) ) -Derived β-fructosidase (manufactured by Sigma), β-fructosidase derived from Aspergillus niger (Aspergillus niger) (Hidaka, Hirayama; “Chemistry and Biology”, 23, 600 (1985)) Can be mentioned. β-fructosidase uses sucrose, fructooligosaccharide and the like as a sugar donor substrate.
[0093]
As the α-glucosidase, any commercially available α-glucosidase may be used, or α-glucosidase may be used after being purified from a microbial cell, a microorganism culture (for example, culture supernatant) or the like. Examples of commercially available α-glucosidases include α-glucosidase derived from Aspergillus niger (manufactured by Amano Enzyme), and α-glucosidase derived from Bacillus stearothermophilus (manufactured by Sigma). , Α-glucosidase (manufactured by Sigma) derived from Saccharomyces cerevisiae. α-Glucosidase uses maltose, dextrin or the like as a sugar donor substrate.
[0094]
As the α-mannosidase, any commercially available α-mannosidase may be used, or natural α-mannosidase may be purified from a microbial cell, a microorganism culture (for example, a culture supernatant), or the like. As an example of the commercially available α-mannosidase, α-mannosidase (manufactured by Sigma) derived from Tachinama Bean is mentioned. α-Mannosidase uses mannoside glycosides, manno-oligosaccharides and the like as sugar donor substrates.
[0095]
The glycosyltransferase may be of any purity as long as it does not contain other enzyme activity that adversely affects the glycosyltransferase reaction. As long as the glycosyltransferase can exhibit its glycosyltransferase activity, it can be used in any form such as a simple inclusion or an immobilized enzyme.
[0096]
The amount of glycosyltransferase can be any amount as long as it can catalyze the glycosyltransferase reaction to Rahan fruit glycoside. The appropriate amount can be appropriately determined by one skilled in the art. Preferably it is 0.01-10000 unit per 1g of substrate, More preferably, it is 0.1-5000 unit. For example, when CGTase used for the transglycosylation reaction is CGTase derived from the genus Bacillus stearothermophilus or Thermoanaerobacter, 0.1 to 2000 units per 1 g of starch is preferable.
[0097]
The greater the amount of glycosyltransferase, the shorter the reaction time required for the glycosyltransferase reaction. When CGTase derived from Bacillus macerans is used, even if the reaction is carried out at a lower temperature (50 ° C.) than CGTase derived from Bacillus stearothermophilus or Thermoanaerobacter, the yield is almost the same as CGTase from other sources. Glycosylated Rahan fruit glycoside can be obtained at a high rate.
[0098]
In one embodiment, once a highly glycosylated compound in which 5 or more glucose residues are bound to the Luohan Glycoside is produced, 1 to 4 glucoses are added to the LuoGang Glycoside by the action of a saccharide-degrading enzyme. Produce highly glycosylated compounds with attached residues.
[0099]
<Highly glycosylated compound in which 1 to 4 glucose residues are bound to Rahan fruit glycoside>
Any saccharide-degrading enzyme can be used for the production of the partially degraded glycosylated Rakan fruit glycoside. Examples of such saccharide-degrading enzymes include α-amylase, β-amylase, glucoamylase, α-glucosidase, maltotriose-generating amylase, maltotetraose-generating amylase, maltopentaose-generating amylase, maltohexaose-generating amylase, isoform Examples include amylase and pullulanase, but the amylase and pullulanase are not limited to these as long as they have an action of shortening the glycosyl sugar chain bound to Luohan Glycoside.
[0100]
α-Amylase is an amylase that hydrolyzes the inside of a sugar chain of a glycosyl group at random. As the α-amylase, any commercially available α-amylase may be used, or α-amylase may be purified from a microbial cell, a microorganism culture (for example, a culture supernatant), or the like. Examples of commercially available α-amylase include α-amylase derived from Bacillus subtilis and α-amylase derived from Aspergillus oryzae (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd. and Novo Nordisk Industries). Can be mentioned.
[0101]
In particular, α-amylase having a strong saccharification power is more advantageous for producing a partially decomposed glycosylglycoside glycoside than amylase having a strong liquefaction power of starch.
[0102]
β-amylase is an amylase that hydrolyzes at a maltose unit from the non-reducing terminal side of a glycosyl group. As the β-amylase, any commercially available β-amylase may be used, or β-amylase may be purified from a microbial cell, a microorganism culture (for example, a culture supernatant) or the like. Examples of commercially available β-amylases include barley-derived β-amylase, wheat-derived β-amylase, soybean-derived β-amylase (manufactured by Amano Enzyme and Nagase Chemtech), and sweet potato-derived β-amylase. (Manufactured by Sigma).
[0103]
Glucoamylase is an amylase that hydrolyzes in units of glucose from the non-reducing terminal side of the glycosyl group. As the glucoamylase, any commercially available glucoamylase may be used, or the glucoamylase may be purified from a microbial cell, a microorganism culture (for example, a culture supernatant), or the like. Examples of commercially available glucoamylases include glucoamylase derived from Rhizopus niveus (manufactured by Seikagaku Corporation) and glucoamylase derived from Aspergillus niger (produced by Hankyu Bioindustry).
[0104]
<Other ingredients>
Any solvent can be used as the solvent. For example, water can be used.
[0105]
The pH of the reaction solution during the transglycosylation reaction and the partial decomposition reaction can be arbitrarily set as long as the enzyme that catalyzes each reaction can act, but is typically 3 to 11, preferably Is in the range of 5-7. The pH of the reaction solution can be appropriately adjusted in consideration of the optimum pH of the enzyme used for the reaction. A method for adjusting the pH of the reaction solution is well known to those skilled in the art.
[0106]
A buffer solution is not always necessary, but any buffer solution may be used as necessary. For example, 10-500 mM acetate buffer and phosphate buffer in the above pH range can be used.
[0107]
Even if the reaction system contains about 5-10% (v / v) of water-soluble organic solvent such as methanol, ethanol, isopropanol, etc., the yield of highly glycosylated compound is hardly affected, but very weak acceptance Since it becomes a body substrate, it is desirable that it does not exist. The addition of a metal salt such as calcium or magnesium 2 is not particularly required.
[0108]
<Method for producing highly glycosylated compound>
In the method for producing the compound of the present invention, unless otherwise specified, a glycoside extraction and fractionation method, a sweetener preparation method, and the like known in the art can be employed. These techniques can be performed using a commercially available column or the like.
[0109]
The highly glycosylated compound of the present invention is produced by a method comprising the step of contacting Rahan fruit glycoside with a sugar donor substrate such as glucan and a glycosyltransferase to obtain a highly glycosylated compound. Typically, the highly glycosylated compound of the present invention is obtained by a method comprising the step of contacting Rahan fruit glycoside with a sugar donor substrate such as α-glucan and a glycosyltransferase to obtain a highly glycosylated compound. Manufactured.
