JP4134330B2 - A method for rapidly sorting target cells using flow cytometry without using fluorescent labels - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数種の細胞混合物の中から何ら修飾処理しないで生きた目的の細胞を迅速に分取する方法に関する。とりわけ、脳疾患に対して期待される再生医療の基礎的研究及びその応用として移植等の治療に利用できる、高純度の神経幹細胞及び神経前駆細胞を迅速に分取する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、脳疾患の治療のための新しい方法として再生医療が注目されている。再生医療は生体にある神経幹細胞のもつ再生能力を治療に用いることで、今まで、再生できないと言われていた神経細胞を新生させることで治療をするものである。
神経幹細胞及び神経前駆細胞（以下、神経幹細胞系とする）は、至適条件でニューロン及びグリアなどの細胞に分化することが証明されていて、上記のような再生医療の観点から、アルツハイマー病、パキンソン氏病などの脳疾患の治療に有用となることが期待される。
【０００３】
そのような実情を受け、神経幹細胞系の精製分離が試みられ、とりわけ、迅速に高純度な神経幹細胞系を単離することが期待されてきた。そのような試みの例として以下の方法を挙げることができる。
【０００４】
まず、細胞培養による方法（Isolation and characterization of mouse neural precurser cells in primary culture, in vitro cell. Dev. Bio1. 27A, 615-624(1991), HIROSHI KITANI et al.）の報告がある。この方法では、高純度の神経幹細胞系の取得が難しく、さらに目的の細胞を分離する前に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）にて培養する必要があり、この培養期間に神経幹細胞系の分化等による性質の変化が生じてしまうという欠点があった。
また、比重遠心法による方法（Fibroblast growth factor-2 activates a latent neurogenic program in neural stem ce11s from diverse regions of the adult CNS. J Neurosci 19(19):8487-97(1999), Palmer TD, et a1.）では、分離操作の時に化学物質の影響が考えられ、さらに遠心操作では大量の細胞を確保し難いという欠点があった。
【０００５】
ところで、フローサイトメトリーを用いる血液細胞の分取の報告がある。血液は複数種の細胞からなるが、各々の血液細胞は構造や性質からはっきり区別できるため、各々の血液細胞の単離は比較的容易に達成できる。
最近、フローサイトメトリーの細胞解析能を利用したセルソーター（細胞分取装置）を用い、構造的にも性質的にも未知の成分を多く含む脳組織抽出混合物中から神経幹細胞系を精製分離しようとする試みがなされている。そのような例として、蛍光標識した神経細胞に対してフローサイトメトリーを用いる方法（Direct isolation of human central nervous system stem cells., Proc Natl Acad Sci USA 19; 97(26):14720-5(2000) Uchida N, et a1.）が報告されている。
神経幹細胞系では、細胞自体の性質を維持して入手することが必須である。しかし、蛍光強度と前方散乱光の組み合わせによる上記の方法では抗体で予め標識する必要があり、神経幹細胞系の性質に好ましくない影響を与える。
即ち、細胞分取操作の前に、目的の細胞の細胞表面分子に対して、蛍光色素を結合させ、その分子に特異的な抗体を標識する必要があり、神経幹細胞系の性質を維持して入手することが難しい。
【０００６】
また、遺伝子導入した動物から神経幹細胞系をフローサイトメトリーで分離する方法（Direct isolation of committed neuronal progenitor cells from transgenic mice coexpressing spectrally distinct fluorescent proteins regulated by stage-specific neural promoters., J Neurosci Res, 65, 220-227(2001) Sawamoto K, et al.）が報告されている。
しかし、この方法は、予め受精卵を標識した動物、すなわち組換え動物に適用される技術であって、組換えを受けていない自然のままの生きた神経幹細胞系を分取することはできない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、複数種の細胞混合物の中から何ら修飾処理しないで生きた目的の細胞を迅速に分取する方法を提供することを目的とし、とりわけ、脳疾患に対して期待される再生医療の基礎的研究及びその応用として移植等の治療に利用できる、高純度の神経幹細胞系を迅速に分取する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的に対し鋭意検討した結果、蛍光を用いることなく、フローサイトメトリーのセルソーターを用い、レーザを照射したときの神経幹細胞系自体からの２つの散乱光を適正な条件に設定し、他の細胞との差別化を行い、２次元での位置情報として可視化することにより、何ら修飾処理しないで生きた初期発生における神経幹細胞系を迅速に且つ高純度で分取できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１） 分取の対象とする神経幹細胞と神経前駆細胞とを含む組織をトリプシン処理して調製した、前記の神経幹細胞と神経前駆細胞とを含む複数種の細胞が混合してなる混合細胞懸濁液を用いて、フローサイトメトリーにより細胞にレーザ光を照射し、蛍光標識を用いることなく、その照射光の前方散乱光及び側方散乱光を測定し、その測定値を２次画面上に位置情報として識別表示して、これにより、前記組織から前記神経幹細胞及び神経前駆細胞を分離・分取する神経幹細胞の分取方法であって、
前記フローサイトメトリーによる細胞の流れであるサンプル・コアの流れが、シース圧とサンプル圧の差０．５〜０．７５且つサンプル圧６．７５ｐｓｉ〜７．０ｐｓｉで制御され、
前記前方散乱光の測定が、検出器に印加する電圧２２０ボルト〜３３０ボルトで検出され、かつ前記側方散乱光の測定が、検出器に印加する電圧４００ボルト〜５２０ボルトで検出されることを特徴とする神経幹細胞の分取方法
を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１１】
フローサイトメトリーは、蛍光を用いることなく、レーザを個々の細胞に照射したときの細胞自体から発する散乱光のみを検出パラメーターとして細胞分取に用いることができる。
【００１２】
本発明で用いるフローサイトメーターのシステムの好ましい１例の概要を図１０に示す。図１０を参照しながらフローサイトメトリーの手順を説明する。
まず、空気圧をかけシース圧調節器１及びサンプル圧調節器４を調節しながらシース液容器２及びサンプル液容器１４からそれぞれシース液及びサンプル液をフローセル７に導入する。ここで、フローセル７中においてシース液とサンプル液とが混じりあうことはない。なお、フローセル７中を流れていくときサンプルコアはシース液流によって囲まれている。
その導入したシース液流で囲まれたサンプルコア流にレーザー光８を照射して、生じた散乱光９を検出する。この散乱光９によりサンプルコア中の細胞を観察する。
【００１３】
次に、レーザー光８の照射により散乱光９で観察した細胞をソーティングする。そのために、水流が水滴に分かれる寸前に水流全体にプラスまたはマイナスの電荷を加え、設定領域内の目的の細胞を含む水滴をプラスまたはマイナスに帯電させる。帯電させたサンプルコアを正電圧板１０及び負電圧板１１でソートし、それぞれ右ソート１２及び左ソート１３に分ける。帯電していないものは垂直に落下して廃液となる。
【００１４】
本発明で用いる検出パラメーターは前方散乱光（ＦＬＳ；１．５°〜１９°）及び側方散乱光（ＰＬＳ；９０°）である。
前方散乱は細胞の大きさ（細胞表面積）に相関があり、側方散乱は細胞内微細構造に相関があることが知られていて、その細胞の特質を表わしている。
この２つのパラメーターで表される２次元座標の１つのドットは個々の細胞を表し、その濃淡は細胞密度を表している。また、その分布は細胞の大きさと細胞内構造の違いを反映する。
【００１５】
図１は標準感度でのフローサイトメトリーによる分取の結果であり、それで得られたゲートIIIのネスチン陽性細胞集団をさらに高感度で分取した結果が図２である。
図１ａは細胞クラスターを差別化した２次元画面であり、図１ｂはａで差別化した細胞クラスターに対するソーティングゲートを作成した２次元画面である。
図２ａはゲートIIIについて標準感度による２次元画面であり、図２ｂはゲートIIIについて高感度による２次元画面であり、図２ｃはゲートIII、IIIA及びIIIBを１つの画面に表示した２次元画面である。
【００１６】
図１及び図２に示したように、Ｉ’：細胞破片、ＩＩ’：死細胞、ＩＩＩＡ：神経幹細胞系、ＩＩＩＢ：ネスチン弱陽性細胞、ＩＶ’：ネスチン弱陽性細胞とフィブロブラスト様細胞の混合細胞を含む支持細胞、Ｖ’：フィブロブラスト様細胞、ＶＩ’：ダブレット（２細胞が連結したもの）のクラスターが存在する２次元画面が得られ、この２つのパラメーターで表示された細胞クラスターにゲート（Ｉ〜ＶＩ、ＩＩＩＡ、及びＩＩＩＢ）を設定することで個々の細胞集団を分取できる。
【００１７】
本発明の方法により分取の対象とする細胞は、神経幹細胞系である。
本発明の方法により分取の対象とする細胞の供給源は、初期胚、初期胚の内部細胞塊、胎仔組織、成人組織等の細胞混合物であってもよい。
本発明の方法により神経幹細胞系を分取する場合、神経幹細胞系の供給源は、胎仔脳、成人脳組織など神経幹細胞系を含む限りいかなる細胞混合物であってもよい。
また、該混合細胞懸濁液の調製は、トリプシンによる酵素法により行われる。上記トリプシンによる酵素法において、溶液中にヒアルロン酸及びキヌレン酸を同時に含んでもよい。また、上記トリプシンによる酵素法において、溶液中にタイプ３コラゲナーゼを含んでもよい。
【００１８】
トリプシンのみによる酵素法の場合、溶媒は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ハンクス平衡塩（ＨＢＳＳ）、ＨＥＰＥＳバッファー液を用いてよい。該溶媒は組合わせて用いてよい。このとき、トリプシンの濃度は０．０２５〜０．１(v/v)％が好ましい。
【００１９】
上記細胞懸濁液は単一（非集合）の細胞懸濁液として調製し、細胞１個ずつレーザを通過させるのが好ましい。そのために、単一の細胞が連続して流れるサンプル液流とそれを包むシース液からなるサンプル・コアを形成し、該サンプル・コア中の１個の細胞がレーザ・ビーム中央を通過するように流れを調節し、且つ一度に複数の細胞が照射されないようにレーザ・ビームを集束させて強度を高めることが好ましい。
本発明で扱われる細胞の大きさは、７〜１８μｍである。
レーザ光の強度は、ビーム中心部より縁部のほうが低いので感度及び分解能を高めるために全ての細胞が同じ経路でレーザ・ビーム中心部を通るのが好ましい。
そのため、該サンプル・コアの直径は小さいほど好ましく、具体的には、該サンプル・コアの直径は２５〜５０μｍが好ましく、特に２８〜３８μｍが好ましい。
【００２０】
前述の理由により上記サンプル・コアの流れは低速であるほど好ましい。具体的には、サンプルフローは２５〜４０が好ましく、特に２８〜３８であることが好ましい。
フローサイトメータとしてＥＰＩＣＳ（登録商標、COULTER社製）を用いた場合、上記サンプルフローの値は、シース圧（上記シース液の入った容器に対する圧力）７．５ｐｓｉ＝１００（サンプル圧（上記細胞懸濁液の入った容器に対する圧力）：７．５ｐｓｉ）として、７．５ｐｓｉ−１ｐｓｉ＝０（サンプル圧：６．５ｐｓｉ）として差の１ｐｓｉを１００等分した値に相関する。
測定時のフロー速度は、１００〜９００細胞／秒が好ましく、特に４００〜７００細胞／秒であることが好ましい。
【００２１】
上記サンプル・コアの流れはシース圧により制御され、上記サンプル・コアの直径はシース圧とサンプル圧の差によって制御される。
例えば、サンプル圧を一定に維持したまま、シース圧を高くすることによって上記サンプル・コアの流れを速め、サンプル・コア直径が小さくなる。
【００２２】
具体的には、シース圧とサンプル圧の差が０．５〜０．７５且つサンプル圧が６．７５ｐｓｉ〜７．０ｐｓｉである。シース圧とサンプル圧の差が０．６２〜０．７２且つサンプル圧が６．７８ｐｓｉ〜６．８８ｐｓｉであることがさらに好ましい。
【００２３】
本発明の光源として用いるレーザは、神経幹細胞系を変質させず、且つ細胞から散乱光が発生する限り、アルゴンレーザ等公知のいかなるレーザを用いることもできるが、アルゴンレーザが好ましい。
波長４８８ｎｍのアルゴンレーザを用いた場合、照射光１０〜２５ｍＷが好ましく、照射光１５ｍＷがさらに好ましい。
上記アルゴンレーザは、ビーム整形レンズを用いて集束させてよい。
上記サンプルコアに照射される上記アルゴンレーザの断面は、扱われる細胞断面の大きさに近いことが好ましく、特に長軸５７μｍ、短軸１５μｍの楕円形をしていることが好ましい。
【００２４】
波長４８８ｎｍのアルゴンレーザを用いた場合、検出する前方散乱光の波長は、４８８ｎｍが好ましい。該前方散乱光は輝度が非常に高いため、光の強度を低減するフィルターを通して検出されてよい。
散乱光の検出器は光電子倍増管又はシリコンフォトダイオードであってよい。
上記光電子倍増管及び上記シリコンフォトダイオード管各々は、それ自体に印加される電圧により感度が変動してよい。
前方散乱光の検出器はシリコンフォトダイオードであることが好ましい。
側方散乱光の検出器は光電子倍増管であることが好ましい。
【００２５】
該前方散乱光の検出器がシリコンフォトダイオードである場合、標準感度による分取の際には、該前方散乱光は、該フィルターを通して該検出器に印加する電圧が１３０ボルト〜１７０ボルトで検出されることが好ましく、特に１４５ボルト〜１５５ボルトで検出されることが好ましい。
該前方散乱光の検出器がシリコンフォトダイオードである場合、高感度による分取の際には、該前方散乱光は、該フィルターを通して該検出器に印加する電圧が２２０ボルト〜３３０ボルトで検出され、特に２４５ボルト〜２５５ボルトで検出されることが好ましい。
【００２６】
波長４８８ｎｍのアルゴンレーザを用いた場合、検出する側方散乱の波長は、４８８ｎｍが好ましい。
該側方散乱光の検出器が光電子倍増管である場合、標準感度による分取の際には、該側方散乱光は、該検出器に印加する電圧が３５０ボルト〜４１０ボルトで検出されることが好ましく、特に３９５ボルト〜４０５ボルトで検出されることが好ましい。
該側方散乱光の検出器が光電子倍増管である場合、高感度による分取の際には、該側方散乱光は、該検出器に印加する電圧が４００ボルト〜５２０ボルトで検出され、特に４３０ボルト〜４５０ボルトで検出されることが好ましい。
上記検出器から発生した電流は、信号としての電圧パルスに変換されてよい。
信号としての該電圧パルスは増幅（増幅比率：ゲイン）、アナログ−デジタル変換等の処理を受けてもよい。
【００２７】
上記２つのパラメーター（前方散乱光及び側方散乱光）について表示された２次元画面上の細胞クラスターにゲートを設定することで個々の細胞集団を分取する際には、そのゲート設定した領域に相当するサンプル・コアに由来する液滴に荷電することにより分取してもよい。
【００２８】
本発明の前方散乱及び側方散乱のフローサイトメトリーを用いる方法において、感度と分解能の至適条件の設定は蛍光標識のビーズであるマイクロスフェア（フローチェック、商品名、COULTER社製）、又は予め４％(w/v)パラホルムアルデヒドで固定し、トリプシン法により作製したＥ１２前脳由来の単一（非集合）細胞などを用いることができる。
【００２９】
本発明において神経幹細胞系を検出するために用いられる抗体としては、１次抗体としては、抗ネスチン抗体、抗ムサシ１抗体などの神経幹細胞系に特異的であれば既知のいかなる抗体でもよく、抗ネスチン抗体を用いることが好ましい。
【００３０】
上記抗ムサシ１抗体は、ＲＮＡ結合タンパク質であり、神経幹細胞系に対する抗体である（(1) Mouse-Musashi-1, a neural RNA-binding protein highly enriched in the mammalian CNS stem cell., Developmental Biology., 176(2), 230-242(1996) Sakakibara S, et al.; (2) Musashi1: an evolutionally conserved marker for CNS progenitor cells including neural stem cells., Dev. Neuroscience, 22, 138-152(2000） Kaneko Y, et al.)。
２次抗体としては、上記１次抗体に親和性のあるものであればよく、既知のいかなる抗体でもよく、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｆａｂ’）２抗体が好ましい。
【００３１】
【実施例】
次に実施例に基づいて本発明を詳述するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
参考例１
１）細胞懸濁液の調製：ラット胎仔１２日目（Ｅ１２）からの胎仔脳（前脳及び中脳を含む）の分離はガーゼを敷いた１０ｃｍペトリディッシュ（SH90-15、商品番号、コーニング社製）及び６ｃｍディッシュ（15020、商品番号、コーニング社製）を用いて実体顕微鏡下でおこなった。
その後、１５ｍｌのコニカルチューブ（2095、商品番号、ファルコン社製）へ移し０．１％トリプシン／ＰＢＳと共に３０分間インキュベートし、０．０４％ＤＮアーゼ（DN‐25、商品番号、シグマ社製）及び１０％ウシ胎児血清を加えて５分間静置した。次いでＤＦ（ＤＭＥＭ／Ｆ‐１２＝１：１）培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）で洗浄し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＦ培地中で２００μｌ用のチップを装着した１ｍｌピペット（7503、商品番号、ファルコン社製）にてピペッティング後に細胞懸濁液とした。
【００３３】
２）フローサイトメトリーによる無菌ソーティング：フローサイトメトリーはアルゴンレーザを光源とし（４８８ｎｍ、１５ｍＷ出力）、径口１００μｍのチップをフローセルに装着している。
フローサイトメトリーの感度と分解能の至適条件の設定は蛍光標識のビーズであるマイクロスフェアを用いた。
フローサイトメーターの液送ラインは予め７０％(v/v)エタノールで滅菌した。また、シース液はオートクレーブにて滅菌し、ろ過したＰＢＳを用いた。
【００３４】
細胞懸濁液中の細胞の解析は個々の細胞がレーザに照射された時に生ずる散乱光（４８８ｎｍ）の強度をパラメーターとする散乱光分析によった。
この分析法はレーザに照射された細胞の前方散乱と９０°の側方散乱を用いるもので、測定結果はワークステーションのモニターにＦＬＳとＰＬＳの２パラメーターとして細胞の分布と密度からなる、６４チャンネルに分けた２次元の画面にドットで表示したサイトグラムで表示される。
【００３５】
前述のHIROSHI KITANIらの細胞培養による方法で行った予備実験での検討から目的の細胞がサイトグラムから確定できるので画面上の領域を指定して分取した。
図３に示すように指定したソート領域はＥとＦとし、Ｅは右側のチューブに、Ｆは左側のチューブに分取した。
図３ａは、胎仔脳を酵素処理し調製した細胞懸濁液をフローサイトメーターに適応した結果を示している。図３ｂは、ソート範囲Ｅの分取後のサイトグラムを示している。
【００３６】
尚、データの再現性を得るために次のように条件設定をした。
ＦＬＳ：１５０ボルト（ゲイン５）、ＰＬＳ：４０５ボルト（ゲイン１０）、シース圧とサンプル圧の差：０．６０〜０．６４（サンプル圧／シース圧＝６．８８／７．５）、サンプルフロー：３４〜３７、フロー速度：８００〜１０００細胞／秒。
【００３７】
ソーティングに際して、細胞懸濁液は予め５０μｍのナイロンメッシュ（共進理工、５０Ｎ）でろ過して凝集した細胞を除いた。
ろ過した単一（非集合）の細胞懸濁液はサンプルチューブ（2063、商品番号、ファルコン社製）に分けて４℃に保存し、順次ソーティングに供した。
分取した細胞は１０％ウシ胎児血清／ＤＦを含む４．５ｍｌのチューブに順次、無菌的に回収し、遠心後６ｃｍディッシュに集めた。
【００３８】
３）細胞培養：無菌的に分取した細胞は遠心後、洗浄し血清を含む培地及び無血清培地にて培養した。培養２４孔マイクロプレート（25820MP、商品番号、コーニング社製）及びチェンバースライド（Ｌａｂ‐Ｔｅｋ、商品名、ヌンク社製）の表面は予めポリエチレンイミン（ＰＥＩ、P-3143、商品番号、シグマ社製）でコーティングしたもの（ＰＥＩ処理ディッシュ）、あるいは未処理（未処理ディッシュ）の２種類を用いた。
培養液はＤＦ（ＤＭＥＭ／Ｆ‐１２＝１：１）培地を用い、無血清培地の検討では亜セレン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）を含みアポ−トランスフェリン（T-1147、商品番号、シグマ社製）、インスリン（ＣＢＰ社製）、ヘパリン（H-3149、商品番号、シグマ社製）のそれぞれを組み合わせて添加し、２４孔プレートあるいはチェンバースライドにて３７℃、５％ＣＯ_２で培養し生存、増殖分化を免疫蛍光法による特異抗原の検出で調べた。培地交換は３日ごとに行った。
【００３９】
また、既知の栄養因子としてａＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）（ＧＦ−０１−０１０、商品名、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）、ｂＦＧＦ（２３３‐ＦＢ、商品名、Ｒ＆Ｂ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＴＧＦ‐α（３２４７ＳＡ、商品番号、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）、ＥＧＦ（３２４７ＳＡ、商品番号、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）、ＩＧＦ‐Ｉ（１３２４５−０１４、商品番号、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＩＧＦ−II（３２５５ＳＡ、商品番号、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）、ＮＧＦ（ＮＣ０１１、商品名、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）及びＬＩＦ（２５０‐Ｌ、商品名、Ｒ＆Ｂ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、また、神経腫瘍細胞、神経膠腫及び神経芽腫の培養上清を用いて神経幹細胞系の培養系にそれぞれ添加し増殖分化能について検討をした（Bottenstein, J.E., and Sato, G.H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 514-517(1979)）。尚、５種類の細胞株は(財)がん研究振興財団細胞バンク（ＪＣＲＢ）から供与された。
【００４０】
細胞懸濁液中の細胞集団の解析
神経上皮細胞層から神経幹細胞系を得るために酵素法にて細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を顕微鏡で観察すると神経幹細胞系を比較的多くを含み、形態が異なる複数の性質をもつ細胞集団が認められ主に、フィブロブラスト、マトリックス細胞、血球系細胞、死細胞それに細胞破片などであった。
次に、これら形態の異なるそれぞれの細胞集団がワークステーションのモニター上でのディスプレイでどの位置を占めるのか特定するため、特にこの中のどこに神経幹細胞系が分布しているのかを調べた。
細胞懸濁液の分布のモニターではほぼ５つの細胞集団がみとめられた。
【００４１】
まず血球細胞系を用いての予備実験を行った。
血球系細胞は胎仔を摘出する際に腹大動脈からヘパリンを含むシリンジにて採血し、等量のＰＢＳで希釈した後、リンパ球比重分離液（日本抗体研究所社製）にて分離した。
分離した血球系細胞のフローサイトメトリーによる解析では、リンバ球は神経幹細胞系集団のほぼ左下方に、顆粒球、マクロファージ様細胞は上方の左右に分散しており、神経幹細胞系集団から離れた位置に認められることが判った。
【００４２】
また、細胞の接着性の違いによる培養法にて細胞懸濁液を個別に分離した神経幹細胞系、フィブロブラスト、マトリックス細胞についてフローサイトメトリーによる解析を行い、それぞれの細胞の位置を同定した（山之端万里、塚田裕三、神経化学４４６〜４４７（１９９４））。
【００４３】
この結果からフィブロブラスト様細胞は図３のＥ領域の神経幹細胞系集団の上方の右側に、すなわちＦ領域に、またマトリックス細胞は下方やや右にそれぞれ位置しておりいずれも神経幹細胞系から離れていた。
死細胞は左下から右上がりの帯上に分散し神経幹細胞系集団から完全に分離できた。細胞破片は左下に認められた。
【００４４】
ソーティングの結果
胎仔脳を酵素処理し調製した細胞懸濁液（１．７×１０^７cells/ml）は直ちにフローサイトメーターに適応し、その結果を図３ａに示した。
神経幹細胞系の位置は培養法による予備実験での結果から判断しソート範囲を図３に示したＥとした。
また、Ｆについてもソーティングを試みた。Ｅ及びＦで設定した細胞はそれぞれ右と左のチューブに分取した。
細胞集団のディスプレイ上での解析ではＥの全体の細胞（図３のＡの範囲）に対する占有率は３７％であり、Ｆは２３％であった。
ソートした細胞の回収率を調べるために、再度サイトメトリーで解析した。その結果を図３ｂ及び表１に示した。
図３ｂはソート範囲Ｅの分取後のサイトグラムを示しており、ソート範囲Ｆとの分離が可能であった。
またＥの分取後の細胞の回収率は７７．５％であった。
【００４５】
【表１】

