JP4129531B2 - Control program and culture apparatus - Google Patents
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Description
本発明は、制御プログラム、及び培養装置に関し、特に、培養装置を制御するのに適当な制御プログラム、及び細胞の連続培養に適した培養装置に関する。 The present invention relates to a control program and a culture apparatus, and more particularly to a control program suitable for controlling the culture apparatus and a culture apparatus suitable for continuous cell culture.
細胞の液体培養は基礎研究や医療、醸造など様々な分野で行われており、細胞を一定の成長相に保ちつつ連続的に培養を行う連続培養は様々な研究で行われており、そのための装置は以前から存在していた(エイブル株式会社の製品群など；http://www.able-biott.co.jp/index.html)。従来の装置では細胞濃度や酸素濃度といった指標で細胞の状態をモニタリングすることと、連続培養からサンプリングした細胞を低温状態（４〜１０℃）で保存することができた。 Liquid culture of cells is performed in various fields such as basic research, medicine, and brewing, and continuous culture in which cells are continuously cultured while maintaining a constant growth phase has been performed in various studies. The device has existed for a long time (Products of Able Co., Ltd .; http://www.able-biott.co.jp/index.html). In the conventional apparatus, it was possible to monitor the state of the cell with an index such as cell concentration or oxygen concentration, and to store the cells sampled from the continuous culture in a low temperature state (4 to 10 ° C.).
また、生物発光リアルタイム測定法は生物に発光遺伝子を組み込んで生きたままの細胞で任意遺伝子の発現量の変動を連続的に測定できる有効な実験法である。（Kondo et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 1993, vol90 pp5672-5676）
しかし、従来の装置では（１）細胞の***速度をモニタリングすることや（２）生物発光レポーター株の生物発光量をモニタリングすること、（３）連続培養からサンプリングした細胞を極低温状態（約−８０℃以下）で保存することができなかった。 However, in the conventional apparatus, (1) monitoring the cell division rate, (2) monitoring the amount of bioluminescence of the bioluminescent reporter strain, (3) the cells sampled from the continuous culture in a cryogenic state (about − It could not be stored at 80 ° C. or lower).
また、従来の生物発光リアルタイム測定法は、細胞を一定の状態で保ちつつ、生物発光を測定することができなかった。 Further, the conventional bioluminescence real-time measurement method cannot measure bioluminescence while keeping cells in a certain state.
したがって、これらの機能を総合的に兼ねそろえている培養装置、及び当該培養装置を効率的に制御し得る制御プログラムが提供されれば、細胞***速度及び任意遺伝子の発現量をリアルタイムで解析し、各サンプルからのデータを比較検討することにより新たな知見を提供し得るが、このような培養装置及び制御プログラムはこれまで存在しない。 Therefore, if a culture apparatus having these functions comprehensively and a control program capable of efficiently controlling the culture apparatus are provided, the cell division rate and the expression level of an arbitrary gene are analyzed in real time, Although new knowledge can be provided by comparing the data from each sample, there is no such culture apparatus and control program.
そこで、本発明は、培養装置を的確に制御し、連続培養を可能とする制御プログラムの提供、及び細胞***速度、任意遺伝子の発現等をモニタリングすることが可能な培養装置を提供することにある。 Then, this invention is providing the control apparatus which controls a culture | cultivation apparatus exactly and enables continuous culture | cultivation, and provides the culture | cultivation apparatus which can monitor the cell division rate, the expression of arbitrary genes, etc. .
上記目的を達成するために、発明者らは、連続培養を可能とする制御システムについて鋭意研究した結果、本発明の培養装置及び制御プログラムを見出すに至った。 In order to achieve the above object, the inventors have intensively studied a control system that enables continuous culture, and as a result, have found the culture apparatus and control program of the present invention.
本発明の制御プログラムは、 液体培養用のフラスコに取り付けられた光電センサーからなる細胞濃度センサーに接続されたコンピュータを、
予め設定した測定間隔で前記細胞濃度センサーからの測定値を読み取り、記録する手段、
前記測定間隔毎に、予め入力した前記細胞濃度センサーからの測定値と細胞濃度との相関関係を利用して、前記記録された測定値から培養液中の細胞濃度を算出する手段、
前記算出された細胞濃度データを記録する手段、
前記記録された測定値と、前記記録された細胞濃度と、測定期間中の前記記録された測定値の変化量とによって、細胞増殖率を算出する手段、
として機能させ、
前記細胞増殖率の計算方法は、単位時間当たりの細胞増殖率G i (Cell Growing rate / h)を、下記の計算式：
G i = ((C c + ΔC x ΣΔE i ) / C c ) (60 / T)
を用いて、測定開始時に入力した電圧−細胞濃度の検定曲線と、下記の入力値：
j:細胞濃度-電圧の検定曲線の組み番号(0 - n)（培養開始時に決定する）
C j : 電圧-細胞濃度の検定曲線を調べた際の細胞濃度(Cells / ml)（培養開始時に決定する）
E j : 電圧-細胞濃度の検定曲線を調べた際の電圧(V)（培養開始時に決定する）
C c :培養時の培養液の細胞濃度(Cells / ml)（培養開始時に決定する）
T:測定間隔(min)（培養開始時に決定する）
i:測定番号(0 - n)（培養期間に測定間隔毎にカウントアップしていく）
ΣΔE i :測定番号i-1からiまでの期間における電圧変化量合計（培養期間に自動的に記録する）
と、上記入力値を元に下記の計算式：
ΔC = (C j - C j-1 ) / (E j - E j-1 )
（ただし、細胞濃度C j とC j-1 はそれぞれ電圧-細胞濃度の検量線を引いたときに「C j-1 < C c < C j 」を満たす細胞濃度C c にもっとも近い値）
を用いて計算した培養時における電圧変化量あたりの細胞濃度変化量ΔC（Cells / ml / V）とから計算する方法であることを特徴とする。当該制御プログラムによれば、細胞濃度センサーからの記録された測定値、細胞濃度、測定中の測定値の変化量とによって細胞増殖率をリアルタイムに提供することが可能となる。
The control program of the present invention includes a computer connected to a cell concentration sensor composed of a photoelectric sensor attached to a flask for liquid culture ,
Means for reading and recording the measurement value from the cell concentration sensor at a predetermined measurement interval ;
Means for calculating the cell concentration in the culture solution from the recorded measurement value by utilizing the correlation between the measurement value and the cell concentration from the cell concentration sensor inputted in advance for each measurement interval;
Means for recording the calculated cell concentration data;
Means for calculating a cell proliferation rate based on the recorded measurement value, the recorded cell concentration, and a change amount of the recorded measurement value during a measurement period;
Function as
The cell growth rate is calculated by calculating the cell growth rate G i (Cell Growing rate / h) per unit time as follows :
G i = ((C c + ΔC x ΣΔE i ) / C c ) (60 / T)
, The voltage-cell concentration calibration curve entered at the start of the measurement and the following input values:
j: cell concentration-voltage test curve set number (0-n) (determined at the start of culture)
C j : Cell concentration (Cells / ml) when examining the test curve of voltage-cell concentration (determined at the start of culture)
E j : Voltage (V) when examining the test curve of voltage-cell concentration (determined at the start of culture)
C c : Cell concentration of the culture medium during culture (Cells / ml) (determined at the start of culture)
T: Measurement interval (min) (determined at the start of culture)
i: Measurement number (0-n) (Count up every measurement interval during the culture period)
ΣΔE i : Total voltage change during the period from measurement number i-1 to i (automatically recorded during the culture period)
And the following formula based on the above input values:
ΔC = (C j -C j-1 ) / (E j -E j-1 )
(However, the cell concentrations C j and C j-1 are values closest to the cell concentration C c that satisfies “C j-1 <C c <C j ”, respectively, when a voltage-cell concentration calibration curve is drawn. )
The cell density change amount ΔC (Cells / ml / V) per voltage change amount at the time of culture calculated using the above is characterized in that it is a method of calculation . According to the control program, it is possible to provide the cell growth rate in real time based on the recorded measurement value from the cell concentration sensor, the cell concentration, and the amount of change in the measurement value during measurement.
本発明の制御プログラムの他の実施態様において、さらに、コンピュータを、
前記フラスコへの培地の供給量を記録する手段、
前記記録された培地の供給量と前記フラスコ内の培養液の体積によって、細胞増殖率を算出する手段、
として機能させ、
前記細胞増殖率の計算方法の代わりに、単位時間当たりの細胞増殖率G i (Cell Growing rate / h)を、下記の計算式：
G i = ((V+ R i x T x S) / V) (60 / T)
を用いて、下記の入力値：
S:追加培養液の流速(ml/min)（培養開始時に決定する）
T:測定間隔(min)（培養開始時に決定する）
V:培養液の体積(ml)。（培養開始時に決定する）
i:測定番号(0 - n)。（培養期間に測定間隔毎にカウントアップしていく）
R i : 測定番号i-1からiの期間における追加培地の供給時間率（培養期間に自動的に記録する）
から計算する方法を用いることを特徴とする。当該プログラムによれば、培地の供給量と培養液の体積によって、細胞増殖率をリアルタイムに提供し得る。
In another embodiment of the control program of the present invention, a computer is further provided.
Means for recording the amount of medium supplied to the flask;
Means for calculating a cell growth rate according to the supply amount of the recorded medium and the volume of the culture solution in the flask;
Function as
Instead of the cell growth rate calculation method, the cell growth rate G i (Cell Growing rate / h) per unit time is calculated by the following formula:
G i = ((V + R i x T x S) / V) (60 / T)
Use to input the following values:
S: Flow rate of additional culture solution (ml / min) (determined at the start of culture)
T: Measurement interval (min) (determined at the start of culture)
V: Volume of culture (ml). (Determined at the start of culture)
i: Measurement number (0-n). (Count up every measurement interval during the culture period)
R i : Feeding rate of additional medium during the period from measurement number i-1 to i (automatically recorded during the culture period)
The method of calculating from is used . According to the program, the cell growth rate can be provided in real time according to the supply amount of the medium and the volume of the culture solution.
本発明の制御プログラムの好ましい実施態様において、さらに、コンピュータを、
予め設定されたタイミングで細胞のサンプリングを行うようにサンプリング装置へ制御信号を出力する手段、
として機能させることを特徴とする。
In a preferred embodiment of the control program of the present invention , a computer is further provided.