[0110]
In the method of the present invention, first, a sugar donor substrate such as Rahan fruit glycoside and glucan and a glycosyltransferase are mixed. The order of mixing is performed in an arbitrary order. That is, after first mixing the sugar donor substrate with the Rahan fruit glycoside, it may be mixed with a glycosyltransferase, or after first mixing the Rakan fruit glycoside and the glycosyltransferase, A sugar donor substrate may be added to and mixed with this. First, the glycosyltransferase and the sugar donor substrate may be mixed, and then the Rahan fruit glycoside may be added thereto and mixed. A glycoside, a sugar donor substrate, and a glycosyltransferase may be mixed together. When an enzyme other than CGTase is used as a glycosyltransferase, and the Luohan fruit glycoside is added after mixing the glycosyltransferase and the sugar donor substrate, the mixture of the glycosyltransferase and the sugar donor substrate is used. The time until the addition of is preferably as short as possible. The mixing may be carried out using any method as long as the Rahan fruit glycoside, sugar donor substrate and glycosyltransferase are substantially uniformly confused, and the mixing time is appropriately selected. Can be done.
[0111]
By mixing in this way, Rahan fruit glycoside, sugar donor substrate and glycosyltransferase can come into contact. During contact, the mixture is preferably kept at a temperature suitable for the transglycosylation reaction. The reaction temperature is typically 10 to 100 ° C, preferably 40 to 90 ° C. The reaction temperature suitable for the glycosyltransferase used is known to those skilled in the art and can be appropriately selected by those skilled in the art. For example, CGTase derived from Bacillus stearothermophilus or Thermoanaerobacter is highly heat-resistant, so CGTase derived from Bacillus stearothermophilus is CGTase derived from Thermoanaerobacter for several days in a reaction at 80 ° C. Can be used for several days in a 90 ° C reaction. On the other hand, CGTase derived from Bacillus macerans is not so high in heat resistance, and is preferably used at a reaction temperature of 50 ° C. or lower.
[0112]
The time for contacting the Rahan fruit glycoside with the sugar donor substrate and glycosyltransferase can be appropriately selected by those skilled in the art in consideration of the glycosyltransferase used. The contact time is typically 5 minutes to 10 days, preferably 30 minutes to 5 days, more preferably 1 hour to 3 days.
[0113]
By bringing the Rahan fruit glycoside into contact with a sugar donor substrate and glycosyltransferase, a glycosyl residue is transferred to the Luhan fruit glycoside, and one or more glucose residues are bound to the Luhan fruit glycoside. Certain highly glycosylated compounds are formed. The reaction system containing the highly glycosylated compound may be used as it is for the intended use, or may be subjected to a treatment for inactivating the glycosyltransferase to prevent further glycosyltransferase reaction. Highly glycosylated compounds may be partially or fully purified from the system.
[0114]
For example, in the case where Mogroside V, which has the highest content in Rahan fruit glycoside, is contacted with starch and CGTase, each R of the above chemical structure 1 is caused by the action of CGTase. ₁ , R ₂ The number of glucose residues newly bound to a plurality of glucose residues (i.e., the degree of polymerization) is usually 1 to 15 respectively, and those having 1 to 5 are relatively large. However, these ratios are not limited because they vary depending on the reaction conditions. By using CGTase, the anomeric form of the bond between the glucose residue of mogroside V and the newly bonded glucose residue is limited to the α form. When the degree of polymerization of newly bonded glucose residues obtained by the action of CGTase is 2 or more, the binding mode between glucose residues is usually only α-1,4 bonds, but α-1,4 Six bonds (ie, branched structures) may be formed.
[0115]
A highly glycosylated compound in which 5 or more glucose residues are α-bonded to the Luohan fruit glycoside is a highly glycosylated compound in which 1 to 4 glucose residues are α-bonded to the Luohan fruit glycoside (ie, In order to obtain a partially degraded glycosylated Rakan fruit glycoside, it can be contacted with a saccharide-degrading enzyme.
[0116]
The glycosylated Rakan fruit glycoside can be brought into contact with the saccharide-degrading enzyme, for example, by being mixed with the saccharide-degrading enzyme in an aqueous solution or the like. The reaction solution containing the glucosylated Rahan fruit glycoside may be mixed with the saccharide-degrading enzyme as it is, but it is preferably mixed with the saccharide-degrading enzyme after a treatment for removing or deactivating the glycosyltransferase. . Examples of the treatment for inactivating the glycosyltransferase include heating, pH change, and addition of an organic solvent such as ethanol. An example of heating is boiling for 15 minutes. Normal glycosyltransferase is almost inactivated by boiling for 15 minutes. When the glycosylated Rahan fruit glycoside is treated with a saccharide-degrading enzyme after inactivating the glycosyltransferase by adding an organic solvent, it is preferable to distill off the organic solvent before adding the saccharide-degrading enzyme. . When the glycosylated Rahan fruit glycoside is brought into contact with a saccharide-degrading enzyme without any treatment for inactivation, glucose, oligosaccharide, etc. produced by the degradation reaction of the saccharide-degrading enzyme are sugar acceptors for the transglycosylation reaction. Since the glycosylated Rakan fruit glycoside once produced serves as a sugar donor substrate and can be returned to the Rakan fruit glycoside, the yield of the partially degraded glycosylated Rahan glycoside may be reduced.
[0117]
During the contacting of the glycosylated rahan glycoside with the saccharide-degrading enzyme, the mixture can be maintained at a temperature suitable for hydrolysis of the glycosyl residue by the saccharide-degrading enzyme. A suitable temperature range is typically 30-80 ° C.
[0118]
If the pH of the mixture during the contact between the glycosylated Rahan fruit glycoside and the saccharide-degrading enzyme is in the range of about pH 5 to 7 in which the glycosyltransferase reaction was carried out, it is not necessary to adjust the pH again, and it is continued as it is. Thus, a partial decomposition reaction can be performed.
[0119]
The time for contacting the glycosylated Rahan fruit glycoside with the saccharide-degrading enzyme takes into consideration the nature of the saccharide-degrading enzyme used in the hydrolysis reaction and the composition of the desired partially degraded glycosylated Luhan fruit glycoside, or in the relevant field. Can be appropriately determined by those skilled in the art by measuring the degree of progress of the reaction using known methods. The degree of production of the partially degraded glycosylated Rakan fruit glycoside can be measured (quantitative analysis, etc.) using, for example, high performance liquid chromatography (HPLC) or thin layer chromatography (TLC).
[0120]
In this way, a partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside can be obtained, but the mixture containing the partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside may be used as it is for the intended purpose, or the saccharide-degrading enzyme may be inactivated. The partially digested glycosylated Rakan fruit glycoside may be partially or completely purified. An example of the treatment for deactivating the saccharide-degrading enzyme is boiling.
[0121]
<Method for isolation, analysis and identification of highly glycosylated compound>
The highly glycosylated compounds of the present invention can be analyzed by methods known in the art. Examples of such analytical methods include high performance liquid chromatography (HPLC), TLC, silica gel chromatography and the like.