【００４６】
分取した細胞の培養結果
分取した図３の細胞集団の培養の結果は、Ｅではブルーの円形の細胞が多く、Ｆでは黄色で変形の細胞およびＥでみられたブルーの円形の細胞でやや大きめの細胞が多くみとめられた。
この細胞集団をＰＥＩ処理ディッシュと未処理ディッシュでそれぞれ培養した。
未処理のディッシュでは、Ｅの細胞は集束しながら増殖するが、ＰＥＩ処理ディッシュではＥの細胞は著明に伸展しさらに培養を継続すると伸展した細胞間で集束を惹起しながらコロニーをつくり増殖をすることが判った。
この増殖している細胞は二次培養でも増殖能が維持された。
尚、Ｆではフィブロブラスト様の接着しながら増殖する細胞が認められた。
このフィブロブラスト接着細胞は弱くピペッティングすることで分離できるが、新たな未処理のディッシュヘ移し二次培養すると集束しながら増殖する。
【００４７】
そこで、Ｅの細胞集団を神経幹細胞系を含む細胞集団として以下の培養・増殖能の検討に用いた。
【００４８】
細胞培養の検討
上記神経幹細胞系を含む細胞集団の無血清培養の検討を行った結果を表２に示した。この中でトランスフェリン、インスリン、ヘパリンを含むＤＦ培地では神経幹細胞系の生存が認められた。
これにｂＦＧＦを添加することで生存から増殖へ移行した。
また、へパリンの添加は相乗作用を示し神経幹細胞系の生存に重要な働きをしていることが判った。
【００４９】
【表２】