Means for outputting a control signal to the sampling device so as to sample the cells at a preset timing;
It is made to function as.
本発明の制御プログラムの好ましい実施態様において、さらに、コンピュータを、
リアルタイムに送られてくる前記測定値に基づいて、前記細胞増殖率を表示する手段と、
所定時間後に新たにリアルタイムに送られてくる測定値に基づいて、前記細胞増殖率をリアルタイムで更新表示する手段、
として繰り返し実行させることを特徴とする。当該プログラムによれば、リアルタイムに送られてくる測定値を利用して、細胞増殖率をリアルタイムに表示することを可能とする。
In a preferred embodiment of the control program of the present invention , a computer is further provided.
Means for displaying the cell growth rate based on the measured values sent in real time;
A means for updating and displaying the cell proliferation rate in real time based on a measurement value newly sent in real time after a predetermined time;
It is characterized by being repeatedly executed. According to the program, it is possible to display the cell growth rate in real time by using the measurement value sent in real time.
本発明の制御プログラムの好ましい実施態様において、さらに、コンピュータを、
リアルタイムに送られてくる生物試料の細胞増殖速度の計算結果に基づいて前記サンプリングのタイミングを制御し、前記サンプリング装置へ制御信号を出力する手段、
として機能させることを特徴とする。当該プログラムによれば、培養中にモニタリングした任意の値(細胞***速度)が予め設定された設定値を超えた場合などに、サンプリングを実行させることが可能である。
In a preferred embodiment of the control program of the present invention , a computer is further provided.
Means for controlling the sampling timing based on the calculation result of the cell growth rate of the biological sample sent in real time and outputting a control signal to the sampling device;
It is made to function as. According to the program, sampling can be executed when an arbitrary value (cell division rate) monitored during culturing exceeds a preset value.
また、本発明のコンピュータ読み取り可能な記録媒体は、上記の制御プログラムを記録したことを特徴とする。Also, a computer-readable recording medium of the present invention is characterized in that the above control program is recorded.
また、本発明の培養装置は、液体培養用のフラスコと該フラスコに取り付けられた光電センサーからなる細胞濃度センサーとを有する培養部と、前記細胞濃度センサーが接続されており、上記の制御プログラムによって制御される制御用コンピュータとを備えることを特徴とする。 Further, the culture apparatus of the present invention is connected to a culture unit having a flask for liquid culture and a cell concentration sensor comprising a photoelectric sensor attached to the flask, and the cell concentration sensor. characterized in that it comprises a control computer to be controlled.
また、本発明の培養装置の好ましい態様において、さらに、前記培養部からの培養液のサンプリングを行うサンプリング部を含み、前記サンプリング部が前記制御用コンピュータに接続されていることを特徴とする。当該培養装置によれば、培養中の細胞の挙動、例えば、細胞***速度などに基づき、サンプリングを行うことができ、生物試料の培養環境下における挙動を観察することが可能である。 In a preferred aspect of the culture apparatus of the present invention, the culture apparatus further includes a sampling unit that samples the culture solution from the culture unit, and the sampling unit is connected to the control computer . According to the culture apparatus, sampling can be performed based on the behavior of cells in culture, for example, the cell division rate, and the behavior of a biological sample in a culture environment can be observed.
また、本発明の培養装置の好ましい態様において、さらに、生物試料を保管する保管部を含むことを特徴とする。これによって、培養中の任意の時間において、サンプリングされた試料を適宜保管することができる。Moreover, the preferable aspect of the culture apparatus of this invention WHEREIN: Furthermore, the storage part which stores a biological sample is characterized by the above-mentioned. As a result, the sampled sample can be appropriately stored at any time during the culture.
また、本発明の培養装置の好ましい態様において、さらに、洗浄システム部を有することを特徴とする。この洗浄システム部によって、送液ラインの自動洗浄システムを提供することができる。すなわち、この洗浄システム部によって、複数種類の洗浄液（例えば、水、エタノールなど）と空気を用いてサンプリング経路を自動的に洗浄する機構を提供することが可能となる。 Moreover, the preferable aspect of the culture apparatus of this invention has further a washing | cleaning system part, It is characterized by the above-mentioned. This cleaning system unit can provide an automatic cleaning system for a liquid feed line. That is, this cleaning system unit can provide a mechanism for automatically cleaning the sampling path using a plurality of types of cleaning liquids (for example, water, ethanol, etc.) and air.
本発明によれば、細胞の***速度をモニタリングすることができるので、連続培養中の細胞の***速度をデータとして把握することができる。また、生物発光レポーター株の生物発光レポーター遺伝子のプロモーターとして任意の遺伝子のプロモーター領域を用いることで、連続培養中の細胞の任意遺伝子の発現を生物発光として連続的かつ自動的に測定・記録することができる。また、サンプリングした試料を極低温下で保管することによって、RNAや不安定なタンパクなどの成分が分解されずに保存できる。さらに、上記の機能、すなわち、細胞の***速度及び任意遺伝子の発現量のモニタリング機能、及びサンプリングした細胞の極定温状態での保存機能、を併せ持つことによって、細胞***速度や任意遺伝子の発現量を元にサンプリングのタイミングを計算して自動実行させることができる。細胞***速度や任意遺伝子の発現量とサンプリングした細胞から得たデータとを比較することができる。 According to the present invention, since the cell division rate can be monitored, the cell division rate during continuous culture can be grasped as data. In addition, by using the promoter region of any gene as the promoter of the bioluminescent reporter gene of the bioluminescent reporter strain, the expression of any gene in cells during continuous culture can be continuously measured and recorded as bioluminescence. Can do. Also, the sampled specimen by storing under cryogenic can be stored without being decomposed component such as RNA or unstable protein. Furthermore, by combining the above functions, that is, the function of monitoring the cell division rate and the expression level of an arbitrary gene, and the function of preserving the sampled cells in an extremely constant temperature state, the cell division rate and the expression level of an arbitrary gene can be reduced. The sampling timing can be calculated and automatically executed. The cell division rate and the expression level of an arbitrary gene can be compared with data obtained from sampled cells.
本発明の実施の形態を、図面を参照して詳細に説明する。図１（ａ）は、本発明の制御プログラムの模式図の一例を示す。図１（ｂ）は、本発明の装置の各部の写真と接続の様子の一例を示す。 Embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. Fig.1 (a) shows an example of the schematic diagram of the control program of this invention. FIG.1 (b) shows an example of the photograph of each part of the apparatus of this invention, and the mode of a connection.
＜本発明の使用方法と動作の一例＞
本発明の装置は（Ａ）制御用コンピュータ、（Ｂ）連続培養部分、（Ｃ）発光測定部分、（Ｄ）サンプリング部分で構成されている。装置の各部はコンピュータ内のプログラムで制御される。<Example of usage and operation of the present invention>
The apparatus of the present invention comprises (A) a control computer, (B) a continuous culture part, (C) a luminescence measurement part, and (D) a sampling part. Each part of the apparatus is controlled by a program in the computer.
（Ａ）制御用コンピュータ：制御用コンピュータは本発明の他の部分と電気的に接続されている(図1a,b)。コンピュータ上で働く制御プログラムによって他の部分から送られてくる測定信号を読みとって電子ファイルとして記録し、制御信号を送って各部の動作を制御する(図1a,b)。 (A) Control computer: The control computer is electrically connected to other parts of the present invention (FIGS. 1a, b). A measurement signal sent from another part is read and recorded as an electronic file by a control program operating on the computer, and the operation of each part is controlled by sending a control signal (FIGS. 1a and b).
当該制御プログラムとして、好適には、本発明の制御プログラムを適用することができる。 As the control program, the control program of the present invention can be preferably applied.
ここで、本発明の制御プログラムの一例について説明すると以下のようである。すなわち、まず、予め細胞濃度の設定値データをキーボードなどの入力装置から入力する。データファイルには、細胞濃度センサーからは測定値が記録される。 Here, an example of the control program of the present invention will be described as follows. That is, first, cell concentration setting value data is input in advance from an input device such as a keyboard. Measurement values are recorded in the data file from the cell concentration sensor.
中央処理装置は、メインメモリ中の制御プログラムの指令を受け、データファイルから設定値データと測定値データを読み出し、両者を比較し、設定値データと測定値データとでいずれが高いかを比較して、培地供給装置へ培地を培養液へ供給するかどうかの制御信号を送る。 The central processing unit receives an instruction from the control program in the main memory, reads the set value data and the measured value data from the data file, compares both, and compares which of the set value data and the measured value data is higher. Then, a control signal indicating whether to supply the culture medium to the culture solution is sent to the culture medium supply device.
また、培養液中の細胞濃度の算出は、予め入力した細胞濃度センサーからの測定値と細胞濃度との相関関係を利用する。得られた細胞濃度データと、記録された測定値と、測定中の測定値の変化量とによって、細胞増殖率を算出することができる。 In addition, the calculation of the cell concentration in the culture medium uses the correlation between the measured value from the cell concentration sensor inputted in advance and the cell concentration. The cell proliferation rate can be calculated from the obtained cell concentration data, the recorded measurement value, and the amount of change in the measurement value during measurement.
ここで、細胞増殖速度について、算出方法の一例を含めて説明すれば以下の通りである。 Here, the cell growth rate will be described as follows including an example of a calculation method.
本発明にかかる装置は数秒おきに光電センサーをもちいて培養液の濁度（培養中の細胞濃度に比例）を光電センサー出力の電圧変化として測定することができる（標準で6秒ごとに5回測定して平均値を算出）。細胞濃度が高くなるほどに電圧値は低下し、電圧値が設定した下限値よりも低くなったなら培地を供給して細胞濃度を希釈することができる。逆に上限値よりも高くなったなら培地の供給を停止することができる。 The apparatus according to the present invention can measure the turbidity of a culture solution (proportional to the cell concentration during culture) using a photoelectric sensor every few seconds as a voltage change of the photoelectric sensor output (standard 5 times every 6 seconds). Measure and calculate the average value). As the cell concentration increases, the voltage value decreases. When the voltage value becomes lower than the set lower limit value, the culture medium can be supplied to dilute the cell concentration. On the contrary, the supply of the culture medium can be stopped if it becomes higher than the upper limit value.