[0122]
Examples of columns that can be used for HPLC include amide-based columns. Examples of the amide column include Asahi Pack NH2P-50 (manufactured by Shodex), amide 80 (manufactured by Tosoh Corporation), and the like. When using these columns, it is preferable to add the same volume of acetonitrile, ethanol, or the like to the sample solution to be analyzed, and previously remove unreacted high molecular weight glucan or the like as a precipitate.
[0123]
Eluents that can be used for HPLC include aqueous acetonitrile, typically 55-85% (v / v) aqueous acetonitrile is suitable. A highly glycosylated compound has a longer retention time on the column as the degree of polymerization of the glucose residue bound to the Rahan fruit glycoside increases.
[0124]
Other columns that can be used for HPLC include reverse phase columns. Since the reverse phase column does not require a precipitation treatment, the analytical operation is simpler than when an amide column is used. Examples of the reversed-phase column include YMC-Pack ODS-AQ (manufactured by YMC) and Shim-pack CLC-ODS (manufactured by Shimadzu Corporation). When a reversed-phase column is used, the higher the glycosylated compound with a greater number of glucose residues α-bonded to the Luohan Glycoside, the shorter the retention time on the column, and the Luohan Glycoside, the acceptor substrate, is highly glycosylated. There is a tendency for the retention time to be longer than for the chemical compound.
[0125]
When the reaction solution is analyzed using thin layer chromatography, the analysis can be performed qualitatively as follows, for example. A part of the reaction solution is spotted on a thin layer plate (Kieselgel 60, manufactured by Merck & Co., Inc.) and developed by an ascending method using ethyl acetate: acetic acid: water (3: 1: 1, v / v) as a developing solvent. After an appropriate time (typically 5 minutes to 1 hour, more preferably 15 minutes to 30 minutes) has elapsed since the start of development, the thin layer plate is taken out of the development solvent and allowed to air dry. In order to detect highly glycosylated Rakan fruit glycoside, a 50% sulfuric acid / methanol solution is sprayed on a thin-layer plate after air drying and heated at 120 ° C. Thereby, the part containing a glycoside in a thin layer board changes to brown. As the number of glucose residues bound to the Rakan fruit glycoside increases, the development mobility of the glycosylated Rahan fruit glycoside decreases.
[0126]
The highly glycosylated compounds of the present invention (glycosylated Luogan glycoside and partially degraded glycosylated Luogan glycoside) can be purified using purification methods well known to those skilled in the art. By subjecting the highly glycosylated compound of the present invention to adsorption chromatography using a reverse phase column (for example, ODS), gel filtration chromatography, etc., a small amount of glucose, oligosaccharide, etc. are removed. The purity of the highly glycosylated compound of the present invention can be increased.
[0127]
For example, in ODS chromatography, an ODS column is equilibrated with water. Glucose and short-chain oligosaccharides in the sample are not adsorbed on the ODS column, but are collected in the non-adsorbed fraction and the water-washed fraction. Glycosylated Rahan fruit glycosides can be eluted by increasing the ethanol concentration or methanol concentration in the eluent stepwise or linearly. At that time, the glycosylated Rahan fruit glycoside is eluted in order from the number of glucose residues bound to the Rahan fruit glycoside.
[0128]
The ethanol concentration in the eluent is preferably not more than 90% (v / v) at the highest concentration, and is preferably about 20 to 50% (v / v).
[0129]
Examples of gel filtration carriers that can be used include Sephadex G-15 or Sephadex G-25 (Pharmacia), Biogel P-2 (BioRad), and the like.
[0130]
As an eluent for gel filtration chromatography, distilled water, 5% ethanol, or the like can be used.
[0131]
<Industrial Level Production of Glycosylated Luohan Glycosides or Partially Degraded Glycosylated Luohan Glycosides>
FIG. 1 shows an example of the production process of glycosylated Rakan fruit glycoside and partially degraded glycosylated Rakan glycoside on an industrial level. This example will be described below.
[0132]
The acceptor substrate may be a mixture of any purity such as a crude extract of Rahan fruit, a partially purified product, and a purified product of each glycoside component. Further, since fructose contained in the crude extract cannot serve as a receptor substrate for glycosyltransferase (eg, CGTase), there is no problem even if it is contained in the receptor substrate at a high concentration.
[0133]
Rakanka extract, starch, and CGTase are put into a temperature-controlled reaction kettle with a volume corresponding to the production volume, and the whole volume is made up with water. After reacting at an optimal reaction temperature (for example, 40 ° C. to 90 ° C.) and an optimal reaction time (for example, 6 to 48 hours) according to the CGTase to be used, the temperature is adjusted to 70 ° C. to 100 ° C. according to the heat resistance of the CGTase used. The glycosyltransferase activity is inactivated by heating for 15 minutes. If necessary, a saccharide-degrading enzyme is added and reacted at an optimum reaction temperature (for example, 30 ° C. to 80 ° C.) for the saccharide-degrading enzyme to be used. Linked partially degraded glycosylated Rakan fruit glycosides can also be obtained.
[0134]
Next, the reaction product obtained above was used to separate and purify the highly glycosylated Rahan fruit glycoside or the partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside having 1 to 4 glucose residues bound to it. The product is poured into a column packed with ODS reverse phase resin at an optimum flow rate. After the column is washed with water, the glycosylated Rahan fruit glycoside or the partially decomposed glycosylated Rahan glycoside is eluted with an aqueous solution having an optimal alcohol concentration.
[0135]
In the concentration step, an alcohol recovery vacuum concentrator with a volume corresponding to the amount of the eluate obtained is used for the eluate to recover the alcohol under the optimum vacuum and concentration temperature conditions required for alcohol recovery. Concentrate the eluate. The recovered alcohol is recycled.
[0136]
For the pulverization step, the above concentrated eluate is applied to a spray dryer having a water evaporation amount according to the amount of the concentrated eluate, and the glycosylated or partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside A dry powder product is obtained.
[0137]
The chemical structures of the isolated glycosylated and lysed glycosides and the partially degraded glycosylated glycoside can be confirmed by mass spectrum. The chemical structure of mogroside V confirmed by mass spectrum is shown in chemical structure 4 below. In addition, the coupling | bonding mode between glucose is only (alpha) -1,4 coupling | bonding from the specificity of CGTase, It is not necessary to analyze the isolated product of each polymerization degree in detail by NMR.
[0138]
(Chemical structure 4)
[0139]
Embedded image

In the method of the present invention, since the glycosyltransferase hardly catalyzes the hydrolysis reaction, the ratio of the products having different degrees of polymerization of the sugars bound to the Luhan fruit glycoside changes with the progress of the reaction. The overall yield of is hardly reduced over the course of the reaction time. Therefore, strict control of reaction conditions and frequent monitoring of products during the reaction are unnecessary.