【００５０】
神経栄養因子の細胞増殖能
図４は、２４孔プレート１×１０^４細胞／ｃｍ^２の培養密度のＤＦ培地に対する、ａＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ‐Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＧＦ−II（１００ｎｇ／ｍｌ）添加について検討した結果を示す。
ａＦＧＦ及びｂＦＧＦが神経幹細胞系の強い増殖能を示した。特に、ｂＦＧＦが強い増殖能を示した。
なお、評価はアラマールブルー・アッセイ（アラマールバイオサイエンスズ社製）により６日培養後の波長５７０及び６００ｎｍの吸収をモニターした。
【００５１】
神経膠腫及び神経芽腫の培養上清の影響
表３に示すように神経膠腫の培養上清はほとんど影響はないが、神経芽腫の３種では程度の差は認められたがいずれも増殖を促進した。これらは、無血清培地で培養した。
【００５２】
【表３】

【００５３】
実施例１
参考例１で得られたソーティング結果、培養条件検討の結果等の知見をもとに、まず標準感度による分取を試みた。
１−１）細胞懸濁液の調製
０．１％(v/v)トリプシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）による調製：胎仔脳は前脳を含む胎生１２日（Ｅ１２）のＳＤラット脳を用いた。摘出した胎仔脳は０．１％トリプシン／ＰＢＳにて３７℃で３０分間インキュベートした。
その後、０．０４％(v/v)ＤＮアーゼ（シグマ社製）及び０．０７％(v/v)オボムコイド（Worthington社製）を添加して５分間静置しＤＦ培地で洗浄した。
【００５４】
遠心して上清を除去し、沈下した脳組織は１００μg／ｍｌトランスフェリン（シグマ社製）、２５μｇ／ｍｌインスリン（コラボレイティブ バイオケミカル プロダクツ社製）、２５μｇ／ｍｌヘパリン（シグマ社製）、３０ｎＭセレン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）、５０ユニット／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＦ培地（ＴＩＨ−ＤＦ）中で、２００μｌのイエローチップを装着した１ｍｌのピペットにて２０回上下を繰り返してピペッティングして細胞懸濁液とした。
【００５５】
機械的粉砕による調製：摘出した胎仔脳の一部はトリプシンを含まないが０．０４％(v/v)ＤＮアーゼ／ＤＦを含む１ｍｌのＰＢＳ中で２００μｌのイエローチップを装着した１ｍｌのピペットにて２０回上下を繰り返してピペッティングして静置し、数分のちに沈下した組織断片のみを再度ピペッティングした。
この操作を合計３回繰り返して、それぞれの細胞懸濁液を集めて、ＤＦ培地で洗浄後にＴＩＨ−ＤＦにて保存した。これら２つの方法で調製したそれぞれの細胞懸濁液は順次フローサイトメーターに適応した。また、いずれの操作も無血清培地で行った。
【００５６】
１−２）細胞培養
培養はＴＩＨ−ＤＦ培地に５ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製）を添加して４×１０^３／ｃｍ^２の細胞密度で３．５ｃｍディッシュ（ファルコン社製）を用いて３７℃で５％ＣＯ_２の条件下にて行った。
培養した培地は３〜４日間隔で新しい培地あるいは、別に調製した培地をいずれも半量ずつ交換した。決められた培養日までに形成した神経細胞塊（ｓｐｈｅｒｅｓ）の数量は３．５ｃｍディッシュにて倒立顕微鏡下で行った。
【００５７】
２次神経細胞塊の培養は初代培養で形成した浮遊している神経細胞塊をトランスファーピペットにてチューブへ移し、先に述べた機械的粉砕にて単一（非集合）細胞の懸濁液として４×１０^３細胞／ｃｍ^２の培養密度で再び培養した。
培養した細胞の分化の程度は、決められた培養日までに形成した神経細胞塊を２００μｌイエローチップにてピックアップして８−ウェルチェンバースライド（ヌンク社製）へ移し、分化培地にて一週間培養した後の分化抗原の発現の程度から判定した。
分化培地は１ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ、１％ウシ胎児血清及び１μＭレチノイン酸を含むＴＩＨ−ＤＦ培地を用いた。
【００５８】
１−３）ネスチンペプチド抗体の作成
ネスチン分子の一次構造から抗原として適している領域を選択するため、Hyphil値、SurfPr値、Al-Ind値を用いて、それらの設定基準を満たしている領域を選定した（東大・医科学研究所ゲノム解析センターのコンピュターを用いた）。
この選定した領域につきＢＬＡＳＴを用いてホモロジー検索を実施した。最終的にネスチン分子のアミノ酸配列のＮ末端側の５１５−５３３（ＥＳＧＬＤＴＥＥＴＱＤＳＱＧＰＬＱＫＥ（配列番号１））及びＣ末端側の１７２３−１７３７（ＤＩＧＧＱＳＰＮＬＤＳＥＱＶＮ（配列番号２））の２箇所を選択した。
２種類のペプチドを合成するにあたり、前者（Ｎ２０）はＣ末端側にまた後者（Ｃ１６）はＮ末端側にシステイン残基をそれぞれ一個付加した。キャリアタンパク質としてヘモシアニン（ＫＬＨ）を用いて、それぞれの合成ペプチドと結合させて抗原とした。ウサギヘの免疫は皮下の複数の箇所へ行った。
【００５９】
初回免疫はフロイントの完全アジュバンド（ＦＣＡ）で行い、３週間のちに不完全アジュバンド（ＦＩＡ）にて一週間置きに追加免疫を行い、適宜採血して抗体価をチェックした。抗血清は２つのペプチドを担体（ＦＭＰ活性化セルロファイン、生化学工業社製）にそれぞれ結合させて作成したアフィニティークロマトグラフィーにて精製した。
精製した２種類の抗体（ＩｇＧ）はいずれも初代培養の細胞に陽性であったがＣ１６の抗体を用いることにした。抗体は使用するまで−３０℃にて保存した。また、Ｃ１６の抗ネスチン抗体としての特異性は東大、中福雅人博士から供与された抗ネスチン抗体（Cattaneo, E. and McKay, R., Nature 347, 762-765(1990)）による初代培養系の細胞の特異性と比較した。
【００６０】
１−４）標準感度によるフローサイトメトリー
参考例１と同様にＦＬＳ及びＰＬＳによる６４チャンネルに分けた２次元の画面のサイトグラムから解析を行った。
フローサイトメーターは４８８ｎｍで１５ｍＷ出力のアルゴンレーザと１００μｍの径口を有するチップをフローセルに装着したＥＰＩＣＳ（登録商標、COULTER社製）を用いた。送液ラインは７０％エタノールにて予め滅菌し、シース液は滅菌・ろ過したＰＢＳを用いた。
尚、データの再現性を得るために次のように条件設定をした。
ＦＬＳ：１５０ボルト（ゲイン５）、ＰＬＳ：４０５ボルト（ゲイン１０）、シース圧とサンプル圧の差：０．６０〜０．６４（サンプル圧／シース圧＝６．８８／７．５）、サンプルフロー：３４〜３７、フロー速度：８００〜１０００細胞／秒。
【００６１】
１−５）フローサイトメトリーによる細胞懸濁液中のネスチン陽性細胞の同定
トリプシンにより調製した細胞懸濁液はナイロンフイルター（ポアサイズ：５０μｍ）にてろ過した後に、その懸濁液の一部はフローサイトメーターへ適応してＦＬＳ及びＰＬＳにて解析した。
図１ａに示したように細胞は散乱光の性質に基づいて６つの細胞クラスター（Ｉ'〜ＶＩ’）に差別化できた。
これらのそれぞれの細胞クラスターに含まれる細胞を同定するために、解析用のソーティングゲートを図１ｂの（Ｉ〜ＶＩ）に示したようにクラスターを囲むように作成した。
【００６２】
ソーティングゲートごとにソーティングした細胞はチューブ（２０６３、商品番号、ファルコン社製）に集めた。チューブには予め０．５ｍｌのＴＩＨ−ＤＦ培地を加えておき、ソートした細胞は４ｍｌになった時に新しいチューブに交換した。このチューブを遠心して細胞を回収し、細胞を固定した後に、抗ネスチン抗体にて染色した。それぞれの結果を図５に示す。
図５は、ゲートごとに抗ネスチン抗体にて染色し、その蛍光強度をパラメータとしたヒストグラムである。
図５に示したように、ネスチン陽性細胞は再びフローサイトメトリーを用いて、今度はその蛍光強度をパラメータとしたヒストグラムによって解析して表示した。
この結果はネスチン陽性細胞はゲートIII及びIVであり、主にゲートIIIに収束した。ゲートIIIは、サイトグラムから分かるように参考例１のＥの神経幹細胞系を含む細胞集団に相当する。
【００６３】
１−６）ネスチン陽性細胞と他の細胞との分離
各ゲートからソーティングした細胞は遠心して集め、直ちにｂＦＧＦを添加したＤＦ−ＴＩＨ培地にて培養した。培養した細胞の位相差顕微鏡による観察結果を図６（スケールバー：２５μｍ）に示す。
図６ａはゲートIIIから得た細胞について、図６ｂはゲートVIから得た細胞について、図６ｃはゲートVから得た細胞について、図６ｄはゲートIVから得た細胞についてのそれぞれの位相差顕微鏡による観察結果を示す。
【００６４】
図６ａに示したようにゲートIIIから得たネスチン陽性細胞は神経細胞塊を形成し、これに対して図６ｄに示したゲートIVでは若干の神経細胞塊と共に培養ディッシュ表面へ接着する支持細胞が、また図６ｃに示したゲートVではIVと形態が異なり培養ディッシュ表面に広く接着するフィブロブラスト様の細胞が認められた。
また、細胞破片はゲートＩに、死細胞はゲートII、そして図６ｂのダブレットや組織球などの支持細胞はゲートVIに認められた。
【００６５】
１−７）ゲートIIIより分取した細胞の２次培養
ゲートIIIから分取した細胞の形態を図７に示す。前述のようにクラスターが認められ、これを分取したゲートIIIについて、ｂＦＧＦを含む無血清培地（ＴＩＨ−ＤＦ）にて６日間培養したところ、図７ａに示した神経細胞塊の形成が認められた。
また、この神経細胞塊から酵素法にて単一（非集合）細胞懸濁液を作成して２次の神経細胞塊の形成を期待したが、図７ｂに示したように予想に反してディッシュ表面に接着するフラットタイプの細胞が多く認められた。なお、図７中のスケールバーは２５μｍを示す。
また、ディッシュ表面に接着するフラットタイプの細胞は抗ネスチン抗体／ＦＩＴＣにて染色したところ、弱陽性であった。
【００６６】
１−８）免疫染色
細胞は４％(w/v)パラホルムアルデヒド−０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．３）にて室温で２０分間固定した後に、免疫染色は以下に述べるそれぞれの抗体を用いて一重あるいは二重染色を行い、陽性細胞は蛍光顕微鏡にて同定し、また陽性率を算出した。
【００６７】
使用した抗体は抗ネスチン抗体（２次抗体：ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｆａｂ’）２抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製））、抗β−チューブリンアイソタイプIII抗体（シグマ−アルドリッチ社製）、抗ＭＡＰ−２抗体（ケミコン社製）及び抗ＧＦＡＰ抗体（ケミコン社製）（各々の２次抗体：ＴＲＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体）、抗Ｏ４抗体（ケミコン社製）（２次抗体：ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＭ抗体）である。
これらのコントロールとしては１次抗体にそれぞれ抗ウサギＩｇＧ抗体（シグマ社製）、抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社製）及び抗マウスＩｇＭ抗体（シグマ社製）を用いた。
なお、上記抗Ｏ４抗体はオリゴデンドロサイトに対する抗体である。
【００６８】
２−１）高感度によるソーティング
１−７）の結果から、神経幹細胞系と上記ディッシュ表面に接着するフラットタイプの細胞とを分離するため、標準感度によるフローサイトメトリーで用いたＦＬＳ及びＰＬＳの感度を変えて、表４に示したようにそれぞれ平均４５％（ＦＬＳ）及び１０％（ＰＬＳ）強くして設定した。
尚、データの再現性を得るために次のように条件設定をした。
ＦＬＳ：２５０ボルト（ゲイン５）、ＰＬＳ：４４０ボルト（ゲイン１０）、シース圧とサンプル圧の差：０．６２〜０．７２（サンプル圧／シース圧＝６．７８／６．８８）、サンプルフロー：２８〜３８、フロー速度：４００〜７００細胞／秒。
【００６９】
【表４】