本発明は、細胞状態を一定に保つことができる。この際に本発明では、培地を供給した時間の比率や培養中の光電センサー電圧値の変化を記録しており、設定した測定間隔(下記T、細胞の種類によるが5〜60 minに設定することが多い)毎にこれらの記録値を元に計算を行うことでリアルタイムに細胞増殖速度を算出・記録することができる。 The present invention can keep the cell state constant. At this time, in the present invention, the ratio of the time during which the medium is supplied and the change in the photoelectric sensor voltage value during the culture are recorded, and the set measurement interval (T below, depending on the cell type, is set to 5 to 60 min. In many cases, the cell growth rate can be calculated and recorded in real time by calculating based on these recorded values.
＜細胞増殖率の計算方法１：供給培地量型の計算＞
以下の計算式は連続液体培養中の培養液量(V)と細胞濃度を均一に保つために
加えた追加培養液の流速(S)、追加培地の供給時間率などの入力値から細胞増殖
率（Gi）を計算する。<Calculation method of cell growth rate 1: Calculation of supply medium amount type>
The following formula is used to calculate the cell growth rate from the input values such as the flow rate (S) of the additional culture solution added to maintain a uniform cell volume (V) and cell concentration during continuous liquid culture, and the supply time rate of the additional medium. Calculate (G i ).
入力値：
S:追加培養液の流速(ml/min)。連続培養開始時に決定する。
T:測定間隔(min)。連続培養開始時に決定する。
V:培養液の体積(ml)。連続培養開始時に決定する。
i:測定番号(0 - n)。連続培養期間に測定間隔毎にカウントアップしていく。
Ri: 測定番号i-1からiの期間における追加培地の供給時間率。連続培養期間に
装置が自動的に記録する。Input value:
S: Flow rate of additional culture solution (ml / min). Determine at the start of continuous culture.
T: Measurement interval (min). Determine at the start of continuous culture.
V: Volume of culture (ml). Determine at the start of continuous culture.
i: Measurement number (0-n). Count up every measurement interval during the continuous culture period.
R i : Feeding rate of additional medium during the period from measurement number i-1 to i. The instrument automatically records during the continuous culture period.
出力値：
Gi: 単位時間あたりの細胞増殖率(Cell Growing rate / h)。入力値を元に自動
的に算出する。Output value:
G i : Cell growth rate per unit time (Cell Growing rate / h). Automatically calculated based on the input value.
出力値の計算式：
Gi = ((V+ Ri x T x S) / V)(60 / T) Output value calculation formula:
G i = ((V + R i x T x S) / V) (60 / T)
＜細胞増殖率の計算方法２：電圧変化量型の計算＞
以下の計算式は測定開始時に入力した電圧−細胞濃度の検定曲線と、連続液体
培養中の培地を追加していないときの電圧変化量の合計値(ΣΔEi)などの入力値
から細胞増殖率（Gi）を計算する。<Calculation method 2 of cell proliferation rate: Calculation of voltage variation type>
The following formula is the cell growth rate from the input value such as the voltage-cell concentration calibration curve entered at the start of measurement and the total voltage change (ΣΔE i ) when no medium is added during continuous liquid culture. Calculate (G i ).
入力値：
j:細胞濃度-電圧の検定曲線の組み番号(0 - n)。連続培養開始時に決定する。
Cj: 電圧-細胞濃度の検定曲線を調べた際の細胞濃度(Cells / ml)。連続培養開始
時に決定する。
Ej: 電圧-細胞濃度の検定曲線を調べた際の電圧(V)。連続培養開始時に決定する。
Cc:連続培養時の培養液の細胞濃度(Cells / ml)。連続培養開始時に決定する。
T:測定間隔(min)。連続培養開始時に決定する。
i:測定番号(0 - n)。連続培養期間に測定間隔毎にカウントアップしていく。
ΣΔEi:測定番号i-1からiまでの期間における培地を供給していないときの電圧
変化量合計。連続培養期間に装置が自動的に記録する。
Input value:
j: cell concentration-voltage calibration curve set number (0-n). Determine at the start of continuous culture.
C j : Cell concentration (Cells / ml) when examining a calibration curve of voltage-cell concentration. Determine at the start of continuous culture.
E j : Voltage (V) when examining the calibration curve of voltage-cell concentration. Determine at the start of continuous culture.
C c : Cell concentration of the culture solution during continuous culture (Cells / ml) . Determine at the start of continuous culture.
T: Measurement interval (min). Determine at the start of continuous culture.
i: Measurement number (0-n). Count up every measurement interval during the continuous culture period.
ΣΔE i : Total voltage change amount during the period from measurement number i-1 to i when no medium is supplied. The instrument automatically records during the continuous culture period.
出力値：
ΔC: 培養時における電圧変化量あたりの細胞濃度変化量(Cells / ml / V)。
測定開始時に入力値を元に計算する。
Gi:単位時間あたりの細胞増殖率(Cell Growing rate / h)。入力値を元に自動的
に算出する。
Output value:
ΔC: Change in cell concentration per cell change during culture (Cells / ml / V).
Calculate based on the input value at the start of measurement.
G i : Cell growth rate per unit time (Cell Growing rate / h). Automatically calculated based on the input value.
出力値の計算式：
ΔC = (Cj - Cj-1) / (Ej - Ej-1)
・ただし、細胞濃度CjとCj-1はそれぞれ電圧-細胞濃度の検量線を引いたときに「Cj-1 < Cc < Cj」を満たす細胞濃度Ccもっともに近い値。
Gi = ((Cc + ΔC x ΣΔEi) / Cc)(60 / T) Output value calculation formula:
ΔC = (C j -C j-1 ) / (E j -E j-1 )
However, the cell concentrations C j and C j-1 are values closest to the cell concentration C c satisfying “C j-1 <C c <C j ” when a voltage-cell concentration calibration curve is drawn.
G i = ((C c + ΔC x ΣΔE i ) / C c ) (60 / T)
以上のような計算式の一例を用いて、記録された測定値と、記録された細胞濃度と、測定中の測定値の変化量によって、細胞増殖率を算出することができる。 Using an example of the above calculation formula, the cell proliferation rate can be calculated from the recorded measurement value, the recorded cell concentration, and the amount of change in the measurement value during measurement.
また、制御プログラムは、予め設定されたタイミングで細胞のサンプリングを行うようにサンプリング装置へ制御信号を出力することができる。予め設定するタイミングは、任意に決定することができ、限定されないが、生物発光量のモニタリングによって得られた値や、細胞増殖速度などのデータに基づいて決定してもよい。例えば、細胞***速度や遺伝子の発現量がピークのときなどにサンプリングを実行したり、培養中にモニタリングした任意の値（細胞***速度、生物発光量）が設定値を越えた場合にサンプリングを実行するように設定することができる。また、それらの測定値をリズム解析して得た予測される***速度／生物発光量のピークに自動的にサンプリングを行うことができる。 Further, the control program can output a control signal to the sampling device so as to sample cells at a preset timing. The timing set in advance can be arbitrarily determined, and is not limited, but may be determined based on a value obtained by monitoring the amount of bioluminescence, data such as a cell growth rate, or the like. For example, sampling is performed when the cell division rate or gene expression level is at a peak, or sampling is performed when any value (cell division rate, bioluminescence amount) monitored during culture exceeds the set value. Can be set to. In addition, it is possible to automatically perform sampling on the peak of the expected division rate / bioluminescence obtained by rhythm analysis of these measured values.
（B）連続培養部分：
連続培養部分は液体培養用のフラスコとそれに取り付けた細胞濃度センサー、追加用の培地、培地の追加制御用の部品（送液ポンプや電磁弁など）から構成されている(図1a,b)。細胞濃度センサーは制御用コンピュータと接続され、コンピュータ上の制御プログラムが測定値を読みとる。培地の追加制御用の部品も制御コンピュータと接続されており、コンピュータ上の制御プログラムは制御信号を送って培地の追加制御用部品の動作を制御する(図1a,b)。(B) Continuous culture part:
The continuous culture part is composed of a flask for liquid culture, a cell concentration sensor attached thereto, an additional medium, and parts for additional control of the medium (liquid feed pump, solenoid valve, etc.) (FIGS. 1a and b). The cell concentration sensor is connected to a control computer, and a control program on the computer reads the measured value. Parts for additional control of the culture medium are also connected to the control computer, and a control program on the computer sends a control signal to control the operation of the additional control parts of the culture medium (FIGS. 1a and b).
センサーによって細胞濃度を測定する手段について説明すれば、以下のようである。例えば、光電センサーを用いて濁度として測定する方法や培養液の電気容量を測定する方法、粒子計を用いて測定する方法などがあり、これらを適宜本発明において使用することができる。濁度や電気容量として測定した場合は測定値を電気信号として取り出し、電流−電圧変換回路やA/D変換回路を介してコンピュータ上のプログラムで読みとる（図1a）。その際に細胞濃度は予め入力しておいたそれぞれの測定値と細胞濃度の相関を示した検量線から算出することができる。粒子計を用いた場合は粒子濃度を細胞濃度と見なすことができる。 The means for measuring the cell concentration by the sensor will be described as follows. For example, there are a method of measuring as turbidity using a photoelectric sensor, a method of measuring the electric capacity of a culture solution, and a method of measuring using a particle meter, and these can be used as appropriate in the present invention. When measured as turbidity or electric capacity, the measured value is taken out as an electrical signal and read by a computer program via a current-voltage conversion circuit or A / D conversion circuit (Fig. 1a). At that time, the cell concentration can be calculated from a calibration curve showing a correlation between each measurement value inputted in advance and the cell concentration. When a particle meter is used, the particle concentration can be regarded as the cell concentration.
本発明においては培養液の細胞濃度を濃度センサーを用いて任意の時間間隔で測定を行い、細胞濃度が入力した値よりも濃くなったら、培地を供給して細胞濃度を希釈することができる（図1a,b）。逆に設定値よりも薄くなったら培地の供給を停止し、細胞の増殖によって細胞濃度は増加する（図1a,b）。本発明はこの一連の動作を継続的に繰り返すことで細胞濃度を一定に保つことができる。細胞濃度以外にも上記の各測定値を直接指標にして培地の供給・停止を制御することができる。 In the present invention, the cell concentration of the culture solution is measured at an arbitrary time interval using a concentration sensor, and when the cell concentration becomes higher than the input value, the culture medium can be supplied to dilute the cell concentration ( Figure 1a, b). On the contrary, when it becomes thinner than the set value, the supply of the medium is stopped, and the cell concentration increases by the proliferation of the cells (FIGS. 1a and b). In the present invention, the cell concentration can be kept constant by continuously repeating this series of operations. In addition to the cell concentration, the supply / stop of the medium can be controlled using each of the above measured values as a direct index.