[0140]
Preferably starch is used as the sugar donor substrate. In this case, combined with high glycosylation efficiency, it is possible to reduce the production cost of the glycosylated Rahan fruit glycoside.
[0141]
<Uses of highly glycosylated compounds>
By bringing a sweetener containing the Luhan fruit glycoside into contact with α-glucan and a glycosyltransferase, the Luhan fruit glycoside contained in the sweetener is converted into a highly glycosylated compound. Because the highly glycosylated compound has a good sweetness that is closer to sucrose than the Luohan Glycoside, this improves the sweetness of the sweetener.
[0142]
The highly glycosylated compound of the present invention can be used as a food composition, sweetener, pharmaceutical composition, quasi-drug composition, and cosmetic composition.
[0143]
The food composition of the present invention contains a highly glycosylated compound. As used herein, “food composition” refers to any food that can be used for food. Examples of food compositions include cooked dishes; beverages such as soft drinks, functional drinks and jelly drinks; confectionery such as Western confectionery and Japanese confectionery; dairy products such as yogurt; seasonings; health foods; (Food for specified health use). The content of the highly glycosylated compound in the food composition of the present invention varies depending on the form and use of the food composition, and can be appropriately selected by those skilled in the art. For example, in the case of beverages such as general soft drinks, functional drinks, and jelly drinks, the content of highly glycosylated compounds in the whole drink is typically about 0.001 to about 2.0% by weight, The ratio is preferably about 0.005 to about 1.0% by weight, more preferably about 0.01 to about 0.5% by weight.
[0144]
The food composition of the present invention can be produced using methods known to those skilled in the art. A person skilled in the art can select an appropriate production method depending on the form and type of the food composition. Here, the highly glycosylated compound can be formulated into the food composition in any manner.
[0145]
The highly glycosylated compound contained in the food composition of the present invention is used as a sweetener in place of general sucrose as a food product such as cooked dishes, confectionery, Japanese confectionery, beverages, dairy products, seasonings, etc. It can be widely used for food use, special use food (special health food), and the like. The highly glycosylated compounds of the present invention are particularly useful for the above applications because they are stable to heating, do not cause browning and coloring, and are stable even in acidic foods.
[0146]
The sweetener of the present invention is an energy-inhibiting sweetener containing a highly glycosylated compound. As used herein, “sweetener” refers to a composition used for sweetening foods. The sweetener of the present invention may be a low energy sweetener or a zero energy sweetener. Alternatively, the sweetener of the present invention requires only a very small amount of sweetener because the sweetness intensity is significantly higher than that of sucrose even though the energy per unit weight of the sweetener is almost the same as that of sucrose. It may be a sweetener that can reduce the absolute use amount. According to the Nutrition Improvement Law, energy labels such as “Low”, “Light”, “Hikameme”, “Reduced”, “Cut”, “Off” The energy per 100 g of sweetener is determined to be 40 kcal or less (however, food used for drinking is 20 kcal or less). In the energy display such as “None”, “Zero”, “Non”, the energy per 100 g of sweetener is 5 kcal or less. In a preferred embodiment, the sweetener of the present invention may be a sweetener capable of displaying an emphasis on “zero” or “low” energy per 100 g.
[0147]
The sweeteners of the present invention can be in the form of a liquid (ie, syrup), semi-solid or solid (eg, powdered, granular, crystalline, hexagonal, etc.). A person skilled in the art can appropriately select the form of the sweetener according to the use of the sweetener.
[0148]
The content of the highly glycosylated compound in the sweetener of the present invention varies depending on the form and use of the product, and can be appropriately selected by those skilled in the art. For example, when used as a tabletop solid high intensity sweetener, the sweetener of the present invention may consist of a highly glycosylated compound alone. That is, the content of the highly glycosylated compound can be 100% by weight. When used as a general tabletop powder or granular low energy sweeteners and low energy syrups, the content of highly glycosylated compounds in the entire sweetener is typically about 0.001 to about 5 weights. %, Preferably about 0.005 to about 2% by weight, more preferably about 0.01 to about 0.5% by weight.
[0149]
The sweeteners of the present invention are manufactured using methods known to those skilled in the art appropriate to the form. For example, in the case of a solid sweetener, it is typically produced by mixing a highly glycosylated compound as well as other ingredients as required. Solid sweeteners can be shaped as needed. In the case of a liquid sweetener, it is typically produced by mixing and dissolving a highly glycosylated compound and, if necessary, other ingredients and a required amount of water. A person skilled in the art can select an appropriate production method according to the form and use of the intended sweetener composition.
[0150]
The pharmaceutical composition of the present invention contains a highly glycosylated compound. As used herein, “pharmaceutical composition” refers to any that can be used for medical purposes. Examples of the pharmaceutical composition include a preparation to be administered orally; a preparation to be applied sublingually (for example, a sublingual tablet); a dental external preparation and a mouth preparation (for example, a mouthwash). The content of the highly glycosylated compound in the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the form and use of the pharmaceutical composition and can be appropriately selected by those skilled in the art. For example, in the case of a general orally administered preparation, the content of the highly glycosylated compound in the whole preparation is typically about 0.001 to about 5% by weight, preferably about 0.05 to about 2% by weight. %, More preferably about 0.01 to about 0.5% by weight.
[0151]
The pharmaceutical composition of the present invention can be produced using methods known to those skilled in the art. A person skilled in the art can select an appropriate production method depending on the form and type of the pharmaceutical composition. Here, the highly glycosylated compound can be formulated into the pharmaceutical composition in any manner.
[0152]
The quasi-drug composition of the present invention contains a highly glycosylated compound. In the present specification, the “composition for quasi drugs” refers to any that can be used for quasi drugs. Examples of the composition for quasi-drugs include mouth refreshing agents (for example, throat refreshing agents, healthy stomach refreshing agents); medicinal cosmetics; medicated toothpastes. As an example of the composition for quasi-drugs, a vitamin C agent, a vitamin E agent, a vitamin EC agent, a vitamin-containing health agent, and a calcium agent may be used. As used herein, a quasi-drug composition includes both a composition used as a quasi-drug or a composition used as a newly designated quasi-drug. The content of the highly glycosylated compound in the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the form and use of the pharmaceutical composition and can be appropriately selected by those skilled in the art. For example, in the case of a typical throat freshener, the content of the highly glycosylated compound in the entire throat freshener is typically about 0.001 to about 5% by weight, preferably about 0.05 to about 2% by weight. %, More preferably about 0.01 to about 0.5% by weight.
[0153]
The pharmaceutical composition of the present invention can be produced using methods known to those skilled in the art. A person skilled in the art can select an appropriate production method depending on the form and type of the pharmaceutical composition. Here, the highly glycosylated compound can be formulated into the pharmaceutical composition in any manner.