２−２）高感度によるソーティングの結果
この高感度による方法を用いて、同様に作成した細胞懸濁液を解析したところ、図２ｂのサイトグラムに示すようにクラスターIIIの細胞集団が２つに分離した。すなわち、ネスチン陽性細胞は２つの異なる形態の細胞に分画された。
これらのクラスターを新たにクラスターIIIA及びIIIBと称した。
【００７０】
次いで、クラスターIIIA及びIIIBの細胞をソーティングし、ｂＦＧＦを含む無血清培地（ＴＩＨ−ＤＦ）にて６日間培養した結果を図８（スケールバー：２５μｍ）に示す。
図８で示されたようにクラスターIIIA及びIIIBの領域における細胞の形態は、前者は神経細胞塊を形成し、後者ではディッシュ表面に接着するフラットタイプの細胞が認められた。
フィブロブラスト様の細胞の領域はIIIBよりさらに右側にシフトしており、IIIBの領域とは異なっていた。
【００７１】
ＦＬＳ及びＰＬＳそれぞれについて３０チャンネルを位置マーカーとしてゲートIII、IIIA及びIIIBを１つの画面に表した図２ｃから分かるように、このIIIA領域に認められる細胞群はIII領域の神経幹細胞系が上位にシフトしたものであると考えられる。
そして、クラスターIIIに混入していた細胞が新たにクラスターIIIBとして認められたことから、クラスターIIIAから高純度の生細胞の神経幹細胞系を分取することができた。
したがって、本発明の方法により高純度の生細胞の神経幹細胞系を分取することができた。
【００７２】
別に、前脳を機械的粉砕にて処理して作成した細胞懸濁液はフローサイトメトリーによって同様に解析したところ、酵素法と同じようにクラスターIIIはクラスターIIIA及びIIIBの２つの領域に認められた。
【００７３】
２−３）ソーティングによる細胞回収率及び純度
ソーティングはゲートIIIAから独立に５回を試みた。表５に示したように酵素処理した細胞懸濁液の細胞を直接、抗ネスチン抗体で染色したところ陽性細胞は全体の細胞に対して５２．５％であった。
また、細胞懸濁液をフローサイトメトリーに適応してゲートIIIAの細胞をソーティングして抗ネスチン抗体にて染色したところ、全細胞に対して３８．６％であった。
この方法で得られる抗ネスチン抗体陽性細胞数は１胎仔当たり３〜５×１０^４細胞であった。また、表６に示したように機械的粉砕にて処理した胎仔脳の細胞懸濁液も同様に算出した。
【００７４】
【表５】