培地の追加手段については、培地の供給の調節はコンピュータ上の制御プログラムから送液ポンプや電磁弁に電気信号を送ることで、送液ポンプの送液速度を制御することや電磁弁を開閉することによって行うことができる（図1a,b）。 As for the means for adding the culture medium, the supply of the culture medium is controlled by sending an electrical signal from the control program on the computer to the liquid feed pump and solenoid valve, thereby controlling the liquid feed speed of the liquid feed pump and opening and closing the solenoid valve. (FIGS. 1a and b).
また、測定値や細胞濃度の値をデータとして記録する方法については、本発明は上記の方法によって細胞状態を一定に保つ際に、センサーの測定値や細胞濃度、追加用培地を供給した時間の比率や記録を電子ファイルとして制御用コンピュータに記録することができる（図1a,b）。更に、これらの記録値を元に設定した測定間隔毎に計算を行うことでリアルタイムに細胞増殖速度を算出し、制御用コンピュータに電子ファイルとして記録することができる。 In addition, regarding the method of recording the measurement value and the cell concentration value as data, the present invention relates to the measurement value of the sensor, the cell concentration, the time when the additional medium was supplied when the cell state is kept constant by the above method. Ratios and records can be recorded as electronic files on the control computer (Fig. 1a, b). Furthermore, the cell growth rate can be calculated in real time by performing calculation at each measurement interval set based on these recorded values, and can be recorded as an electronic file on the control computer.
(C)発光測定部分：
細胞に生物発光遺伝子を組み込んでいた場合には、制御プログラムは装置を制御して定期的に培養液をサンプリングして、生物発光を測定することができる(図1a, 図2)。(C) Luminescence measurement part:
If the bioluminescent gene has been incorporated into the cell, the control program can control the device and periodically sample the culture solution to measure bioluminescence (FIGS. 1a, 2).
サンプリングされた培養液中の生物試料の生物発光の測定には、例えば、基質が溶液、揮発性などの違いにより以下のような例を挙げることができる。基質が溶液である場合の例として、図２（ａ）に示す。発光レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼなどを用いる場合は、ペリスタポンプを駆動することで個別に送液した培養液と基質溶液とをサンプリング経路上で混合し、細胞に発光基質を供給することができる。その後、混合液が発する生物発光を光電子増倍管で測定することができる(図２a)。 Examples of the measurement of bioluminescence of a biological sample in a sampled culture solution include the following examples depending on differences in the substrate solution and volatility. An example of the case where the substrate is a solution is shown in FIG. When firefly luciferase or the like is used as the luminescent reporter gene, the luminescent substrate can be supplied to the cells by driving the peristaltic pump to mix the individually sent culture solution and substrate solution on the sampling path. Thereafter, the bioluminescence emitted from the mixture can be measured with a photomultiplier tube (FIG. 2a).
なお、図２（a）においては、培養液中にホタルルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ生物試料を用いて、当該生物試料とD-ルシフェリン溶液を混合させているが、生物発光を測定できれば、混合の手段は特に問わない。 In FIG. 2 (a), the biological sample and the D-luciferin solution are mixed using a biological sample in which a firefly luciferase gene is incorporated in the culture solution. However, if bioluminescence can be measured, mixing means can be used. Is not particularly limited.
また、基質が揮発性のものを用いる場合の例として、図２（ｂ）に示す。発光レポーター遺伝子としてバクテリアルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合は、送液した培養液を揮発性基質であるn-デカナールを充満させた容器に通気性チューブを用いて通すことで細胞に発光基質を供給し、培養液が発する生物発光を測定部で測定する(図２b)。測定したデータは測定信号としてコンピューターに転送され、制御プログラムによって記録・表示される(図1a, 図2)。 An example of using a volatile substrate is shown in FIG. When the bacterial luciferase gene is used as the luminescent reporter gene, the luminescent substrate is supplied to the cells by passing the fed culture solution through a container filled with n-decanal, which is a volatile substrate, using a breathable tube. The bioluminescence emitted by the liquid is measured by the measuring unit (FIG. 2b). The measured data is transferred to a computer as a measurement signal, and recorded and displayed by a control program (FIGS. 1a and 2).
(D)サンプリング部
装置はプログラムの入力に基づいて送液ポンプを駆動して培養液をサンプリングし、保管することが可能である(図1a,b)。極低温の保冷剤を満たすことができる保温部をサンプリング部に付加することで、サンプリングした細胞を極低温状態で（−80℃以下）に保つことを可能になっている。極低温とは特に限定されないが、ほとんどのタンパク質の働きを止めることができ、分解しやすい生体高分子（ｍRNAなど）も安定して保存し得るという観点から、好ましい温度範囲としては、−７０℃以下である。(D) Sampling unit The device can sample and store the culture solution by driving the feeding pump based on the input of the program (FIGS. 1a and b). By adding a heat retaining part capable of filling a cryogenic cryogen to the sampling part, it is possible to keep the sampled cells in a cryogenic state (−80 ° C. or lower). Although the cryogenic temperature is not particularly limited, a preferable temperature range is −70 ° C. from the viewpoint that most protein functions can be stopped and biopolymers (such as mRNA) that are easily degraded can be stably stored. It is as follows.
また、本発明の制御プログラムを利用すれば、予め設定されたタイミングで細胞のサンプリングを行うように、制御信号により制御されたサンプリング装置などの駆動装置によって、細胞を保管部又は測定装置へ移送することができる。 In addition, if the control program of the present invention is used, the cells are transferred to the storage unit or the measuring device by a driving device such as a sampling device controlled by the control signal so that the cells are sampled at a preset timing. be able to.
ここで、本発明の一実施例を説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されることを意図するものではない。以下の実施例は、本発明の一実施態様を説明するために用いたものであり、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨及び範囲を逸脱しない限り、いかなる変更等を排除するものではない。 Here, although an embodiment of the present invention will be described, the present invention is not intended to be interpreted as being limited to the following embodiment. The following examples are used to explain one embodiment of the present invention, and do not exclude any changes or the like without departing from the spirit and scope of the present invention described in the claims. Absent.
実施例１
本実施例において用いた培養装置について説明すれば以下の通りである。
連続培養部分は液体培養用の角フラスコとそれに取り付けた光電センサー（細胞濃度測定用）、追加用の培地、培地制御の追加制御用の送液ポンプから構成される。連続培養の開始には、液体培養用の角フラスコ内に培養液を入れ、光電センサーを取り付ける。培養用のボトルには送液ポンプを介して新鮮な培地を追加できるように接続する。制御プログラムは光電センサーを用いて培養液の細胞濃度を測定し、培養液濃度が入力した値よりも上昇すると培地を追加することで細胞濃度を一定に保つ。また、制御プログラムは測定した細胞濃度や細胞濃度の変化、追加した培養液量をそれぞれ記録しており、これらの値から細胞濃度を表示することや、細胞増殖速度の変化を計算して表示することができる。
Example 1
The culture apparatus used in this example will be described as follows.
The continuous culture part is composed of a square flask for liquid culture, a photoelectric sensor (for cell concentration measurement) attached thereto, an additional medium, and a liquid feed pump for additional control of medium control. At the start of continuous culture, the culture solution is placed in a square flask for liquid culture and a photoelectric sensor is attached. It connects so that a fresh culture medium can be added to the bottle for culture | cultivation via a liquid feeding pump. The control program measures the cell concentration of the culture solution using a photoelectric sensor, and keeps the cell concentration constant by adding a medium when the culture solution concentration rises above the input value. In addition, the control program records the measured cell concentration, changes in cell concentration, and the amount of added culture solution, and displays the cell concentration from these values and calculates and displays changes in cell growth rate. be able to.
細胞に生物発光遺伝子を組み込んでいた場合には、制御プログラムは装置を制御して定期的に培養液をサンプリングして、生物発光を測定することができる。発光レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子などを用いる場合は、ペリスタポンプを駆動することで個別に送液した培養液と基質溶液とをサンプリング経路上で混合し、細胞に発光基質を供給する。その後、混合液が発する生物発光を光電子増倍管で測定する。発光レポーター遺伝子としてバクテリアルシフェラーゼを用いる場合は、送液した培養液を揮発性基質であるn-デカナールを充満させた容器に通気性チューブを用いて通すことで細胞に発光基質を供給し、培養液が発する生物発光を測定部で測定する。測定したデータをコンピューターに転送され、制御プログラムによって記録・表示される。 When a bioluminescent gene has been incorporated into the cell, the control program can measure the bioluminescence by controlling the apparatus and periodically sampling the culture solution. When a firefly luciferase gene or the like is used as the luminescent reporter gene, the culture solution and the substrate solution individually fed by driving the perista pump are mixed on the sampling path to supply the luminescent substrate to the cells. Thereafter, the bioluminescence emitted from the mixed solution is measured with a photomultiplier tube. When bacterial luciferase is used as the luminescent reporter gene, the luminescent substrate is supplied to the cells by passing the fed culture solution through a container filled with n-decanal, a volatile substrate, using a breathable tube. The bioluminescence emitted by is measured by the measurement unit. The measured data is transferred to the computer and recorded and displayed by the control program.
装置はプログラムの入力に基づいて送液ポンプを駆動して培養液をサンプリングし、極低温で保管する。 Based on the input of the program, the device drives the feed pump to sample the culture and stores it at a cryogenic temperature.
以上のような培養装置を用いて、実際に、細胞増殖速度のモニタリング、生物発光のモニタリング、細胞から抽出したRNAの解析を行った。 Using the culture apparatus as described above, cell growth rate monitoring, bioluminescence monitoring, and RNA extracted from cells were actually analyzed.