[0154]
The cosmetic composition of the present invention contains a highly glycosylated compound. As used herein, “cosmetic composition” refers to any composition that can be used for cosmetic purposes. Examples of cosmetic compositions include lipsticks and toothpastes. The content of the highly glycosylated compound in the cosmetic composition of the present invention varies depending on the form and use of the cosmetic composition, and can be appropriately selected by those skilled in the art. For example, in the case of common dentifrices, the content of highly glycosylated compounds in the entire dentifrice is typically about 0.005 to about 5% by weight, preferably about 0.005 to about 2% by weight, The proportion is preferably about 0.01 to about 0.5% by weight.
[0155]
The cosmetic composition of the present invention can be produced using methods known to those skilled in the art. A person skilled in the art can select an appropriate production method depending on the form and type of the cosmetic composition. Here, the highly glycosylated compound can be formulated into the cosmetic composition in any manner.
[0156]
The glycosyltransferases and saccharide-degrading enzymes used in the present invention are industrial materials such as cyclodextrins and coupling sugars (glycosyl sucrose), foods (for example, sweeteners), pharmaceuticals, cosmetics and the like. There is no problem in terms of safety because it has been used for reliable manufacturing.
[0157]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The present invention is not limited only to the following examples.
[0158]
<Example 1: Glucose transfer rate to mogroside V when various CGTases are used>
In order to examine the rate of sugar transfer to mogroside V by various CGTases, the following experiment was conducted. First, a composition containing 20% (w / v) Rahan Glycoside in 50 mM acetate buffer (pH 6.0) (containing about 30% (w / v) Mogroside V as Luo Han Glycoside; Guilin, China) CGTase derived from Bacillus stearothermophilus against Rakan fruit glycoside solution (0.95 ml) containing 10% (w / v) soluble starch (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.) (Example 1-1), CGTase derived from Terumoanaerobacter genus (Example 1-2), CGTase derived from Bacillus circulans (Example 1-3), or CGTase derived from Bacillus macerans (Example 1-4) ) (20 units each) were added and mixed, and reacted at 60 ° C. for 24 and 48 hours. As a blank, the same operation was performed without adding CGTase.
[0159]
After the reaction for 24 hours or 48 hours, the reaction solution was boiled at 100 ° C. for 15 minutes to deactivate CGTase. The reaction solution after boiling was analyzed by HPLC equipped with an ODS column. The amount of mogroside V in the blank reaction solution (MogV (bla)) was taken as 100%, and the decrease rate of the amount of mogroside V (MogV (react)) in the reaction solution after the transglycosylation reaction was regarded as the transglycosylation rate. . That is,
[0160]
[Expression 1]

The results are shown in Table 1.
[0161]
[Table 1]

When any CGTase was used, sugar transfer to mogroside V was observed. The transglycosylation rate is very high when CGTase derived from Bacillus stearothermophilus, CGTase derived from Thermoanaerobacter genus and CGTase derived from Bacillus circulans are used. In the case of the enzyme, the sugar transfer rate was as high as 80% or more even in the reaction for 24 hours (Table 1- <2>, Table 1- <1> and Table 1- <4>). Therefore, these enzymes can be suitably used in the production method of the present invention.
[0162]
On the other hand, when CGTase derived from Bacillus macerans was used and added at 20 units and reacted at 60 ° C., the transglycosylation rate was less than 50% and not so high, so the amount of enzyme was increased to 100 units. The experiment was conducted in the same manner as described above at a reaction temperature of 50 ° C. (Example 1-5). As a result, the synthesis rate after 24 hours increased to 80% (Table 1-5).
[0163]
From these facts, even when CGTase derived from any microbial cell, microbial culture (for example, culture supernatant) or the like is used, by appropriately setting the amount of enzyme and the reaction temperature, the glycosylated Rakan fruit glycoside It turned out that it can be used suitably for manufacture of this.
[0164]
<Example 2: Effect of enzyme addition amount and reaction temperature on sugar transfer to mogroside V>
In order to investigate the effects of the amount of enzyme added and the reaction temperature on the sugar transfer to mogroside V, the following experiment was conducted. First, a composition containing 20% (w / v) Rahan Glycoside in 50 mM acetate buffer (pH 6.0) (containing about 30% (w / v) Mogroside V as Luo Han Glycoside; Guilin, China) CGTase enzyme (derived from Thermoanaerobacter genus, Novo) against Rahan fruit glycoside solution (0.95 ml) containing 10% (w / v) soluble starch (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.) Nordisk) 0.67 units / g starch (sample A), 1.33 units / g starch (sample B), 3.33 units / g starch (sample C), 6.67 units / g starch ( Sample D), 13.33 units / g starch (sample E), 33.33 units / g starch (sample F) or 66.67 units / g starch (sample G) added and mixed. , Reaction temperature 60 ° C And at 80 ° C., the reaction time was 24 hours and 48 hours. As a blank, the same operation was performed without adding CGTase.
[0165]
After the reaction for 24 hours or 48 hours, the reaction solution was boiled at 100 ° C. for 15 minutes to deactivate CGTase. The reaction solution after boiling was analyzed by HPLC equipped with an ODS column, and the influence of enzyme amount and reaction temperature on sugar transfer was judged. As in Example 1, the amount of mogroside V (MogV (bla)) in the blank reaction solution was taken as 100%, and the reduction rate of the amount of mogroside V (MogV (react)) in the reaction solution after the transglycosylation reaction Was regarded as the rate of sugar transfer.
[0166]
Table 2 below shows the sugar transfer rate at various addition amounts of CGTase, reaction temperature, and reaction time.
[0167]
[Table 2]

As can be seen from Table 2, with the increase in the amount of added enzyme (sample A → sample G), the sugar transfer rate of the main component (Mogroside V) of Rahan fruit glycoside increased. Increasing the reaction temperature from 60 ° C. to 80 ° C. also increased the sugar transfer rate. In addition, the rate of sugar transfer increased as the reaction time increased from 24 hours to 48 hours. Therefore, the rate of sugar transfer to mogroside V can be increased by appropriately setting the amount of added enzyme, reaction temperature and reaction time. Therefore, those skilled in the art can appropriately set conditions that are convenient for synthesizing highly glycosylated compounds.
[0168]
<Example 3: Effect of sugar donor substrate concentration on transglycosylation rate>
The effect of the sugar donor substrate (starch) concentration on the rate of transglycosylation to mogroside V by cyclodextrin synthase (CGTase, derived from Thermoanaerobacter sp.) Was examined.
[0169]
First, each test tube is mixed with 20% (w / v) Rahan Fruit Glycoside-containing composition (obtained from Guilin China Special Technology Co., Ltd.) and soluble starch solution of various concentrations in equal amounts, and 10% ( w / v) Rakan fruit glycoside-containing composition, 0.5% (w / v), 1.0% (w / v), 2.5% (w / v), 5.0% (w / v) Reaction substrate solutions containing v), 7.5% (w / v) or 9.6% (w / v) soluble starch were prepared. 10 units of CGTase was added to the reaction solution and mixed, and then reacted at 60 ° C. for 20 hours and 44 hours.