【００７５】
【表６】

【００７６】
２−４）高純度で分取された神経幹細胞系の生存性の検討
ゲートIIIAからソーティングした神経幹細胞系は５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むＤＦ−ＴＩＨで５×１０^３細胞／ｃｍ^２にて培養した。
培養した細胞は培養８日目までは増殖し神経細胞塊を形成しながらそのサイズの増大が認められたが、培養９〜１０日日になると全て死滅した。
このため培養１０日目以降の生存の条件について、図９に示したように検討を行なった。
【００７７】
図９において、Ａ＋／Ｂ−はゲートIIIAの細胞を含むがゲートIIIBの細胞は含まないことを示し、Ａ＋／Ｂ＋はゲートIIIAとゲートIIIBの細胞を含むことを示している。細胞塊の数の算出は倒立顕微鏡にて行った。
ｂＦＧＦの添加の濃度の影響を調べるために、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを用いたが１０日目以降の生存は認められなかった。
次に、ゲートIIIBからディッシュ表面接着性のフラットタイプの細胞をソーティングし、そこヘゲートIIIAからソートした神経幹細胞系を加えて培養すると１０日目以降の生存が確認できた。
神経幹細胞系を加える日数は培養する１日目から８日目までのそれぞれの培養日に加えても生存が認められた。
しかし、図９に示すように対照条件として接着性の細胞を含むがｂＦＧＦを含まないＤＦ−ＴＩＨの培地にすると神経幹細胞系の生存は認められなかった。
【００７８】
２−５）神経幹細胞系の長期増殖
上述の生存性の検討から、本発明の方法により得られた高純度の神経幹細胞系は、ｂＦＧＦのみでは培養１０日目に死滅し、長期培養の条件としてIIIBの接着性細胞を若しくは接着性細胞の培養上清を加えることが必須であると判った。
【００７９】
また、共培養によって１０日目以降に増殖する神経細胞塊は、ピペットにて５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むＴＩＨ−ＤＦ培地へ移すと生存及び増殖が認められた。培養２０日の神経細胞塊を酵素処理法にて単一な細胞とし、ｂＦＧＦを含むＴＩＨ−ＤＦ培地で培養すると２次神経細胞塊のみを形成した。
【００８０】
２−６）神経幹細胞系の分化程度の解析
分化抗原の発現から、本発明により得られた神経幹細胞系の分化程度の解析を行った。
１−２）の培養条件に従い、ｂＦＧＦを含むＤＦ−ＴＩＨで６日間培養した後４％(w/v)パラホルムアルデヒドにて固定し染色したとき、その構成細胞はネスチン陽性であったが、得られた神経細胞塊は、神経前駆細胞に特異的な抗βチューブリンIII抗体にも陽性の細胞が認められた。
これらの神経細胞塊を培養６日目に分化培地に切り替えて７日間培養した後は神経細胞のマーカーであるＭＡＰ−２にも陽性であった。
そのとき、アストロサイトのＧＦＡＰに陽性の細胞、及びオリゴデンドロサイトのＯ４に陽性の細胞は認められなかったが、切り替えて１５日以降まで培養した神経細胞塊ではＧＦＡＰ陽性細胞、さらにＯ４陽性細胞が認められた。
【００８１】
上記神経幹細胞系の分化程度の解析から、本発明の方法により得られた神経幹細胞系が初期発生における生きた神経幹細胞系であることが判った。
【００８２】
したがって、本発明のフローサイトメトリーを用いた方法に従って、２次画面上に位置情報として識別表示することにより、細胞に何ら異物を付加することなく、初期発生における生きた神経幹細胞系を高純度で分取することが可能になった。
【００８３】
【発明の効果】
以上のように、本発明は、胎仔組織、成人組織等の細胞混合物の中から何ら修飾処理しないで生きた目的の神経幹細胞系を迅速に分取することを可能にし、とりわけ、再生医療の基礎的研究及びその応用として移植等の治療に利用できる、初期発生における生きた神経幹細胞系を迅速に分取することを可能にするものである。
【００８４】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、標準感度におけるサイトグラムを示す図である。ａ：細胞クラスターを差別化した２次元画面。ｂ：ａで差別化した細胞クラスターに対するソーティングゲートを作成した２次元画面。
【図２】図２は、図１におけるゲートIIIについての標準感度と高感度におけるサイトグラムを示す図である。ａ：ゲートIIIについて標準感度による２次元画面。ｂ：ゲートIIIについて高感度による２次元画面。ｃ：ゲートIII、IIIA及びIIIBを１つの画面に表示した２次元画面。
【図３】図３ａは、胎仔脳を酵素処理し調製した細胞懸濁液をフローサイトメーターに適応した結果を示す図である。図３ｂは、ソート範囲Ｅの分取後のサイトグラムを示す図である。
【図４】図４は、神経栄養因子の影響を示したグラフである。
【図５】図５は、ゲートごとに抗ネスチン抗体にて染色し、その蛍光強度をパラメータとしたヒストグラムを示す図である。
【図６】図６は、標準感度によるゲートIII〜VIより分取した細胞の培養及びその細胞形態の差異を示す図である。
【図７】図７は、ゲートIIIから分取した細胞の形態を示す図である。ａ：分取後ｂＦＧＦを含む無血清培地（ＴＩＨ−ＤＦ）にて６日間培養後を示す。ｂ：ａから単一細胞懸濁液を作成した後の２次培養を示す。
【図８】図８は、ゲートIIIA及びIIIBから分取した細胞の形態の差異を示す図である。
【図９】図９は、ゲートIIIBより分取した接着性細胞における神経幹細胞系の生存に及ぼす影響を示したグラフである。
【図１０】図１０は、本発明で用いることができるフローサイトメーターのシステムの概要図である。
【符号の説明】
１ シース圧調節器
２ シース液容器
３ シースライン
４ サンプル圧調節器
５ ピンチバルブ
６ トランスデューサー
７ フローセル
８ レーザ光
９ 散乱光
１０ 正電圧板
１１ 負電圧板
１２ 右ソート
１３ 左ソート
１４ サンプル液容器[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for rapidly sorting a desired target cell without any modification treatment from a plurality of cell mixtures. In particular, the present invention relates to a method for rapidly sorting high-purity neural stem cells and neural progenitor cells, which can be used for basic research of regenerative medicine expected for brain diseases and as an application thereof for treatment such as transplantation.
[0002]
[Prior art]
In recent years, regenerative medicine has attracted attention as a new method for the treatment of brain diseases. Regenerative medicine uses the regenerative ability of neural stem cells in the living body for treatment, and treats the patient by renewing nerve cells that have been said to be unable to regenerate.
Neural stem cells and neural progenitor cells (hereinafter referred to as neural stem cell lines) have been proven to differentiate into cells such as neurons and glia under optimal conditions. From the viewpoint of regenerative medicine as described above, Alzheimer's disease, It is expected to be useful for the treatment of brain diseases such as Parkinson's disease.
[0003]
Under such circumstances, purification and isolation of neural stem cell lines have been attempted, and in particular, it has been expected to rapidly isolate high-purity neural stem cell lines. The following method can be mentioned as an example of such an attempt.
[0004]
First, there is a report of a method using cell culture (Isolation and characterization of mouse neural precurser cells in primary culture, in vitro cell. Dev. Bio1.27A, 615-624 (1991), HIROSHI KITANI et al.). In this method, it is difficult to obtain a high-purity neural stem cell line, and further, it is necessary to culture in 10% fetal bovine serum (FBS) before the target cells are separated. There was a drawback that the property change due to.
In addition, the method by specific gravity centrifugation (Fibroblast growth factor-2 activates a latent neurogenic program in neural stem ce11s from diverse regions of the adult CNS. J Neurosci 19 (19): 8487-97 (1999), Palmer TD, et a1. ) Has the disadvantage that it is difficult to secure a large number of cells in the centrifugal operation because of the influence of chemical substances during the separation operation.
[0005]
By the way, there is a report of sorting of blood cells using flow cytometry. Although blood consists of a plurality of types of cells, since each blood cell can be clearly distinguished from the structure and properties, isolation of each blood cell can be achieved relatively easily.
Recently, we tried to purify and isolate a neural stem cell line from a brain tissue extract mixture containing many components that are unknown in terms of structure and properties using a cell sorter (cell sorting device) that utilizes the cell analysis ability of flow cytometry. Attempts have been made. As such an example, a method using flow cytometry on fluorescently labeled neurons (Direct isolation of human central nervous system stem cells., Proc Natl Acad Sci USA 19; 97 (26): 14720-5 (2000) Uchida N, et a1.) Has been reported.
In neural stem cell systems, it is essential to obtain them while maintaining the properties of the cells themselves. However, in the above method using a combination of fluorescence intensity and forward scattered light, it is necessary to label with an antibody in advance, which adversely affects the properties of the neural stem cell line.
That is, prior to cell sorting, it is necessary to bind a fluorescent dye to the cell surface molecule of the target cell and label an antibody specific for that molecule, maintaining the properties of the neural stem cell line. It is difficult to obtain.
[0006]
Alternatively, direct isolation of committed neuronal progenitor cells from transgenic mice coexpressing spectrally distinct fluorescent proteins regulated by stage-specific neural promoters., J Neurosci Res, 65, 220 -227 (2001) Sawamoto K, et al.) Has been reported.
However, this method is a technique that is applied to an animal in which a fertilized egg is labeled in advance, that is, a recombinant animal, and it is not possible to sort a natural living neural stem cell line that has not undergone recombination.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to provide a method for rapidly sorting living cells without any modification treatment from a mixture of a plurality of types of cells. It is an object of the present invention to provide a method for rapidly sorting a high-purity neural stem cell line that can be used for treatment such as transplantation as a basic medical research and its application.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies on the above-mentioned object, the present inventors have determined that two scattered lights from the neural stem cell system itself when the laser is irradiated using a flow cytometry cell sorter without using fluorescence. By distinguishing it from other cells and visualizing it as two-dimensional positional information, it is possible to quickly and accurately sort neural stem cell lines in the early development without any modification treatment. As a result, the present invention has been completed.
[0009]
  That is, the present invention
  (1)A mixed cell suspension prepared by trypsinizing a tissue containing neural stem cells and neural progenitor cells to be sorted, and comprising a mixture of a plurality of types of cells including the neural stem cells and neural progenitor cells. UseThe cells are irradiated with laser light by low cytometry, the forward scattered light and the side scattered light of the irradiated light are measured without using a fluorescent label, and the measured values are identified and displayed as position information on the secondary screen. And thisFrom the organizationNerve trunkVesicle and godIsolate and sort transprogenitor cellsGodA method of sorting stem cells,
  The flow of the sample core, which is the flow of cells by the flow cytometry, is controlled by the difference between the sheath pressure and the sample pressure of 0.5 to 0.75 and the sample pressure of 6.75 psi to 7.0 psi,
  The measurement of the forward scattered light is detected at a voltage of 220 volts to 330 volts applied to a detector, and the measurement of the side scattered light is detected at a voltage of 400 volts to 520 volts applied to the detector. Characteristic neural stem cell sorting method
Is to provide.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is described in detail below.
[0011]
In flow cytometry, without using fluorescence, only scattered light emitted from the cells themselves when the laser is irradiated to individual cells can be used for cell sorting as a detection parameter.
[0012]
An outline of a preferred example of a flow cytometer system used in the present invention is shown in FIG. The flow cytometry procedure will be described with reference to FIG.
First, the sheath liquid and the sample liquid are introduced into the flow cell 7 from the sheath liquid container 2 and the sample liquid container 14 while adjusting the sheath pressure adjuster 1 and the sample pressure adjuster 4 by applying air pressure. Here, the sheath liquid and the sample liquid do not mix in the flow cell 7. The sample core is surrounded by the sheath liquid flow as it flows through the flow cell 7.
The sample core flow surrounded by the introduced sheath liquid flow is irradiated with laser light 8 to detect the generated scattered light 9. Cells in the sample core are observed by the scattered light 9.
[0013]
Next, the cells observed with the scattered light 9 by the irradiation of the laser light 8 are sorted. For this purpose, a positive or negative charge is applied to the entire water flow just before the water flow is divided into water droplets, and the water droplets containing the target cells in the setting region are charged positively or negatively. The charged sample cores are sorted by the positive voltage plate 10 and the negative voltage plate 11 and divided into a right sort 12 and a left sort 13, respectively. Those that are not charged fall vertically and become waste liquid.
[0014]
The detection parameters used in the present invention are forward scattered light (FLS; 1.5 ° to 19 °) and side scattered light (PLS; 90 °).
Forward scatter is known to correlate with cell size (cell surface area), and side scatter is known to correlate with intracellular microstructure and represents the nature of the cell.
One dot of the two-dimensional coordinates represented by these two parameters represents an individual cell, and the shading represents the cell density. The distribution also reflects differences in cell size and intracellular structure.
[0015]
FIG. 1 shows the result of sorting by flow cytometry at a standard sensitivity, and FIG. 2 shows the result of sorting the nestin-positive cell population of Gate III thus obtained with higher sensitivity.
FIG. 1 a is a two-dimensional screen in which cell clusters are differentiated, and FIG. 1 b is a two-dimensional screen in which a sorting gate is created for the cell clusters differentiated in a.
2a is a two-dimensional screen with standard sensitivity for gate III, FIG. 2b is a two-dimensional screen with high sensitivity for gate III, and FIG. 2c is a two-dimensional screen with gates III, IIIA and IIIB displayed on one screen. is there.
[0016]
As shown in FIG. 1 and FIG. 2, I ′: cell debris, II ′: dead cell, IIIA: neural stem cell line, IIIB: nestin weak positive cell, IV ′: mixed nestin weak positive cell and fibroblast-like cell Supporting cells including cells, V ′: fibroblast-like cells, VI ′: doublet (cluster of two cells) cluster is obtained, and a two-dimensional screen is obtained, and the cell clusters displayed with these two parameters are gated. Individual cell populations can be sorted by setting (I-VI, IIIA, and IIIB).
[0017]
  Cells to be sorted by the method of the present invention are neural stem cell lines.It is.
  The cell source to be sorted by the method of the present invention may be a cell mixture such as an early embryo, an inner cell mass of an early embryo, a fetal tissue, an adult tissue or the like.
  When the neural stem cell line is sorted by the method of the present invention, the source of the neural stem cell line may be any cell mixture as long as it includes a neural stem cell line such as fetal brain and adult brain tissue.
  In addition, the mixed cell suspension is prepared by enzyme using trypsinDone by law.In the enzymatic method using trypsin, hyaluronic acid and kynurenic acid may be simultaneously contained in the solution. In the enzyme method using trypsin, type 3 collagenase may be included in the solution.
[0018]
  In the case of an enzymatic method using only trypsin, PBS (phosphate buffered saline), Hanks balanced salt (HBSS), or HEPES buffer solution may be used as the solvent. The solvents may be used in combination. At this time, the concentration of trypsin is preferably 0.025 to 0.1 (v / v)%..
[0019]
The cell suspension is preferably prepared as a single (non-aggregated) cell suspension, and the cells are preferably passed through the laser one by one. For this purpose, a sample core consisting of a sample liquid stream in which a single cell flows continuously and a sheath liquid surrounding the sample liquid stream is formed so that one cell in the sample core passes through the center of the laser beam. It is preferable to increase the intensity by adjusting the flow and focusing the laser beam so that a plurality of cells are not irradiated at one time.
The size of the cells handled in the present invention is 7 to 18 μm.
Since the intensity of the laser light is lower at the edge than at the center of the beam, it is preferred that all cells pass through the center of the laser beam in the same path to increase sensitivity and resolution.