(1) Synechocystis sp. PCC6803の細胞増殖速度のモニタリング
藍色細菌Synechocystis sp. PCC6803を1LのBG-11液体培地に植え付け、本装置を用いて30 ℃、白色光照射下（45μmol/m2/sec）で通気培養を開始し、培養液濃度がOD730=0.25(2.5 × 109 cells/ml)になるまで細胞を増殖させた。培養液濃度の安定を確認した後、12時間の暗処理を行い、その後、白色光照射下（45 μmol/m2/sec）に置き、細胞の増殖速度を追加した新鮮な培地の量から計算した。(1) Monitoring of cell growth rate of Synechocystis sp. PCC6803 The cyanobacteria Synechocystis sp. PCC6803 was planted in 1 L of BG-11 liquid medium and irradiated with white light (45 μmol / m 2 / sec) using this device. ) And aeration culture was started, and the cells were grown until the culture solution concentration reached OD730 = 0.25 (2.5 × 10 9 cells / ml). After confirming the stability of the culture solution concentration, perform a dark treatment for 12 hours, then place it under white light irradiation (45 μmol / m 2 / sec) and calculate the cell growth rate from the amount of fresh medium added. did.
その結果、連続培養中のSynechocystisの細胞増殖速度の変動パターンを観測できていることが判明した(図３)。図３は、本発明の装置及び制御プログラムを用いて測定した細胞増殖速度のリズムを示す。図３は、本培養装置の細胞増殖速度モニタリング機能を用いて、藍色細菌Synechocystis sp. Strain PCC6803の細胞増殖速度を測定した一実施例を示す。横軸は、測定開始からの時間、縦軸は、1時間あたりの細胞数の増殖倍率である。連続培養期間中の細胞増殖速度の変動パターンが観察できている。 As a result, it was found that the fluctuation pattern of the cell growth rate of Synechocystis during continuous culture could be observed (FIG. 3). FIG. 3 shows the rhythm of the cell growth rate measured using the apparatus and control program of the present invention. FIG. 3 shows an example in which the cell growth rate of the cyanobacteria Synechocystis sp. Strain PCC6803 was measured using the cell growth rate monitoring function of the present culture apparatus. The horizontal axis is the time from the start of measurement, and the vertical axis is the multiplication factor of the number of cells per hour. The fluctuation pattern of the cell growth rate during the continuous culture period can be observed.
図3に示す値は連続培養期間中に表示されており、これの表示値を元に実験スケジュールを柔軟に変更することができる。 The values shown in FIG. 3 are displayed during the continuous culture period, and the experiment schedule can be flexibly changed based on the displayed values.
(2)次に、 ホタルルシフェラーゼを発光遺伝子として用いた生物発光モニタリングを行った。 (2) Next, bioluminescence monitoring was performed using firefly luciferase as a luminescence gene.
好熱性藍色細菌Thermosynechococcus elongatusに耐熱性ホタルルシフェラーゼを発光遺伝子として組み込んだ発光レポーター株を1LのBG-11液体培地に植え付け、本装置を用いて50 ℃、白色光照射下（20μmol/m2/sec）、5％CO2通気培養を開始し、培養液濃度がOD730=0.6(6 × 109 cells/ml)になるまで細胞を増殖させた。培養液濃度の安定を確認した後、12時間の暗処理を行い、その後、連続明下（12 μMol/m2/sec）で連続培養を行った。生物発光測定は培養液を２時間に１回サンプリングして、5mM D-ルシフェリン溶液と混合して暗室内に110分間静置し、光電子増倍管で生物発光を測定した。Planting a light emitting reporter strain incorporating thermostable firefly luciferase thermophilic cyanobacterial Thermosynechococcus elongatus as a light-emitting gene BG-11 liquid medium 1L, 50 ° C. using the present device, the white light illumination under (20μmol / m 2 / sec), 5% CO 2 aeration culture was started, and the cells were grown until the culture solution concentration reached OD730 = 0.6 (6 × 10 9 cells / ml). After confirming the stability of the culture solution concentration, dark treatment was performed for 12 hours, and then continuous culture was performed under continuous light (12 μMol / m 2 / sec). In the bioluminescence measurement, the culture solution was sampled once every 2 hours, mixed with a 5 mM D-luciferin solution and allowed to stand in a dark room for 110 minutes, and bioluminescence was measured with a photomultiplier tube.
その結果、本装置の生物発光測定機能を用いて、好熱性藍色細菌Thermosynechococcus elongatusに耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ発光レポーター株の生物発光を測定することができた（図４a）。図４は、本発明の装置とプログラムを用いて測定した生物発光リズムを示す。図４（ａ）は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を用いた生物発光レポーター株の生物発光を測定した例を示す。図４（ｂ）は、バクテリアルシフェラーゼ遺伝子を用いた生物発光レポーター株の生物発光を測定した例を示す。 As a result, the bioluminescence of the luminescent reporter strain in which the thermostable firefly luciferase gene was incorporated into the thermophilic cyanobacteria Thermosynechococcus elongatus could be measured using the bioluminescence measuring function of this apparatus (FIG. 4a). FIG. 4 shows the bioluminescence rhythm measured using the apparatus and program of the present invention. FIG. 4 (a) shows an example of measuring bioluminescence of a bioluminescent reporter strain using a firefly luciferase gene. FIG. 4 (b) shows an example of measuring bioluminescence of a bioluminescent reporter strain using a bacterial luciferase gene.
これによって、連続培養期間中の細胞の任意遺伝子の発現量が生物発光として測定できることが分かる。そして、ルシフェラーゼの前に接続したプロモーターの活性に従った明確なリズムを観測することができることが判明した。 This shows that the expression level of any gene in the cells during the continuous culture period can be measured as bioluminescence. And it became clear that a clear rhythm according to the activity of the promoter connected before luciferase can be observed.
（３）次に、バクテリアルシフェラーゼを発光遺伝子として用いた生物発光モニタリングを行った。 (3) Next, bioluminescence monitoring was performed using bacterial luciferase as a luminescence gene.
藍色細菌Synechocystis sp. PCC6803にバクテリアルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ発光レポーター株を1LのBG-11液体培地に植え付け、本装置を用いて30℃、白色光照射下（12μmol/m2/sec）、通気培養を開始し、培養液濃度がOD730=0.25になるまで細胞を増殖させた。培養液濃度の安定を確認した後、12時間の暗処理を行い、その後、連続明下（12μmol/m2/sec）で連続培養を行った。生物発光測定は培養液を1時間に１回サンプリング、通気性のチューブを用いて3%n-デカナール溶液を入れた容器通してから、暗室内に50分間静置した後、光電子増倍管で生物発光を測定した。A luminescent reporter strain with the bacterial luciferase gene incorporated into the cyanobacteria Synechocystis sp. PCC6803 is planted in 1 L of BG-11 liquid medium, and this device is used at 30 ° C under white light irradiation (12 μmol / m 2 / sec), aeration The culture was started, and the cells were grown until the culture solution concentration reached OD730 = 0.25. After confirming the stability of the culture solution concentration, dark treatment was performed for 12 hours, and then continuous culture was performed under continuous light (12 μmol / m 2 / sec). For bioluminescence measurement, the culture solution was sampled once an hour, passed through a container containing 3% n-decanal solution using an air-permeable tube, allowed to stand for 50 minutes in a dark room, and then a photomultiplier tube. Bioluminescence was measured.
その結果、本装置の生物発光測定機能を用いて、藍色細菌Synechocystis sp. PCC6803にバクテリアルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ発光レポーター株の生物発光を測定することができた（図4b）。Thermosynechococcusのときと同様、明確なリズムを観測することができる。 As a result, the bioluminescence of the luminescent reporter strain in which the bacterial luciferase gene was incorporated into the cyanobacteria Synechocystis sp. PCC6803 could be measured using the bioluminescence measurement function of this device (FIG. 4b). As with Thermosynechococcus, a clear rhythm can be observed.
（４）次に、自動サンプリング装置を用いてサンプリングしたクラミドモナス細胞から抽出したRNAの解析を行った。 (4) Next, RNA extracted from Chlamydomonas cells sampled using an automatic sampling device was analyzed.
Chlamydomonas reinhardtiiを1LのTAP液体培地に植え付け、本装置を用いて23 ℃、白色光照射下（45 μmol/m2/sec）で通気培養を開始し、培養液濃度が(1.7 × 106 cells/ml)になるまで細胞を増殖させた。培養液濃度の安定を確認した後、12時間の暗処理を行い、その後、白色光照射下（45 μmol/m2/sec）に置いた。本発明の自動サンプリング機能を用いて、連続培養したクラミドモナス細胞を２時間毎に50mlずつサンプリングし、極低温下で保管した。２４時間のサンプリングの終了後、極低温下で保管していた試料からRNAを抽出し、cabII遺伝子のプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを行った。Chlamydomonas reinhardtii was planted in a 1L TAP liquid medium, and aeration culture was started using this device under white light irradiation (45 μmol / m 2 / sec) at 23 ° C, and the culture solution concentration was (1.7 × 10 6 cells / The cells were grown to ml). After confirming the stability of the culture solution concentration, a dark treatment was performed for 12 hours, and then placed under white light irradiation (45 μmol / m 2 / sec). Using the automatic sampling function of the present invention, 50 ml of continuously cultured Chlamydomonas cells were sampled every 2 hours and stored at extremely low temperatures. After completion of sampling for 24 hours, RNA was extracted from a sample stored at a cryogenic temperature, and Northern hybridization was performed using a probe of cabII gene.
その結果、本発明の培養装置を用いてサンプリングした試料から得たRNAの電気泳動図のパターン（図5a）においては、rRNAが分解していないことが判明した。図５は、本発明の装置とプログラムを用いて培養及びサンプリングを行ったクラミドモナスの細胞から抽出したトータルRNAとノーザンブロット解析を示す。図５（a）は、装置を用いてサンプリングした試料から得られたトータルRNAの電気泳動図を示す。図５（ｂ）は、Cabll遺伝子プローブを用いたノーザンブロット解析を示す。 As a result, it was found that rRNA was not decomposed in the pattern of the electrophoretic diagram of RNA obtained from the sample sampled using the culture apparatus of the present invention (FIG. 5a). FIG. 5 shows Northern RNA analysis and total RNA extracted from Chlamydomonas cells cultured and sampled using the apparatus and program of the present invention. FIG. 5 (a) shows an electrophoretogram of total RNA obtained from a sample sampled using the apparatus. FIG. 5 (b) shows Northern blot analysis using the Cabll gene probe.