[0170]
After the reaction for 24 hours or 44 hours, the reaction solution was boiled at 100 ° C. for 15 minutes to deactivate CGTase. The reaction solution after boiling was analyzed by HPLC equipped with an ODS column, and the influence of the amount of starch on sugar transfer was judged. As in Example 1, the amount of mogroside V (MogV (bla)) in the blank reaction solution was taken as 100%, and the reduction rate of the amount of mogroside V (MogV (react)) in the reaction solution after the transglycosylation reaction Was regarded as the rate of sugar transfer. The sugar transfer rate was measured by the area value of the main component (Mogroside V) of Rahan fruit glycoside.
[0171]
The results are shown in Table 3.
[0172]
[Table 3]

Table 3 shows the effect of the sugar donor substrate (starch) concentration on the rate of sugar transfer to mogroside V by CGTase. In HPLC, a decrease in the main component (Mogroside V) of Rakan fruit glycoside was observed at any starch concentration, confirming sugar transfer. In particular, when the starch concentration was 2.5% or higher, the sugar transfer rate (%) after 20 hours was as high as 75% or higher. Furthermore, when the starch concentration was 2.5% or more, the sugar transfer rate (%) was as high as 78 to 93% after 44 hours. From the above results, it was suggested that even when a relatively low starch concentration was used, the transglycosylated product was produced in a high yield within 20 hours of the reaction, and the reaction was extremely excellent in productivity.
[0173]
<Example 4: Synthesis and analysis of partially degraded glycosylated product>
Synthesis and analysis of partially degraded glycosylated products by β-amylase treatment of highly glycosylated compounds were performed as follows.
[0174]
First, in a 50 mM acetate buffer (pH 6.0), 30% (w / v) Rahan fruit glycoside-containing composition (obtained from Guilin China Technology) and 15% (w / v) soluble starch ( 1,400 units of CGTase enzyme (derived from Bacillus stearothermophilus, manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratories) was added to an aqueous solution of Rakan fruit glycoside (50 ml) containing Kanto Chemical Co., Ltd. The resulting mixture was reacted at a reaction temperature of 60 ° C. for 18 hours to synthesize a highly glycosylated compound. After the reaction for 18 hours, the reaction solution was boiled at 100 ° C. for 15 minutes to deactivate CGTase, and 99.5% ethanol (manufactured by Nacalai) was added twice to precipitate the glucan mixture. This precipitate was removed by centrifugation to obtain a supernatant. The supernatant was subjected to an evaporator to remove ethanol.
[0175]
Β-Amylase (soybean, manufactured by Hankyu Bioindustry) was added to this solution, mixed and reacted at 40 ° C. for 16 hours to partially decompose the added sugar residue from the synthesized glycosylated Rakan fruit glycoside. did. After the reaction for 16 hours, the reaction solution was subjected to HPLC to obtain a chromatogram.
[0176]
The obtained chromatogram is shown in FIG. In FIG. 2, the horizontal axis indicates the peak height, and the vertical axis indicates the retention time. The number near the peak indicates the retention time at which the peak appears. The molecular weight of the component contained in each peak was measured by LC mass, and the number of glucose residues bound was determined.
[0177]
A peak of the main component (Mogroside V) of Rakan fruit glycoside was confirmed around a retention time of 4.5 minutes. Thereafter, a peak of glycosylated product in which 1 residue of glucose is bound to mogroside V is around 6 minutes, a peak of glycosylated product in which 2 residues of glucose are bound to mogroside V is around 11 minutes, A peak of glycosylated product in which 3 residues of glucose were bonded to mogroside V was confirmed, and a peak of glycosylated product in which 4 residues of glucose were bonded to mogroside V was confirmed in the vicinity of 15 minutes.
[0178]
From FIG. 2, it is clear that a partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside is produced and separated by HPLC according to the number of added sugars.
[0179]
<Example 5: Measurement of sweetness intensity>
(1) Synthesis of glycosylated Rakan fruit glycoside
Luohan Glycoside (composition containing about 30% (w / v) Mogroside V as Luohan Glycoside; a composition containing Luohan Glycoside; obtained from Guilin China Special Technology Co., Ltd.) and starch (soluble, first grade, Kanto Chemical) 7.5 g of 50 mg acetate buffer (pH 6.0) is prepared to 50 mL, and 1 mL of CGTase enzyme (trade name: THERMOPHILICCGTase, origin: Bacillus stearothermophilus, 1,400 units / g) is added at 60 ° C. The reaction was carried out for 18 hours to synthesize glycosylated Rahan fruit glycoside. Next, this reaction solution was heat-treated to deactivate CGTase, and then centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes, and the supernatant was charged to an ODS column (Organo, φ30 mm × 450 mm) and deionized water. After elution of 500 mL using a solution, 3 L eluate was obtained using ethanol / water with a linear concentration gradient from water (0 v / v% ethanol) to 60 v / v% ethanol. The solution was freeze-dried to obtain a powdered glycosylated Rakan fruit glycoside.
[0180]
(2) Synthesis of partially degraded glycosylated Rakan fruit glycoside
Luohan Glycoside (composition containing about 30% (w / v) Mogroside V as Luohan Glycoside; a composition containing Luohan Glycoside; obtained from Guilin China Special Technology Co., Ltd.) and starch (soluble, first grade, Kanto Chemical) 7.5 g of 50 mg acetate buffer (pH 6.0) was prepared, and 1 mL of CGTase enzyme (trade name: THERMOPHILIC CGTase, origin: Bacillus stearothermophilus, 1,400 units / g) was added, The reaction was carried out for 18 hours to synthesize glycosylated Rahan fruit glycoside. Next, the reaction solution was heat-treated to inactivate the CGTase enzyme, and then 100 mL of ethanol (special reagent grade, manufactured by Nakarai) was added to precipitate the starch, followed by centrifugation at 10,000 rpm for 20 minutes. The supernatant was collected, ethanol was removed using an evaporator, and the mixture was concentrated until the total amount became 40 mL. To 40 mL of this concentrated solution, 20 mg of a degrading enzyme (trade name: β-amylase # 1500S, manufactured by Nagase ChemteX Corporation, 15,000 AUN / g) was added and reacted at 40 ° C. for 16 hours. Glycosides were synthesized. After heat-treating this reaction solution to deactivate the degrading enzyme, this reaction solution was charged into an ODS column (Organo, φ30 mm × 450 mm), and 1.5 L was eluted with deionized water to remove impurities. Then, 3 L of eluate was obtained using ethanol / water with a linear concentration gradient from water (0 v / v% ethanol) to 60 v / v% ethanol, and this eluate was freeze-dried to partially decompose the powder. Glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained.