Therefore, the diameter of the sample core is preferably as small as possible. Specifically, the diameter of the sample core is preferably 25 to 50 μm, particularly preferably 28 to 38 μm.
[0020]
For the reasons described above, the sample core flow is preferably as low as possible. Specifically, the sample flow is preferably 25 to 40, and particularly preferably 28 to 38.
When EPICS (registered trademark, manufactured by COULTER) was used as the flow cytometer, the value of the sample flow was 7.5 psi = 100 (sample pressure (the cell suspension above) with respect to the container containing the sheath fluid). The pressure on the container containing the turbid liquid): 7.5 psi), and 7.5 psi-1 psi = 0 (sample pressure: 6.5 psi).
The flow rate at the time of measurement is preferably from 100 to 900 cells / second, particularly preferably from 400 to 700 cells / second.
[0021]
The flow of the sample core is controlled by the sheath pressure, and the diameter of the sample core is controlled by the difference between the sheath pressure and the sample pressure.
For example, while keeping the sample pressure constant, increasing the sheath pressure speeds up the flow of the sample core and decreases the sample core diameter.
[0022]
  Specifically, the difference between the sheath pressure and the sample pressure is 0.5 to 0.75, and the sample pressure is 6.75 psi to 7.0 psi.TheMore preferably, the difference between the sheath pressure and the sample pressure is 0.62 to 0.72 and the sample pressure is 6.78 psi to 6.88 psi.
[0023]
As the laser used as the light source of the present invention, any known laser such as an argon laser can be used as long as it does not alter the neural stem cell system and the scattered light is generated from the cells, but an argon laser is preferable.
When an argon laser having a wavelength of 488 nm is used, irradiation light of 10 to 25 mW is preferable, and irradiation light of 15 mW is more preferable.
The argon laser may be focused using a beam shaping lens.
The cross section of the argon laser irradiated to the sample core is preferably close to the size of the cell cross section to be treated, and particularly preferably has an elliptical shape with a major axis of 57 μm and a minor axis of 15 μm.
[0024]
When an argon laser having a wavelength of 488 nm is used, the wavelength of the forward scattered light to be detected is preferably 488 nm. Since the forward scattered light has a very high luminance, it may be detected through a filter that reduces the intensity of the light.
The scattered light detector may be a photomultiplier tube or a silicon photodiode.
The sensitivity of each of the photomultiplier tube and the silicon photodiode tube may vary depending on the voltage applied to itself.
The detector of forward scattered light is preferably a silicon photodiode.
The detector of side scattered light is preferably a photomultiplier tube.
[0025]
  When the forward scattered light detector is a silicon photodiode, the forward scattered light is detected with a voltage applied to the detector through the filter of 130 to 170 volts when sorting by standard sensitivity. In particular, it is preferable to detect at 145 volts to 155 volts.
  When the forward scattered light detector is a silicon photodiode, the forward scattered light is detected at a voltage of 220 to 330 volts applied to the detector through the filter when sorting with high sensitivity.AndIn particular, it is preferably detected at 245 volts to 255 volts.
[0026]
  When an argon laser having a wavelength of 488 nm is used, the side scattering wavelength to be detected is preferably 488 nm.
  When the side scattered light detector is a photomultiplier tube, the side scattered light is detected at a voltage applied to the detector of 350 volts to 410 volts when sorting by standard sensitivity. In particular, it is preferable that detection is performed at 395 volts to 405 volts.
  When the detector of the side scattered light is a photomultiplier tube, the side scattered light is detected when the voltage applied to the detector is 400 volts to 520 volts when sorting with high sensitivity.AndIn particular, it is preferably detected at 430 volts to 450 volts.
  The current generated from the detector may be converted into a voltage pulse as a signal.
  The voltage pulse as a signal may be subjected to processing such as amplification (amplification ratio: gain) and analog-digital conversion.
[0027]
When sorting individual cell populations by setting a gate on a cell cluster on the two-dimensional screen displayed for the above two parameters (forward scattered light and side scattered light), Sorting may be done by charging droplets from the corresponding sample core.
[0028]
In the method using forward scattering and side scattering flow cytometry according to the present invention, the optimum conditions of sensitivity and resolution are set as microspheres (flow check, trade name, manufactured by COULTER), which are beads of fluorescent labels, or in advance. Single (non-aggregated) cells derived from E12 forebrain prepared by trypsin method, which are fixed with 4% (w / v) paraformaldehyde, can be used.
[0029]
As an antibody used for detecting a neural stem cell line in the present invention, the primary antibody may be any known antibody as long as it is specific to a neural stem cell line such as anti-nestin antibody and anti-musashi 1 antibody. It is preferable to use a nestin antibody.
[0030]
The anti-musashi 1 antibody is an RNA binding protein and is an antibody against neural stem cell line ((1) Mouse-Musashi-1, a neural RNA-binding protein highly enriched in the mammalian CNS stem cell., Developmental Biology., 176 (2), 230-242 (1996) Sakakibara S, et al .; (2) Musashi1: an evolutionally conserved marker for CNS progenitor cells including neural stem cells., Dev. Neuroscience, 22, 138-152 (2000) Kaneko Y, et al.).
As the secondary antibody, any antibody having affinity for the primary antibody may be used, and any known antibody may be used, and a FITC (fluorescein isothiocyanate) -labeled goat anti-rabbit IgG (Fab ') 2 antibody is preferable.
[0031]
【Example】
EXAMPLES Next, although this invention is explained in full detail based on an Example, this invention is not limited to this.
[0032]
Reference example 1
1) Preparation of cell suspension: Separation of fetal brain (including forebrain and midbrain) from rat fetus day 12 (E12) was performed using a 10 cm Petri dish (SH90-15, product number, Corning) with gauze ) And 6 cm dishes (15020, product number, manufactured by Corning) were performed under a stereomicroscope.
Thereafter, it was transferred to a 15 ml conical tube (2095, product number, manufactured by Falcon), incubated with 0.1% trypsin / PBS for 30 minutes, 0.04% DNase (DN-25, product number, manufactured by Sigma) and 10% fetal bovine serum was added and allowed to stand for 5 minutes. Next, it was washed with DF (DMEM / F-12 = 1: 1) medium (GibcoBRL), and a 1 ml pipette (7503, product number, Falcon) equipped with a 200 μl tip in DF medium containing 10% fetal calf serum. After cell pipetting, a cell suspension was obtained.
[0033]
2) Aseptic sorting by flow cytometry: Flow cytometry uses an argon laser as a light source (488 nm, 15 mW output), and a chip having a diameter of 100 μm is attached to the flow cell.
Microspheres, which are fluorescently labeled beads, were used to set the optimum conditions for sensitivity and resolution of flow cytometry.
The flow line of the flow cytometer was previously sterilized with 70% (v / v) ethanol. The sheath solution was sterilized by an autoclave and filtered PBS.
[0034]
Analysis of the cells in the cell suspension was performed by scattered light analysis using the intensity of scattered light (488 nm) generated when individual cells were irradiated with the laser as a parameter.
This analysis method uses forward scatter and 90 ° side scatter of cells irradiated to the laser, and the measurement results are 64 channels consisting of cell distribution and density as two parameters of FLS and PLS on the workstation monitor. It is displayed as a cytogram displayed as dots on a two-dimensional screen divided into two.
[0035]
Since the target cells can be determined from the cytogram based on the preliminary experiments conducted by the cell culture method of HIROSHI KITANI et al. Described above, the regions on the screen were designated and sorted.
As shown in FIG. 3, the designated sorting areas were E and F, where E was sorted into the right tube and F was sorted into the left tube.
FIG. 3a shows the result of applying a cell suspension prepared by enzyme treatment of fetal brain to a flow cytometer. FIG. 3 b shows the cytogram after sorting the sorting range E.
[0036]
In order to obtain data reproducibility, conditions were set as follows.
FLS: 150 volts (gain 5), PLS: 405 volts (gain 10), difference between sheath pressure and sample pressure: 0.60 to 0.64 (sample pressure / sheath pressure = 6.88 / 7.5), sample Flow: 34-37, flow rate: 800-1000 cells / second.
[0037]
At the time of sorting, the cell suspension was filtered through a 50 μm nylon mesh (Kyojin Riko, 50N) in advance to remove aggregated cells.
The filtered single (non-aggregated) cell suspension was divided into sample tubes (2063, product number, manufactured by Falcon), stored at 4 ° C., and sequentially subjected to sorting.
The sorted cells were collected aseptically sequentially in 4.5 ml tubes containing 10% fetal bovine serum / DF, and collected in a 6 cm dish after centrifugation.
[0038]
3) Cell culture: Aseptically sorted cells were centrifuged, washed and cultured in serum-containing medium and serum-free medium. The surface of the culture 24-well microplate (25820MP, product number, manufactured by Corning) and chamber slide (Lab-Tek, product name, manufactured by Nunk) is preliminarily polyethyleneimine (PEI, P-3143, product number, manufactured by Sigma). Two types of coatings (PEI-treated dish) or untreated (untreated dish) were used.
The culture broth used DF (DMEM / F-12 = 1: 1) medium, and in the examination of serum-free medium, sodium selenite (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was included and apo-transferrin (T-1147, product number, Sigma), insulin (CBP), and heparin (H-3149, product number, Sigma) were added in combination, and the mixture was added to a 24-well plate or chamber slide at 37 ° C, 5% CO.₂The cells were cultured and cultured, and survival and proliferation / differentiation were examined by detection of specific antigens by immunofluorescence. The medium was changed every 3 days.
[0039]
Moreover, as a known trophic factor, aFGF (Fibroblast growthfactor) (GF-01-010, trade name, manufactured by Biosource), bFGF (233-FB, trade name, manufactured by R & B Systems), TGF-α (3247SA, product number) , GibcoBRL), EGF (3247SA, product number, GibcoBRL), IGF-I (13245-014, product number, Life technologies), IGF-II (3255SA, product number, GibcoBRL), NGF (NC011, trade name, manufactured by Chemicon) and LIF (250-L, trade name, manufactured by R & B Systems), and neural stem cell line using culture supernatants of neuronal tumor cells, glioma and neuroblastoma. Add to culture system and increase It was investigated differentiation potential (Bottenstein, J.E., and Sato, G.H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 514-517 (1979)). The five cell lines were provided by the Cancer Research Foundation Cell Bank (JCRB).
[0040]
Analysis of cell population in cell suspension
To obtain a neural stem cell line from the neuroepithelial cell layer, a cell suspension was prepared by an enzymatic method. Observation of this cell suspension under a microscope reveals a cell population with a relatively large number of neural stem cell lines and different properties, mainly fibroblasts, matrix cells, blood cells, dead cells and cells. It was debris.
Next, in order to determine where each of these different cell populations occupies the display on the workstation monitor, it was investigated where the neural stem cell line was distributed.
In monitoring the cell suspension distribution, approximately 5 cell populations were observed.
[0041]
First, a preliminary experiment using a blood cell system was performed.
Blood cells were collected from the abdominal aorta with a syringe containing heparin when the fetus was removed, diluted with an equal volume of PBS, and then separated with a lymphocyte specific gravity separation solution (manufactured by Nippon Antibody Laboratories).
According to flow cytometry analysis of isolated hematopoietic cells, limba cells are distributed almost to the lower left of the neural stem cell population, and granulocytes and macrophage-like cells are distributed to the upper left and right, and are located away from the neural stem cell population. It was found to be accepted.
[0042]
We also analyzed the neural stem cell lines, fibroblasts, and matrix cells that had been separated into individual cell suspensions by culture methods based on cell adhesion, and identified the location of each cell (mountain). Mari Nobata, Yuzo Tsukada, Neurochemistry 446-447 (1994)).
[0043]
From these results, fibroblast-like cells are located on the upper right side of the neural stem cell line population in the E region in FIG. 3, that is, in the F region, and the matrix cells are located slightly below and to the right, both separated from the neural stem cell line. It was.
Dead cells were distributed on the band from the lower left to the right, and were completely separated from the neural stem cell line population. Cell debris was found in the lower left.
[0044]
Sorting result
Cell suspension prepared by enzyme treatment of fetal brain (1.7 × 10⁷cells / ml) were immediately applied to the flow cytometer, and the results are shown in FIG. 3a.
The position of the neural stem cell line was judged from the result of the preliminary experiment using the culture method, and the sorting range was E shown in FIG.
We also tried sorting F. The cells set in E and F were sorted into right and left tubes, respectively.
In the analysis of the cell population on the display, the occupation ratio of E to the whole cells (A range in FIG. 3) was 37%, and F was 23%.
In order to examine the recovery rate of the sorted cells, it was analyzed by cytometry again. The results are shown in FIG.
FIG. 3 b shows a cytogram after sorting of the sort range E, and separation from the sort range F was possible.
Further, the cell recovery rate after the separation of E was 77.5%.
[0045]
[Table 1]