また、CabII遺伝子のDNA断片をプローブに用いたノーザン・ハイブリダイゼーション（図5b）では、CabII mRNAのバンドは分解されておらず明確なバンドを示した。このことから、本発明を用いてサンプリングしたクラミドモナス細胞から高品質のRNAを調製することができることが判明した。以上の結果、本発明の培養装置を用いてサンプリングし保管したクラミドモナス細胞から高品質のRNAを調製できることが判明した。 In Northern hybridization using a DNA fragment of CabII gene as a probe (FIG. 5b), the band of CabII mRNA was not decomposed and showed a clear band. From this, it was found that high quality RNA can be prepared from Chlamydomonas cells sampled using the present invention. As a result, it was found that high-quality RNA can be prepared from Chlamydomonas cells sampled and stored using the culture apparatus of the present invention.
要約すると、本発明の培養装置及び制御プログラムにより、連続培養している細胞の***速度の変動を計算・表示できること、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ発光レポーター株の生物発光を測定・表示できること、バクテリアルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ発光レポーター株の生物発光を測定・表示できること、自動サンプリングした試料から分解しやすい生体高分子（mRNAなど）を高品質で調製できることが証明された。 In summary, the culture apparatus and control program of the present invention can calculate and display fluctuations in the division rate of continuously cultured cells, can measure and display the bioluminescence of a luminescent reporter strain incorporating a firefly luciferase gene, and bacterial luciferase can be measured and displayed bioluminescence of luminescent reporter strain incorporating a gene, it was demonstrated that easily decomposed biopolymer from automatic sampling sample (such as mRNA) can be made by adjustment with high quality.
また、本発明の装置・プログラムはこれらの機能を兼ね備えることにより、リアルタイム表示した細胞***速度や生物発光量（遺伝子発現量）をもとに培養液の自動サンプリングを柔軟なスケジュールで行うことができる。また、サンプリングした試料から得たデータと細胞***速度や生物発光量（遺伝子発現量）を比較することができることも証明された。 Further, the apparatus / program of the present invention has these functions, so that it is possible to perform automatic sampling of a culture solution with a flexible schedule based on the cell division rate and bioluminescence amount (gene expression amount) displayed in real time. . It was also proved that data obtained from sampled samples can be compared with cell division rate and bioluminescence level (gene expression level).
実施例２
次に、本発明の装置の機能について、既存の装置と比較した。本発明の装置と既存の装置との比較を以下の表1にまとめた。Example 2
Next, the function of the device of the present invention was compared with that of an existing device. A comparison between the device of the present invention and existing devices is summarized in Table 1 below.
既存の連続培養装置は培地の自動追加によって細胞濃度を一定に保つ機能は持っている。本発明の培養装置は、既存の培養装置が有していない以下の機能、「細胞***速度のリアルタイム測定機能」、「ホタルルシフェラーゼやバクテリアルシフェラーゼなどの発光レポーターを用いた生物発光のリアルタイム測定機能」、「自動サンプリング機能」、「自動凍結保存機能」、を装置に搭載することで、培養中の細胞の状態を詳細かつ全自動でリアルタイム測定し、自動的にサンプリングして凍結保存することを可能とすることができることが判明した。 Existing continuous culture devices have a function to keep the cell concentration constant by automatically adding a medium. The culture apparatus of the present invention has the following functions that the existing culture apparatus does not have, "real-time measurement function of cell division rate", "real-time measurement function of bioluminescence using a luminescent reporter such as firefly luciferase or bacterial luciferase" , "Automatic sampling function" and "Automatic cryopreservation function" are installed in the device, and the state of cells in culture can be measured in detail and fully automatically in real time, and can be automatically sampled and stored frozen It turned out that can be.
実施例３
次に、本発明の別の実施態様を試みた。本発明の別の実施態様における模式図の一例を図６に示す。
既に説明した本発明の図１に示す実施態様との違いは、以下のようである。
すなわち、図１と比較した場合の変更点は、「洗浄システム」を追加した点である。「洗浄システム」はエタノールを用いて送液チューブ内壁に付着した細胞を洗浄し、空気と水を用いてエタノールを除去することで、送液チューブ内を常にクリーンな状態に保つためのものである。「洗浄システム」を搭載したことによって、高濃度の細胞培養液の自動サンプリングや生物発光のリアルタイム測定を安定に行うことが可能となる。高濃度の培養液を用いた生物発光リアルタイム測定については、後述の実施例４で説明する。Example 3
Next, another embodiment of the present invention was attempted. An example of the schematic diagram in another embodiment of the present invention is shown in FIG.
Differences from the embodiment of the present invention described above shown in FIG. 1 are as follows.
In other words, the change compared to FIG. 1 is that a “cleaning system” is added. "Washing system" is used to keep the inside of the liquid feeding tube clean by washing the cells attached to the inner wall of the liquid feeding tube using ethanol and removing the ethanol using air and water. . By installing the “cleaning system”, it becomes possible to stably perform automatic sampling of high-concentration cell culture solution and real-time measurement of bioluminescence. Bioluminescence real-time measurement using a high concentration culture solution will be described in Example 4 described later.
この洗浄システムを追加した場合の本発明の装置の動作について説明すれば、以下の通りである。 The operation of the apparatus of the present invention when this cleaning system is added will be described as follows.
培養装置の動作機構
細胞濃度を光電センサーで測定し、コンピューター上の制御プログラムによって培地の追加量を自動計算して培養液へ培地を自動追加することで、細胞濃度を一定に保つ。細胞濃度は実験者が任意に設定することができる。また、同プログラムによって、単位時間あたりの培地追加量（体積）、または単位時間あたりの光電センサーの電圧変化量から細胞***速度（細胞増殖速度）をリアルタイムに自動算出する。実験者が設定した任意の時間間隔で培養液を自動的にサンプリングし、発光検出部で生物発光量を自動測定して測定値を信号としてコンピュータへ送信する。発光検出部の測光デバイスは、光電子増倍管や高感度CCDカメラなどを使用する。コンピュータが受信した信号は、プログラムによって自動処理されて生物発光量がリアルタイム測定される。さらに、実験者が設定した任意のタイミングで培養液を自動的にサンプリングして、凍結保存容器中で保存する。生物発光測定のためのサンプリングや凍結保存のためのサンプリングを自動実行した直後は毎回、洗浄システムでサンプリング経路に付着した細胞を自動的に洗浄して取り除く。
Operating mechanism of the culture device The cell concentration is kept constant by measuring the cell concentration with a photoelectric sensor, automatically calculating the additional amount of the medium by the control program on the computer, and automatically adding the medium to the culture solution. The experimenter can arbitrarily set the cell concentration. In addition, according to the program, the cell division rate (cell growth rate) is automatically calculated in real time from the added amount of medium (volume) per unit time or the voltage change amount of the photoelectric sensor per unit time. The culture solution is automatically sampled at arbitrary time intervals set by the experimenter, the amount of bioluminescence is automatically measured by the luminescence detection unit, and the measured value is transmitted as a signal to the computer. The photometric device of the light emission detector uses a photomultiplier tube or a high sensitivity CCD camera. The signal received by the computer is automatically processed by the program and the amount of bioluminescence is measured in real time. Furthermore, the culture solution is automatically sampled at an arbitrary timing set by the experimenter and stored in a cryopreservation container. Immediately after the automatic execution of sampling for bioluminescence measurement or sampling for cryopreservation, cells attached to the sampling path are automatically washed and removed by the washing system .
このようにして洗浄システムを用いることによって、送液チューブ内を常にクリーンな状態にすることができることが分かる。 It can be seen that by using the cleaning system in this way, the inside of the liquid feeding tube can be always kept clean.
実施例４
次に、本発明の別の実施態様に係る装置について検討を加えた。この実施態様は、図２の装置に変更を加えたものであり、実施例３で述べた洗浄機構を利用している。
本装置における生物発光のリアルタイム測定の仕組みについて説明すれば、以下の通りである。Example 4
Next, an apparatus according to another embodiment of the present invention was examined. This embodiment is a modification of the apparatus shown in FIG. 2 and uses the cleaning mechanism described in the third embodiment.
The mechanism of real-time measurement of bioluminescence in this device will be described as follows.
(a)はホタルルシフェラーゼなど水溶性の発光基質を要求する生物発光系をレポーターに持った細胞の生物発光リアルタイム測定法である。まず、連続培養している培養液を送液ポンプで三叉路へ送液する。同時に別の送液ポンプでD-ルシフェリンなどの水溶性の基質を三叉路へ送液して培養液と混合し、培養液とルシフェリンの混合液を光電子増倍管などの測光デバイスの直下へ送液する。次に、測光デバイスで生物発光を測定し、測定データをコンピュータへ送信して記録する。コンピュータ上のプログラムで発光測定データをリアルタイムに視覚化および解析する。測定後の培養液は、廃液入れへ送液されて廃棄される。一連の動作は、コンピュータ上の制御プログラムによって実験者の設定した任意のタイミング・繰り返し回数・その他の設定値に基づいて自動的に実行される。 (a) is a method for real-time bioluminescence measurement of a cell having a bioluminescent system requiring a water-soluble luminescent substrate such as firefly luciferase as a reporter. First, the culture solution that has been continuously cultured is fed to the three-way through a feeding pump. At the same time, a separate solution pump supplies a water-soluble substrate such as D-luciferin to the three-way junction and mixes it with the culture solution. Then, the mixture of the culture solution and luciferin is sent directly under a photometric device such as a photomultiplier tube. To do. Next, bioluminescence is measured with a photometric device, and the measurement data is transmitted to a computer and recorded. Visualization and analysis of luminescence measurement data in real time using a computer program. The culture solution after the measurement is sent to the waste solution container and discarded. A series of operations is automatically executed based on an arbitrary timing, number of repetitions, and other set values set by the experimenter by a control program on the computer.