[0181]
(3) Measurement of sweetness intensity of glycosylated Rakanka glycoside and partially degraded glycosylated Rakanka glycoside
The sweetness intensities of the glycosylated Rakan fruit glycoside and the partially degraded glycosylated Rahan glycoside obtained in the above (1) and (2) were measured by the following methods, respectively. Twelve healthy subjects (6 males, 6 females, average age 31.2 years) were used to sample 10% sucrose aqueous solution for glycosylated or partially degraded glycosylated glycosylated glycosides. Then, the relative sweetness intensity was evaluated, and the sweetness intensity of each sample when the sweetness intensity of sucrose was set to 1 was determined.
[0182]
As a result, the concentration of the glycosylated Rakan fruit glycoside aqueous solution necessary for obtaining a sweetness intensity equivalent to that of a 10% aqueous sucrose solution was 0.141% by weight, and the concentration of the partially degraded glycosylated Rakan fruit glycoside aqueous solution was 0. 0.056% by weight. Therefore, it was found that the sweetness intensity of the glycosylated Rakan fruit glycoside has a sweetness intensity about 70 times that of sucrose, and the partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an intensity of sweetness about 180 times that of sucrose.
[0183]
<Comparative Example 1: Measurement of sweetness intensity of Rahan fruit glycoside>
In the same manner as in Example 5, the sweetness intensity of Luohan Glycoside (composition containing Luohan Glycoside containing approximately 30% (w / v) Mogroside V as Luohan Glycoside; obtained from Guilin China Technology Co., Ltd.) It was measured. As a result, the concentration of the Rahan fruit glycoside aqueous solution necessary for obtaining the sweetness intensity equivalent to that of the 10% sucrose aqueous solution was 0.047% by weight. Therefore, Rahan fruit glycoside has a sweetness intensity about 210 times that of sucrose.
[0184]
[Table 4]

<Example 6 and Comparative Example 2>
Various sweetener aqueous solutions were prepared by the following methods.
[0185]
Example 6 Preparation of Glycosylated Rahan Fruit Glycoside and Partially Degraded Glycosylated Rahan Fruit Glycoside Aqueous Solution>
In a glass beaker having a capacity of 50 mL, the glycosylated Rahan fruit glycoside and the partially decomposed glycosylated Rahan glycoside obtained in (1) and (2) of Example 5 are each 0.1% by weight. Thus, an aqueous solution of glycosylated Rahan fruit glycoside and an aqueous solution of partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside were obtained.
[0186]
<Comparative Example 2: Preparation of Rakan fruit glycoside aqueous solution>
In the same manner as in Example 6, an aqueous solution of Rahan fruit glycoside was prepared to be 0.1% by weight.
[0187]
<Experimental Example 1: Evaluation of sweetener aqueous solution>
A sensory test was conducted on the taste of 6 elements of the sweetener aqueous solutions obtained in Example 2 and Comparative Example 2 by 10 healthy subjects (5 men, 5 women, average age 31.4 years). Using a sucrose aqueous solution as a reference solution, various sweetener aqueous solutions (glycosylated Rahan fruit glycoside aqueous solution or partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside aqueous solution or Rahan fruit glycoside aqueous solution) were sampled and “▲ 1 bitterness, {2} Each of “3. Retraction, (3) persistent, (4) habit, (5) astringency, (6) refreshing feeling” was evaluated with a score of 7 levels (0 to 6 points). The evaluation score is 0 for “very superior to sucrose solution”, 2 for “much better than sucrose solution”, 2 for “slightly better than sucrose solution”, “ "Same as sucrose solution" 3 points, "Slightly inferior to sucrose solution" 4 points, "Slightly inferior to sucrose solution" 5 points, "Inferior to sucrose solution" 6 points. Therefore, the score for the sweetness of sucrose is 3.0 in all factors.
[0188]
Furthermore, a radar chart was created based on the evaluation score obtained for each element. That is, the taste of the six elements evaluated was represented by six axes, and the average value of the evaluation scores of ten subjects was plotted on this axis, and the hexagon was drawn by connecting the plots with straight lines. Moreover, the sweetness quality is so excellent that the point which plotted all six elements came inside, and conversely, the sweetness quality is inferior, so that it comes outside.
[0189]
The evaluation score by each subject of each sample and the average value thereof are shown in the following table and graph.
[0190]
[Table 5]

As is apparent from the above table and FIG. 4, the evaluation score of the glycosylated Rahan fruit glycoside aqueous solution is 4.0 or more in most elements in the Rakan fruit glycoside aqueous solution of Comparative Example 2, but Was about 4.0 in all the elements, and it was found that the sweet taste quality was excellent as compared with Luohan Glycoside. Moreover, the evaluation score of the partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside aqueous solution is 3.1 to 3.5 in all elements, which is similar to that of sucrose. It was found that the sweetness was even better than that of saccharides.
[0191]
<Example 7>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 1 was obtained.
[0192]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0193]
<Example 8>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the following structure of Compound No. 2 was obtained.
[0194]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0195]
<Example 9>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 3 was obtained.
[0196]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0197]
<Example 10>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 4 was obtained.
[0198]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0199]
<Example 11>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 5 was obtained.
[0200]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0201]
<Example 12>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 6 was obtained.
[0202]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0203]
<Example 13>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 7 was obtained.
[0204]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0205]
<Example 14>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 8 was obtained.
[0206]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0207]
<Example 15>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 9 was obtained.
[0208]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0209]
<Example 16>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 10 was obtained.
[0210]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0211]
<Example 17>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 11 was obtained.
[0212]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0213]
<Example 18>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 12 was obtained.
[0214]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0215]
<Example 19>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 13 was obtained.
[0216]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0217]
<Example 20>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 14 was obtained.
[0218]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0219]
<Example 21>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 15 was obtained.
[0220]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0221]
<Example 22>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 16 was obtained.
[0222]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0223]
<Example 23>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 17 was obtained.
[0224]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0225]
<Example 24>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 18 was obtained.
[0226]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0227]
<Example 25>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 19 was obtained.
[0228]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0229]
<Example 26>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 20 was obtained.
[0230]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0231]
<Example 27>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 21 was obtained.
[0232]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0233]
<Example 28>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 22 was obtained.
[0234]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0235]
<Example 29>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 23 was obtained.
[0236]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0237]
<Example 30>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 24 was obtained.
[0238]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0239]
<Example 31>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 25 was obtained.
[0240]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0241]
<Example 32>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 26 was obtained.
[0242]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0243]
<Example 33>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 27 was obtained.
[0244]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0245]
<Example 34>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 28 was obtained.
[0246]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0247]
<Example 35>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 29 was obtained.
[0248]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0249]
<Example 36>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 30 was obtained.
[0250]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0251]
<Example 37>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 31 was obtained.
[0252]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0253]
<Example 38>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 32 was obtained.
[0254]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0255]
<Example 39>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 33 was obtained.
[0256]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0257]
<Example 40>
In the same manner as in Example 4, a large amount of partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside was obtained. After performing HPLC, the structure was confirmed by NMR and MASS spectra, and a partially decomposed glycosylated Rahan fruit glycoside having the structure of Compound No. 34 was obtained.