[0046]
Culture results of sorted cells
As a result of culturing the sorted cell population of FIG. 3, E showed many blue circular cells, F showed yellow and deformed cells, and blue round cells seen in E and many larger cells. It was.
This cell population was cultured in a PEI-treated dish and an untreated dish, respectively.
In untreated dishes, E cells proliferate while converging, but in PEI-treated dishes, E cells proliferate and continue to grow, creating colonies while causing converging between the expanded cells. I found out that
The proliferating ability of the proliferating cells was maintained even in the secondary culture.
In F, cells proliferating with fibroblast-like adhesion were observed.
The fibroblast-adherent cells can be separated by weak pipetting, but they grow while converging when transferred to a new untreated dish and subcultured.
[0047]
Therefore, the cell population of E was used as a cell population including a neural stem cell line for the following examination of culture / proliferation ability.
[0048]
Examination of cell culture
Table 2 shows the results of studies on serum-free culture of a cell population containing the neural stem cell line. Among them, the survival of the neural stem cell line was observed in the DF medium containing transferrin, insulin, and heparin.
By adding bFGF to this, it shifted from survival to proliferation.
It was also found that the addition of heparin has a synergistic effect and plays an important role in the survival of neural stem cell lines.
[0049]
[Table 2]

[0050]
Cell growth ability of neurotrophic factor
FIG. 4 shows a 24-hole plate 1 × 10⁴Cells / cm²AFGF (20 ng / ml), bFGF (10 ng / ml), TGF-α (50 ng / ml), EGF (50 ng / ml), IGF-I (100 ng / ml), and IGF- The result of having examined about II (100 ng / ml) addition is shown.
aFGF and bFGF showed strong proliferation ability of neural stem cell lines. In particular, bFGF showed strong proliferation ability.
The evaluation was performed by monitoring absorption at wavelengths of 570 and 600 nm after 6 days of culture using an Alamar Blue assay (Alamar Biosciences).
[0051]
Effect of culture supernatant of glioma and neuroblastoma
As shown in Table 3, the culture supernatant of glioma had almost no effect, but three types of neuroblastoma promoted proliferation, although a difference in degree was observed. These were cultured in serum-free medium.
[0052]
[Table 3]

[0053]
Example 1
On the basis of knowledge such as the sorting results obtained in Reference Example 1 and the results of examination of the culture conditions, first, fractionation with standard sensitivity was attempted.
1-1) Preparation of cell suspension
Preparation with 0.1% (v / v) trypsin (manufactured by GibcoBRL): As the fetal brain, embryonic day 12 (E12) SD rat brain including forebrain was used. The excised fetal brain was incubated with 0.1% trypsin / PBS at 37 ° C. for 30 minutes.
Thereafter, 0.04% (v / v) DNase (manufactured by Sigma) and 0.07% (v / v) ovomucoid (manufactured by Worthington) were added, left still for 5 minutes, and washed with DF medium.
[0054]
The supernatant was removed by centrifugation, and the settled brain tissue was 100 μg / ml transferrin (manufactured by Sigma), 25 μg / ml insulin (manufactured by Collaborative Biochemical Products), 25 μg / ml heparin (manufactured by Sigma), 30 nM sodium selenate. In a DF medium (TIH-DF) containing 50 units / ml penicillin and 50 μg / ml streptomycin (made by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), pipette up and down 20 times with a 1 ml pipette equipped with 200 μl of yellow tip. A cell suspension was obtained by petting.
[0055]
Preparation by mechanical crushing: A portion of the isolated fetal brain contained in a 1 ml pipette fitted with 200 μl yellow tip in 1 ml PBS without trypsin but with 0.04% (v / v) DNase / DF. Repeatedly pipetting up and down 20 times and allowed to stand, and only the tissue fragment that settled in a few minutes was pipetted again.
This operation was repeated three times in total, and each cell suspension was collected, washed with DF medium, and stored in TIH-DF. Each cell suspension prepared by these two methods was sequentially applied to a flow cytometer. All operations were performed in a serum-free medium.
[0056]
1-2) Cell culture
The culture was performed by adding 5 ng / mlbFGF (manufactured by R & D) to TIH-DF medium and 4 × 10.³/ Cm²5% CO at 37 ° C. using a 3.5 cm dish (Falcon)₂It carried out on condition of this.
As for the cultured medium, a new medium or a separately prepared medium was exchanged by half every 3 to 4 days. The number of nerve cell clusters (spheres) formed up to the determined culture date was measured under an inverted microscope in a 3.5 cm dish.
[0057]
The secondary nerve cell mass is cultured by transferring the floating nerve cell mass formed in the primary culture to a tube with a transfer pipette and making a single (non-aggregated) cell suspension by mechanical grinding as described above. 4x10³Cells / cm²It was cultured again at a culture density of.
The degree of differentiation of the cultured cells was determined by picking up the neural cell mass formed by the predetermined culture date with a 200 μl yellow chip, transferring it to an 8-well chamber slide (manufactured by NUNK), and culturing in a differentiation medium for one week. After that, it was determined from the degree of expression of the differentiation antigen.
As a differentiation medium, a TIH-DF medium containing 1 ng / ml bFGF, 1% fetal bovine serum and 1 μM retinoic acid was used.
[0058]
1-3) Preparation of nestin peptide antibody
In order to select a region that is suitable as an antigen from the primary structure of the nestin molecule, a region that satisfies these setting criteria was selected using Hyphil values, SurfPr values, and Al-Ind values (The University of Tokyo, Institute of Medical Science) Using a computer from the Genome Center).
A homology search was performed on the selected region using BLAST. Finally, two sites of 515-533 (ESGLDTEETQDSQGPLQKE (SEQ ID NO: 1)) on the N-terminal side and 1723-1737 (DIGGQSPNLDSEQVN (SEQ ID NO: 2)) on the C-terminal side were selected from the amino acid sequence of the nestin molecule.
In synthesizing two kinds of peptides, one cysteine residue was added to the C-terminal side of the former (N20) and one to the N-terminal side of the latter (C16). Hemocyanin (KLH) was used as a carrier protein and bound to each synthetic peptide to prepare an antigen. Rabbits were immunized to several subcutaneous sites.
[0059]
The first immunization was performed using Freund's complete adjuvant (FCA), and after 3 weeks, additional immunization was performed every other week using incomplete adjuvant (FIA), and blood was collected as appropriate to check the antibody titer. The antiserum was purified by affinity chromatography prepared by binding two peptides to a carrier (FMP activated cellulose fine, manufactured by Seikagaku Corporation).
The two purified antibodies (IgG) were both positive for primary cells, but C16 antibody was used. The antibody was stored at −30 ° C. until use. The specificity of C16 as an anti-nestin antibody is the primary culture system using an anti-nestin antibody (Cattaneo, E. and McKay, R., Nature 347, 762-765 (1990)) provided by Dr. Masato Nakafuku, University of Tokyo. Compared with the specificity of the cells.
[0060]
1-4) Flow cytometry with standard sensitivity
Similar to Reference Example 1, analysis was performed from a cytogram of a two-dimensional screen divided into 64 channels by FLS and PLS.
The flow cytometer used was an EPICS (registered trademark, manufactured by COULTER) in which a flow cell was equipped with a chip having a 488 nm, 15 mW output argon laser and a 100 μm aperture. The liquid feeding line was sterilized in advance with 70% ethanol, and the sheath liquid was sterilized and filtered PBS.
In order to obtain data reproducibility, conditions were set as follows.
FLS: 150 volts (gain 5), PLS: 405 volts (gain 10), difference between sheath pressure and sample pressure: 0.60 to 0.64 (sample pressure / sheath pressure = 6.88 / 7.5), sample Flow: 34-37, flow rate: 800-1000 cells / second.
[0061]
1-5) Identification of nestin positive cells in cell suspension by flow cytometry
The cell suspension prepared with trypsin was filtered with a nylon filter (pore size: 50 μm), and a part of the suspension was applied to a flow cytometer and analyzed with FLS and PLS.
As shown in FIG. 1a, the cells could be differentiated into 6 cell clusters (I′-VI ′) based on the nature of the scattered light.
In order to identify the cells contained in each of these cell clusters, a sorting gate for analysis was created so as to surround the clusters as shown in (I to VI) of FIG. 1b.
[0062]
Cells sorted for each sorting gate were collected in a tube (2063, product number, manufactured by Falcon). 0.5 ml of TIH-DF medium was previously added to the tube, and the sorted cells were replaced with a new tube when the volume reached 4 ml. The tube was centrifuged to collect the cells. The cells were fixed and then stained with an anti-nestin antibody. Each result is shown in FIG.
FIG. 5 is a histogram in which each gate is stained with an anti-nestin antibody and the fluorescence intensity is used as a parameter.
As shown in FIG. 5, nestin-positive cells were analyzed using flow cytometry again, and this time they were analyzed and displayed using a histogram with the fluorescence intensity as a parameter.
As a result, nestin positive cells were gates III and IV, and converged mainly to gate III. As can be seen from the cytogram, gate III corresponds to a cell population containing the neural stem cell line E of Reference Example 1.
[0063]
1-6) Separation of nestin positive cells from other cells
Cells sorted from each gate were collected by centrifugation and immediately cultured in DF-TIH medium supplemented with bFGF. FIG. 6 (scale bar: 25 μm) shows the observation results of the cultured cells with a phase contrast microscope.
FIG. 6a shows the cells obtained from Gate III, FIG. 6b shows the cells obtained from Gate VI, FIG. 6c shows the cells obtained from Gate V, and FIG. 6d shows the cells obtained from Gate IV, respectively. An observation result is shown.
[0064]
As shown in FIG. 6a, nestin-positive cells obtained from gate III form a nerve cell mass, whereas in gate IV shown in FIG. 6d, supporting cells that adhere to the culture dish surface together with some nerve cell mass. In addition, in the gate V shown in FIG. 6c, fibroblast-like cells that differ in morphology from IV and adhere widely to the surface of the culture dish were observed.
Cell debris was found at Gate I, dead cells were found at Gate II, and supporting cells such as doublets and histocytes in FIG. 6b were found at Gate VI.
[0065]
1-7) Secondary culture of cells sorted from gate III
The morphology of cells sorted from Gate III is shown in FIG. As described above, clusters were observed, and the gate III from which the fractions were collected was cultured in a serum-free medium (TIH-DF) containing bFGF for 6 days. As a result, formation of nerve cell masses shown in FIG. 7a was observed. It was.
In addition, a single (non-aggregated) cell suspension was prepared from this nerve cell mass by an enzymatic method, and the formation of a secondary nerve cell mass was expected. However, as shown in FIG. Many flat type cells adhering to the surface were observed. Note that the scale bar in FIG. 7 indicates 25 μm.
Further, flat type cells adhering to the dish surface were weakly positive when stained with anti-nestin antibody / FITC.
[0066]
1-8) Immunostaining
The cells were fixed with 4% (w / v) paraformaldehyde-0.1 M PBS (pH 7.3) for 20 minutes at room temperature, and then immunostaining was performed by single or double staining using each antibody described below, Positive cells were identified with a fluorescence microscope, and the positive rate was calculated.
[0067]
The antibodies used were anti-nestin antibody (secondary antibody: FITC-labeled goat anti-rabbit IgG (Fab ′) 2 antibody (manufactured by Cappel)), anti-β-tubulin isotype III antibody (manufactured by Sigma-Aldrich), anti-MAP- 2 antibodies (Chemicon) and anti-GFAP antibody (Chemicon) (each secondary antibody: TRITC-labeled goat anti-mouse IgG antibody), anti-O4 antibody (Chemicon) (secondary antibody: FITC-labeled goat anti-rabbit IgM antibody).
As these controls, anti-rabbit IgG antibody (manufactured by Sigma), anti-mouse IgG antibody (manufactured by Sigma) and anti-mouse IgM antibody (manufactured by Sigma) were used as primary antibodies.
The anti-O4 antibody is an antibody against oligodendrocytes.
[0068]
2-1) High sensitivity sorting
From the results of 1-7), the sensitivity of FLS and PLS used in flow cytometry with standard sensitivity was changed in order to separate the neural stem cell line from the flat type cells that adhere to the dish surface. As shown, the average 45% (FLS) and 10% (PLS) were set stronger.
In order to obtain data reproducibility, conditions were set as follows.
FLS: 250 volts (gain 5), PLS: 440 volts (gain 10), difference between sheath pressure and sample pressure: 0.62 to 0.72 (sample pressure / sheath pressure = 6.78 / 6.88), sample Flow: 28-38, flow rate: 400-700 cells / second.
[0069]
[Table 4]