(b)はバクテリアルシフェラーゼ遺伝子など揮発性物質を発光基質に要求する生物発光系をレポーターに持った細胞の生物発光リアルタイム測定法である。まず、連続培養している培養液を送液ポンプで送液する。送液チューブには通気性チューブを使用し、これをあらかじめn-デカナールなどの揮発性の基質を充満させておいた容器に通しておく。揮発性の基質は通気性チューブの中へ拡散することができるので、送液チューブの中を培養液がゆっくりと通過する過程で培養液中の細胞に発光基質が投与される。基質を投与された培養液を光電子増倍管などの測光デバイスの直下へ送液する。次に、測光デバイスで生物発光を測定し、測定データをコンピュータへ送信して記録する。コンピュータ上のプログラムで測定データをリアルタイムに視覚化および解析する。測定後の培養液は、廃液入れへ送液されて廃棄される。一連の動作は、コンピュータ上の制御プログラムによって実験者の設定した任意のタイミング・繰り返し回数・その他の設定値に基づいて自動的に実行される。 (b) is a real-time bioluminescence measurement method for cells having a bioluminescence system that requires a luminescent substrate such as a bacterial luciferase gene as a luminescent substrate. First, the culture solution that has been continuously cultured is fed with a feed pump. Use a breathable tube as the liquid delivery tube, and pass it through a container filled with a volatile substrate such as n-decanal. Since the volatile substrate can diffuse into the breathable tube, the luminescent substrate is administered to the cells in the culture solution as the culture solution slowly passes through the feeding tube. The culture solution to which the substrate has been administered is fed directly under a photometric device such as a photomultiplier tube. Next, bioluminescence is measured with a photometric device, and the measurement data is transmitted to a computer and recorded. Visualize and analyze measurement data in real time with a program on a computer. The culture solution after the measurement is sent to the waste solution container and discarded. A series of operations is automatically executed based on an arbitrary timing, number of repetitions, and other set values set by the experimenter by a control program on the computer.
こうして送液チューブ内をクリーンに保ちつつ測定を行うことができる結果、より高精度の装置を実現できることが分かる。 It can be seen that, as a result of performing the measurement while keeping the inside of the liquid feeding tube clean in this way, a more accurate apparatus can be realized.
実施例５
次に、実施例１の実験手順にならって、単細胞性緑藻Chlamydomonas reinhardtiiの細胞増殖リズムのリアルタイムモニタリングについて調査した。Example 5
Next, following the experimental procedure of Example 1, real-time monitoring of the cell growth rhythm of the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii was investigated.
単細胞性緑藻Chlamydomonas reinhardtiiを1LのTAP液体培地に植え付け、本装置を用いて23℃、白色光照射下（46μmol/m2/sec）で通気培養を行った。培養液の細胞濃度がOD730=0.3になるまで細胞を増殖させ、細胞濃度をこの値に保つように連続培養を行った。連続培養中に12時間の暗期を培養液に与えて細胞内の生物時計をリセットした後、連続白色光照射下（46μmol/m2/sec）へ移してこの時刻を０時間目とした。連続明開始からの細胞の増殖速度をリアルタイム測定した。図８aは、培養液に追加した培地の体積から本明細書段落番号［0036］に記載の計算式によって細胞増殖速度を算出した場合であり、図8bは、培養液の細胞濃度変化を光電センサーの電圧変化として捉えて本明細書段落番号［0040］に記載の計算式によって細胞増殖速度を算出した場合である。いずれの場合も、細胞増殖速度は1時間あたりの細胞数の増殖倍率として図中に表示した。その結果、いずれの計算方法を用いた場合も、細胞増殖速度の変動パターンを概日リズムとして測定することができた。したがって、本装置を用いて２つの計算方法のいずれを用いても、細胞増殖速度をリアルタイム測定できることが実証された。 The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii was planted in 1 L of TAP liquid medium, and aeration culture was performed using this apparatus under white light irradiation (46 μmol / m 2 / sec) at 23 ° C. The cells were grown until the cell concentration of the culture solution reached OD 730 = 0.3, and continuous culture was performed so as to keep the cell concentration at this value. During the continuous culture, a dark period of 12 hours was given to the culture solution to reset the biological clock in the cell, and then it was transferred to continuous white light irradiation (46 μmol / m 2 / sec), and this time was set to 0 hour. The cell growth rate from the start of continuous light was measured in real time. FIG. 8a shows the case where the cell growth rate is calculated from the volume of the medium added to the culture solution by the calculation formula described in paragraph [0036] of this specification. FIG. 8b shows the change in the cell concentration of the culture solution as a photoelectric sensor. This is a case where the cell growth rate is calculated by the calculation formula described in paragraph [0040] of this specification. In either case, the cell growth rate was shown in the figure as the growth rate of the number of cells per hour. As a result, it was possible to measure the fluctuation pattern of the cell growth rate as a circadian rhythm using any calculation method. Therefore, it was demonstrated that the cell growth rate can be measured in real time using either of the two calculation methods using this apparatus.
実施例６
次に、種々の生物の発光レポータ株における生物発光リズムのリアルタイム測定を行った。Example 6
Next, real-time measurement of bioluminescence rhythm in various organism luminescence reporter strains was performed.
(a) 常温性藍色細菌Synechococcus sp. strain PCC 7942のPkaiBC::luxAB発光レポーター株の生物発光リズム(図９(a))(a) Bioluminescence rhythm of P kaiBC :: luxAB luminescent reporter strain of thermophilic cyanobacteria Synechococcus sp. strain PCC 7942 (Fig. 9 (a))
バクテリアルシフェラーゼ遺伝子luxABを発光レポーターに持つSynechococcusを1LのBG-11液体培地に植え付け、本装置を用いて30℃、白色光照射下（20μmol/m2/sec）で5% CO2ガスを通気して培養を行った。培養液の細胞濃度がOD730=0.3になるまで細胞を増殖させ、細胞濃度をこの値に保つように連続培養を行った。連続培養中に12時間の暗期を培養液に与えて細胞内の生物時計をリセットした後、連続白色光照射下（20μmol/m2/sec）へ移してこの時刻を０時間目とした。そして、連続明開始からの生物発光を本装置でリアルタイム測定した。その結果、PkaiBC::luxAB発光レポーター遺伝子の発現を明瞭な生物発光リズムとしてリアルタイム測定することができた。Synechococcus with the bacterial luciferase gene luxAB as a luminescent reporter is planted in 1L of BG-11 liquid medium, and 5% CO 2 gas is aerated using this device under white light irradiation (20μmol / m 2 / sec) at 30 ° C. The culture was performed. The cells were grown until the cell concentration of the culture solution reached OD 730 = 0.3, and continuous culture was performed so as to keep the cell concentration at this value. During the continuous culture, a dark period of 12 hours was given to the culture solution to reset the biological clock in the cell, and then transferred to continuous white light irradiation (20 μmol / m 2 / sec), and this time was set to 0 hour. And the bioluminescence from the start of continuous light was measured in real time with this apparatus. As a result, the expression of the P kaiBC :: luxAB luminescence reporter gene could be measured in real time as a clear bioluminescence rhythm.
(b) 好熱性藍色細菌Thermosynechococcus elongatusのPkaiA::lucTe発光レポーター株の生物発光リズム(図９(b))(b) Bioluminescence rhythm of the P kaiA :: luc Te luminescent reporter strain of the thermophilic indigo bacterium Thermosynechococcus elongatus (FIG. 9 (b))
Thermosynechococcusのゲノムに最適化した耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子lucTeを発光レポーターに持つThermosynechococcusを1LのBG-11液体培地に植え付け、本装置を用いて50℃、白色光照射下（45μmol/m2/sec）で5% CO2ガスを通気して培養を行った。培養液の細胞濃度がOD730=2.0という高濃度になるまで細胞を増殖させ、細胞濃度をこの値に保つように連続培養を行った。連続培養中に12時間の暗期を培養液に与えて細胞内の生物時計をリセットした後、連続白色光照射下（45μmol/m2/sec）へ移してこの時刻を０時間目とした。そして、連続明開始からの生物発光を本装置でリアルタイム測定した。その結果、PkaiA::lucTe発光レポーター遺伝子の発現を明瞭な生物発光リズムとしてリアルタイム測定することができた。したがって、本装置は高濃度の培養液においても生物発光レポーター株の生物発光リアルタイム測定が可能であることが実証された。Thermosynechococcus, a thermostable firefly luciferase gene luc Te optimized for the genome of Thermosynechococcus, was planted in 1L of BG-11 liquid medium with luc Te as a luminescent reporter, and this device was used at 50 ° C under white light irradiation (45μmol / m 2 / sec ) And aerated with 5% CO 2 gas. The cells were grown until the cell concentration of the culture solution reached a high concentration of OD 730 = 2.0, and continuous culture was performed so as to keep the cell concentration at this value. During the continuous culture, a dark period of 12 hours was given to the culture solution to reset the biological clock in the cell, and then it was transferred to continuous white light irradiation (45 μmol / m 2 / sec), and this time was set to 0 hour. And the bioluminescence from the start of continuous light was measured in real time with this apparatus. As a result, the expression of the P kaiA :: luc Te luminescence reporter gene could be measured in real time as a clear bioluminescence rhythm. Therefore, it was demonstrated that this apparatus can perform bioluminescence real-time measurement of a bioluminescent reporter strain even in a high concentration culture solution.
(c) 単細胞性緑藻Chlamydomonas reinhardtiiのPpsbD::lucCP発光レポーター株の生物発光リズム（図９(ｃ)）(c) Bioluminescence rhythm of P psbD :: lucCP luminescent reporter strain of unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Fig. 9 (c))
Chlamydomonasの葉緑体ゲノムに最適化したホタルルシフェラーゼ遺伝子lucCPを発光レポーターに持つChlamydomonasを1LのTAP液体培地に植え付け、本装置を用いて23℃、白色光照射下（45μmol/m2/sec）で通気培養を行った。培養液の細胞濃度がOD730=0.35になるまで細胞を増殖させ、細胞濃度をこの値に保つように連続培養を行った。連続培養中に12時間の暗期を培養液に与えて細胞内の生物時計をリセットした後、連続白色光照射下（45μmol/m2/sec）へ移してこの時刻を０時間目とした。そして、連続明開始からの生物発光を本装置でリアルタイム測定した。その結果、PpsbD::lucCP発光レポーター遺伝子の発現を明瞭な生物発光リズムとしてリアルタイム測定することができた。Chlamydomonasは真核生物なので、本装置は真核生物の生物発光レポーター株の生物発光リアルタイム測定が可能であることが実証された。Chlamydomonas with the luciferase gene lucCP optimized for the chloroplast genome of Chlamydomonas as a luminescent reporter is planted in a 1L TAP liquid medium, and this device is used at 23 ° C under white light irradiation (45μmol / m 2 / sec) Aeration culture was performed. Cells were grown until the cell concentration in the culture reached OD 730 = 0.35, and continuous culture was performed to keep the cell concentration at this value. During the continuous culture, a dark period of 12 hours was given to the culture solution to reset the biological clock in the cell, and then it was transferred to continuous white light irradiation (45 μmol / m 2 / sec), and this time was set to 0 hour. And the bioluminescence from the start of continuous light was measured in real time with this apparatus. As a result, the expression of the P psbD :: lucCP luminescence reporter gene could be measured in real time as a clear bioluminescence rhythm. Since Chlamydomonas is a eukaryote, it has been demonstrated that this device is capable of real-time bioluminescence measurement of eukaryotic bioluminescent reporter strains.