[0258]
The partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside was evaluated for sweetness in the same manner as in Example 6. As a result, this partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside has an excellent sweet taste with significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing feeling compared to the taste quality of Rahan fruit glycoside. It was found to have
[0259]
【The invention's effect】
According to the present invention, a method for producing a glycosylated Rakan fruit glycoside very efficiently and inexpensively by a glycosyltransferase reaction by allowing a glycosyltransferase such as cyclodextrin synthase to act on a sugar donor substrate such as starch and the like. There is provided the production of a partially degraded glycosylated Rahan fruit glycoside partially degraded by a saccharide-degrading enzyme or the like.
[0260]
According to the present invention, a method for greatly improving the taste quality of Luohan Glycosides, which is improved in the taste quality items of bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency, and refreshing taste, and becomes a soft and hypoallergenic taste quality, and Novel glycosylated Rahan fruit glycosides are provided.
[0261]
The glycoside obtained by the present invention or a carbohydrate containing it can be used as a high-intensity sweetener for foods, pharmaceuticals, cosmetics and the like. In particular, the glycosylated Rahan fruit glycoside of the present invention has significantly improved bitterness, aftertaste, persistentness, habit, astringency and a refreshing feeling as compared with the taste quality of Rahan fruit glycoside.
[0262]
The highly glycosylated compound of the present invention can be used as an additive to foods such as tabletop sweeteners, beverages, confectionery, and seasonings, pharmaceuticals, and cosmetics.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a schematic view of an industrial production method for glycosylated Rakanka glycosides and partially degraded glycosylated Rakanka glycosides.
FIG. 2 is a high-performance liquid chromatogram of a Rahan fruit glycoside solution after CGTase and β-amylase enzyme treatment.
FIG. 3 is a graph showing the sweetness intensity of glycosylated Rakanka glycosides and partially degraded glycosylated Rakanka glycosides when the sweetness intensity of sucrose is 1.
FIG. 4 is a radar chart showing the results of Example 6 and Comparative Example 2;

Claims (18)

羅漢果配糖体に１〜４個のグルコース残基がα結合している、高度グリコシル化化合物。A highly glycosylated compound in which 1 to 4 glucose residues are α-bonded to Rahan fruit glycoside. 以下からなる群より選択される、請求項１に記載の高度グリコシル化化合物：

The highly glycosylated compound of claim 1 selected from the group consisting of:

モグロサイドＶに１〜４個のグルコース残基がα結合している、請求項１に記載の高度グリコシル化化合物。2. The highly glycosylated compound of claim 1, wherein 1 to 4 glucose residues are alpha linked to mogroside V. 請求項１に記載の高度グリコシル化化合物を含有する、食品用組成物。  A food composition comprising the highly glycosylated compound of claim 1. 請求項１に記載の高度グリコシル化化合物を含有する、甘味料。  A sweetener comprising the highly glycosylated compound of claim 1. 請求項１に記載の高度グリコシル化化合物を含有する、医薬品用組成物。  A pharmaceutical composition comprising the highly glycosylated compound of claim 1. 請求項１に記載の高度グリコシル化化合物を含有する、医薬部外品用組成物。  A quasi-drug composition comprising the highly glycosylated compound of claim 1. 請求項１に記載の高度グリコシル化化合物を含有する、化粧品用組成物。  A cosmetic composition comprising the highly glycosylated compound of claim 1. 高度グリコシル化化合物の製造方法であって、該方法は、羅漢果配糖体を、α−グルカンおよび糖転移酵素と接触させて、高度グリコシル化化合物を得る工程；および該高度グリコシル化化合物と糖質分解酵素を接触させて、請求項１に記載の高度グリコシル化化合物を得る工程を包含する、方法。A method for producing a highly glycosylated compound, comprising contacting Rahan fruit glycoside with α-glucan and glycosyltransferase to obtain a highly glycosylated compound ; and said highly glycosylated compound and carbohydrate A method comprising contacting a degrading enzyme to obtain a highly glycosylated compound according to claim 1 . 前記糖転移酵素が、シクロデキストリン合成酵素である、請求項９に記載の方法。The method according to claim 9 , wherein the glycosyltransferase is a cyclodextrin synthase. 前記羅漢果配糖体が、モグロサイドＶである、請求項９に記載の方法。The method according to claim 9 , wherein the Rahan fruit glycoside is mogroside V. 請求項９に記載の方法によって得られる、高度グリコシル化化合物。A highly glycosylated compound obtained by the method of claim 9 . 羅漢果配糖体に１〜４個のグルコース残基がα結合している高度グリコシル化化合物の製造方法であって、該方法は、
羅漢果配糖体を、α−グルカンおよび糖転移酵素と接触させて、羅漢果配糖体に５個以上のグルコース残基がα結合している高度グリコシル化化合物を得る工程、および
該羅漢果配糖体に５個以上のグルコース残基がα結合している高度グリコシル化化合物に糖質分解酵素を接触させて、羅漢果配糖体に１〜４個のグルコース残基がα結合している高度グリコシル化化合物を得る工程
を包含する、方法。A method for producing a highly glycosylated compound in which 1 to 4 glucose residues are α-bonded to Rahan fruit glycoside, the method comprising:
A step of contacting a Rahan fruit glycoside with α-glucan and a glycosyltransferase to obtain a highly glycosylated compound in which five or more glucose residues are α-bonded to the Rahan fruit glycoside, and the Rahan fruit glycoside Glycosylation with a glycosidase in contact with a highly glycosylated compound with 5 or more glucose residues α-linked to 1 to 4 glucose residues α-bonded to the Luohan fruit glycoside A method comprising obtaining a compound. 前記糖質分解酵素が、グルコアミラーゼ、β−アミラーゼおよびα−アミラーゼからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。The method according to claim 14 , wherein the saccharide-degrading enzyme is selected from the group consisting of glucoamylase, β-amylase and α-amylase. 前記羅漢果配糖体が、モグロサイドＶである、請求項１３に記載の方法。The method according to claim 13 , wherein the Rahan fruit glycoside is Mogroside V. 請求項１３に記載の方法によって得られる、１〜４個のグルコース残基がα結合した高度グリコシル化化合物。A hyperglycosylated compound obtained by the method according to claim 13 , wherein 1 to 4 glucose residues are α-linked. 羅漢果配糖体を含む甘味料の味質改善方法であって、該甘味料を、α−グルカンおよび糖転移酵素と接触させる工程；および該接触工程後の甘味料に糖質分解酵素を接触させる工程を包含する、方法。A method for improving the taste quality of a sweetener comprising a Rahan fruit glycoside, wherein the sweetener is brought into contact with α-glucan and a glycosyltransferase ; and the sugar-degrading enzyme is brought into contact with the sweetener after the contact step. comprising the step, way. 請求項１７に記載の方法によって得られた、味質の改善された甘味料。18. A sweetener with improved taste obtained by the method of claim 17 .

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