2-2) Results of high sensitivity sorting
When a cell suspension prepared in the same manner was analyzed using this highly sensitive method, the cluster III cell population was separated into two as shown in the cytogram of FIG. 2b. That is, nestin positive cells were fractionated into two different forms of cells.
These clusters were newly designated as clusters IIIA and IIIB.
[0070]
Next, the cells of clusters IIIA and IIIB are sorted, and the result of culturing in a serum-free medium (TIH-DF) containing bFGF for 6 days is shown in FIG. 8 (scale bar: 25 μm).
As shown in FIG. 8, regarding the morphology of the cells in the regions of clusters IIIA and IIIB, the former formed a nerve cell mass, and in the latter, flat type cells adhering to the dish surface were observed.
The region of fibroblast-like cells was shifted further to the right than IIIB and was different from the region of IIIB.
[0071]
As can be seen from FIG. 2c in which gates III, IIIA, and IIIB are represented on one screen with 30 channels as position markers for each of FLS and PLS, the neural stem cell lineage in the III region is shifted upward in the group of cells observed in this IIIA region. It is thought that
Since the cells that had been mixed in cluster III were newly recognized as cluster IIIB, it was possible to sort a high-purity living neural stem cell line from cluster IIIA.
Therefore, it was possible to sort a neural stem cell line of high purity living cells by the method of the present invention.
[0072]
Separately, the cell suspension prepared by mechanically grinding the forebrain was analyzed by flow cytometry in the same manner. As with the enzymatic method, cluster III was found in two regions, cluster IIIA and IIIB. It was.
[0073]
2-3) Cell recovery rate and purity by sorting
Sorting tried 5 times independently from Gate IIIA. As shown in Table 5, when the cells of the cell suspension treated with the enzyme were directly stained with an anti-nestin antibody, the number of positive cells was 52.5% of the total cells.
Further, when the cell suspension was adapted to flow cytometry, the cells of gate IIIA were sorted and stained with an anti-nestin antibody, it was 38.6% of the total cells.
The number of anti-nestin antibody positive cells obtained by this method is 3-5 × 10 6 per fetus.⁴It was a cell. The cell suspension of fetal brain treated by mechanical grinding as shown in Table 6 was also calculated in the same manner.
[0074]
[Table 5]

[0075]
[Table 6]

[0076]
2-4) Examination of the viability of neural stem cell lines sorted with high purity
Neural stem cell line sorted from gate IIIA is 5 × 10 5 with DF-TIH containing 5 ng / ml bFGF.³Cells / cm²Incubated in
The cultured cells grew until the 8th day of culture and increased in size while forming a nerve cell mass, but all died after 9-10 days in culture.
Therefore, the survival conditions after the 10th day of culture were examined as shown in FIG.
[0077]
In FIG. 9, A + / B− indicates that cells of gate IIIA are included but cells of gate IIIB are not included, and A + / B + indicates that cells of gate IIIA and gate IIIB are included. The number of cell masses was calculated with an inverted microscope.
In order to examine the effect of the concentration of bFGF addition, 20 ng / ml bFGF was used, but no survival was observed after the 10th day.
Next, when the dish type surface-adhesive flat type cells were sorted from Gate IIIB, and the neural stem cell line sorted from Hegate IIIA was added and cultured, survival after day 10 could be confirmed.
Survival was observed even when the number of days to which the neural stem cell line was added was added to each culture day from the first day to the eighth day of culture.
However, as shown in FIG. 9, when a DF-TIH medium containing adhesive cells but not bFGF was used as a control condition, survival of the neural stem cell line was not observed.
[0078]
2-5) Long-term proliferation of neural stem cell line
From the above-described examination of viability, the high-purity neural stem cell line obtained by the method of the present invention was killed on the 10th day of culture with bFGF alone, and IIIB adherent cells or adherent cells were used as long-term culture conditions. It was found that it was essential to add the culture supernatant.
[0079]
Moreover, survival and proliferation were observed when the nerve cell mass proliferating after the 10th day by co-culture was transferred to TIH-DF medium containing 5 ng / ml bFGF with a pipette. When the nerve cell mass on the 20th day of culture was made into a single cell by the enzyme treatment method and cultured in a TIH-DF medium containing bFGF, only the secondary nerve cell mass was formed.
[0080]
2-6) Analysis of the degree of differentiation of neural stem cell line
From the expression of the differentiation antigen, the degree of differentiation of the neural stem cell line obtained by the present invention was analyzed.
According to the culture conditions of 1-2), when the cells were cultured for 6 days in DF-TIH containing bFGF and then fixed and stained with 4% (w / v) paraformaldehyde, the constituent cells were nestin positive. The obtained nerve cell mass was also positive for anti-β tubulin III antibody specific for neural progenitor cells.
After these nerve cell masses were switched to the differentiation medium on the 6th day of culture and cultured for 7 days, they were also positive for MAP-2 which is a marker of nerve cells.
At that time, cells that were positive for astrocytes GFAP and cells that were positive for oligodendrocytes O4 were not found, but in the neuronal mass cultured after switching to 15 days or later, GFAP positive cells and further O4 positive cells were found. Admitted.
[0081]
From the analysis of the degree of differentiation of the neural stem cell line, it was found that the neural stem cell line obtained by the method of the present invention was a living neural stem cell line in the early development.
[0082]
Therefore, according to the method using the flow cytometry of the present invention, the living neural stem cell line in the early development can be purified with high purity without adding any foreign substance to the cell by identifying and displaying it as position information on the secondary screen. It became possible to sort.
[0083]
【The invention's effect】
  As described above, the present inventionDetails of fetal tissue, adult tissue, etc.The purpose of living without any modification from the cell mixtureThe neural stem cell lineIt enables rapid sorting, and in particular, enables rapid sorting of living neural stem cell lines in early development that can be used for basic research of regenerative medicine and treatment such as transplantation as its application. It is.
[0084]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a cytogram at standard sensitivity. a: A two-dimensional screen in which cell clusters are differentiated. b: A two-dimensional screen in which a sorting gate for the cell cluster differentiated by a is created.
FIG. 2 is a diagram showing cytograms at standard sensitivity and high sensitivity for gate III in FIG. 1; a: Two-dimensional screen with standard sensitivity for Gate III. b: Two-dimensional screen with high sensitivity for gate III. c: A two-dimensional screen displaying gates III, IIIA and IIIB on one screen.
FIG. 3a is a diagram showing the result of applying a cell suspension prepared by enzyme treatment of fetal brain to a flow cytometer. FIG. 3 b is a diagram showing the cytogram after sorting the sorting range E.
FIG. 4 is a graph showing the influence of neurotrophic factors.
FIG. 5 is a diagram showing a histogram in which each gate is stained with an anti-nestin antibody and the fluorescence intensity is used as a parameter.
FIG. 6 is a diagram showing the culture of cells sorted from gates III to VI according to standard sensitivity and the difference in their cell morphology.
FIG. 7 is a diagram showing the morphology of cells sorted from gate III. a: After fractionation, 6 days after culturing in serum-free medium (TIH-DF) containing bFGF. b: Secondary culture after creating a single cell suspension from a.
FIG. 8 is a diagram showing the difference in the morphology of cells sorted from gates IIIA and IIIB.
FIG. 9 is a graph showing the effect on the survival of neural stem cell lines in adherent cells sorted from gate IIIB.
FIG. 10 is a schematic diagram of a flow cytometer system that can be used in the present invention.
[Explanation of symbols]
1 Sheath pressure regulator
2 Sheath liquid container
3 Sheath line
4 Sample pressure regulator
5 Pinch valve
6 Transducer
7 Flow cell
8 Laser light
9 Scattered light
10 Positive voltage plate
11 Negative voltage plate
12 Right sort
13 Left sort
14 Sample solution container

Claims (1)

分取の対象とする神経幹細胞と神経前駆細胞とを含む組織をトリプシン処理して調製した、前記の神経幹細胞と神経前駆細胞とを含む複数種の細胞が混合してなる混合細胞懸濁液を用いて、フローサイトメトリーにより細胞にレーザ光を照射し、蛍光標識を用いることなく、その照射光の前方散乱光及び側方散乱光を測定し、その測定値を２次画面上に位置情報として識別表示して、これにより、前記組織から前記神経幹細胞及び神経前駆細胞を分離・分取する神経幹細胞の分取方法であって、
前記フローサイトメトリーによる細胞の流れであるサンプル・コアの流れが、シース圧とサンプル圧の差０．５〜０．７５且つサンプル圧６．７５ｐｓｉ〜７．０ｐｓｉで制御され、
前記前方散乱光の測定が、検出器に印加する電圧２２０ボルト〜３３０ボルトで検出され、かつ前記側方散乱光の測定が、検出器に印加する電圧４００ボルト〜５２０ボルトで検出されることを特徴とする神経幹細胞の分取方法。 A mixed cell suspension prepared by trypsinizing a tissue containing neural stem cells and neural progenitor cells to be sorted, and comprising a mixture of a plurality of types of cells including the neural stem cells and neural progenitor cells. used, the laser beam is irradiated to the cells by flow cytometry, without using a fluorescent label, measuring the forward scattered light and side scattered light of the irradiation light, the position information of the measurement value on the secondary display identification to as, thereby, the neural stem cells and neural progenitor cells from the tissue to a preparative method of God neural stem cells you preparative separation · min,
The flow of the sample core, which is the flow of cells by the flow cytometry, is controlled by the difference between the sheath pressure and the sample pressure of 0.5 to 0.75 and the sample pressure of 6.75 psi to 7.0 psi,
The measurement of the forward scattered light is detected at a voltage of 220 volts to 330 volts applied to the detector, and the measurement of the side scattered light is detected at a voltage of 400 volts to 520 volts applied to the detector. A method for sorting neural stem cells.

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