実施例７
次に、Chlamydomonas reinhardtiiのpsbD遺伝子のノーザン解析について調べた。Example 7
Next, the northern analysis of the plamb gene of Chlamydomonas reinhardtii was investigated.
単細胞性緑藻Chlamydomonas reinhardtiiを1LのTAP液体培地に植え付け、本装置を用いて23℃、白色光照射下（45μmol/m2/sec）で通気培養を行った。細胞濃度がOD730=0.35になるまで細胞を増殖させ、細胞濃度をこの濃度に保つように連続培養を行った。連続培養中に12時間の暗期を培養液に与えて生物時計をリセットした後、連続白色光照射下（45μmol/m2/sec）へ移してこの時刻を０時間目とした。本装置の自動サンプリング機能を用いて、Chlamydomonasの細胞を4時間間隔で50mlずつサンプリングし、極低温に凍結保存した。極低温で凍結保存した細胞から全RNAを抽出し、Chlamydomonasの葉緑体遺伝子であるpsbDの発現をノーザン解析した（図10）。rRNAを染色して対照とした。その結果、psbD mRNAレベルの変動を概日リズムとして捉えることができた。したがって、本装置で培養、サンプリング、凍結保存した細胞から抽出したRNAは質的に十分良質であり、ノーザン解析などの実験に用いることが可能であることが実証された。 The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii was planted in 1 L of TAP liquid medium, and aerated culture was performed using this apparatus under white light irradiation (45 μmol / m 2 / sec) at 23 ° C. Cells were grown until the cell concentration reached OD 730 = 0.35, and continuous culture was performed to keep the cell concentration at this concentration. During the continuous culture, a dark period of 12 hours was given to the culture solution to reset the biological clock, and then it was transferred to continuous white light irradiation (45 μmol / m 2 / sec) to set this time as the 0th hour. Using the automatic sampling function of this device, Chlamydomonas cells were sampled 50 ml at intervals of 4 hours and stored frozen at a cryogenic temperature. Total RNA was extracted from cells cryopreserved at cryogenic temperatures, and the expression of plamb, a chloroplast gene of Chlamydomonas, was analyzed by Northern analysis (Fig. 10). rRNA was stained as a control. As a result, the fluctuation of psbD mRNA level was understood as circadian rhythm. Therefore, it was demonstrated that RNA extracted from cells cultured, sampled, and cryopreserved with this apparatus is qualitatively sufficiently high in quality and can be used for experiments such as Northern analysis.
基礎研究、医療、醸造などの種々の分野における細胞の液体培養に利用することができる。 It can be used for liquid culture of cells in various fields such as basic research, medicine, and brewing.
Claims (11)
予め設定した測定間隔で前記細胞濃度センサーからの測定値を読み取り、記録する手段、
前記測定間隔毎に、予め入力した前記細胞濃度センサーからの測定値と細胞濃度との相関関係を利用して、前記記録された測定値から培養液中の細胞濃度を算出する手段、
前記算出された細胞濃度データを記録する手段、
前記記録された測定値と、前記記録された細胞濃度と、測定期間中の前記記録された測定値の変化量とによって、細胞増殖率を算出する手段、
として機能させ、
前記細胞増殖率の計算方法は、単位時間当たりの細胞増殖率 G i (Cell Growing rate / h) を、下記の計算式：
G i = ((C c + Δ C x ΣΔ E i ) / C c ) (60 / T)
を用いて、測定開始時に入力した電圧−細胞濃度の検定曲線と、下記の入力値：
j: 細胞濃度 - 電圧の検定曲線の組み番号 (0 - n) （培養開始時に決定する）
C j : 電圧 - 細胞濃度の検定曲線を調べた際の細胞濃度 (Cells / ml) （培養開始時に決定する）
E j : 電圧 - 細胞濃度の検定曲線を調べた際の電圧 (V) （培養開始時に決定する）
C c : 培養時の培養液の細胞濃度 (Cells / ml) （培養開始時に決定する）
T: 測定間隔 (min) （培養開始時に決定する）
i: 測定番号 (0 - n) （培養期間に測定間隔毎にカウントアップしていく）
ΣΔ E i : 測定番号 i-1 から i までの期間における電圧変化量合計（培養期間に自動的に記録する）
と、上記入力値を元に下記の計算式：
Δ C = (C j - C j-1 ) / (E j - E j-1 )
（ただし、細胞濃度 C j と C j-1 はそれぞれ電圧 - 細胞濃度の検量線を引いたときに「 C j-1 < C c < C j 」を満たす細胞濃度 C c にもっとも近い値）
を用いて計算した培養時における電圧変化量あたりの細胞濃度変化量Δ C （ Cells / ml / V ）とから計算する方法であることを特徴とする制御プログラム。 A computer connected to a cell concentration sensor consisting of a photoelectric sensor attached to a flask for liquid culture ,
Means for reading and recording the measurement value from the cell concentration sensor at a predetermined measurement interval ;
Means for calculating the cell concentration in the culture solution from the recorded measurement value by utilizing the correlation between the measurement value and the cell concentration from the cell concentration sensor inputted in advance for each measurement interval;
Means for recording the calculated cell concentration data;
Means for calculating a cell proliferation rate based on the recorded measurement value, the recorded cell concentration, and a change amount of the recorded measurement value during a measurement period;
Function as
The cell growth rate is calculated by calculating the cell growth rate G i (Cell Growing rate / h) per unit time as follows :
G i = ((C c + Δ C x ΣΔ E i ) / C c ) (60 / T)
, The voltage-cell concentration calibration curve entered at the start of the measurement and the following input values:
j: Cell concentration - voltage calibration curve set number (0-n) (determined at the start of culture)
C j: Voltage - cell concentration at the time of examining the calibration curve of cell concentration (Cells / ml) (determined at the initiation of the culture)
E j : Voltage (V) when examining the calibration curve of voltage - cell concentration (determined at the start of culture)
C c : Cell concentration of the culture medium during culture (Cells / ml) (determined at the start of culture)
T: Measurement interval (min) (determined at the start of culture)
i: Measurement number (0-n) (Count up every measurement interval during the culture period)
ΣΔ E i : Total voltage change during the period from measurement number i-1 to i (automatically recorded during the culture period)
And the following formula based on the above input values:
Δ C = (C j -C j-1 ) / (E j -E j-1 )
(However, the cell concentrations C j and C j-1 are values closest to the cell concentration C c that satisfies “ C j-1 <C c <C j ” when a voltage - cell concentration calibration curve is drawn. )
A control program characterized in that it is a method of calculating from a change amount Δ C ( Cells / ml / V ) of cell concentration per change amount of voltage at the time of culturing calculated by using .
前記フラスコへの培地の供給量を記録する手段、
前記記録された培地の供給量と前記フラスコ内の培養液の体積によって、細胞増殖率を算出する手段、
として機能させ、
前記細胞増殖率の計算方法の代わりに、単位時間当たりの細胞増殖率 G i (Cell Growing rate / h) を、下記の計算式：
G i = ((V+ R i x T x S) / V) (60 / T)
を用いて、下記の入力値：
S: 追加培養液の流速 (ml/min) （培養開始時に決定する）
T: 測定間隔 (min) （培養開始時に決定する）
V: 培養液の体積 (ml) 。（培養開始時に決定する）
i: 測定番号 (0 - n) 。（培養期間に測定間隔毎にカウントアップしていく）
R i : 測定番号 i-1 から i の期間における追加培地の供給時間率（培養期間に自動的に記録する）
から計算する方法を用いることを特徴とする請求項１記載の制御プログラム。In addition, the computer
Means for recording the amount of medium supplied to the flask;
Means for calculating a cell growth rate according to the supply amount of the recorded medium and the volume of the culture solution in the flask;
Function as
Instead of the cell growth rate calculation method, the cell growth rate G i (Cell Growing rate / h) per unit time is calculated by the following formula:
G i = ((V + R i x T x S) / V) (60 / T)
Use to input the following values:
S: Flow rate of additional culture solution (ml / min) (determined at the start of culture)
T: Measurement interval (min) (determined at the start of culture)
V: Volume of culture (ml) . (Determined at the start of culture)
i: Measurement number (0-n) . (Count up every measurement interval during the culture period)
R i : Feeding rate of additional medium during the period from measurement number i-1 to i (automatically recorded during the culture period)
The control program according to claim 1, wherein a calculation method is used .
予め設定されたタイミングで細胞のサンプリングを行うようにサンプリング装置へ制御信号を出力する手段、 Means for outputting a control signal to the sampling device so as to sample the cells at a preset timing;
として機能させることを特徴とする請求項１又は２記載の制御プログラム。 The control program according to claim 1, wherein the control program is made to function as:
リアルタイムに送られてくる前記測定値に基づいて、前記細胞増殖率を表示する手段と、 Means for displaying the cell growth rate based on the measured values sent in real time;
所定時間後に新たにリアルタイムに送られてくる測定値に基づいて、前記細胞増殖率をリアルタイムで更新表示する手段、 A means for updating and displaying the cell proliferation rate in real time based on a measurement value newly sent in real time after a predetermined time;
として繰り返し実行させることを特徴とする請求項１〜３のいずれか Any one of claims 1 to 3 is repeatedly executed. 11 項に記載の制御プログラム。The control program according to item.
リアルタイムに送られてくる生物試料の細胞増殖速度の計算結果に基づいて前記サンプリングのタイミングを制御し、前記サンプリング装置へ制御信号を出力する手段、 Means for controlling the sampling timing based on the calculation result of the cell growth rate of the biological sample sent in real time and outputting a control signal to the sampling device;
として機能させることを特徴とする請求項１〜４項のいずれか１項に記載の制御プログラム。 The control program according to any one of claims 1 to 4, wherein the control program is made to function as:
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